IT202100008201A1 - Frammento anticorpale della regione variabile a catena singola (scfv) e suo uso per la identificazione della porzione extracellulare del cd79b a scopo terapeutico e diagnostico - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
A corredo di una domanda di brevetto di invenzione dal titolo: ?Frammento anticorpale della regione variabile a catena singola (scFv) e suo uso per la identificazione della porzione extracellulare del CD79B a scopo terapeutico e diagnostico?
CAMPO DELL?INVENZIONE
1. La presente invenzione si riferisce al campo degli anticorpi e alla loro applicazione per scopi diagnostici ed immunoterapeutici in onco-ematologia.
2. In particolare la presente invenzione si riferisce alla generazione di un anticorpo monoclonale, di tipo immunoglobuline del gruppo G, in grado di riconoscere e legare la porzione extracellulare della proteina umana CD79B (Figura 1) ed al suo uso medico nel campo dell?immunoterapia dei linfomi esprimenti il CD79B attraverso il frammento della regione variabile a catena singola (single chain Fragment variable, scFv) dell?anticorpo.
STATO DELL?ARTE
3. La possibilit? di sviluppare anticorpi monoclonali contro antigeni espressi da cellule neoplastiche ha rivoluzionato la diagnosi e il trattamento delle malattie oncologiche. Negli ultimi tempi inoltre, l?aumento delle conoscenze nel campo dell?immuno-oncologia e dell?ingegneria genetica hanno consentito di sfruttare la caratteristica specificit? degli anticorpi monoclonali per produrre nuovi modelli di immunoterapia come gli anticorpi bispecifici, trispecifici, i nanobodies e le cellule CAR-T (Chimeric antigen receptor T-cells).
4. Queste forme innovative di immunoterapia si basano sull?associazione tra il riconoscimento specifico di una determinata proteina tumorale, tipico della risposta immunitaria anticorpale, e la citotossicit? indotta dall?attivazione linfocitaria, caratteristica della risposta immunitaria cellulo-mediata. La combinazione di queste due potenzialit? permette ai linfociti T citotossici di eliminare le cellule tumorali che esprimono un determinato antigene extracellulare, in maniera selettiva e specifica.
5. Il riconoscimento degli antigeni tumorali in queste nuove forme di immunoterapia non avviene in maniera fisiologica, attraverso l?interazione tra il recettore dei linfociti T (T-cell receptor, TCR) e il complesso maggiore di istocompatibilit?, ma ? mediata da una sequenza amminoacidica artificiale, derivata dalle regioni variabili delle catene leggere e pesanti (complementary determining regions, CDRs) di un anticorpo monoclonale.
6. Questa sequenza ? denominata frammento della regione variabile a catena singola (single chain fragment variable, scFv) e viene ottenuta coniugando insieme le CDRs della sequenza genetica di uno specifico anticorpo monoclonale.
7. Il vantaggio di un riconoscimento antigene-specifico mediato dalla scFv ? quello di poter generare una risposta immunitaria contro qualsiasi molecola espressa sulla superficie delle cellule tumorali, anche se non presentata dal complesso maggiore di istocompatibilit?.
8. La possibilit? di eliminare tali cellule, "invisibili" al sistema immunitario per la mancata espressione del complesso maggiore di istocompatibilit?, costituisce una importante alternativa terapeutica in pazienti con neoplasie recidivanti o refrattarie a chemio e radioterapia.
9. Un esempio di come queste nuove forme di immunoterapia siano particolarmente efficaci ? rappresentato dalle cellule CAR-T, in cui i linfociti T dei pazienti vengono geneticamente modificati per esprimere la proteina chimerica CAR, costituita dalla fusione tra la scFv di un anticorpo monoclonale ed il dominio di attivazione delle cellule T (CD3z).
