IT202000019030A1 - Composizione per l’uso nel trattamento di infezioni virali - Google Patents

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Roberto Verga
Simone Stasi
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Description

?COMPOSIZIONE PER L?USO NEL TRATTAMENTO DI INFEZIONI VIRALI?
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione riguarda una composizione per il trattamento di infezioni causate da agenti patogeni, quali virus. In particolare, la composizione dell?invenzione comprende un?associazione sinergica di due ingredienti attivi, che si ? mostrata significativamente attiva contro tali agenti patogeni.
STATO DELLA TECNICA
L'antibiotico-resistenza ? un fenomeno ormai riconosciuto e diffuso in tutto il mondo. Lo sviluppo della resistenza ai farmaci ? un normale processo evolutivo. Tipicamente, in una colonia di microbi sensibili a un certo farmaco, ne esistono alcuni che sono naturalmente resistenti: il fenomeno si chiama insensibilit? primaria. Quando l'antibiotico distrugge i batteri sensibili, quelli insensibili al farmaco e che fino a quel momento si trovavano in uno stato "dormiente" cominciano a moltiplicarsi. Oppure pu? succedere che una resistenza si sviluppi in seguito a mutazioni del materiale genetico del batterio, oppure allo scambio dei geni che conferiscono la resistenza tra batteri.
Pur essendo un fenomeno naturale, esso ? accelerato e aggravato da un uso scorretto dei farmaci antibiotici.
Tra le pratiche considerate pi? dannose c'? l'abitudine di fare uso degli antibiotici anche per trattare infezioni virali, dove non hanno alcuna utilit?. Poich? i virus sono minuscoli e si replicano all'interno delle cellule usando i meccanismi propri delle cellule, ci sono solo un numero limitato di funzioni metaboliche che i farmaci antivirali possono colpire. Pertanto, i farmaci antivirali sono molto pi? difficili da sviluppare rispetto agli antibiotici. Inoltre, i virus possono sviluppare resistenza ai farmaci antivirali. Gli stessi farmaci antivirali possono anche essere tossici per animali e umani. Gli antibiotici non sono efficaci contro le infezioni virali, ma se un soggetto ha un'infezione batterica oltre a un'infezione virale, ? generalmente necessario un antibiotico.
Le infezioni del tratto respiratorio sono infezioni comuni del tratto respiratorio superiore (ad es. naso, orecchie, seni nasali e gola) e del tratto respiratorio inferiore (ad es. trachea, bronchi e polmoni). I sintomi dell'infezione del tratto respiratorio superiore comprendono naso che cola o chiuso, irritabilit?, irrequietezza, scarso appetito, riduzione del livello di attivit?, tosse e febbre.
Le attuali terapie per le infezioni del tratto respiratorio prevedono rispettivamente la somministrazione di agenti antivirali, antibatterici e antifungini per il trattamento, la prevenzione o il miglioramento delle infezioni virali, batteriche e fungine del tratto respiratorio. Sfortunatamente, per quanto riguarda alcune infezioni, non ci sono terapie disponibili, le infezioni hanno dimostrato di essere refrattarie alle terapie o il verificarsi di effetti collaterali supera i benefici della somministrazione di una terapia a un soggetto. ? quindi scopo della presente invenzione fornire una soluzione alternativa all?uso di farmaci antibiotici, che consenta di trattare efficacemente infezioni causate da virus, senza innescare fenomeni di resistenza.
RIASSUNTO DELL?INVENZIONE
Detto scopo ? stato raggiunto mediante una composizione comprendente un ingrediente attivo ed almeno un estratto vegetale, come riportato nella rivendicazione 1, per l?uso nel trattamento di infezioni causate da agenti patogeni.
Sotto un altro aspetto, la presente invenzione concerne un integratore alimentare comprendente tale composizione.
Sotto un altro aspetto, la presente invenzione concerne un cosmetico o un dispositivo medico comprendente tale composizione.
Le caratteristiche ed i vantaggi della presente invenzione risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata e dalle forme realizzative fornite a titolo di esempi illustrativi e non limitativi.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
L?invenzione riguarda pertanto una composizione comprendente:
i) un ingrediente attivo comprendente lattoferrina oppure almeno un peptide comprendente lattoferricina, polilisina, natamicina o loro miscela, oppure una miscela di lattoferrina e detto almeno un peptide, e
ii) almeno un estratto vegetale comprendente antiossidanti scelti tra catechine, polifenoli e loro miscele,
detta composizione essendo per l?uso nel trattamento di infezioni virali.
Il termine ?trattamento? si riferisce agli effetti della composizione dell'invenzione la quale ? in grado di impartire un beneficio ai pazienti, sia umani che animali, affetti da una patologia infettiva, ad esempio un miglioramento delle condizioni del paziente o un ritardo nella progressione della malattia. Tale composizione pu? avere anche un effetto preventivo, oltre che curativo, nei confronti della infezione. Nel presente documento, con il termine ?infezione?, o il suo sinonimo ?patologia infettiva? si intende l'invasione, la colonizzazione e/o la moltiplicazione di un microrganismo all'interno o su un altro organismo ospite. Con il termine di ?infezione? si intende una patologia infettiva causata da un virus, in particolare virus respiratori, virus intestinali e virus che causano infezioni croniche e predispongono l?insorgenza di tumori.
Un virus, per gli scopi della presente invenzione, ? preferibilmente scelto tra virus respiratorio sinciziale, virus influenzale, virus parainfluenzale, Metapneumovirus, Rinovirus, Adenovirus, Coronavirus, Norovirus, Rotavirus, Astrovirus, Poliovirus, Orthopoxvirus, Herpes virus, Papillomavirus, Virus umano T-linfotropico 1, Virus di Epstein-Barr, Virus dell'epatite B, Virus dell'epatite C, Calicivirus felino, o Parvovirus canino.
La lattoferrina, conosciuta anche come lattotransferrina ? una proteina globulare multifunzionale con attivit? antimicrobica, sia battericida che fungicida. La lattoferrina appartiene alla famiglia delle transferrine e possiede una massa molecolare di 80 KDa, con due siti di legame per lo ione ferrico (Fe<3+>), similmente alla stessa transferrina. La lattoferrina non ? mai satura di ferro e il suo contenuto ferrico varia. Si trova soprattutto nel latte, ma ? presente in molte secrezioni mucose come le lacrime e la saliva, protegge inoltre i neonati da infezioni all'apparato gastrointestinale. L'attivit? antimicrobica della lattoferrina ? correlata alla sua affinit? per il Fe<3+ >(quindi la sua elevata capacit? di competere allo stato libero con i microrganismi ferro-dipendenti), e a un'azione diretta sulla membrana esterna dei batteri Gram negativi. La combinazione della lattoferrina con lo ione ferrico nelle secrezioni mucose modula l'attivit? e le capacit? aggregative dei batteri e dei virus verso le membrane cellulari. Questo perch? alcuni batteri richiedono ferro per poter effettuare la replicazione cellulare e la lattoferrina, al contrario, lo sottrae dall'ambiente circostante, impedendone la proliferazione. Batteri come Escherichia coli tuttavia possiedono chelanti del ferro che permettono al microrganismo di procurarselo anche in presenza di lattoferrina. Il potere fungicida e battericida della lattoferrina (e della transferrina e ovotransferrina) in vitro dipende dalla concentrazione di sale. Nel normale latte fresco ? inattiva. La lattoferrina possiede inoltre un'attivit? battericida ferroindipendente, essendo in grado di attaccare e lisare la membrana batterica, sfruttando l'affinit? dei propri domini cationici nei confronti della membrana batterica (carica negativamente), che, in combinazione con il lisozima, un enzima in grado di scindere i legami ?1-4 glicosidici del peptidoglicano, comporta la morte del batterio per citolisi. La lattoferricina ? un peptide cationico che pu? essere generato dalla digestione mediata da pepsina di lattoferrina, oppure pu? essere prodotta per via sintetica. La sequenza completa della lattoferricina corrisponde al frammento 17-41 di lattoferrina (FKCRRWQWRM KKLGAPSITCVRRAF; LFB0084). Negli esseri umani, lattoferricina corrisponde al frammento 1-47 di lattoferrina ma ? costituito da due sottounit?, ossia dai frammenti 1-11 e 12-47, collegati da un ponte disolfuro.
La polilisina o ?-polilisina ? un piccolo omo-polipeptide dell'amminoacido essenziale lisina prodotto da fermentazione batterica. L'epsilon (?) incluso nel nome indica il sito di legame delle molecole di lisina, che a differenza dei normali peptidi legati tramite il gruppo in posizione ?, gli amminoacidi sono qui legati tramite il gruppo amminico in ? e il gruppo carbossilico per mezzo di legame ammidico. La ?-polilisina ? un omopolipeptide di approssimativamente 25 - 30 residui L-lisinici. In acqua, la polilisina contiene gruppi amminoacidici carichi positivi. Come altri composti tensioattivi, ha la capacit? di inibire la crescita microbiotica. La ?-polilisina ? assorbita elettrostaticamente sulla superficie batterica che causa lo smembramento della membrana esterna.
