IT201900008910A1

IT201900008910A1 - Complesso tra un idrolizzato di lattoferrina e una silice, processo di produzione dello stesso, e relativi usi.

Info

Publication number: IT201900008910A1
Application number: IT102019000008910A
Authority: IT
Inventors: Lucio Lenzi; Morena Restani; Mirco Grossi; Claudio Angelinetta
Original assignee: L I Co Rice S R L
Priority date: 2019-06-13
Filing date: 2019-06-13
Publication date: 2020-12-13
Also published as: WO2020250195A1

Description

COMPLESSO TRA UN IDROLIZZATO DI LATTOFERRINA E UNA SILICE, PROCESSO DI PRODUZIONE DELLO STESSO, E RELATIVI USI.

La presente invenzione concerne un complesso tra un idrolizzato di lattoferrina e una silice, un processo per la sua produzione, e relativi usi.

E' ben noto che l'igiene orale è un fattore determinante nella prevenzione di patologie dell'apparato dentale, quali carie, gengiviti, parodontiti, perimplantiti, ecc.

E' noto che la parodontite è una malattia infiammatoria cronica caratterizzata dalla distruzione delle strutture di supporto del dente (legamento parodontale, osso alveolare). La parodontite ha una prevalenza molto elevata nella popolazione generale (attestata intorno al 10-15% degli adulti) ed induce numerosi effetti negativi sulla qualità della vita.

La perimplantite è invece un processo infiammatorio che colpisce i tessuti intorno ad un impianto osteointegrato portando ad una perdita del tessuto osseo di sostegno e quindi dell'impianto stesso. La causa può essere infettiva, oppure può essere dovuta a un'errata passivazione implantoprotesica (trauma occlusale), anche se clinicamente si possono riscontrare entrambe le cause. L'esame radiografico permette di distinguere facilmente una perimplantite da trauma occlusale da una batterica.

Per prevenire o rallentare l'evolversi di tali patologie, una igiene orale particolarmente accurata diventa critica in persone affette da disfunzioni o patologie, in particolare il diabete, che incrementano lo stress ossidativo nel cavo orale.

Dal punto di vista clinico, il diabete mellito è un gruppo clinicamente e geneticamente eterogeneo di disordini metabolici caratterizzati da elevati livelli di glucosio nel sangue (iperglicemia). L’iperglicemia può essere diretta conseguenza di un deficit di secrezione insulinico determinato dalla disfunzione delle cellule β pancreatiche o della resistenza allo stesso ormone da parte dei tessuti epato-muscolari, o ancora una combinazione dei suddetti fenomeni. Questo disordine metabolico è frequentemente associato ad alterazione del metabolismo degli adipociti e può essere considerato a tutti gli effetti una sindrome. L’iperglicemia cronica conduce, nel lungo periodo, a danni multipli ad organi differenti quali ad esempio cuore, occhi, reni, nervi, sistema vascolare.

Numerosi recenti studi epidemiologici confermano che il diabete può essere considerato come un importante fattore di rischio per lo sviluppo di malattia parodontale. Le evidenze scientifiche degli ultimi 15-20 anni supportano una significativa associazione indipendente tra infiammazione parodontale e stato glicemico. La suscettibilità all’insorgenza di parodontite risulta tre volte maggiore nei pazienti affetti da diabete mellito

Recenti dati forniti dall’Organizzazione Mondiale della Sanità evidenziano come l’incidenza della patologia diabetica sia drammaticamente in aumento. Una diretta conseguenza di questo dato è il parallelo aumento di pazienti affetti da malattia parodontale, essendo il diabete un fattore di rischio per lo sviluppo di parodontite, indipendentemente dalla riduzione della abitudine al fumo e da un miglioramento dell’igiene orale.

Diabete mellito e malattia parodontale sono entrambe caratterizzate da uno stato di infiammazione sistemica. L’iperglicemia cronica, così come la parodontite, inducono l’iper-attivazione del sistema immunitario con conseguente iperproduzione di molecole pro-infiammatorie (TNF-a, IL6, IL1). Queste, entrando nel circolo sistemico, possono incidere negativamente sull’organismo. In questo senso, l’infiammazione cronica dei tessuti gengivali può peggiorare il profilo glicemico e clinico del paziente affetto da diabete mellito. Questa relazione deve quindi essere considerata, alla luce di quanto premesso, di natura bidirezionale.

