DE3300961A1

DE3300961A1 - Verfahren und reagentien fuer die anwendung von ss-d-galactosidase als tracer in der immuno-zytochemie

Info

Publication number: DE3300961A1
Application number: DE19833300961
Authority: DE
Inventors: Giorgio Milano Chieregatti; Enzo Melzo Milano Murador
Original assignee: Farmitalia Carlo Erba SpA 20159 Milano; Farmitalia Carlo Erba SRL
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1982-01-20
Filing date: 1983-01-13
Publication date: 1983-07-28
Also published as: IT8224880A0; FR2520121B1; IT8224880A1; FR2520121A1; IT1153912B

Description

—. "7 —

FARMITALIA CARLO ERBA S.p.Α., MAILAND / ITALIEN

Verfahren und Reagentien für die Anwendung von
ß-D-Galactosidare als Tracer in der Imrauno-Zytochemie

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein zytochemischeG Immunoenzym-Verfahren zur Identifizierung von Antigenen in Geweben, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ß-D-Galactosidase als Tracer angewandt wird. 5.

Die Erfindung schliesst auch Reagontien für die Verwirklichung des genannten Verfahrens ein.

Antikörper, die durch Enzyme und Fluoreszierungsmittel markiert sind, werden allgemein in der Immuno-

Histochemie angewandt, um die Lokalisierung von Antigenen in Geweben zu demonstrieren (Proc. Soc. Exp.
Biol. Med. £7: 200-202, 1941; J. Immunol. £5: 159-170,

1942; J. Εχρ. Med. SVi 1-13, 1950; Arch. Pathol. Lab. Med. 102: 113-121, 1978; J. Clin. Pathol. TU 14-20, 1974).

In jüngerer Zeit wurde jedoch die Enzym-Immuno-Lokalisierung immer beliebter, weil sie dem Pathologen gegenüber der Immuno-Fluoreszenz einige entscheidende Vorteile eröffnet. Diese Vorteile schliessen die stabileren, kontrastierbaren und fein detailliert gefärbten Präparationen, die Dauerhaftigkeit der Abbildungen, die Beobachtbarkeit des umgebenden Gewebes und, für die meisten Antigene, die Anwendung von Material ein, das für die Lichtmikroskopie mittels Standard⁴* Prozeduren zur Fixierung und Einbettung hergestellt wurde. Entsprechend der genannten Vorteile ergibt es sich, dass die Immunoenzym-Verfahren in hohem Masse empfindlich sind und sehr präzise Methoden darstellen, so dass unter den Immuno-histochomischen Techniken die histochemiüchen Immunoenzym-/erfahren jetzt die am meisten angewandten in der di ignostischen Pathologie sind. Die zytochemischen Imm moenzym-Verfahren, insbesondere die histochemischen, lieferten wichtige Informationen in der Renalpathologie, z.B. beim Studium von bakteriellen und viralen Krankheiten, in der Physiopathologie des Immunsystems, als auch über die Ausscheidung von Hormonen.

Des weiteren wurden Markierungsmittel aufgezeigt, die für gegebene Krankheitsbilder un 1 Zellarten spezifisch sind, wodurch signifikante Informationen über Histogenese und Differenzierung ;on Tumoren erhalten wurden.

• m

Durch die Anwendung dieser Techniken wurde cine grosse Vielfalt von Zellprodukten, einschliesslich Enzym-, Polypeptid- und Steroidhormone, Immunoglobuline, Tumor-Antigene, virale Antige und andere zellspezifische Proteine, in gefrorenen oder konventionell fixierten und eingebetteten Gewebsschnitten abgebildet.

GrÖssere Anwendungsgebiete dieser Verfahren schliessen z.B. die Abbildung verschiedener Immunoglobulin-Klassen in Tumoren lymphoretikularen Ursprungs und bei atypischen Lymphoproliferationsprozessen, die Identifizierung von Pol], peptidhormonen in endokrinen Tumoren und die Abbildung verschiedener Tumormarkierungsr.ittcl, wie Carcinoembryonal-Antigen und Alpha-Foetoprotcin in neoplastischen und präneoplastisehen Bedingungen, ein.

Eine prägnante Zusammenfassung einiger Anwendungsgebie-0 te immunoenzymairischer Techniken in der Histopathologie wird in Human Pathology, _1_2' 590-596 (1981) geboten.

Nicht weniger al s 70 mögliche Anwendungsfelder sind aufgelistet. Die Möglichkeit, in routinemässig fixierten und in Wachr eingebetteten Zellen und Geweben, einen weiten Bei eich von Markierungsmittel zu identifizieren, von denen viele spezifisch für eine gegebene Krankheit und e.inige sogar ätiologisch sind, gibt dem Pathologen neue objektive Diagnosekriterien an die Hand, im Gegensatz zu den traditionellen, oft

subjektiven, rein morphologischen Paramtern.

Gegenwärtig stellt Peroxidase dan Enzym dar, das in der Immuno-Zytochemie im weitesten Ausmass angewandt wird (Am. J. Clin. Pathol. 21'· 4H3-488, 1979). Obwohl einerseits dieses Enzym Vorteile bietet, wie eine deutliche Stabilität und dia Möglichkeit, ein unlösliches Substrat mit hohem Dofinitionsgrad anzuwenden und Ketten zu bilden, die aus multiplen Antikörperschichten nur mit Bindungen des immunologischen Typs bestehen (d.h. PAP Peroxida^e-Antiperoxidase-System),stösst man bei der Anwendung dieser Verfahren, die unter dem Begriff "Immuno-Peroxidase" zusammengefasst sind, auf einige Nachteile.

Endogene Peroxidasen und Pseudoperoxidasen sind in einigen Geweben vorhanden, was zu einem falschen Posi*- tivresultat Anlass geben kann; das meistgenutzte chromogene Substrat, 3,3',4,4·-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB), besitzt eine signifikante karzinogene Aktivität (Registry of toxic effects of Chemical Substances - Ed. NIOSH - U.S. De Jt. of Health and Human Services - Cincinnati - 19J0), und es wird zunehmend schwierig, eine Verbindu ig mit einem signifikanten Reinheitsgrad auf dem M irkt zu finden (J. Histochem. Nr. 28, S. 191-192 (1)80)).

Die für die Abbildung von Peroxidase angewandte Lösung ist instabil und darf nur wenige Minuten vor Gebrauch hergestellt werden (Sternberger L.A.: Imrnunocytochemistry - 2. Ausgabe - John Wiley and Sons New York, 1979).

Darüber hinaus zeigt das Peroxidasesubstratchromogen eine tiefbraune Farbe gegen einen hellbraunen Hintergrund, was manchmal ernste Probleme bei der Bewertung der Präparation aufwirft und zu irreführender Positiventscheidung führen kann.

