ITBO940146A1

ITBO940146A1 - Derivati di acidi biliari utili nella terapia della calcolosi biliare da colesterolo e nelle patologie indotte da colestasi

Info

Publication number: ITBO940146A1
Application number: IT94BO000146A
Authority: IT
Inventors: Egidio Marchi; Maria Rita Milani; Silvano Piani; Aldo Roda; Gianfranco Cainelli
Original assignee: Alfa Wassermann Spa
Priority date: 1994-04-06
Filing date: 1994-04-06
Publication date: 1995-10-06
Also published as: DE69501125D1; EP0676410A2; ATE160785T1; EP0676410A3; DE69501125T2; ES2109747T3; IT1274000B; DK0676410T3; ITBO940146A0; EP0676410B1; GR3025811T3; US5639744A

Description

Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo:

DERIVATI DI ACIDI BILIARI UTILI NELLA TERAPIA DELLA

CALCOLOSI BILIARE DA COLESTEROLO E NELLE

PATOLOGIE INDOTTE DA COLESTASI.

RIASSUNTO DELL'INVENZIONE

Ammidi degli acidi ursodesossicolico, iocolico ed iodesossicolico con amminoacidi ciclici di formula generale

e loro sali organici od inorganici farmacologicamente accettabili. Queste ammidi mostrano una stabilità metabolica, sia intestinale che epatica, superiore a quella dei corrispondenti acidi biliari coniugati con glieina o taurina presenti fisiologicamente nel circolo enteroepatico. L'attività farmacologica dei derivati di formula I e dei loro sali organici od inorganici farmacologicamente accettabili ne rende efficace l'uso nella terapia della calcolosi biliare da colesterolo e in tutte le patologie indotte da colestasi quali l'epatite cronica da colestasi, la cirrosi biliare primitiva e l'epatopatia infantile associata a fibrosi cistica.

