IT202000007285A1 - Formulazioni ad uso topico per la prevenzione dell’effetto urticante del veleno di cnidari marini - Google Patents
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Description
Titolo: ?FORMULAZIONI AD USO TOPICO PER LA PREVENZIONE DELL?EFFETTO URTICANTE DEL VELENO DI CNIDARI MARINI?
DESCRIZIONE
La presente invenzione concerne delle formulazioni di prodotti topici per la prevenzione delle punture degli Cnidari marini, quali anemoni e meduse.
Considerato un problema minore fino a pochi anni fa, una eccessiva proliferazione di meduse, specie appartenente alla famiglia degli Cnidari, segnalata con crescente frequenza in tutto il mondo, ha notevolmente aumentato l'interesse per l'impatto medico e sociale dei fenomeni di punture da meduse a volte con effetti addirittura, per alcune specie pelagiche in particolare, mortali. In effetti, molti studi scientifici hanno collegato la comparsa di specie invasive nei mari temperati a molteplici cause come i cambiamenti climatici, la pesca eccessiva e l'inquinamento.
In questo scenario, la massiva presenza delle meduse ? diventato un problema serio non solo per la salute pubblica, ma anche per tutte le attivit? economiche legate al turismo e alla pesca. Si pensi solo che ogni anno in tutto il mondo vengono riportate oltre 150 milioni di punture di meduse, con oltre 500 milioni di persone esposte al rischio. Secondo la National Science Foundation degli Stati Uniti, circa 500.000 persone vengono colpite ogni anno da meduse nella baia di Chesapeake e oltre 200.000 nella sola Florida. Nel frattempo, in Australia oltre 10.000 persone ogni anno hanno un incontro ravvicinato e doloroso con la temuta ed altamente tossica ?caravella portoghese?. Ci? ha causato un drammatico aumento del numero di persone in cerca di cure o di trattamenti preventivi per le punture di meduse.
Tuttavia, nonostante l'urgente necessit?, pochissimi prodotti disponibili sul mercato sono in qualche modo utili per la prevenzione dell?effetto urticante del veleno di Cnidari marini (puntura di medusa e di anemoni) e la maggior parte di essi non ? specificamente progettata per questo scopo. I tradizionali prodotti topici utilizzati in questo settore hanno infatti lo svantaggio di creare esclusivamente una barriera sulla pelle umana, che peraltro tende a degradarsi in presenza dell'acqua di mare e divenendo per questo motivo incapace di impedire il contatto con gli cnidociti presenti sui tentacoli delle meduse.
Un ulteriore inconveniente delle note composizioni contro preferenzialmente le punture delle meduse ? rappresentato dalla mancata soluzione al problema della stimolazione delle cnidocisti al contatto con la pelle umana.
Costituisce lo scopo principale della presente invenzione quello di fornire delle formulazioni di prodotti topici per la prevenzione dell?effetto urticante del veleno degli Cnidari marini ed in particolar modo delle punture delle meduse, che presentano un effetto inibente sulla stimolazione delle cnidocisti.
Rappresenta un ulteriore scopo dell'invenzione quello di fornire delle formulazioni di prodotti topici per la prevenzione dell?effetto urticante del veleno degli Cnidari marini, capaci di non degradarsi al contatto con l'acqua di mare.
Questi ed altri scopi sono raggiunti con gli estratti botanici e le formulazioni delle rivendicazioni rispettivamente 1 e 6. Dei preferiti modi di realizzare le formulazioni dell'invenzione risultano dalle restanti rivendicazioni.
In rapporto alle note composizioni per la prevenzione dell?effetto urticante del veleno degli Cnidari marini, le formulazioni secondo la presente invenzione offrono il vantaggio di presentare un'azione biomimetica che inibisce l'attivazione degli cnidociti, facendo mancare in questo modo la stimolazione della secrezione delle sostanze urticanti da parte delle cnidocisti.
Le formulazioni dell'invenzione presentano inoltre il vantaggio di creare una crema barriera ad elevata resistenza all'acqua ed al sale.
Un ulteriore vantaggio delle formulazioni dell'invenzione ? rappresentato dal fatto che le stesse presentano una diffusione duratura ed omogenea sulla pelle, peraltro in assenza di effetti sensibilizzanti verso quest'ultima.