La natamicina (denominazione comune internazionale, conosciuta anche come pimaricina) ? un composto organico con formula bruta C33H47NO13. Si tratta di un agente antifungino prodotto dai comuni batteri Streptomyces natalensis e Streptomyces chattanoogensis, e usato dall'uomo come farmaco e come additivo alimentare. Chimicamente rappresenta un poliene epossido macrolide, e a temperatura ambiente si presenta come una polvere bianco/gialla. Adoperata soprattutto in dermatologia e ginecologia, la natamicina ? efficace contro le infezioni fungine, in particolare di Candida, Aspergillus, Cephalosporium, Fusarium e Penicillium. Pu? essere somministrata come crema, come collirio o (per infezioni orali) in pastiglia. Viene assorbita in quantit? trascurabile; se assunta per via orale, viene minimamente assorbita dal tratto gastrointestinale, il che la rende inadatta a curare infezioni sistemiche.
La composizione dell?invenzione comprende anche almeno un estratto vegetale comprendente antiossidanti scelti tra catechine, polifenoli e loro miscele.
Preferibilmente, tale estratto vegetale ? estratto di semi di uva, estratto di sambuco, estratto di t? verde, estratto di semi di pompelmo o una loro miscela. Tali estratti possono essere preparati per estrazione acquosa o con solvente.
In particolare, l?estratto di semi di uva (o Grape Seed Extract) ? una ricca fonte di polifenoli. Questi importanti metaboliti secondari svolgono molteplici ruoli essenziali nella fisiologia delle piante e mostrano una vasta gamma di propriet? bioattive nell'organismo umano, principalmente come antiossidante, antinfiammatorio, antitumorale, cardioprotettivo e anti-invecchiamento. GSE ? riconosciuto come una miscela complessa di monomeri, oligomeri, e polimeri di flavan-3-oli. I principali monomeri identificati sono (+)-catechina, (-)-epicatechina, (-)-epicatechina gallato, (-)-epigallocatechina e (-)-epigallocatechina gallato. Il contenuto di flavan-3-oli in uva da semina ? influenzato da diversi fattori, principalmente cultivar, irrigazione, concimazione azotata, ritardata raccolta, e le condizioni di conservazione.
Tra i polifenoli, inoltre, l?azione terapeutica non ? esplicata solo dai flavonoidi, ma anche dalle antocianidine. Queste ultime sono molecole ad azione antiossidante presenti in molti fitocomplessi. Una delle piante che ne presenta in abbondanza ? il sambuco, Sambuco nigra.
Il t? verde deriva dalle foglie di una pianta chiamata Camellia sinensis, il polifenolo pi? caratteristico e principale responsabile delle sue propriet? ? l?Epigallocatechina gallato (noto anche con la sigla EGCG), rappresenta circa il 59% del totale dei polifenoli presenti nelle foglie di t? verde secco. Gli altri componenti sono epicatechina gallato, epigallocatechina, epicatechina e catechina, presenti in percentuali diverse tra loro. L'estratto di semi di pompelmo si ottiene dai semi e dalle membrane del frutto gi? disidratato, che hanno dimostrato, attraverso molti studi scientifici, di avere un effetto su una vasta gamma di microrganismi nocivi, come batteri, funghi, virus, lieviti, muffe, e anche parassiti come vermi e pidocchi, cos? come protozoi quali le amebe. L'estratto di semi di pompelmo si ottiene da un estratto standardizzato che comprende i semi e la parte membranosa del pompelmo (il sottile strato che contiene i segmenti del frutto) e pu? essere fluido o secco, e in entrambi i casi, l'estratto ? ricco di componenti polifenolici come la quercetina, esperidina, glicoside canforato, neoesperidina, naringina, apigenina, rutina, poncirin, ecc.
L'estratto di semi di pompelmo ? considerato una sostanza antivirale e battericida molto potente. L'efficacia dell'estratto di semi di pompelmo su batteri, virus, funghi e parassiti ? stata dimostrata grazie a molteplici e significativi studi effettuati da laboratori e istituti italiani e di tutto il mondo, ? sempre pi? utilizzato in ambito sanitario.
Il meccanismo di azione dell'Estratto di Semi di Pompelmoconsiste nell'indebolimento della struttura e l'efficienza della membrana cellulare microbica che, modificandosi, porta alla perdita di elementi citoplasmatici e diventa incapace di assorbire i nutrienti dall'ambiente circostante, che poi uccide i microrganismi per mancanza di apporto nutrizionale.
Preferibilmente, nella composizione dell?invenzione, detto ingrediente attivo e detto almeno un estratto vegetale sono in rapporto in peso di almeno 1:2. Si ? sorprendentemente trovato che nelle composizioni in cui detto ingrediente attivo ? presente in quantit? inferiore a detto almeno un estratto vegetale, si ottiene un significativo effetto sinergico antivirale, come anche dimostrato dagli esempi di seguito forniti.
Preferibilmente, nella composizione dell?invenzione, detto ingrediente attivo e detto almeno un estratto vegetale sono in rapporto in peso non superiore a 1:1000.
Pi? preferibilmente, detto ingrediente attivo e detto almeno un estratto vegetale sono in rapporto in peso da 1:5 a 1:50.
In forme di realizzazione preferite, la composizione dell?invenzione comprende da 0.0005% a 20% in peso di detto ingrediente attivo e da 0.001% a 10% in peso di detto almeno un estratto vegetale, sul peso della composizione.
Pi? preferibilmente, detto ingrediente attivo ? lattoferricina.
In forme di realizzazione preferite, la lattoferricina ? ottenuta da idrolisi enzimatica di lattoferrina, preferibilmente mediante impiego di un enzima immobilizzato.
Adatti enzimi appartengono alla classe delle idrolasi che catalizzano la rottura del legame peptidico tra due aminoacidi consecutivi della proteina di interesse, in questo caso la lattoferrina. Questi enzimi presentano selettivit? differente nei confronti dei diversi aminoacidi presenti, pertanto non si assiste alla completa degradazione della proteina nei singoli costituenti amminoacidici ma piuttosto alla generazione di frammenti peptidici di varia lunghezza in base alla posizione degli aminoacidi riconosciuti dall?enzima idrolitico utilizzato. Poich? l?enzima utilizzato per l?idrolisi pu? rappresentare un?impurezza del prodotto, il processo si basa preferibilmente sull?immobilizzazione dell?enzima stesso su supporti inerti tramite legami covalenti; l?immobilizzazione permette la rimozione del biocatalizzatore a fine reazione, tramite metodi fisici (es. filtrazione) e quindi consente di evitare modifiche di pH e aumento della temperatura, necessari ad inattivare l?enzima libero, che hanno per? impatto negativo sull?attivit? del prodotto.
Enzimi preferiti sono le proteasi, in particolar modo le endoproteasi tra cui preferibilmente pepsina, clostripaina, proteasi tipo XVII, ASP-N endopeptidasi, ARG-C proteinasi, Glutamil endopeptidasi, proteinasi, tripsina, termolisina, subtilisina, chimotripsina, e loro miscele.
In forme di realizzazione preferite, detto enzima ? pepsina di maiale, clostripaina, proteasi tipo XVII, endoproteasi ASP-N, endoproteasi ARG-C, o loro miscela.
Preferibilmente, il pH a cui effettuare l?idrolisi enzimatica non ? superiore a 3, pi? preferibilmente ? circa 2.
La composizione dell?invenzione pu? ulteriormente comprendere eccipienti farmaceuticamente accettabili. Con il termine ?eccipiente? si intende un composto o una sua miscela adatta per l?utilizzo in una formulazione per il trattamento di infezioni causate da virus. Ad esempio, un eccipiente per l?uso in una formulazione farmaceutica generalmente non deve causare una risposta avversa in un soggetto, n? deve inibire in modo significativo l?efficacia della composizione.
Adatti eccipienti sono acidificanti, correttori di acidit?, anti-agglomeranti, antiossidanti, agenti di carica, agenti di resistenza, gelificanti, agenti di rivestimento, amidi modificati, sequestranti, addensanti, edulcoranti, diluenti, disaggreganti, glidanti, coloranti, leganti, lubrificanti, stabilizzanti, adsorbenti, conservanti, umettanti, aromi, sostanze filmogene, emulsionanti, bagnanti, ritardanti di rilascio e loro miscele.
L?aggiunta di eccipienti pu? essere effettuata mediante metodi noti nella tecnica. Infatti i componenti possono, per esempio, essere miscelati tal quali oppure con uno o pi? eccipienti, racchiusi in capsule soft-gel oppure in forma solida, quale compressa, minicompressa, micro-compressa, granulo, micro-granulo, pellet, multiparticolato, particolato micronizzato, polvere, oppure in forma di soluzione, emulsione, gel, fiale, gocce o spray. La composizione dell?invenzione pu? essere somministrata per via orale, nasale, intranasale, sublinguale, buccale, intramuscolare, endovenosa, transdermica, sub-cutanea, topica esterna, topica interna, rettale, oppure oculare.
Preferibilmente, la composizione dell?invenzione ulteriormente comprende almeno un altro peptide antimicrobico naturale.