Un ulteriore aspetto legato alla parodontite cronica è l’alterazione del sistema immunitario in termini di equilibrio tra agenti antiossidanti e specie reattive dell’ossigeno a favore di queste ultime. Lo stress ossidativo può aggravare le manifestazioni cliniche del paziente diabetico. D’altra parte, il diabete è a sua volta causa di stress ossidativo e ciò può giustificare il fatto che i quadri clinici derivanti dalla parodontite siano particolarmente aggressivi nei pazienti diabetici. L’elevata prevalenza e severità della malattia parodontale nei pazienti diabetici possono essere dovute ad uno stato di iperglicemia cronica e un accumulo di prodotti finali di glicazione avanzata (AGEs). Lo stress ossidativo protratto nei tessuti gengivali potrebbe giustificare la distruzione aggressiva dei tessuti parodontali che si riscontra nei pazienti diabetici. L’interazione tra AGEs e i loro recettori cellulari induce un aumento dello stress ossidativo che può contribuire all’iperattivazione cronica dei monociti, all’attivazione del sistema NF-Kb con conseguente espressione di mRNAs pro-infiammatori.

La lattoferrina è una glicoproteina ad azione antimicrobica e ferro-trasportatrice, naturalmente presente in vari fluidi biologici dei mammiferi, quali latte, saliva, lacrime. E' inoltre presente nei granulociti neutrofili, che sono cellule immunitarie con funzioni di difesa da infezioni batteriche e fungine. La lattoferrina è considerata un prodotto particolarmente utile per le sue proprietà antiossidanti, immunomodulatrici e antinfettive.

Tramite digestione pepsinica della lattoferrina, è possibile ottenere peptidi, che vengono comunemente indicati come idrolizzati della lattoferrina o anche, più semplicemente, come lattoferricina, i quali, pur avendo peso molecolare assai inferiore rispetto alla proteina di partenza, contengono la sequenza N-terminale della lattoferrina e ne mantengono l'attività biologica, anzi in taluni casi tale attività risulta potenziata. A tale proposito si veda ad esempio l'articolo di J. L. Gifford et al, Cell. Mol. Life Sci.

62 (2005), 2599-2598, dove si descrive la lattoferricina e le sue proprietà antimicrobiche, antivirali, antitumorali e immunologiche.

Nella domanda di brevetto WO 2016/046108 si descrive una composizione contenente un idrolizzato di lattoferrina e glicerofosforilinositolo o suoi sali e/o verbascoside o estratti che lo contengono, e il suo utilizzo per la prevenzione e/o il trattamento di infiammazioni e infezioni dermatologiche, otologiche e stomatologiche. Tale composizione può trovare applicazione per il trattamento di diverse infezioni, soprattutto in campo veterinario, che possono causare patologie delle orecchie, della pelle o di tipo stomatologico.

Gli idrolizzati della lattoferrina non hanno trovato al momento largo impiego, principalmente a causa della loro scarsa stabilità e compatibilità con gli eccipienti normalmente utilizzati in campo farmaceutico o para-farmaceutico (ad esempio dentifrici, colluttori, integratori alimentari, e simili). Gli idrolizzati della lattoferrina inoltre hanno una biodisponibilità relativamente bassa quando applicati per via topica e sono soggetti a fenomeni di degradazione ossidativa.

La Richiedente si è dunque posta il problema di ottenere una composizione contenente un idrolizzato di lattoferrina che presenti elevata stabilità e biodisponibilità, così da esplicare un'azione antibatterica e antiossidante che sia efficace e duratura nel tempo.

Tale problema e altri che verranno meglio illustrati in seguito sono stati risolti tramite l'associazione di un idrolizzato di lattoferrina con almeno una silice avente elevata area superficiale specifica, la quale è in grado di complessarsi con il peptide per formare un complesso stabile che aumenta e preserva per tempi lunghi l'attività antiossidante e antibatterica dell'idrolizzato di lattoferrina.

Secondo un primo aspetto, la presente invenzione riguarda pertanto un complesso tra almeno un idrolizzato di lattoferrina e almeno una silice avente un'area superficiale specifica compresa tra 100 m<2>/g e 1000 m<2>/g, preferibilmente tra 150 m<2>/g e 700 m<2>/g (area BET, misurata secondo la norma ISO 9277-2010), detto complesso essendo ottenibile tramite addizione di detto idrolizzato di lattoferrina a detta silice in forma di sol-gel con un solvente acquoso, e successivo essiccamento del sol-gel.