10. Il riconoscimento di uno specifico antigene espresso dalla cellula tumorale da parte della proteina chimerica CAR, determina l?attivazione del linfocita CAR-T con il conseguente rilascio di granuli e citochine che portano alla distruzione selettiva della cellula target anche in assenza della presentazione da parte del complesso maggiore di istocompatibilit?.
11. Diversi studi clinici hanno mostrato un notevole successo della terapia con cellule CAR-T in ambito onco-ematologico, soprattutto mediante l'uso di cellule CAR T anti-CD19 per il trattamento di alcune malattie linfoproliferative quali la leucemia acuta linfoblastica e i linfomi diffusi a grandi cellule B. L?antigene CD19 ? consIDerato un target quasi IDeale per approcci innovativi di immunoterapia mediante cellule CAR-T in quanto espresso nella maggior parte delle cellule neoplastiche, mentre non ? espresso su cellule normali ad eccezione dei linfociti B maturi.
12. Tuttavia, un limite della terapia con cellule CAR-T anti-CD19 ? il possibile fenomeno dell??antigen escape?, dovuto alla capacit? della cellula tumorale di non esprimere o esprimere in maniera differente l?antigene CD19 sulla superficie cellulare per meccanismi di splicing alternativo.
13. Tale fenomeno consente alle cellule tumorali CD19 negative di sfuggire al riconoscimento e all?azione citotossica delle cellule CAR-T anti-CD19, e, quindi, di proliferare indisturbate e determinare la recidiva di malattia.
14. ?, dunque, necessaria l?identificazione di nuovi antigeni bersaglio che possibilmente abbiano un ruolo importante per la proliferazione e sopravvivenza della cellula tumorale, riducendo la possibilit? di un ?antigen escape? e consentendo, quindi, una risposta pi? efficace e durevole dopo trattamento con cellule CAR-T.
15. In considerazione del ridotto numero di antigeni tumorali alternativi al CD19 per il trattamento delle malattie linfoproliferative B con cellule CAR-T, ? essenziale la produzione di nuovi anticorpi monoclonali per generare le scFv necessarie allo sviluppo delle cellule CAR-T.
16. ? dunque necessaria la identificazione di nuovi antigeni bersaglio che possibilmente abbiano un ruolo importante per la proliferazione e sopravvivenza della cellula tumorale, riducendo la possibilit? di un antigen escape e consentendo quindi una risposta pi? efficace e durevole dopo trattamento con cellule CAR-T.
17. In considerazione del ridotto numero di antigeni tumorali alternativi al CD19 per il trattamento delle malattie linfoproliferative B con cellule CAR-T, ? essenziale la produzione di nuovi anticorpi monoclonali per generale le scFv necessarie allo sviluppo delle cellule CAR-T.
18. A tale scopo, questi nuovi anticorpi monoclonali dovrebbero possedere i seguenti requisiti:
- Riconoscere un antigene bersaglio che sia possibilmente espresso nella maggior parte delle cellule di neoplasie linfoproliferative B;
- Riconoscere un epitopo della porzione extracellulare dell?antigene bersaglio in maniera selettiva e specifica; - Riconoscere un antigene bersaglio che abbia possibilmente un ruolo importante per la cellula tumorale, che quindi sia espresso in maniera stabile e omogenea sulla superficie cellulare, anche nelle recidive di malattia;
- Riconoscere possibilmente tutte le isoforme di un antigene bersaglio, per evitare fenomeni di ?antigen escape? dovuti a meccanismi di splicing alternativo.
LA SOLUZIONE PROPOSTA
19. La presente invenzione riguarda lo sviluppo di un nuovo anticorpo monoclonale contro la porzione extracellulare dell?antigene CD79B umano, per il suo uso nel campo dell?immunoterapia attraverso la sua scFv.
20. Il CD79B, conosciuto anche come B29 o catena beta della proteina associata al recettore delle cellule B (B-cell receptor, BCR; Figura 1), ? considerato un importante antigene bersaglio per gli approcci di immunoterapia nei linfomi non Hodgkin a cellule B (B cell Non Hodgkin Lymphoma, B-NHL).
