IT202000004849A1

IT202000004849A1 - Peptidi e loro usi

Info

Publication number: IT202000004849A1
Application number: IT102020000004849A
Authority: IT
Inventors: Barbara Biondi; Gianfranco Bocchinfuso; Simone Martinelli; Marco Tartaglia; Lorenzo Stella
Original assignee: Univ Degli Studi Di Roma “Tor Vergata”; Ospedale Pediatrico Bambino Gesù
Priority date: 2020-03-06
Filing date: 2020-03-06
Publication date: 2021-09-06
Also published as: US20230192765A1; WO2021176072A1; EP4114849A1

Description

PEPTIDI E LORO USI

AMBITO TECNICO

La presente invenzione riguarda peptidi e loro derivati, e peptidimimetici, inibitori delle interazioni proteina-proteina della fosfatasi SHP2, per la terapia antitumorale e delle RASopatie, e come strumenti per la ricerca biomedica.

STATO DELL?ARTE

SHP2 in fisiologia e patologia

La fosforilazione dei residui di tirosina, regolata da proteine ad attivit? tirosin-chinasica (Protein Tyrosine Kinases, PTK) e da proteine ad attivit? tirosin-fosfatasica (Protein Tyrosine Phosphatases, PTP), ? uno dei meccanismi principali nella regolazione della trasduzione del segnale intracellulare. La fosforilazione aberrante dei residui di tirosina causata dall?iperattivazione delle PTK ? associata a un gran numero di neoplasie e la maggior parte delle attuali terapie antitumorali ? basata proprio sull?utilizzo di inibitori di PTK [Wu 2015]. Le PTP contrastano gli effetti delle chinasi e pertanto sono generalmente considerate come regolatori negativi della trasduzione del segnale e come soppressori tumorali [Elson 2018]. La fosfatasi 2 contenente due domini di omologia a Src 2 (SH2) (SHP2), codificata dal gene PTPN11, ? una PTP di tipo non recettoriale che non rientra nel suddetto schema [Tajan 2015].

SHP2 ? espressa in modo ubiquitario e media la trasduzione del segnale a valle di numerosi recettori tirosin-chinasi (Receptor Tyrosine Kinases, RTK): ? necessaria per l'attivazione completa e prolungata nel tempo della via RAS-MAP chinasi (RAS-MAPK) [Saxton 1997], e modula anche altre vie di segnalazione intracellulare attraverso le cascate PI3K-AKT e JAK-STAT, fra le altre. Pertanto, SHP2 ? coinvolta nella regolazione di un ampio spettro di processi cellulari, inclusi la proliferazione, la sopravvivenza, il differenziamento e la migrazione [Tajan 2015]. Considerando l?importanza di queste funzioni, non sorprende che SHP2 giochi un ruolo chiave sia nel cancro che nelle malattie dello sviluppo [Grossmann 2010].

PTPN11 ? stato il primo proto-oncogene codificante una PTP ad essere identificato [Tartaglia 2003]. Mutazioni attivanti di PTPN11 che insorgono nel DNA di cellule somatiche costituiscono la causa principale di leucemia mielomonocitica giovanile di tipo sporadico (Juvenile Myelomonocytic Leukemia, JMML), rendendo conto di circa il 35% dei casi [Tartaglia 2003]. La JMML ? un raro ed aggressivo disordine mielodisplastico/mieloproliferativo della primissima infanzia con una prognosi generalmente infausta, per la quale non ? attualmente disponibile alcun tipo di trattamento farmacologico [Niemeyer 2019]. Mutazioni di PTPN11 ricorrono inoltre in alcune sindromi mielodisplastiche dell'et? pediatrica, cos? come nella leucemia monocitica acuta (AMoL, FAB M5) e linfoblastica acuta (LLA, sottogruppo "common") del bambino [Tartaglia 2004; Grossmann 2010]. Pi? raramente, mutazioni attivanti di questo gene sono state identificate in sindromi mielodisplastiche dell?adulto, nella leucemia mielomonocitica cronica e in alcuni tumori solidi quali il neuroblastoma, il glioma, il rabdomiosarcoma di tipo embrionale, il carcinoma polmonare, il tumore del colon e il melanoma [Bentires-Alj 2004, Loh 2005, Martinelli 2006 e 2009].

Oltre alle neoplasie causate da mutazioni in PTPN11, diverse forme tumorali sono strettamente legate alla fisiologica attivit? di SHP2. Recentemente, da uno studio elegante ed innovativo condotto mediante screening di centinaia di linee cellulari effettuato utilizzando una libreria di shRNA, ? emerso come SHP2 svolga un ruolo essenziale nella sopravvivenza delle cellule tumorali rese tali dall?iperattivazione di RTK [Chen 2016].

SHP2 costituisce anche un nodo centrale nella resistenza intrinseca e acquisita ai farmaci antitumorali mirati [Prahallad 2015; Dardarei 2018; Fedele 2018; Ruess 2018; Wong 2018; Ahmed 2019; Hill 2019; Lu 2019]; tale resistenza ? spesso associata ad attivazione di RTK tramite meccanismi di feedback.

SHP2 svolge inoltre un ruolo chiave come modulatore delle vie di trasduzione del segnale dei checkpoint immunitari, quali PD-1 e SIRP?/CD47 [Okazaki 2013, Veillette 2018]. Queste cascate del segnale inibiscono l?attivazione delle cellule immunitarie, favorendo in questo modo l'auto-tolleranza e la modulazione della durata e dell'ampiezza della risposta immune fisiologica. SHP2 lega i recettori attivati ed ? responsabile dell'avvio delle cascate del segnale che prevengono l?attivazione delle cellule immunitarie [Okazaki 2013, Veillette 2018]. Alcune cellule tumorali sono in grado di ?dirottare? queste vie di trasduzione del segnale, sfuggendo cos? alle difese immunitarie antitumorali [Pardoll 2012], SHP2 ? pertanto attualmente considerata come un potenziale bersaglio nel trattamento immunoterapeutico del cancro [Ran 2016, Quintana 2019, Zhao 2019].

Infine, vale la pena ricordare che l'induzione del carcinoma gastrico da parte di H. pylori ? mediata dall'interazione del suo fattore di virulenza CagA proprio con SHP2, causando l?attivazione aberrante della fosfatasi [Higashi 2002, Hayashi 2017].

Oltre al ruolo che svolge nella trasformazione neoplastica, SHP2 ? coinvolta in una famiglia di malattie genetiche rare conosciute come RASopatie: mutazioni missenso di PTPN11 della linea germinale occorrono nel 50% circa dei soggetti con sindrome di Noonan (SN) [Tartaglia 2001], una malattia dello sviluppo che predispone all?insorgenza di JMML [Tartaglia 2010; Roberts 2013], e circa il 90% dei pazienti affetti da una condizione clinicamente correlata alla SN, la SN con lentiggini multiple (acronimo inglese NSML, precedentemente nota come sindrome LEOPARD) [Digilio 2002, Legius 2002, Tajan 2018]. Le RASopatie sono caratterizzate dalla presenza di cardiopatie congenite, cardiomiopatia ipertrofica, bassa statura, anomalie muscoloscheletriche, dismorfismi facciali, disabilit? intellettive di grado variabile e suscettibilit? allo sviluppo di tumori [Tartaglia 2010]. Ad oggi, l'unico trattamento per la SN e disturbi correlati che ? stato studiato ? la terapia con ormone della crescita, utilizzata per migliorare la crescita lineare [Roberts 2013, Gelb 2015].

Struttura e regolazione allosterica di SHP2

SHP2 ? costituita da due domini di omologia alla proteina Src 2 (SH2), chiamati N-SH2 e C-SH2, seguiti da un dominio catalitico (PTP) e da una coda C-terminale non strutturata, la cui funzione ? ancora largamente oscura (Figura 1) [Tajan 2015]. I domini SH2 sono elementi di riconoscimento che legano sequenze proteiche contenenti un residuo di tirosina fosforilata (pY); nel caso di SHP2, mediano l'associazione dell?enzima con RTK, recettori di citochine, molecole di adesione cellulare e proteine adattatrici [Tajan 2015]. Pertanto, SHP2 (insieme alla proteina paraloga SHP1) viene reclutata, tramite i domini SH2, da motivi contenenti due residui di pY e a sua volta defosforila le pY di altre proteine (o anche delle stesse) mediante il suo dominio PTP.

Le strutture cristallografiche di SHP2 [Hof 1998, LaRochelle 2018], integrate da analisi biochimiche [Bocchinfuso 2007], hanno permesso di far luce sulle principali caratteristiche della regolazione allosterica dell'attivit? della fosfatasi. In condizioni basali, il dominio N-SH2 blocca il sito attivo del dominio PTP inserendo un?ansa (DE o "ansa di blocco") nella tasca catalitica. In linea con questa evidenza strutturale, l'attivit? basale di SHP2 ? estremamente bassa. L'associazione della SHP2 con i suoi partner di legame attraverso i domini SH2 favorisce il rilascio di questa interazione autoinibitoria, rendendo il sito catalitico accessibile ai substrati, causando quindi l'attivazione della proteina (Figura 1). In particolare, le strutture del dominio N-SH2 in associazione con sequenze fosfopeptidiche mostrano che il legame di SHP2 con i suoi interattori cellulari induce un cambiamento conformazionale nell?ansa DE, che perde complementariet? con il sito attivo [Lee 1994]. Allo stesso tempo, l'interazione fra il dominio N-SH2 e il dominio PTP controlla in modo allosterico la conformazione del sito di associazione dello stesso dominio N-SH2. I cristalli della proteina nel suo stato autoinibito mostrano che il sito di legame del dominio N-SH2 ? chiuso da due anse (EF e BG). Al contrario, nelle strutture del dominio N-SH2 isolato [Lee 1994], o nella struttura recentemente riportata dello stato attivo di SHP2 [LaRochelle 2018], il sito di legame ? aperto (Figura 1). Di conseguenza, ? stato ipotizzato che la transizione tra lo stato chiuso, autoinibito, e quello aperto, attivo, dell?enzima sia accoppiata ad un aumento di affinit? per i partner di legame [Keilhack 2005; Bocchinfuso 2007, Martinelli 2008, LaRochelle 2018].

Lo spettro delle mutazioni patogenetiche di PTPN11 ? in larga misura coerente con il suddetto modello di regolazione di SHP2. La maggior parte delle mutazioni interessa l'interfaccia N-SH2/PTP , destabilizzando l'interazione fra i due domini e causando l'attivazione costitutiva della fosfatasi [Tartaglia 2006; Bocchinfuso 2007]. Nel contempo, esse promuovono una risposta pi? efficace all?attivazione dovuta al legame dei domini SH2 con sequenze bifosforilate [Keilhack 2005; Bocchinfuso 2007, Martinelli 2008, LaRochelle 2018]. Un?altra classe di mutazioni interessa aminoacidi che mappano nella tasca di legame dei domini SH2; queste varianti aumentano l?affinit? di legame per i partner di legame fosforilati [Tartaglia 2006L?effetto finale ? un aumento del flusso del segnale lungo la via RAS/MAPK.

SHP2 come target farmacologico

Complessivamente, le evidenze riportate nei paragrafi precedenti identificano SHP2 come un importante bersaglio molecolare sia nel cancro che nelle RASopatie [Butterworth 2014; Ran 2016; Frankson 2017].

L?attivit? di ricerca volta all?individuazione di farmaci in grado di inibire SHP2 si ? concentrata principalmente sull?identificazione di inibitori del sito attivo. Numerosi composti con attivit? inibitoria dell?attivit? catalitica di SHP2 sono stati scoperti [Butterworth 2014], tuttavia, molti di essi sono soggetti alle stesse limitazioni che hanno portato le PTP ad essere considerate non idonee come bersagli molecolari [Blaskovich 2009; Ran 2016], ovvero la mancanza di specificit? e la scarsa biodisponibilit?. Alcuni composti con buona affinit? ed apparente selettivit? sono stati descritti, e i dati sperimentali sull?efficacia antitumorale di alcuni inibitori di SHP2 PTP sono stati riportati [Bunda 2015; Grosskopf 2015]. Tuttaviastudi pi? recenti hanno dimostrato che queste molecole hanno diversi effetti collaterali [Tsutsumi 2018].

Una strategia farmacologica alternativa ? stata proposta recentemente dai ricercatori del gruppo Novartis [Chen 2016], seguiti da altri [Xie 2017; Nichols 2018; Wu 2019], i quali hanno identificato inibitori allosterici in grado di stabilizzare la struttura autoinibita di SHP2, legandosi a una tasca situata all'interfaccia fra domini nella conformazione chiusa della fosfatasi.

