IT8224880A1 - METODO E REAGENTI PER L'USO DI β-GALATTOSIDASI COME MARCANTE IN IMMUNOCITOCHIMICA - Google Patents
METODO E REAGENTI PER L'USO DI β-GALATTOSIDASI COME MARCANTE IN IMMUNOCITOCHIMICA Download PDFInfo
- Publication number
- IT8224880A1 IT8224880A1 IT1982A24880A IT2488082A IT8224880A1 IT 8224880 A1 IT8224880 A1 IT 8224880A1 IT 1982A24880 A IT1982A24880 A IT 1982A24880A IT 2488082 A IT2488082 A IT 2488082A IT 8224880 A1 IT8224880 A1 IT 8224880A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- galactosidase
- specific
- reagent
- cytochemical
- immunoenzymatic
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 99
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 55
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims description 8
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 title description 3
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 title 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 title 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 57
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 57
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 57
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 27
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 claims description 15
- -1 indolyl - Chemical class 0.000 claims description 12
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 10
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims description 10
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 9
- 239000012992 electron transfer agent Substances 0.000 claims description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 7
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 7
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 claims description 5
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 claims description 5
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 claims description 5
- LHYQAEFVHIZFLR-UHFFFAOYSA-L 4-(4-diazonio-3-methoxyphenyl)-2-methoxybenzenediazonium;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=C([N+]#N)C(OC)=CC(C=2C=C(OC)C([N+]#N)=CC=2)=C1 LHYQAEFVHIZFLR-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 4
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 4
- JUQPZRLQQYSMEQ-UHFFFAOYSA-N CI Basic red 9 Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC=C1C(C=1C=CC(N)=CC=1)=C1C=CC(=[NH2+])C=C1 JUQPZRLQQYSMEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 3
- YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N ferricyanide Chemical compound [Fe+3].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 5-methylphenazinium methyl sulfate Chemical compound COS([O-])(=O)=O.C1=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C3)C3=NC2=C1 RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L nitro blue tetrazolium dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 239000000276 potassium ferrocyanide Substances 0.000 claims description 2
- XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N tetrapotassium;iron(2+);hexacyanide Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[Fe+2].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000006149 azo coupling reaction Methods 0.000 claims 4
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 claims 4
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims 1
- 150000002475 indoles Chemical class 0.000 claims 1
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 claims 1
- MUUHXGOJWVMBDY-UHFFFAOYSA-L tetrazolium blue Chemical compound [Cl-].[Cl-].COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 MUUHXGOJWVMBDY-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 42
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 28
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 26
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 26
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 20
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 20
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 19
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 101000635854 Homo sapiens Myoglobin Proteins 0.000 description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 7
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 7
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Substances N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 7
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 7
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 101500028775 Homo sapiens Glucagon Proteins 0.000 description 6
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 6
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 6
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 6
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 6
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 229940023064 escherichia coli Drugs 0.000 description 6
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 6
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 101001018100 Homo sapiens Lysozyme C Proteins 0.000 description 5
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 5
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 235000015393 sodium molybdate Nutrition 0.000 description 5
- 239000011684 sodium molybdate Substances 0.000 description 5
- TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N sodium molybdate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 4
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- XMVONEAAOPAGAO-UHFFFAOYSA-N sodium tungstate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][W]([O-])(=O)=O XMVONEAAOPAGAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 2
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 2
- 230000001130 anti-lysozyme effect Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VCESGVLABVSDRO-UHFFFAOYSA-L 2-[4-[4-[3,5-bis(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-2-yl]-3-methoxyphenyl]-2-methoxyphenyl]-3,5-bis(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 VCESGVLABVSDRO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- CDIBHUYMESSNFP-UHFFFAOYSA-N 4-(4,4-diaminocyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)cyclohexa-2,5-diene-1,1-diamine Chemical compound C1=CC(N)(N)C=CC1=C1C=CC(N)(N)C=C1 CDIBHUYMESSNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000001976 Endocrine Gland Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000004641 Fetal Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010003471 Fetal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 101500024558 Homo sapiens Pancreatic icosapeptide Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006994 Precancerous Conditions Diseases 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000000571 coke Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 201000011523 endocrine gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000001589 lymphoproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
- C12Q2334/50—Indoles
- C12Q2334/52—5-Bromo-4-chloro-3-indolyl, i.e. BCI
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Descrizione dell?invenzione avente per titolo "METODO E REAGENTI PER L'USO DI ? -GALATTOSIDASI COKE MARCANTE IN IKMUNOCITOCHIMICA"
RIASSUNTO
La presente invenzione fornisce un metodo diagnostico di tipo immunocitochimico per l?identificazione di particolari antigeni su preparati istologici.
Secondo il metodo dell'invenzione il riconoscimento degli antigeni da rivelare viene effettuato, su fettine di tessuto sia congelate che incluse, mediante l?uso di anticorpi marcati con l'enzima ?-D-galattosidasi ed il successivo trattamento con un substrato precipitante di suddetto enzima.
I metodo dell?invenzione permette la rivelazione cromatica e il riconoscimento di particolari cellule ne l tessuto in esame mediante l?uso di reattivi stabili e di un comune microscopio ottico.
TESTO DELL'INV
La presente invenzione La. pei? oggetto un metodo c?tochimi co immunoenzimatico per l ' identificazione di antigeni in tessuti nel quale la ?-D-galattosidasi ? usata come marcante. .
L' invenzione comprende anche ireagenti per l?esecuzione di detto metodo.
Anti corpi marcati con enzimi e sostanze fluorescenti vengono comunemente usati in immunoistochimica per evidenziare la localizzazionedegU antigeni nei tessuti (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 47:200-202,1941; J.Immunol.
45:159-170, 1942; J. Exp. Med. 91:1-13? 1950; Arch.
Pathol. Lab. Med. 102:113-121, 1978; J. Clin. Pathol. 27:14-20, 1974).
Tuttavia, 1 'immunolocalizzazione per mezzo di enzimi h quisito recentemente maggiore diffusione poich? offre ai patologi alcuni vantaggi ben definiti rispetto all'immunofluorescenza. Questi vantaggi comprendono la maggiore stabilit?, il miglior contrasto e dettaglio dei preparati colorati , la stabilit? dei vetrini , la salvaguardia del tessuto circostante e , per la maggior parte degli antigeni , l ' impiego di materiale preparato con procedimenti standard!zzati di fissaggio ed inclusione per microscopia ottica.
