IT9067703A1 - Peptidi sintetici contenenti sequenze di aminoacidi che definiscono epitopi immunoreattivi contro anticorpi umani anti hcv, utili per l'allestimento di dosaggi immunologici. - Google Patents
Peptidi sintetici contenenti sequenze di aminoacidi che definiscono epitopi immunoreattivi contro anticorpi umani anti hcv, utili per l'allestimento di dosaggi immunologici. Download PDFInfo
- Publication number
- IT9067703A1 IT9067703A1 IT067703A IT6770390A IT9067703A1 IT 9067703 A1 IT9067703 A1 IT 9067703A1 IT 067703 A IT067703 A IT 067703A IT 6770390 A IT6770390 A IT 6770390A IT 9067703 A1 IT9067703 A1 IT 9067703A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- synthetic peptide
- sequence
- amino acid
- hcv
- peptides
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 46
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 title description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 claims description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 16
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 4
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 4
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- QLPHBNRMJLFRGO-YDHSSHFGSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-n-[6-[3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoylamino]hexyl]pentanamide Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)NCCCCCCNC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 QLPHBNRMJLFRGO-YDHSSHFGSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010019791 Hepatitis post transfusion Diseases 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 2
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 2
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 102000036675 Myoglobin Human genes 0.000 description 1
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000219995 Wisteria Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 230000009833 antibody interaction Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N benzidine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C=C1 HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 125000006575 electron-withdrawing group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 125000005519 fluorenylmethyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000002952 polymeric resin Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 1
- 239000012048 reactive intermediate Substances 0.000 description 1
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 238000010517 secondary reaction Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000002653 sulfanylmethyl group Chemical group [H]SC([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 210000000623 ulna Anatomy 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "Peptidi sintetici contenenti sequenze di aminoacidi che definiscono epitopi immunoreattivi contro anticerpi umani anti HCV, utili per 1'allestintento di dosaggi immunologici".
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce a sequenze di aminoacidi disegnate in modo tale da ricostruire reagenti antigenici multiepitopici, sintetizzabili per via chimica ed utilizzabili per la messa a punto di dosaggi immunologici per la ricerca di ariticorpi.anti HCV.
Il campo di applicazione è la diagnostica dei marcatori sierologici di infezioni di tipo virale attraverso saggi immunologici di tipo isotopico (Radio-immunoassay , RIA) n non isotopico (Enzyme-immunoassay, EIA; Enzyme—linked—immunosorbent-assay, ELISA ; Fluorescent-immunoassay, FIA ; Chemiluminescent-immunoassay , CLIA ecc.',) per la ricerca degli. anticorpi specifici anti antigeni virali. T..1 prodotta che incorpora l'invenzione è un corredo di reagenti, spesso 'denominato con il. termine "kit", che consente l'esecuzione presso l 'utilizzatore (tipicamente, ma non esclusivamente, il laboratorio analisi privato o ospedaliero) di un prefissato numero di analisi. Uno di tali reagenti, quello fondamentale, e' basato su una preparazione di antigeni virali specifici, di cui il presente brevetto rivendica la composizione.
Con il termine "Epatite non-A, non-B (NANBH) viene indicato un insieme di patologie causate da fattori con tropismo epatico, i quali non risultano correlati dal punto di vista sierologico ne' al virus dell'epatite virale di tipo A (HAV), ne' al virus dell'epatite virale di tipo B <HBV). In tale contesto, assume particolare rilievo .l'epatite non-A, non-B post-trasfusionale (PT-NANBH), i.1 cui principale veicolo di trasmissione e' rappresentato dalla trafusione sanguigna.
L'epatite post-trasfusionale e' senza dubbio la meglio caratterizzata tra le diversi epatiti non-A, ηοη-Bs Feinstone ed altri (1) hanno osservato che l'agente eziologico della PT-NANBH e' sensibile al cloroformio, facendo ritenere che la particella virale contiene lipidi essenziali per il virus ed hanno inoltre osservato che induce nel fegato degli scimpanzè' infettati, sperimentalmente ultrastrutture citoplasmatiche caratteristiche .