AMBITO DELL'INVENZIONE

Gli acidi biliari sono i maggiori metaboliti del colesterolo e facilitano la sua eliminazione nelle feci mediante la formazione di micelle, come riportato da D.M. Small in The bile acids - Chemistry, Physiology and Metabolism, Vol.l, P.P. Nair and D. Kritchevsky Eds., Plenum Press, N.Y., 249-355, (1971). Nel fegato, durante la circolazione enteroepatica, interviene un processo di coniugazione con glieina e taurina degli acidi biliari liberi sintetizzati dal colesterolo prima della loro secrezione nel dotto biliare e nel duodeno. Nel lume intestinale gli acidi biliari intervengono nel meccanismo di assorbimento dei grassi e di altri lipidi con formazione di micelle miste. Gli acidi biliari primari, colico e chenodesossicolico, sono modificati dai batteri intestinali ad acidi biliari secondari con formazione rispettivamente di acido desos sicolico ed acido litocolico. Prima di tale processo gli acidi biliari coniugati con glieina e taurina sono anche parzialmente deconiugati od idrolizzati dalla flora batterica intestinale. L'acido chenodesossicolico (CDCA) e l'acido ursodesossicolico (UDCA) vengono ampiamente utilizzati nel trattamento della litiasi biliare colesterolica in alternativa all'intervento chirurgico, come riportato da J.L. Thistle e A.F. Hofmann in New Engl. J. Med., 289. 655 (1973) e da P.N. Maton et al, in Lancet, 2, 1297 (1977). Altre applicazioni terapeutiche riportate in letteratura riguardano il trattamento delle epatopatie, descritto da R. Poupon et al. in Lancet , 1, 834 (1987), delle gastriti da riflusso biliare, come descritto da A.B. Stefaniwsky et al. in Gastroenterology, 89, 1000 (1985) e della fibrosi cistica. Il primo acido biliare introdotto nella terapia della calcolosi biliare colesterolica è stato l'acido chenodesossicolico (CDCA) tuttora utilizzato nonostante la non buona tollerabilità; il suo utilizzo cronico provoca infatti numerosi effetti collaterali tra i quali diarrea ed innalzamento degli enzimi epatici (transaminasi) che ne limitano l'impiego terapeutico. Tale molecola è molto attiva nell' inibire la sintesi epatica del colesterolo (HMGCoA riduttasi) con il risultato di produrre una bile sottosatura di colesterolo stesso, inoltre l'elevata detergenza del CDCA favorisce la dissoluzione dei calcoli biliari nella bile sotto forma di soluzione micellare. Il CDCA, di per sè moderatamente tossico sia a livello intestinale che epatico, viene metabolizzato nell'organismo ad acido litocolico, un acido biliare ad elevata epatotossicità. Il metabolismo del CDCA nell'uomo avviene normalmente per assorbimento intestinale mediante meccanismo passivo, coniugazione da parte del fegato con glieina e taurina, secrezione biliare sotto queste forme chimiche che vengono poi successivamente assorbite con meccanismo passivo (glicoconiugato) e attivo (tauroconiugato e glicoconiugato). Durante questo circolo enteroepatico la molecola viene in parte assorbita ed in parte eliminata con le feci. Nel 1980, onde ovviare agli effetti collaterali del CDCA, è stato introdotto nell'uso terapeutico l'epimero del CDCA noto come acido ursodesossicolico (UDCA) che si differenzia dal CDCA unicamente per l'orientamento dell'ossidrile in posizione 7 (da 7 a a 78). Tale modifica strutturale, apparentemente minima, provoca invece profonde modifiche sia nelle proprietà chimico-fisiche che in quelle farmacotossicologiche. In particolare l'UDCA è una molecola decisamente più idrofila e meno detergente del CDCA ed anche degli altri acidi biliari normalmente presenti nella bile umana quali l'acido desossicolico e l'acido colico. Mentre la somministrazione cronica di CDCA provoca un arricchimento nella bile di quest'ultimo di circa il 90% degli acidi biliari totali, la somministrazione di UDCA alla stessa dose provoca un arricchimento non superiore al 50% degli acidi biliari totali. Tale fatto può essere attribuibile a diversi fattori tra i quali la mancata inibizione della sintesi degli acidi biliari endogeni dal colesterolo e il non completo assorbimento intestinale di quest'ultimo. Studi più recenti hanno evidenziato come il meccanismo d'azione responsabile della dissoluzione di calcoli biliari da parte dell 'UDCA sia diverso da quello del CDCA. L'UDCA è in grado di sciogliere i calcoli mediante una riduzione selettiva della secrezione biliare di colesterolo associata ad un malassorbimento intestinale del colesterolo stesso. L'UDCA non è così attivo come il CDCA nell' inibire la sintesi del colesterolo e degli acidi biliari dal colesterolo. Una bile arricchita per il 50% di UDCA o dei suoi coniugati con glieina e taurina forma una mesofase con il colesterolo ed i fosfolipidi e il meccanismo di dissoluzione del colesterolo avviene non con micelle ma con un sistema che contiene anche liposomi costituiti da fosfolipidi biliari. La farmacocinetica dell'UDCA è simile a quella del CDCA: il farmaco viene assorbito nel primo passaggio con meccanismo passivo, trasportato al fegato dal sistema portale, coniugato con glieina e taurina e così secreto per essere riassorbito con meccanismo attivo sotto forma glicoconiugata e tauroconiugata a livello dell' ileo. Anche l'UDCA viene in parte 7-deidrossilato con formazione di acido litocolico, ma con una cinetica più lenta del CDCA. Questo fatto, unito al minor assorbimento a livello intestinale, rende l'UDCA una molecola molto meno tossica del CDCA, innocua anche a dosi 10 volte superiori a quelle terapeutiche. Per questo fatto l'UDCA è stato proposto in quest'ultimi anni come nuovo farmaco nelle patologie epatiche ed è risultato essere efficace nella terapia della cirrosi biliare primitiva e di alcune forme di epatopatie colestatiche. L'indicazione terapeutica dell' UDCA è quindi sia nella dissoluzione dei calcoli biliari di colesterolo sia nel trattamento delle epatopatie. Si deve infine tener presente che la forma che si accumula nell'organismo dopo somministrazione cronica di UDCA non è il farmaco per sè ma i suoi metaboliti epatici, e cioè le sue forme coniugate, GUDCA e TUDCA, che verosimilmente sono i principi attivi. Queste forme coniugate subiscono un processo di deconiugazione e di 7-deidrossilazione ad acido litocolico da parte della flora batterica intestinale e pertanto l'UDCA in questo modo perde parte della propria efficacia terapeutica ed aumenta la propria tossicità. Per ovviare a questi seri inconvenienti sono stati sintetizzati nuovi derivati steroidei, a struttura correlata agli acidi ursodesossicolico, iodesossicolico e iocolico, in cui la funzione acida in posizione 24 viene sostituita con una funzione ammidica stabile alla degradazione da parte dei batteri intestinali rispetto alle ammidi fisiologiche contenenti glieina e taurina. La scelta delle ammidi è stata effettuata in modo che le molecole risultanti assumano le proprietà chimico-fisiche e farmacologiche necessarie per ottenere una buona efficacia terapeutica ed una bassa tossicità. Le variazioni strutturali apportate incidono sulle proprietà chimico-fisiche dei derivati favorendone assorbimento e secrezione durante la permanenza nel circolo enteroepatico in quanto le variazioni di ionizzazione ed idrofobicità incidono sul trasporto di queste sostanze nel sistema epatobiliare ed in particolare riducono l'impegno metabolico del fegato per coniugare le molecole e contemporaneamente riducono notevolmente il processo di 7-deidrossilazione intestinale ad acido litocolico. Le variazioni strutturali incidono favorevolmente anche sulle proprietà farmacologiche di queste nuove ammidi aumentandone l'effetto sulla dissoluzione dei calcoli biliari da colesterolo e nelle patologie colestatiche anche mediante un effetto coleretico. Per questi motivi i derivati degli acidi biliari oggetto della presente invenzione possono trovare utile applicazione terapeutica nel trattamento di svariate patologie del tratto epatico quali la dissoluzione dei calcoli biliari da colesterolo, le patologie derivanti da colestasi, in particolare l'epatite cronica colestatica, la cirrosi biliare primitiva e Γ epatopatia infantile da fibrosi cistica.

DESCRIZIONE DELL'INVENZIONE

L'oggetto dell'invenzione è costituito da ammidi degli acidi ursodesossicolico, iocolico e iodesossicolico con amminoacidi ciclici di formula generale