Detto peptide antimicrobico naturale ? preferibilmente Nisina, Beta-defensina, LL-37, Temporina A, Temporina B, Temporina L, Indolicina, Melittina, Protegrina-1, Protegrina-2, Protegrina-3, Protegrina-4, Protegrina-5, Magainina 2, RTD-1, RTD-2, RTD-3, RTD-4, RTD-5, Arenicina-1, Arenicina-2, Arenicina-3, Dermcidina, Cecropina, Andropina, Moricina, Ceratotossina, Dermaseptina, Bombinina, preferibilmente Maximin H1, Maximin H2, Maximin H3, Maximin H4, o Maximin H5, Esculentina, Ranalexina, Buforina II, CAP18 umano, Abaecina, Apidaecina, Profenina, Bactenecina, Brevinina-1, Brevinina-2, Tachiplesina, Drosomicina, o lor miscela.
In forme di realizzazione preferite, detto peptide antimicrobico naturale ? Nisina.
Si ? infatti osservato che la composizione dell?invenzione in miscela con almeno un altro peptide antimicrobico naturale mostra un ulteriore effetto sinergico.
Sotto un altro aspetto, la presente invenzione concerne un integratore alimentare comprendente la composizione per l?uso, come sopra descritto, detto integratore essendo sia ad uso umano che animale.
Sotto un ulteriore aspetto, la presente invenzione concerne lattoferricina per l?uso nel trattamento di infezioni virali causate da virus respiratorio sinciziale, virus influenzale, virus parainfluenzale, Metapneumovirus, Rinovirus, Adenovirus, Coronavirus, Norovirus, Rotavirus, Astrovirus, Poliovirus, Orthopoxvirus, Herpes virus, Papillomavirus, Virus umano T-linfotropico 1, Virus di Epstein-Barr, Virus dell'epatite B, Virus dell'epatite C, Calicivirus felino, o Parvovirus canino.
Sotto un ulteriore aspetto, la presente invenzione concerne estratto di semi di uva per l?uso nel trattamento di infezioni virali causate da virus respiratorio sinciziale, virus influenzale, virus parainfluenzale, Metapneumovirus, Rinovirus, Adenovirus, Coronavirus, Norovirus, Rotavirus, Astrovirus, Poliovirus, Orthopoxvirus, Herpes virus, Papillomavirus, Virus umano T-linfotropico 1, Virus di Epstein-Barr, Virus dell'epatite B, Virus dell'epatite C, Calicivirus felino, o Parvovirus canino.
Sotto un ulteriore aspetto, la presente invenzione concerne polilisina per l?uso nel trattamento di infezioni virali causate da virus respiratorio sinciziale, virus influenzale, virus parainfluenzale, Metapneumovirus, Rinovirus, Adenovirus, Coronavirus, Norovirus, Rotavirus, Astrovirus, Poliovirus, Orthopoxvirus, Herpes virus, Papillomavirus, Virus umano T-linfotropico 1, Virus di Epstein-Barr, Virus dell'epatite B, Virus dell'epatite C, Calicivirus felino, o Parvovirus canino.
? da intendersi che risultano descritte, e quindi analogamente preferite, anche tutte le possibili combinazioni degli aspetti preferiti dei componenti della composizione, come sopra indicati.
? inoltre da intendersi che tutti gli aspetti identificati come preferiti e vantaggiosi per la composizione ed i suoi componenti, sono da ritenersi analogamente preferiti e vantaggiosi anche per la preparazione e gli usi della composizione stessa.
Si riportano di seguito Esempi di realizzazione della presente invenzione forniti a titolo illustrativo e non limitativo.
ESEMPI
Esempio 1.
Si riportano di seguito esempi di procedure di immobilizzazione enzimatica tramite le quali ? possibile ottenere biocatalizzatori da impiegare nella produzione dell?idrolizzato di lattoferrina comprendente la lattoferricina.
a) Immobilizzazione enzimatica #1 (acido cloridrico)
Preparare una soluzione acquosa di HCl a concentrazione 10 mM.
Aggiungere pepsina di maiale in polvere a concentrazione di 25 mg/mL e lasciare in agitazione fino a completa dissoluzione.
Misurare il pH e portare a 2,00 ? 0,20 tramite l?utilizzo di una soluzione acquosa di acido cloridrico o idrossido di sodio.
Aggiungere resina epossidica a concentrazione di 250mg/mL alla sospensione enzimatica e lasciare in agitazione per 4h.
Rimuovere la soluzione di enzima non legato tramite almeno 3 lavaggi con pari volume di soluzione HCl 10mM NaCl 1M.
Dopo l?ultimo lavaggio, eliminare la frazione liquida dall?enzima immobilizzato su resina con una pompa da vuoto e riporre la resina a 4?C.
Titolare l?attivit? enzimatica tramite protocollo standard
con emoglobina 2% (w/v) come substrato. b) Immobilizzazione enzimatica #2 (acido fosforico)
Preparare una soluzione acquosa di acido fosforico 85% (w/w) a concentrazione 1,25% (v/v).
Aggiungere pepsina di maiale in polvere a concentrazione 25 mg/mL e lasciare in agitazione fino a completa dissoluzione.
Misurare il pH e portare a 2,00 ? 0,20 tramite l?utilizzo di una soluzione acquosa di acido fosforico o idrossido di potassio.
Aggiungere la resina epossidica a concentrazione 250mg/mL alla sospensione enzimatica e lasciare in agitazione per 4h.
Rimuovere la soluzione di enzima non legato tramite almeno 3 lavaggi con pari volume di soluzione acquosa di acido fosforico 1,25% (v/v) NaCl 1M.
Dopo l?ultimo lavaggio, eliminare la frazione liquida dall?enzima immobilizzato su resina con una pompa da vuoto e riporre la resina a 4?C
Titolare l?attivit? enzimatica tramite protocollo standard
con emoglobina 2% (w/v) come substrato. Esempio 2.
Processo di idrolisi di lattoferrina mediante enzima immobilizzato #1 (HCl / glicina) Preparare una soluzione acquosa di glicina a concentrazione 3 g/L.
Mantenere la soluzione in agitazione e versare lentamente lattoferrina in polvere a concentrazione 130 g/L ed attendere fino a completa dissoluzione.
Correggere il pH della sospensione a 2,1 ? 0,10 tramite l?utilizzo di una soluzione acquosa di acido cloridrico.
Aggiungere pepsina immobilizzata ad una concentrazione compresa tra 32,5-65 U/mL (misurate tramite titolazione su substrato standard emoglobina 2% (w/w)).
A meno di 2 ore di reazione a temperatura 20-30?C, l?enzima immobilizzato viene rimosso tramite setacci calibrati che permettono di separare in maniera efficiente la parte liquida (idrolizzato di lattoferrina) da quella solida (enzima immobilizzato esausto). Analizzare il profilo di idrolisi del prodotto tramite HPLC, da cui si rileva la presenza di lattoferricina.
Esempio 3.
Processo di idrolisi di lattoferrina mediante enzima immobilizzato #2 (acido fosforico) Preparare una soluzione acquosa di lattoferrina a concentrazione 130 g/L, mantenere la soluzione in agitazione ed attendere fino a completa dissoluzione.
Correggere il pH della sospensione a 2,1 ? 0,10 tramite l?utilizzo di una soluzione di acido fosforico 85% (w/w).
Aggiungere pepsina immobilizzata ad una concentrazione compresa tra 65-130 U/mL (misurate tramite titolazione su substrato standard emoglobina 2% (w/w)).
A meno di 2 ore di reazione a temperatura 20-30?C, l?enzima immobilizzato viene rimosso tramite setacci calibrati che permettono di separare in maniera efficiente la parte liquida (idrolizzato di lattoferrina) da quella solida (enzima immobilizzato esausto). Analizzare il profilo di idrolisi del prodotto tramite HPLC, da cui si rileva la presenza di lattoferricina.
Esempio 4.
Processo di idrolisi di lattoferrina mediante enzima immobilizzato #3 (acido lattico / acido fosforico)
Preparare una soluzione acquosa di acido lattico 80% (w/w) a concentrazione 2% (v/v). Mantenere la soluzione in agitazione e versare lentamente lattoferrina in polvere a concentrazione 130 g/L ed attendere fino a completa dissoluzione.
Correggere il pH della sospensione a 2,1 ? 0,10 tramite l?utilizzo di una soluzione acquosa di acido fosforico 85% (w/w).
Aggiungere pepsina immobilizzata ad una concentrazione compresa tra 65-130 U/mL (misurate tramite titolazione su substrato standard emoglobina 2% (w/w)).
A meno di 2 ore di reazione a temperatura 20-30?C, l?enzima immobilizzato viene rimosso tramite setacci calibrati che permettono di separare in maniera efficiente la parte liquida (idrolizzato di lattoferrina) da quella solida (enzima immobilizzato esausto). Analizzare il profilo di idrolisi del prodotto tramite HPLC, da cui si rileva la presenza di lattoferricina.
Esempio 5.
Processo di idrolisi di lattoferrina mediante enzima immobilizzato #4 (acido lattico) Preparare una soluzione acquosa di lattoferrina a concentrazione 130 g/L, mantenere la soluzione in agitazione ed attendere fino a completa dissoluzione.