A motivo di detti vantaggi, i metodi imrnunoenzimatici risultano essere metodi altamente sensibili e precisi,co fra.le tecniche immunoistochirniche, quelle isto? chimiche immunoenzimatiche sono oggi le pi? usate in patologia diagnostica. I metodi citochimici immunoenzimatici , in particolare istochimi ci , hanno fornito importanti infoimazioni in patologia renale , per esempio , nello studio di malattie batteriche e 'virali , nella fi siopatologia del si stema immunitario come pure della secrezione ormonale .
Inoltre sono stati evidenziati rivelatori specifici di determinate malattie e tipi di cellule ottenendo significative informazioni riguardo pila i stogenesi e differenzia zione di tumori .
Una grande quantit? di prodotti cellulari , fra cui enzimi, ormoni steroidei e polipeptidici, immunpglobuline, antigeni dello sviluppo oncogeno, antig?ni virali ed altre proteine cellulari, sono stati messi in evidenza in sezioni di tessuto congelate o sotto? poste convenzionalmente a tecniche di fissaggio ed inclusione, utilizzando le metodiche summenzionate.
Pi? estese applicazioni di questi metodi comprendono, per esempio, 1'evidenziazione di varie classi di immunoglobuline nei tumori di origine linforeticolare e nei processi linfoproliferativi atipici, l'identificazione di ormoni polipeptidici nei tumori endocrini e L'evidenziazione di vari rivelatori tumorali come L' antigene carcinoembz?onico e L??-fetoproteina in condizioni neoplastiche e preneoplastiche.
Un conciso sommario di alcune applicazioni delle teeniche immunoenzimatiche in istopatologia ? riportato in Human Pathology, 12, 590-596 (1981).
Vi sono elencati non meno di 70 possibili campi di applicazione.
La possibilit? di identificare in cellule e tessuti, routinariam ente fissati ed inclusi in paraffina, una grande variet? di segnalatori, alcuni dei quali specifici per una determinata malattia ed altri addirittura eziologici, offre al patologo nuovi criteri obiettivi di diagnosi al posto dei tradizionali parametri , spesso soggettivi, puramente morfologici. La perossidasi rappresenta normalmente l'enzima a pi? larga diffusione in immunocitochimica /Am. J. Clin. Pathol. 71_: 483-488, 1979/. Bench?, da una parte, quest'enzima offra vantaggi come notevole stabilit? , possibilit? di utili zzare un substrato insolubile ad alte defini zione e di formare catene costituite da strati multipli di anticorpi con tipi? di legami esclusivamente immunologici (ad es . il sistema perossidasi-antiperossidasi t PAP) , diversi svantaggi sono emersi durante l 'uso di tali metodi raggruppati sotto il temine comune di "immunoperos? sidasi " .
Perossidasi e pseudoperossidasi endogene sono presenti in alcuni tessuti e possono condurre a falsi risultati positivi ;? il substrato croniogeno pi? largamente usato : 3 , 3 ' , 4 , 4 '-diaminobenzidina tetracloridrato (DAB) possiede un ' elevata azione carcinogena [Registry of toxic effects of Chemi cal Substances -Ed . N IOSH - U. S . Dept . of Health and Human Services -Cincinnati - 1980/ e diventa sempre pi? diffi cile trovare in commercio un composto ad alto grado di purezza [j . Histochem . N. 28 , pagg. 191-192 ( 1980)7?. La soluzione usata per evidenziare la perossidasi e instabile e ; deve essere preparata soltanto pochi minuti prima dell'uso /Stenberger L.A.: Immunocytochemistry - 2nd Edition - John Wiley and Sons - New York -1979/.
Inoltre, il substrato croniogeno della perossidasi mostra una colorazione intensamente marrone
contro uno sfondo marrone chiaro,cosa che pone talvolta seri problemi nella determinazione del preparato e pu? portare a risultati positivi erronei. Sono stati proposti substrati altern ativi per perossidasi od altri enzimi come, per esempio, glucosio ossidasi e fosfatasi alcalina, ma sinora non sono stati ottenuti risultati paragonabili a quelli forniti dal sistema perossidasi DAB, specialmente perch? molti metodi portano alla formazione di composti croniogeni solubili nei solventi organici utilizzati per disidi-atare e purificare i preparati, oppure meno sensibili nel rivelare gli antigeni tissutali. Noi abbiamo trovato che l'impiego di ?-D-gals.ttosidasi come marcante permette di ovviare agli svantaggi comuni alle tecniche citochimiche immunoenzimatiche note,in particolare al metodo citochimico immunoperossidasico .
Conseguentemente, la presente invenzione ha per oggetto un metodo citochimico immunoenzimatico per L' identificazione di antigeni nei tessuti, particolarmente tessuti umani, caratterizzato dal fa,tto che l'enzima ?-D-galattosidasi viene impiegato'come marcante.
Secondo l'invenzione 1'identificazione degli antigeni nei tessuti si ottiene tramite la formazione di un prodotto insolubile e colorato generato per azione della ?-D-galattosidasi su uno specifico substrato croniogeno.
Pi? precisamente l'invenzione ha per oggetto un metodo per l'identificazione di antigeni in tessuti comprendente il legare l?enzima ?-D-galattosidasi all'antigene da identificare tramite qualsiasi possibile legante specifico ed il rivelare l'attivit? della?-D-galatto@idasi per mezzo della reazione con un specifico substrato in grado di fornire un prodotto.
insolubile e colorato per azione della ?-D-galattosidasi L ' enzima ?-D-galattosidc! si usato nel metodo dell ' invenzione pu? essere qualsiasi ?-h-galattosidasi di origine microbica, bench? esso sia , preferibilmente, ?-D-galattosidasi da Escheri chia coli .
Secondo l ? invenzione la ?-D-galattosidasi pu? essere legata all ' antigene da identifi care tramite qualsiasi tipo di legante specifico . In particolare , per esempio , qualsiasi tecnica di marcatura. o di coniuga zione gi? descritta per perossidasi nei metodi immunoperossidasici , pu? essere utilizzata per legare la ?-D-galattosidasi all * antigene da rivelare .
Secondo la tecnica preferita, detto antigene viene fatto reagire con un primo anticorpo specifico per l'antigene stesso e che, a sua volta., viene legato alla ?-D-galattosidasi o direttamente o tramite qualsiasi sistema di coniugazione in grado di
dare un coniugato con ?-D-galattosidasi.
Un opportuno coniugato con ?-D-galattosidasi pu? essere, in particolare, per esempio, un anti-anticorpo enzima-coniugato del tipo descritto, per esempio, in FE3S Lett. 95> 311 (1978) o in Am. J. Clin. Fathol.