Preferibilmente, l’essiccamento viene realizzato tramite trattamento con CO2 supercritica oppure tramite liofilizzazione, come meglio illustrato nel seguito.

Secondo un altro aspetto, la presente invenzione riguarda una composizione farmaceutica o nutraceutica, che comprende detto complesso e almeno un eccipiente fisiologicamente accettabile. Preferibilmente, la composizione farmaceutica è per uso orale oppure per uso topico.

Secondo un altro aspetto, la presente invenzione riguarda una composizione per l'igiene orale, in particolare per l'igiene orale di pazienti diabetici, che comprende detto complesso e almeno un eccipiente fisiologicamente accettabile.

Secondo un altro aspetto, la presente invenzione riguarda un complesso come sopra definito per uso, tramite applicazione topica, nella prevenzione o nel trattamento di patologie dell'apparato dentario, in particolare per l'uso nella prevenzione o nel trattamento di parodontosi o perimplantiti, preferibilmente in pazienti affetti da diabete.

Secondo un altro aspetto, la presente invenzione riguarda un complesso come sopra definito per uso, tramite applicazione topica o somministrazione orale, nella prevenzione o nel trattamento di infiammazioni dell'apparato urogenitale, in particolare della vagina, quali vaginosi o vaginiti di origine batterica o virale, oppure infezioni da lieviti (candidosi).

Secondo un altro aspetto, la presente invenzione riguarda un complesso come sopra definito per uso, tramite somministrazione orale, nella prevenzione o nel trattamento del dismicrobismo intestinale, cioè per ristabilire l'equilibrio del microbioma intestinale.

Secondo un altro aspetto, la presente invenzione riguarda un complesso come sopra definito per uso, tramite applicazione topica, nel trattamento di lesioni cutanee, in particolare piaghe, ulcere o erosioni cutanee.

Per quanto riguarda gli idrolizzati della lattoferrina, si tratta di prodotti ben noti nella tecnica, che possono essere preparati secondo tecniche note, in particolare tramite trattamento di una lattoferrina con un enzima proteolitico, ad esempio una pepsina. La lattoferrina di partenza può essere di origine naturale o sintetica, e può includere diverse forme, sia monomeriche che oligomeriche, eventualmente già legate al ferro (ololattoferrina) oppure non legate al ferro (apolattoferrina). Ulteriori dettagli sugli idrolizzati della lattoferrina e sulla loro preparazione sono riportati ad esempio nei seguenti articoli: Wakabayashi H., et al, Current Pharm. Design, 9(16) (2003), 1277-87; Théolier J., et al, Dairy Science & Technology, 94(2) (2013), 181-193; Eliassen L.T., et al, Anticancer Res., 22(5) (2002 Sep-Oct), 2703-10. I peptidi risultanti dalla proteolisi della lattoferrina hanno in genere un numero di unità amminoacidiche da 5 a 30, preferibilmente da 5 a 15. Per quanto riguarda la silice, questa può essere ottenuta per sintesi oppure tramite trattamento di materiali di origine naturale, come meglio illustrato nel seguito. Tra le silici sintetiche, particolarmente preferite sono le silici fumé (fumed silica) oppure le silici precipitate. Preferibilmente, la silice è una silice idrofila.

Per gli scopi della presente invenzione, particolarmente preferite sono le silici in forma di aerogel. Si tratta di silici amorfe caratterizzate, oltre che da alta area superficiale specifica, anche da una porosità molto elevata e una densità molto bassa. La porosità è in genere superiore al 85% e può raggiungere anche valori del 95-99%, e la densità è tipicamente da 0,003 g/cm<3 >a 0,8 g/cm<3>, preferibilmente da 0,005 g/cm<3 >a 0,3 g/cm<3>.

Particolarmente preferita è una silice in forma di aerogel ottenuta da scarti vegetali, in particolare dalla lolla derivante dalla lavorazione di cerali, quali riso, avena, frumento, segale, farro. Tale silice, che è ottenuta da fonti rinnovabili, è caratterizzata da elevata biocompatibilità e presenta un'alta area superficiale e una struttura altamente porosa, a pori aperti, che favorisce l'interazione con l'idrolizzato di lattoferrina. Particolarmente preferita è la silice ottenuta dalla lolla di riso.