Piu' recentemente Houghton e coll. (2). in collaborazione con il Prof. Bradley del C.D.C. di Atlanta, a partire dal fegato di uno scimpanzè' infettato hanno ottenuto e clonato un cDNA nel fago Lambda gt-11, creando una genoteca di espressione. Tale genoteca e' stata analizzata con un siero classificato come portatore di anticorpi anti PT-NANBH, riuscendo ad isolare una placca fagica reattiva. Il cDNA contenuto nella placca reattiva e' stato sequenziato ed utilizzato come sonda per individuare altre placche contenenti le sequenze ad esso sovrapponentesi. In questo modo iterativo sono state sequenziale circa 8000 bp, ed e' risultato che le proteine virali erano codificate da un singola registro di lettura. Tale osservazione, unita alla comparazioni della sequenza con altre sequenze note dalla letteratura, ha assegnato l'agente eziologico della PT-NANBH alla famiglia dei flavivirus, anche se per una completa definizione tassonomica e' necessario disporre della completa analisi aminoacidica. A tale entità virale 'e stato assegnato il nome di virus dell'Epatite virale di tipo C (HCV).
Inoltre, un segmento comprendente la placca reattiva unito a sequenze fiancheggienti e' stato clonato in vettori, d'espressione e la proteina espressa (proteina C-100) si e' rivelata in grado, in un saggio ELISA per la ricerca degli anticorpi anti C-100, di identificare l'80 %. dei sieri da pazienti cronici ed il 15 % dei sieri, da pazienti, in fase acuta per infezione da PT—NANBH (3).
Recentemente J.S. Kim ed altri (4) hanno osservato, dopo aver ottenuto un'altra genoteca di cDNA a partire da sieri di pazienti NANBH, che un frammento di cDNA diverso dal C100, espresso .in un opportuno vettore di espresssione, manifestava un profilo di immunoreattivita analogo al C 100 (717. di positività' nei sieri umani e B37- nei sieri di scimpanzè' con PT-NANBH cronica). Questi risultati hanno dimostrato che antigeni di HCV-non strutturali esterni alla regione C-100 possono rappresentare marcatori potenzialmente utili per scopi diagnostici, anche se la regione clonata non sembrava fornire informazioni diagnostiche piu' utili, ne' in termini di sensibilità', ne' in termini di specificità', rispetto alla proteina C-100.
Al contrario, M. Maeno e T. Shikata (5), hanno ottenuto un cDNA, a partire da'plasmi giapponesi, associato alla PT-NANBH: un segmento genico di tale cDNA e' stato clonato, espresso, e il prodotto genico (Proteina C8-H) confrontato in ELISA con .la proteina C-100.
Mentre la proteina C.B-2 non evidenzia sostanziali differenze rispetto al C-100 per quanto riguarda l'analisi dei sieri da pazienti cronici, valutando le risposte da individui con valori di ALT elevati, si osservano alcuni casi in cui compaiono anticorpi anti C-100 e viceversa, come se ai diversi stadi dell'infezione da PT-NANBH o da HCV possano essere associate risposte anticorpali contro epitopi. diversi delle proteine virali.
I limiti dei reagenti ad oggi utilizzati per la ricerca di anticorpi specifici nei campioni di plasma/siero umano contaminato da virus HCV risiedono quindi:
a. nella povertà,di epitopi immunoreattivi residenti nella/nelle sequenze note, ed utilizzate come reagenti antigenici: ciò' e' causa della scarsa sensibilità' dei metodi finora sviluppati
b. nella presenza in tali reagenti di sequenze non specifiche, causa probabile della elevata percentuale d.i false positività' riscontrate a carico dei test disponibili.
L'invenzione risolve il problema relativo alla disponibilità' ed ac.cessibilita’ di piu' epitopi specificamente immunoreattivi in un polipeptide a struttura chimica definita e fornisce un reagente idoneo a sviluppare e produrre test immunologici di prestazioni (sensibilità / specificità, valore predittivo) superiori a quanto finora descritto. L'invenzione ha comportato;
a. Identificazione di sequenze potenzialmente epitopiche all'interno dei polipeptidi ricombinanti noti di HCV, attraverso l'utilizzo di criteri per la predizione dei siti potenzialmente antigenici di una proteina quali l'esposizione sulla superficie, la conformazione e l'immunegenicita'.
b. Creazione di sequenze epitopiche “miste" attraverso accoppiamento delle sequenze identificate. al punto a all'interno di peptidi sintetici che ne rappresentano la somma, essendo compreso nei peptidi stessi un numero variabile da 1 a 5 di Glicine, utilizzate come sequenza spaziatrice inerte tra le sequenze dei singoli epitopi.