SHP099, l'inibitore sviluppato da Novartis, sta trovando applicazioni promettenti nel trattamento dei tumori associati ad iperattivazione dei RTK [Chen 2016], delle neoplasie dipendenti da KRAS o da BCR-ABL1 [Gu 2018; Mainardi 2018; Ruess 2018; Wong 2018], cos? come nella terapia combinata contro le cellule resistenti ai farmaci [Dardarei 2018; Fedele 2018; Ahmed 2019; Lu 2019]. Tuttavia, questo composto ? risultato inefficace nel caso in cui siano presenti mutazioni attivanti di PTPN11, poich? il sito di legame allosterico viene perso quando l?enzima si trova nella sua conformazione aperta [Sun 2018; LaRochelle 2018].

Inibizione delle interazioni proteina-proteina come strategia farmacologica alternativa

A causa del meccanismo di regolazione allosterica sopra descritto, l'attivazione di SHP2 e la sua associazione con i partner di legame sono eventi strettamente associati. Pertanto, l'effetto delle mutazioni sottostanti la SN e le leucemie che destabilizzano la conformazione autoinibita ? duplice: esse causano un aumento dell'attivit? catalitica della fosfatasi, ma allo stesso tempo favoriscono la conformazione del dominio N-SH2 che lo rende pi? efficace nel legare proteine fosforilate, aumentando cos? la risposta complessiva di SHP2 ai suoi interattori. Molte sono le evidenze che suggeriscono come il secondo evento, piuttosto che l?accresciuta attivit? basale, sia cruciale ai fini dell?iperattivazione della via di trasduzione del segnale RAS-MAPK.

Alcune mutazioni patogenetiche, come la sostituzione p.T42A causativa di SN, aumentano semplicemente l'affinit? di legame del dominio N-SH2, senza alcun effetto sull?attivit? catalitica basale della proteina [Martinelli 2008, Keilhack 2005]; d'altra parte, la capacit? di SHP2 di legare i suoi interattori ? sempre conservata in tutte le mutazioni patogenetiche di PTPN11 [Tartaglia 2006, Martinelli 2012, 2020].

Costrutti troncati che presentano una delezione completa o parziale del dominio N-SH2 causano un aumento drammatico dell'attivit? enzimatica di SHP2 e, allo stesso tempo, dalla totale incapacit? di legare i propri interattori. Questi costrutti non erano patogenici in topi eterozigoti [Saxton 1997], n? hanno causato alcun fenotipo aberrante in modelli cellulari [Saxton 1997, Higashi 2002]. In cellule omozigoti per il costrutto deleto, l?attivazione della via RAS-MAPK ? perfino inferiore rispetto a quanto osservato nelle cellule WT [Shi 1998]. Tuttavia, una volta traslocata in membrana plasmatica grazie all?aggiunta di una sequenza di localizzazione specifica, la proteina tronca causa l?insorgenza di cambiamenti morfologici cellulari noti come ?fenotipo a colibr?? [Higashi 2002], dimostrando l'importanza di una corretta localizzazione subcellulare, normalmente mediata dai domini di legame SH2.

La rilevanza delle interazioni proteina-proteina via domini SH2 nel modificare in modo aberrante la trasmissione del segnale intracellulare ? stata ulteriormente dimostrata da uno studio condotto con proteine artificiali che mimano gli anticorpi (?monobodies?), capaci di legare in modo specifico il dominio N-SH2, inibendone l'associazione con le proteine partner.

L'espressione di queste proteine in cellule tumorali che presentano la mutazione attivante p.V45L abolisce quasi completamente la fosforilazione di ERK1/2 [Sha 2013].

Un esempio della situazione opposta in cui il legame non viene alterato mentre l'attivit? catalitica ? compromessa, ? rappresentato dalle mutazioni di PTPN11 associate a NSML, ad esempio la sostituzione p.T468M. Queste mutazioni interessano residui localizzati in prossimit? del sito attivo di PTP, all'interfaccia PTP/N-SH2, e hanno un duplice effetto: da un lato destabilizzano la conformazione chiusa della proteina promuovendo l?associazione con i suoi interattori; dall?altro perturbano il sito attivo e quindi compromettono fortemente l'attivit? catalitica della fosfatasi. ? interessante notare che il quadro clinico che caratterizza la NSML ? molto simile a quello osservato nella SN e queste mutazioni non inibiscono l?attivazione delle cascate di trasduzione del segnale, inclusa la cascata delle RAS/MAPK [Martinelli 2008].

Complessivamente, i dati raccolti fino ad oggi suggeriscono fortemente che un mero aumento dell'attivit? catalitica di SHP2 non sia sufficiente a causare alcuna malattia; essi indicano che l?aumentata associazione con i partner di legame gioca un ruolo determinante nel meccanismo alla base della patogenicit? delle lesioni di SHP2. Pertanto, l'inibizione delle interazioni proteina-proteina di SHP2 attraverso i suoi domini SH2 rappresenta una strategia farmacologica alternativa estremamente promettente. Sebbene i domini SH2, in generale, abbiano ricevuto molta attenzione come potenziali bersagli molecolari [Machida 2005], non sono mai state sviluppate a scopi terapeutici molecole destinate a legare i domini SH2 di SHP2.

Kert?sz e collaboratori [Kert?sz 2006a,b] hanno riportato come la sequenza naturale di Gab1 che lega SHP2 [GDKQVEpYLDLDLD (SEQ ID N. 3), quando introdotta in cellule immunitarie, fosse in grado di modulare la fosforilazione di proteine target. Tuttavia, questo peptide contiene una normale pY e una sequenza di aminoacidi standard, e gli autori hanno dimostrato che nelle cellule viene rapidamente degradato. Pertanto, il suddetto peptide non pu? essere utilizzato tal quale per scopi terapeutici.

Pertanto, c?? una evidente necessit? di sviluppare molecole che inibiscano le interazioni proteina-proteina di SHP2 per la realizzazione di nuove terapie mirate.

RIASSUNTO DELL?INVENZIONE

Gli autori hanno sviluppato molecole a base peptidica con affinit? nella regione del basso nM per il dominio N-SH2 di SHP2, buona internalizzazione cellulare e resistenza alla degradazione, per inibire le interazioni proteina-proteina di SHP2. La presente invenzione rappresenta un approccio innovativo per terapie mirate contro SHP2 e offre un nuovo strumento per studiare il ruolo delle interazioni proteina-proteina nella funzione di SHP2.

DESCRIZIONE DELL?INVENZIONE

Pertanto, uno degli oggetti dell?invenzione ? un peptide che comprende la, o consiste della sequenza, dall?N- al C- terminale:

X-2X-1ZX1X2X3X4X5,

dove

? Z ? la tirosina, fosfotirosina (pY) o un analogo non naturale della fosfotirosina, come ad esempio la fosfonodifluorometil fenilalanina (F2Pmp).

? X-2 ? un amminoacido idrofobo, preferibilmente selezionato dal gruppo che consiste di:

Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp e Met

? X-1 ? un qualunque amminoacido

? X1 ? un amminoacido idrofobo, preferibilmente selezionato dal gruppo che consiste di:

Ile, Leu, Val, Phe, Tyr, Trp e Met

? X3 ? un amminoacido idrofobo, preferibilmente selezionato dal gruppo che consiste di:

Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp e Met

? X5 ? un amminoacido idrofobo, preferibilmente selezionato dal gruppo che consiste di:

Trp, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, and Met

? X2 e X4 sono amminoacidi anionici, preferibilmente, ciascuno e in modo indipendente, ? Asp o Glu.

dove gli amminoacidi possono essere, ciascuno indipendentemente, un amminoacido naturale o non naturale, come ad esempio C? o N metilati, peptoidi, beta amminoacidi, o D amminoacidi,

a condizione che il peptide non sia GLNpYIDLDL e GDKQVEpYLDLDLD.

La presente invenzione fornisce anche un peptide che comprende la, o consiste della sequenza, dall?N- al C- terminale:

X-2X-1ZX1X2X3X4X5,

dove

Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp e Met

? X-1 ? un qualunque amminoacido

? X1 ? un amminoacido idrofobo, preferibilmente selezionato dal gruppo che consiste di: Ile, Val, Phe, Tyr, Trp e Met

Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp e Met

Trp, Ile, Val, Phe, Tyr, and Met

dove gli amminoacidi possono essere, ciascuno indipendentemente, un amminoacido naturale o non naturale, come ad esempio C? o N metilati, peptoidi, beta amminoacidi, o D amminoacidi

X-2X-1ZX1X2X3X4X5,

dove

? Z ? la tirosina o un analogo non naturale della fosfotirosina, come ad esempio la fosfonodifluorometil fenilalanina (F2Pmp).

Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp e Met

? X-1 ? un qualunque amminoacido

Ile, Leu, Val, Phe, Tyr, Trp e Met

Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp e Met

Trp, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, and Met

dove gli amminoacidi possono essere, ciascuno indipendentemente, un amminoacido naturale o non naturale, come ad esempio C? o N metilati, peptoidi, beta amminoacidi, o D amminoacidi.

In una realizzazione preferita dei peptidi secondo l?invenzione:

- X-2 ? Leu e/o

- X-1 ? Asn e/o

- X1 ? Ile e/o

- X2 ? Asp e/o

- X3 ? Leu e/o

- X4 ? Asp e/o

- X5 ? Trp, Leu o Phe, preferibilmente Trp.

Preferibilmente, Z ? un analogo non naturale della fosfotirosina, preferibimente Z ? F2Pmp. Preferibilmente, detto analogo ? un derivato non defosforilabile.

Preferibilmente, il peptide dell?invenzione comprende la, o consiste della sequenza, dall?N- al C-terminale:

LN-(F2Pmp)-IDLDW (SEQ ID N. 4) o GLN-(F2Pmp)-IDLDW (SEQ ID N. 5).

Preferibilmente, il peptide dell?invenzione comprende, o consiste dei peptidi di Tabella 1, con l?esclusione di P9.

In una realizzazione preferita, l?N-terminale e/o il C-terminale della sequenza o del peptide, come sopra definiti, sono modificati, preferibimente mediante acetilazione o ammidazione, o mediate marcatura con sonde fluorescenti, preferibilmente la 5,6 carbossifluoresceina (CF) o la carbossi cianina 3-acido carbossilico (Cy3), con maggiore preferenza l?N-terminale ? acetilato o marcato con CF e/o il C-terminale ? ammidato.

Preferibilmente, il peptide ? il peptide comprendente e costituito dalla sequenza dall?N-terminale al C-terminale:

LN-(F2Pmp)-IDLDW o GLN-(F2Pmp)-IDLDW

dove l?N-terminale del peptide ? acetilato e il C-terminale del peptide ? ammidato.

Preferibilmente, il peptide, in base all?invenzione, comprende una sequenza amminoacidica che favorisce la penetrazione nelle cellule (peptide internalizzante, o cell penetrating peptide, CPP), preferibilmente, detta sequenza ? TAT (GRKKRRQRRR (SEQ ID N. 25)), penetratina (RQIKIWFQNRRMKWKKGG (SEQ ID N. 26)), transportan 10 (AGYLLGKINLKALAALAKKIL(SEQ ID N. 11)) oligo-Arg (ad esempio Arg5 fino a Arg12), con detta sequenza amminoacidica legata all?N-terminale e/o al C-terminale del peptide.

Un ulteriore oggetto dell?invenzione ? un complesso non covalente che comprende il peptide come sopra definito o il peptide GLNpYIDLDL ed una sequenza amminoacidica che favorisce la penetrazione nelle cellule, preferibilmente detta sequenza ? Pep1 (Acetil-KETWWETWWTEWSQPKKKRKV-Cisteammide (SEQ ID N. 27)).

Un ulteriore oggetto dell?invenzione ? una composizione farmaceutica che comprende un peptide come sopra definito, il peptide GLNpYIDLDL o il complesso come sopra definito e almeno un vettore, eccipiente e/o diluente farmaceuticamente accettabile, preferibilmente che comprenda anche almeno un agente terapeutico, preferibilmente detto agente terapeutico aggiuntivo ? selezionato dal gruppo che consiste di: agenti chemoterapici, agenti antitumorali mirati, inibitori della risposta al danno al DNA.