La silice in forma di aerogel da scarti vegetali può essere ottenuta tramite un processo multistadio che comprende: combustione dello scarto vegetale, trattamento delle ceneri così ottenute con una soluzione alcalina (NaOH) con ottenimento di un silicato (di sodio), trattamento di quest'ultimo con una soluzione acida (HCl) con formazione di un sol-gel umido, ed infine essiccamento del sol-gel umido, preferibilmente tramite trattamento con CO2 supercritica. Ulteriori dettagli sulla preparazione di tali forme di silice sono riportati, ad esempio, nella domanda di brevetto WO 2016/193877 e nell'articolo di R. S. Kumar et al, Int. J. Chem. Eng. and Appls., Vol.

4, No. 5, October 2013.

Preferibilmente, nel complesso in accordo con la presente invenzione, detta almeno un idrolizzato di lattoferrina e detta almeno una silice sono presenti in un rapporto in peso da 0,05:1 a 10:1, più preferibilmente da 0,1:1 a 5:1.

Preferibilmente, la composizione per l'igiene orale in accordo con la presente invenzione comprende:

da 10% a 70% in peso di almeno una silice;

da 0,05% a 15% in peso di almeno un idrolizzato di lattoferrina;

da 25% a 80% in peso di una fase acquosa.

Più preferibilmente, la composizione in accordo con la presente invenzione comprende:

da 20% a 50% in peso di almeno una silice;

da 0,2% a 10% in peso di almeno un idrolizzato di lattoferrina;

da 40% a 75% in peso di una fase acquosa.

Da notare che le quantità di silice sopra riportate sono riferite alla quantità di silice complessivamente presente nella composizione, sia essa in forma complessata o non complessata con l'idrolizzato di lattoferrina.

Secondo una forma preferita di realizzazione, la composizione secondo la presente invenzione comprende il complesso tra almeno un idrolizzato di lattoferrina e almeno una silice come sopra definito in miscela con una silice idrofila non complessata con un idrolizzato di lattoferrina, in particolare una silice di sintesi, preferibilmente una silice idrofila fumé. L’aggiunta di una silice non complessata ha principalmente lo scopo di stabilizzare ulteriormente il complesso tra silice e l'idrolizzato di lattoferrina, fungendo sostanzialmente da barriera rispetto all’interazione con altri ingredienti della composizione che potrebbero destabilizzare il complesso stesso.

Il rapporto in peso tra silice complessata con l'idrolizzato di lattoferrina e silice idrofila non complessata con l'idrolizzato di lattoferrina è preferibilmente compreso tra 1:200 e 1:1, più preferibilmente tra 1:150 e 1:5.

Per quanto riguarda la fase acquosa, questa preferibilmente comprende una miscela di acqua e un poliolo, più preferibilmente glicerolo o sorbitolo. Il rapporto in peso tra acqua e poliolo è preferibilmente compreso tra 1:20 e 1:1, più preferibilmente tra 1:10 e 1:2.

La Richiedente ha trovato che il complesso tra idrolizzato di lattoferrina e silice secondo la presente invenzione consente di ottenere un effetto antibatterico e antiossidante migliorato rispetto all'idrolizzato di lattoferrina utilizzato da solo alle medesime concentrazioni, il quale viene esplicato per tempi più lunghi, così da prolungare l'effetto senza dover ripetere l'applicazione della composizione troppo spesso.

Il complesso in accordo con la presente invenzione viene preferibilmente preparato tramite un processo che comprende:

preparare una silice avente un'area superficiale specifica compresa tra 100 m<2>/g e 1000 m<2>/g, preferibilmente tra 150 m<2>/g e 700 m<2>/g (area BET, misurata secondo la norma ISO 9277-2010) in forma solgel con un solvente acquoso;

addizionare alla silice in forma di sol-gel almeno un idrolizzato di lattoferrina;

sottoporre la miscela così ottenuta ad una fase di essiccamento.

L’addizione del idrolizzato di lattoferrina alla silice in forma di sol-gel può essere realizzata tramite aggiunta graduale del peptide al sol-gel e miscelazione meccanica fino all’ottenimento di una dispersione omogenea. La temperatura di miscelazione è in genere mantenuta tra 15°C e 50°C.