Alternativsubstrate für Peroxidasen oder andere Enzyme, wie z.B. Glukoseoxidase und alkalische Phosphatase, wurden vorgeschlagen, aber Ergebnisse, die denen des Peroxidase + DAB-Systems vergleichbar wären, wurden bis jetzt nicht erhalten, besonders weil viele Verfahren zur Bildu ig von Chromogenverbindungen führten, die in den organischen Lösungsmitteln, die zur Entwässerung und Klärung der Präparationen angewandt wurden, löslich oder weniger empfindlich bezüglich der Aufdeckung von Gewebe-Antigenen waren. Es wurde gefunden, dass die Anwendung von ß-D-Galactosidase als Tracer es erlaubt, die Nachteile, die mit den bekannten zytochemischen Immunoenzym-Techniken, insbesondere

20- der zytochemischen Iramuno-Peroxidase-Methode, verbunden sind, zu überwinden.

Demgemäss bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein zytochemischos Immunoenzym-Verfahren zur Antigen-Identifizierung in Geweben, insbesondere in Humangeweben, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ß-D-Galactosidaseenzym als Tracer angewandt wird.

Entsprechend der Erfindung wird die Identifizierung der Antigene in Geweben durch die Bildung eines unlöslichen und gefärbten Produktes geleistet, das durch

die Wirkung von ß-D-Galactosidase auf ein spezifisches chromogenes Substrat erhalten wird. Genauer gesagt, liefert die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Antigenen in Geweben, das beinhaltet, dass das ß-D-Galactosidaseenzym an das zu identifizierende Antigen mittels jedes möglichen spezifischen Binders gebunden und die ß-D-Galactosidase-Aktivität durch Reaktion mit einem spezifischen Substrat, das befähigt ist, durch die Wirkung von ß-D-Galactosidase ein unlösliches und gefärbtes Produkt zu ergeben, offenbart wird.

Das in dem Verfahren der Erfindung zur Anwendung gelangende ß-D-Galactosidaseenzym kann jede beliebige ß-D-Galactosidase mikrobiellen Ursprungs sein, obwohl ß-d-Galactosidase von Escherichia CoIi vorzuziehen ist.

Erfindungsgemäss kann ß-D-Galactcsidase an das zu identifizierende Antigen mittels jeglicher Art von spezifischem Binder gebunden werden. Insbesondere kann z.B. jede der Markierungs- oder Verbrückungstechniken, die bereits für Peroxidase in den Immuno-Peroxidase-Verfahren beschrieben sind, angewandt werden, um ß-D-Galactosidase an das aufzudeckende Antigen zu binden.

In Übereinstimmung mit den bevorzugten Techniken wird das genannte Antigen mit einem ersten Antikörper zur Reaktion gebracht, der spezifisch zum Antigen selbst ist und seinerseits an ß-D-Galactosidase entweder

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direkt oder durch jedes Konjugationssystem, das ein ß-D-Galactosidas2-Konjugat ergeben kann, gebunden wird. Ein passenies ß-D-Galactosidase-Konjugat kann insbesondere z.B. ein enzymkonjugierter Anti-Antikörper des Typs, beschrieben z.B. in FEBS lett. !9_5, 311

(1978) oder in An. J. Clin. Pathol. T\_, 483 (1979), oder ein enzymkcιjugiertes Biotin-Avidin-System in jeder seiner mocilichen Konfigurationen, z.B. des Typs, berichtet in J. Histochem. Cytochem. Bd. 27, Nr. 8, 1131 (1979), sein.

Vorzugsweise werden die Stufe, in der das zu identifizierende Antigen mit dem ersten, zum Antigen selbst spezifischen Antikörper zur Reaktion gebracht wird, und die anschliessende Stufe oder Stufen, die dazu führen, den genannten spezifischen Antikörper und ß-D-Galactosidare miteinander zu verbrücken, nacheinander ausgeführt.

Um die ß-D-Galactosidace-AktivitäL zu offenbaren, kann gemäss dem Verfahren der Erfindung jedes chromogene Substrat angewandt werden, das zum ß-D-Galactosidaseenzym spezifisch ist und zusätzlich durch die Wirkung von ß-D-Galactosidase ein gefärbtes, unlösliches und stabiles Reaktionsprodukt ergeben kann.

Das Produkt, dat. aus dem genannten chromogenen Substrat durch die Wirkung von ß-D-Galactosidase entsteht, muss neben der Erfordernis, gefärbt und stabil zu sein, entweder in den wässrigen oder in den organischen Lösungsmitteln, die im allgemeinen zur Behandlung von

Geweben in der Histologie angewandt werden, vorzugsweise sowohl in den genannten wässrigen als auch organischen Lösungsmitteln, unlöslich, sein.

Vorzugsweise ist das zur ß-D-Galactosidase spezifische chromogene Substrat in denselben Lösungsmitteln löslich.

Dieses chromogene Substrat mit ß-D-Galactosidase-Spezifität kann jedes beliebige ß-D-Galactosid-Derivat sein, das, sobald es durch das Enzym gespalten ist, ein gefärbtes, unlösliches und stabiles Reaktionsprodukt, wie oben spezifiziert, erzeugen kann. Beispiele von chromogenen Substraten, die ^ich für das Verfahren der Erfindung besonders eignen, sind z.B. bestimmte Indolyl- und Naphthyl-ß-D-Galactosid-Derivate.

Besonders bevorzugte Substrate sind Indolyl-ß-D-Galactosid-Derivate, und unter diesen ist 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galactosid ganz besonders bevorzugt. Unter den Naphthyl-ß-D-galactosid-Derivaten ist 6-Brom-2-naphthyl-ß-D-galactosid ein bevorzugtes.

Um die ß-D-Galactosidase-Aktiviflt erkennbar zu machen, kann es manchmal notwendig sein, das chromogene Substrat in Gegenwart eines oder mehrerer Zusatzreagentien zur Reaktion zu bringen, die z.B. Kupplungsagentien, oxidierende oder elektronenübertragende Agentien sein können.

So ist z.B. bei Anwendung eines Haphthyl-ß-D-galactosid-Derivats als chromogenes Substrat die Anwesenheit

eines entsprechenden Azo-Kupplungsreagenses erforderlich, um die Enzymaktivität aufzudecken, und ein Azo-Kupplungsreagens kann gegebenenfalls auch im Aufklärungsreagens zugogen sein, wenn ein Indolyl-ß-D-galactosidchromogen angewandt wird.

Geeignete Azo-Kuoplungsreagentien können z.B. hexazotiertes p-RosaniLin, Echtblau VB, BB und RR, Echtgranat GBC und ähnliches sein, wobei hexazotiertes p-Rosanilin ein besonders bevorzugtes ist.