Preferibilmente, il peptide come sopra definito, il peptide GLNpYIDLDL, o il complesso o la composizione farmaceutica come sopra definita, per l?utilizzo come medicamento, preferibilmente per l?uso:

- nel trattamento dei disordini mieloproliferativi dell?infanzia, preferibilmente leucemia mielomonocitica giovanile (JMML), sindromi mielodisplastiche pediatriche (ad esempio RAEB), leucemia infantile [ad esempio leucemia monocitica acuta (AMoL, FAB M5) e leucemia linfoblastica acuta (ALL), sottotipo ?common?], sindromi mielodisplastiche, leucemia mieloide e linfoblastica dell?adulto, tumori solidi pediatrici o dell?adulto, associati con un?attivit? aberrante di SHP2, dovuta alla presenza di mutazioni somatiche attivanti di PTPN11, ad esempio neuroblastoma, glioma, rabdomiosarcoma embrionale, cancro ai polmoni, cancro al colon e melanoma,

- nel trattamento di tumori associati all?iperattivazione delle cascate di trasduzione del segnale regolate da SHP2 (RAS-MAPK e PI3K-AKT-mTOR), ad esempio tumori di colon, collo uterino, endometrio, pancreas, intestino crasso e tenue, pelle, prostata, testa e collo e polmoni, - nel trattamento delle manifestazioni cliniche post natali delle RASopatie, causate da mutazioni germinali di PTPN11 (sindrome di Noonan e sindrome di Noonan con lentiggini multiple, anche detta sindrome LEOPARD), come ad esempio la cardiomiopatia ipertrofica, la bassa statura e la predisposizione a certe neoplasie maligne, in particolare la JMML, - nell?immunoterapia del cancro, per evitare l?evasione immunitaria del tumore mediata dall?attivazione da parte di SHP2 delle cascate di trasduzione del segnale dei checkpoint immunitari, come ad esempio Programmed Cell Death 1 (PD-1) o signal-regulatory protein alpha (SIRP?)/CD47, modulando in questo modo la risposta immunitaria nel cancro, - come un inibitore competitivo del cytotoxin-associated gene A (CagA) nel carcinoma gastrico mediato dall?H. pylori.

Un altro oggetto dell?invenzione ? l?uso del peptide come sopra definito, del peptide GLNpYIDLDL, del complesso o della composizione farmaceutica come sopra definiti, per investigare in vitro o ex vivo il ruolo delle interazioni di SHP2 con i suoi partner proteici, nel controllo della funzione di SHP2 e le conseguenze della sua disregolazione nelle cascate di trasduzione del segnale dipendenti da SHP2.

Il peptide, secondo l?invenzione, pu? ad esempio comprendere o avere la sequenza, dall?N-terminale al C-terminale:

X-3X-2X-1pYX1X2X3X4X5

dove X-3 pu? essere ogni amminoacido, ad esempio Gly, in grado di funzionare come spaziatore per legare altri gruppi, come fluorofori o sequenze internalizzanti, dove X-3 fino a X5 hanno lo stesso significato sopra descritto.

Nei peptidi secondo l?invenzione possono essere coniugati gruppi chimici in grado di formare legami ammidici con il gruppo amminico N-terminale o con il gruppo carbossilico C-terminale.

Ad esempio, una ammina libera pu? essere presente all?estremit? N-terminale o C-terminale, analogamente un gruppo acetile pu? essere aggiunto all?estremit? N- o C-terminale generando cos? peptidi acetilati all?N- o C-terminale, rispettivamente. Ulteriori peptidi possono essere coniugati alle estremit? N- o C-terminale dei peptidi oggetto dell?invenzione, ad esempio peptidi internalizzanti (CCP), come Pep1, sequenze TAT, penetratina, oligo-arginine ecc. In alternativa, tali peptidi posso essere combinati in modi differenti con i peptidi dell?invenzione, generando cos? complessi non covalenti. Ai peptidi dell?invenzione possono essere coniugate sonde fluorescenti, ad es. carbossifluoresceina o cianine.

L?invenzione riguarda anche un polinucleotide che codifica per i peptidi cos? come precedentemente definiti, un vettore che comprende il suddetto polinucleotide e una cellula ospite geneticamente modificata che esprime il peptide come sopra definito. Preferibilmente il polinucleotide ? selezionato dal gruppo costituito da: RNA o DNA, preferibilmente detto polinucleotide ? DNA.

Preferibilmente il vettore ? un vettore di espressione selezionato dal gruppo costituito da: plasmidi, particelle virali e fagi.

Preferibilmente detta cellula ospite ? selezionata dal gruppo costituito da: cellula batterica, cellula fungina, cellula da insetto, cellula animale e cellula vegetale, preferibilmente detta cellula ospite ? una cellula animale.

I peptidi oggetto dell?invenzione possono essere di origine sintetica o ricombinante, lineari o multimerici in qualsiasi forma chimica, fisica e/o biologica tale da preservare la loro funzione.

I peptidi dell?invenzione possono essere sintetizzati e usati in forma ramificata, come divulgato ad esempio nel brevetto US 5,229,490.

I peptidi dell?invenzione possono contenere due sequenze fosforilate per il legame ai due domini SH2 e SHP2, invece che a uno solo di essi.

Tutti gli amminoacidi nel peptide possono avere la stessa stereochimica, per esempio, il peptide pu? essere costituito di soli amminoacidi L- o solo D- amminoacidi. In alternativa, il peptide pu? comprendere una combinazione di amminoacidi sia L- che D-. Il peptide della presente invenzione pu? essere in forma di dimero o multimero. Nella presente descrizione, esempi di spaziatori contenuti nel dimero o nel multimero includono legami esterei (-CO-O-, -O-CO-), legami eterei (-O-), legami ammidici (NHCO, CONH), spaziatori formati da catene di zuccheri, polietilen glicoli, peptidi e simili. Esempi di spaziatori peptidici comprendono spaziatori che contengano almeno uno dei 20 amminoacidi naturali che costituiscono le proteine. Il numero di amminoacidi dello spaziatore peptidico ?, per esempio, ma non limitato a, da 1 a 20, da 1 a 15, da 1 a 12, da 1 a 8, da 1 a 6 o da 1 a 4. Esempi di spaziatori peptidici includono peptidi dimeri, trimeri, tetrameri di arginina; dimeri, trimeri, tetrameri di lisina; dimeri, trimeri, tetrameri, pentameri e esameri della glicina; alanina-alanina-tirosina (AAY), isoleucina-leucina-alanina (ILA), arginina-valina-lisina-arginina (RVKR), e simili, prolina-alanina-serina (PAS). Lo spaziatore pu? essere bivalente o multivalente.

Quando il peptide della presente invenzione ? un multimero, si pu? utilizzare per il legame uno spaziatore multivalente ramificato (ad es., un dendrimero), un complesso metallico, o simili.

Esempi di spaziatori multivalenti ramificati comprendono dietilentriammina, spermina, spermidina, trietanolammina, etilendiammina tetracetato (EDTA), pentaeritritolo, azidopropil(alchil) ammina, lisina, ornitina, acido aspartico, acido glutammico, peptidi polifunzionali (dipetidi, tripeptidi o tetrapeptidi contenenti lisina, ornitina, o acido aspartico o glutammico), e composti organici amminici multivalenti (ad es., poli(ammidoammina) (PAMAM), Tris(2-aminoetil)ammina, poli(propilen immina) (Astramol (trademark)). Il dendrimero della presente invenzione include, ad esempio, un dimero ottenuto legando le estremit? N-terminali (o C-terminali) dei peptidi qui divulgati. Inoltre, il dendrimero della presente invenzione comprende anche un tetramero ottenuto per ulteriore legame di ?un dimero ottenuto dalla connessione delle estremit? N-terminali dei peptidi soprariportati? e ?un dimero ottenuto dalla connessione delle estremit? C-terminali dei peptidi soprariportati?.

Compresi nella presente invenzione sono anche frammenti funzionali, derivati o varianti dei peptidi definiti precedentemente. Opportunamente, ?derivati? e ?varianti? includono quei peptidi in cui al posto degli amminoacidi naturali, gli amminoacidi che compaiono nella sequenza sono loro analoghi strutturali. Gli amminoacidi usati nelle sequenze possono anche essere derivatizzati o modificati, ad es., marcati, garantendo che la funzione del peptide non venga negativamente influenzata in modo significativo. I derivati o le varianti sopra descritte possono essere ottenute durante la sintesi del peptide o attraverso modifiche successive, oppure quando il peptide ? ottenuto per via ricombinante utilizzando le note tecniche di mutagenesi sito specifica, mutagenesi casuale, o scissione enzimatica e/o legame di acidi nucleici.

I frammenti ?funzionali? secondo l?invenzione possono essere ottenuti per troncamento, ad es. per rimozione di uno o pi? amminoacidi a partire dall?estremit? N- e/o C-terminale. Tali frammenti possono essere ottenuti dalle sequenze qui divulgate o possono essere ottenuti da un peptide funzionalmente equivalente come precedentemente descritto.

Opportunamente, le variazioni funzionali secondo l?invenzione hanno una sequenza amminoacidica che presenta pi? del 70%, ad esempio 75 o 80%, preferibilmente pi? del 85%, ad esempio pi? del 90 o 95% di omologia con le sequenze qui divulgate.

I peptidi dell?invenzione, come qui definiti, possono essere chimicamente modificati, per esempio con modifiche post-traduzionali. Per esempio, possono essere glicosilati o comprendere residui amminoacidici modificati.

I peptidi chimicamente modificati comprendono anche quelli che hanno uno o pi? residui chimicamente derivatizzati per reazione di un gruppo funzionale in catena laterale. Tali catene laterali derivatizzate comprendono quelle che sono state derivatizzate per ottenere il cloroidrato di un?ammina, gruppi p-toluensolfonici, gruppi carbobenzossi, gruppi t-butilossicarnolici, gruppi cloroacetili e gruppi formilici. I gruppi carbossilici liberi possono essere derivatizzati per formare sali, esteri metilici o etilici o altri tipi di esteri o idrazidi. I gruppi ossidrilici liberi possono essere derivatizzati per formare derivati O-acetilici o O-alchilici. L?azoto imidazolico dell?istidina pu? essere derivatizzato per formare N-im-benzil istidina.

Compresi tra i peptidi chimicamente modificati sono anche i peptidi ciclici, cio? i peptidi dell?invenzione che sono legati con un legame covalente per formare un anello. Tipicamente un gruppo amminico terminale e un carbossile terminale (chiamata ciclizzazione testa-coda), un?ammina terminale e una catena laterale (chiamata ciclizzazione testa-catena laterale), un gruppo carbossilico terminale e una catena laterale (chiamata ciclizzazione catena laterale-coda), o le catene laterali (chiamata ciclizzazione catena laterale-catena laterale) possono essere legati per formare un peptide ciclico. Peptidi ciclici testa-coda possono essere tipicamente ottenuti per formazione di un legame ammidico. Cicli tra catene laterali possono essere ottenuti per formazione di un ponte disolfuro Cys-Cys o per formazione di un legame ammidico interno al peptide ciclico. In alternativa, un?ammina terminale, un carbossile terminale o una catena laterale possono essere legati con un legame covalente alla catena principale peptidica per formare un peptide ciclico.

Compresi tra i peptidi chimicamente modificati ci sono anche quelli che contengono uno o pi? derivati dei venti amminoacidi standard. Ad esempio, 4-idrossiprolina pu? sostituire una prolina oppure omoserina pu? sostituire una serina.

Un peptide dell?invenzione pu? portare una sonda per la rivelazione. Sonde opportune includono radioisotopi, sonde fluorescenti, sonde enzimatiche o altre sonde per proteine come la biotina.

Qualsiasi formula qui fornita ha anche lo scopo di rappresentare forme non marcate e forme isotopiche dei peptidi. I peptidi marcati isotopicamente hanno strutture rappresentate dalle formule fornite nel presente documento, tranne per il fatto che uno o pi? atomi sono sostituiti da un atomo con una massa atomica o numero di massa definiti. Esempi di isotopi che possono essere incorporati nei peptidi dell'invenzione includono isotopi di idrogeno, carbonio, azoto, ossigeno, fosforo, fluoro e cloro. Solvati farmaceuticamente accettabili secondo l'invenzione includono quelli in cui il solvente di cristallizzazione pu? essere sostituito isotopicamente, ad es. D2O, d6-acetone, d6-DMSO.

I peptidi come sopra descritti per l'uso in conformit? con l'invenzione possono essere preparati mediante modalit? di sintesi convenzionali comprendenti mezzi genetici o chimici.