Preferibilmente, l’essiccamento viene realizzato tramite trattamento con CO2 supercritica oppure tramite liofilizzazione. In tal modo viene garantita la complessazione tra la silice e l'idrolizzato di lattoferrina, senza che quest’ultimo subisca modifiche strutturali che ne comprometterebbero la funzionalità.

Il complesso tra idrolizzato di lattoferrina e silice secondo la presente invenzione può essere trattato con almeno un poliolo, preferibilmente glicerolo o sorbitolo. Il poliolo ha la funzione di ricoprire le particelle di silice caricate con l'idrolizzato di lattoferrina, stabilizzandone ulteriormente la struttura.

Come solvente acquoso è possibile impiegare acqua, eventualmente in miscela con almeno un solvente organico solubile in acqua, ad esempio etilacetato o acetone.

Preferibilmente, la fase di essiccamento con CO2 supercritica viene condotta in autoclave, ad una temperatura tra 15°C e 60°C e una pressione tra 80 bar e 150 bar. Allo scopo di evitare la degradazione dell'idrolizzato di lattoferrina, è preferibile utilizzare una temperatura non superiore a 60°C. Il trattamento viene condotto per un tempo preferibilmente compreso tra 2 ore e 10 ore, più preferibilmente tra 4 ore e 8 ore.

Preferibilmente, la fase di essiccamento tramite liofilizzazione (crioessiccamento) viene condotta tramite raffreddamento sottovuoto ad una temperatura tra −80°C e −30°C e successivo riscaldamento, sempre sottovuoto, ad una temperatura non superiore a 60°C, preferibilmente tra 20°C e 50°C. La pressione durante la liofilizzazione viene preferibilmente mantenuta tra 0,1 bar e 0,8 bar.

La composizione per l’igiene orale secondo la presente invenzione comprende, oltre al complesso, almeno un eccipiente fisiologicamente accettabile. Ciò allo scopo di ottenere un prodotto per l’igiene orale in forme diverse, ad esempio di dentifricio, collutorio, gel, gomma da masticare, pastiglia orodispersibile, tintura gengivale, e simili.

A tale scopo, la composizione secondo la presente invenzione può comprendere ingredienti di comune utilizzo nel campo dei prodotti per l'igiene dentale, quali ad esempio: agenti abrasivi in forma particellare, umettanti, leganti, inspessenti, regolatori della viscosità, tensioattivi, edulcoranti, aromatizzanti, conservanti, agenti anti-placca, coloranti, ecc.

Per quanto riguarda le composizioni farmaceutiche che includono il complesso secondo la presente invenzione, queste possono presentarsi in diverse forme, quali compresse, capsule, sospensioni acquose, sciroppi, supposte, e contenere i comuni eccipienti utilizzati per tali prodotti.

Per quanto riguarda le composizioni nutraceutiche che includono il complesso secondo la presente invenzione, queste possono essere in forma di capsule, compresse, formulazioni liquide, barrette, e similari. Esse possono includere, oltre al complesso, acqua e altri prodotti aventi valore nutrizionale, quali carboidrati, lipidi, proteine, vitamine, sali minerali e simili.

Nelle suddette composizioni, il complesso in accordo con la presente invenzione può essere combinato con altri prodotti biologicamente attivi, ad esempio con glicerofosforilinositolo o suoi sali, il quale ha la funzione principale di aumentare l'effetto antibatterico.

Nel caso di composizioni nutraceutiche, particolarmente adatte nella prevenzione o nel trattamento del dismicrobismo intestinale, queste possono contenere, oltre al complesso, uno o più ceppi di microorganismi utili per il microbioma intestinale, quali Lactobacilli e simili (ad esempio Lactobacillus casei).

Per quanto riguarda l'utilizzo del complesso in accordo con la presente invenzione per applicazioni topiche, il complesso può essere formulato in forma di sospensione, gel, tintura, crema, e simili, con gli eccipienti comunemente utilizzati per tali prodotti. La formulazione può eventualmente contenere un regolatore di pH, così da garantire un valore di pH fisiologico, ad esempio acido lattico che fornisce un pH attorno a 3,4/4, tipico dell'ambiente vaginale.

I seguenti esempi di realizzazione sono forniti a mero scopo illustrativo della presente invenzione e non devono essere intesi in senso limitativo dell’ambito di protezione definito dalle accluse rivendicazioni.

ESEMPI 1-3.