21. Il CD79B ? un antigene tumorale altamente specifico, in quanto espresso nella maggior parte dei B-NHL, indipendentemente dallo stadio, sottotipo e caratteristiche citogenetiche e molecolari.
22. Al contrario, tra le popolazioni cellulari normali, ? espresso solo dai linfociti B maturi, riducendo quindi il rischio di tossicit? "on-target/off-tumor?.
23. Uno studio clinico che ha valutato la sicurezza e l'attivit? di polatuzumab vedotin, un anticorpo anti-CD79B coniugato con il chemioterapico vedotin, in combinazione con chemioterapia e Rituximab, ha mostrato che l?aggiunta del polatuzumab vedotin non ha portato a una maggiore tossicit? rispetto alla sola chemioterapia.
24. Un?altra caratteristica che rende il CD79B un target particolarmente promettente per l?immunoterapia dei B-NHL, ? la sua importanza nel sostenere la proliferazione neoplastica e nel conferire alle cellule linfomatose la capacit? di risultare resistenti a farmaci molecolari, come ad esempio l?ibrutinib.
25. Infine, il CD79B ? stabilmente espresso sulla membrana cellulare delle cellule tumorali, anche quando i pazienti recidivano dopo terapie con cellule CAR-T anti-CD19. Si stima che circa il 20?30% delle recidive dopo la terapia con cellule CAR-T anti-CD19 nei B-NHL sono causati dalla perdita di espressione dell?antigene CD19.
26. I meccanismi specifici responsabili dell??antigen escape? sono generalmente dovuti a mutazioni di esoni e delle isoforme di splicing del gene CD19, che portano alla scomparsa dell?espressione dell?epitopo riconosciuto dalla scFv del CAR anti-CD19. Pertanto ? di fondamentale importanza sviluppare nuove cellule CAR-T contro antigeni tumorali la cui espressione rimane conservata nelle varie fasi della malattia.
27. Al pari del CD19, anche l?espressione dell?antigene CD20 pu? essere persa nei B-NHL a seguito della pressione immunologica esercitata dall?anticorpo monoclonale anti-CD20 Rituximab, frequentemente associato agli schemi di chemioterapia nel trattamento delle malattie linfoproliferative.
28. L?antigene CD79B ? invece costantemente presente alla valutazione immunoistochimica e immunofenotipica nei B-NHL, sia alla diagnosi che alla recidiva.
29. Tale evidenza ? stata confermata anche nel caso di un paziente affetto da un Linfoma diffuso a grandi cellule B, trattato con cellule CAR-T anti-CD19 presso il Centro di Ematologia di Perugia. Dopo una iniziale risposta alla terapia con cellule CAR-T anti-CD19, documentata mediante PET-TC, il paziente ? recidivato a livello addominale, in una sede attigua ma precedentemente non interessata dalla malattia. La biopsia della nuova massa linfonodale ha confermato la presenza di cellule linfoidi di grande taglia ma che all?immunoistochimica non esprimevano pi? i marcatori classici dei linfomi B quali CD19, CD20 e CD79a (presenti prima della terapia con le cellule CAR-T).
30. L?unico marcatore rimasto costantemente espresso prima e dopo la terapia cellulare con le CAR-T era il CD79B.
31. Anche il confronto del sequenziamento dell?RNA tra i campioni prima del trattamento con le cellule CAR-T e alla ricaduta, ha confermato la scomparsa dell?espressione del CD19 e la persistenza di CD79B, a conferma dell?importanza del CD79B nella scelta del bersaglio terapeutico (Figura 2).
32. Pertanto, lo sviluppo di nuove cellule CAR-T anti-CD79B potrebbero rappresentare un valido approccio terapeutico per il trattamento dei B-NHL.