Tecniche sintetiche, come la sintesi in fase solida di tipo Merrifield, possono essere preferite per ragioni di purezza, specificit? antigenica, libert? da prodotti collaterali indesiderati e facilit? di produzione. Tecniche adatte per la sintesi di peptidi in fase solida sono ben note agli esperti del settore (vedi ad esempio Merrifield et al., 1969, Adv. Enzymol 32, 221-96 e Fields et a /., 1990, Int. J. Peptide Protein Res, 35, 161-214). La sintesi chimica pu? essere eseguita con metodi ben noti nella tecnica e coinvolgono reazioni di deprotezione selettiva dei gruppi funzionali di un amminoacido terminale e accoppiamento di residui di amminoacidi selettivamente protetti che vengono ripetute ciclicamente, seguite dalla deprotezione completa di tutti i gruppi funzionali. La sintesi pu? essere eseguita in soluzione o su un supporto solido usando opportune supporti solidi noti nella tecnica.

In una forma di realizzazione alternativa, un peptide oggetto dell'invenzione pu? essere generato o somministrato nella forma di una sequenza polinucleotidica che lo codifica e lo esprime. Tali polinucleotidi possono essere sintetizzati utilizzando tecniche ben note nel campo, come descritto a titolo esemplificativo in Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning - un manuale di laboratorio; Cold Spring Harbor Press). I polinucleotidi possono essere utilizzati sia in vitro che in vivo nella produzione di un peptide oggetto dell'invenzione. Le suddette sequenze polinucleotidiche possono quindi essere somministrate o usate nel trattamento del cancro o di un'altra malattia o condizione come qui descritto.

La presente invenzione include anche i vettori di espressione che comprendono le sequenze polinucleotidiche sopramenzionate. Questi vettori vengono generati in modo routinario utilizzando tecniche di biologia molecolare di base e possono per esempio, al fine di consentire l'espressione di un peptide oggetto dell'invenzione, coinvolgere l?uso di DNA plasmidico, appropriati iniziatori della trascrizione, promotori, enhancer ed altri elementi regolatori come ad esempio, quando necessari, segnali di poliadenilazione disposti nel corretto orientamento. Ulteriori vettori idonei sarebbero evidenti per gli esperti nel campo . A titolo di ulteriore esempio, ci riferiamo a Sambrook et al. (ibid).

Pertanto, il peptide pu? essere generato in seguito a trasferimento del vettore in un sistema cellulare appropriato, tale da permettere la trascrizione della sequenza desiderata. Un polinucleotide oggetto dell'invenzione o da usare nell?ambito dell?invenzione in un vettore, ? opportunamente ?operativamente collegato? ad una sequenza in grado di fornire l?espressione della sequenza codificante da parte della cellula ospite, vale a dire che il vettore ? un vettore di espressione. Il termine "operativamente collegato" si riferisce al corretto posizionamento degli elementi descritti, tale da permettere loro di funzionare in modo appropriato. Una sequenza regolativa, come un promotore, "operativamente collegata" a una sequenza codificante, ? posizionata in modo tale che l'espressione della sequenza codificante avvenga compatibilmente con la sequenza regolativa.

I vettori possono essere ad esempio plasmidi, virus o fagi provvisti di un'origine di replicazione, facoltativamente un promotore per l'espressione di detto polinucleotide e, facoltativamente, un regolatore del promotore. I vettori possono contenere uno o pi? marcatori genetici selezionabili, ad esempio un gene di resistenza all'ampicillina nel caso di un plasmide batterico o un gene di resistenza per un vettore fungino. I vettori possono essere utilizzati in vitro, ad esempio per la produzione di DNA o RNA, o utilizzati per trasfettare o trasformare una cellula ospite, ad esempio una cellula ospite di mammifero. I vettori possono anche essere adattati per un loro utilizzo in vivo, ad esempio per consentire l'espressione in vivo del polipeptide.

L'invenzione include anche le cellule che sono state modificate per esprimere un peptide oggetto dell'invenzione. Tali cellule includono linee di cellule transienti o preferibilmente stabili eucariotiche superiori , come cellule di mammifero o cellule di insetto, cellule eucariotiche inferiori, come i lieviti, o cellule procariotiche come i batteri. Esempi particolari di cellule che possono essere modificate inserendo vettori che codificano per un peptide oggetto dell'invenzione includono cellule di mammifero HEK293T, CHO, HeLa e COS. La linea cellulare selezionata sar? non solo stabile, ma consentir? anche la glicosilazione matura e l'espressione in membrana di un polipeptide. L'espressione pu? essere ottenuta anche in ovociti trasformati. Un peptide idoneo pu? essere espresso in cellule di un animale transgenico non umano, in particolare un topo. Un animale transgenico non umano che esprime un peptide oggetto dell'invenzione ? incluso nell'ambito dell?invenzione. Un peptide oggetto dell'invenzione pu? anche essere espresso in ovociti o melanofori di Xenopus laevis.

I peptidi della presente invenzione possono essere impiegati da soli come unica terapia o in combinazione con altri agenti terapeutici per la prevenzione e/o il trattamento delle condizioni sopra menzionate

Il peptide pu? essere somministrato come parte distinta (simultanea, sequenziale) di un trattamento di singoli componenti o in forma di singolo dosaggio contenente tutti i componenti. Quando i peptidi di questa invenzione sono in combinazione con altri principi attivi, i principi attivi possono essere formulati separatamente in preparazione a singolo ingrediente in una delle modalit? sopra descritte e successivamente somministrati come preparazioni combinate, somministrate nello stesso istante o in tempi differenti, oppure possono essere preparati insieme in preparazioni con due o pi? ingredienti.

Come di consueto, le composizioni sono normalmente accompagnate da istruzioni scritte o stampate per l?uso nel trattamento in questione.

Esperti del settore selezioneranno la forma di somministrazione e il dosaggio efficace, individuando opportuni diluenti, adiuvanti e/o eccipienti.

La presente invenzione ? quindi illustrata tramite esempi, non limitanti, riferiti alle seguenti figure.

Figura 1: Struttura di SHP2 e schema del processo di attivazione.

In alto: strutture cristallografiche dello stato chiuso, auto-inibito, e dello stato aperto, attivo, di SHP2 (rispettivamente a sinistra e a destra). I domini N-SH2, C-SH2 e PTP sono colorati rispettivamente in azzurro, arancione e rosa. L?ansa bloccante [DE] ? colorata in blu, mentre il sito attivo di PTP ? evidenziato in rosso scuro. Le anse EF e BG di N-SH2, che controllano l?accesso al sito di legame delle sequenze fosforilate dei partner di legame, sono rappresentate in bianco. I codici PDB delle due strutture sono 2SHP e 6CRF. I tratti mancanti nelle strutture sperimentali sono stati modellati come descritto in precedenza [Bocchinfuso 2007]

In basso: modello schematico del meccanismo di regolazione allosterica.

Figura 2: curve di legame del peptide IRS-1 pY1172 fosforilato e non fosforilato.

[CF-P9]=1 nM (simboli pieni e linea continua) [CF-P9Y0]=10 nM (simboli vuoti e curva tratteggiata); gli esperimenti replicati sono riportati con simboli diversi e sono stati interpolati cumulativamente.

Figura 3: effetto della lunghezza della sequenza sulla affinit? di legame.

Esperimenti di spiazzamento per analoghi di differente lunghezza. [CF-P9]=1 nM; [N-SH2]= 40 nM.

Figura 4: Calcolo in silico della energia libera per diverse sequenze modificate.

Il profilo di energia libera ? riportato in funzione della distanza tra i centri di massa del dominio N-SH2 e del fosfopeptide. Le simulazioni predicono una perdita di affinit? di P8 (linea blu) con defosforilazione della pY (linea blu tratteggiata), ed un aumento per effetto della sostituzione della Leu in posizione 5 con Trp (linea rossa), ma non con Phe (linea viola). La successiva sostituzione di Asp in 4 con Glu (arancione) non fornisce nessun ulteriore aumento della affinit?. Le aree ombreggiate corrispondono alle deviazioni standard nei profili di potenziale di forza media.

Figura 5: effetto di sostituzioni alla posizione 5 sulla affinit? di legame

Pannello di sinistra: esperimenti di legame diretto; [CF-P9W5]=0,10 nM, [CF-P9E4W5]=0,10 nM, [CF-P9]=1 nM. Per confronto, sono riportati anche qui i dati di CF-P9.

Pannello di destra: saggi di spiazzamento, [CF-P9W5]=0,10 nM, [N-SH2]=3,35 nM.

Figura 6: selettivit? di legame di CF-P9W5 per i due domini SH2 di SHP2

Confronto delle curve di associazione di CF-P9W5 ai domini N-SH2 e C-SH2 di SHP2.

Condizioni sperimentali per gli esperimenti di legame ad N-SH2: si veda Fig.5; per gli esperimenti di legame a C-SH2: [CF-P9W5]=1 nM

Figura 7: selettivit? di legame di Cy3-P9W5 per una griglia (?array?) di domini SH2. I pannelli di sinistra riportano la fluorescenza del peptide legato, ad una concentrazione di 0,5 nM (in alto), 5 nM (al centro) e 50 nM (in basso). Ogni dominio SH2 ? presente in duplicato, e sono presenti anche punti di controllo negativo (con solo GST). I punti pi? luminosi corrispondono al dominio N-SH2 di SHP2 ed al dominio SH2 della ?proteina adattatrice contenente i domini SH2 e PH? APS (anche chiamata SHP2B2). L?intensit? di tutti gli altri punti ? comparabile a quella dei controlli negativi.

Il pannello in alto a destra mostra la posizione di ciascun dominio SH2 nella griglia, mentre in basso a destra ? riportato un controllo del carico della proteina in ciascun punto, condotto con un anticorpo anti-GST

Figura 8: legame del peptide non defosforilabile CF- P9ND0W5 (o OP) al dominio N-SH2 Per confronto, ? riportata anche la curva per CF-P9W5. [CF-P9ND0W5]=1 nM, [CF-P9W5]=0,10 nM

Figura 9. Resistenza di OP alla degradazione proteolitica in siero umano e in DMEM Profili HPLC di OP dopo incubazione a diversi tempi con siero umano (a sinistra) o DMEM (a destra).

Figura 10: legame del peptide CF-OP alla proteina SHP2 intera (nativa e mutanti patogenetici)

A sinistra: frazione del peptide CF-OP legata alla proteina nativa ed a mutanti selezionati, ottenuta da esperimenti di anisotropia di fluorescenza. La frazione di peptide legato ? stata ottenuta seguendo la variazione della anisotropia di fluorescenza del peptide durante la titolazione con frazioni crescenti di proteina. [CF-OP] = 1 nM.

Al centro: attivit? catalitica della proteina nativa e di mutanti selezionati, sotto condizioni basali (barre piene) e dopo stimolo con 10 ?M di peptide BTAM (barre tratteggiate).

A destra: correlazione tra attivit? basale e affinit? (costante di associazione).

Figura 11: defosforilazione di P8W5 ed altri fosfopeptidi dal dominio PTP di SHP2

I seguenti fosfopeptidi sono stati usati per confronto, in aggiunta a P8 e P8W5, in un saggio del verde malachite.

GAB1 Y657 [DKQVEpYLDLDL (SEQ ID N. 6)]

p190A/RhoGAP Y1105 [EEENIpYSVPHD (SEQ ID N. 7)]

EGFR Y1016 [VDADEpYLIPQQ (SEQ ID N. 8)]

BTAM, o bifosforilato SHSP-1 TAM1 [GGGGDIT(pY)ADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTE(pY)ASIQTS (iSEQ ID N. 9), con 4 residui G all?N-terminale].

Un costrutto di SHP2 mancante del dominio N-SH2 (cio? i primi 104 residui) ? stato usato ad una concentrazione di 95 nM. I fosfopeptidi sono stati aggiunti ad una concentrazione di 100 ?M ed il rilascio di fosfato ? stato misurato a diversi tempi. Dalla regione lineare della curva riportante il fosfato rilasciato in funzione del tempo, ? stata calcolata e riportata in grafico la variazione dell?assorbanza a 655 nm in 1 min, dovuta al fosfato rilasciato.

Figura 12: associazione di CF-OP al dominio PTP

[CF-P9ND0W5]=1 nM

Figura 13: Attivazione di SHP2 dal OP

La attivit? basale ? riportata in verde chiaro, mentre le attivit? in presenza di 10 ?M di BTAM o 10 ?M di OP sono mostrate rispettivamente in verde e verde scuro.

Figura 14: Internalizzazione cellulare dei fosfopeptidi.

Pannello di sinistra: quantificazione FACS della internalizzazione cellulare spontanea ed indotta da CPP in cellule NIH3T3 dopo 120 minuti di incubazione.

Pannello di destra: andamento nel tempo del processo di assorbimento cellulare ad una concentrazione di peptide fluorescente pari a 10 ?M.

Figura 15: ottimizzazione della concentrazione di Pep1

Quantificazione mediante FACS della internalizzazione cellulare indotta da Pep1 in cellule NIH3T3 dopo 120 minuti di incubazione. La concentrazione di CF-P9W5 era 0 (viola), 0,5 ?M (blu), 1 ?M (verde) and 2 ?M (rosso).