Questi ed altri scopi, vantaggi e caratteristiche risultano dalla descrizione che segue di alcuni preferiti modi di realizzare le formulazioni dell'invenzione, riportate a solo titolo esemplificativo e non limitativo della stessa.
Allo scopo di prevenire i danni alla pelle dovuti alla puntura di medusa o da altri Cnidari marini ? stata realizzata, secondo l'invenzione, una crema che presenta un effetto di barriera chimica e meccanica in grado di proteggere la pelle quando questa viene a contatto con i tentacoli degli Cnidari marini. Grazie alle formulazioni dell'invenzione i marcatori tipici della pelle umana che attirano il rilascio del veleno dai tentacoli degli Cnidari marini sono mascherati, cos? da rendere la pelle simile ad un oggetto inanimato, impedendone peraltro il contatto diretto con gli cnidociti.
A tale scopo ? stato innanzitutto identificato il modello animale per la selezione delle molecole candidate, utili per contrastare il bruciore e l?effetto urticante del veleno degli Cnidari marini quali anemoni e meduse. Come modelli animali per i test si sono impiegati gli anemoni di mare (Heteractis crispa), ovvero un invertebrato filogeneticamente molto vicino alla medusa e dal veleno simile.
Successivamente si sono studiate le propriet? e la composizione di molecole molto simili alla glicoproteina di collagene mucoso degli anemoni (anch?essi del phylum degli Cnidari), ci? che ha permesso di identificare gli ingredienti e le concentrazioni delle molecole utili per ottenere le migliori prestazioni nella protezione della pelle contro il contatto con i tentacoli degli Cnidari marini e per contrastare l'attivazione di cnidociti, l'evento critico che porta all?espulsione e all'iniezione di veleno.
Gli studi sono stati inoltre sviluppati con l'obiettivo di conferire alla crema barriera dell'invenzione una elevata resistenza all'acqua ed al sale, poich? l'acqua salata tende a distruggere la stabilit? dell'emulsione.
Gli inventori hanno cos? sorprendentemente scoperto che l'estratto dal rizoma di Dioscorea villosa offre le migliori prestazioni nella protezione della pelle contro il contatto con gli Cnidari marini e l'attivazione delle loro cnidocisti, che ? l'evento critico che porta all'iniezione del veleno.
La Dioscorea villosa ? una pianta erbacea perenne rampicante monocotiledone della famiglia delle Dioscoreaceae. La Dioscorea, anche detta igname selvatico (wild yam), ? una pianta erbacea perenne diffusa in America Centrale e Canada e possiede diverse propriet? benefiche grazie alla presenza di fitosteroidi, diosgenina e tannini. Esiste in oltre 500 variet?, di cui si utilizzano generalmente radici e rizomi per prepararne integratori e tintura madre a partire dall?estratto secco. Tra le sue propriet?, spiccano quelle antidolorifiche e lenitive, depurative, antiossidanti e dimagranti.
Come descritto dal Cosmetic, Toilery and Frangrance Association (CTFA) e inserito nella International Ingredient Dictionary and Handbook, l?estratto secco della Dioscorea villosa (Wild Yam) con CAS n? 90147-49-2 ? l?estratto del rizoma.
Attualmente esistono pochi dati relativi alle propriet? degli ingredienti della D. villosa. In accordo con la CTFA (1) l?estratto ha un pH da 4.0 a 6.8, un indice di rifrazione a 25?C da 1.362 a 1,47 ed una densit? specifica da 0.90 a 1.06 a 25?C.
L'estratto di rizoma di Dioscorea villosa ? elencato come ingrediente cosmetico nell'inventario UE INCI ed ? noto per le sue propriet? anti-aging e cosmetiche in genere, senza alcun legame o riferimento con gli scopi dell'invenzione che si sono detti pi? sopra.
Nella tradizione fitoterapica e nella medicina popolare la Dioscorea viene utilizzata per il trattamento di disturbi reumatici, coliche biliari, crampi e dismenorrea grazie alle sue propriet? fitoprogestiniche. La Dioscorea trova impieghi anche in ambito omeopatico, dove la si pu? trovare sotto forma di granuli, gocce e tintura madre. Attualmente in commercio esistono formulazioni contenenti Dioscorea villosa ma soprattutto preparati ad uso topico o come integratore alimentare con diverse titolazioni e a diverse concentrazioni.