c. Accoppiamento alle sequenze identificate in a. e b. di strutture proteiche “rigide", quali alfa eliche e piani beta che piu' verosimilmente costituiscono il "core" interno' di una proteina e quindi non sono in grado di originare attività immunolog ica di tipo B (6) e quindi non reattive con la popolazione anticorpale circolante nell'uomo; c.io' allo scopo di esporre la sequenza epitopica e predisporla all'interazione anticorpale. Dal momento che un peptide di ridotte dimensioni può' assumere molte conformazioni , alcune delle quali mimano quelle assunte dalla proteina nativa, e' stato deciso di inserire i potenziali determinanti antigenici in sequenze ami noacidiche a struttura secondaria nota e caratterizzate da un alto grado di rigidità' in modo da ridurre il numero dei possibili conformeri. Sono risultate particolarmente idonee a questo scopo strutture ad alfa-elica derivate da proteine strutturate umane quali cheratina mioglobina ecc. .
Tra le varie ipotesi e' risultato preferibile utilizzare la sequenza 124-145 e 171-191 della cheratina umana di 56 kD di tipo 2 del citoscheletro. Il risultato degli accoppiamenti e' stato analizzato attraverso la predizione della struttura secondaria.
d. Studio di'metodologie di immobilizzazione dei polipeptidi su supporti insolubili utilizzabili nel dosaggio immunelogico, sia di tipo idrofobico, sia comportanti modifiche chimiche alla sequenza allo scopo di introdurre gruppi reattivi utili per l'ancoraggio orientato del reagente alla fase solida. Quest'ultimo caso pub essere realizzato attraverso biotinilazione di residui aminoacidici specifici addizionati alle sequenze originali Lad esempio dl cisteine via Biotina-HPDP (7) e successiva interazione con avidina e/o sptreptavidina preimmobilizzata in fase solida oppure utilizzazione di reagenti chimici bifunzionali (es: succinimidii 3-<2-piridil-ditio> propionato o maleimmidohenzoil-N-idrossisuccinimmide estere) per legare il polipeptide a gruppi funzionali reattivi già presenti o appositamente introdotti sul supporto.
Costituiscono quindi un oggetto dell'invenzione peptidi sintetici quali definiti nelle rivendicazioni che seguono.
Le sequenze datate di alta attività immunologica preferite sono .le seguenti:
L e sequenze da 19 a 27 alle quali si aggiunge YS LA
.A LA
I peptidi sintetici corrispondenti alle sequenze sopra descritte possono essere sintetizzati con il metodo della sintesi in fase solida, dovuto a Merrifield (8), che consiste nell'uso di un supporto solido costituito da particelle di resinapolimerica (stirene/divinilbenzene 1%) opportunamente funzionalizzate in modo da poter legare covalentemente la catena aminoacidica in formazione. Una volta ancorato, con formazione di un estere, l'amino acido in posizione C-terminale, i termini successivi vengono legati al precedente mediante un legame ammldico fra il gruppo NH2 in x dell'aminoacido gia' introdotto in catena ed il carbossile di quello da introdurre, attivato da un gruppo elettronattrattore. Gli aminoacidi utilizzati presentano inizialmente i gruppi.NH2 in x bloccati con opportuni gruppi proteggenti, per cui e' necessaria la loro deprotezione per consentire la formazione del legame: tali operazioni di deprotezione e di attacco vengono ripetute fino ad ottenere la sequenza programmata. L'utilizzazione di gruppi fluorenilmetilossicarbonilici (Fmoc), labili in piperidina, come proteggenti dei gruppi NH2 in x, e l'uso di una resinai p-idrossimetilfenossiacetica (HMP) il cui legame con il peptide sia particolarmente labile al trattammento con acidi, permette di poter lavorare in condizioni .sufficientemente blande, evitanda tutta una serie di reazioni secondarie possibili, invece, nel caso in cui i gruppi proteggenti in NH2-x siano dei t-butilossicarbonilini (BOC), labili in ambiente acido. Il successo della sintesi peptidica dipende essenzialmente dalla rimozione selettiva dei gruppi proteggenti: il gruppo proteggente in x-NHS deve essere rimosso prima della sua acilazione, ma nel processo di deprotezione le funzioni in catena laterale devono rimanere bloccate per evitare l'acilazione sui gruppi funzionali nucleofili. Una volta ottenuta la sequenza desiderata sara' possibile, in fase di deprotezione finale, staccare il peptide dalla resina e contemporaneamente deproteggere i- vari gruppi funzionali in catena .laterale.