Figura 16: tossicit? del peptide negli esperimenti di internalizzazione cellulare

La vitalit? cellulare negli esperimenti FACS ? stata determinata mediante la fluorescenza del Sytox.

ESEMPI MATERIALI E METODI

Materiali

Gli Fmoc (9-fluorenilmetilossicarbonil)-amminoacidi sono stati ottenuti da Novabiochem (Merck Biosciences, La Jolla, CA). La resina Rink amide MBHA (0,65 mmol/g, 100-200 mesh) ? stata acquistata da Novabiochem. Tutti gli altri amminoacidi protetti, i reagenti e i solventi per la sintesi peptidica sono stati forniti da Sigma?Aldrich (St. Louis, MO). I componenti del terreno di LB, tutti i reagenti usati per preparare le soluzioni tampone e il reagente di Bradford sono stati acquistati da Sigma-Aldrich. La tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP) ? stata ottenuta da Soltec Ventures (Beverly, MA, USA). I solventi organici per spettroscopia sono stati acquistati da Carlo Erba Reagenti (Milano, Italia). I fattori di crescita dei terreni di coltura cellulare e gli anticorpi sono stati acquistati da VWR International PBI (Milano, Italia), EuroClone (Milano, Italia), Promega (Madison, WI, USA), Invitrogen (Carlsbad, CA, USA), Cell Signaling (Danvers, MA, USA), Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA), e Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA).

Sintesi peptidica

La sintesi dei peptidi su sintetizzatore Syro Wave (Biotage, Uppsale, Sweden) ? stata condotta su scala 0,1 mmol con metodologia FastMoc, a partire dalla resina Rink Amide MBHA (Merck Biosciences, La Jolla, CA) (155 mg, loading 0,65 mmol/g). Il peptide ? stato rimosso dalla resina, filtrato e raccolto. La soluzione ? stata concentrata sotto flusso di azoto, e il peptide grezzo precipitato per aggiunta di dietiletere. I peptidi grezzi sono stati purificati tramite cromatografia flash su cromatografo Isolera Prime (Biotage, Uppsale, Sweden) utilizzando colonne SNAP KP-C18-HS 12g oppure attraverso RP-HPLC preparativo con colonna Phenomenex C18 (22,1x250 mm, 10 ?m, 300 ?) utilizzando il sistema per cromatografia liquida Akta Pure GE Healthcare (Little Chalfont, UK) dotato di un rivelatore UV (flusso 15 mL/min) e un sistema di eluizione binaria: A, H2O; B, CH3CN/H2O (9:1 v/v); modalit? di eluizione a gradiente: 25-55% B in 30 min. Le frazioni purificate sono state analizzate tramite HPLC-MS utilizzando una colonna analitica Phenomenex Kinetex XB-C18 (4,6 x 100 mm, 3,5 ?m, 100 ?) su sistema HPLC Agilent Technologies (Santa Clara, CA) 1260 Infinity II e rivelatore di massa 6130 quadrupole LC/MS. Il sistema di eluizione binario utilizzato ? A, 0.05% TFA (acido trifluoroacetico) in H2O; B, 0.05% TFA in CH3CN; velocit? di flusso 1 mL/min. I tempi di ritenzione (Rt) dei peptidi sintetici, ottenuti attraverso RP-HPLC (le condizioni di eluizione per i diversi peptidi sono riportate tra parentesi), e le masse molecolari sperimentalmente determinate tramite spettrometria ESI-MS sono riportati nella Tabella 1.

I peptidi sono stati sciolti in DMSO per ottenere soluzioni madre con concentrazione 1 e 1,5 mM. L?esatta concentrazione ? stata ottenuta tramite misure UV, sfruttando il segnale della carbossifluoresceina per i peptidi marcati e della pTyr, Tyr e Trp per i peptidi non marcati. A questo scopo, i peptidi marcati con CF sono stati diluiti a partire dalle soluzioni madre (1:100) con soluzione tampone (pH 9), e la loro concentrazione ? stata determinata dal segnale della CF a 490 nm utilizzando un coefficiente di estinzione molare di 78.000 M<-1 >cm<-1 >[Esbj?rner 2007]. I peptidi non marcati sono stati diluiti 1:100 con una soluzione tampone a pH 7.4, i coefficienti di estinzione molare di Tyr, Phe e Trp sono stati ricavati da Pace et al. [1995], mentre il coefficiente di estinzione molare di pY ? stato ricavato da Bradshaw et al. [1999].

Espressione e purificazione delle proteine

Il cDNA diPTPN11 umano (residui 1-528) marcato con esaHis ? stato clonato in un vettore pET-26b (Novagen, MA, USA). Le sostituzioni nucleotidiche associate a SN o leucemia sono state introdotte tramite mutagenesi sito-specifica (QuikChange site-directed mutagenesis kit; Stratagene, CA, USA). Tramite amplificazione via PCR a partire dal cDNA selvatico del gene completo, ? stato generato (e subclonato nel vettore pET-26b) un costrutto contenente il cDNA codificante il dominio PTP isolato preceduto dal dominio C-SH2 (residui 105-528 (SHP2?104). Seguendo una procedura analoga, sono stati generati i costrutti dei domini N-SH2 (residui 2-111), C-SH2 (residui 109-217) e PTP (residui 212-528), cos? come il tandem NSH2/C-SH2 (residui 2-217). Le sequenze di oligonucleotidi utilizzati nelle reazioni di amplificazione sono disponibili su richiesta.

Le proteine ricombinanti sono state espresse come descritto precedentemente [Martinelli 2012, Pannone 2017], utilizzando cellule competenti E. coli (DE3) Rosetta2 (Novagen). In breve, dopo induzione con isopropil-?-D-1-tiogalattopiranoside (Roche) (2 h a 30 ?C o 12-16 h a 18 ?C), i batteri sono stati centrifugati a 5.000 giri al minuto, 4 ?C, per 15 minuti, risospesi in un tampone di lisi contenente lisozima [50 mM TRIS-HCl pH=8,5; 0,5 M NaCl; 20 mM imidazolo; 1mM tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP); 100 mg/ml lisozima; 1 compressa di inibitori di proteasi] e sonicati. Il lisato ? stato centrifugato a 16.000 giri al minuto, 4?C per 30 minuti. Il supernatante ? stato successivamente raccolto e la proteina di interesse purificata tramite cromatografia di affinit? su colonna Ni-NTA (Qiagen, Hilden, Germania), utilizzando un tampone (50 mM TRIS-HCl; 0,5 M NaCl; 1 mM TCEP) contenente 100 mM or 250 mM di imidazolo, usato rispettivamente per lavare ed eluire.

Allo scopo di rimuovere l?imidazolo, i campioni sono stati dializzati in un tampone contenente 20 mM TRIS-HCl (pH 8,5), 1 mM TCEP, 1 mM EDTA e 50mM NaCl (o 150 mM NaCl nel caso in cui non fosse necessario eseguire ulteriori passaggi di purificazione su colonna). Le proteine intere e il costrutto SHP2?104 sono stati soggetti a passaggi successivi di purificazione via cromatografia sequenziale, utilizzando un sistema ?kta FPLC (?kta Purifier 900, Amersham Pharmacia Biotech, Little Chanfont, UK). I campioni sono stati inizialmente eluiti in una colonna a scambio anionico Hi-Trap QP 1ml (GE Helathcare, Pittsburgh, PA, USA); l?eluizione ? stata condotta con 20 mM TRIS-HCl (pH 8,5) in un gradiente di NaCl da 50 a 500 mM. Le frazioni pi? concentrate sono state successivamente eluite in una colonna Superose per gel filtrazione utilizzando un tampone costituito da 20 mM TRIS-HCl contenente NaCl (150 mM) come fase mobile. La purezza del campione ? stata valutata via SDS-PAGE tramite colorazione blu di coomassie, ed ? risultata essere sempre maggiore del 90%.

Le proteine sono state quantificate sia tramite saggio Bradford [Bradford 1976] che in seguito ad assorbimento UV dei residui aromatici, calcolando i coefficienti di estinzione in accordo con Pace [Pace 1995]. In generale, le misure effettuate con le due metodologie sono risultate coerenti, ma i valori ottenuti tramite assorbimento UV si sono rivelati pi? precisi e sono pertanto riportati in Figure e Tabelle. I campioni di proteine sono state utilizzate immediatamente dopo la purificazione o conservate a -20 ?C e usate entro la settimana successiva. In questo caso, subito dopo lo scongelamento, ? stato aggiunto 2,5 mM TCEP, i campioni sono stati centrifugati a 13.000 giri al minuto per 20 minuti, e la nuova concentrazione ? stata rivalutata con i metodi suddetti. Nei rari casi in cui fosse presente assorbanza apparente residua nello spettro UV dovuta a diffusione della luce, tale valore ? stato sottratto in accordo con quanto riportato in Castanho et al., 1997.

Saggi di attivit? fosfatasica

L?attivit? catalitica ? stata valutata in vitro utilizzando 20 pmol di proteina ricombinante purificata in un tampone di reazione di 200 ?l supplementato con 20 mM p-nitrofenil fosfato (Sigma) come substrato, sia in condizioni basali che in seguito a stimolazione con un peptide bifosforilato derivato dalla proteina tirosin-fosfatasica non recettoriale PTPNS1 (peptide BTAM) [GGGGDIT(pY)ADLNLPKGKKPAPQAAEPNNHTE(pY)ASIQTS (SEQ ID N:9)] (Primm, Milano, Italia), come descritto precedentemente [Martinelli 2008]. Le proteine sono state incubate per 15 min (SHP2?104) o 30 min (SHP2) a 30 ?C. Il rilascio di fosfato ? stato determinato misurando l?assorbanza a 405 nm.

I saggi DiFMUP (6,8-difluoro-4-methilumbelliferone fosfato) sono stati effettuati come precedentemente descritto [Garcia Fortanet 2016], con piccole modifiche. In breve, le reazioni sono state eseguite a temperatura ambiente in piastre di polistirene nero con fondo piatto a 96 pozzetti, flangia bassa, superficie non legante (Corning, cat. no. 3991), in un volume finale di 100 ?l e il seguente tampone di reazione: 60 mM HEPES (pH 7,2); 75 mM NaCl; 75 mM KCl; 1 mM EDTA; 0,05% Tween-20; 5 mM DTT. L?attivit? catalitica ? stata misurata in presenza di 1 nM SHP2 e differenti concentrazioni dei peptidi attivanti. Dopo 45 min a 25 ?C, 200 ?M del substrato surrogato DiFMUP (Invitrogen, cat. no. D6567) ? stato aggiunto alla miscela di reazione e incubato a 25 ?C per 30 min. La reazione ? stata interrotta con l'aggiunta di 20 ?l di 160 ?M bpV (Phen) (potassio bisperoxo (1,10-fenantrolina)ossovanadato (V) idrato) (Enzo Life Sciences cat. No. SML0889-25MG). La fluorescenza ? stata monitorata utilizzando un lettore di micropiastre (Envision, Perki-Elmer), servendosi di lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di 340 nm e 455 nm, rispettivamente.

La capacit? di SHP2 di defosforilare i fosfopeptidi ? stata valutata anche tramite un saggio con il verde malachite verde (PTP assay kit 1 Millipore, MA, USA). Oltre al peptide BTAM, in questo saggio sono stati utilizzati i seguenti peptidi monofosforilati derivati da substrati noti di SHP2: DKQVEpYLDLDL (SEQ ID N. 6) (GAB1Y657), EEENIpYSVPHD (SEQ ID N. 7) (p190A/RhoGAPY1105) e VDADEpYLIPQQ (SEQ ID N. 8) (EGFRY1016) (Primm) [Sun et al., 2009; Ren et al., 2011]. I peptidi ricombinanti SHP2?104 o PTP (2,38 pmol) sono stati incubati con 100 ?M di ciascun fosfopeptide (in un volume totale di 25 ?l) per differenti tempi di incubazione. La reazione ? stata bloccata aggiungendo 100 ?l di soluzione di malachite verde. Dopo 15 minuti, l'assorbanza ? stata letta a 655 nm usando un lettore di micropiastre e confrontata con una curva standard per determinare il rilascio di fosfato. I dati ottenuti nella regione lineare della curva sono stati normalizzati sul tempo di reazione (1 min).