Des weiteren kann, um die enzymkatalysierte Aufklärungsreaktion zu beschleunigen, besonders wenn ein Indolyl-ß-D-galactosidsubstrat angewandt wird, ein oxidierendes oder elektronenüberti-agendes Reagens im Reaktionsmedium gegebenenfalls auch anwesend sein.

Oxidierende oder elektronenübertragende Reagentien können in angemessenem Rahmen jede in der anorganisehen und organischen Chemie bekannten oxidierenden and elektronenübertragenden Reagentien sein, wobei im allgemeinen anorganische Reagentien bevorzugt sind.

Beispiele von bevorzugten oxidierenden oder elektronenübertragenden Reagentien sind insbesondere Phenazinmethosulphät, Tetrazoliumsalze oder jedes passende Redox-Ionenpaar. Ein geeignetes Tetrazoliumsalz kann z.B. p-Nitroblau-Tetrazoliumchlorid oder Tetranitxoblau-Tetrazoliumchlorid sein.
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Ein passendes Redox-Ionenpaar kann z.B. aus der Gruppe

ι · ·■«

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der Ionenpaare Fe²⁺/Fe³⁺, Ce²⁺/Ce⁴⁺, jT/voJ", J /VO₃, J~/WO²~, J~/B₄O₇ ²", J~/MO²~, J**/Mo₇O₂₄ ⁶" und ähnlichem ausgewählt sein.

2+ 3 +
Paare des Fe /Fe -Typs können insbesondere z.B.

durch die entsprechenden Cyanidkoraplexe oder Sulfatsalze geliefert werden. Cyanidkomplexe sind vorzugsweise alkalische Ferrocyanide/Ferricyanide, insbesondere KaliumferrocyanidZ-ferricyanid. 10

Ce /Ce -Paare werden vorzugsweise durch die entsprechenden Sulfatsalze geliefert.

Die anionischen Paare werden durch die entsprechenden¹ Salze geliefert, vorzugsweise sind dies die jeweiligen Alkali- oder Erdalkalisalze.

Entsprechend dem Verfahren der Erfindung können die Gewebeproben durch jede bekannte Vorgehensweise hergestellt werden, z.B. Gefrier-, Fixierungs- und Einbettungsprozeduren, die gewöhnlich in der Histochemie Anwendung finden.

Zum Beispiel können in Formalin fixierte und in Paraffin eingebettete Gewebe mit dem Verfahren der Erfindung sehr leicht untersucht werden.

Die Bewertung der Exemplare kann mit jedem gewöhnlichen Lichtmikroskop, 20- bis 800-fache Vergrösserung, ausgeführt werden.

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Die Anwendung de:; ß-D-Galactosidascenzyms und eines passenden :;pezif sehen chromogenen Subctrats erlaubt es, wie beieits .estgestellt, die mit der Anwendung von z.B. Peroxidase verbundenen Nachteile zu umgehen. 5

Insbesondere werden z.B. die Probleme, die durch die Anwesenheit endogener Peroxidasen und Pseudoperoxidasen in Gewebsproben hervorgerufen werden, die, wie ebenfalls bereits betont, eine grosse Einschränkung der Immuno-histochem.i.sehen Peroxidase-Verfahren darstellen, in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung vermieden, sowohl weil das :'>-D-Gaiactosidaseenzym üblicherweise in den Humangeweben nicht vorhanden ist, als auch weil in jedem Falle dar pH-Bereich der Aktivität der Humanß-D-galactosidaso vollkommen verschieden vom pH-Boreich der Aktivität der im Verfahren der Erfindung angewandten mikrobiellen ß-D-Galactosidase ist: Der Human-ß-D-galactosidase-Bereich der Aktivität liegt bei ca, 5^u bis 6, während z.B. der Escherichia Coli-ß-D-galactosidase-pH-Bereich der Aktivität bei ca. 7,0 bis 7,5 liegt.

Zudem wird ß-D-Galactosidase in weniger als 1 Minute bei ungefähr 55⁰C inaktiviert (The Enzymes, 1960,

2. Ausgabe, S. 409-430, Bd. 4 Ed: P.D. BOYER, H. LARI)Y, K. MYRBÄCK, Academic Press-New York), was eine normalerweise während der üblichen Einbettungsprozeduren erreichte Temperatur darstellt. Wegen des Fehlens einer Interferenz seitens endogener ß-D-Galactosidasen treten die Hintergrund-Färbungsprobleme, die bei den üblicherweise angewandten Peroxidasen wegen der in Geweben

möglichen peroxidaseartxgen Aktivität entstehen, mit ß-D-Galactosidase nicht auf.

Mikrobielle ß-D-Galactosidase gibt keine Hintergrund-Färbung in Säugetiergeweben und reagiert mit handelsüblichen chromogenen Substraten unter. Erzeugμng stark kontrastierender und gut erkennbar gemachter morphologischer Muster. Die erhaltenen Färbungen sind viel besser ausgeprägt und unterscheidbar als diejenigen, die üblicherweise mit den Peroxidasetechniken gewonnen werden, auch vom Tatbestand aus betrachtet, dass die meisten der angewandten ß-D-Galactosidase-Chromogen-Substrate es erlauben, einen fast vollkommen weissen Hintergrund zu haben. Als eine Folge sind die Sichtbarmachung und Interpretation von Stellen spezifischer Immuno-Reaktivität sehr erleichtert.

Dies bedingt eine gesteigerte Empfindlichkeit hinsichtlich des ß-D-Galactosidase-Verfa irenszieles der Erfindung und bewirkt die besondere A iwendbarke.it zur Untersuchung von Geweben mit Wund- od ^r Verbrennungr.verletzung on.

Zudem sind die bei den histologischen ß-D-Galactosidase-Reaktionen zur Anwendung gelangenden Reagentien, insbesondere z.B. die äusserst bevorzugt angewandten Indolyl-ß-D-galactosidchromogene, nicht als karzinogen bekannt, im Gegensatz zu dem Hochkontrast-Substrat, Diaminobenzidin, das bei Peroxid:ise-Färbungen meistens eingesetzt wird.

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Weiterhin sind die zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens angewandten Reagentien stabil und erzeugen Abbildurgen, die ebenfalls dauerhaft stabil sind und den Gebjauch eines einfachen, gewöhnlichen Lichtmikroskops c rfordern.

Dank der.im Vorgenannten zusammengefassten Vorteile zeigt das Immuno- zytochemische ß-D-Gal£ictosidase--Verfahren der Erfindung einen sehr hohen Grad an Präzision und Empfindlichkeit, zumindest vergleichbar mit dem der Peroxidasetechniken, ohne gleichzeitig die Nachteile, die die letzteren Techniken kennzeichnen, aufzuweisen.