Secondo l'invenzione, l'estratto di rizoma di Dioscorea villosa ? realizzato dall?estratto da rizoma della Dioscorea villosa ed ? stato preparato frantumando e sminuzzando il rizoma stesso ed eseguendo successivamente l?estrazione del materiale mediante una miscela di acqua/etanolo. Il materiale cos? preparato ? successivamente messo in macerazione o percolazione con solventi ed il solvente rimosso tramite processo di purificazione/ distillazione. Il materiale risultante pu? essere utilizzato come estratto secco o diluito con un solvente appropriato, ad esempio idroglicerico o glicolico.
Gli inventori hanno in effetti scoperto che le formulazioni dell'invenzione, contenenti almeno l?1% peso, preferibilmente dal 5% all'8% in peso di estratto di rizoma di Dioscorea villosa, nella forma di estratto secco, idroglicerico o in altri solventi, esibiscono una efficace azione di inibizione del rilascio di veleno da parte degli cnidociti presenti sui tentacoli degli Cnidari marini, simulando sulla pelle umana i segnali dei materiali inerti che, per la loro natura, non stimolano le cnidocisti.
Secondo un modo ancora pi? preferito di realizzare l'invenzione, accanto alla descritta azione chimica svolta dalla Dioscorea villosa le formulazioni dell'invenzione presentano anche una efficace azione meccanica di barriera sulla pelle contro il contatto con gli cnidociti, grazie alla loro elevata resistenza al dilavamento e stabilit? all?acqua salata.
Questo risultato ? raggiunto preparando le formulazioni dell'invenzione nella forma di emulsioni di acqua in olio o acqua in silicone, in cui la fase olio circonda e protegge le gocce della fase acqua che contiene l'estratto di rizoma di Dioscorea villosa, proteggendola dall'aggressione dell'acqua di mare.
Le emulsioni acqua in olio delle formulazioni dell'invenzione sono realizzate attraverso un processo di emulsione inversa (A/O o A/S). Nell?emulsione acqua in olio (A/O) o acqua in silicone (A/S), l?acqua rappresenta la fase dispersa (o discontinua o interna) e l?olio la fase lipofila disperdente (o continua o esterna). La capacit? di azione dell'estratto di rizoma di Dioscorea villosa contenuto nella fase acqua delle formulazioni dell'invenzione non ? ovviamente compromessa dalla descritta modalit? di preparazione delle emulsioni acqua in olio/silicone.
Nella fattispecie della suddetta formulazione la fase acqua contenente l'estratto di rizoma di Dioscorea villosa ? messa in emulsione con una fase grassa che contiene uno o pi? tra i seguenti: olio di vaselina, vaselina (paraffina), squalano, squalene, coco-caprilato, C12-C15 alchilbenzoato, coco-caprilato/caprato, caprilic/capric trigliceride, isopropil miristato, cera d?api, cera bellina, cera microcristallina, dicapriril etere, poliisobutene, isostearil-isotearato, ottildodecanolo, esil laurato, cetil palmitato, diottil cicloesano, deciloleato, cetearil ottanoato, oleil oleato, cetil lattato, glicol distearato, isostearil alcool, cetil alcool, glicoli etossilati, lauril dimeticone copolioli, olio di ricino idrogenato, trigliceridi, siliconi, colesterolo, olio di mandorle, olio di oliva, olio di avocado, olio di jojoba, olio di arachidi, olio di colza, olio di germe di grano, olio di mais, olio di riso e di germe di riso, olio di vinaccioli, olio di girasole, olio di noci, olio di nocciolo, olio di sesamo,olio di ribes nero, olio di borragine, burro di karit?, olio di soja,
olio di carnauba, glicerolo, ottil ottanoato, sorbitano sesquioleato, dipoliidrossistearato
/Etilesil dodecanolo ottildodecil xiloside, glicol propilenico, dimeticone e suoi derivati,
gliceril stearato.
Nel seguito sono forniti alcuni esempi di creme barriera secondo le
formulazioni dell'invenzione, dove le percentuali sono in peso.
