IT202000025207A1 - Formulazione spray per uso nasale/orale con attivita’ contro i coronavirus respiratori - Google Patents
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Description
FORMULAZIONE SPRAY PER USO NASALE/ORALE CON ATTIVITA? CONTRO I CORONAVIRUS RESPIRATORI
DESCRIZIONE
CAMPO DELL?INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce ad una formulazione spray per uso nasale/orale, con attivit? contro i Coronavirus respiratori e, in particolare, ad una soluzione da spruzzare nelle narici e in gola allo scopo di inibire o rallentare l?attivit? dei Coronavirus respiratori.
STATO DELLA TECNICA ANTERIORE I Coronavirus sono virus caratterizzati dalla presenza di una morfologia simile a una ?corona? evidenziabile al microscopio elettronico. Si dividono da un punto di vista tassonomico in tre generi:
- gruppo 1, che comprende virus che colpiscono gatti, maiali e due virus umani (NL63 e 229E) che causano infezioni respiratorie; - gruppo 2, nel quale sono compresi virus dei topi, dei maiali, delle pecore e cinque virus umani; e
- gruppo 3, che riguarda sostanzialmente solo virus aviari.
I cinque virus umani del gruppo 2 sono il virus OC43, il virus HKU1, il virus SARS-CoV (da Severe Acute Respiratory Syndrome emerso nel 2002 nella Provincia di Guangdong in China) (Weiss S.R. and Navas-Martin S.
2005)<1>, il virus MERS-CoV (da Middle East Respiratory Syndrome emerso nel 2012 in Arabia Saudita) ed il virus SARS-CoV-2 o COVID-19 (emerso tra la fine del 2019 e l?inizio del 2020 nella citta di Wuhan in Cina).
Sinteticamente, si possono riassumere le caratteristiche dei Coronavirus umani sopra indicati affermando che i virus NL63 e 229E del gruppo 1 e i virus OC43 e HKU1 del gruppo 2 causano infezioni superficiali a carico delle prime vie respiratorie, mentre i virus SARS-CoV, MERS-Cov e SARS-CoV-2 causano gravi infezioni delle vie aree inferiori.
I coronavirus umani entrano nelle cellule dell?organismo umano attraverso distinti recettori: il virus HCoV 229E si lega ad amminopeptidasi N; i virus HCoV OC43 e HCoV HKU1 utilizzano fondamentalmente degli zuccheri per entrare nelle cellule umane (porzioni contenenti Neu5,9Ac2); mentre il virus HCoV NL-63 e i tre virus SARS-CoV, MERS-CoV e SARS-CoV-2 impiegano l?enzima ACE2 (enzima convertitore dell'angiotensina 2) presente in numerose cellule dell?organismo umano (Wang Q., Zhang Y., Wu L. et al.
2020)<2>. La possibilit? dei coronavirus SARS-CoV-2 e SARS-CoV di legarsi ai recettori ACE 2 e di entrare nelle cellule dell?organismo umano dipende dalla presenza dei recettori ACE2 e, in misura minore, della serin proteasi TMPRSS2 (Hoffmann M., Kleine-Weber H., Schroeder S., Kruger N., Herrier T. et al.
2020)<3>. A livello nasale l?espressione dell?enzima ACE 2 risulta maggiore nelle cellule apicali di tipo secretorio, ciliate e soprabasali (Kuhnemund M., Lako M., Lee H. and Leroy S. et al. 2020)<4>.
Che numerosi virus, una volta entrati nell?organismo umano, possano poi colpire il sistema nervoso centrale ? oramai un fatto acquisito. L'entrata di virus nel cervello pu? avvenire o per via ematica o per via neuronale retrograda. In questo secondo caso il virus utilizza la macchina di trasporto assonale per ottenere l?accesso al sistema nervoso centrale. Per un virus respiratorio quest'ultimo caso ? rappresentato dalla possibilit? di infettare i recettori ed il bulbo olfattivo e questa evenienza ? stata dimostrata nei coronavirus, in studi su topi dopo inoculazione nasale, sia per il virus HCoV-OC43 che per il virus della SARS-CoV (Desforges M., Le Copuanec A., Debeau P., Bourgouin A., Lajoie L., Dub? M. and Talbot P.J. 2019)<5>.