71, 483 (1979) < oppure un sistema biotina-avidina enzima coniugato,in qualunque delle sue possibili configurazioni , per esempio del tipo riportato in
J. Histochem. Cytochem. voi. 27, n. 8, 1131 (1979).
Preferibilmente lo stadio della reazione,dell 'antigene da identificare con il primo anticorpo specifico per lhntigene stesso ed il successivo stadio o stadi che portano a stabilire un ponte fra detto specifico anti corpo e la ?-D-ga?attosidasi, vengono eseguiti consecutivamente .
Per evidenziare l'attivit? della ??D?galattosidasi, secondo il metodo dell'invenzione pu? essere usato qualsiasi substrato croniogeno che sia specifico per l'enzima ?-D-galattosidasi e che, in aggiunta, sia in grad? di fornire, per azione della ?-D-galattosidasi, un prodotto di reazione colorato<insolubile e stabile. Il prodotto che si origina da detto substrato cromogeno per azione della ?-D-galattosidasi, oltre'ad essere colorato e stabile, deve essere insolubile o nei solventi acquosi o nei solventi organici comunemente usati per trattare i tessuti in istologia, essendo preferibilmente insolubile in ambedue i tipi di solventi suddetti sia acquosi che organici.
Preferibilmente, il substrato croniogeno specifico per la 6-D-galattosidasi ? sol?bile negli stessi solventi. Questo substrato croniogeno con specificit? per la ?-D-gA tosidasi pu? essere qualsiasi derivato ?-D-galattosidico che, una volta scisso dall'enzima, sia in
grado di produrre una sostanza colorata, insolubile e stabile come sopra specificato.
Esempi di substrati croniogeni particolarmente utili secondo il metodo dell'invenzione sono, per esempio, alcuni derivati indolii- e naftil-?-D-galattosidici. Substrati particolarmente preferiti sono i derivati indolil-p-L-galattosidici e, fra questi, ? pi? particolarrnente preferito il 5-bromo-4-cloro-3-indolil--?-D-galattoside .
Fra i derivati naftil-?-D-galattosidipi il 6-bromo-2--naf til-?-D-galattoside ? uno dei preferiti.
Per evidenziare l'attivit? della ?-D-galattosidasi pu? essere talvolta necessario far reagire il substrato' croniogeno in presenza di imo o pi? reagenti addiziona?i che possono essere, per esempio, copulanti, ossidanti od agenti di trasferimento di elettroni.
Cos?, per esempio, quando si usa come substrato croniogeno un derivato naftil-?-D-galattosidico , per rivelare l'attivit? enzimatica si richiede la presenza di un opportuno azo-copulante il quale azo-copulante pu? anche essere opzionalmente presente nel reattivo dirivelazione,dell'attivit? allorch? si impiega un cromogeno indolil-?-D-galattosidico.
Azo-copulenti opportuni possono essere, per esempio, p-rosanilina esaazotata, Fast Blue VB, 33 e HR, Fast Gam et GBC e simili, essendo particolarmente preferita la p-rosanilina esaazotata.
Inoltre, per accelerare la reazione catalizzata dall' enzima, in particolare quando si usa un substrato indolil-?-D-galattosidico , nel mezzo di reazione pu? anche essere opzionalmente presente un ossidante od un agente di trasferimento di elettroni.
Agenti ossidanti o di trasferimento di elettroni possono essere, purch? appropriati, tutti quelli noti come agenti ossidanti o di trasferimento di elettroni in chimica organica ed inorganica,con preferenza generalmente per gli agenti inorganici.
Esempi di agenti ossidanti o di trasferimento di elettroni preferiti sono, in particolare, fenazina metosolfato, sali di tetrazolio oppure qualsiasi coppia ionica red-ox appropriata.
Un sale di tetrazolio opportuno pu? essere, per esempio, il cloruro di p-nitro-blu-tetrazolio oppure il cloruro di tetranitro-blu-tetrazolio.
Una coppia ionica red-ox opportuna pu? essere, per esempio, scelta nel gruppo delle coppie ioniche
, .
Coppie del tipo Fe /Fe , in particolare, possono essere fornite,e.g.,dai rispettivi cianuri complessi 0 sali solfato ; cianuri complessi sono preferibilmente f errocianuri/f erri cianuri alcalini , in parti colare potassio ferrocianuro/ferricianuro. Coppie Ce /Ce sono preferibilmente fornite dai rispettivi sali solfato le coppie anioniche sono fornite dai rispettivi?sali,pre feribilmente sali con.metalli alcalini o alcalino-terros Secondo il metodo dell'invenzione i campioni di tessuto possono essere preparati mediante qualsiasi procedura nota, e.,g.. procedimenti di fissaggio, inclusione e congelamento comunemente usati in istochimica.
Per esempio , tessuti fi ssati con formalina ed ind?si in paraffina possono essere esaminati molto facilmente col metodo dell'invenzione,
l'esame dei campioni pu? essere eseguito con ogni normale microscopio ottico con ingrandimenti di
20-800 volte.
l'impiego dell'enzima ?-D-galattosidasi e di opportuni substrati cromogeni specifici permette di ovviare, come gi? detto, agli svantaggi che si incontrano impiegando, e.g.;perossidasi.
In pai-ticolere, per esempio, i problemi causati dalla presenza nei campioni di tessuto di perossidasi e pseudoperossidasi endogene , che, come anche detto precedentemente , costituiscono una grande limitazione dei metodi immunoistochimici perossidasici, vengo- \ no ovviati nel metodo dell'invenzione sia perch? 1' enzima ?-D-galattosidasi ? normalmente assente
dai tessuti umani, sia perch?, in ogni caso, il campo di pH per l'attivit? della ?-D-galattosidasi umana ? completamente differente dal campo di pH per 1' attivit? della ?-D-galattosidasi microbica usata nel metodo dell'invenzione; il range di pH per l'attivit? della ?-D-galattosidasi umana ? circa 5,5-6 mentre e.g., il range di pH di attivit? della ?-D-galattosidasi dell?Escherichia coli ? circa 7,0-7,5.
Inoltre la ?-D-galattosidasi viene inattivata in meno di un minuto a circa 55?G /The Enzymes i9602nd Ed. pagg. 409-430 Voi. 4 Ed.: P.D. BOYER, H. LAKDY, K.
IiYRBACK, Academic Press - New York/ la quale ? una temperatura che si raggiunge normalmente durante i * convenzionali procedimenti di inclusione.
Grazie all'assenza di interferenza da parte di ?-D--galattosidasi endogene, i.problemi della colorazione di fondo che insorgono con le perossidasi comunemente impiegate a motivo dell'attivit? .perossidasi--simile nei tessuti, non si incontrano con la ?-D-galattosidasi .