Addizionare acido lattico 80% (w/w) a concentrazione finale 2% (v/v).
Aggiungere pepsina immobilizzata ad una concentrazione compresa tra 32,5-65 U/mL (misurate tramite titolazione su substrato standard emoglobina 2% (w/w)).
Dopo 2 ore di reazione a temperatura 20-30?C, l?enzima immobilizzato viene rimosso tramite setacci calibrati che permettono di separare in maniera efficiente la parte liquida (idrolizzato di lattoferrina) da quella solida (enzima immobilizzato esausto).
Analizzare il profilo di idrolisi del prodotto tramite HPLC, da cui si rileva la presenza di lattoferricina.
Esempio 6.
Studio dell'attivit? virale in vitro anti SARS-CoV-2 della lattoferrina/lattoferricina e della lattoferrina.
Lo scopo di questo studio era di verificare l'attivit? antivirale contro la SARS-CoV-2, responsabile della COVID-19, di lattoferrina / lattoferricina (PREP 1) e lattoferrina (PREP2).
Coltura cellulare e test di citotossicit?
La tossicit? cellulare ? stata monitorata determinando l'effetto dei composti contro le cellule Vero (Monkey Kidney Epithelial Cells). Le cellule sono state mantenute in mezzo DMEM integrato con il 10% di siero fetale di vitello fetale inattivato a caldo, 2 mM di glutammina, 100 unit? / ml di penicillina, 100 ?g / ml di streptomicina.
Per il test di citotossicit?, le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti a concentrazione di 1?10<4 >cellule/pozzetto. Dopo 24 ore di incubazione, le cellule sono state trattate con diluizioni seriali 2x di PREP 1 (da 8,12 a 0,06 mg/ml; 8,32 mg/ml corrispondono alla diluizione 1:16 della soluzione madre) o PREP 2 (da 9,37 mg/ml a 0,07 mg/ml; 9,37 mg/ml corrispondono alla diluizione 1:32 della soluzione madre) o clorochina (da 200 a 1,9 ?M) (come controllo), in un volume finale di 200 ?l, in duplicato. Dopo l'incubazione per 72 ore a 37 ?C al 5% di CO2, la vitalit? cellulare ? stata misurata con il saggio MTT.
La percentuale di cellule vitali ? stata calcolata utilizzando cellule non trattate come controllo (vitalit? al 100%) utilizzando la formula: [(assorbanza del campione - campione campione libero di cellule in bianco) / media assorbanza di controllo del mezzo di controllo] ? 100.
La concentrazione citotossica del 50% (CC50) che causa una riduzione del 50% della vitalit? delle cellule Vero rispetto alle cellule di controllo non trattate ? stata determinata utilizzando il software Gene5. Cambiamenti morfologici delle cellule Vero sono stati osservati anche al microscopio ottico.
Isolamento di SARS-CoV-2 da tamponi naso-faringei
La SARS-CoV-2 ? stata isolata da 500 microlitri di tampone nasal-faringeo, aggiunto alle cellule Vero all'80% di confluenza; l'inoculo ? stato rimosso dopo un'incubazione di 3 ore a 37 ?C con il 5% di CO2 e le cellule sono state incubate a 37 ?C, 5% di CO2, per 72 ore, quando erano evidenti gli effetti citopatici (CPE).
La quantificazione dei numeri di copie virali nel sovranatante cellulare ? stata valutata attraverso una specifica PCR quantitativa Real Time RT-PCR (qRT-PCR). Il virus SARS-CoV-2 ? stata precipitato per mezzo del PEG, seguendo le istruzioni del produttore, e il titolo virale ? stato determinato con il test della placca, utilizzando fattori di diluizione che vanno da 10<1 >a 10<9>.
Il virus ? stato utilizzato per infezioni multiple con (MOI) di 0,05 neglio esperimenti successivi.
L'infezione delle cellule Vero e il trattamento dei composti
Le cellule VERO sono state seminate in piastre a 96 pozzetti ad una densit? di 1,3 ? 10<4 >cellule / pozzetto e sono state incubate per 24 ore a 37 ? C, 5% di CO2. Le cellule sono state poi infettate a un MOI di 0,05 (1000 PFU / pozzetto) e sono state incubate per 2 ore a 37?C, 5% DI CO2. L'inoculo del virus ? stato rimosso e le cellule infette sono state incubate con il mezzo per 72 ore al 37?C, 5% DI CO2.
Per verificare l'attivit? antivirale dei composti sono stati utilizzati diversi schemi di trattamento, come riassunto nella tabella 1:
1. Schema A (preincubazione del virus con i composti): il virus (MOI 0,05) ? stato incubato per 1 h a 37 ?C in presenza di diverse concentrazioni di PREP 1 (da 4,06 a 0,51 mg/ml) e PREP 2 (da 4,68 a 0,59 mg/ml), e poi aggiunto al monostrato cellulare per 2 ore a 37 ?C, 5% di CO2. Dopo la rimozione dell'inoculo del virus, le cellule sono state incubate per 72 ore a 37 ?C, 5% di CO2. Questo schema ? stato ripetuto preincubando le diverse concentrazioni di PREP 1 e PREP 2 con le cellule per 1h a 37 ? C, prima dell'inoculo virale.
2. 2. Schema B (trattamento durante l'inoculo virale): Le cellule sono state infettate a un MOI di 0,05 (1000 PFU/pozzetto) in terreno tal quale o in un terreno contenente PREP 1 (da 4,06 a 0,51 mg/ml) o PREP 2 (da 4,68 a 0,59 mg/ml) e incubate per 2 ore a 37 ?C, 5% di CO2. L'inoculo del virus ? stato rimosso e le cellule infette sono state incubate con il terreno per 72 ore a 37 ?C, 5% di CO2.
3. 3. Schema C (trattamento delle cellule infette): Dopo la rimozione dell'inoculo del virus dalle cellule, le cellule sono state trattate con terreno (controllo) o terreno contenente PREP 1 (da 4,06 a 0,51 mg/ml), PREP 2 (da 4,68 a 0,59 mg/ml) e incubato per 72 ore a 37 ?C, 5% di CO2.
4. 4. Schema B+C (trattamento durante e dopo l'inoculo del virus): Le cellule sono state infettate a un MOI di 0,05 (1000 PFU/pozzetto) in solo terreno o in terreno contenente PREP 1 (da 4,06 a 0,51 mg/ml) o PREP 2 (da 4,68 a 0,59 mg/ml) e incubate per 2 ore a 37 ?C, 5% di CO2. Dopo la rimozione dell'inoculo del virus dalle cellule, le cellule sono state trattate con terreno (controllo) o terreno contenente PREP 1 (da 4,06 a 0,51 mg/ml), PREP 2 (da 4,68 a 0,59 mg/ml) e incubate per 72 ore a 37 ?C, 5% di CO2.
5. 5. Schema B+C+D (trattamento durante, dopo l'inoculo del virus e ripetuto): Le cellule sono state infettate a un MOI di 0,05 (1000 PFU/pozzetto) in solo terreno o in terreno contenente PREP 1 (da 4,06 a 0,51 mg/ml) o PREP 2 (da 4,68 a 0,59 mg/ml) e incubate per 2 ore a 37 ?C, 5% di CO2. Dopo la rimozione dell'inoculo del virus dalle cellule, le cellule sono state trattate con terreno (controllo) o terreno contenente PREP 1 (da 4,06 a 0,51 mg/ml), PREP 2 (da 4,68 a 0,59 mg/ml) e incubato per 2 ore a 37 ?C, 5% di CO2. Infine, le cellule sono state trattate con terreno (controllo) o terreno contenente PREP 1 (da 4,06 a 0,51 mg/ml), PREP 2 (da 4,68 a 0,59 mg/ml) e incubati per 72 ore a 37 ? C, 5% di CO2.
Tabella 1: Sintesi dei diversi schemi sperimentali
Schema sperimentale Pretrattamento (2h) Durante l'inoculo del virus (2h) Post-inoculo (2h) Post-inoculo (72h) A* - - -B - - -C - - -
B+C - - B+C+D -
*= ? stato effettuato anche un pretrattamento sulle cellule
+= trattamento farmacologico
- = nessun farmaco, solo terreno di coltura cellulare
In tutti gli esperimenti la clorochina (da 50 a 1,9 ?M) ? stata utilizzata come farmaco di controllo
Valutazione dell'attivit? antivirale di PREP 1 e di PREP 2
La quantificazione dei numeri di copie virali nel sovranatante cellulare ? stata valutata tramite RT-PCR quantitativa specifica in tempo reale (qRT-PCR), dopo il trattamento termico dei surnatanti a 98 ?C per 5 minuti. I risultati sono stati espressi come:
- la differenza dei valori di soglia del ciclo (Ct) del surnatante delle cellule infette non trattate e trattate (?Ct= Ct del surnatante delle cellule infette non trattate - Ct del surnatante trattato); Ct ? inversamente correlata alla quantit? del target; ?Ct=3 corrisponde ad una diminuzione media della carica virale di 1 Log;
- la carica virale di SARS-CoV-2 espressa come copie/mL;
RISULTATI
Citotossicit? del composto
La citotossicit? di PREP 1, PREP 2 e clorochina (CQ) ? stata misurata con il saggio MTT. I CC50 e CC10 del PREP 1 e del PREP 2 sono riportati nella tabella 2.
