ITBO960037A1

ITBO960037A1 - COMPOSITION AND PROCEDURE FOR THE STERILIZATION OF CULTURE SUBSTRATES

Info

Publication number: ITBO960037A1
Application number: IT96BO000037A
Authority: IT
Inventors: Paolo Giovannetti
Original assignee: Paolo Giovannetti
Priority date: 1996-01-30
Filing date: 1996-01-30
Publication date: 1997-07-30
Also published as: WO1997028249A1; IT1285551B1; ITBO960037A0

Abstract

Si propone una composizione per la sterilizzazione di substrati di coltura che permette di eliminare completamente l'impiego di autoclavi e filtri e che riduce drasticamente l'uso di cappe sterili. La nuova composizione utilizza l'azione del cloro allo stato gassoso o liquido e non richiede tecniche laboriose e personale altamente specializzato.We propose a composition for the sterilization of culture substrates which allows to completely eliminate the use of autoclaves and filters and which drastically reduces the use of sterile hoods. The new composition uses the action of chlorine in a gaseous or liquid state and does not require laborious techniques and highly specialized personnel.

Description

D E S C R I Z I O N E DESCRIPTION

annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE dal titolo: COMPOSIZIONE E PROCEDIMENTO PER LA STERILIZZAZIONE DI SUBSTRATI DI COLTURA. attached to a patent application for INDUSTRIAL INVENTION entitled: COMPOSITION AND PROCEDURE FOR THE STERILIZATION OF CULTURE SUBSTRATES.

D E S C R I Z I O N E D E L T R O V A T O D E S C R I Z I O N E D E L T R O V A T O

La presente invenzione ha per oggetto una composizione per sterilizzare substrati di coltura. Più in particolare, la presente invenzione ha per oggetto una composizione sterilizzante a base di cloro attivo ed il suo impiego, nonché un procedimento per sterilizzare substrati di coltura con detta composizione. The present invention relates to a composition for sterilizing culture substrates. More particularly, the present invention relates to a sterilizing composition based on active chlorine and its use, as well as a process for sterilizing culture substrates with said composition.

Nella tecnica della micropropagazione in vitro si pone particolare importanza alla sterilizzazione del substrato di coltura, in quanto esso va soggetto molto facilmente a contaminazioni batteriche e fungine essendo composto principalmente da zuccheri, proteine ed aminoacidi. Tale substrato è allo stato liquido a temperatura ambiente, e quando scaldato a 90°C e poi lasciato raffreddare si trasforma in gel. In the in vitro micropropagation technique, particular importance is placed on the sterilization of the culture substrate, as it is very easily subject to bacterial and fungal contamination as it is mainly composed of sugars, proteins and amino acids. This substrate is in a liquid state at room temperature, and when heated to 90 ° C and then left to cool it turns into a gel.

Per sterilizzare il substrato si effettua in genere un passaggio in autoclave a 120°C per 20 minuti nel caso di quantità inferiori a 500 cc, mentre per quantitativi superiori si possono richiedere anche 25-30 minuti. Se si supera questo limite, il substrato tende a degradarsi. Per mantenere poi la sua sterilità, i vasi che lo contengono vengono normalmente avvolti con pellicole di materiale plastico. To sterilize the substrate, a passage in an autoclave at 120 ° C is generally carried out for 20 minutes in the case of quantities of less than 500 cc, while for higher quantities it may take up to 25-30 minutes. If this limit is exceeded, the substrate tends to degrade. To then maintain its sterility, the vessels that contain it are normally wrapped with plastic films.

Un metodo alternativo al trattamento in autoclave è la filtrazione del substrato su membrane di acetato o nitrato di cellulosa, che sono capaci di trattenere particelle molto piccole e quindi anche batteri e spore fungine.Questo metodo alternativo è lungo e dispendioso e viene utilizzato solo quando si devono aggiungere al substrato sostanze termolabili. An alternative method to autoclaving is the filtration of the substrate on membranes of acetate or cellulose nitrate, which are capable of retaining very small particles and therefore also bacteria and fungal spores.This alternative method is time-consuming and expensive and is used only when must add thermolabile substances to the substrate.