Saggio di associazione basato sull?anisotropia di fluorescenza

Le misure di anisotropia sono state effettuate con uno spettrofluorimetro Horiba Fluoromax 4. Per i saggi di associazione, la quantit? di peptide necessaria (1 nM o 0.1 nM ) ? stata diluita in tampone (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, TCEP 1 mM, nel seguito indicato come ?tampone di fluorescenza?) ed il suo segnale di anisotropia ? stato registrato. Il peptide ? stato poi titolato con quantitativi crescenti di proteina, finch? il suo segnale di anisotropia non ha raggiunto un valore stabile al suo massimo, o fino ad una concentrazione di proteina a cui l?aggregazione proteica e la conseguente diffusione della luce inficiava i valori di anisotropia (tipicamente sopra 1 ?M). Le misure sui peptidi marcati con CF sono state effettuate utilizzando una lunghezza d?onda di eccitazione di 470 nm e raccogliendo i valori di anisotropia ad una lunghezza d?onda di emissione di 520 nm. ? stato usato un filtro in emissione con lunghezza d?onda di taglio di 495 nm. Per i peptidi marcati con Cy3, sono state utilizzate lunghezze d?onda di eccitazione e di emissione di 520 nm e 560 nm. Negli esperimenti di associazione ? stata utilizzata la minima concentrazione necessaria per avere un segnale di fluorescenza sufficiente (0,1 nM). Concentrazioni pi? elevate (1 o 10 nM) sono state usate per peptidi con affinit? inferiori, e perci? con valori di Kd pi? elevati.

I saggi di spiazzamento sono stati svolti con le stesse impostazioni sperimentali. In questo caso il complesso proteina/peptide marcato ? stato titolato con quantit? crescenti di peptide non marcato, seguendo la diminuzione di anisotropia. Gli esperimenti sono stati svolti alla stessa concentrazione di peptide marcato con CF utilizzata per gli esperimenti di associazione corrispondenti. Per quanto riguarda la concentrazione proteica, ? necessario un compromesso tra due necessit? [Huang 2003]. Da un lato, ? desiderabile avere una frazione significativa del peptide marcato legata alla proteina, per massimizzare l?intervallo dinamico del segnale di anisotropia, che diminuisce durante l?esperimento di spiazzamento. Dall?altro, la concentrazione proteica dovrebbe essere confrontabile o inferiore alla costante di dissociazione del peptide non marcato (Ki), per permettere una determinazione quantitative e affidabile della sua affinit? di associazione. Poich? diversi peptidi non marcati hanno mostrato un?affinit? pi? elevata delle loro controparti fluorescenti, negli esperimenti di spiazzamento gli autori hanno utilizzato una concentrazione proteica [?]T?Kd, o, in alcuni casi, anche ?Kd/2.

I valori di Kd sono stati ottenuti da un?analisi dei dati con la seguente equazione, descritta in Van der Weert 2011, che evita la necessit? dell?approssimazione comunemente utilizzata (ma spesso in modo ingiustificato) della concentrazione di proteina libera con la concentrazione totale:

sono le concentrazioni totali di proteina e ligando, mentre r, r0 e rmax sono

rispettivamente i valori di anisotropia ad una data concentrazione proteica, in assenza di proteina e quando il peptide ? completamente legato.

L?affinit? dei peptidi non marcati ? stata determinata mediante esperimenti di competizione, in cui un campione con concentrazioni di proteina e ligando fisse e ? stato titolato con l?inibitore, causando lo spiazzamento del peptide fluorescente e una diminuzione dell?anisotropia. Da questi dati ? stata determinata l?IC50 (ossia la concentrazione totale di peptide non marcato che spiazza la met? dell?analogo fluorescente legato), interpolando la curva di spiazzamento utilizzando un?equazione di Hill fenomenologica [Barlow 1989]:

dove [I]T ? la concentrazione totale di peptide che causa lo spiazzamento, e rfin ? l?anisotropia che corrisponde allo spiazzamento totale, mentre in questo caso r0 ? l?anisotropia iniziale, in assenza di peptide spiazzante.

Successivamente, la costante di dissociazione del peptide non marcato (Ki) ? stata calcolata dai valori noti di e come descritto di seguito.

Qui, [PL]0 pu? essere sostituito con l?espressione seguente, analoga all?Eq. (1):

In questo senza alcuna approssimazione.

Microrray di domini SH2

L?esperimento con il microarray ? stato condotto dal Array and Analysis Core at the MD Anderson Cancer Center (University of Texas, USA), come precedentemente descritto [Roth 2019]. In breve, una libreria di domini SH2 [Huang 2008] ? stata espresso come costrutti di fusione con la GST in E. coli e purificata su resina di sepharose-glutatione. I domini sono stati depositati su vetrini ricoperti di nitrocelulosa slides (Oncyte Avid slides, Grace Bio-Labs) utilizzando un apposito strumento ad aghi [Espejo 2002]. Ogni dominio ? stato depositato in duplicato. Dopo l?incubazione con una soluzione di Cy3-P9W5 (0,5; 5 nM, o 50 nM), i segnali di fluorescenza sono stati rivelati utilizzando uno scanner GeneTACTM LSIV (Genomic Solutions).

Studi in silico

Preparazione del sistema

La struttura iniziale di N-SH2 complessato con il fosfopeptide P8 (Tabella 1) ? stata ottenuta sostituendo (e togliendo) amino acidi nella struttura cristallografica della proteina complessata con il peptide GAB1 (sequenza GDKQVE-pY-LDLDLD (SEQ ID N.: 3)) (codice PDB 4QSY). La conformazione delle catene laterali per i residui mutati ? stata scelta selezionando la pi? probabile in una libreria di rotameri dipendenti dalla conformazione della catena principale [Dunbrack 2002]. I complessi ottenuti sono stati poi usati come strutture di partenza per le sostituzioni amminoacidiche successive nel peptide legato.

Equilibratura del sistema

Le simulazioni MD sono state eseguite usando il programma GROMACS [Abraham 2015] ed una variante del campo di forze AMBER99SB con parametri per i residui fosforilati [Homeyer 2006]. Le molecole di acqua sono state descritte con il modello TIP3P [Jorgersen 1983]. Tutti i sistemi simulati sono stati inseriti in una scatola periodica triclina pre-equilibrata, contenente 24000 molecole di acqua e controioni per neutralizzare la carica totale del sistema. Questi sistemi sono stati rilassati facendo all?inizio una minimizzazione con il metodo della massima pendenza (steepest descent minimization) di 5000 cicli, tenendo fissa la posizione della proteina e permettendo ad acqua e ioni di adattarsi liberamente, seguita da un protocollo di riscaldamento in cui la temperatura ? stata progressivamente aumentata da 100K a 300K. Il sistema ? stato a quel punto equilibrato per 100 ps in un insieme NVT a 300K, usando un metodo del ridimensionamento delle velocit? con un termine stocastico (tempo di rilassamento 1 ps) [Bussi 2007] e quindi per 500 ps a pressione costante (1 atm) usando il barostato Parrinello-Rhaman (tempo di rilassamento 5 ps) [Parrinello 1981]. Le interazioni elettrostatiche a lunga distanza sono state calcolate usando il metodo particella-maglia (particle-mesh) di Ewald [Darden 1993] e la distanza di azzeramento (cut-off) delle interazioni di non legame ? stata impostata uguale a 12.0 ?. Gli atomi di idrogeno sono stati vincolati mediante LINCS ed ? stato usato un tempo di integrazione di 2 fs [Hess 1997].

Campionamento delle configurazioni iniziali per il campionamento ad ombrello (Umbrella sampling)

Per ogni sistema, un insieme di configurazioni iniziali ? stato preparato conducendo una simulazione guidata. La distanza tra i centri di massa (acronimo inglese COM) del peptide e del dominio N-SH2 ? stata imposta con una forza armonica (K=1.000 kJ mol<-1 >nm<-2>). La trazione ? stata condotta aumentando gradualmente il valore della distanza di equilibrio con una velocit? costante di 0.0025 nm/ps. La lunghezza di ciascuna simulazione ? stata di circa 2,5 ns. Durante l?intera simulazione, una costrizione della posizione (1.000 kJ/( mol ? nm) ? stata applicata a tutti gli atomi pesanti nel dominio N-SH2 eccetto gli atomi delle anse intorno alla regione di legame (residui 30-45, 52-75, 80-100). La scelta del cammino di allontanamento ottimale ? critica per una stima attendibile della energia libera di legame del peptide [Chovancova 2012, Vuong 2015]. In questo lavoro, tre diverse direzioni sono state testate, corrispondenti a: i) il vettore dal fosfato al carbonio alpha del pY, nel complesso equilibrato; ii) il vettore definito dalle posizioni iniziali dei due centri di massa; iii) il vettore perpendicolare alla superficie della cavit? definita dalle anse EF e BG, passante dal centro di massa del dominio N-SH2. Tra i tre diversi cammini, la terza direzione ha evidenziato meno occlusioni steriche delle anse EF e BG, ed ? stata quindi selezionata per le ulteriori analisi.

Simulazioni di campionamento a ombrello

Un insieme di configurazioni di partenza ? stata estratta dalle traiettorie di dinamica guidata, salvandole a distanze dei centri di massa di peptide e proteina spaziate di 2 ? nell?intervallo da 9 a 40 ?, ottenendo quindi 20 finestre lungo la distanza dei COM. Il sistema in ogni finestra ? stato preliminarmente equilibrato per 1 ns con un forte costrizione delle posizioni (1.000 kJ/ mol ? nm) di tutti i carboni alfa eccetto quelli nelle anse che delimitano la regione di legame (come nelle simulazioni di allontanamento), seguita da una traiettoria di produzione di 150 ns. In questa fase, un potenziale armonico (K=1.000 kJ/mol? nm<2>)) ? stato applicato alla distanza tra i due COM. Finestre aggiuntive sono state aggiunte ogni 1 ? lungo la distanza dei due COM fino alla distanza di 15 ?. La risultante distribuzione asimmetrica delle finestre di campionamento ? stata usata per calcolare il potenziale di forza media (acronimo inglese PMF) sulle traiettorie di produzione. A tal fine, ? stato utilizzato il metodo dell?analisi degli istogrammi ponderati (Weighted Histogram Analysis Method - WHAM) [Kumar 1992], con le impostazioni predefinite (50 classi e tolleranza di 10<?6 >kJ mol<?1>), usando lo strumento gmx wham di GROMACS [Hub 2010]. La analisi della simulazione ? stata condotta sui 150 ns della traiettoria di produzione, durante la quale le configurazioni sono state salvate ogni 0,1 ns. La incertezza statistica dei PMF ottenuti ? stata stimata con una analisi bootstrapping [Hub 2010].

Stabilit? dei peptidi in siero e DMEM

I peptidi sono stati sciolti in DMSO (5 mg/mL). In provette eppendorf, 1 mL di tampone HEPES (C = 25 mM, pH = 7,6) ? stato equilibrato a 37 ?C prima di procedere con l?aggiunta di 250 ?L di siero umano e 20 ?L di soluzione di peptide; la reazione ? stata seguita per 90 minuti. A intervalli prefissati, sono stati prelevati 100 ?L di soluzione a cui sono stati aggiunti 200 ?L di etanolo assoluto. I campioni sono stati tenuti in ghiaccio per 15 minuti, quindi centrifugati a 13.000 giri al minuto, per 5 minuti; le soluzioni surnatanti sono state analizzate tramite HPLC e HPLC-MS con gradiente 20-60% B in 20 minuti per seguire il decorso della reazione. In parallelo, sono stati anche analizzati campioni contenenti unicamente peptide, tampone ed etanolo. Prove di resistenza alla degradazione sono state condotte anche in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium). Le condizioni sperimentali sono simili a quelle sopradescritte; la reazione ? stata monitorata per 72 ore. La resistenza alla degradazione enzimatica ? stata seguita tramite HPLC utilizzando un gradiente 5-50% B in 20 minuti.

Esperimenti di internalizzazione cellulare

Gli esperimenti di internalizzazione del peptide sono stati eseguiti in cellule NIH3T3. Sono state piastrate circa 200.000 cellule/pozzetto in piastre da 6 pozzetti. Le cellule sono state coltivate in terreno Dulbecco (Eagle) supplementato con 10% di siero bovino fetale (Gibco) inattivato al calore e 1% di penicillina/streptomicina, e mantenute a 37 ?C in presenza di anidride carbonica (5%).