La ?-D-galattosidasi microbica non produce colorazione di fondo nei tessuti dei mammiferi e reagisce con i substrati croniogeni disponibili creando profili morfologici altamente contrastati e caratteristici. Le colorazioni ottenute sono assai meglio definite e distinte di quelle usualmente ottenibili con le tecniche perossidasiche anche in vista del fatto che la maggior parte dei substrati cromogeniutilizzati per la ?-D-galattosidasi permette di ottenere un fondo quasi totalmente incolore. Ne consegue che la visualizzazione ed il riconoscimento dei siti di immunoreattivit? specifica sono grandemente facilitati.
Ci? implica una aumentata sensibilit? per il metodo con ?-D-galattosidasi oggetto dell'invenzione e lo rende specialmente utile per l'esame di tessuti con lesioni emorragiche od infiammatorie.
In aggiunta, i reattivi usati per le reazioni istologiche della.?-D-galattosidasi in particolare^per esempio, i cromogeni indolii ?-D-galattosidici preferibilmente usati/non sono conosciuti come carcinogeni a differenza della diaminobenzidina, substrato ad elevato contrasto largamente usato per la colorazione della perossidasi.
Inoltre, i reagenti usati per eseguire il metodo dell'invenzione sono stabili e producono sezioni che sono esse pure permanentemente stabili e che richiedono l?uso di un semplice microscopio ottico normale. Grazie ai vantaggi brevemente riportati sopra, il metodo ?-D-galattosidasi-immunocitochimico dell'invenzione ? dotato di un elevatissimo grado di precisione e sensibilit?, che sta alla pari almeno con quello delle tecniche perossibasiche, mentre, nello stesso tempo, ? privo degli svantaggi che caratterizzano queste ultime tecniche.
A motivo dell?ele\?ata sensibilit?, il metodo dell? invenzione permette di raggiungere risultati ottimali anche nella localizzazione di antigenisu materiali fissati ed inclusi routinariamente nei quali l?antigenicita residua e soltanto una frazione di quella del tessuto congelato.
Bench? con il metodo dell?invenzione nonsia di norma necessario un pretrattamento dei campioni di tessuto, tuttavia, allo scopo di aumentare ulteriormente la sensibilit? della tecnica, un pretrattamento, e.g. secondo Heydermann / J. Clin. Pathol. 3_2, 971-378 (1979)7? essere talvolta utile per eliminare possibili leggere interferenze delle perossidasi endogene e/o del ferro tissutale.
Il metodo dell'invenzione permette di identificare una grande variet? di prodotti cellulari e, in particolare, un grande numero di rivelatori , molti dei quali specifici per determinate malattie ed alcuni addirittura eziologici, i quali prodotti cellulari e rivelatori possono essere, per esempio, quelli previamente indicati in questa domanda di brevetto. L'invenzione fornisce anche reagenti per la realizzazione del metodo ? -D-galattosidasi?immunoistochimico descritto sopra.
Un reagente pu? essere sia
1) un reagente specifico comprendente, come componenti essenziali, a) un anticorpo specifico per l'antigene da identificare, b) ? -D-galattosidasi o un ?-D-galattosidasi coniugato e c) un substrato cormogeno specifico per ?-D-galattosidasi e in grado di produrre un composto insolubile e colorato per azione della ?-D-galattosidasi; sia 2) un reagente comprendente, come componenti essenziali, a') un anti-anticorpo coniugato con ?-D -galattosidasi e b') un substrato croniogeno specifico per la ?-D-galattosidasi e in grado di produrre un composto insolubile e colorato per azione della ?-D-galattosidasi .
Ovviamente un reagente del tipo-indicato al punto 1) ? utile soltanto per la identificazione di quel particolare antigene che ? riconoscibile dall*anticorpo del componente a), specifico per l'antigene stesso. Al contrario, un reagente del tipo indicato al punto 2) ? adatto per la identificazione di qualsiasi antigene. Infatti 1'anti-anticorpo?coniugato con ? -D--galattosidasi nel componente a?) ? tale da riconoscere indistintamente qualsiasi anticorpo specifico per l'antigene da identificare purch? quest*ultimo anticorpo sia originato in una specie rispetto alla quale l'anti-anticorpo del componente a') ? "anti". Conseguentemente l?anti-anticorpo del componente a') ? "specie-specifico " cio? ? specifico per la specie in cui l'anticorpo diretto all?antigene da identificare ? originato.
Cos?, per esempio, un anti-anticorpo che ? "anti-coniglio" (cio? 'anti' alla specie coniglio) ? in grado di riconoscere qualsiasi anticorpo originato in coniglio; un anti-anticorpo che ? "anti-capra" o "anti-pecora" ? in grado di riconoscere qualsiasi anticorpo originato in capra o, rispettivamente, in pecora e, analogamente, un anti-anticorpo che ? "anti-topo" ? in grado di riconoscere qualsiasi anticorpo originato in topo.
La presente invenzione fornisce perci? vari reagenti del tipo 2) sopra indicato i quali differiscono l'uno dall'altro per quanto concerne la "specie-specificit?". Tali reag?nti sono, ad esempio, un reagente coniglio specifico contenente un antisiero anticoniglio coniugato con ?-D-galattosidasi come componente a*)? un reagente capra-specifico (o pecora specifico) contenente un antisiero anti-capra (o anti-pecora) coniugato con ? -D-galattosidasi come componente a'); e un reagente topo-specifico contenente un antisiero anti-topo coniugato con ? -D-galattosidasi come componente a1).
Ciascun tipo di reagente 2) pu? essere usato per la identificazione di qualsiasi antigene, purch? come antic?rpo specifico per 1'antigene venga impiegato un ;anticorpo originato nella specie appropriata: questa specie sar?, ad esempio, il coniglio per un reagente coniglio-specifico, la capra o la pecora per un reagente capra- o pecora-specifico e il topo,per un reagente topo-specifico.
E' evidente ad ogni modo che, in qualsiasi caso, un anticorpo specifico per lfantigene da identificare, anche se non incluso nel reagente di tipo 2), deve essere sempre impiegato per poter rivelare l 'antigene.
Se desiderato., un anticorpo specifico per l'antigene da identificare o una serie di anticorpi specifici per una serie di antigeni da identificare possono essere separatamente forniti insieme con il reagente 2)..
Ciascuno dei reagenti di tipo 1) e 2) sopra descritti pu? addizionalmente contenere un certo numero di ulteriori componenti quali, per esempio, azo-copulanti, ossidanti o agenti di trasferimento di elettroni, e tamponi..
I vari componenti di ciascun reagente possono essere confezionati, sia insieme che separatamente, in una qualsiasi conveniente maniera che consenta il facile e rapido uso del reagente stesso..