33. ? quindi di notevole importanza disporre di anticorpi monoclonali anti-CD79B altamente affini e specifici per scopi terapeutici, quale le terapie con cellule CAR-T.
34. Inoltre, anticorpi monoclonali sviluppati contro la porzione extracellulare del CD79B in grado di riconoscerne entrambe le isoforme, potrebbero essere impiegati a scopo diagnostico nell?ambito della valutazione immunoistochimica e immunofenotipica di tutti i Linfomi Non Hodgkin B.
35. In particolare, riconoscere in modo adeguato l?espressione del CD79B su cellule linfomatose potrebbe risultare particolarmente utile nel guidare in maniera mirata la scelta della migliore terapia, riservando o escludendo immunoterapie anti-CD79B come il Polatuzumab sulla base della presenza o meno del CD79B.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
Generazione e selezione dell?anticorpo monoclonale anti-CD79B
36. L?anticorpo monoclonale 128 4C5 ? stato generato contro un peptide ricombinante his-coniugato da 16 kDa (U5623EH200-1), corrispondente alla porzione extracellulare amminoterminale NH2 della proteina CD79b (Figura 3). La sequenza nucleotidica del peptide ricombinante U5623EH200-1 ? stata clonata nel plasmide pET-30a, espresso in E. coli, e purificato dai lisati batterici mediante cromatografia su colonna su colonne Ni. Dopo sterilizzazione, con un filtro da 0,22 ?m, ? stata determinata la concentrazione del peptide mediante analisi delle proteine secondo Bradford. La purezza del peptide U5623EH200-1 ed il suo peso molecolare sono stati determinati mediante SDS-PAGE standard e confermati in Western blotting (Figura 4) (GenScript USA Inc, Piscataway, NJ, USA).
37. La sequenza amminoacidica del peptide ricombinante sintetizzato ? la seguente:
ARSEDRYRNPKGSACSRIWQSPRFIARKRGFTVKMHCYMNSASGNVSWLWKQEMDENPQQL KLEKGRMEESQNESLATLTIQGIRFEDNGIYFCQQKCNNTSEVYQGCGTELRVMGFSTLAQ LKQRNTLKD.
38. Gli anticorpi monoclonali (mAb) sono stati prodotti presso il polo accademico Centro Ricerche Onco-Ematologiche (CREO, Perugia, Italia). In breve, il peptide ricombinante della porzione extracellulare del CD79B (172,5 ?g) ? stato risospeso in PBS e somministrato per via intraperitoneale in topi Balb/c. Dopo la quarta somministrazione, i topi sono stati sacrificati e la loro milza utilizzata per generare gli ibridomi. Tra tutti i cloni sottoposti a screening mediante immunoistochimica, il surnatante del clone 128 di una singola colonia di ibridoma ha mostrato una reattivit? contro i linfociti B su criosezioni di tonsille umane (Figura 5). Il clone 128 ? stato successivamente subclonato per 4 volte per assicurarne la monoclonalit? (clone 128 4C5).
39. Valutazione della specificit? dell?anticorpo monoclonale anti-CD79B
40. Per valutare la specificit? dell?anticorpo monoclonale anti-CD79B 128 4C5, sono state eseguite analisi di western blotting e citometria a flusso su cellule CD79b positive come i linfociti B e due linee cellulari di Linfoma non-Hodgkin B, SUDHL-16 e RIVA. Come controlli sono state valutate cellule CD79B negative, come i linfociti T e la linea cellulare di leucemia acuta mieloide KG-1.
41. La migrazione della proteina CD79B in western blotting ? stata confermata confrontando il mAb designato 128 4C5 con un mAb anti-CD79B commerciale gi? convalidato, come controllo. Una banda 37-40 kDa (corrispondente al peso molecolare del CD79B) ? stata rilevata nella corsia dei lisati dei linfociti B e delle linee cellulari umane di NHL SUDHL-16 e RIVA. Nelle corsie dei controlli negativi, non ? stata osservata alcuna espressione nei lisati dei linfociti T e delle linee cellulari KG-1. Un profilo di espressione analogo ? stato rilevato con un anticorpo commerciale anti-CD79B precedentemente validato, confermando la specificit? dell?anticorpo (Figura 6).