Tabella 2: CC50 e CC10 di PREP 1, PREP 2 e CQ
Composto CC50 CC10
PREP 1 (mg/ml) ? 4.06* ? 4.06*
PREP 2 (mg/ml) ? 4.68? ? 4.68?
CQ (?M) 95,3 ? 18 20,93 ? 4,39
I dati sono il mezzo ? SD di tre esperimenti indipendenti eseguiti in doppio
* Diluizione 1:32
? 1:64 diluizione
NB: Utilizzando concentrazioni superiori a 4,06 mg/ml e 4,68 mg/ml per PREP1 e PREP2, rispettivamente, ? stato osservato un precipitato nei pozzetti
Sulla base di questi dati, la concentrazione massima non tossica del PREP 1 e del PREP 2 ? stata ipotizzata pari a 4,06 e 4,68 mg/ml, rispettivamente. Pertanto, queste concentrazioni e tre diluizioni di 2 volte, sono stati selezionati per testare l'attivit? antivirale.
Isolamento della SARS-CoV-2 da tamponi naso-facciali
L'isolamento del virus ? stato confermato da una specifica q-RT-PCR, e il ceppo isolato ? stato successivamente titolato con il test della placca. La sequenza nucleotidica completa del ceppo isolato della SARS-CoV ? stata depositata presso la Gen Bank, presso la NCBI (numero di adesione: MT748758).
Attivit? antivirale del PREP 1 e del PREP 2 contro la SARS-CoV-2
La tabella 3 riassume i risultati ottenuti con qRT-PCR, dopo aver riscaldato i surnatanti delle cellule a 98 ?C per 5 minuti. I risultati sono espressi come media ?Ct (media di almeno tre esperimenti). Una attivit? antivirale ? stata rilevata per il PREP 1, quando aggiunto alle cellule infette, a dosi elevate, dopo l'inoculo, una o due volte (media ?Ct -3,3) (Schemi C, B C e B C D). Nessuna attivit? antivirale significativa ? stata osservata utilizzando PREP 2. Nessun effetto antivirale ? stato osservato quando PREP 1 e 2 sono stati utilizzati come pretrattamento delle cellule non infette (dati non mostrati). CQ, utilizzato come controllo secondo lo schema di trattamento C, ha causato la diminuzione di 7,9 (50 mM) e 4,3 (16 mM) Ct, corrispondente a circa 2,5 e 1,5 Log. Tabella 3: Attivit? antivirale del PREP 1 e del PREP 2 contro la SARS-CoV-2 espressa come media ?Ct
Esempio 7.
Studio dell'attivit? virale in vitro anti SARS-CoV-2 del virus della polilisina Lo scopo di questo studio era di verificare l'attivit? antivirale contro la SARS-CoV-2, responsabile del COVID-19, del polilisina (PREP 3).
Coltura cellulare e test di citotossicit?
La tossicit? cellulare ? stata monitorata determinando l'effetto dei composti contro le cellule Vero (Monkey Kidney Epithelial Cells). Le cellule sono state mantenute in mezzo DMEM integrato con il 10% di siero fetale di vitello fetale inattivato a caldo, 2 mM di glutammina, 100 unit? / ml di penicillina, 100 ?g / ml di streptomicina.
Per il test di citotossicit?, le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti a concentrazione di 1?10<4 >cellule/pozzetto. Dopo 24 ore di incubazione, le cellule sono state trattate con diluizioni seriali 2x di PREP 3 (da 0,80 a 0,025 mg/ml) o clorochina (da 200 a 1,9 ?M) (come controllo), in un volume finale di 200 ?l, in duplicato.
Dopo l'incubazione per 72 ore a 37 ?C al 5% di CO2, la vitalit? cellulare ? stata misurata con il saggio MTT.
La percentuale di cellule vitali ? stata calcolata utilizzando cellule non trattate come controllo (vitalit? al 100%) utilizzando la formula: [(assorbanza del campione - campione campione libero di cellule in bianco) / media assorbanza di controllo del mezzo di controllo] ? 100.
La concentrazione citotossica del 50% (CC50) che causa una riduzione del 50% della vitalit? delle cellule Vero rispetto alle cellule di controllo non trattate ? stata determinata utilizzando il software Gene5. Cambiamenti morfologici delle cellule Vero sono stati osservati anche al microscopio ottico.
Isolamento di SARS-CoV-2 da tamponi naso-faringei
La SARS-CoV-2 ? stata isolata da 500 microlitri di tampone nasal-faringeo, aggiunto alle cellule Vero all'80% di confluenza; l'inoculo ? stato rimosso dopo un'incubazione di 3 ore a 37 ?C con il 5% di CO2 e le cellule sono state incubate a 37 ?C, 5% di CO2, per 72 ore, quando erano evidenti gli effetti citopatici (CPE).
La quantificazione dei numeri di copie virali nel sovranatante cellulare ? stata valutata attraverso una specifica PCR quantitativa Real Time RT-PCR (qRT-PCR). Il virus SARS-CoV-2 ? stata precipitato per mezzo del PEG, seguendo le istruzioni del produttore, e il titolo virale ? stato determinato con il test della placca, utilizzando fattori di diluizione che vanno da 10<1 >a 10<9>.
Il virus ? stato utilizzato per infezioni multiple con (MOI) di 0,05 neglio esperimenti successivi.
L'infezione delle cellule Vero e il trattamento dei composti
Le cellule VERO sono state seminate in piastre a 96 pozzetti ad una densit? di 1,3 ? 10<4 >cellule / pozzetto e sono state incubate per 24 ore a 37 ? C, 5% di CO2. Le cellule sono state poi infettate a un MOI di 0,05 (1000 PFU / pozzetto) e sono state incubate per 2 ore a 37?C, 5% DI CO2. L'inoculo del virus ? stato rimosso e le cellule infette sono state incubate con il mezzo per 72 ore al 37?C, 5% DI CO2.
Per verificare l'attivit? antivirale dei composti sono stati utilizzati diversi schemi di trattamento, come riassunto nella tabella 1:
1. Schema A (preincubazione del virus con i composti): il virus (MOI 0,05) ? stato incubato per 1 h a 37 ?C in presenza di diverse concentrazioni di PREP 3 (da 0,40 a 0,05 mg/ml) e poi aggiunto al monostrato cellulare per 2 ore a 37 ?C, 5% di CO2. Dopo la rimozione dell'inoculo del virus, le cellule sono state incubate per 72 ore a 37 ?C, 5% di CO2. Questo schema ? stato ripetuto preincubando le diverse concentrazioni di PREP 3 con le cellule per 1h a 37 ? C, prima dell'inoculo virale.
2. 2. Schema B (trattamento durante l'inoculo virale): Le cellule sono state infettate a un MOI di 0,05 (1000 PFU/pozzetto) in terreno tal quale o in un terreno contenente PREP 3 (da 0,40 a 0,05 mg/ml) e incubate per 2 ore a 37 ?C, 5% di CO2. L'inoculo del virus ? stato rimosso e le cellule infette sono state incubate con il terreno per 72 ore a 37 ?C, 5% di CO2.
3. 3. Schema C (trattamento delle cellule infette): Dopo la rimozione dell'inoculo del virus dalle cellule, le cellule sono state trattate con terreno (controllo) o terreno contenente PREP 3 (da 0,40 a 0,05 mg/ml) e incubato per 72 ore a 37 ?C, 5% di CO2.
4. 4. Schema B+C (trattamento durante e dopo l'inoculo del virus): Le cellule sono state infettate a un MOI di 0,05 (1000 PFU/pozzetto) in solo terreno o in terreno contenente PREP 3 (da 0,40 a 0,05 mg/ml) e incubate per 2 ore a 37 ?C, 5% di CO2. Dopo la rimozione dell'inoculo del virus dalle cellule, le cellule sono state trattate con terreno (controllo) o terreno contenente PREP 3 (da 0,40 a 0,05 mg/ml) e incubate per 72 ore a 37 ?C, 5% di CO2.
5. 5. Schema B+C+D (trattamento durante, dopo l'inoculo del virus e ripetuto): Le cellule sono state infettate a un MOI di 0,05 (1000 PFU/pozzetto) in solo terreno o in terreno contenente PREP 3 (da 0,40 a 0,05 mg/ml) e incubate per 2 ore a 37 ?C, 5% di CO2. Dopo la rimozione dell'inoculo del virus dalle cellule, le cellule sono state trattate con terreno (controllo) o terreno contenente PREP 3 (da 0,40 a 0,05 mg/ml) e incubato per 2 ore a 37 ?C, 5% di CO2. Infine, le cellule sono state trattate con terreno (controllo) o terreno contenente PREP 3 (da 0,40 a 0,05 mg/ml) e incubati per 72 ore a 37 ? C, 5% di CO2.