Wegen der hohen Empfindlichkeit erlaubt es das Verfahren der Erfindung, Optimalresultate auch bei der Antigen-Lokalisicrung auf routinemUssig fixierten und eingebettenen Materialien zu erzielen, in denen äio Rest-Antigenizitot nur ein Teil derjenigen in gefroronen Gewebeη ist.

Obwohl bei dem Verfahren der Erfindung eine Vorbehandlung der Gewebeproben gewöhnlich nicht notwendig ist, kann dennoch, um die Empfindlichkeit der Technik weiter zu steigern, eine Vorbehandlung. z.B. gemäss Heydermann (J. C] in. Pathol. 32!, 971-978 (1979)), manchmal nutzbringend sein, um mögliche leichte Interferen-• zen seitens endogener Peroxiasen und/oder Gewebseisenspuren zu eliminieren.

Das erfindungsgenässe Verfahren erlaubt es, eine gresse

Vielfalt von Zellprodukten und insbesondere einen weiten Bereich von Markierungssubsianzen zu identifizieren, von denen viele spezifisch für gegebene Krankheiten und einige sogar ätiologisch sind. Die Zellprodukte und Markierungssubstanzen können z.B. solche betreffen, die im Rahmen der hieir vorliegenden Spezifikation vorstehend aufgeführt E;ind.

Die Erfindung liefert auch Reagentien zur Verwirklichung des oben beschriebenen Imriuno-histochemischen ß-D-Galactosidase-Verfahrens.

Ein Reagens kann entweder

(1) ein spezifisches Reagens sein, das als wesentliche Komponenten

(a) einen zum zu identifizierenden Antigen spezifischen Antikörper,

(b) ß-D-Galactosidase oder ein ß-D-Galactosidase-Konjugat und

(c) ein chromogenes Substrat, das zur ß-D-Galactosidase spezifisch ist und durch

die Wirkung von ß-D-G.Llac^osidase ein unlösliches und gefärbt-is Produkt ergeben kann,

enthält; oder es kann
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(2) ein Reagens sein, das als wesentliche Komponenten

(a') einen i;-D-Galaktosidase~konjugierten Anti-Antikörper und

(b ') ein chiomoqenes Substrat

enthält, das zur ß-D-Galactosidase spezifisch ist und durch die Wirkung von ß~D-Galactosidase ein unlösliches und gefärbtes Produkt ergeben kann.

Offensichtlich i£;t ein Reagens der im Vorstehenden unter (1) genannten Art nur für die Bestimmung dieses besonderen Antigens., das mittels der zum Antigen selbst spezifischen Ant.Lkörper-Komponente (a) erkennbar ist, anwendbar.

Im Gegensatz dazu ist ein Reagens der im Vorstehenden unter (2) cjenann .en Art zur Beutira;aung eines jeden Antigens geeigne ;. Tatsächlich ist der in der Komponente (a¹) mit ß-D-Galactosidase konjugierte AntiAntikörper so geartet, dass er befähigt ist, unterschiedslos jeden Antikörper zu jedem zu identifizierenden Antigen zu erkennen, vorausgesetzt, dass der zuletztgenannte Antikörper in einer Spezies aufgewachsen ist, zu der ler Anti-Antikörper der Komxnonente Ca¹)-, "anti" ist. Demgemäss ist der Anti-Antikörper von Komponente (a¹) "Spezies-spezifisch", d.h. spezifisch zu der Spezies, in der der Antikörper zu den zu identifizierenden Antigenen aufgewachsen ist. So wird

z.B. ein Anti-Antikörper, der ein Anti-Kaninchen-Antikörper ist (d.h. "anti" zu der Kaninchen-Spezies) befähigt sein, jeden in Kaninchen aufgewachsenen Antikörper zu erkennen; ein Anti-Antikörper, der ein Anti-Ziege- oder Anti-Schaf-Antikörper ist, wird befähigt sein, jeden in Ziegen oder Schafen aufgewachsenen Antikörper zu erkennen; und analog wird ein AntiAntikörper, der ein Anti-Maus-Antikörper ist, befähigt sein, jeden in Mäusen aufgewachsenen Antikörper zu erkennen. Derageiuäss liefert die vorliegende Erfindung verschiedene Reagentien der vorgenannten Art (2), die sich insofern voneinander unterscheiden, als die "Spezies-Spezifität" betroffen ist, so z.B. ein Kanin¹-chen-spezifisches Reagens, das als die Komponente (a¹) ein ß-D-Galactosidase-konjugiertes Anti-Kaninchen-Antiserurn enthält; ein Ziegen-spezifisches (oder Schaf-spezifisches) Reagens, das als Komponente (a¹) ein ß-D-Galactosidase-konjugiertes Anti-Ziege- (oder Anti-Schaf-) Antiserum enthält; und ein Maus-spezifischc.j Reagens, das als Komponente (a¹) ein ß-D-Galactosidase-konjugiertes Anti-Maus-Antiserum enthält.

Jede der genannten Arten von Reagens (2) kann zur Identifizierung eines jeden Antigens herangezogen wer— den, vorausgesetzt, dass ein Antikörper zum Antigen angewandt wird, der in der entsprechenden Spezies aufgewachsen ist: diese Spezies wird z.B. ein Kaninchen für ein Kaninchen-spezifisches Reagens, eine Ziege für ein Ziegen-spezifisches Reagens, ein Schaf für ein Schaf-spezifisches Reagens und eine Maus für ein Mausspezifisches Reagens sein.

Es ist jedoch offenkundig, dass auf alle Fälle ein zum aufzuzeigenden Antigen spezifischer Antikörper, sogar falls nicht in einem Reagens der oben genannten Art (2) eingesch] ossen, immer angewandt werden muss, um das Antigen entdecken zu können.

Falls gewünscht, können ein für das zu identifizierende Antigen spczifischer Antikörper oder eine Reihe von für eine Reihe von zu identifizierenden Antigenen spezifischen Antikörpern extra mit dem Reagens (2) ausgestattet sein.

Jedes der oben genannten Reagentien (1) und (2) hann . zusätzlich eine Anzahl weiterer Komponenten enthalten, wie z.B. ein Azo-Kupplungsreagens, ein oxidierendes oder elektronenübertragendes Reagens und einen Puffer.

Die verschiedenen Komponenten eines jeden Reagenses können entweder zusammen oder getrennt verpackt Hein, in jeder bequeme ι Weise, die die leichte und rasche Reagensanv.'endung gestattet.