Le applicazioni,dell'invenzione sono:
a. preparazione di reagenti per dosaggio degli anticorpi totali e/o classe specifici (ad es. IgM) anti HGV in fluidi biologici umani, attraverso metodiche immunoanalitico di tipo competitivo e/o immunometrico che utilizzano traccianti isotopici e non isotopici.
ti.Preparazione di matrici per cromatografia di affinità per la purificazione di anticorpi poli e monoclonaii umani e murini anti HCV.
c. Preparasione di immunogeni per la preparazione di antisieri e di anticarpi monaclonali.
I peptidi sintetici corrispondenti alle sequenze sopra descritte possono essere utilizzati per "sensibilizzare" cioè ricoprire con quantità calibrate di reagente supporti solidi solitamente impiegati nel dosaggio immunologico, quali miero e macrosfere, piastre per microtitolazione e provette in materiali plastici quali polistirene, polipropilene, nylon ecc... Tali supporti solidi, resi antigenicarnente attivi e cioè in grado di legare specificamente i rispettivi anticorpi, sono utilizzabili in diversi schemi analitici già sperimentati. per la ricerca degli anticorpi. specifici circolanti nel siero o in altri fluidi biologici di pazienti con infezioni acute, croniche e/o pregresse da agenti virali o batterici.
Tipiche applicazioni,di tali metodi si riscontrano nei cosiddetti metodi ELISA indiretti per la ricerca degli anticorpi totali, e nei metodi J.RMA o IEMA "a cattura''per la ricerca degli anticerpi di classe IgM.
Saggi immunologici che utilizzano i petiipeptidi quali reagenti antigeni e corredi per la ricerca di anticorpi anti HCV comprendenti detti polipeptidi in un idoneo contenitore costituiscono un ulteriore oggetto dell'invenzione.
Esempio 1 : sintesi e immobilizzazione su un supporto insolubile di.saggio del peptide corrispon¬
Sintesi in fase solida :
E' preferibile scegliere la combinazione ortogonale data da gruppi Fmoc in NH2- x e gruppi labili in ambiente acido a protezione -delle-.catene laterali. In tal modo, lavorando con una resina HMP, e' possibile distaccare il peptide dalla resina e deproteggere le catene laterali per semplice trattamento con acido trifluoroacetico. Gli intermedi reattivi al carbossile da utilizzare sono gli N-tdrossibenzotriazolo-esteri che, rispetto alle corrispondenti anidridi simmetriche, hanno il vantaggio di presentare lina maggiore solubilità . I gruppi proteggenti in catena laterale sono dati dal t-butile per GLU, ASP e SER, dal t-Boc per LYS e dal tritile per HIS. Il problema dato dalla protezione del gruppo guanidinico dell'ARG e' risolto utilizzando il pentametilcromansulfonile , (facilmente deproteggibile con acido tritiuoroacetito .
La deprotezione delle catene laterali ed il distacco del peptide dalla resina sono ottenuti mediante trattamento con acido trifluoroacetico in presenza di tioanisolo ed etanditiolo con funzione di scavengers.
Il grezzo di reazione viene quindi lavato piu' volte con eterer estratto in soluzione acquosa e successivamente purificato mediante HPLC utilizzando una colonna C1Q a fase inversa. Il prodotto purificato viene concentrato, liofilizzato e controllato mediante analisi aminoacidica.
Immobilizzazione del peptide su superfici funzionalizzate mediante reagenti, eterobifunzionali.s
Il peptide sopra citato può' essere immobilizzato su piastre da microtitolazione di polistirene funzionaiizzato con gruppi ammanici secondari (Covalink, NUNC), dove il numero di gruppi funzionali disponibili e spaziati di 2 nm dalla superficie della piastra e' di circa 1014/cm2. Il peptide può' essere legato alla piastra tramite .il reagente eterohifunzionale N-succinimidi.l 3-(2-piridildltio) propionato (SPDP), .in grado di reagire prima con il gruppo ammi.nico secondario che funzionalizza la piastra ed in un secondo momento con il gruppo tioli.co della catena laterale della cisteina (9).