Esempio 1
Sostanza % in Peso Acqua qb a 100 Conservante ? 1,0 Glicerolo 2,0-10,0 ESTRATTO di Dioscorea villosa 5,0-8,0 Ottil ottanoato ? 20 ,0 Vaselina 5,0-15,0 Cera bellina 5,0-15,0 Magnesio solfato 0,2-1,0
Esempio 2
Sostanza % in Peso Acqua qb a 100 Conservante ? 1,0 Glicerolo 2-10,0 ESTRATTO di Dioscorea villosa 1,0-5,0 Filtri solari ? 10 ,0 Vaselina 10,0-15,0 Sorbitano sesquioleato 3,0-7,0 Cera d?api ? 2,0 Magnesio solfato 0,1-2,0 squalano ? 10 ,0 Coco-caprilato ? 10 ,0
Esempio 3
Sostanza % in Peso Acqua qb a 100 Conservante (es alcool benzilico e acido deidroacetico) 0,6 Glicole propilenico 15,0 ESTRATTO di Dioscorea villosa 5,0 Diottil cicloesano 5,0 Dicaprililetere 5,0 Cetil dimeticone copoliolo 2,5 lauril dimeticone copoliolo 2,5 Cloruro di sodio 1,0 Squalano 5,0 dimeticone 5,0
E? inoltre possibile incorporare l?estratto di Dioscorea in emulsioni O/A (olio
in acqua), o geli, meno efficaci per? dal punto di vista della sostantivit? poich?
meno idrorepellenti, come ad esempio:
Esempio 4
Sostanza % in Peso Acqua qb a 100 Conservante (es alcool benzilico e acido deidroacetico) 0,6 Glicerolo 4,5 ESTRATTO di Dioscorea villosa 8,0 Octil octanoato 7,5 Isopropil miristato 7,5
PEG-20 3,0
Gliceril stearato 2,0 Alcool cetistearilico 5,0 Edta 0,1
Esempio 5
Sostanza % in Peso Acqua qb a 100 Conservante (es imidazolidinil urea e parabeni) 0,8 Glicerolo 4,5 Propilen glicole 4,5 ESTRATTO di Dioscorea villosa 5,0 Copolimeri acrilati 0,2 Isopropil miristato 10,0 Carbomer 0,5 acido ialuronico 0,2 Sepigel 0,8 Neutralizzante (es AMP) 0,3 Per verificare l'efficacia delle formulazioni dell'invenzione ? stata preparata una formulazione campione secondo l'esempio che segue, in cui ? utilizzato un estratto idroglicerico di rizoma di Dioscorea villosa:
Esempio campione
Sostanza % in Peso
Acqua qb a 100
Conservanti ?1,0
Glicerolo 5,0-15%
ESTRATTO di Dioscorea villosa 1-10,0 %
Filtri solari ?12 ,0%
vaselina o olii vegetali ?,20,0%
PEG-30/Dipoliidrossistearato/Etilesil dodecanolo/
/Octildodecil xiloside 3,0-6,0%
Cera d?api 0,5-1,5%
Squalano vegetale 2-5%
Magnesio solfato 0,5-2%
C12-15 alchil benzoato 2-8%
Coco-caprilato 2-10%
L?efficacia ? inoltre stata testata su diluizioni in acqua e glicerina dell?estratto di rizoma di Dioscorea villosa in concentrazioni dall?1% all?8%.
La prova ? basata su dei vetrini appositamente trattati con derivati animali in grado di attirare la risposta alla puntura negli anemoni di mare Heteractis Crispa coltivati in laboratorio.
I vetrini sono stati testati direttamente dopo averli rivestiti con la formulazione dell'invenzione, immergendoli nell?acquario a contatto con la superficie dell'anello esterno dei tentacoli degli anemoni, insieme a dei controlli negativi e positivi. Dopo il contatto in modo controllato, i vetrini sono stati immediatamente immersi in una soluzione di colorazione blu di Coomassie (utilizzata per evidenziare in modo colorimetrico la presenza di cnidociti) per identificare i punti di rilascio di tossine, che appaiono di un colore blu. Le immagini della superficie del vetro sono state scattate usando un microscopio ottico standard con una fotocamera, per documentare i risultati.
In particolare, il test di efficacia per l'inibizione delle punture dagli anemoni di mare ? stato eseguito come segue.
PROTOCOLLO
Il saggio ? stato modificato da una versione del test di tossicit? della puntura su bacchette di vetro.