In jedem Reagens sind die Charakteristika der verschiedenen Komponente.! diejenigen, die bei der Beschreibung des Verfahrens der Erfindung vorstehend aufgeführt sind, die bevorzugten Komponenten sind diejenigen, die ebenfalls als die bevorzugten in der vorstehenden Beschreibung aufgeführt sind. 30

So enthält z.B. das im Vorstehenden unter (1) aufgeführte

Reagens in einer bevorzugten Ausführungsform als wesentliche Bestandteile

(a) einen zum zu identifizierenden Antigen spezifischen Antikörper,

(b) ein ß-D-Galactosidase-Konjugat und

(c) ein Indo.lyl-ß-D-galactosid 10

als chromogenes Substrat.

In einer bevorzugten Ausführungi;form enthält das im Vorstehenden unter (2) aufgeführte Reagens als wesentliehe Bestandteile

(a¹) einen ß-D-Galactosidase-konjugierten Speziesspezifischen Anti-Antikörper und

(b¹) ein Indolyl-ß-D-galactosid

als chrornogenos Substrat. In der oben genannten bevorzugten Ausführungsform des Reagensos (1) ist das spezifische ß-D-Galactosidase-Konjugat vorzugsweise ein ß-D-GalactosiJase-konjugierter Anti-Antikörper oder ein ß-D-Galactosidase-konjugiertes Biotin-Avidin-System.

In der oben genannten bevorzugten Ausführungsform des Reagenses (2) ist der ß-D-Galactosidase-konjugierte Spezies-spezifische Anti-Antikörper vorzugsweise ein ß-D-Galactosidase konjugierter Anti-Kaninchen-Antikörper oder ein ß-D-Galactosidase-konjugierter

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Anti-Ziege- oder Anti-Schaf-Antikörper oder ein ß-D-Galactosidase-konjugierter Anti-Maus-Antikörper.

In beiden oben genannten bevorzugten Ausführungsform in der Reagentien (1) und (2) ist das Indolyl-ß-D-galactosid-Chromojensubstrat vorzugsweise 5*-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galactosid.

Die folgenden Beispiele verdeutlichen die Erfindung, begrenzen sie jedoch in keiner Weise.

Beispiel 1
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Humaninsulin wurde in Humanpancreas durch die folgenden Vorgehensweisen identifiziert.

Es wurde Huxnanpancreasgewebe herangezogen, das in 10 ξ,-igcm phospha tgcpuf f er ten Formalin, fixiert und routinemässig in Paraffin eingebettet wurde. Die Paraffinschnitte wurden in phosphatgepufferte Kochsalzlösung von pH 7,2 (PBS) eingebracht, 5 Minuten lang mit 7,5 %-igem Ι1ο°2 ^un(^ schliesslich 2 Minuten lang mit 0,02 %-igem NaBII₄ behandelt (J. Clin. Pathol. 32, 971-978 (1979)). Nach mehrmaligem Waschen in PBS wurden die Schnitte über Nacht bei 4⁰C mit einem Kaninchen-Anti-h-Insulin-Antiserum, verdünnt mit PBS auf 1/1.000,inkubiert. Nach Waschen in PBS wurden den Schnitten Anti-Kaninchen-Immunoglubulin-Antikörper, in Eseln entstanden und konjugiert zu ß-D-Galactosidase

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aus Escherichia CoIi,»gemäss der in FEBS Letters 95, 311 (1978) berichteten Vorgehensweise, verdünnt auf 1/30 in PBS, das 1 % Normal-Schweineserum enthielt, zugefügt. Nach 30 Minuten unter Raumtemperatur wurden die Gewebe in PBS gewaschen. Die Enzymakti- '.' vität wurde mittels Anwendung einer Lösung aufgeklärt, die erhalten wurde durch Auflösung in pH = 7,2-PBS von:

5-Br-4-Cl-3-indolyl-ß-D-galactosid .0,44 g/l

Magnesiumchlorid ' . . 1., 1 mM/1

.Kaliumferricyanid ' . . 3,0 mM/1

Kaliumferrocyanid ■ 3,0 mM/1 '

Die Behandlung mit dieser AufklärungslÖsung wurde durch Inkubation über 1 Stunde bei 37⁰G durchgeführt. Nach Maischen wurden die Zellkerne mit Neutralrot gegengefärbt, die Schnitte entwässert und auf Eukitt ^—' aufgebracht. Die Gewebe wurden mittels eines Lichtmikroskops (Leitz Orthoplan). bei 200-^fachcr Vergrösserung untersucht.' Die Positivreaktion erschien intensiv blau. Die Positiv-Färbung war·sehr gut.sichtbar, da der Hintergrund ungefärbt blieb und die Zellkernerotgefärbt erschienen. Die Ergebnisse wurden mit denjenigen verglichen,· die in demselben Gewebe erhalten wurden, das mit demselben Anti-Insulin-Antiserum behandelt und anschliessend entsprechend der Peroxidase-PAP-Methode (Sternberger - J-. Histöchem. Cytochem. 18, 315 (1970)) verarbeitet wurde. Das Ergebnis'mit der Peroxidase-Methode war eine Positivreaktion, intensiv braun.-gefärbt. Die Positiv-Färbuny war jedoch

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wenigei' gut sichtbar und weniger klar als die mit dem ß-Galactosidase-Verfahren erhaltene, wegen der leichten Braunfärbung des Hintergrunds. Auf diese Weise gestattete es das ß-D-Galactosidase-Verfahren, eine viel bessere Farbevidenz als mit dem PAP-Peroxidase-Verfahren zu erzeugen.

Beispiel 2

! Entsprechend der Vorgehensweise von Beispiel 1, jedoch unter Ersatz des Anti-Insulin-Antiserixins durch entsprechende Antisera, die alle in Kaninchen entstanden "waren, wurden die folgenden Antigene ebenfalls identifiziert: " '

Human-Casein in Human-Brustgewebe; Hepatitis B-Oberflächen-Antigen (UBsAG) in Human-Leber; Human-Lysozym im Human-Dünndarm;

Human-Myoglpbin im Human-Skelettmuskel; und' Human-Glucagon in Human-Pancrcas.

Es wurden analoge Ergebniiise wie in Beispiel 1 erzielt.

-■ '.'

Beispiel 3 ■ .·

Human-Myoglobin im Skelett.muskel wurde durch die folgende Vorgehensweise identifiziert. Es wurde Human-

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Skelettmuskelgewebe herangezogen, das in 10 %-igem phosphatgepuffertem Formalin fixiert und routinemässig in Paraffin eingebettet wurde. Paraffinschnitte wurden in PBS eingebracht und über Nacht bei 4°C mit einem Kaninchen-Antimyoglobin-Antiserum (Behringwerke), verdünnt auf 1/500 mit PBS₇ inkubiert. Nach Waschen" in PBS wurde der Vorgehensweise von Beispiel 1 gefolgt; es wurde dieselbe Art von Ergebnissen erhalten.