Con la formazione di tale legame covalente è possibile orientare in modo definito il peptide immobilizzato sulla piastra, contrariamente a quanto si ha con il semplice adsorbimento.
Esempio E : metodo ELISA per la ricerca degli anticorpi totali anti HCV:
Triton, 0.01% Mertiolato d. Soluzione di Tetrametri ’Benzidina 0.01% in 0.005% H20H
e. Soluzione.di H2S04 2N.
f. Siero umano negativo per anticerpi anti HBV, anti HAV, anti HCV, anti HIV (controllo negativo) g. Siero umano positivo per anticorpi anti HCV (controllo positivo)
h. IgG di capra anti immunoglobuline limane coniugate al-1'enzima Perossidasi di Rafano (HRP). i. Pannello di sieri umani selezionati per reattività' anti HCV (negativi, positivi e potenziali interferenti, avente la composizione qui di seguito indicata.
Caratteristiche generali;
Panel composto da campioni dosati con kit Ortho, comprendente 260 campioni negativi e 80 campioni positivi per anti-HCV, codificati, ripartiti in aliquote da 0.1 mi.
Formazione del Panel:
Negativi: 50 sieri di B.lood Donors negativi per HBsftg, anti-HIV, anti-HBc, anti-HCV e con valori di ALT normali.
50 sieri, di Blood Donors negativi per HBsAg, anti-HIV, anti-HCV, con valori di ALT normali e positivi per anti-HBc.
50 sieri di Blood Donors negativi per HBsAg, anti-HIV, anti-HBc, anti-HCV e con valori d.i ALT .elevati-50 sieri di Blood Donors negativi per HBsAg, anti-HIV, anti-HCV, con valori di ALT elevati e positivi per anti-HBc.
HO sieri di pazienti con Epatite cronica (attiva o persistente) da HBV o HDV, risultanti negativi per anti-HCV
20 sieri di pazienti, con cirrosi epatiche non virali (alcolica, PBC, ecc) risultanti negativi per anti-HCV.
20 sieri di pazienti, con malattie autoimmuni (ANA, ASMA, RF, etc) risultanti negativi per anti-HCV. Positivi: 2.0 sieri, di Blood Donors negativi per HBsAg, anti-HIV, anti-HBc, positivi per anti-HCV con reattivita a livelli, differenti (bassa, media, alta) e con valori noti di ALT.
HO sieri di Blood Donors negativi per HBsAg, anti-HIV, positivi per anti-HBc e per ant.i-HCV con reattività' a livelli differenti (bassa, media, alta) e con valori noti di ALT.
HO sieri di pazienti con PTH acuta, classificata come NANB in base al principio di esclusione per assenza di T.gM anti-HBc, anti-HAV, anti-CMV ed anti-EBV.
20 sieri di pazienti con epatite cronica NANB classificata sulla base di dati sierologici (negatività' per HBsAg) e bioptici (assenza di HBcAg nei nuclei degli epatociti).
Metodo:
Sulle piastre di poiistirene funzionalizzato vengono fatte reagire, con il metodo descritto nell'esempio 1, concentrazioni variabili da 0.2. a 2 /ug/ml del peptide sintetico. I pozzetti vengono successivamente lavati per 5 volte con il tampone c.1 (0.25 ml/volta/pozzetto), essiccati e conservati a 40C sigillati in sacchetti di politene fino al momento dell'uso. Viene selezionata la concentrazione di peptide che consente la massima risposta ottenibile dal controllo positivo mantenendo la risposta dal controllo negativo al di sotto di 0.1 unita' di densità' ottica; tali esperienze vengono condotte con un saggio in cui i pozzetti sono incubati a 37 OC per 1 ora con 100 /ul di campionedi siero diluito 1/10 nel tampone c.2 ; durante tale incubazione gli anticorpi eventualmente presenti nel campione si legano al peptide .immobilizzato sul supporto insolubile. Al termine del1 'incubazione stessa i pozzetti vengono .lavati per 5 volte con il tampone c.3 ’<0.25 mi/volta/pozzetto) e ad ognuno vengono aggiunti 100 /ni di coniugato ,h. diluito in tampone ,c.4. Dopo 1 ora di incubazione a 37 OC durante la quale .1'anticorpo anti IgG umane coniugato all'enzima reagirà' c.on le immunoglobliline risultate legate al supporto dopo la prima incubazione, i pozzetti, vengono di nuovo lavati per 5 volte con i.1 tampone c.3 (0.25 mi/volta/ pozzetto). Segue l'aggiunta a ciascun pozzetto di 100 /ul di soluzione d. che è costituita da un substrato cromogenico specifico per l'enzima presente nel coniugato h.; lo sviluppo del colore eventualmente generatosi nei pozzetti viene arrestato, dopo 30 minuti di incubazione a temperatura ambiente, con l'aggiunta di 100 /ul di soluzione e. Le densità' ottiche differenziali (D.0.4-50 - D.0.630) delle soluzioni all'interno di ciascun pozzetto vengono misurate con un colorimetro del tipo ΒΙOΤΕΚ EL 311 e correlate in maniera diretta alla presenza nei campioni d.i anticorp.i reattivi con il peplide di fase solida.