In ciascun reagente le caratteristiche dei'vari componenti sono quelle precedentemente riportate nel descrivere il metodo dell'invenzione e i componenti preferiti sono pure gli stessi indicati come preferenziali nella precedente descrizione* -Cos?, per esempio, in una forma di realizzazione preferita, il reagente di tipo 1) comprende come componenti essenziali a) un anticorpo specifico per l'antigene da identificare, b) uno specifico ?-D-galattosidasi-coniugato, e c) un indolii-? -D-galattoside come substrato cromogeno.
In una forma di realizzazione preferita il reagente di tipo 2) comprende, come componenti essenziali,, a') un anti-anticorpo specie-specifico coniugato con ?-D -galattosidasi, e b') un indolil-?-D-galattosi-3e come substrato cromogeno.,
bella suddetta forma di realizzazione preferita del reagente 1) lo specifico ?-D-galattosidasi coniugato ?, preferibilmente, un anti-anticorpo coniugato con ? -D-galattosidasi o un sistema Biotina-Avidina coniugato com ?-D-galattosidasi..
Nella suddetta forma di realizzazione preferita del reagente 2) 1?anti-anticorpo specie-specifico coniugato,con ?-D-galattosidasi ?, preferibilmente, un anticorpo anti-coniglio coniugato, con ?-D-galattosidasi, o un anticorpo anti-capra o enti-pecora coniugato con ?-D-galattosidasi o un anticorpo anti--topo coniugato con ?-D-galattosidasi .
In entrambe le suddette forme di realizzazione preferite dei reagenti 1) e 2) il substrato cromogeno ind.olil-?-D-galattoside ?, preferibilmente, 5-bromo-4-cloro-3-indolil- ?-D -galattoside,
I seguenti esempi servono ad illustrare l'invenzione ma non la limitano in alcun modo.
Esempio 1
L'insulina umana nel pancreas umano fu identificata con la seguente procedura. Si utilizz? tessuto pancreatico umano fissato in formalina al 10% tamponata con tampone fosfato e incluso routinariamente in paraffina. Gli str ti sezionati di paraffina vennero immersi in fisiologic tamponata con tampone fosfato (PBS) a pH 7,2 e trattati per 5 minuti con H202 7,5>, indi per 5 minuti con acido periodico 2,28% ed alfine per 2 minuti con NaBH 0,002% ['j. Clin. Pathol. 32, 971-978 (1979)/. Dopo ?icimi lavaggi in PBS, le sezioni furono incubate?a 4?C per una notte con un antisiero di coniglio anti-h-insulina diluito 1/1000 con PBS.
Dopo lavaggio in PBS,anticorpi immunoglobulinici anti-coniglio prodotti in asini e coniugati
a ?-D-galattosidasi da Escherichia coli secondo il procedimento riportato in FEBS Letters 95, 311 (1978), dilui;?ti 1/30 in PBS contenente l'1% di siero suino normale,furonoaggiunti alle sezioni. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, i tessuti furono lavati in PBS e l'attivit? enzimatica rivelata con una soluzione otter?uta sciogliendo in PBS a pH 7,2:
Il trattamento con questa soluzione di rivelazione fu eseguito incubando per 1 ora a 37?C. Dopo lavaggio i nuclei vennero contrassegnati colorandoli con rosso neutro e le sezioni vennero disidratate e montate in Eukitt
I tessuti furono esaminati con un microscopio ottico (Leitz Orthoplan) a 200 ingrandimenti. I luoghi di reazione positiva apparivano intensamente colorati in blu. La colorazione positiva era molto evidente in quanto il fondo era incolore ed i nuclei apparivano colorati in .rosso. I risultati furono confrontati con quelli ottenuti negli stessi tessuti trattati con lo stesso antisiero anti-insulina e poi esaminati secondo la procedura perossidasica PAP /stem berger -J. Histochem. Cytochem. _18_, 315 (1970)/7. Il risultato con la procedura perossidasica fu una reazione positiva di intenso colore marrone. La;colorazione positiva era per? meno evidente e meno;nitida di quella ottenuta con il metodo ?-D-galattosidasico a causa della leggera colorazione marrone del fondo. Cos? il metodocon?-D-galattosidasi permette di ottenere risultati di colorazione molto migliori di quelli ottenuti con il procedimento perossidasico PAP.
Esempio 2
Impiegando il procedimento dell'esempio 1 ma sostituendo gli appropriati antisieri, tutti prodotti nel coniglio, all'antisiero anti-insulina, vennero identificati anche i seguenti antigeni:
caseina umana, in tessuto mammario umano; nntigenedi superficie di epatite 3 (HBsAg) in fegato umano ;
lisozima umano in intestino tenue umano;
mioglobina umana in muscolo scheletrico umano;
e
glucagone umano in pancreas umano.
Furono raggiunti risultati analoghi a quelli ottenuti nell 'esempio 1.
Esempio 3
La mioglobina umana nel muscolo scheletrico fu identificata con la seguente procedura. Si impieg? tessuto di muscolo scheletrico umano fissato in formalina'al 10% in tampone fosfato ed incluso secondo routine in paraffina. Le sezioni paraffiniche vennero portate in PBS ed incubate per una notte a 4?C con un anti siero anti-mioglobina di coniglio (Behringwerke) diluito 1/500 con PBS. Dopo lavaggio in PBS fu seguita la procedura dell'esempio 1 e furono ottenuti gli ? stessi risultati.
Procedendo analogamente ed impiegando gli antisieri opportuni furono identificati i seguenti antigeni: insulina umana in pancreas umano;
caseina umana in tessuto mammario umano;
antigene di superficiedi epatite B (HBsAg) in fegato umano ;
lisozima umano in intestino tenue umano;
glucagone umano in pancreas umano.
Esempio ?
L?antiviene ai superficie ?i epatite B (HBsAg) nel fegato umano fu identificato come segue. Fu impiegato tessuto di fegato umano fissato ed incluso come descritto nell'esempio 1. Si segu? la procedura dell'esempio 1 sostituendo all'antisiero anti-insulina.un antisiero di coniglio anti HBsAg (Behringwerke) diluito 1/500 con IBS.
Si us? inoltre una soluzione PBS di rivelazione come quella;impiegata nell'esempio 1 ma priva di potassio ferroc;Lanuro e di potassio ferricianuro. Con questa procedura si ottenne lo stesso tipo di risultato ottenuto'?nell'esempio 1.
Procedendo analogamente ma impiegando gli antisieri opportuni vennero identificati i seguenti antigeni: insulina umana in pancreas umano;
caseina umana in tessuto mammario umano;
lisozima umano in intestino tenue umano; mioglobina umana in muscolo scheletrico umano; glucagone umano in pancreas umano.