· Bei analoger Vorgehensweise und unter Anwendung entsprechender Antisera wurden die folgenden'Antigene identifiziert: ."■'.;.

Human-Insulin in Human-Panc'reas; Human-Cascin in Human-Brustgewebe; «

Hepatitis B-Oberflächen-Antigen (HBsAG) in Human-Leber; Hüman-Lyso'/iym im Human-Dünndarm; IIuman-Glucacjon in Iluman-Pancreas. ■ .

Beispiel 4

Hepcititis B-Oberf lächen-Antigen (HBsAG) in .Human-Leber wurde" wie folgt identifiziert. Es wurde Human-Leber- * gewebe herangezogen, das, wie in Beispiel 1 beschrieben, fixiert und eingebettet wurde. Es wurde der Vorgehensweisu von Beispiel 1 gefolgt, unter Ersatz des Anti- , Insulin-Antiserums durch ein Kaninchen-Anti-IIBsAG· (Behringworke)-Antiserum, das mit PBS auf 1/500 verdünnt wurde. Des weiteren wurde i'ine Aufklürungs-PBS-Lösung, wie in Beispiel 1 ,.,angewandt, sie enthielt

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jedoch nicht die Kaliumferrocyanid- und Kaliumferricyanid-Reagentien. Dieselbe Art von Ergebnis, wie in Beispiel 1, wurde mit dieser Methode erhalten. Durch analoge Vorgehensweise, jedoch unter Anwendung der .5 entsprechenden 'Antisera, wurden die folgenden Antigene identifiziert: ·

Human-Insulin in Human-Pancreas; Human-Casein in Human-Brustgewebe; 10' Human-Lysozym im Human-Dünndarm; Human-Myoglobin im Human-Skelettmuskel; Human-Glucagön in Human-Pancreas.

Beispiel 5

Human-Lysozym im Human-Dünndarm wurde durch die folgende Prozedur identifiziert. Es wurde Human-Dünndarm-.gewebe herangezogen, das, wie in Beispiel 1 beschrieben, fixiert und eingebettet wurde. Es wurde der Vorge-.hensweise von Beispiel 1 gefolgt, unter Ersatz des Änti-Insulin-Antiserums durch ein Kaninchen-Anti-, Lysozym (DAKO).- Anti serum, das mit PBS auf 1/500 verdünnt wurde, und unter Anwendung einer pH = 7,2-PBS-Lösung als- Auf k,lärungs-Lösung, die enthielt:

5-Br-4-Cl-3-indolyl-ß-D-galactosid 0,44 g/l

Magnesiumchlorid 1,1 mM/1

Kaliumjodid 1 %

Natriumwolframat 0,0015 %

- 30 -

Analoge Ergebnisse wie in Beispiel 1 wurden erhalten.

Gemäss analoger Vorgehensweise und unter Anwendung entsprechender Antisera wurden die folgenden Antigene identifiziert:

Human-lnsulin in Human-Pancreas;
Human-Casein in Human-Brustgewebe ;." Hepatitis B-Oberflächen-Antigen (HBsAG) in Human-Leber; Human-Myoglobin in Human-Skelettmuskel; Human-Glucagon in Human-Pancreas.

Beispiel 6

Human-Caso.in wurde in Human-Brustgewebe durch die folgende Vorgehensweise identifiziert. Es wurde gefrorenes Human-Brustgewebe herangezogen. Kryosta-tschnitte ' wurden hergestellt und verarbeitet, wie in Beispiel 1, unter Ersatz des Anti-Insulin-Antiserums durch ein Kaninchen-Anti-Casein-Antiserum, das in PBS auf 1/1.000 verdünnt wurde. Es wurde"n analoge Ergebnisse wie in Beispiel 1 erzielt.

Durch analoge Vorgehensweise an gefrorenen Geweben und unter Anwendung entsprechender Antisera wurden die' folgenden Antigene identifiziert:

Human-lnsulin in Human-Pancreas;

Hepatitis B-Oberflächen-Antigen (HBsÄG). in Human-Leber;

Huraan-Lysozym im Human-Dühndarnr;
Human-Myoglobin im Human-Skelettmuskel; Human-Glucagon. in Human-Pahcreas.

Beispiel 7

Hepatitis B-Oberfläehen-Antigen (UBsAG) in Hujman-Lebergewebe wurde', wie folgt identifiziert. ■

■ Es wurde Buman-Lebergewebe herangezogen, das wie in Beispiel 1" beschrieben, fixiert und eingebettet wurde.

Paraffinschnitte wurden auf pH.7,2.PBS gebracht.

Die Abbildungen'wurden 15 Minuten lang mit PBS gewaschen und dann bei 37⁰C 2 Stunden lang mit Kaninchen-■ Anti-HBsAG-AntiEcrum (1/500-Lösung in PBS) inkubiert. .'

Nach Waschen in PBS über 15 Minuten wurde den Schnitten eine PBS-Lösung (5 0 μΐ), die Anti-Kaninchen-F Fragment-Irnraunoglobuline, die/gemäss 'der in FEBS Letters 9j3, 311 (1978) berichteten Vorgehensweise, in ■ 'Eseln (4,5 χ 10 μΜ) entstanden und zu ß-D-Galactosidase, aus Escherichia CoIi (1,5 χ 10 μΜ) konjugiert waren, 'und 1 % Normal-Ese'lseruia enthielt, zugefügt.

Nach 3 0 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Schnitte ' mit PBS 15 Minuten lang gewaschen, dann wurde eine Aufklärungs-Lösung angewandt, die erholten wurde durch f Lösen in pH = 7,2-PBS von:

5-Br~4-Cl~3-indolyl-ß-D- galactosid 0,44 g/l Magnesiumchlorid . 0,9 mM/1

Natriumjodid 1 %

Natriumwolframat . ■ ■ 0,0015 %

Nach Inkubation über 30 Minuten bei Raumtemperatur und Waschen mit PBS wurden die Zellkerne mif Neü.tralrot gegengefärbt·, die Schnitte entwässert und auf Eukitt ^R aufgebracht.

.

Die Gewebe wurden mittels eines Lichtmikroskops (Leitz Orthoplan) bei 200-facher Vergrösserung untersucht. Die Positiv-Reaktion erschien intensiv blau. Die Positiv-Färbung war sehr gut sichtbar, da der Hintergrund ungefärbt war und die Zellkerne rotgefärbt erschienen. Die Ergebnisse wurden mit denjenigen verglichen, die in demselben Gewebe erhalten wurden, die.mit demselben Anti-HBsAG-Antiserum behandelt und ans chli'es send entsprechend der Peroxidase-PAP-Methode gemäss Stemberger (siehe Bezug in- Beispiel 1) verarbeitet wurden.