e dai loro sali organici od inorganici farmacologicamente accettabili, che possono essere vantaggiosamente utilizzati nella terapia della calcolosi biliare da colesterolo e delle patologie indotte da colestasi. Nella formula generale R1 rappresenta un atomo di idrogeno, un gruppo (C1-C6)-alchile, lineare o ramificato, ossidrile, (Cl-C6)-alcossile, lineare o ramificato, solfidrile o (C1-C6)-tioalcossile, lineare o ramificato, mentre n rappresenta un numero intero compreso tra 1 e 3. R2 rappresenta un atomo di idrogeno nel caso dell’ acido ursodesossicolico o un gruppo ossidrile in posizione a nel caso degli acidi iocolico e iodesossicolico. R3 rappresenta un atomo di idrogeno nel caso dell'acido iodesossicolico, un gruppo ossidrile in posizione a nel caso dell'acido iocolico ed in posizione β nel caso dell'acido ursodesossicolico. I composti preferiti nell'attuazione dell' invenzione sono quelli in cui Γ amminoacido è costituito da prolina, 4-(trans)-idrossiprolina, 4-(trans)-tioidrossiprolina, 4-(trans)-metossiprolina o acido pipecolinico, tutti sia sotto forma racema che di singoli isomeri ottici. Ulteriore oggetto dell'invenzione è costituito dall'uso dei composti di formula generale I, dei loro sali organici ed inorganici farmacologicamente accettabili e delle composizioni farmaceutiche che li contengono nel trattamento della calcolosi biliare da colesterolo e in tutte le patologie indotte da colestasi quali l'epatite cronica da colestasi, la cirrosi biliare primitiva e l'epatopatia infantile associata a fibrosi cistica. I composti dell'invenzione vengono somministrati preferibilmente per via orale incorporati in forme farmaceutiche convenzionali scelte tra compresse, capsule, confetti e granulari che possono contenere, insieme al principio attivo, i vari agenti leganti, disgreganti, lubrificanti, dolcificanti, aromatizzanti, coloranti e ricoprenti normalmente utilizzati nella tecnica farmaceutica. Queste forme farmaceutiche possono essere sia a pronto rilascio che a rilascio controllato o ritardato in modo da poter essere somministrate una o più volte al giorno e possono contenere da 100 a 750 mg di principio attivo. Il dosaggio terapeutico, funzione sia del peso corporeo e dello stato fisico del paziente che della severità della patologia, è generalmente compreso nell'intervallo tra 5 e 15 mg/Kg/die. Il processo di sintesi dei composti di formula generale I avviene facendo reagire in un solvente organico scelto tra eteri lineari e ciclici 1 equivalente molare dell'acido biliare con da 1 a 1,2 equivalenti molari di un cloroformiato alchilico, preferibilmente di etile o di isobutile, in presenza di da 1 a 1,2 equivalenti molari di una base organica terziaria, preferibilmente trietilamina o tributilamina, ad una temperatura compresa tra 0°C e 25 °C per un periodo di tempo compreso tra 15 e 60 minuti. Le anidridi miste così ottenute vengono fatte reagire, senza isolarle, con da 1 a 1,5 equivalenti molari dell'opportuno amminoacido disciolto in una soluzione alcalina acquosa contenente la quantità di base, preferibilmente idrossido di sodio, necessaria per la salificazione dell' amminoacido. La temperatura viene fatta lentamente risalire a temperatura ambiente per un periodo di tempo compreso fra 2 e 24 ore e quindi la miscela di reazione viene addizionata di ghiaccio e portata ad un pH compreso fra 1,5 e 3 per aggiunta di una soluzione concentrata di acido cloridrico. I prodotti grezzi vengono recuperati dalle miscele di reazione per filtrazione e possono essere ulteriormente purificati o per cromatografia su colonna di gel di silice o per precipitazione frazionata del residuo di acido biliare di partenza non reagito ed eventuale successiva ricristallizzazione. Le ammidi degli acidi biliari cosi ottenute possono essere salificate secondo i metodi noti nella tecnica con basi organiche od inorganiche capaci di dare sali farmacologicamente accettabili. Sali di basi inorganiche, come idrossido di sodio e di potassio, e sali di basi organiche, come trietilammina e trietanolammina sono preferiti nell'attuazione della presente invenzione. Le ammidi degli acidi biliari descritte nella presente invenzione sono state caratterizzate analiticamente mediante l'utilizzo di tecniche spettrofotometriche e mediante l'analisi elementare. Lo spettro I.R. è stato ottenuto mediante spettrofotometro Peririn-Elmer mod.281/B generalmente, quando non diversamente specificato, preparando il campione in nujol e registrando lo spettro fra 4000 e 600 nm. Lo spettro 1H-NMR è stato registrato a temperatura ambiente mediante spettrometro Varian Gemini a 200 MHz, nei solventi riportati, utilizzando come standard interno il tetrametilsilano; le risonanze sono state espresse in p.p.m.. Lo spettro ^C-NMR è stato effettuato a 50,3 MHz con uno spettrometro Varian Gemini 200 utilizzando come standard interno il tetrametilsilano e come solventi quelli descritti nella parte sperimentale. Le cromatografie su gel di silice sono state effettuate usando gel di silice 60 F254 (230-400 mesh - E. Merck) con gli eluenti riportati negli esempi, secondo la metodica descritta da Clark Stili W. et al. in J.Org.Chem., 42, 2923, (1978). Altre caratteristiche chimico-fisiche dei derivati oggetto della presente invenzione sono state determinate attraverso tests comunemente utilizzati su analoghe sostanze steroidee e sono riportate nella tabella 1.

In particolare sono state determinate le seguenti proprietà:

1) Detergenza (Concentrazione micellare critica) (CMC)

2) Lipofilia (su HPLC in fase inversa C-18)

3) Solubilità della forma protonata

4) Acidità (pKa)

5) CMpH: valore di pH in cui l'acido si solubilizza nell'intestino in una soluzione micellare.