Sono state seguite due differenti strategie. In un primo gruppo di esperimenti il peptide fluorescente ? stato incubato con Pep1, un peptide internalizzante nelle cellule (CPP). La soluzione madre di Pep1 ? stata preparata sciogliendo il peptide in acqua ultrapura. Il peptide fluorescente ? stato diluito in PBS partendo da una soluzione madre di DMSO. I peptidi sono stati miscelati e incubati per 30 min a temperatura ambiente, in un volume finale di 400 ?l. Le condizioni ottimali di internalizzazione del peptide sono state ottenute testando diversi rapporti tra carico e CPP. Successivamente, le miscele sono state aggiunte alle cellule, precedentemente lavate con PBS, insieme a 600 ?l di terreno privo di siero (i volumi riportati si riferiscono al singolo pozzetto). Dopo un?ora di incubazione ? stato aggiunto siero bovino fetale (FBS) ad una concentrazione finale del 10%.

Successivamente le cellule sono state incubate per tempi diversi, lavate con PBS, raccolte e marcate con SYTOX blu (1mM, Invitrogen) per valutare la vitalit? cellulare ed ? stata quantificata la fluorescenza verde di CFP9W5 per misurare l?internalizzazione cellulare del peptide. I dati ottenuti sono stati analizzati con il Software Kaluza (Beckman Coulter).

Un secondo gruppo di esperimenti ? stato condotto utilizzando l?analogo peptide coniugato con TAT. In questo caso, le cellule sono state incubate direttamente con differenti quantit? di peptide.

RISULTATI

1) Caratterizzazione dell?associazione IRS-1 pY1172/N-SH2

1.1) Il peptide IRS-1 pY1172 lega il dominio N-SH2 con un?affinit? basso nanomolare.

In un esperimento di associazione l?analogo marcato CFP9 di IRS-1 pY1172 (Tabella 1) ? stato titolato con concentrazioni crescenti del dominio N-SH2. La frazione di peptide legato alla proteina ? stata determinata dall?aumento dell?anisotropia di fluorescenza (Figura 2), ottenendo una KD di 53?2 nM (Tabella 2).

1.2) La fosforilazione contribuisce solo per il 30% all?energia libera di associazione.

L?associazione dei domini SHP2 con i partner di associazione ? regolata dalla fosforilazione e perci? il gruppo fosfato ? necessariamente responsabile per un?ampia frazione dell?affinit? di associazione. D?altra parte, per avere una buona selettivit?, il resto della sequenza deve anch?esso contribuire in modo significativo all?interazione peptide/proteina. Per quantificare questo aspetto, gli autori hanno effettuato un esperimento di associazione (Figura 2) con un analogo non fosforilato del peptide IRS-1 pY 1172 marcato, CF-P9Y0 (Tabella 1). L?affinit? ? risultata circa 100 volte inferiore, con una KD di 6,6?0,6 ?M, in confronto a 53?2 nM per il peptide fosforilato. I valori corrispondenti per l?energia libera standard di associazione (assumendo uno stato standard 1 M) sono -29,6?0,2 kJ/mol e -41,6?0,1 kJ/mol, rispettivamente. Assumendo che i contributi siano additivi, il gruppo fosfato risulta essere responsabile per la differenza di -12,0?0,2 kJ/mol, ossia per meno del 30% dell?energia libera standard di associazione del peptide fosforilato. Questo risultato indica che il contributo del resto del peptide predomina nelle interazioni di associazione.

2) Ottimizzazione della sequenza

2.1) La sequenza pu? essere ridotta ad 8 amminoacidi, senza perdita di affinit?.

I dati di letteratura sono particolarmente contraddittori per quanto riguarda l?effetto del troncamento della sequenza IRS-1 pY1172 sull?affinit? di associazione. Kay [1998] ha riportato che un accorciamento della sequenza al C-terminale, fino al residuo 5, non ha causato nessuna perdita di affinit?. Al contrario, Case [1994] ha osservato una significativa riduzione di affinit? residui nel determinare l?affinit? di legame del dominio di legame N-SH2, gli autori hanno effettuato esperimenti di spiazzamento (Figura 3) con il peptide non marcato P9 e con gli analoghi tronchi P8 e P7 (Tabella 1), dove sono stati rimossi, rispettivamente il residuo -3, o i residui -2 e -3.

Nessuna perdita di affinit? significativa ? stata osservata riducendo la sequenza a 8 residui, mentre l?eliminazione dell?amminoacido in posizione -2 ha causato una drastica perturbazione della stabilit? del complesso. (Figura 3). La sequenza di IRS-1 da -2 a 5 ? il peptide minimo che mantiene una costante di dissociazione basso-nM.

2.2) Singole sostituzioni amminoacidiche migliorano la Kd fino all?intervallo basso nanomolare. In base alle strutture di complessi tra fosfopeptidi e domini N-SH2 [Lee 1994, Hayashi 2017] si pu? predire che la sequenza IRS-1 pY1172 abbia diverse interazioni favorevoli, poich? ha residui apolari nelle posizioni 1, 3 e 5, che puntano verso il solco idrofobo nella sequenza di N-SH2, e amminoacidi anionici in posizione 2 e 4, che possono interagire con residui di lisina nell?ansa BG.

Nel tentativo di migliorare ulteriormente l?affinit? di associazione, gli autori hanno analizzato in silico l?effetto di diversi amminoacidi apolari in posizione 5. Calcoli di energia libera hanno suggerito che la sostituzione di L con il pi? ingombrante W (ma non con F) potesse essere favorevole (Figura 4). Anche la sostituzione del D in 4 con il pi? lungo E ? stata considerata, per una possibile rafforzamento delle interazioni elettrostatiche. In questo caso, non ? stato predetto nessun aumento aggiuntivo dell?affinit? (Figura 4). Analoghi con F o W in posizione 5 (P8F5 e P8W5), e un analogo marcato con la sostituzione di L in W (CF-P9W5, Tabella 1) sono stati sintetizzati e caratterizzati sperimentalmente (Figura 5). Come predetto, l?introduzione di W in 5 ? risultata altamente favorevole, portando ad una riduzione della costante di dissociazione di un ordine di grandezza, sia per l?analogo marcato che per quello senza sonda (Tabelle 2 e 3). Di conseguenza, la Kd per l?analogo P8W5 ? risultata essere 1.6?0.4 nM. Al contrario, la sostituzione aggiuntiva di D in E ? risultata in una piccola perdita di affinit? di associazione (Figura 5 e Tabelle 2 e 3). Sulla base di questi risultati, gli studi successivi si sono concentrati sul peptide con W in posizione 5.

3) Selettivit? di associazione

3.1) La sequenza modificata ? altamente selettiva per il dominio N-SH2 di SHP2.

La selettivit? di associazione di CF-P9W5 ? stata inizialmente valutata rispetto al dominio C-SH2 di SHP2, anche in questo caso mediante un saggio di anisotropia di fluorescenza (Figura 6). Come riportato in Tabella 2, l?affinit? per il dominio C-SH2 ? risultata di quasi 1000 volte inferiore a quella per il domino N-SH2.

Un?analisi pi? completa della selettivit? di associazione ? stata svolta su una matrice proteica di 97 domini SH2 umani (Figura 7). In questo saggio ? stato utilizzato un analogo del CF-P9W5, in cui la CF ? stata sostituita con la sonda Cy3, adatta per la rivelazione nello strumento per la lettura della matrice proteica. Esperimenti di associazione di controllo hanno dimostrato che il cambiamento di fluoroforo ha avuto un effetto solamente marginale sull?affinit? di associazione (Tabella 2).

Sorprendentemente, si ? osservata un?associazione significativa solo con il dominio N-SH2 di SHP2, e, in misura minore, al dominio SH2 della proteina adattatrice APS (anche detta SHP2B2). ? degno di nota il fatto che anche l?associazione al dominio N-SH2 di SHP1, che ha la pi? elevata identit? di sequenza con quello di SHP2 [Liu 2006] ? risultato trascurabile.

4) Ottimizzazione della resistenza alla degradazione

4.1) L?introduzione di un analogo della pY non idrolizzabile ? compatibile con un?affinit? basso nM.

Con l?obiettivo di un utilizzo intracellulare o in vivo del peptide, ? essenziale renderlo resistente alla degradazione. Il gruppo pi? labile chimicamente ? il gruppo fosfato del residuo pY, che pu? essere idrolizzato da protein-tirosin-fosfatasi di cui IRS-1 pY 1172 ? un substrato, eventualmente anche dalla stessa SHP2 [Noguchi 1994]. Gli autori hanno sostituito la pY con l?analogo non idrolizzabile fosfonodifluorometil fenilalanina (F2Pmp), che ? isosterico con la pY ed ha una carica totale negativa paragonabile a quella della pY in condizioni di pH fisiologico [Burke 2006]. Esperimenti di associazione hanno dimostrato che l?analogo sostituito (CF-P9ND0W5, dove ND indica non-defosforilable, Tabella 1) ha una costante di dissociazione per il dominio N-SH2 che ? solo un ordine di grandezza pi? bassa rispetto a quella del CF-P9W5 (68 ? 5 nM rispetto a 4,6 ? 0,4 nM) (Figura 8 e Tabella 2). In modo analogo, la costante di dissociazione per il peptide non marcato P9ND0W5 ? risultata di 15 ? 0,4 nM (rispetto a 1,6 ? 0,4 nM per P8W5) e perci? ? rimasta nella regione nM (Tabella 3).

Per brevit?, nel testo seguente, CF-P9ND0W5 ed il suo analogo non marcato P9ND0W5 saranno indicati anche come i peptidi ottimizzati, o CF-OP e OP, rispettivamente.

4.2) Il peptide ottimizzato OP ? resistente alla degradazione proteolitica.

Per verificare la resistenza alle proteasi, il peptide ottimizzato OP ? stato incubato con siero umano fino a 90 minuti, o in DMEM per tre giorni, e in seguito analizzato mediante HPLC. In questi intervalli di tempo non ? stata osservata nessuna degradazione significativa (Figura 9). Al contrario, l?ottadecapeptide HPA3NT3 [Park 2008], che gli autori hanno utilizzato come controllo positivo, ? stato degradato completamente gi? dopo 5 minuti (dati non mostrati). Questo risultato ? importante per applicazioni in vivo del peptide.

5) Associazione alla proteina SHP2 intera e sua attivazione

5.1) OP lega i mutanti patogenetici con un?affinit? molto maggiore rispetto a quella per la proteina selvatica.

Come discusso nell?introduzione, gli autori ed altri ricercatori hanno ipotizzato che nello stato autoinibito la conformazione del dominio N-SH2 impedisca un?associazione efficace agli interattori, mentre l?affinit? di associazione a sequenze fosforilate sia massimizzata nello stato aperto e attivo [Keilhack 2005; Bocchinfuso 2007, Martinelli 2008, LaRochelle 2018]. Questo modello ha diverse conseguenze rilevanti, perch? implica che i mutanti patogenetici abbiano un duplice effetto: aumentano l?attivit? della fosfatasi, ma anche la sua affinit? verso gli interattori. In principio, entrambi gli effetti potrebbero essere all?origine dell?iperattivazione delle cascate di trasduzione del segnale coinvolte nelle patologie causate da mutazioni di PTPN11.

Nonostante l?importanza di questo aspetto, al meglio delle nostre conoscenze, non ? stato finora riportato nessun esperimento di associazione diretta di fosfopeptidi all?intera proteina SHP2, probabilmente a causa del fatto che la pY pu? essere defosforilata dal dominio PTP. Ora, il peptide OP e il suo analogo fluorescente CF-OP permettono di testare direttamente l?ipotesi sopra descritta. La Figura 10 e la Tabella 2 riportano i risultati di esperimenti di associazione svolti con CF-OP e SHP2 selvatica, o con i mutanti patogenetici A72S, E76K, D61H, F71L and E76V. E76K ? tra le lesioni pi? comunemente associate con la leucemia e non ? stata mai osservata in pazienti con la sindrome di Noonan. Questa mutazione ? fortemente attivamente, con un?attivit? basale del mutante almeno 10 volte maggiore di quella della proteina selvatica. Al contrario, la sostituzione A72S si presenta frequentemente nei pazienti con SN. In questo caso, l?attivazione basale ? solo di un fattore 2 [Bocchinfuso 2007]. Le mutazioni D61H, F71L e E76V sono state identificate come eventi somatici in neoplasie ematopoietiche e linfoidi [Tartaglia 2003, Tartaglia 2005]. Gli autori hanno osservato che l?affinit? per il CF-OP ha un andamento analogo all?attivit? basale di questi mutanti (Figure 10). Questo risultato rappresenta la prima conferma diretta del fatto che lo stato chiuso e autoinibito ha un?affinit? per i partner di interazione inferiore a quella della conformazione aperta e attiva.