Sono state preparate le composizioni riportate in Tabella 1 (% in peso sul totale della composizione):

TABELLA 1

(*) comparativo

- silice idrofila: silice fumé idrofila avente area superficiale specifica pari a circa 200 m<2>/g (area BET, misurata secondo la norma ISO 9277-2010) (prodotto commerciale Aerosil™ 200 della Evonik);

- silice da lolla di riso: silice in forma di aerogel avente area superficiale specifica pari a circa 550 m<2>/g (area BET, misurata secondo la norma ISO 9277-2010) e una densità pari a circa 0,050 g/cm<3>;

- idrolizzato di lattoferrina: peptide avente un numero di unità amminoacidiche da 5 a 10, ottenuto tramite trattamento di lattoferrina bovina con pepsina.

La silice da lolla di riso e l'idrolizzato di lattoferrina sono stati precedentemente complessati tramite il seguente processo. La silice da lolla di riso è stata preparata come descritto nell’Esempio 1 di WO 2016/193877, con la differenza che, dopo aver ottenuto il sol-gel di silice, questo è stato addizionato con l'idrolizzato di lattoferrina e quindi sottoposto ad essiccamento con CO2 supercritica come descritto nel medesimo Esempio 1, ad eccezione del fatto che il sol gel di silice addizionato con l'idrolizzato di lattoferrina è stato trattato in autoclave ad una temperatura di 50°C e una pressione di 100 bar, per un tempo pari a 6 ore, così da ottenere l’essiccamento del sol-gel senza causare la degradazione del peptide.

Il complesso così ottenuto e gli altri ingredienti della composizione sono stati miscelati in una beuta con l’ausilio di un’ancoretta magnetica, fino all’ottenimento di una formulazione omogenea. Da notare che la silice idrofila è stata addizionata tal quale, cioè non complessata con l'idrolizzato di lattoferrina.

Su tali composizioni sono state verificate le proprietà come antiossidante e come antibatterico, valutando la variazione dell'efficacia nel tempo.

Attività antiossidante (scavenger).

L’attività antiossidante (scavenger per i radicali liberi) delle composizioni di cui sopra è stata valutata misurando la capacità di contrastare la formazione di radicali liberi (ROS) in colture cellulari di cheratinociti umani. A tale scopo i cheratinociti sono stati trattati con concentrazioni scalari del prodotto (diluizioni 1:2 a partire da 1,0 mg/ml) e quindi esposti a raggi UVA a temperatura ambiente per stimolare la produzione di ROS. Cellule non trattate rappresentano il controllo negativo. Parallelamente è stato condotto un saggio di captazione del rosso neutro (NRU) prima e dopo irraggiamento allo scopo di verificare che nelle condizioni sperimentali la vitalità cellulare non diminuisca significativamente. I risultati del test NRU prima dell’esposizione ai raggi UVA hanno dimostrato l’assenza di inibizione della vitalità cellulare a tutte le concentrazioni utilizzate. Quindi per il dosaggio dei ROS sono state prese in considerazione tutte le concentrazioni.

I risultati ottenuti dal dosaggio dei ROS hanno dimostrato l’azione antiossidante, espressi come riduzione % dei ROS rispetto al controllo negativo.

Più in dettaglio, i materiali e le condizioni operative utilizzate sono riportate nel seguito.

Sono stati utilizzati cheratinociti umani (Huker) coltivati in DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle medium) contenente 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di antibiotici (penicillina e streptomicina), incubati in condizioni di coltura standard (37°C, 5% CO2). Sono state applicate le buone pratiche per la coltivazione di cellule.

Allo scopo di simulare una condizione di stress ambientale capace di indurre la formazione di ROS, le cellule sono state sottoposte ad irraggiamento con raggi UVA. La lampada utilizzata negli esperimenti era un simulatore di luce solare che riproduce lo spettro solare con un range di emissione costante negli UVA compreso tra 315 nm e 400 nm e con una radianza di 1,7 mW/cm<2>. L'emissione di UVB viene schermata in maniera appropriata per evitare danni citotossici diretti alle colture cellulari.

Sono stati valutati gli effetti sulla produzione dei ROS a diversi tempi di irraggiamento: 4, 8, 12, 16 e 20 min.