42. Il riconoscimento della sola porzione extracellulare dell?antigene CD79B ? stato valutato mediante citometria a flusso sulle linee cellulari umane di NHL non permeabilizzate (SUDHL-16 e RIVA), coltivate in fiasche con terreno 1630 RPMI al 20% di FBS. Le cellule sono state lavate con una soluzione di PBS-BSA 2% e marcate prima con l?anticorpo primario designato 128 4C5 e poi con l?anticorpo secondario coniugato con il fluorocromo Alexa-488. Le cellule marcate non permeabilizzate sono state analizzate con lo strumento BD FACS Canto II, mostrando una intensa espressione del CD79B rispetto alle cellule marcate con il solo anticorpo secondario.
43. Inoltre, per escludere la cross-reattivit? dell?anticorpo anti-CD79B 128 4C5 con altri epitopi presenti sulla superficie cellulare, sono state eseguite due ulteriori indagini a conferma della specificit? del mAb.
44. Nella prima indagine, il cDNA dell?antigene CD79B ? stato transfettato temporaneamente nelle linee cellulari embrionali umane 293t, che non esprimono il CD79B a causa della loro derivazione fibroblastica. Dopo 24 ore dall?inoculo del cDNA mediante lipotrasfezione, le cellule 293t sono state colorate e analizzate per WB e citofluorimetria, come descritto in precedenza. L?anticorpo monoclonale anti-CD79B 128 4C5 ha mostrato una marcata intensit? di espressione nelle sole cellule 293t transfettate con il cDNA del CD79B, mentre le cellule 293t non trasfettate usate come controllo sono risultate negative (Figura 7).
45. Nella seconda indagine, ? stata utilizzata la tecnica del gene editing mediante CRISPR-CAS9 per provocare il knockout (KO) del CD79b sulla linea cellulare di NHL SUDHL-16. In breve, gli sgRNA modificati chimicamente per riconoscere il gene che codifica per il CD79B sono stati disegnati utilizzando mediante il software Synthego CRISPR Gene KO e acquistati da Synthego.
1,5 ?g di proteina Cas9 (IDT) e 1 ?g di sgRNA sono stati coniugati e incubati per 15 minuti a temperatura ambiente.
400.000 cellule SUDHL-16 sono state lavate con PBS, risospese in tampone Neon T, risospese con il complesso ribonucleoproteico Cas9/sgRNA e quindi elettroporate (Invitrogen Neon Electroporation System, Thermofisher, USA). Dopo l'elettroporazione, le cellule sono state incubate a 37? C fino alla valutazione. Sia l?analisi in western blotting che in citofluorimetria hanno mostrato che il mAb anti-CD79b designato 128 4C5 ? in grado di riconoscere solo la linea cellulare SUDHL-16 wild type. Nella linea cellulare modificata CD79B KO invece, l?anticorpo non ha mostrato alcuna reattivit? in citofluorimetria mentre in western blotting non sono state riconosciute bande all?altezza del peso molecolare del CD79B (Figura 8).
Valutazione del riconoscimento di entrambe le isoforme del CD79B
46. Dopo aver stabilito la specificit? e la selettivit? dell?anticorpo monoclonale designato 128 4C5 anti-CD79B, ? stata indagata la capacit? di riconoscimento delle varie isoforme dell?antigene CD79B. Cellule 293t sono state transfettate sia con l?isoforma 1 (detta anche isoforma lunga, della lunghezza di 229 AA e del peso molecolare di 33-40 kDa) che con l?isoforma 2 dell?antigene (detta anche isoforma corta, della lunghezza di 125 AA e del peso molecolare di 15-20 kDa). I lisati cellulari delle cellule 293t transfettate sono stati poi valutati mediante analisi di western blotting con l?anticorpo monoclonale anti-CD79b designato 128 4C5 e confrontato con le cellule 293t non transfettate, utilizzate come controllo. Una banda in corrispondenza del peso molecolare di entrambe le isoforme del CD79B ? visibile nei lisati delle cellule 293t transfettate, mentre nessuna banda ? rilevabile invece nelle cellule 293t non transfettate utilizzate come controllo (Figura 9).