Il substrato sterilizzato deve essere mantenuto tale nelle operazioni successive, per cui l'introduzione ad esempio di germogli deve essere eseguita in condizioni di assoluta asepsi sotto cappa a flusso laminare sterile impiegando pinzette e bisturi chirurgici preventivamente e ripetutamente sterilizzati alla fiamma. The sterilized substrate must be kept as it is in the subsequent operations, so that the introduction of sprouts, for example, must be performed under conditions of absolute asepsis under a sterile laminar flow hood using tweezers and surgical scalpels previously and repeatedly sterilized by flame.

Era scopo della presente invenzione eliminare tutte le operazioni laboriose menzionate sopra e fornire un metodo semplice ed efficace in grado di sterilizzare substrati di coltura risparmiando tempo e manodopera con semplificazione delle operazioni, e ottenere maggiori produttività con minor consumo energetico senza ricorrere a personale altamente specializzato e senza impiegare autoclavi, filtri e cappe sterili. It was the aim of the present invention to eliminate all the laborious operations mentioned above and to provide a simple and effective method capable of sterilizing culture substrates saving time and labor with simplification of operations, and obtaining greater productivity with less energy consumption without resorting to highly specialized personnel and without using autoclaves, filters and sterile hoods.

E' stato trovato che tutti gli scopi menzionati possono essere raggiunti se come sterilizzante si impiega cloro attivo. Come "cloro", nell'ambito della presente invenzione si può utilizzare sia cloro gassoso che liquido, oppure lo si può generare in situ per opportuno trattamento di composti in grado di cedere cloro. Questa ultima procedura è la più preferita, in quanto consente di eliminare gli svantaggi e i rischi collegati all'impiego del cloro libero. It has been found that all the aforementioned purposes can be achieved if active chlorine is used as the sterilant. As "chlorine", in the context of the present invention both gaseous and liquid chlorine can be used, or it can be generated in situ by suitable treatment of compounds capable of releasing chlorine. This last procedure is the most preferred, as it eliminates the disadvantages and risks associated with the use of free chlorine.

La presente invenzione ha quindi per oggetto una composizione per sterilizzare substrati di coltura comprendente: The present invention therefore relates to a composition for sterilizing culture substrates comprising:

a) una soluzione contenente un composto in grado di cedere cloro ad una concentrazione che arriva sino al 5%, e a) a solution containing a compound capable of releasing chlorine at a concentration of up to 5%, e

b) una soluzione di un acido forte o debole ad una concentrazione che arriva sino al 10% nel caso di un acido forte e sino al 20% nel caso di un acido debole. b) a solution of a strong or weak acid at a concentration that reaches up to 10% in the case of a strong acid and up to 20% in the case of a weak acid.

Nell'impiego in accordo con l'invenzione, le due soluzioni vengono mescolate nel rapporto compreso tra 1:0,5 e 1:1 e la miscela viene aggiunta immediatamente al substrato ancora caldo e lasciata agire. When used according to the invention, the two solutions are mixed in the ratio between 1: 0.5 and 1: 1 and the mixture is immediately added to the still hot substrate and left to act.

Come composti in grado di cedere cloro si possono utilizzare tutti i composti capaci di cedere cloro a patto che la concentrazione della loro soluzione sia come massimo del 5%, in quanto concentrazioni superiori potrebbero bruciare i germogli. Si è rivelata anche opportuna una concentrazione non inferiore al 3%, dato che in un simile caso la sua efficacia risulta troppo bassa o addirittura nulla. Composti in grado di cedere cloro sono gli ipocloriti dei metalli alcalini e alcalino-terrosi, come ad esempio ipoclorito di calcio e sodio, le cloroamine, gli isoclorocianurati, i composti clorurati fosfatici, gli acidi isoclorocianidrici e così via. As compounds capable of releasing chlorine, all compounds capable of releasing chlorine can be used as long as the concentration of their solution is a maximum of 5%, as higher concentrations could burn the shoots. A concentration of not less than 3% has also proved appropriate, given that in such a case its effectiveness is too low or even zero. Compounds capable of releasing chlorine are the hypochlorites of alkaline and alkaline-earth metals, such as calcium and sodium hypochlorite, chloroamines, isochlorocyanurates, chlorinated phosphatic compounds, isochlorocyanhydric acids and so on.