Analoge Ergebnisse wie·in Beispiel 1 wurden beobachtet. · ^ '■-

Dieselbe Vorgehensweise von Beispiel 7 wurde wiederholt, unter Anwendung einer Aufklärungs-Lösung, die 0,0015 % Natriumtetraborat bzw. 0,00175 % Natriummolybdat, anstatt 0,0015 % Natriumwolf jrarnat, enthielt.

"Auch in diesen Fällen wurden analoge Resultate wie in Beispiel 1 beobachtet. "„

.- 33 -

Beispiel 8

Es wurde ein Reagens zur histochemischen Identifizierung des Hepatitis B-Oberflächen-Antigens (HBcAG) auf 50 Huanan-Lebergewebeschnitten hergestellt, das enthielt

(a) eine 1/500-Lösung von Kaninchen-Ant'i-HBsAG-/mtiserum in PBS: 2,5 ml;

(b) eine 1/100-Lösung von Escherichia Coli-ß-D-

galactosidase-konjugiei~ton Anti-Kaninchen-Fc-Fr iigment-Immunoglobulinen in PBS: 2,5 ml; und

(c) eine gefriergetrocknete Komponente, die vor

Gebrauch in destilliertem Wasser gelöst wird, um 2,5 ml einer wässrigen Lösung zu ergeben, mit der folgendem Zusammensetzung:

5-Br-4-Cl-3-indolyl-ß-D-galactosid 0,44 g/l

Magnesiumchlorid 0,9 mM/1

Natriurnjodid 1 %

Natriumwolframat 0,0015 %

. Die Komponenten (a), (b) und {c) des Reagenses wurden ■gemäss der Vorgehensweise des Beispiels 7 a):gev/andt.

Analoge Reagentien wurden mit derselben oben genannten Zusammensetzung hergestellt, jedoch mit einer gefriergetrockneten Komponente (c), die 0,0015 % Natriumtetraborat bzw. 0,0075 % Natriummolybdat, anstatt·0,0015 %

Natriumwolfrämat, enthielt, wobei die ££O_zent-Konzentrationen von Natriunitetraborat und Natriummolybdat immer noch auf 2,5 ml wässrige Lösung bezogen sind.

Des gleichen wurden die genannten Reagentien zur Identifizierung des HBs/\G-Antigens in Human-Lebergeweben, gelnäss Vorgehensweise von Beispiel 7, angewandt.

Beispiel 9

Ein Kaninchen-spezifisches Reagens wurde hergestellt, das für die histochemische Demonstration jeder Art von Antigen auf 50 Human-Gewebeschnitten anwendbar ist und zusammengesetzt ist aus:

(a¹) einer 1/100-Lösung von Escherichia-Coli-ß-D-

galaktosidase-konjugierten Anti-Kaninchen-F -Fragrnent-Immunoglobulinen in PBS: 2,5 ml;

und

(b¹) einer gefriergetrockneten Komponente, die ; vor Gebrauch in destilliertem Wasser gelöst wird, um 2,5 ml einer wässrigen Lösung zu er

geben, mit der folgenden Zusammensetzung:

5-Br-4-Cl-3-indolyl-ß-D-galactosid Magnesiumchlorid
Natriumjodid

Natriumwolfrämat .

0,	44	g/i
0,	9	mM/1
1		%
ö.,	O'01 5	%

,.Λ
ι \

- 35 -

Die Komponenten (a¹) und (b¹) des Reagenses wurden angewandt gemäss Vorgehensweisen, analog denen, die in den Beispielen 1 und 7 beschrieben sind, zur Identifizierung von:
5

Human-Insulin in Human-Pancreas;
Human-Casein in Human-Brustgewebe; Hepatitis B-Oberflächen-Antigen (HBsAG) in Human-Leber; Human-Lysozym im Human-Dünndarm; · Human-Myoglobin im Human-Skelettmuskel; und Human-Glucagon in Human-Pancreas;

in allen Fällen unter Anwendung eines /mtiserums, das . in Kaninchen entstanden ist, d.h. jeweils Anti-Insulin-Antiserum, entstanden in Kaninchen, Anti-Casein-Antiserum, entstanden in Kaninchen, Anti-HBsAG, entstanden in Kaninchen, Anti-Lysozym-Antiserum, entstanden in Kaninchen, Anti-Myoglobin-Antiserum, entstanden in Kaninchen, 'und Anti-Glucagon-Antiserum, entstanden in Kaninchen.

Analoge Kaninchen-spezifische Reagentien wurden mit . derselben oben genannten Zusammensetzung hergestellt, jedoch mit einer gefriergetrockneten Komponente (b¹), die 0,0015 % Natriumtetraborat bzw. 0,0075 % Natriummolybdat, anstatt 0,0015 % Natriumwolframat, enthielt, wobei die Prozent-Konaentrationen von Natriumtetraborat und Natriummolybdat immer noch auf 2,5 ml wässrige Lösung bezogen sind. Die genannten Reagentien wurden in diesem Beispiel zur Identifizierung aller oben genannten Antigene, entsprechend Vorgehensweisen, analog den

in den Beispielen 1 und 7 beschriebenen, angewandt.

Beispiel 10

Ein Ziege-spezifisches Reagens wurde zur histochemi-' sehen Identifizierung eines Antigens auf SO Human-Gewebeschnitten hergestellt, mit derselben Re'agens-Zusammensetzung, wie in Beispiel 9 beschrieben; es., enthielt jedoch ß-D-Galactosidase-konjugierte Anti-Ziege-F -Fragment-Immunoglobuline, anstatt ß-D-Galactosidase-konj ugierte Anti-Kaninchen-F -Fragment-Immunoglobuline .

Ähnliche Reagentien wurden hergestellt, enthielten je-' doch ß-D-Gulactosidase-konjugierte Anti-Schaf-F Fragment-Immunoglobuline bzw. ß.-D-Galactosidase-konjugierte Anti-Maus-F -Fragment-Immunoglobuline, anstatt ß-D-GalacLosidase-konjugierte Anti-Kaninchen-F -Fragment-Immunoglobuline.

Jedes Reagens wurde angewandt zur Identifizierung von Human-Myoglobin im Human-Skelettmuskel und von. Hepatitis B-Oberflüchen-Antigen (HBsAG) im Human-Lebergewebe, entsprechend Vorgehensweisen, analog denen, die in den Beispielen 1 und 7 beschrieben sind, jedoch unter Anwendung von Anti-Myoglobin-Antiserum bzw. Anti-HBsAG-Antiserum, jeweils entstanden in Ziegen oder Schafen oder Mäusen.