Isolamento e sequenziamento della scFv dell?anticorpo monoclonale anti-CD79b
47. Per le caratteristiche di tale mAb designato 1284C5 contro la porzione extracellulare dell?antigene CD79B, una sua possibile applicazione terapeutica potrebbe essere l?utilizzo della sua scFv per lo sviluppo di anticorpi bispecifici e chimeric antigen receptors (CARs) anti-CD79B. Per questo ultimo scopo, le cellule dell?ibridoma 128 4C5 sono state utilizzate per estrarre la sequenza genetica dei domini variabili della catena pesante e leggera dell'anticorpo (regioni che determinano la complementarit?, CDR), caratteristica per il legame dell'antigene specifico. In breve, dalle cellule dell?ibridoma 128 4C5 ? stato estratto l?RNA totale seguendo il manuale tecnico del kit RNeasy Plus Micro (QIAGEN, Cat. No.: 74034). L'RNA ? stato quindi retrotrascritto in cDNA utilizzando primer anti-senso specifici per isotipo o primer universali seguendo il manuale tecnico della trascrittasi inversa SMARTScribe (TaKaRa, Cat. No.: 639536). I frammenti di anticorpi di catena pesante e catena leggera sono stati amplificati secondo la procedura di amplificazione rapida delle estremit? del cDNA di GenScript (RACE). I frammenti degli anticorpi amplificati sono stati clonati separatamente in un vettore di clonazione standard ed eseguita una PCR per lo screening di cloni con inserti di dimensioni corrette (Figura 10).
48. L?anticorpo monoclonale della presente invenzione ? inoltre idoneo all?impiego in campo diagnostico, in considerazione delle caratteristiche precedentemente illustrata. Oltre a riconoscere in modo netto e specifico le cellule CD79B positive in citofluorimetria, l?anticorpo designato 128 4C5 ? risultato reattivo anche in immunoistochimica, su sezioni paraffinate di B-NHL (Figura 11, pannello in alto). Tale marcatura ? risultata analoga a quella di un anticorpo anti-CD79B commerciale (Figura 11, pannello in basso), a conferma della possibilit? di utilizzo diagnostico di tale anticorpo monoclonale anche in istologia oltrech? in citofluorimetria e immunofluorescenza.
Tabella 1
SPIEGAZIONE DELLE FIGURE
Figura 1. Struttura del B-cell receptor, composto da una immunoglogulina legata in modo non covalente a una fosfoproteina eterodimerica transmembrana composta dal CD79a (Ig?) e dal CD79b (Ig?) (Mourad Aribi (February 26th 2020). Introductory Chapter: B-Cells, Normal and Malignant B-Cell, Mourad Aribi, IntechOpen, DOI: 10.5772/intechopen.90636)
Figura 2. Riporta il caso clinico di un paziente con Linfoma diffuso a grandi cellule B trattato con cellule CAR-T anti-CD19 presso il nostro centro, in cui si ? verificata una recIDiva CD19 negativa dopo l?iniziale risposta. Immagini della tomografia a emissione di positroni (A); analisi immunoistochimica con colorazione H&E, CD19, CD79a e CD79B dei campioni del paziente prima del trattamento e alla recIDiva dopo l'infusione delle cellule CAR-T anti-CD19 (B); sequenziamento dell?RNA relativi al CD19 e al CD79B prima del trattamento e alla recidiva dopo l'infusione delle cellule CAR-T anti-CD19 (C).