L?espressione dei geni per ACE2 e TMPRSS2 ? assente nei neuroni sensoriali olfattivi mentre risulta presente nelle cellule sustentacolari e nelle cellule basali orizzontali ad una concentrazione simile a quella dell?epitelio respiratorio (mentre le cellule microvillari e le cellule delle ghiandole di Bowman esibiscono un?espressione dei geni TMPRSS2 uguale o maggiore a quella dell?epitelio respiratorio ma una minore frequenza dell?espressione di quelli ACE2). Il virus HCoV NL-63 e i tre virus SARS-CoV, MERS-CoV e SARS-CoV-2 possono quindi penetrare nel sistema nervoso centrale non direttamente attraverso i neuroni sensoriali olfattivi ma attraverso le cellule di supporto, le cellule staminali che fanno parte dell?epitelio olfattivo (Brann D.H., Tsukahara T., Weinreb C., Lipovsek M. et al. 2020)<6 >e probabilmente i periciti vascolari che accompagnano il nervo olfattivo. Del resto esperimenti condotti con ratti transgenici per l?espressione dell?enzima umano ACE2 hanno evidenziato come l?inoculazione intranasale del virus SARS-CoV sia causa di evidente morte neuronale in assenza di segni di encefalite. Lo schema di distribuzione neuronale dell'antigene virale era fortemente suggestivo di una penetrazione per via olfattiva, essendo presente nel bulbo olfattivo e in regioni come la corteccia piriforme e infralimbica, i nuclei basali (le regioni del pallido ventrale e dell?area preottica laterale) e del mesencefalo (la regione del rafe dorsale), tutte regioni con connessioni primarie o secondarie con il bulbo olfattivo (Netland J., Meyerhol D.K., Morre S., Cassell M. and Perlman S. 2008)<7>. ll fatto che, in un recente studio, l?espressione di ACE2 nell'epitelio olfattivo delle cavit? nasali sia risultato maggiore di quello dell?epitelio respiratorio (Chen M., Shen W., Rowan N.R., Kulaga H., Hille A., Ramanathan M. and Lane A.P.
2020)<8 >permette inoltre di ipotizzare che la principale via di penetrazione dei Coronavirus nell?organismo sia costituita proprio dall?epitelio olfattivo e dal sistema nervoso centrale e che la gravit? (spesso improvvisa) di certi quadri respiratori possa essere imputabile ad un?infezione del tronco encefalico (che comprende il nucleo del tratto solitario e il nucleo ambiguo).
Nel quadro medico sopra descritto, il problema affrontato dalla presente invenzione ? quello di offrire una formulazione spray per uso nasale/orale che sia in grado di inibire o quantomeno di ridurre l?attivit? virale all?interno della cavit? nasale, prima che i virus possano penetrare nell?organismo attraverso il sistema nervoso centrale o accedere in profondit? nel sistema respiratorio.
Nell?ambito di questo problema, un primo scopo dell?invenzione ? quello di offrire una formulazione spray per uso nasale/orale in grado di ostacolare il legame dei Coronavirus con i rispettivi recettori, in modo da ritardare l?accesso di detti Coronavirus all?interno delle cellule dell?epitelio nasale e della gola.
Un secondo scopo dell?invenzione ? poi quello di offrire una formulazione spray del tipo sopra indicato che mostri un?attivit? virucida sufficientemente elevata nei confronti dei Coronavirus da impedirne la penetrazione nelle cellule dell?organismo, senza tuttavia esplicare attivit? citotossica nociva nei confronti delle cellule dell?epitelio nasale e della gola.
DESCRIZIONE SOMMARIA DELL?INVENZIONE
Questo problema viene risolto e questi scopi vengono raggiunti mediante una formulazione spray per uso nasale/orale avente le caratteristiche definite nella rivendicazione 1. Altre preferite caratteristiche di detta formulazione spray per uso nasale/orale vengono definite nelle rivendicazioni secondarie.
BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI
Ulteriori caratteristiche e vantaggi della formulazione spray per uso nasale/orale secondo la presente invenzione risulteranno comunque meglio evidenti dalla seguente descrizione dettagliata di una forma di esecuzione preferita della stessa, fornita a puro titolo esemplificativo e non limitativo ed illustrata nel disegno allegato nel quale sono riportati i risultati di una prova di inibizione del legame tra una proteina spike del virus SAR-CoV-2 e il recettore ACE 2, mediante alcune formulazioni secondo l?invenzione.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELLA PREFERITA FORMA DI ESECUZIONE
Secondo la presente invenzione, al fine di risolvere il problema sopra evidenziato con una formulazione di facile reperibilit?, di basso costo e di sicura efficacia, l?inventore ha ipotizzato di utilizzare una coppia di sostanze attive che presentano un particolare effetto sinergetico. Una prima sostanza attiva ? infatti indirizzata ad ostacolare il legame tra i Coronavirus e il loro recettore ACE 2, impedendo cos? o quantomeno ritardando l?ingresso dei Coronavirus all?interno delle cellule dell?epitelio nasale e della gola. Una seconda sostanza attiva esplica invece un effetto virucida sui Coronavirus, la cui vulnerabilit? ? esaltata proprio dal fatto che si vengono a trovare per un tempo prolungato in posizione extracellulare e quindi maggiormente esposti all?effetto della sostanza attiva virucida, anche quando questa venga utilizzata in concentrazioni abbastanza ridotte da non esplicare un effetto citotossico significativo sulle cellule dell?epitelio nasale e della gola.