Un lotto di piastre preparate con la concentrazione ottimale di peptide di 1 /ug/ml è stato utilizzato per analizzare, con il metodo sopra descritto, in paragone ad un test di riferimento (Elisa, ORTHO) e al RIPA (W.Blot, ORTHCJ), il pannello di riferimento i. ottenendo i risultati illustrati nella tabella qui di seguito riportata:.
ASP ARG GLU VAL LEU TYR ARG GLU PHE ASP GLU GLY GLY THR ARG HYS ASP SER PRO ASP ALA'ASP ALA GLN GLY ALA MET ASN LYS ALA LEU GLU LEU PHE ARG LYS ASP MET ALA SER ASN CYS
b. Piastre da microtitolasione (Nunc).
c. Tampone 1 : 50 mM Carbonato» pH 9.6
Tampone 2 10 mM Tris» pH 7.6» 17. BSA Tampone 3 10 mM PBS, pH 7.A, 507. siero di capra, 1% BSA, 0.017. Mertiolato Tampone A 10 mM PBS, pH 7.A, 0.057. Tween 20 d. Soluzione di Tetrametil Benzidina 0.017. in 0.0057. H202
e. Soluzione di H2S0A AN.
f. Siero umano negativo per anticorpi anti. HBV, ant.i HAV, anti HCV, anti H.T.V (controllo negativo) g. Siero umano positivo per anti,corpi anti HCV (controllo positivo)
h. .IgG di capra anti immunoglobuline umane coniugate al-l'enzima Perossidasi di Rafano (HRP).
i. Pannello di sieri umani selezionati per reattività anti HCV (negativi, positivi e potenziali interferenti, avente la composizione già' indicata in Esempio 2.
Metodo:
Sulle piastre di poiistirene vengono immobilizzate per adsorbimento idrofobico in tampone c.1T quantità' variabili di peptide, attraverso incubazione (125 /ul/pozzetto) per 18 ore a temperatura ambiente di soluzioni con concentrazioni variabili di peplide sintetico da 1 a 10 /ug/ml. J. pozzetti vengono successivamente lavati per 5 volte con il tampone c.2 (0.25 ml/volta/pozzetto ), essiccati e conservati a 40C sigillati in sacchetti di palitene fino al momento dell'uso. Viene selezionata la concentrazione di peptide che consente la massima risposta ottenibile dal controllo positivo mantenendo la risposta dal controllo negativo al di sotto di 0.1 unita' di densità' ottica. Tali esperienze vengono condotte con un saggio in cu.i i pozzetti sono incubati a 37 OC per 1 ora con 220 /ul di campione di siero diluito 1/10 nel tampone c.3 ; durante tale incubazione gli anticorpi eventualmente presenti nel campione si legano al peptide immobilizzata sul supporto insolubile. Al termine dell'incubazione stessa 1 pozzetti vengono lavati per 5 volte con il tampone c.A e ad ognuno vengono aggiunti 200 /ul di coniugato h. diluito in tampone c.3. Dopo 1 ora di incubazione a 37 "C durante la quale l'anticorpo anti IgG umane coniugato all'enzima reagirà' con le irumanoglobuiine risultate legate al supporto dopo la prima incubazione, i pozzetti vengono di nuovo lavati per 5 volte con il tampone c.4 (0.25 mi/voita/pozzetto). Segue l'aggiunta a ciascun pozzetto dì 200 /ul di soluzione d. che e' costituita da un substrato cromogenico specifico per l'enzima presente nel coniugato h.; lo sviluppo del colore eventualmente generatosi nei pozzetti viene arrestato,, dopo 30 minuti di incubazione a temperatura ambiente, con l'aggiunta di 50 /ul di soluzione e. Le densità' ottiche differenziali (D.0.450 — t).0.630) delle soluzioni all'interno di ciascun pozzetto vengono misurate con un colorimetro del tipo BIOTEK EL 311 e correlate in maniera diretta alla presenza nei campioni di anticorpi reattivi, con il peptide di. fase solida.