Figura 3. Riporta la sequenza (nucleotidica e amminoacidica) del peptIDe U5623EH200-1, sintetizzato in base alla sequenza della porzione extracellulare del CD79B ed utilizzato per l?immunizzazione murina.
Figura 4. Riporta l?analisi elettroforetica in sodium dodecyl sulfate?poliacrilamide gel (SDS-PAGE) e western blot (WB) del peptide U5623EH200-1, sintetizzato in base alla sequenza della porzione extracellulare del CD79b ed utilizzato per l?immunizzazione murina. Corsie M1 e M2: marcatori in kDa; corsia 1: BSA 2 ug; corsie 2 e 3: peptide U5623EH200-1.
Figura 5. Colorazione immunoistochimica su criosezioni di tonsille umane utilizzando l?anticorpo monoclonale primario anti-CD79B 128 4C5, che evidenzia i linfociti B del mantello e del centro germinativo.
Figura 6. Risultati di analisi citofluorimetrica riguardo la specificit? dell?anticorpo monoclonale anti-CD79B 128 4C5 nel riconoscere la porzione extracellulare del CD79b espresso da cellule 293t transfettate con il cDNA della proteina CD79B (pannelli di destra). Nessuna espressione ? rilevabile invece nelle cellule 293t non transfettate utilizzate come controllo.
Figura 7. Risultati di analisi di western blot riguardo la specificit? dell?anticorpo monoclonale anti-CD79B 128 4C5, confrontato con un anticorpo commerciale anti-CD79B gi? validato. Nei lisati cellulari dei controlli positivi (linea cellulare di NHL SUDHL-16 wild type e linfociti B) ? presente una banda in corrispondenza del peso molecolare del CD79b (37-40 kDa), mentre nei controlli negativi (linea cellulare di NHL SUDHL-16 CD79B KO e linfociti T) non ? visibile alcuna banda a quell?altezza.
Figura 8. Risultati di analisi di western blot che mostrano il riconoscimento di entrambe le isoforme del CD79B da parte dell?anticorpo monoclonale anti-CD79B 128 4C5. Nei lisati cellulari di cellule 293t transfettate con il cDNA sia dell?isoforma 1 (lunga) che dell?isoforma 2 (corta) della proteina CD79B, ? visibile una banda in corrispondenza del peso molecolare di entrambe le isoforme del CD79B (isoforma 1 o lunga: 37-40 kDa; isoforma 2 o corta: 17-20 kDa). Nessuna espressione ? rilevabile invece nelle cellule 293t non transfettate utilizzate come controllo.
Figura 9. Specifiche del sequenziamento genetico del dominio variabile dei geni dell?ibridoma che codificano per l?anticorpo monoclonale anti-CD79B 128 4C5 (analisi immunogenica delle giunzioni V (D) J)
Figura 10. Sequenze amminoacidiche delle CDRs delle catene leggere e pesanti dell?anticorpo monoclonale anti-CD79B 128 4C5, necessarie per la sintesi della scFv.
Figura 11. Colorazione immunoistochimica su sezioni paraffinate di un caso di Linfoma Diffuso a Grandi Cellule B, dove viene confrontata la marcatura tra l?anticorpo monoclonale primario anti-CD79B 128 4C5 e un anticorpo commerciale anti-CD79B.
Claims (15)
1. Frammento anticorpale della regione variabile a catena singola (scFv) di una immunoglobulina di tipo IgG1 in grado di riconoscere e legare un epitopo del dominio extracellulare della proteina umana CD79B. Tale immunoglobulina comprende una catena variabile pesante (VH) e una catena variabile leggera (VL) dirette preferibilmente contro detto dominio extracellulare consistente essenzialmente nella sequenza amminoacidica SEQ ID NO: 2, unite tra di loro da un linker peptidico.