Come acidi si possono utilizzare gli acidi forti, come ad esempio acido cloridrico, solforico, nitrico e gli acidi deboli come acido acetico, citrico, ossalico.Al posto degli acidi si possono utilizzare anche i loro sali di ammonio quaternario in concentrazioni oscillanti tra il 5 e il 15%. Strong acids can be used as acids, such as hydrochloric, sulfuric, nitric acids and weak acids such as acetic, citric, oxalic acid. Instead of acids, their quaternary ammonium salts can also be used in concentrations ranging from 5 and 15%.

Nel caso degli acidi forti si sono rivelate vantaggiose concentrazioni delle soluzioni comprese tra il 6 e il 9%, mentre nel caso degli acidi deboli concentrazioni oscillanti tra il 12 e il 20%. Logicamente l'invenzione non è ristretta o limitata a particolari acidi e composti capaci di cedere cloro, in quanto la loro scelta dipende unicamente dalla disponibilità degli stessi e dalla facilità con la quale possono essere ottenuti. In the case of strong acids, concentrations of solutions ranging from 6 to 9% have proved to be advantageous, while in the case of weak acids concentrations ranging from 12 to 20%. Logically, the invention is not restricted or limited to particular acids and compounds capable of releasing chlorine, since their choice depends solely on their availability and on the ease with which they can be obtained.

Come ricordato sopra, la sterilizzazione può essere anche effettuata aggiungendo direttamente al substrato cloro gas alla concentrazione del 3,5-4%, oppure cloro liquido ad una concentrazione compresa tra il 3 e il 5%. As mentioned above, sterilization can also be carried out by adding directly to the substrate chlorine gas at a concentration of 3.5-4%, or liquid chlorine at a concentration between 3 and 5%.

In un esempio di una realizzazione preferita in accordo con l'invenzione, si sono mescolati 1,3 mi della soluzione di a) con 0,7 mi della soluzione b) facendo attenzione a non respirare i vapori di cloro che si liberano, e la miscela così ottenuta viene subito aggiunta al substrato ancora caldo (50-60°C) prima della determinazione del pH finale, che, nel caso presente, deve oscillare tra 5,5 e 5,7. Logicamente il valore del pH dipenderà sempre dalle pianticelle che devono poi essere seminate. La miscela, nella misura di 2 mi, viene versata nel caso in oggetto in 11 di substrato, dove anche qui il rapporto tra miscela e substrato dipende dalla quantità di agar presente nel substrato stesso. In an example of a preferred embodiment according to the invention, 1.3 ml of the solution of a) were mixed with 0.7 ml of the solution b) taking care not to breathe the chlorine vapors that are released, and the The mixture thus obtained is immediately added to the still hot substrate (50-60 ° C) before determining the final pH, which, in the present case, must oscillate between 5.5 and 5.7. Logically, the pH value will always depend on the seedlings that must then be sown. The mixture, to the extent of 2 ml, is poured in the present case into the substrate, where again the ratio between the mixture and the substrate depends on the quantity of agar present in the substrate itself.

Il trattamento così eseguito ha rivelato la totale assenza di muffe, batteri o di altri agenti in grado di pregiudicare la sterilità del substrato. The treatment thus performed revealed the total absence of molds, bacteria or other agents capable of compromising the sterility of the substrate.

Claims

R IV E N D ICA C IO N I 1. A composition for the sterilization of culture substrates comprising: a) a solution containing a compound capable of releasing chlorine at a concentration of up to 5%, e b) a solution of a strong or weak acid at a concentration that reaches up to 10% in the case of a strong acid and up to 20% in the case of a weak acid, in which the ratio between a) and b) oscillates between 1: 0.5 and 1: 1.

2. Composition according to claim 1, characterized in that the concentration of solution a) ranges from 3 to 5%.

3. Composition according to claim 1, characterized in that the concentration of solution b) is comprised between 6 and 10% when the acid is a strong acid.

4. Composition according to claim 1, characterized in that the concentration of solution b) is comprised between 12 and 20% when the acid is a weak acid.

5. Composition according to claim 1, characterized in that a solution of the corresponding quaternary ammonium salt at a concentration of between 5 and 15% can be used instead of the acid solution.

6. Process for sterilizing culture substrates, characterized in that a composition according to each of claims 1 to 5 is made to act on the substrate to be sterilized.

7. Process for the sterilization of culture substrates, characterized in that chlorine gas or liquid is caused to act directly on the substrate to be sterilized.

8. Process according to claim 7, characterized in that the concentration of the gas or liquid chlorine varies between 3 and 5%.