Un lotto di piastre-preparate can la concentrar zinne ottimale di "coating" pari a 5 /ug peptide/ml e' stato utilizzato per anali.zzare con il metodo sopra descritto, in paragone ad un test di riferimento (Elisa, ORTHQ) e al RIBA (W.Blot., ORTHO), il pannello di riferimento i ottenendo i risultati illustrati nella tabella qui di seguito riportata:
Tali risultati evidenziano che l'utilizzo del peptide aggetto dell'invenzione come reagente nel. test sopra dettagliato consente un miglioramento delle prestasioni analitiche rispetto ai saggi precedentemente descritti; la 'specificità risulta pari a 99.37. (in 1a analisi) e la sensibilità pari a 87.57. (in 3a analisi). L'efficienza del metodo risulta in prima analisi pari a 9A.77. (339/340), contro l'efficienza di 87.37. (397/340) calcolata per il test di riferimento. Specificità sensibilita' ed efficienza sono state calcolate secondo le formule illustrate nell'esempio 2.
Tali risultati, evidenziano che l'utilizzo del peptile oggetto dell'invenzione come reagente nel test sopra descritto consente una specificità (in prima analisi) del 97.3%, e ulna sensibilità (in seconda analisi) del 85%, calcolate secondo le formule qui di seguito riportate:
Veri positivi† Falsi negativi veri. L' efficienza del metodo in prima analisi risulta del per il nuovo test contro 1' efficienza del determinata per il kit di riferimento.
I1 calcolo dell' efficienza del sistema è stata eseguita applicando la seguente formula:
Esempio 3 : metodo ELISA per la ricerca degli cinticorpi totali anti HCV:
Materiali:
a. Pepti.de sintetico corrispondente alla sequenza
Claims (11)
- RIVENDI CAZIONI 1. Peptide «sintetico scelto del gruppo che consiste di:
- 2. Peptide sintetico costituito dall'accoppiamento di 2 qualsiasi, dei peptidi definiti nella rivendicazione Ir con interposizione tra le sequenze amminoacide di detti due peptidi di una sequenza spaziatrice di residui aminoacidici non antigenici, 3.
- Peptide sintetico secondo la rivendicazione 2, in cui detta sequenza-spaziatrice è nGLY dove n- è un intero da 1 a 5. A.
- Peptite sintetico secando la rivendicazione 2, avente struttura risultante dall'accoppiamento di uno qualsiasi dei peptidi 1) a 3) con uno qualsiasi dei peptidi A) a A) quali-definìtί nella rivendicazione 1 con l'interposizione tra i due peptidi della sequenza aminoacidic.a GLY-GLY,
- 5. Peptide sintetico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 2 a 4 in cui uno o più dei residui MET e CYS sono sostituiti rispettivamente e indipendentemente l'uno dall'altro con i residui LEU e ABU.
- 6. Peptide sintetico costituito da una sequenza aminoacidica quale definita .in una qualsiasi delle rivendicazioni 2 a 5 e avente a monte e a valle di detta sequenza'una sequenza aminoacidica con struttura ad alfa-elica derivata da una proteina strutturale umana.
- 7. Peptide sintetico secondo la rivendicazione 6, in cui la struttura d.i testa è .la sequenza:e in cui la struttura d.i coda è la sequenza:
- 8. Peptide sintetico avente struttura quale definita in una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 7 e avente in testa e/o in coda un residuo aminoacido CYS.
- 9 Peptide sintetica secondo una qualsiasi delie rivendicazioni 1 a 3 legato ad un sopporto solido.