Tabella 1: Sintesi dei diversi schemi sperimentali
Schema sperimentale Pretrattamento (2h) Durante l'inoculo del virus (2h) Post-inoculo (2h) Post-inoculo (72h) A* - - -B - - -C - - -
B+C - - B+C+D -
*= ? stato effettuato anche un pretrattamento sulle cellule
+= trattamento farmacologico
- = nessun farmaco, solo terreno di coltura cellulare
In tutti gli esperimenti la clorochina (da 50 a 1,9 ?M) ? stata utilizzata come farmaco di controllo
Valutazione dell'attivit? antivirale di PREP 1 e di PREP 2
La quantificazione dei numeri di copie virali nel sovranatante cellulare ? stata valutata tramite RT-PCR quantitativa specifica in tempo reale (qRT-PCR), dopo il trattamento termico dei surnatanti a 98 ?C per 5 minuti. I risultati sono stati espressi come:
- la differenza dei valori di soglia del ciclo (Ct) del surnatante delle cellule infette non trattate e trattate (?Ct= Ct del surnatante delle cellule infette non trattate - Ct del surnatante trattato); Ct ? inversamente correlata alla quantit? del target; ?Ct=3 corrisponde ad una diminuzione media della carica virale di 1 Log;
- la carica virale di SARS-CoV-2 espressa come copie/mL;
Al fine di verificare l'attivit? virucida del composto, il test della placca ? stato condotto dopo l'inoculo del virus+composto (400 ?l/pozzetto) sulle cellule, piastrato in una piastra a 6 pozzetti. In breve, dopo 2 ore di inoculo con sospensione del virus, l'inoculo ? stato rimosso e le cellule sono state coperte con 0,3% di agarosio disciolto in mezzo cellulare e incubato per 72 ore a 37 ? C, 5% di CO2. Le cellule sono state fissate con soluzione di formaldeide al 4% e, dopo la rimozione dell'agarosio, sono state colorate con blu di metilene. Le placche sono state contate e i risultati sono espressi come unit? di formazione della placca (PFU)/mL, e come percentuale di replicazione del virus, rispetto alle cellule infette non trattate.
RISULTATI
Citotossicit? del composto
La citotossicit? di PREP 3 e clorochina (CQ) ? stata misurata con il saggio MTT. I CC50 e CC10 di PREP3 sono riportati nella tabella 2.
Tabella 2: CC50 e CC10 di PREP 1, PREP 2 e CQ
Composto CC50 CC10
PREP 3 (mg/ml) 0,56 ? 0,21 ? 0,40
CQ (?M) 95,3 ? 18 20,93 ? 4,39
Sulla base di questi dati, la concentrazione massima non tossica di PREP 3 ? stata ipotizzata pari a 0,40 mg/ml, rispettivamente. Pertanto, queste concentrazioni e tre diluizioni di 2 volte (0,20,0,20,0,05 mg/ml), sono stati selezionati per testare l'attivit? antivirale.
Isolamento della SARS-CoV-2 da tamponi naso-faringei
L'isolamento del virus ? stato confermato da una specifica q-RT-PCR, e il ceppo isolato ? stato successivamente titolato con il test della placca. La sequenza nucleotidica completa del ceppo isolato della SARS-CoV ? stata depositata presso la Gen Bank, presso la NCBI (numero di adesione: MT748758).
Attivit? antivirale di PREP3 contro SARS-CoV-2
La tabella 3 riassume i risultati ottenuti con qRT-PCR, dopo aver isolato l?RNA dal surnatante delle cellule infette. I risultati sono espressi come media ?Ct (media di almeno tre esperimenti). Mentre nessun effetto era evidente negli schemi A, B e C, un effetto antivirale dose-dipendente era presente quando il PREP 3 ? stato aggiunto durante e dopo l'inoculo (schema B C), da -1,80 a -5,22 ?Ct, con dose crescente di PREP 3. Un leggero effetto ? stato anche mostrato con l'aggiunta di una terza dose di PREP 3. Nessun effetto antivirale ? stato osservato quando il PREP 3 ? stato utilizzato come pretrattamento delle cellule non infette (dati non mostrati).
CQ, usato come controllo, ha causato la diminuzione di 7,9 (50 mM) e 4,3 (16 mM) Ct, corrispondente a circa 2,5 e 1,5 Log.
Tabella 3: Attivit? antivirale del PREP 3 contro la SARS-CoV-2 espressa come media ?Ct
Attivit? virucida
Per confermare l'attivit? virucida del PREP 3, ? stato condotto il test della placca. La tabella 6 riporta i risultati ottenuti, espressi come PFU/ml medio. L?infettivit? di SARS-CoV-2 ? stata ridotta del 96,3%, 48,8%, 30,2% e 20%, utilizzando 0,40, 0,20, 0,1 e 0,05 mg/ml di PREP 3. Questi risultati hanno fortemente confermato l'effetto dose-dipendente del PREP 3, sia per le sue attivit? antivirali e virucide.
Tabella 4: attivit? virucida del PREP 3, secondo lo schema B+C
Attivit? antivirali e virucide contro la SARS-CoV-2 ? stata osservata quando il PREP 3 ? stato aggiunto durante e dopo l'inoculo del virus, raggiungendo pi? del 90% dell'inibizione del virus.
Esempio 8.
Studio dell'attivit? virale in vitro anti SARS-CoV-2 dell'estratto di semi d'uva Lo scopo di questo studio era di verificare l'attivit? antivirale contro la SARS-CoV-2, responsabile del COVID-19, dei semi d'uva (PREP 4).
Coltura cellulare e test di citotossicit?
La tossicit? cellulare ? stata monitorata determinando l'effetto dei composti contro le cellule Vero (Monkey Kidney Epithelial Cells). Le cellule sono state mantenute in mezzo DMEM integrato con il 10% di siero fetale di vitello fetale inattivato a caldo, 2 mM di glutammina, 100 unit? / ml di penicillina, 100 ?g / ml di streptomicina.
Per il test di citotossicit?, le cellule sono state seminate in piastre da 96 pozzetti a concentrazione di 1?10<4 >cellule/pozzetto. Dopo 24 ore di incubazione, le cellule sono state trattate con diluizioni seriali 2x di PREP 4 (da 0,6 a 0,015 mg/ml) o clorochina (da 200 a 1,9 ?M) (come controllo), in un volume finale di 200 ?l, in duplicato.
Dopo l'incubazione per 72 ore a 37 ?C al 5% di CO2, la vitalit? cellulare ? stata misurata con il saggio MTT.
La percentuale di cellule vitali ? stata calcolata utilizzando cellule non trattate come controllo (vitalit? al 100%) utilizzando la formula: [(assorbanza del campione - campione campione libero di cellule in bianco) / media assorbanza di controllo del mezzo di controllo] ? 100.
La concentrazione citotossica del 50% (CC50) che causa una riduzione del 50% della vitalit? delle cellule Vero rispetto alle cellule di controllo non trattate ? stata determinata utilizzando il software Gene5. Cambiamenti morfologici delle cellule Vero sono stati osservati anche al microscopio ottico.
Isolamento di SARS-CoV-2 da tamponi naso-faringei
La SARS-CoV-2 ? stata isolata da 500 microlitri di tampone nasal-faringeo, aggiunto alle cellule Vero all'80% di confluenza; l'inoculo ? stato rimosso dopo un'incubazione di 3 ore a 37 ?C con il 5% di CO2 e le cellule sono state incubate a 37 ?C, 5% di CO2, per 72 ore, quando erano evidenti gli effetti citopatici (CPE).
La quantificazione dei numeri di copie virali nel sovranatante cellulare ? stata valutata attraverso una specifica PCR quantitativa Real Time RT-PCR (qRT-PCR). Il virus SARS-CoV-2 ? stata precipitato per mezzo del PEG, seguendo le istruzioni del produttore, e il titolo virale ? stato determinato con il test della placca, utilizzando fattori di diluizione che vanno da 10<1 >a 10<9>.
Il virus ? stato utilizzato per infezioni multiple con (MOI) di 0,05 negli esperimenti successivi.
L'infezione delle cellule Vero e il trattamento dei composti
Le cellule VERO sono state seminate in piastre a 96 pozzetti ad una densit? di 1,3 ? 10<4 >cellule / pozzetto e sono state incubate per 24 ore a 37 ? C, 5% di CO2. Le cellule sono state poi infettate a un MOI di 0,05 (1000 PFU / pozzetto) e sono state incubate per 2 ore a 37?C, 5% DI CO2. L'inoculo del virus ? stato rimosso e le cellule infette sono state incubate con il mezzo per 72 ore al 37?C, 5% DI CO2.
Per verificare l'attivit? antivirale dei composti sono stati utilizzati diversi schemi di trattamento, come riassunto nella tabella 1:
1. Schema A (preincubazione del virus con i composti): il virus (MOI 0,05) ? stato incubato per 1 h a 37 ?C in presenza di diverse concentrazioni di PREP 4 (da 0,3 a 0,03 mg/ml) e poi aggiunto al monostrato cellulare per 2 ore a 37 ?C, 5% di CO2. Dopo la rimozione dell'inoculo del virus, le cellule sono state incubate per 72 ore a 37 ?C, 5% di CO2. Questo schema ? stato ripetuto preincubando le diverse concentrazioni di PREP 3 con le cellule per 1h a 37 ? C, prima dell'inoculo virale.