500 microlitri di dispersione di mucina sono stati diluiti in acqua e la soluzione risultante ? stata applicata su vetrini. I vetrini sono stati poi successivamente lasciati asciugare per 16 ore. A termine, i vetrini sono stati ispezionati per verificare che lo strato di mucina risultante fosse solidificato ed uniformemente distribuito sull?intera superficie. I vetrini rivestiti di mucina sono stati quindi testati come controllo negativo per verificare che attirassero la risposta alla puntura negli anemoni di mare della specie utilizzata: la Heteractis crispa.
50mg di estratto diluito come sopra descritto all?1%, 5% e 8% o 50 mg di formulazione secondo l'esempio campione sono stati distribuiti uniformemente sulla superficie della mucina ed i corrispondenti vetrini sono stati testati direttamente dopo il rivestimento con il medesimo campione (o dopo un tempo prestabilito per verificare la migrazione delle sostanze bersaglio dalla mucina e attraverso lo strato di rivestimento).
I vetrini sono quindi stati immersi nell?acquario alla presenza degli anemoni e messi in contatto con la superficie esterna di loro tentacoli e lasciati in contatto diretto per 60 secondi. Il controllo negativo ? stato esposto per lo stesso tempo (60 secondi) per ultimo, al fine di confermare che l?anemone non avesse esaurito gli cnidociti. I vetrini sono stati quindi recuperati e fissati.
Successivamente i vetrini sono stati immediatamente immersi nella soluzione di colorazione blu di Coomassie, preparata come segue:
Soluzione di Colorazione
50% metanolo
10% acido acetico
40% acqua
1,2 g/L Coomassie blue
RISULTATI
La crema base dell'invenzione contenente l?estratto di rizoma di Dioscorrea villosa all?1% e all?1,6% (partendo da un estratto secco) e al 3%, 5% e 8% (partendo da un estratto idroglicerico) ha determinato in tutti i casi una riduzione proporzionale alla concentrazione di punture da parte degli cnidociti, con il massimo risultato alle concentrazioni del 5 e 8% dell?estratto idroglicerico (riduzione del 100% delle punture).
La crema barriera contenente l'estratto di rizoma di Dioscorea villosa al 5% ha determinato l'assenza di punture da parte degli cnidociti con un calo del 90-100% di nematocisti rispetto al campione di confronto.
Come illustrato in Figura 1 (immagine x 100 ingrandimenti) tutti i controlli negativi hanno mostrato grandi gruppi di filamenti di nematocisti in strisce lunghe e sottili sulla superficie del vetrino, risultanti dal contatto diretto con i tentacoli (Figura 1). Le diapositive mostrano in effetti la presenza di cnidociti nell'area al di fuori dello strato del campione testato.
Al contrario, come illustrato in Figura 2 (immagine x 200 ingrandimenti) la superficie coperta con la formulazione dell'invenzione ha mostrato pochi o nessun cnidocita, confermando cos? la reazione dell'anemone in modo semiquantitativo.
Pertanto:
? L'estratto di rizoma di Dioscorea villosa ? risultato efficace a concentrazioni ? 1% con concentrazione ottimale al 5% nell?impedire le punture di cnidociti fino al 100%.
? Le formulazioni dell'invenzione contenenti l'estratto di Dioscorea Villosa hanno determinato un calo critico del numero di nematocisti (calo dal 90% al 100%) e quindi una elevata capacit? protettiva in una formulazione adatta ad essere applicata sulla pelle e commercializzata.
I test hanno inoltre mostrato:
- una resistenza all'acqua contro l'acqua salata marina superiore al 70% circa (spiegare meglio il calcolo del valore numerico); Tale resistenza viene valutata mediante la misura del fattore di protezione solare (SPF) posseduto dal prodotto prima e dopo i test di dilavamento.
- una assenza di sensibilizzazione cutanea, perch? non aumenta l'espressione dei marcatori di sensibilizzazione indagati nei monociti umani, mostrando quindi di non possedere un potenziale stimolante del sistema immunitario mediato dal monocita/macrofago;
- una stabilit? microbiologica attraverso la valutazione del rischio di contaminazione microbica in un prodotto cosmetico, che pu? essere considerata a basso rischio di contaminazione microbica secondo ISO 29621:2010.