- 10. Corredo per 1'analisi, di campioni per rivelare la presenza di anticorpi diretti contro antigeni HCV, comprendente un peplide.secondo una. qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 9.
- 11. Saggio immunolngico per la determinazione di anticerpi diretti contro un antigene HCV, comprendente l'operazione di incubare un campione sospettato di contenere anticorpi HCV con un peptide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 9 in condizioni tali da consentire la formazione di un complesso antigene-anti.corpo e rivelare la presenza di detto complesso.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IT67703A IT1241581B (it) | 1990-09-20 | 1990-09-20 | Peptidi sintetici contenenti sequenze di aminoacidi che definiscono epitopi immunoreattivi contro anticorpi umani anti hcv, utili per l'allestimento di dosaggi immunologici. |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IT67703A IT1241581B (it) | 1990-09-20 | 1990-09-20 | Peptidi sintetici contenenti sequenze di aminoacidi che definiscono epitopi immunoreattivi contro anticorpi umani anti hcv, utili per l'allestimento di dosaggi immunologici. |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
IT9067703A0 IT9067703A0 (it) | 1990-09-20 |
IT9067703A1 true IT9067703A1 (it) | 1992-03-20 |
IT1241581B IT1241581B (it) | 1994-01-18 |
Family
ID=11304639
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
IT67703A IT1241581B (it) | 1990-09-20 | 1990-09-20 | Peptidi sintetici contenenti sequenze di aminoacidi che definiscono epitopi immunoreattivi contro anticorpi umani anti hcv, utili per l'allestimento di dosaggi immunologici. |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
IT (1) | IT1241581B (it) |
-
1990
- 1990-09-20 IT IT67703A patent/IT1241581B/it active IP Right Grant
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IT1241581B (it) | 1994-01-18 |
IT9067703A0 (it) | 1990-09-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6596476B1 (en) | Hepatitis C assay | |
EP0445423B1 (en) | Hepatitis C assay | |
US6416946B1 (en) | Methods of typing hepatitis C virus and reagents for use therein | |
JP2778886B2 (ja) | C型肝炎ウィルスのコア抗原タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット | |
JP3219409B2 (ja) | C型肝炎アッセイ | |
US20060234214A1 (en) | Methods of detecting hepatitis C virus | |
IT9067703A1 (it) | Peptidi sintetici contenenti sequenze di aminoacidi che definiscono epitopi immunoreattivi contro anticorpi umani anti hcv, utili per l'allestimento di dosaggi immunologici. | |
EP0525910A1 (en) | Non-A, non-B peptide | |
US5670310A (en) | Methods and compositions for differential diagnosis of acute and chronic hepatitis c virus infection | |
US6103485A (en) | Non-A non-B hepatitis related nucleic acids proteins peptides antigens and antibodies | |
EP0536838A2 (en) | Non-A, non-B peptides | |
US20030152965A1 (en) | HCV core protein sequences | |
CA2172305A1 (en) | Multiple antigenic peptide comprising at least two hepatitis c virus-associated peptides | |
EP0488812B1 (en) | Non-A, non-B hepatitis related nucleic acids, antigens, antibodies and their detection reagents | |
JPH02273700A (ja) | ペプチド | |
WO1994013700A1 (en) | Peptides from the c33 region of hcv, antibodies thereto and methods for the detection of hcv | |
WO1993011158A2 (en) | Non-a, non-b peptides | |
JPH0797398A (ja) | C型肝炎用検査薬およびc型肝炎ウイルス抗原ペプチド | |
JPH0656891A (ja) | Hcv非構造領域のペプチド | |
CA2162250C (en) | Methods of typing hepatitis c virus and reagents for use therein | |
EP0500236A1 (en) | Non-A, non-B hepatitis related nucleic acids, antigens, antibodies and their detection reagents | |
CA2151128A1 (en) | Hepatitis c virus (hcv) non-structural-3 peptides, antibodies thereto and methods for the detection of hcv | |
JPH03287069A (ja) | 測定試薬 | |
JPH05310786A (ja) | Hcvエンベロープ領域のペプチド | |
JPH04288097A (ja) | Hcv非構造領域のペプチド |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
0001 | Granted | ||
TA | Fee payment date (situation as of event date), data collected since 19931001 |
Effective date: 19950929 |