Ciascun campione delle composizioni in esame è stato sciolto in acqua e quindi diluito in terreno di crescita fino alle concentrazioni finali desiderate comprese tra 0,0156 e 1,0 mg/ml (diluizioni 1:2). Come tracciante fluorimetrico è stato utilizzato 2’,7’-diclorofluorescina diacetato (DCFDA), sciolto in dimetilsolfossido (DMSO) alla concentrazione di 50 mM e quindi diluito nell’apposito tampone fino alla concentrazione di utilizzo di 250 µM.

Ciascun campione di cellule (cheratinociti umani) è stato seminato in piastre da 96 pozzetti. Una volta raggiunto un monostrato semiconfluente, le cellule sono state lavate con tampone fosfato (PBS) e quindi incubate con la soluzione di DCFDA per 20 min in condizioni di coltura standard. La DCFDA è stata quindi rimossa, le cellule sono state lavate in PBS, trattate con le diverse concentrazioni della composizione in esame e con il controllo positivo, incubate per 20 min a condizioni standard e quindi irraggiate con UVA per 4, 8, 12, 16 e 20 min. Al termine di ogni periodo di irraggiamento è stata eseguita una lettura al fluorimetro alla lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e di emissione di 530 nm.

Allo scopo di verificare che la vitalità cellulare non vari significativamente in presenza della composizione in esame e nelle condizioni sperimentali applicate, è stato eseguito il saggio di captazione del rosso neutro (NRU) prima e dopo irraggiamento delle cellule. Il rosso neutro (NR) è una sonda debolmente cationica che passa attraverso la membrana cellulare per diffusione passiva non ionica e si concentra nei lisosomi, dove si lega mediante interazioni elettrostatiche ai siti anionici della matrice. La captazione di NR dipende dalla capacità delle cellule di creare gradienti di pH, determinato a sua volta dalla produzione di ATP. Il NR si accumula quindi solo nelle cellule vive, da cui viene estratto con una soluzione acida di etanolo: l’assorbanza della soluzione, misurata allo spettrofotometro, è proporzionale alla vitalità cellulare.

Dopo aver delicatamente rimosso il mezzo, le cellule sono state trattate con il rosso neutro (NR) (50 µg/ml) e incubate per 3 ore a condizioni standard. Le cellule sono state successivamente lavate con PBS per eliminare i residui di colorante e il NR è stato estratto. Le piastre sono state agitate delicatamente per almeno 10 min (per favorire la dissoluzione di NR) ed è stata quindi determinata l’assorbanza (densità ottica, OD) mediante lettura spettrofotometrica a 540 nm. L’assorbanza misurata a 540 nm è proporzionale alla vitalità cellulare. Le percentuali sono state calcolate in base ai valori di assorbanza a 540 nm e considerando come 100% l’assorbanza del controllo negativo (cellule non trattate). In assenza di irraggiamento UVA la vitalità cellulare dei cheratinociti trattati con il prodotto risultava paragonabile a quella dei cheratinociti non trattati per tutte le concentrazioni testate, di conseguenza tutte le concentrazioni sono state prese in considerazione nel dosaggio dei ROS.

Attività antimicrobica.

Ciascuna composizione è stata testata per verificare l'attività antimicrobica rispetto a E. coli. Una quantità pari a 9 g della composizione è stata addizionata a 1 ml di inoculo di E. coli (ATCC 8739) in modo da ottenere una carica finale di circa 10<5 >CFU. Dopo tempi di contatto crescenti (1, 4, 8 e 24 ore), 0,5 ml della sospensione sono stati prelevati per effettuare la conta su piastra (metodo di spatolamento superficiale). E' stata quindi determinata la variazione % di carica batterica rispetto a quella iniziale.

I risultati sono riportati nelle seguenti tabelle, dove la colonna di sinistra riporta i tempi (in minuti per la Tabella 2 e in ore per la Tabella 3). I medesimi risultati sono riportati nei grafici in allegato come Fig. 1 e Fig. 2.