I dati qui presentati hanno anche un?altra conseguenza importante: in ambiente cellulare, il peptide ha la propriet? di agire come inibitore efficace delle interazioni proteina-proteina della SHP2 mutata e iperattiva, mentre lascerebbe sostanzialmente imperturbata la proteina selvatica. Questo comportamento ? l?esatto opposto di quanto ? stato osservato per gli inibitori allosterici, come lo SHP099, che hanno un?attivit? significativamente ridotta nei confronti di mutanti patogenetici di SHP2 [Sun 2018; LaRochelle 2018].

5.2) OP inibisce anche il dominio PTP.

Sulla base di studi precedenti, riguardanti la defosforilazione di IRS-1 pY 1172 da parte di SHP2 SHP2 [Noguchi 1994], gli autori hanno verificato se anche P8 e P8W5 fossero dei substrati di questa proteina. Come riportato in Figura 11, la defosforilazione ha effettivamente avuto luogo, sebbene in misura minore rispetto ad altri fosfopeptidi.

Utilizzando il peptide non defosforilabile CD-OP, gli autori hanno misurato direttamente la sua associazione al dominio PTP di SHP2 (Figure 12). Effettivamente si ? osservata un?associazione significativa, sebbene con un?affinit? molto peggiore di quella per il dominio N-SH2 (Kd=10 ? 0,8 ?M). Questo risultato indica che, in principio, il peptide non defosforilabile OP potrebbe agire come un inibitore di SHP2 a doppio bersaglio, agendo sia sulle interazioni proteina-proteina, sia sull?attivit? catalitica.

5.3) OP attiva SHP2 solo debolmente.

L?attivazione di SHP2 ? causata dall?associazione a peptidi mono- o di-fosforilati. Gli autori hanno testato l?effetto dell?OP sulla proteina selvatica e sul mutante A72S (questo esperimento non ? possibile con il mutante E76K, poich? in quel caso la proteina ? completamente attivata gi? in assenza di fosfopeptidi). Come mostrato in Figura 13, l?attivazione ? risultata essere piuttosto debole, in confronto a quella indotta dal peptide bifosforilato BTAM, e un effetto significativo ? stato osservato solo con la proteina mutata. ? interessante notare che, nelle condizioni sperimentali utilizzate, sia la proteina selvatica che il mutante A72S dovrebbero essere quasi completamente saturate dall?OP, in base agli esperimenti di associazione riportati in Figura 10. Una possibile spiegazione di questo risultato ? fornita dalla combinazione di due effetti: l?apertura della proteina, a seguito dell?associazione del peptide al dominio N-SH2, e parziale inibizione dell?attivit? catalitica mediante associazione al dominio fosfatasico. Questo risultato ? interessante, in quanto l?attivazione di SHP2 da parte dell?OP avrebbe potuto rappresentare un effetto collaterale indesiderabile. I dati indicano che il peptide possa inibire le interazioni proteina-proteina di SHP2, senza causare un significativo aumento dell?attivit? catalitica.

6) Internalizzazione cellulare

6.1) I peptide di internalizzazione trasportano i fosfopeptidi all?interno della cellula in modo efficiente e senza tossicit?.

SHP2 ? un bersaglio intracellulare, ma l?internalizzazione spontanea dei peptidi sviluppati in questo studio, che sono fortemente carichi, ? altamente improbabile. Per risolvere questo problema, gli autori hanno sviluppato due diverse strategie, che utilizzano sequenze dei peptidi di internalizzazione (CPP). Questi peptidi sono in grado di attraversare spontaneamente le membrane cellulari, portando con s? le macromolecole a cui siano stati associati covalentemente o non covalentemente. Per la strategia non covalente, gli autori hanno semplicemente mischiato i peptidi con il CPP Pep1 [Bobone 2011]. Gli autori hanno anche legato covalentemente la sequenza del frammento 48-57 della proteina TAT del virus dell?immunodeficienza acquisita umano di tipo 1 al C-terminale dei peptidi (Tabella 1) [Brooks 2005].

Esperimenti di citofluorimetria a flusso (FACS) su cellule NIH3T3 con il peptide CF-P9W5 hanno dimostrato che in effetti l?internalizzazione spontanea ? minima. Al contrario, ? stato possibile ottenere un?efficiente internalizzazione sia con la strategia covalente, sia con quella non covalente (Figura 14). In entrambi i casi ? stata rivelata una concentrazione intracellulare di peptide marcato significativa e dose-dipendente. Non sono stati osservati effetti di saturazione nell?intervallo di concentrazioni studiato. Esperimenti in funzione del tempo hanno dimostrato che, anche dopo 2 ore di incubazione, l?internalizzazione cellulare non era completa (Figura 14). La concentrazione di Pep1 da utilizzare negli esperimenti di internalizzazione ? stata determinata sulla base di esperimenti preliminari, che hanno dimostrato una massima internalizzazione ad una concentrazione di peptide di internalizzazione pari a 10 ?M, indipendentemente dalla concentrazione di peptide che doveva essere trasportato (Figura 15). In queste condizioni la tossicit? di Pep1 ? risultata trascurabile. Anche il CF-P9W5-TAT non ha causato tossicit? cellulare a tutte le concentrazioni studiate (Figura 16).

Tabelle

Tabella 1. Sequenze peptidiche investigate in questo studio

Tutti i peptidi erano amidati al C-terminale. I peptidi non marcati erano acetilati all?N-terminale. CF sta per 5,6 carbossifluoresceina, Cy3 per cianina 3-acido carbossilico e F2Pmp ? fosfonodifluorometil fenilalanina, un analogo non defosforilabile della pY. Sono riportati i tempi di ritenzione (Rt) per i peptidi sintetici ottenuti da RP-HPLC (le diverse condizioni di eluizione usate per i vari peptidi sono mostrate tra parentesi), i pesi molecolari per i peptidi sintetici determinati sperimentalmente mediante spettrometria ESI-MS e la purezza.

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Tabella 2. Costanti di dissociazione ottenute da esperimenti di legame mediante anisotropia di fluorescenza

Tabella 3. Costanti di inibizione ottenute da esperimenti di spiazzamento. Tutte le misure sono state condotte sul dominio N-SH2 di SHP2. Gli esperimenti sono stati fatti a [N-SH2]= 3,4 nM e [CF-P9W5]=0,5 nM (per P8 e P9ND0W5) o 0,1 nM (per gli altri peptidi)

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Un peptide che comprende la, o consiste della, sequenza, dall?N- al C- terminale: X-2X-1ZX1X2X3X4X5 (SEQ ID N.:1), dove ? Z ? un analogo non naturale della fosfotirosina, come ad esempio la fosfonodifluorometil fenilalanina (F2Pmp), la tirosina o la fosfotirosina (pY) ? X-2 ? un amminoacido idrofobo, preferibilmente selezionato dal gruppo che consiste di: Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp e Met ? X-1 ? un qualunque amminoacido ? X1 ? un amminoacido idrofobo, preferibilmente selezionato dal gruppo che consiste di: Ile, Leu, Val, Phe, Tyr, Trp e Met ? X3 ? un amminoacido idrofobo, preferibilmente selezionato dal gruppo che consiste di: Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp e Met ? X5 ? un amminoacido idrofobo, preferibilmente selezionato dal gruppo che consiste di: Trp, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, and Met ? X2 e X4 sono amminoacidi anionici, preferibilmente, ciascuno e in modo indipendente, ? Asp o Glu dove gli amminoacidi possono essere, ciascuno indipendentemente, un amminoacido naturale o non naturale, come ad esempio C? o N metilati, peptoidi, beta amminoacidi, o D amminoacidi, a condizione che il peptide non sia GLNpYIDLDL (SEQ ID N.: 2) e GDKQVEpYLDLDLD (SEQ ID N.: 3).
2. Il peptide secondo una qualunque delle rivendicazioni, dove: - X-2 ? Leu e/o - X-1 ? Asn e/o - X1 ? Ile e/o - X2 ? Asp e/o - X3 ? Leu e/o - X4 ? Asp e/o - X5 ? Trp, Leu o Phe, preferibilmente Trp.
3. Il peptide secondo le rivendicazioni 1 o 2, dove Z ? un analogo non naturale della fosfotirosina, preferibilmente Z ? F2Pmp.
4. Il peptide, secondo la rivendicazione 4, che comprende la, o consiste della, sequenza, dall?N- al C-terminale: LN-(F2PmP)-IDLDW (SEQ ID N.:4) o GLN-(F2PmP)-IDLDW (SEQ ID N.: 5).
5. Il peptide, secondo una qualunque delle precedenti rivendicazioni, dove l?N-terminale e/o il C-terminale del peptide sono modificati, preferibilmente mediante acetilazione o ammidazione, o tramite marcatura con sonde fluorescenti, preferibilmente la 5,6 carbossifluoresceina (CF) e la cianina 3 acido carbossilico (Cy3), con maggiore preferenza l?N-terminale ? acetilato o marcato con CF e/o il C-terminale ? ammidato.
6. Il peptide secondo la rivendicazione 5, dove il peptide ? il peptide definite nella rivendicazione 4 e il suo N-terminale ? acetilato e il suo C-terminale ? ammidato.
7. Un peptide secondo una qualunque delle precedenti rivendicazioni, che comprende anche una sequenza amminoacidica che favorisca la penetrazione nelle cellule, preferibilmente detta sequenza ? TAT, penetratina, olig-Arg, trasportan 10, essendo detta sequenza amminoacidica legata all?N-terminale e/o al C-terminale del peptide.
8. Un complesso non covalente comprendente il peptide secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-7 o il peptide GLNpYIDLDL (SEQ ID N. 2) e una sequenza amminoacidica che favorisca la penetrazione nelle cellule, preferibilmente detta sequenza ? Pep1.
9. Una composizione farmaceutica che comprende un peptide secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-7, il peptide GLNpYIDLDL (SEQ ID N.: 2) or il complesso della rivendicazione 8 e almeno un vettore, eccipiente e/o diluente farmaceuticamente accettabile, preferibilmente che comprenda anche almeno un agente terapeutico, preferibilmente detto agente terapeutico aggiuntivo ? selezionato dal gruppo che consiste di: agenti chemioterapici, agenti antitumorali mirati, inibitori della risposta al danno al DNA.
10. Il peptide secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-7, il peptide GLNpYIDLDL (SEQ ID N.: 2), il complesso della rivendicazione 8 o la composizione farmaceutica della rivendicazione 9, per l?utilizzo come medicamento, preferibilmente per l?uso: - nel trattamento dei disordini mieloproliferativi dell?infanzia, preferibilmente leucemia mielomonocitica giovanile (JMML), sindromi mielodisplastiche pediatriche (ad esempio RAEB), leucemie infantile [ad esempio leucemia monocitica acuta (AMoL, FAB M5) e leucemia linfoblastica acuta (ALL), sottotipo ?common?], sindromi mielodisplastiche, leucemia mieloide e linfoblastica dell?adulto, tumori solidi pediatrici o dell?adulto, associati con un?attivit? aberrante di SHP2, dovuta alla presenza di mutazioni somatiche attivanti di PTPN11, ad esempio neuroblastoma, glioma, rabdomiosarcoma embrionale, cancro ai polmoni, cancro al colon e melanoma, - nel trattamento di tumori associati all?iperattivazione delle cascate di trasduzione del segnale regolate da SHP2 (RAS-MAPK e PI3K-AKT-mTOR), ad esempio tumori di colon, collo uterino, endometrio, pancreas, intestino crasso e tenue, pelle, prostata, testa e collo e polmoni, - nel trattamento delle manifestazioni cliniche post natali delle RASopatie, causate da mutazioni germinali di PTPN11 (sindrome di Noonan e sindrome di Noonan con lentiggini multiple, anche detta sindrome LEOPARD), come ad esempio la cardiomiopatia ipertrofica, la bassa statura e la predisposizione a certe neoplasie maligne, in particolare la JMML, - nell?immunoterapia del cancro, per evitare l?evasione immunitaria mediata dall?attivazione da parte di SHP2 delle cascate di trasduzione del segnale dei checkpoint immunitari, come ad esempio ?Programmed Cell Death 1? (PD-1) o ?signal-regulatory protein alpha? (SIRP?)/CD47, modulando in questo modo la risposta immunitaria nel cancro, - come un inibitore competitivo del ?cytotoxin-associated gene A? (CagA) nel carcinoma gastrico mediato dall?H. pylori.
11. Uso del peptide, secondo una qualunque delle rivendicazioni 1-7, del peptide GLNpYIDLDL (SEQ ID N.: 2), del complesso della rivendicazione 8 o della composizione farmaceutica della rivendicazione 9 per investigare in vitro o ex vivo il ruolo delle interazioni di SHP2 con i suoi partner proteici, nel controllo della funzione di SHP2 e le conseguenze della sua disregolazione nelle cascate di trasduzione del segnale dipendenti da SHP2.