2. 2. Schema B (trattamento durante l'inoculo virale): Le cellule sono state infettate a un MOI di 0,05 (1000 PFU/pozzetto) in terreno tal quale o in un terreno contenente PREP 4 (da 0,3 a 0,03 mg/ml) e incubate per 2 ore a 37 ?C, 5% di CO2. L'inoculo del virus ? stato rimosso e le cellule infette sono state incubate con il terreno per 72 ore a 37 ?C, 5% di CO2.
3. 3. Schema C (trattamento delle cellule infette): Dopo la rimozione dell'inoculo del virus dalle cellule, le cellule sono state trattate con terreno (controllo) o terreno contenente PREP 4 (da 0,3 a 0,03 mg/ml) e incubato per 72 ore a 37 ?C, 5% di CO2.
4. 4. Schema B+C (trattamento durante e dopo l'inoculo del virus): Le cellule sono state infettate a un MOI di 0,05 (1000 PFU/pozzetto) in solo terreno o in terreno contenente PREP 4 (da 0,3 a 0,03 mg/ml) e incubate per 2 ore a 37 ?C, 5% di CO2. Dopo la rimozione dell'inoculo del virus dalle cellule, le cellule sono state trattate con terreno (controllo) o terreno contenente PREP 4 (da 0,3 a 0,03 mg/ml) e incubate per 72 ore a 37 ?C, 5% di CO2.
5. 5. Schema B+C+D (trattamento durante, dopo l'inoculo del virus e ripetuto): Le cellule sono state infettate a un MOI di 0,05 (1000 PFU/pozzetto) in solo terreno o in terreno contenente PREP 4 (da 0,3 a 0,03 mg/ml) e incubate per 2 ore a 37 ?C, 5% di CO2. Dopo la rimozione dell'inoculo del virus dalle cellule, le cellule sono state trattate con terreno (controllo) o terreno contenente PREP 4 (da 0,3 a 0,03 mg/ml) e incubato per 2 ore a 37 ?C, 5% di CO2. Infine, le cellule sono state trattate con terreno (controllo) o terreno contenente PREP 4 (da 0,3 a 0,03 mg/ml) e incubati per 72 ore a 37 ? C, 5% di CO2.
Tabella 1: Sintesi dei diversi schemi sperimentali
Schema sperimentale Pretrattamento (2h) Durante l'inoculo del virus (2h) Post-inoculo (2h) Post-inoculo (72h) A* - - -B - - -C - - -
B+C - - B+C+D -
*= ? stato effettuato anche un pretrattamento sulle cellule
+= trattamento farmacologico
- = nessun farmaco, solo terreno di coltura cellulare
In tutti gli esperimenti la clorochina (da 50 a 1,9 ?M) ? stata utilizzata come farmaco di controllo
Valutazione dell'attivit? antivirale di PREP 1 e di PREP 2
La quantificazione dei numeri di copie virali nel sovranatante cellulare ? stata valutata tramite RT-PCR quantitativa specifica in tempo reale (qRT-PCR), dopo il trattamento termico dei surnatanti a 98 ?C per 5 minuti. I risultati sono stati espressi come:
- la differenza dei valori di soglia del ciclo (Ct) del surnatante delle cellule infette non trattate e trattate (?Ct= Ct del surnatante delle cellule infette non trattate - Ct del surnatante trattato); Ct ? inversamente correlata alla quantit? del target; ?Ct=3 corrisponde ad una diminuzione media della carica virale di 1 Log;
- la carica virale di SARS-CoV-2 espressa come copie/mL;
Al fine di verificare l'attivit? virucida del composto, il test della placca ? stato condotto dopo l'inoculo del virus+composto (400 ?l/pozzetto) sulle cellule, piastrato in una piastra a 6 pozzetti. In breve, dopo 2 ore di inoculo con sospensione del virus, l'inoculo ? stato rimosso e le cellule sono state coperte con 0,3% di agarosio disciolto in mezzo cellulare e incubato per 72 ore a 37 ? C, 5% di CO2. Le cellule sono state fissate con soluzione di formaldeide al 4% e, dopo la rimozione dell'agarosio, sono state colorate con blu di metilene. Le placche sono state contate e i risultati sono espressi come unit? di formazione della placca (PFU)/mL, e come percentuale di replicazione del virus, rispetto alle cellule infette non trattate.
RISULTATI
Citotossicit? del composto
La citotossicit? di PREP 4 e clorochina (CQ) ? stata misurata con il saggio MTT. I CC50 e CC10 di PREP4 sono riportati nella tabella 2.
Tabella 2: CC50 e CC10 di PREP 1, PREP 2 e CQ
Composto CC50 CC10
PREP 4 (mg/ml) 0,175 ? 0,07 ? 0,30
CQ (?M) 95,3 ? 18 20,93 ? 4,39
Sulla base di questi dati, la concentrazione massima non tossica di PREP 4 ? stata ipotizzata pari a 0,30 mg/ml, rispettivamente. Pertanto, queste concentrazioni e tre diluizioni di 2 volte (0,15,0,08,0,04 mg/ml), sono stati selezionati per testare l'attivit? antivirale.
Isolamento della SARS-CoV-2 da tamponi naso-faringei
L'isolamento del virus ? stato confermato da una specifica q-RT-PCR, e il ceppo isolato ? stato successivamente titolato con il test della placca. La sequenza nucleotidica completa del ceppo isolato della SARS-CoV ? stata depositata presso la Gen Bank, presso la NCBI (numero di adesione: MT748758).
Attivit? antivirale di PREP4 contro SARS-CoV-2
La tabella 3 riassume i risultati ottenuti con qRT-PCR, dopo aver isolato l?RNA dal surnatante delle cellule infette. I risultati sono espressi come media ?Ct (media di almeno tre esperimenti). Mentre non ? stata osservata alcuna attivit? antivirale quando il PREP 4 ? stato aggiunto alle cellule, seguendo gli schemi A e B, una forte attivit? antivirale ? stata osservata quando il PREP 4 ? stato aggiunto dopo l'inoculo virale: ?Ct di -1,89, -4,23, -8,69 e -14,41 sono stati rilevati in corrispondenza dell'aggiunta di 0,04, 0,08, 0,15 e 0,30 mg/ml di PREP 4, rispettivamente. La stessa tendenza, ma leggermente inferiore, ? stata osservata quando il PREP 4 ? stato aggiunto durante l'inoculo e dopo di esso, una o due volte (schemi B+C e B+C+D).
CQ, usato come controllo, ha causato la diminuzione di 7,9 (50 mM) e 4,3 (16 mM) Ct, corrispondente a circa 2,5 e 1,5 Log.
Tabella 3: Attivit? antivirale del PREP 4 contro la SARS-CoV-2 espressa come media ?Ct
La forte attivit? antivirale del PREP 4 ? evidente, poich? ha indotto la diminuzione di fino a 3 Log quando aggiunto dopo l'inoculo, una o due volte.
Questa diminuzione corrisponde ad una completa (100%) attivit? antivirale.
Attivit? virucida
Per confermare l'attivit? virucida del PREP 4, ? stato condotto il test della placca, seguendo lo schema C. La tabella 4 riporta i risultati ottenuti, espressi come PFU/ml medio. L'infettivit? della SARS-CoV-2 ? stata ridotta del 100% utilizzando
0,30 mg/ml e 0,15 mg/ml, e 81,5% e 52%, utilizzando 0,08 mg/ml, e 0,04 mg/ml di PREP 4, rispettivamente. Questi risultati hanno fortemente confermato l'effetto dose-dipendente del PREP 4, sia per le sue attivit? antivirali che virucide. Inoltre, essi assomigliavano all'attivit? antivirale del CQ, usato come controllo (dati non mostrati).
Tabella 4: attivit? virucida del PREP 4, secondo lo schema B+C
Attivit? antivirali e virucide contro la SARS-CoV-2 ? stato osservato quando il PREP 4 ? stato aggiunto dopo l'inoculo del virus, raggiungendo il 100% di inibizione del virus. Esempio 9.
Attivit? contro Virus a RNA e DNA, enveloped e non enveloped, testati secondo le norme ISO EN 14476: 2013 - ISO EN 16777:2019 e ISO 18184:2019.
Esempio 9A) Lattoferricina e grape seed contro Herpes Virus
Con l?esperimento qui riportato ? stato valutato l?effetto sinergico dell?attivit? antivirale di lattoferricina in combinazione con Grape Seed extract. Questa attivit? antivirale ? stata valutata utilizzando cellule Cf2Th (timociti canini) infettate con l?Herpes Virus canino, CHV-1.
Brevemente, le cellule Cf2Th sono state piastrate alla concentrazione di 5x10<5 >cell/mL in multiwell da 96 pozzetti (100 ?L/pozzetto) ed incubate a 37 ?C in atmosfera con 5% di CO2.
Al raggiungimento di circa il 90% di confluenza (48h di incubazione), il terreno ? stato aspirato da ogni pozzetto, e sostituito con 100 ?L terreno fresco contenente una concentrazione finale di virus pari a 1x10<3 >UFP/mL, e diverse concentrazioni di Lactive e Grape Seed extract.