Esempio 5
PI lisozima umano nell'intestino tenue umano fu identificato con la seguente procedura. Si impieg? tessuto di intestino tenue umano fissato ed inglobato come descritto nell'esempio 1. Si segu? la procedura dell'esempio 1 sostituendo all'antisiero anti-insulina un antisiero di coniglio anti-lisozima (DAKO) diluito 1/500 con PBS ed usando come soluzione di rivelazione una soluzione di P3S a pH 7,2 contenente:
Furono raggiunti risultati analoghi a quelli ottenuti nell'esempio 1.
Procedendo analogamente ed impiegando gli antisieri opportuni furono identificati i seguenti antigeni: insulina umana in pancreas umano;
caseina umana in tessuto mammario umano;
antigene di superficie di epatite B (HBsAg) in fegato umano;
mioglobina umana in muscolo scheletrico umano; glucagone umano in pancreas umano.,
Esempio 6
La caseina rimana fu identificata in tessuto mammario umano con la seguente procedura. Fu usato tessuto mammario umano congelato. Vennero preparate delle sezioni di tessuto in criostato evennerotrattate come nell'esempio 1 utilizzando come sostituto dell'antisiero anti-insulina un antisiero di coniglio anti-caseina diluito 1/1000 in PBS.
Vennero conseguiti risultati analoghi a quelli ottenuti nell'esempio 1.
procedendo analogamente con tessuti congelati ed impiegando gli opportuni antisieri vennero identificati i seguenti antigeni:
insulina umana in pancreas umano;
antigene di superficie di epatite B (PIBsAg) in fegato umano;
lisozima umano!in intestino tenue umano; mioglobina umana in muscolo scheletrico umano; glucagone umano in pancreas umano.
Esempio 7
L?antigene di superficie di epatite B (HBsAg) in tessuto di fegato umano fu identificato come segue. Fu impiegato tessuto di fegato umano fissato ed incluso come descritto nell?esempio 1. Gli strati sezionati di paraffina vennero immersi in fisiologica tamponata con tampone fosfato (PBS) a pH 7,2.
Dopo lavaggio in PBS per 15 minuti le sezioni furono incubate a 37?C per 2 ore con antisiero di coniglio anti-HBsAg (soluzione 1:500 in PBS) e quindi lavate di nuovo con PBS. Le sezioni furono poi trattate con 50 ml di una soluzione in PBS contenente frammpn ti Fa di immunoglobuline di coniglio originate in asini (4,5.10<-6 >?M)? e coniugate con ?-D-galattosidasi da Escherichia Coli (1,5.10 6 pM) secondo la procedura riportata in FEBS Letters 95,311 (1978), e contenente l'lfc.di siero normale di asino.
Dopo 30 minuti a temperatura ambiente le sezioni furono lavate con PBS per 15 minuti, quindi una soluzione di rivelazione ottenuta sciogliendo in PBS a pH;7,2
fu applicata su di esse.
Dopo incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente e lavaggio con PBS i nuclei furono contrassegnati colorandoli con rosso neutro e le sezioni venne? ro disidratate e montate in Eukitt
I tessuti furono esaminati con un microscopio ottico /Leitz Orthoplan/ a 200 ingrandimenti. I luoghi di reazione positiva apparivano intensamente colorati in blu. La colorazione positiva era molto evidente in quanto il fondo era incolore ed i nuclei apparivano colorati in rosso. I risultati furono confrontati con quelli ottenuti negli stessi tessuti trattati con lo stesso antisiero anti-HBs4g e poi esaminati secondo la procedura perossidasica PAP secondo Stera berger (vedi citazione in esempio 1). Risultati analoghi a quelli descritti nell'esempioifurono osservati.
La stessa procedura dell'esempio 7 fu ripetuta usando una soluzione di rivelazione contenente sodio tetraborato (0,0015%) o, rispettivamente, sodio molibdato (0,0075%) invece del sodio tungstato.
Risultati analoghi a quelli descritti nell'esempio 1 furono osservati anche in questi casi.
Esempio 8
Per la identificazione istochimica dell'antigene di superficie di epatite B (HBsAg)-su 50 sezioni di tessuto epatico umano fu preparato un reagente contenente :
a) una soluzione 1:500 in PBS di antisiero di coniglio anti-HBsAg 2,5 mi;
b) una soluzione 1:100 in PBS di frammenti Fc di immunoglobuline di coniglio coniugate con ?-D-galattosidasi da Escherichia Coli : 2,5 ml; e c) un componente liofilizzato da disciogliersi prima dell'uso in acqua distillata a dare 2,5 ml di una soluzione acquosa della composizione seguente:
I componenti a), b) e c) del reagente furono usati secondo la procedura descritta nell'esempio 7.
Furono preparati reagenti analoghi aventi la stessa composizione sopra riportata ma in cui il componente c) conteneva lo 0,0015% di sodio tetraborato o, rispettivamente, lo 0,0075% di sodio molibdato, invece dello 0,0015% di sodio tungstato, le concentrazioni percentuali del sodio tetraborato e del sodio molibdato essendo sempre riferite a 2,5 ml di soluzione acquosa del liofilizzato,.
Anche detti reagenti furono impiegati per l?identificazione dell?antigene HBsAg nel tessuto epatico umano, secondo la procedura dell?esempio 7.
Esempio 9
Per l'identificazione istochimica di qualsiasi tipo di antigene su 50 sezioni di tessuto umano venne preparato un reagente coniglio-specifico contenente: a?) una soluzione 1:100 in PBS di frammenti Fa di imrnunoglobuline di coniglio coniugate con p~D? -galattosidasi da Escherichia Coli: 2,5 ml; e b') un componente liofilizzato da disciogliersi prima dell'uso in acqua distillata a dare 2,5 ml di una soluzione acquosa della composizione seguente:
I componenti a?) e V ) del reagente furono usati, seguendo procedure analoghe a quelle descritte negli esempi 1 e 7, per lfidentificazione di insulina umana in pancreas umano, caseina umana in tessuto mammario umano, antigene di superficie di epatite B (HBsAg) in tessuto epatico umano, lisozima umano in? intestino tenue umano, mioglobina uman? in muscolo:, scheletrico umano,,e glucagone umano in pancreas umano, usando, in tutti i casi, un antisi?ro originato in coniglio,cio?, rispettivamente, antisiero, anti-insulina originato in coniglio, antisiero anticaseina originato??in coniglio, antisiero.anti-HBsAg originato, in coniglio, antisiero,anti-lisozima originato in coniglio, antisiero,anti-mioglobina originato in coniglio ed antisiero anti-glucagone originato in coniglio.