Claims

HOFFMANN . EITUE"&'PÄF«?hfeR^#··*"'·*

PATENT- UMD RECHTSANWÄLTE

PATENTANWÄLTE DiPL.-ING. W. EITLE · DR. RER. NAT. K. HOf Ι-ΜΛΝΝ . DIPL.-ING. W. LPHN

DIPL.-ING. K. FÜCHSLE · DR. RFR. NA¹I. H. HAMSL-N · UR. RER NAT, H.-A. BRAUNS · C^IPL.-ING. K. GDRB

DIPL.-ING. K. KOHLMANN · RECHTSANWALT A. NETTTi

38 021

FARMITALIA CARLO ERBA S.p.A., MAILAND / ITALIEN

Verfahren und Reigentien für die Anwendung von ß-D-Galactosidas■; als Tracer in der Immung-Zytochemie

PATENTANSPRÜCHE

{ 1 .j Zytocheraisches Immunoenzym-Verfahren zur Antigen-Identifizierung in Geweben, dadurch gekennzeichnet , dass ß-D-Galactosidase als Tracer angewandt wird.
5
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Antigen-Identifizierung in Geweben mittels der Bildung eines unlöslichen und gefärbten Produktes, das durch die Wirkung des ß-D-Galactosidase-Tracers auf ein spezifisches chroinogenes Substrat erhalten wird, geleistet

und der ß-D-Galactosidase-Tracer mittels eines spezifischen Binders an das zu identifizierende Antigen gebunden wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die ß-D-Galactosidase mikrobielle ß-D-Galactosidase ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch g e k e η η zeichnet/ dass die mikrobielle ß-D-Galactosidase ß-D-Galactosidase von Escherichia CoIi ist.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch g e k e η ή ^to zeichnet, dass der spezifische Binder, der ß-D-Galactosidase an das zu identifizierende Antigen bindet, aus einem Antikörper besteht, der zum Antigen selbst spezifisch ist.
6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass der spezifische Binder, der ß-D-Galactosidase an das zu identifizierende Antigen bindet, aus einem zum Antigen selbst spezifischen Antikörper und einem Konjugationssystem besteht, das befähigt ist, ein ß-D-Galactosidase-Konjugat zu ergeben.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , dass das ß-D-Galactosidase-Konjugat ein ß-D-Galactosidase-konjugierter AntiAntikörper ist.

!."••Ι i Ί ' :"
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch g e k e η η • zeichnet , dass das ß-D-Galactosidase-

Konjugat ein ß-D-Galactosidase-konjugicrtes Biotin-Avidin-Systcη ist.
5
9. Verfahren naah Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass das spezifische chromogene Substrat ein ß-D-Galactosid-Derivat ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , dass das ß-D-Galactosid-Derivat ein Indolyl-ß-D-galactosid-Derivat ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch g e k e η η zeichnet, dass das Indolyl-ß-D-galactosid-Derivat 5-Brom-4~chlor-3-indolyl-ß-D-galactosid ist.
12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch g e k e η η zeichnet, dass das ß-D-Galactosid-Derivat ein Naphthyl-ß-D-galactosid ist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , dass das Naphthyl-ß-D-galactosid 6-Brom-2-naphthyl-ß-D-galactosid ist.
14. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Indolyl-ß-D-galactosid-Derivat als chromogenes Substrat angewandt wird und gegebenenfalls ein Azo-Kupplungsreagens zugegen ist.
15. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass ein Naphthyl-ß-D-galactosid-Derivat als chromogenes Substrat angewandt wird und ein Azo-Kupplungsreagens als zusätzlicher Reaktionspartner zugegen ist.
16. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass ein Indolyl-ß-D-galactosid- oder Naphthyl-ß-D-galactosid~Derivat als chromogenes Substrat angewandt wird und ein Azo-Kupplungsreagens, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus hexazotiertem p-Rosanilin, Echtblau VB, Echtblau BB, Echtblau RR und Echtgraneit GBC, zugegen ist.
17. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass ein Indolyl-ß-D-galactosid-Derivat als das chromogene Substrat angewandt wird und gegebenenfalls ein oxidierendes oder elektronenübertragendes Reagens zugegen ist.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das oxidierende oder elektronenübertragende Reagens Phenazinmethosulfat oder ein Tetrazoliurasalz ist.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das oxidierende oder elektronenübertragende Reagens ein Redox-Ionenpaar ist.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet , dass das Redox-Ionenpaar aus

Fe /Fe -Ionen oder Ce /Ce -Ionen besteht.
21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet , dass das Redox-Ionenpaar aus einer Gruppe, die aus j"/VO^~, j"/VO~, j"/WO₄", J~/MO^~, J~/Mo₇O₂₄ ⁶~ und J~/B₄O_? ²~ besteht, ausgewählt ist.
22. Reagens für die Verwirklichung eines zytochemisehen Immunoenzym-Verfahrens zur Antigen-Identi-

fizierung in Geweben, dadurch gekennzeichnet , dass ß-D-Galactosidase als Tracer angewandt wird, als wesentliche Komponenten, zusammengesetzt aus
15

(a) einem zum zu identifizierenden Antigen spezifischen Antikörper,

(b) ß-D-Galactosidase oder einem ß-D-Galactosidase-Konjugat und

(c) einem zur ß-D-Galactosidase spezifischen chromogenen Substrat

und befähigt,durch die Wirkung von ß-D-Galactosidase ein unlösliches und gefärbtes Produkt zu ergeben .
23. Reagens nach Anspruch 22, dadurch g e k e η η zeichnet, dass ß-D-Galactosidase ß-D-Galactosida.T.e von Escherichia CoIi ist.
24. Reagens nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet , dass das ß-D-Galactosidase-Konjugat ein ß-D-Galactosidase-konjugierter AntiAntikörper oder ein ß-D-Galactosidase-konjugier- tes Biotin-Avidin-System ist.
25. Reagens für die Verwirklichung eines zytochemischen Immunoenzym-Verfahrens zur Antigen-Identifizierung in Geweben, dadurch g e k e η η zeichnet, dass ß-D-Galactosidase als Tracer angewandt wird, als wesentliche Komponenten, zusaminengesetz aus

(a') einem ß-D-Galactosidase-konjugierten Anti-Antikörper und

(b') einem zur ß-D-Galactosidase spezifischen chromogenen Substrat

und befähigt, durch die Wirkung von ß-D-Galactosidase ein unlösliches und gefärbtes Produkt zu ergeben .
26. Reagens nach Anspruch 25, dadurch g e k e η η zeichnet, dass ß-D-Galactosidase in der Komponente (a¹) ß-D-Galactosidase von Escherichia CoIi ist.
27. Reagens nach Anspruch 25, dadurch g e k e η η zeichnet, dass der zur ß-D-Galactosidase konjugierte Anti-Antikörper in der Komponente (a¹) ein Anti-Kaninchen- oder Anti-Ziege- oder AntiSchaf- oder Anti-Maus-Antikcrper ist.