Tutti i parametri sono stati determinati secondo i metodi riportati da A. Roda et al. in J. Pharm. Sci., 77, 596-605 (1988). Per quanto riguarda il valore di detergenza definito come concentrazione micellare critica (CMC) i composti rivendicati nella presente invenzione mostrano valori confrontabili agli analoghi fisiologici. I derivati meno detergenti sono risultali i composti degli esempi 3, 5, 7 e 8 mentre i composti degli esempi 1, 2 e 6, presentano un moderato potere detergente, simile a quella degli analoghi fisiologici coniugati con glieina e taurina. In base a considerazioni di relazione struttura-attività (SAR) sia sull'UDCA che su di una serie di acidi biliari fisiologici il valore di concentrazione micellare critica ritenuto ideale per garantire un buon trasporto epatico deve essere maggiore di 10 mM, cioè il potere detergente deve essere relativamente basso. Tutti i derivati sintetizzati tranne quelli descritti negli esempi 4 e 6 mostrano un valore di CMC maggiore di 10; è comunque da considerare che il coniugato con taurina, TUDCA, mostra un valore di 8, analogamente ai composti descritti negli esempi 4 e 6. I valori di lipofilia, funzione dei sostituenti introdotti, sono compresi tra quello dell'UDCA, considerato uguale a 1, e quelli dei coniugati fisiologici TUDCA e GUDCA. Il valore ottimale di lipofilia per gli acidi biliari è ritenuto essere rK' > 0,6; una elevata lipofilia associata ad una bassa detergenza è da considerarsi la scelta ottimale. Con tali caratteristiche la molecola è poco tossica e nello stesso tempo, se sufficientemente lipofila, può ripartirsi nella membrana e quindi garantire un efficace assorbimento anche con meccanismo di diffusione passiva. Da questo punto di vista tutti i derivati sintetizzati mostrano una combinazione favorevole di tali caratteristiche. Per quanto riguarda il valore di solubilità della forma protonata tutti i composti rivendicati nella presente invenzione mostrano un valore nettamente superiore agli analoghi composti naturali e particolarmente significativi sono i valori dei composti degli esempi 1 e 2. La solubilità della forma protonata in soluzione micellare, espressa dal valore di CMpH, è per tutti i composti sintetizzati analoga a quella del coniugato naturale con glieina ed inferiore a quella dell'acido ursodesossicolico. I valori di pKa sono ottimali per garantire la ionizzazione dei composti dell'invenzione al pH del contenuto intestinale e quindi favorire la formazione del sale ionizzato solubile e la formazione di micelle essendo il valore ideale compreso fra 3,5 e 4,5 analogamente a quanto avviene per il GUDCA. Il valore del pKa unitamente a quello delle CMC rendono conto della possibilità dei composti dell'invenzione di solubilizzarsi ad un pH compreso tra 4 e 7 permettendo così alle molecole di raggiungere l'intestino una volta protonate a livello dello stomaco. Tutte le sostanze sintetizzate mostrano un profilo di tali caratteristiche chimico-fisiche favorevole rispetto agli acidi biliari fisiologici ed ai loro coniugati.

La farmacocinetica biliare dei derivati oggetto della presente invenzione dopo somministrazione nel ratto per via endovenosa alla dose di 10 /xmoli/min/Kg è stata valutata secondo la metodica riportata da A. Roda et sL in J- Pharm. Sci., 77, 596-605 (1988) ed espressa con i seguenti parametri: volume della bile, secrezione di acidi biliari (Tabella 2), secrezione di fosfolipidi, secrezione di colesterolo (Tabella 3). I valori del volume della secrezione biliare massima (SMB) e residua al termine dell'esperimento (SRg) vengono espressi in ml/min/Kg. I valori di secrezione degli acidi biliari, massimo (SMAB) e residuo (SRAB), dei fosfolipidi, massimo (SMPL) e residuo (SRPL) e del colesterolo, massimo (SMC) e residuo (SRC) vengono espressi in ^moli/min/Kg. I tempi necessari per raggiungere i valori massimi di reazione (Tmax) vengono espressi in minuti.

I composti rivendicati nella presente invenzione presentano un effetto coleretico compreso tra l'effetto indotto da TUDCA e GUDCA (0,07 ml/min/Kg) e quello indotto da UDCA (0,12 ml/min/Kg). I composti di formula I vengono secreti nella bile senza subire sostanziale metabolismo epatico a differenza dell 'UDCA che per essere secreto deve essere coniugato con glieina e/o taurina. La massima secrezione biliare, ottenuta con il composto dell' esempio 3, è nettamente superiore a quella ottenuta con gli acidi biliari coniugati, mentre tutti gli altri composti mostrano un valore simile a quello di TUDCA e GUDCA. Il valore di secrezione degli acidi biliari esprime in parte l'effetto della somministrazione del composto sul trasporto con albumina al fegato e quindi sulla efficienza della captazione epatica. Inoltre un valore elevato di secrezione massima nella bile indica che la molecola ha idonee proprietà chimico-fisiche e che non deve essere trasformata dal fegato a metaboliti più polari per essere secreta. Tutti i composti esemplificati presentano valori di secrezione biliare di fosfolipidi simili ai prodotti naturali tranne i composti 6 e 8 dove i valori di SMp^ sono significativamente aumentati. La secrezione massima del colesterolo è simile ai controlli con l'eccezione del composto 3 dove è significativamente ridotta. La cinetica dell'assorbimento su di una ansa ileale (Figura 1) dell'intestino isolato e perfuso di coniglio, secondo la metodica riportata da R. Aldini in Eur. Surg. Res., 22, 93-100 (1990), è stata adottata per valutare i parametri quantitativi dell'assorbimento, espresso come pmoli/min/cm intestino, dai quali si può ricavare il tipo di assorbimento, passivo o attivo dei composti di formula I in confronto con gli acidi biliari coniugati fisiologici.