Le sostanze virucide hanno da sempre svolto un ruolo chiave nel limitare o eradicare la deleteria presenza di virus patogeni in numerosi ambienti. Tra queste sostanze virucide note il cloruro di benzalconio, che ? una miscela di cloruri di ammonio quaternari, pu? vantare ottime propriet? antisettiche e preservanti (The Merck Index); tale sostanza attiva presenta infatti un?ampia gamma di propriet? antibatteriche sia nei confronti di batteri gram positivi che di batteri gram negativi ed ? anche noto per la sua capacit? di inattivare numerosi virus. Per questo motivo viene infatti normalmente impiegato per la sanificazione di superfici inanimate dove distrugge sia virus che batteri.
? anche noto l?utilizzo del cloruro di benzalconio in spray e tamponi nasali, in concentrazioni comprese tra lo 0,02% e l?0,13%; tuttavia l?effetto sui virus in questo caso pu? essere ridotto dato che il ciclo vitale degli agenti virali si svolge prevalentemente in modo intracellulare. Le concentrazioni pi? basse di cloruro di benzalconio (0,02-0,05%) risultano dunque meno efficaci, poich? possono distruggere solo le particelle virali residuali che si trovano in posizione extracellulare, mentre concentrazioni pi? elevate di cloruro di benzalconio, che avrebbero teoricamente un?efficacia pi? marcata anche sui virus in posizione intracellulare, determinano un forte aumento della citotossicit? di questa sostanza attiva che porta alla distruzione non solo del virus in posizione intracellulare ma anche delle cellule che lo ospitano ed anche, ovviamente, delle cellule sane e cio? non ancora penetrate dal virus. ll cloruro di benzalconio a livello nasale viene dunque generalmente considerato sicuro e non irritante ad una concentrazione compresa tra lo 0,02% e lo 0,05%, mentre concentrazioni pi? elevate risultano irritanti e citotossiche e non sono quindi idonee per una formulazione curativa o preventiva per uso topico.
Per ovviare alla scarsa efficacia virucida del cloruro di benzalconio, almeno alle basse percentuali con cui questo pu? essere utilizzato a contatto delle mucose nasali e della gola di un essere umano, l?inventore ha ipotizzato di associare allo stesso il lisozima che ? una sostanza naturale presente in numerosi fluidi nasali dove agisce come agente antimicrobico. Il lisozima ? infatti una delle poche sostanze naturali presenti nel nostro organismo in grado di inibire numerose forme dell?enzima ACE2 presente nel nostro organismo.
Secondo l?invenzione, dunque, l?associazione di queste due sostanze attive in una medesima formulazione salina consente di raggiungere un imprevisto e sorprendente effetto sinergico dove il lisozima blocca il legame dei Coronavirus sull?enzima ACE2 presente nelle mucose nasali o della gola impedendo o ritardando l?entrata dei virus nelle cellule dell?epitelio respiratorio e delle vie olfattive. Grazie a questa azione inibitoria del lisozima, il cloruro di benzalconio ha la possibilit? di sviluppare la sua azione virucida, anche a concentrazioni non irritanti per l?epitelio nasale e della gola, distruggendo cos? i Coronavirus che non sono potuti penetrare nelle cellule della mucosa nasale e della gola a causa dell?indisponibilit? del recettore ACE2.
Nella formulazione spray dell?invenzione possono essere eventualmente incorporati coadiuvanti ed eccipienti noti nella pratica farmaceutica per migliorare l?assorbimento e l?efficacia della formulazione stessa. In particolare possono essere utilizzati, in associazione alle sostanze attive sopra descritte, sodio citrato per incrementare l?efficacia della formulazione e idrossietilcellulosa, metilcellulosa o proprionilmetilcellulosa per promuovere un effetto barriera della formulazione dell?invenzione che ne rende utile l?impiego in modo preventivo o ai primi sintomi di congestione nasale.
La soluzione salina in cui sono disciolti i componenti della formulazione pu? essere una tradizionale soluzione isotonica (0,9% NaCl) o, preferibilmente, una soluzione ipertonica (da 1,2% a 3% di NaCl). In quest?ultimo caso, infatti, l?uso della formulazione determina una depolarizzazione delle membrane cellulari della mucosa nasale contribuendo a rendere cos? le cellule maggiormente impermeabili alla penetrazione da parte dei Coronavirus.