Furono preparati analoghi reagenti coniglio-specifici aventi la stessa composizione sopra riportata ma in cui il componente b'1) conteneva lo 0,0015/^ di sodio tet.reborato o, rispettivamente, lo 0,0075% di sodio molibdato invece dello 0,0015% di. sodio tungstato, le concentrazioni percentuali di sodio'tetraborato e di sodio molibdato essendo sempre riferite a 2,5 ml di soluzione acquosa del liofilizzato. Detti reagenti furono,impiegati per l?identificazione di tutti gli antigeni menzionati io precedenza in questo esempio, seguendo procedure analoghe a quelle descritte negli esempi 1 e 7.
Esempio 10
Per l'identificazione istochimica di un antigene su 50 sezioni di tessuto umano fu preparato un reagente capra-specifico avente la stesso composizione del reagente descritto nell?esempio 9 ma contenente frammenti Fc di immunoglobuline di capra coniugate con ? -D-galattosidasi, invece che frammenti Fc di immunoglobuline di coniglio coniugate con.?-D-galattosidasi.
Furono inoltre preparati reagenti simili ma contenenti frammenti Fc di immunoglobuline di pecora coniugate Gon p -D-galattosidasi o, rispettivamente, frammenti Fc di immunoglobuline di topo coniugate con p-D-galattosidasi , invece che frammenti Fc di immunoglobuline di coniglio coniugate con ^-D-galattosidasi..
Ciascun reagente venne impiegato per l'identificazione della mioglobina umana in muscolo scheletrico.
Claims (37)
1) Metodo citochimico immuroenzimatico per l'identificazione di antigeni in tessuti caratterizzato dal fatto che si usa come marcante ?-D-galattosid?si .
2) Metodo citochimico immunoenzimatico secondo la rivendicazione 1 nel quale l'identificazione degli .antigeni nei tessuti viene ottenuta attraverso la formazione di un prodotto insolubile e colorato generato per azione del marcante ?-D-galattosidasi su un substrato croniogeno specifico, e nel quale metodoil marcante ?-D-galattosidasi ? legato all'antigene da identificare tramite un
legante specifico.
3) Metodo citochimico immunoenzimatico secondo le rivendicazioni 1 e 2 nel quale la ?-D-galattosidasi ? ?-D-galattosidasi microbica.
4) Metodo citochimico immunoenzimatico secondo la rivendicazione 3 nel quale la ?-D-galattosidasi ? microbica ? ?-D-galattos?dasi da Escherichia coli.
5) Metodo citochimico immuneenzimatico secondo la rivendicazione 2 nel quale il legante specifico che lega la ?-D-galattosidasi all*antigene da identificare comprende un anticorpo specifico per 1'antigene stesso.
6) Metodo citochimico immunoenzimatico secondo la rivendicazione 2 nel quale il legante specifico che lega la ?-D-galattosidasi all'antigene da ?dentificare comprende un anticorpo specifico per l'antigene stesso ed un sistema di coniugazione in grado di dare un ?-D-galattos?dasi coniugato..
7) Metodo citochimico immunoenzimatico secondo la rivendicazione 6 nel quale il ?-D-galattosidasiconiugato ? un anti-anticorpo ?-D-galattosidasi--coniugato .
8) Metodo citochimico immunoenzimatico secondo la rivendicazione 6 nel quale il ?-D-galattosidasi coniugato ? un sistema Biotina-Avidina ?-D-galattosidasi-coniugato .
9) Metodo citochimico immunoenzimatico secondo le rivendicazioni 2-4 nel quale il substrato croniogeno specifico ? un derivato ?-D-galattosidico.
10) Metodo secondo la rivendicazione 9 nel quale il derivato ?-D-galattosidico ? un derivato indolii--?-D-galattosidico .
11) Metodo secondo la rivendicazione 10 nel quale il derivato indolil-??D-galattosidico ? il 5-brorno--4-cloro-3-ind.olil-?-D-galattoside .
12) Metodo secondo la rivendicazione 9 nel quale il derivato ?-D-galattosidico ? un naftil ?--Dgalattoside .
13) Metodo secondo la rivendicazione 12 nel quale il naftil-?-D-galattoside ? il 6-"bromo-2-naftil-?-D--galattosi de.
14) Metodo secondo le rivendicazioni 1-9 caratterizzato dal fatto che quando si usa come substrato croniogeno un derivato indolil-?-D-galattosidico secondo le rivendicazioni 10-11, un agente azo-copuiante pu? essere opzionalmente presente.
15) Metodo secondo le rivendicazioni 1-9 caratterizzato dal fatto che quando si usa come substrato croniogeno un derivato naftil-?-D-galattosidico secondo le rivendicazioni 12-13, un agente azo-copulante ? presente come reagente addizionale.
16) Metodo secondo le rivendicazioni 14 e 15 nel quale l'agente azo-copulante e p-rosanilina esaazotata.
17) Metodo secondo le rivendicazioni 14 e 15 nel quale l'agente azo-copulante ? scelto nel gruppo consistente di Fast-Blue VB, Fast-Blue BB, Fast--BLue RB e Fast-Gam et GBC.
18) Eetodo secondo le rivendicazioni 1-9 caratterizzato dal fatto che, quando si usa come substrato croniogeno un derivato indolil ?-D-galattosidico secondo le rivendicazioni 10-11, un agente ossidante o d? trasferimento di elettroni pu? essere opzionalmente presente.
19) Eetodo secondo la rivendicazione 18 nel quale l'agente ossidante o di trasferimento di elettroni comprende il metosolfato di fenazina.
20) Metodo secondo la rivendicazinne 18 nel quale 1' agente ossidante o di trasferimento di elettroni comprende un sale di tetrazolio.
21) Eetodo secondo la rivendicazione 20 nel quale il sale di tetrazolio ? scelto nel gruppo consistente di p-nitro blu tetrazolio cloruro e tetranitro blu tetrazolio cloruro.
22) Eetodo secondo la rivendicazione 18 nel quale l'agente ossidante o di trasferimento d? eletti^oni ? una coppia ionica red-ox.
23) Eetodo secondo la rivendicazione 22 nel quale la coppia ionica red-ox comprende Fe<2+>/Fe<3+ >ioni o Ce<2+>/Ce<4+ >ioni.
24) Metodo secondo la rivendicazione 23 nel quale la coppia ionica Fe<2+>/Fe<3+ >? fornita dai ilspettivi cianuri complessi o sali solfato.
25) Metodo secondo la rivendicazione 24 nel quale i cianuri complessi sono un ferrocianuro alcalino ed un ferricianuro alcalino.
26) Metodo secondo la rivendicazione 25 nel quale il ferrocianuro ed il ferricianuro alcalini sono potassio ferrocianuro e potassio ferricianuro.