In particolare, le diverse combinazioni tra i due composti erano state preparate in precedenza incrociando diluizioni seriali degli stessi, secondo il protocollo definito ?broth microdilution checkerboard method?, ovvero ?metodo della scacchiera?.
Le cellule sono state lasciate in co-incubazione con il virus e i composti in esame per 48h (37 ?C ? 5% CO2).
Al termine dell?incubazione, sono stati discriminati i pozzetti caratterizzati da una lisi cellulare data dall?infezione virale, da quelli in cui il virus ? stato inibito dai composti e quindi con cellule vitali. Questa valutazione ? stata effettuata sia tramite osservazione diretta al microscopio, sia mediante colorazione con blu di metilene.
Secondo il protocollo di colorazione, il terreno contenente i vari trattamenti ? stato aspirato da ogni pozzetto, e le cellule sono state lavate con PBS, eliminando cos? tutte le cellule non adese.
Successivamente, le cellule sono state fissate incubando ogni pozzetto con 100 ?L di una soluzione acquosa di formaldeide al 10% per 20 minuti a temperatura ambiente.
La soluzione fissante ? stata poi aspirata e le cellule lavate con PBS, prima di aggiungere ad ogni pozzetto 100 ?L di una soluzione di blu di metilene (1% in acqua).
Dopo 15 minuti di incubazione a temperatura ambiente la soluzione di blu di metilene ? stata rimossa e le cellule lavate con PBS per rimuovere l?eccesso di colorante.
In questo modo nei pozzetti che contenevano cellule vitali, queste risultano intensamente colorate, mentre i pozzetti in cui le cellule erano andate incontro a lisi virale non presentano colorazione.
Per determinare l?effettiva presenza di sinergia fra i due composti, ? stato calcolato il rapporto sotto riportato, definito FIC Index (FIC I). Affinch? l?associazione dei due composti in esame sia considerata sinergica il FIC Index deve essere minore di 1.
Quindi, considerando i risultati ottenuti nel presente esperimento si pu? determinare il valore del FIC Index, come di seguito riportato.
Ci? dimostra la presenza di un effetto sinergico dell?attivit? antivirale di lattoferricina in combinazione con Grape Seed extract.

Claims (12)

RIVENDICAZIONI
1. Composizione comprendente:
i) un ingrediente attivo comprendente lattoferrina oppure almeno un peptide comprendente lattoferricina, polilisina, natamicina o loro miscela, oppure una miscela di lattoferrina e detto almeno un peptide, e
ii) almeno un estratto vegetale comprendente antiossidanti scelti tra catechine, polifenoli e loro miscele,
detta composizione essendo per l?uso nel trattamento di infezioni causate da agenti patogeni.
2. La composizione di rivendicazione 1, in cui detto ingrediente attivo e detto almeno un estratto vegetale sono in rapporto in peso di almeno 1:2.
3. La composizione di rivendicazione 1 o 2, in cui detto ingrediente attivo e detto almeno un estratto vegetale sono in rapporto in peso non superiore a 1:1000.
4. La composizione di rivendicazione 3, in cui detto ingrediente attivo e detto almeno un estratto vegetale sono in rapporto in peso da 1:5 a 1:50.
5. La composizione di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, comprendente da 0.0005% a 20% in peso di detto ingrediente attivo e da 0.001% a 10% in peso detto almeno un estratto vegetale, sul peso della composizione.
6. La composizione di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, in cui detto ingrediente attivo ? lattoferricina.
7. La composizione di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6, in cui lattoferricina ? ottenuta da idrolisi enzimatica di lattoferrina, preferibilmente mediante impiego di un enzima immobilizzato.
8. La composizione di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7, ulteriormente comprendente almeno un altro peptide antimicrobico naturale.
9. Lattoferricina per l?uso nel trattamento di infezioni virali causate da virus respiratorio sinciziale, virus influenzale, virus parainfluenzale, Metapneumovirus, Rinovirus, Adenovirus, Coronavirus, Norovirus, Rotavirus, Astrovirus, Poliovirus, Orthopoxvirus, Herpes virus, Papillomavirus, Virus umano T-linfotropico 1, Virus di Epstein-Barr, Virus dell'epatite B, Virus dell'epatite C, Calicivirus felino, o Parvovirus canino.
10. Estratto di semi di uva per l?uso nel trattamento di infezioni virali causate da virus respiratorio sinciziale, virus influenzale, virus parainfluenzale, Metapneumovirus, Rinovirus, Adenovirus, Coronavirus, Norovirus, Rotavirus, Astrovirus, Poliovirus, Orthopoxvirus, Herpes virus, Papillomavirus, Virus umano T-linfotropico 1, Virus di Epstein-Barr, Virus dell'epatite B, Virus dell'epatite C, Calicivirus felino, o Parvovirus canino.
11. Polilisina per l?uso nel trattamento di infezioni virali causate da virus respiratorio sinciziale, virus influenzale, virus parainfluenzale, Metapneumovirus, Rinovirus, Adenovirus, Coronavirus, Norovirus, Rotavirus, Astrovirus, Poliovirus, Orthopoxvirus, Herpes virus, Papillomavirus, Virus umano T-linfotropico 1, Virus di Epstein-Barr, Virus dell'epatite B, Virus dell'epatite C, Calicivirus felino, o Parvovirus canino.
12. Integratore alimentare, cosmetico o dispositivo medico comprendente la composizione per l?uso di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022265697A1 (en) * 2021-06-18 2022-12-22 Tiger Development, LLC Compositions for treating viral infections and methods for same
CN117158444B (zh) * 2023-09-05 2024-02-27 通化康元生物科技有限公司 一种林蛙抗菌肽制剂及其制备方法和在外用防护品及抗流感病毒药物中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019021175A1 (en) * 2017-07-26 2019-01-31 Bict S.R.L. LACTOFERRICIN AND LACTOFERRAMPINE FOR THE TREATMENT OF INFECTIONS

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019021175A1 (en) * 2017-07-26 2019-01-31 Bict S.R.L. LACTOFERRICIN AND LACTOFERRAMPINE FOR THE TREATMENT OF INFECTIONS

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Gen Bank", Database accession no. MT748758
ANONYMOUS: "Verbraucherinformation - SanFerin Tabletten", 1 January 2017 (2017-01-01), XP055795532, Retrieved from the Internet <URL:https://www.apo-rot.de/docs/11608182.pdf> [retrieved on 20210415] *
GELBE LISTE ONLINE: "Natamycin - Anwendung, Wirkung, Nebenwirkungen | Gelbe Liste", 1 January 2017 (2017-01-01), XP055794951, Retrieved from the Internet <URL:https://www.gelbe-liste.de/wirkstoffe/Natamycin_532> [retrieved on 20210413] *
LANGELAND N. ET AL: "Interaction of Polylysine with the Cellular Receptor for Herpes Simplex Virus Type 1", JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, vol. 69, no. 6, 1 June 1988 (1988-06-01), pages 1137 - 1145, XP055794953, ISSN: 0022-1317, Retrieved from the Internet <URL:https://www.researchgate.net/profile/Nina-Langeland/publication/20316813_Interaction_of_Polylysine_with_the_Cellular_Receptor_for_Herpes_Simplex_Virus_Type_1/links/02e7e51d7125f1bd8f000000/Interaction-of-Polylysine-with-the-Cellular-Receptor-for-Herpes-Simplex-Virus-Type-1.pdf> DOI: 10.1099/0022-1317-69-6-1137 *
LORENZO RODRÍGUEZ J M ET AL: "ANTIMICROBIAL AND ANTIVIRAL ACTIVITIES OF GRAPE SEED EXTRACTS", 1 January 2016 (2016-01-01), XP055794947, Retrieved from the Internet <URL:https://www.novapublishers.com/wp-content/uploads/2018/10/978-1-63484-578-6_ch10.pdf> [retrieved on 20210413] *
LOTZ B.: "Lactoferrin als Prophylaxe oder Therapie bei COVID-19?", 1 July 2020 (2020-07-01), XP055795414, Retrieved from the Internet <URL:https://www.apotheke-adhoc.de/branchennews/alle-branchennews/branchennews-detail/volopharm-gmbh-lactoferrin-als-prophylaxe-oder-therapie-bei-covid-19-1/> [retrieved on 20210414] *
TAN ZHILEI ET AL: "The antimicrobial effects and mechanism of [epsilon]-poly-lysine against Staphylococcus aureus", BIORESOURCES AND BIOPROCESSING, vol. 6, no. 1, 13 April 2019 (2019-04-13), XP055794952, Retrieved from the Internet <URL:http://link.springer.com/article/10.1186/s40643-019-0246-8/fulltext.html> DOI: 10.1186/s40643-019-0246-8 *
X. SU ET AL: "Grape Seed Extract for Control of Human Enteric Viruses", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 77, no. 12, 15 April 2011 (2011-04-15), pages 3982 - 3987, XP055142467, ISSN: 0099-2240, DOI: 10.1128/AEM.00193-11 *
YOSHIDA, F, BULL. AGRI.CHEM.SOC. JAPAN, vol. 20, 1956, pages 252 - 256
YOSHIDA, F, BULL. AGRI.CHEM.SOCA JAPAN, vol. 20, 1956, pages 252 - 256

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