Tutti i composti studiati presentano una cinetica di assorbimento di tipo attivo simile a quella di TUDCA e GUDCA. Il tipo di cinetica osservato è in accordo con la struttura dei composti caratterizzati dalla presenza del legame amidico, quindi in forma coniugata, fondamentale per il riconoscimento recettoriale del sistema carrier attivo. Il metabolismo intestinale ed epatico dei derivati oggetto della presente invenzione è stato studiato per determinarne la stabilità e quindi la possibilità di accumulo nel circolo enteroepatico. La stabilità presa in considerazione è quella relativa agli enzimi pancreatici come le carbossipeptidasi che rompono il legame ammidico generato nel processo di coniugazione ed ai batteri della flora intestinale che, con l'enzima colilglicina idrolasi, sono responsabili della deconiugazione e 7-deidrossilazione. Nel circolo enteroepatico esiste una continua deconiugazione intestinale e riconiugazione epatica dell’acido biliare e quindi l'emivita biologica della molecola coniugata è relativamente bassa. Il razionale della ricerca di nuovi acidi biliari stabili metabolicamente a livello epatico ed intestinale risiede nel fatto che prodotti coniugati più idrofili e solubili a valori più bassi di pH permangono nel circolo enteroepatico più a lungo. Infatti, ad esempio, la coniugazione rende l'UDCA più idrofilo e solubile a valori più bassi di pH avendo un pKa di 3,9 per il GUDCA e circa 1 per il TUDCA. I parametri relativi al metabolismo intestinale sono stati determinati secondo la metodica riportata da A. Roda et al. in J.Lipìd. Res. , 31, 289-298 (1990) e vengono riportati nella tabella 4. I composti di formula I trattati con colilglicina idrolasi, enzima in grado di idrolizzare il legame amidico in C-24 di TUDCA e GUDCA, presentano una elevata stabilità e solo per il composto dell' esempio 6 è stata documentata una modesta idrolisi comunque nettamente inferiore al grado di idrolisi cui sottostanno i coniugati fisiologici TUDCA e GUDCA. Si ritiene che la stabilità nettamente superiore dei composti di formula I rispetto ai coniugati fisiologici TUDCA e GUDCA sia dovuta al fatto che l'atomo di azoto del legame ammidico dei composti di formula I fà parte di un anello ciclico e che pertanto sussistano elementi di ingombro sierico che impediscono l'attacco dell'enzima colilglicina idrolasi. La stabilità delle molecole è stata valutata in vitro in presenza di batteri intestinali; in tali condizioni è possibile valutare sia il processo di deconiugazione che quello di 7-deossidriIazione. Tutti i composti studiati presentano una elevata stabilità quando fatti incubare in condizioni anaerobiche con feci umane, mentre gli analoghi GUDCA e TUDCA vengono rapidamente metabolizzati ad acido litocolico.

Il metabolismo epatico è stato valutato mediante infusione endovenosa dei prodotti e successiva determinazione via HPLC delle forme chimiche recuperate nella bile secreta. Tutti i derivati di formula I sono stati efficientemente captati dal fegato e secreti rapidamente nella bile senza subire alcuna biotrasformazione, contrariamente aU'UDCA che si è coniugato con glieina e taurina per essere secreto. I dati ottenuti dimostrano la buona conservazione dei composti di formula I nel circolo enteroepatico come tali, con una aumentata emivita biologica e senza formazione di metaboliti tossici o comunque non desiderati. La farmacologia dei derivati oggetto della presente invenzione è stata studiata prevalentemente valutando le capacità di prevenire un danno epatico indotto da un acido biliare molto detergente e tossico come l'acido taurochenodesossicolico (TCDCA) da parte dei derivati oggetto della presente invenzione, secondo il metodo descritto da D.L. Schmucker et al., in Hepatology, 12, 1216-1221 (1990). I parametri determinati nella tabella 5 sono il danno epatico espresso come numero di cellule necrotiche, il contenuto di calcio nella bile espresso come /imoli/min/Kg, il contenuto biliare di lattatodeidrogenasi (LDH) e di fosfatasi alcalina (ALP) espresso come UI/L. L'aumento della escrezione degli enzimi LDH e ALP e la diminuzione del contenuto di calcio rappresentano un indice della epatotossicità indotta dal TCDCA. Tutti i composti di formula I sono stati in grado di prevenire il danno epatico indotto dal composto tossico quando sono stati coinfusi per via endovenosa con il composto tossico ad una dose equimolare (8 //moli/min/Kg). Tutti i composti dell'invenzione, con la parziale eccezione di quelli degli esempi 6 e 8, sono risultati più potenti dei composti naturali come evidenziato dalla valutazione istochimica del danno cellulare e dal ridotto release biliare di LDH e ALP.

Il composto dell’esempio 1 è stato sottoposto a valutazione per quanto riguarda la sua efficacia nel ridurre le alterazioni istologiche e biochimiche indotte da colestasi in seguito a legatura del coledoco, come riportato da J.L. Poo in Gastroenterology 102. 1752-1759 (1992). Nella sottostante tabella 6 sono stati valutati parametri di tipo istologico, come il peso del fegato e la colangiofibrosi espressa sia come deposizione di fibre collagene che come proliferazione dei dotti biliari, e di tipo biochimico come la concentrazione della fosfatasi alcalina (ALP) e della lattatodeidrogenasi (LDH). Il peso del fegato è espresso in grammi/100 grammi di peso corporeo, la deposizione di fibre collagene è espressa come area in pixel, mentre la proliferazione dei dotti biliari, attraverso la colorazione delle sezioni e la valutazione dell' enzima yGT viene espressa per lettura indiretta della densità ottica (D.O.) e la fosfatasi alcalina e la lattatodeidrogenasi vengono espresse come UI/L