Claims (11)
- RIVENDICAZIONI 1. Formulazioni per la prevenzione dell?effetto urticante del veleno degli Cnidari marini, caratterizzate dal fatto di comprendere un estratto di rizoma di Dioscorea villosa.
- 2. Formulazioni secondo la rivendicazione 1, caratterizzate dal fatto di comprendere almeno l?1% in peso di estratto di rizoma di Dioscorea villosa e preferenzialmente tra il 5% e l?8%.
- 3. Formulazioni secondo la rivendicazione 1, caratterizzate dal fatto di essere delle emulsioni di acqua in olio o acqua in silicone.
- 4. Formulazioni secondo la rivendicazione 3, caratterizzate dal fatto di comprendere inoltre una fase lipidica.
- 5. Formulazioni secondo la rivendicazione 4, caratterizzate dal fatto che la detta fase lipidica contiene uno o pi? tra i seguenti: olio di vaselina, vaselina (paraffina), squalano, squalene, coco-caprilato, C12-C15 alchilbenzoato, coco-caprilato/caprato, caprilic/capric trigliceride, isopropil miristato, cera d?api, cera bellina, cera microcristallina, dicapriril etere, poliisobutene, isostearil-isotearato, ottildodecanolo, esil laurato, cetil palmitato, diottil cicloesano, deciloleato, cetearil ottanoato, oleil oleato, cetil lattato, glicol distearato, isostearil alcool, cetil alcool, glicoli etossilati, lauril dimeticone copolioli, olio di ricino idrogenato, trigliceridi, siliconi, colesterolo, olio di mandorle, olio di oliva, olio di avocado, olio di jojoba, olio di arachidi, olio di colza, olio di germe di grano, olio di mais, olio di riso e di germe di riso, olio di vinaccioli, olio di girasole, olio di noci, olio di nocciolo, olio di sesamo,olio di ribes nero, olio di borragine, burro di karit?, olio di soja, olio di carnauba, glicerolo, ottil ottanoato, sorbitano sesquioleato, dipoliidrossistearato /Etilesil dodecanolo, ottildodecil xiloside, glicol propilenico, dimeticone e suoi derivati, gliceril stearato.
- 6. Prodotto per la prevenzione degli effetti urticanti del veleno rilasciato dagli Cnidari marini, caratterizzato dal fatto di comprendere una formulazione secondo una o pi? delle rivendicazioni precedenti.
- 7. Prodotto secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto di essere in forma di una crema per la somministrazione topica.
- 8. Prodotto secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto di presentare la seguente composizione: Sostanza % in Peso Acqua qb a 100 Conservante ? 1,0 Glicerolo 2,0-10,0 ESTRATTO di Dioscorea villosa 5,0-8,0 Ottil ottanoato ? 20 ,0 Vaselina 5,0-15,0 Cera bellina 5,0-15,0 Magnesio solfato 0,2-1,0
- 9. Prodotto secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto di presentare la seguente composizione: Sostanza % in Peso Acqua qb a 100 Conservante ? 1,0 Glicerolo 2-10,0 ESTRATTO di Dioscorea villosa 1,0-5,0 Filtri solari ? 10 ,0 Vaselina 10,0-15,0 Sorbitano sesquioleato 3,0-7,0 Cera d?api ? 2,0 Magnesio solfato 0,1-2,0 squalano ? 10 ,0 Coco-caprilato ? 10 ,0
- 10. Prodotto secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto di presentare la seguente composizione: Sostanza % in Peso Acqua qb a 100 Conservanti ?1,0 Glicerolo 5,0-15% ESTRATTO di Dioscorea villosa 1-10,0 % Filtri solari ?12 ,0% vaselina o olii vegetali ?,20,0% PEG-30/Dipoliidrossistearato/Etilesil dodecanolo/ /Ottildodecil xiloside 3,0-6,0% Cera d?api 0,5-1,5% Squalano vegetale 2-5% Magnesio solfato 0,5-2% C12-15 alchil benzoato 2-8% Coco-caprilato 2-10%
- 11. Uso delle formulazioni e del prodotto secondo una o pi? delle rivendicazioni precedenti nella prevenzione dell?effetto urticante del veleno degli Cnidari marini.
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| IT (1) | IT202000007285A1 (it) |
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