2J) Metodo secondo la rivendicazione 23 nel quale la coppia ionica Ce<2+>/Ce<4+ >e fornita dai rispettivi sali solfato.
28) Metodo secondo la rivendicazione 22 nel quale la coppia ionica red-ox ? scelta in un gruppo con?
f
29) Metodo secondo la rivendicazione 28 nel quale le coppie ioniche ivi menzionate-sono fom ite dai rispettivi sali con metalli alcalini o al? calino-terrosi
30) Reagente per l'esecuzione di un metodo citochimico immunoenzimatico per la identificazione degli antigeni nei tessuti caratterizzato dal fatto che la f -D-galattosidasi ? usata come marcante, comprendente, come componenti essenziali, a) un anticorpo specifico per l?antigene da determinare, b) -D-galattosidasi o un ^-D-galattosidasi coniugato, e c) un substrato croniogeno specifico per la ?-D -galattosidasi e in grado di formare un prodotto insolubile e colorato per azione della ?-D-galattosidasi.
31) Reagente per l'esecuzione di un metodo citochimico immunoenzimatico per la identificazione degli1 antigeni nei tessuti caratterizzato dal fatto che la ?-D galattosidasi ? usata come marcante, comprendente, come componenti essen- : ziali, a') un anti-anticorpo coniugato con:
-D-galattosidasi, e bf) un substrato croniogeno specifico per la ?-D-galattosidasi e in grado di formare un prodotto insolubile e colorato per azione della ?-D-galattosidasi.
32) Reagente secondo ciascuna delle rivendicazioni 30 e 31 nel quale la ?-D-galattosid.asi ? come definita nelle rivendicazioni 3 e 4*
33) Reagente secondo ciascuna delle rivendicazioni 30, 31 e 32 nel quale il substrato croniogeno specifico per la?-D-galattosidasi ? come definito nelle rivendicazioni 9-13-
34) Reagente secondo le rivendicazioni 30, 32 e 33 nel quale il ?-D-galattosidasi coniugato previsto come componente b) nella rivendicazione 30 ? come definito nelle rivendicazioni 7 e 8.
35) Reagente secondo le rivendicazioni 31? 32 e 33 nel quale l?'anti-anticorpo coniugato con ?-D -galattosidasi previsto come componente a") nella rivendicazione 31 ? un anticorpo anti-coniglio o anti-capra o anti-pecors o anti-topo.
36) Reagente secondo ciascuna delle rivendicazioni 30-35 contenente un agente azo-copulante come definito nelle rivendicazioni 15-17 quale componente addizionale..
37) Reagente secondo ciascuna delle rivendicazioni 30-36 contenente un agente ossidante o di trasferimento di elettroni come definito alle rivendicazioni 19-29 quale componente addizionale..
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8201547 | 1982-01-20 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| IT8224880A0 IT8224880A0 (it) | 1982-12-21 |
| IT8224880A1 true IT8224880A1 (it) | 1984-06-21 |
| IT1153912B IT1153912B (it) | 1987-01-21 |
Family
ID=10527737
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT24880/82A IT1153912B (it) | 1982-01-20 | 1982-12-21 | Metodo e reagenti per l'uso di beta-galattosidasi come marcante in immunocitochimica |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE3300961A1 (it) |
| FR (1) | FR2520121B1 (it) |
| IT (1) | IT1153912B (it) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4218539A (en) * | 1978-03-24 | 1980-08-19 | Weltman Joel K | Enzyme conjugates and method of preparation and use |
| GB2098730B (en) * | 1981-04-21 | 1985-02-06 | Welsh Nat School Med | Immunolocalisation |
-
1982
- 1982-12-21 IT IT24880/82A patent/IT1153912B/it active
-
1983
- 1983-01-13 DE DE19833300961 patent/DE3300961A1/de not_active Withdrawn
- 1983-01-20 FR FR8300851A patent/FR2520121B1/fr not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1153912B (it) | 1987-01-21 |
| DE3300961A1 (de) | 1983-07-28 |
| FR2520121A1 (fr) | 1983-07-22 |
| FR2520121B1 (fr) | 1985-08-23 |
| IT8224880A0 (it) | 1982-12-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9618512B2 (en) | Biomarker for breast cancer | |
| JP3503890B2 (ja) | 改良された免疫組織化学的染色法およびそのための試薬 | |
| CN101598731B (zh) | 一种用于肿瘤病理诊断用途的免疫组织化学诊断试剂盒 | |
| CN103328979B (zh) | 组合的组织学染色 | |
| US8486657B2 (en) | Anti-preproprotein and anti-preprotein antibodies as immunohistochemical markers | |
| Krenacs et al. | Multiple antigen immunostaining procedures | |
| CN111363789B (zh) | 一种同时检测蛋白质和rna的试剂盒和方法 | |
| IT8224880A1 (it) | METODO E REAGENTI PER L'USO DI β-GALATTOSIDASI COME MARCANTE IN IMMUNOCITOCHIMICA | |
| Jennette | Immunohistology in diagnostic pathology | |
| JP4560314B2 (ja) | 中性アミノ酸トランスポーターによる癌の検出法、及びそのためのキット | |
| JP2543630B2 (ja) | 特定タンパク質の糖化割合の測定方法 | |
| Denk | Immunohistochemical methods for the demonstration of tumor markers | |
| KR20100060897A (ko) | 에틸벤젠 독성 중독 진단용 바이오마커 | |
| GB2113839A (en) | Method and reagents for the use of beta -D-galactosidase as a tracer in immunocytochemistry | |
| CN103884694A (zh) | 一种lkb1蛋白检测方法及试剂盒 | |
| CN121108352B (en) | CK-MB monoclonal pairing antibody and application thereof | |
| CN115598344B (zh) | 一种粪胰弹性蛋白酶1的检测试剂盒及其制备方法 | |
| JPS63209600A (ja) | パ−オキシダ−ゼ標識による測定方法 | |
| Mauro et al. | Simultaneous and successive localization of two antigens in the same tissue section using 3, 3′-diaminobenzidine and 1-naphthol basic dye | |
| CN120948811A (zh) | 一种阿尔茨海默相关神经丝蛋白AD7c-NTP的检测试纸条与试剂盒 | |
| JPS62124460A (ja) | 上皮細胞増殖因子の酵素免疫測定法 | |
| CN118112260A (zh) | 一种半定量检测粪便中血红蛋白浓度的方法 | |
| Stockard et al. | Factors Affecting lmmunohistochemical Evaluation of Biomarker Expression in Neoplasia | |
| Avrameas | Immunocytological methods for the identification and localization of antigens | |
| KR20110042694A (ko) | 염화메틸렌 독성 중독 진단용 바이오마커 |