Nella formulazione spray per uso nasale/orale della presente invenzione, la concentrazione del cloruro di benzalconio ? compresa tra 0,02% e 0,15% e preferibilmente tra 0,03% e 0,06%), mentre la concentrazione del lisozima ? compresa tra 0,2% e 1,0% e preferibilmente tra 0,3 e 0,8%.
L?azione inibente del lisozima sui recettori ACE2, che non possono pi? legarsi alle proteine spike virali, e quella della soluzione ipertonica sulle membrane cellulari hanno l?effetto di ostacolare e ritardare l'ingresso delle particelle virali nelle cellule della mucosa nasale e della gola. Le particelle virali permangono negli spazi extracellulari e vengono facilmente distrutte dal cloruro di benzalconio, anche alle basse concentrazioni utilizzate, senza che tale sostanza attiva possa dare alcun problema di citotossicit?. La distruzione delle particelle virali ? progressiva col tempo e viene completata in un periodo di 4-6 ore.
L?efficacia della formulazione spray della presente invenzione ? stata testata in una classica prova di riduzione su piastra secondo il metodo descritto da Hayden FG, Cote KM, Douglas RG (1980)<9>, con i risultati indicati nella sottostante Tabella 1. Un ceppo del virus hCoV-19/egypt/NRC-03/2020 ? stato diluito fino ad ottenere una concentrazione di 103 PFU/pozzetto e miscelato con la concentrazione erogata da un singolo puff di erogatore nasale/orale.
TABELLA 1
L?efficacia della formulazione spray della presente invenzione ? stata inoltre testata in una prova di inibizione del legame delle proteine spike del virus SARS-CoV-2 rispetto al recettore ACE2. Il test ? stato effettuato su un corredo commerciale per lo sviluppo di nuovi inibitori del virus SARS-CoV e si basa sull?interazione tra le proteine ACE2 e la proteina spike SARS-CoV-2 RDB. Il test ? consistito nel testare 5 diverse diluzioni (10%, 25%, 50%, 80% e 100%) di due differenti soluzioni, e precisamente: una soluzione isotonica contenente 0,4% di lisozima e 0,04% di cloruro di benzalconio; e una soluzione ipertonica contenente 0,5% di lisozima e 0,05% cloruro di benzalconio. E? stata quindi valutata l?inibizione indotta dai differenti campioni di prova sopra indicati rispetto ad un campione di controllo costituito da anticorpi monoclonali anti?ACE2 (AC384) alla concentrazione fissa di 2000 ng/ml. I risultati sono illustrati nella figura allegata.
S?intende comunque che l?invenzione non deve considerarsi limitata alle particolari disposizioni illustrate sopra, che costituiscono soltanto forme di esecuzione esemplificative di essa, ma che diverse varianti sono possibili, tutte alla portata di un tecnico del ramo, senza per questo uscire dall?ambito di protezione dell?invenzione stessa, che risulta unicamente definito dalle rivendicazioni che seguono.
Claims (7)
1) Formulazione spray per uso nasale/orale per la protezione contro infezioni da Coronavirus che utilizzano il recettore ACE2 per penetrare nelle cellule della mucosa nasale e della gola, caratterizzato da ci? che consiste in una soluzione salina comprendente, come sostanze attive, cloruro di benzalconio e lisozima.
2) Formulazione spray per uso nasale/orale come in 1, in cui la concentrazione di cloruro di benzalconio ? compresa tra 0,02% e 0,15% e la concentrazione di lisozima ? compresa tra 0,2% e 1,0%.
3) Formulazione spray per uso nasale/orale come in 1, in cui la concentrazione di cloruro di benzalconio ? compresa tra 0,03% e 0,06% e la concentrazione di lisozima ? compresa tra 0,3% e 0,8%.
4) Formulazione spray per uso nasale/orale come in una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, comprendente inoltre sodio citrato e/o idrossietilcellulosa, metilcellulosa o proprionilmetilcellulosa come coadiuvanti.
5) Formulazione spray per uso nasale/orale come in una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detta soluzione salina ? una soluzione isotonica (NaCl 0,9%)
6) Formulazione spray per uso nasale/orale come in una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni, in cui detta soluzione salina ? una soluzione ipertonica (NaCl 1,2% a 3%)
7) Uso di una formulazione spray per uso nasale/orale come in una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni per prevenire la diffusione di Coronavirus nelle vie respiratorie e nel sistema nervoso centrale.
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