TABELLA 2

(effetto antiossidante: riduzione % ROS)

Claims

(*) comparativo TABELLA 3 (effetto antibatterico: riduzione % carica batterica) ;(*) comparativo Dai risultati ottenuti, appare evidente che il complesso tra idrolizzato di lattoferrina e silice consente di aumentare in modo più graduale e di mantenere nel tempo l'efficacia sia in termini di effetto antiossidante che di effetto antibatterico, rispetto all'idrolizzato di lattoferrina utilizzato da solo. RIVENDICAZIONI 1. Complesso tra almeno un idrolizzato di lattoferrina e almeno una silice avente un'area superficiale specifica compresa tra 100 m<2>/g e 1000 m<2>/g, preferibilmente tra 150 m<2>/g e 700 m<2>/g (area BET, misurata secondo la norma ISO 9277-2010), detto complesso essendo ottenibile tramite addizione di detto idrolizzato di lattoferrina a detta silice in forma di sol-gel con un solvente acquoso, e successivo essiccamento del sol-gel.
2. Complesso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta almeno una silice è una silice sintetica, scelta tra silici fumé (fumed silica) e silici precipitate.
3. Complesso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta almeno una silice è in forma di aerogel.
4. Complesso secondo la rivendicazione 3, in cui detta almeno una silice in forma di aerogel ha una porosità superiore al 85% e una densità da 0,003 g/cm<3 >a 0,8 g/cm<3>, preferibilmente da 0,005 g/cm<3 >a 0,3 g/cm<3>.
5. Complesso secondo la rivendicazione 3 o 4, in cui detta almeno una silice è ottenuta da scarti vegetali, in particolare dalla lolla derivante dalla lavorazione di cerali, preferibilmente del riso.
6. Complesso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui detta almeno un idrolizzato di lattoferrina e detta almeno una silice sono presenti in un rapporto in peso da 0,05:1 a 10:1, preferibilmente da 0,1:1 a 5:1.
7. Complesso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in forma di particelle trattate superficialmente con almeno un poliolo, preferibilmente glicerolo o sorbitolo.
8. Processo per la preparazione di un complesso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, che comprende: preparare una silice avente un'area superficiale specifica compresa tra 100 m<2>/g e 1000 m<2>/g, preferibilmente tra 150 m<2>/g e 700 m<2>/g (area BET, misurata secondo la norma ISO 9277-2010) in forma solgel con un solvente acquoso; addizionare alla silice in forma di sol-gel almeno un idrolizzato di lattoferrina; sottoporre la miscela così ottenuta ad una fase di essiccamento.
9. Processo secondo la rivendicazione 8, che comprende inoltre trattare la miscela essiccata tramite aggiunta di almeno un poliolo, preferibilmente glicerolo o sorbitolo.
10. Processo secondo la rivendicazione 8 o 9, in cui la fase di essiccamento viene realizzata tramite trattamento con CO2 supercritica.
11. Processo secondo la rivendicazione 8 o 9, in cui la fase di essiccamento viene realizzata tramite liofilizzazione.
12. Processo secondo la rivendicazione 10, in cui la fase di essiccamento con CO2 supercritica viene condotta in autoclave, ad una temperatura tra 15°C e 60°C e una pressione tra 80 bar e 150 bar.
13. Processo secondo la rivendicazione 11, in cui la fase di essiccamento tramite liofilizzazione viene condotta tramite raffreddamento sottovuoto ad una temperatura tra −80°C e −30°C e successivo riscaldamento, sempre sottovuoto, ad una temperatura non superiore a 60°C, preferibilmente tra 20°C e 50°C.
14. Processo secondo la rivendicazione 13, in cui la liofilizzazione viene realizzata ad una pressione tra 0,1 bar e 0,8 bar.
15. Composizione per l'igiene orale, che comprende almeno un complesso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, e almeno un eccipiente fisiologicamente accettabile.
16. Composizione secondo la rivendicazione 15, in cui detto almeno un complesso è in miscela con almeno una silice idrofila non complessata con un idrolizzato di lattoferrina, preferibilmente una silice idrofila fumé.
17. Composizione secondo la rivendicazione 16, comprendente: da 10% a 70% in peso, preferibilmente da 20% a 50% in peso, di almeno una silice; da 0,05% a 15% in peso, preferibilmente da 0,2% a 10% in peso, di almeno un idrolizzato di lattoferrina; da 25% a 80% in peso, preferibilmente da 40% a 75% in peso, di una fase acquosa.
18. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 15 a 17, in cui la fase acquosa comprende una miscela di acqua e un poliolo, preferibilmente glicerolo o sorbitolo.
19. Complesso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 per uso, tramite applicazione topica, nella prevenzione o nel trattamento di patologie dell'apparato dentario, in particolare per uso nella prevenzione o nel trattamento di parodontosi