2. Frammento anticorpale della regione variabile a catena singola, secondo la rivendicazione 1, in cui dette catene VH e VL comprendono ciascuna una regione CDR 3 consistente essenzialmente nelle sequenze amminoacidiche rispettivamente SEQ ID NO: 10 e 18 o sequenze con una identit? di almeno il 95%.
3. Frammento anticorpale della regione variabile a catena singola, secondo le rivendicazioni 1 e 2, in cui detta catena VH comprende una regione CDR 1 e una regione CDR 2 consistenti essenzialmente nelle sequenze amminoacidiche rispettivamente SEQ ID NO: 6 e 8 o sequenze con una identit? di almeno il 95%.
4. Frammento anticorpale della regione variabile a catena singola, secondo le rivendicazioni da 1 a 3, in cui detta catena VL comprende una regione CDR 1 e una regione CDR 2 consistenti essenzialmente nelle sequenze amminoacidiche rispettivamente SEQ ID NO: 14 e 16 o sequenze con una identit? di almeno il 95%.
5. Frammento anticorpale della regione variabile a catena singola, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui detta catena VH consiste essenzialmente nella sequenza amminoacidica SEQ ID NO: 4 o sequenze con una identit? di almeno il 95%.
6. Frammento anticorpale della regione variabile a catena singola, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, in cui detta catena VL consiste essenzialmente nella sequenza amminoacidica SEQ ID NO: 12 o sequenze con una identit? di almeno il 95%.
7. Frammento anticorpale della regione variabile a catena singola, secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detto linker consiste essenzialmente nella sequenza amminoacidica SEQ ID NO: 20.
8. Frammento anticorpale della regione variabile a catena singola, secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detto frammento consiste essenzialmente nella SEQ ID NO: 22 o sequenze con una identit? di almeno il 95%.
9. Sequenza nucleotidica codificante per un frammento anticorpale della regione variabile a singola catena, secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 8.
10. Cellula di ibridoma, identificata come 128 4C5, comprendente un gene che codifica per la sequenza nucleotidica secondo la rivendicazione 9.
11. Anticorpo umano, umanizzato o chimerico comprendente almeno una sequenza CDR di detto frammento anticorpale della regione variabile a singola catena secondo le rivendicazioni 2,3 e 4.
12. Frammento anticorpale della regione variabile a singola catena secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9, oppure anticorpo secondo la rivendicazione 11, per uso terapeutico nell?ambito dell?immunoterapia o per uso diagnostico.
13. Frammento anticorpale della regione variabile a singola catena secondo la rivendicazione 12, per l?uso nel trattamento dei Linfomi CD79B+ mediante cellule CAR-T geneticamente modificate per esprimere un recettore chimerico anti-CD79B derivato da tale frammento anticorpale secondo qualsiasi delle rivendicazioni precedenti.
14. Frammento o anticorpo, secondo le rivendicazioni da 11 a 13, per l?uso terapeutico consistente nel veicolare nelle cellule linfomatose CD79B+ composti citotossici ad azione antitumorale, radionuclidi, linfochine e chemochine.
15. Kit immunodiagnostico per il riconoscimento della proteina umana CD79B, comprendente detto frammento anticorpale secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9 per la diagnosi dei linfomi.
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Non-Patent Citations (2)
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| MOREADITH RANDALL W ET AL: "Clinical development of a poly(2-oxazoline) (POZ) polymer therapeutic for the treatment of Parkinson's disease - Proof of concept of POZ as a versatile polymer platform for drug development in multiple therapeutic indications", EUROPEAN POLYMER JOURNAL, PERGAMON PRESS LTD OXFORD, GB, vol. 88, 1 October 2016 (2016-10-01), pages 524 - 552, XP029942912, ISSN: 0014-3057, DOI: 10.1016/J.EURPOLYMJ.2016.09.052 * |
Also Published As
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