Il composto in esame ha mostrato per quanto riguarda il peso del fegato una diminuzione di questo parametro rispetto agli animali di controllo trattati con soluzione fisiologica con un valore simile a quello dell'UDCA. I risultati delle misure videocitometriche evidenziano una moderata diminuzione nella deposizione di fibre collagene e nella proliferazione dei dotti biliari da parte del composto dell'esempio 1 rispetto sia a UDCA che TUDCA. I trattamenti con UDCA, TUDCA e composto dell' esempio 1 hanno ridoto drasticamente la concentrazione piasmatica di ALP evidenziando per tutti i composti una simile capacità di limitare la severità del danno epatico. Infine solo il composto dell'esempio 1 si è mostrato in grado di ridurre i livelli plasmatici di LDH rispeto al gruppo non trattato e a quelli trattati con gli acidi biliari naturali. I dati chimico-fisici e biologici, riportati nella presente invenzione, depongono per un significativo miglioramento farmacologico dei composti riportati negli esempi rispetto agli analoghi naturali. Le modifiche strutturali introdote rendono le molecole più idrofile delTUDCA e con una analoga detergenza; tali proprietà sono atte a rendere la bile più idrofila e meno detergente rispetto a quella contenente acidi biliari naturali con il risultato finale di una ridotta tossicità di membrana. Le modifiche strutturali introdote hanno inoltre notevolmente aumentato la stabilità metabolica inducendo un duplice effeto positivo in quanto tutti i composti non vengono deconiugati in catena laterale e, conseguentemente, non 7-deossidrilati nell'anello steroidico. Tale effetto è di grande importanza sia per aumentare la emivita biologica di tali composti, sia per ridurre la formazione di metaboliti potenzialmente tossici come l'acido litocolico. Tutti i derivati manifestano un notevole effetto sulla secrezione lipidica biliare mantenendo una idonea secrezione di fosfolipidi e colesterolo. In particolare il composto dell'esempio 3 è in grado di ridurre selettivamente la secrezione del colesterolo con il risultato finale di una produzione di bile sottosatura di colesterolo e fortemente arricchita di fosfolipidi ed acidi biliari; in tali condizioni la bile ha una potenziale aumentata attività nella dissoluzione dei calcoli biliari di colesterolo. Le modifiche strutturali inoltre non hanno compromesso il trasporto sia intestinale che epatico; i composti dell'invenzione vengono assorbiti con un meccanismo attivo e passivo con parametri cinetici simili a quelli dei composti naturali. Infine molti composti si dimostrano attivi nel prevenire il danno epatico indotto da TCDCA a causa di un idoneo bilancio idrofobicoidrofilico della molecola associato ad un efficiente assorbimento e trasporto della molecola nel circolo enteroepatico. In conclusione i composti descritti sono risultati più attivi degli analoghi naturali sia nell 'inibizione della secrezione del colesterolo, e adatti quindi alla dissoluzione dei calcoli biliari, che nel trattamento delle epatopatie croniche colestatiche. Gli esempi di seguito riportati debbono essere considerati come una illustrazione della presente invenzione e non come una limitazione della medesima.

19,6 Grammi (50 mmoli) di acido ursodesossicolico (acido 3cc, 7B-diidrossi-5B-colan-24-oico) vengono sospesi in 300 mi di diossano anidro sotto atmosfera di gas inerte. Alla sospensione vengono addizionati 13,2 mi (55 mmoli) di tributilammina e la temperatura viene portata a 10°C; lentamente vengono poi addizionati 5,3 mi (55 mmoli) di etilcloroformiato sciolti in 10 mi di diossano. Dopo 30 minuti a temperatura di 10°C si sgocciola nella miscela di reazione una soluzione di 6,9 g (60 mmoli) di L-prolina sciolti in 25 mi di una soluzione acquosa al 10% (p/v) di idrossido di sodio. La miscela di reazione viene mantenuta sotto agitazione per 4 ore lasciando salire la temperatura fino a temperatura ambiente; la miscela di reazione viene quindi addizionata di 400 g di ghiaccio ed acidificata a pH 2 con una soluzione concentrata di acido cloridrico. Il precipitato bianco che si forma viene lasciato sotto agitazione per 30 minuti e successivamente filtrato e seccato sotto vuoto. Il prodotto grezzo (23,6 g) viene purificato per precipitazione frazionata del residuo di acido ursodesossicolico di partenza; dopo aver ridisciolto il grezzo di reazione in 20 mi di una soluzione acquosa di idrossido di sodio 2,5N si aggiunge lentamente una soluzione acquosa di acido cloridrico IN fino a pH 5,4. La sospensione viene lasciata riposare per 5 minuti e quindi il solido viene filtrato via mentre le acque di filtrazione vengono portate a pH 1,5 con una soluzione acquosa concentrata di acido cloridrico mantenendo la temperatura costante. La purezza del solido bianco che precipita (20,7 g) viene controllata in T.L.C. con eluente tetraidrofurano e rivelatore fosfomolibdato di cerio e ammonio nitrato; nel caso in cui la cromatografia riveli ancora presenza di UDCA la precipitazione frazionata viene ripetuta nelle stesse condizioni. H prodotto puro così ottenuto presenta le seguenti caratteristiche chimico-fisiche:

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ESEMPIO 2

Ν-Γ(3α. 5i. 7B)-3.7-Diidrossi-24-oxocolan-24-ill-4-(transl-idrossi-L·-prolina

Il prodotto grezzo viene ottenuto con lo stesso procedimento e nelle stesse condizioni descritte nella prova precedente (esempio 1) utilizzando 7,86 g (60 mmoli) di (trans)-4-idrossi-L-prolina al posto della L-prolina. Il prodotto grezzo (25 g) è stato purificato per cromatografia su colonna di gel di silice utilizzando come eluente tetraidrofurano distillato e acido acetico glaciale in rapporto 98:2 (v/v) ottenendo 22,8 g di prodotto puro avente le seguenti caratteristiche chimico-fisiche:

Il prodotto grezzo viene ottenuto con lo stesso procedimento e nelle stesse condizioni descritte nella prova dell'esempio 1 utilizzando 8,6 g (60 mmoli) di (trans)-4-metossi-L-prolina al posto della L-prolina. Il prodotto grezzo (20,2 g) è stato purificato 2 volte per cromatografia su colonna di gel di silice utilizzando prima come eluente tetraidrofurano distillato e successivamente la miscela tetraidrofurano distillato e acido acetico glaciale in rapporto 98:2 (v/v) ottenendo, dopo ricristallizzazione con etere etilico, 11,6 g di prodotto puro avente le seguenti caratteristiche chimico-fisiche:

Il prodotto grezzo viene ottenuto con lo stesso procedimento e nelle stesse condizioni descritte nella prova dell'esempio 1 utilizzando 6,9 g (60 mmoli) di D-prolina al posto della L-prolina. Il prodotto grezzo (21,2 g) è stato purificato 2 volte per cromatografia su colonna di gel di silice utilizzando prima come eluente tetraidrofurano distillato e successivamente la miscela tetraidrofurano distillato e acido acetico glaciale in rapporto 98:2 (v/v) ottenendo, dopo ricristallizzazione con etere etilico, 5,0 g di prodotto puro avente le seguenti caratteristiche chimico-fisiche:

Il prodotto grezzo viene ottenuto con lo stesso procedimento e nelle stesse condizioni descritte nella prova dell'esempio 1 utilizzando 6,9 g (60 mmoli) di D,L-prolina al posto della L-prolina. Il prodotto grezzo (20,1 g) è stato purificato 2 volte per cromatografia su colonna di gel di silice utilizzando prima come eluente tetraidrofurano distillato e successivamente la miscela tetraidrofurano distillato e acido acetico glaciale in rapporto 98:2 (v/v) ottenendo, dopo ricristallizzazione con etere etilico, 12,8 g di prodotto puro avente le seguenti caratteristiche chimico-fisiche:

Il prodotto grezzo viene ottenuto con lo stesso procedimento e nelle stesse condizioni descritte nella prova dell'esempio 1 utilizzando 7,75 g (60 mmoli) di acido D,L-pipecolinico al posto della L-prolina. Il prodotto grezzo (19,5 g) è stato purificato 2 volte per cromatografia su colonna di gel di silice utilizzando come eluente acetato di etile/metanolo/acido acetico in rapporto 88:10:2 (v/v), ottenendo 10,8 g di prodotto puro avente le seguenti caratteristiche chimico-fisiche:

ESEMPIO 7

Ν- (3α. 5α. 6 α. 7α)-3.6.7-Triidrossi-24-oxocolan-24-il1-L-prolina H prodotto grezzo viene ottenuto con lo stesso procedimento e nelle stesse condizioni descritte nella prova dell'esempio 1 utilizzando 20,4 g (50 mmoli) di acido iocolico al posto dell'acido ursodesossicolico. Il prodotto grezzo (15,0 g) è stato purificato per flash cromatografia su colonna di gel di silice utilizzando come eluente acetato d'etile/ metanolo/acido acetico in rapporto 8,5: 1:0,5 (v/v), ottenendo 8 g di prodotto puro avente le seguenti caratteristiche chimico-fisiche:

Il prodotto grezzo viene ottenuto con lo stesso procedimento e nelle stesse condizioni descritte nella prova dell'esempio 1 utilizzando 19,6 g (50 mmoli) di acido iodesossicolico al posto dell’acido ursodesossicolico. Il prodotto grezzo (24,9 g) è stato purificato per flash cromatografia su colonna di gel di silice, utilizzando come eluente acetato d'etile/ metanolo/acido acetico in rapporto 8,5: 1:0,5 (v/v), ottenendo 13 g di prodotto puro avente le seguenti caratteristiche chimico-fisiche:

1,96 Grammi (5 mmoli) di acido ursodesossicolico vengono sospesi in 30 mi di diossano anidro, sotto atmosfera di gas inerte, a questa sospensione vengono addizionati 1,32 mi (5,5 mmoli) di tributilammina e, dopo aver portato la temperatura della miscela di reazione a 10°C, si sgocciolano 0,53 mi (5,5 mmoli) di etilcloroformiato. La temperatura della reazione è mantenuta a 10°C per 1 ora; successivamente vengono addizionati 0,69 g (6 mmoli) di 4-(cis)-tioidrossi-L-prolina sciolti in 2,5 mi di una soluzione acquosa di idrossido di sodio al 10% (p/v) e si lascia la reazione a temperatura ambiente per una notte. Dopo aver portato a secco la miscela di reazione si aggiunge, alla temperatura di 0°C, una soluzione acquosa di acido cloridrico IN fino a pH 1 e si lascia omogeneizzare il precipitato che viene recuperato per filtrazione e seccato sotto vuoto con una resa dell' 82%. Il prodotto puro così ottenuto presenta le seguenti caratteristiche chimico-fisiche:

Claims

RIVENDICAZIONI 1) Ammidi degli acidi ursodesossicolico, iocolico e iodesossicolico con amminoacidi ciclici, terapeuticamente efficaci nel trattamento della calcolosi biliare da colesterolo e di tutte le patologie indotte da colestasi, di formula generale

e loro sali organici od inorganici farmacologicamente accettabili, in cui R1 rappresenta un atomo di idrogeno, oppure un gruppo ossidrile, solfidrile, (C1-C6-alchile, lineare o ramificato, (C1-C6)-alcossile, lineare o ramificato, o (C1-C6-tioalcossile, lineare o ramificato, n rappresenta un numero intero compreso tra 1 e 3, R2 rappresenta un atomo di idrogeno nel caso dell'acido ursodesossicolico o un gruppo ossidrile in posizione a nel caso degli acidi iocolico e iodesossicolico ed R3 rappresenta un atomo di idrogeno nel caso dell'acido iodesossicolico, un gruppo ossidrile in posizione a nel caso dell'acido iocolico ed in posizione β nel caso dell'acido ursodesossicolico.
2) Ammidi secondo la rivendicazione 1 caratterizzate dal fatto che gli amminoacidi ciclici sono scelti tra prolina, 4-(trans)-idrossiprolina, 4(trans)-tioidrossiprolina, 4-(trans)-metossiprolina e acido pipecolinico sia sotto forma racema che di singoli isomeri ottici.
3) Ammidi secondo ciascuna delle rivendicazioni 1 e 2 caratterizzate dal fatto che i sali organici sono i sali di trietilammina e di trietanolammina ed i sali inorganici sono i sali di sodio e di potassio.
4) Composto secondo la rivendicazione 2 che è la Ν-[(3α, 56, 7B)-3,7-diidrossi-24-oxocolan-24 -il] -L-prolina.
5) Composto secondo la rivendicazione 2 che è la N-[(3a, 56, 76)-3,7-diidrossi-24-oxocolan-24-il]-4- (trans) -idrossi-L-prolina .
6) Composto secondo la rivendicazione 2 che è la N-[(3a, 56, 78)-3,7-diidrossi-24-oxocolan-24-il]-4-(trans)-metossi-L-prolina.
7) Composto secondo la rivendicazione 2 che è la N-[(3cx, 58, 76)-3,7-diidrossi-24-oxocolan-24-il]-D-prolina.
8) Composto secondo la rivendicazione 2 che è la N-[(3a, 56, 76)-3,7-diidrossi-24-oxocolan-24-il] -D , L-prolina.
9) Composto secondo la rivendicazione 2 che è la 2-carbossi-N-[(3a, 56, 76)-3,7-diidrossi-24-oxocolan-24-il]-D,L-piperidina.
10) Composto secondo la rivendicazione 2 che è la Ν-[(3α, 5α, 6a, 7a)-3 , 6 , 7-triidrossi-24-oxocolan-24-il] -L-prolina.
11) Composto secondo la rivendicazione 2 che è la Ν-[(3α, 5a, 6a)-3,6-diidrossi-24-oxocolan-24-il]-L-prolina.
12) Composto secondo la rivendicazione 2 che è la N-[(3a, 58, 7B)-3,6-diidrossi-24-oxocolan-24-il]-4-(cis)-tioidrossi-L-prolina.
13) Processo per produrre le ammidi secondo la rivendicazione 1 che consiste nel far reagire in un solvente scelto tra eteri lineari e ciclici 1 equivalente molare dell'acido biliare con da 1 a 1,2 equivalenti molari di un cloroformiato alchilico in presenza di da 1 a 1,2 equivalenti molari di una base organica terziaria ad una temperatura compresa tra 0°C e 25°C per un periodo di tempo compreso tra 15 e 60 minuti, nel far reagire Γ anidride mista così ottenuta con da 1 a 1,5 equivalenti molari dell'opportuno amminoacido disciolto in una soluzione alcalina acquosa, contenente la quantità di base necessaria per salificare l'amminoacido, per un periodo di tempo compreso tra 2 e 24 ore a temperatura ambiente e nel purificare il prodotto grezzo così ottenuto per cromatografia su colonna di gel di silice o per precipitazione frazionata del residuo di acido biliare di partenza non reagito ed eventuale successiva ricristallizzazione.
14) Processo secondo la rivendicazione 13 caratterizzato dal fatto che il cloroformiato alchilico è cloroformiato di etile o di bufile e che la base organica terziaria è trietilammina o tributilammina.
15) Uso dei composti di formula I e dei loro sali organici od inorganici farmacologicamente accettabili nel trattamento della calcolosi biliare da colesterolo e di tutte le patologie indotte da colestasi.
16) Uso di composizioni farmaceutiche per via orale contenenti da 100 a 750 mg di un composto di formula I o di un suo sale organico od inorganico farmacologicamente accettabile nel trattamento della calcolosi biliare da colesterolo e di tutte le patologie indotte da colestasi.
17) Uso secondo la rivendicazione 16 caratterizzato dal fatto che le composizioni farmaceutiche sono scelte tra compresse, capsule, confetti e granulari.
18) Metodo per il trattamento della calcolosi biliare da colesterolo, dell'epatite cronica da colestasi, della cirrosi biliare primitiva e dell'epatopatia infantile associata a fibrosi cistica che consiste nel somministrare a pazienti affetti da dette patologie da 5 a 15 mg/Kg/die di un composto di formula I o di un suo sale organico od inorganico farmacologicamente accettabile.
19) Metodo per il trattamento della calcolosi biliare da colesterolo, dell'epatite cronica da colestasi, della cirrosi biliare primitiva e dell'epatopatia infantile associata a fibrosi cistica che consiste nel somministrare per via orale una o più volte al giorno a pazienti affetti da dette patologie composizioni farmaceutiche contenenti da 100 a 750 mg di un composto di formula I o di un suo sale organico od inorganico farmacologicamente accettabile.