IT201800021157A1 - Metodo per rilevare la presenza e la quantita’ del recettore lrp8 e dei suoi frammenti proteolitici, kit di rilevamento e relativi anticorpi - Google Patents

Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo: “METODO PER RILEVARE LA PRESENZA E LA QUANTITA’ DEL RECETTORE

LRP8 E DEI SUOI FRAMMENTI PROTEOLITICI, KIT DI RILEVAMENTO E

RELATIVI ANTICORPI"

SETTORE TECNICO DELL’INVENZIONE

[001] La presente invenzione si riferisce ad un metodo per rilevare la presenza e la quantità di Low-Density Lipoprotein Receptor-Related Protein 8 (LRP8) e dei suoi frammenti proteolitici carbossi-terminali in campioni biologici isolati dal corpo umano. L’invenzione è relativa anche ad un kit per il rilevamento di LRP8 e dei suoi frammenti, nonché agli anticorpi usati nel kit e diretti contro LRP8 ed i suoi frammenti, da impiegare nel metodo e per la diagnosi di neurodegenerazione in patologie quali la malattia di Alzheimer, la sindrome di Down ed i tumori.

STATO DELLA TECNICA ANTERIORE

[002] La malattia di Alzheimer (AD, Alzheimer’s Disease) rientra tra le demenze di tipo degenerativo per cui ha un esordio particolarmente insidioso e non presenta un quadro neurologico elementare specifico. In generale, comunque, l’AD è caratterizzata dalla progressiva estensione di lesioni degenerative neuronali, le cui conseguenze sono il progressivo depauperamento di alcune popolazioni neuronali e la progressiva insufficienza neuro-trasmettitoriale pre-sinaptica. Morfologicamente, l’atrofia cerebrale può determinare riduzioni del peso del cervello superiori a quelle dovute al normale invecchiamento, risparmia le aree proiettive mentre compromette quelle associative.

Istologicamente, si riscontrano degenerazioni endoneuronali, tra le quali la più diffusa è quella neurofibrillare, e degenerazioni extra-neuronali, tra le quali le placche argirofile (o senili) sono quelle più comuni.

[003] I disturbi presentati dai soggetti affetti da AD comprendono disturbi della memoria sia a breve termine (fatti quotidiani) sia a lungo termine. Inoltre, hanno difficoltà nel riportare alla coscienza ed esplicitare eventi del passato oppure si comportano nel presente come in un vissuto passato lontano della loro esistenza. Ulteriori disturbi tipici sono legati al linguaggio orale e scritto che li porta ad avere difficoltà nella pianificazione del discorso, afasie, eloquio spontaneo inappropriato, alessia (incapacità a leggere) e agrafia (incapacità a scrivere); alla difficoltà del riconoscimento dei segni grafici convenzionali e degli oggetti comuni; alle alterazioni della motilità, sensibilità e coordinazione dei movimenti e gesti che portano a difficoltà quotidiane importanti quale, ad esempio, indossare correttamente gli indumenti; alla tendenza a perdersi nei luoghi; alla scarsa capacità di concentrazione; ai disturbi cognitivi.

[004] Tutti i suddetti disturbi, ovviamente, compromettono la vita sociale e lavorativa sia dei soggetti che soffrono di AD sia delle persone che si devono prendere cura di questi, quali i familiari, i “caregivers” (operatori specifici che forniscono assistenza) e gli amici.

[005] È poi da rilevare che, secondo dati statistici, l’incidenza dei casi di AD arriva all’8-10% nei soggetti ultrasessantacinquenni e addirittura al 30-50% degli ultraottantenni, tenendo presente che la vita media umana negli ultimi decenni è aumentata e si aggira attorno a 80-85 anni circa.

[006] Di conseguenza, l‘AD è un problema sociale di notevole rilevanza e, pertanto, oggetto di numerosi studi clinici atti ad identificare precocemente l’insorgenza ed escogitare nuove terapie che possano efficacemente combattere le cause di detta malattia.

[007] Purtroppo, un’identificazione corretta e precoce dell’AD, in particolar modo nelle forme sporadiche e tardive, non sempre può essere formulata, sia per la difficoltà di distinguerne la sintomatologia rispetto ad altre forme di demenza, sia per la mancanza di indicatori e marcatori precisi ed affidabili. In altre parole, attualmente la diagnostica non è in grado di offrire validi ed efficaci metodi di identificazione dell’AD soprattutto negli stati più precoci in modo da poter intervenire il prima possibile. In aggiunta, non sono attualmente a disposizione farmaci efficaci per tale patologia.

[008] In effetti, molti sforzi si sono concentrati nello studio del processamento proteolitico della proteina precursore dell’amiloide (AȕPP), una proteina di membrana di tipo I, da parte degli enzimi ȕ- e Ȗ-secretasi, in quanto la sua alterazione appare la causa scatenante l’AD. Lo scopo, quindi, oggigiorno è quello di trovare in particolare inibitori della Ȗ-secretasi poiché tale complesso enzimatico è considerato un cardine dello sviluppo dell’evoluzione dell’AD. Infatti, sembra che un’alterazione della funzione proteolitica di quest’ultima porti alla produzione di peptidi ȕ-amiloidi neurotossici. Alternativamente, altre linee di ricerca si sono focalizzate sulla produzione di anticorpi monoclonali murini e umanizzati in grado di sviluppare una risposta immunitaria contro Aȕ in modo da bloccarne il potenziale neurotossico. Tali anticorpi però si sono rivelati inefficaci, non sufficientemente specifici (probabilmente a causa della cross-reattività con altre proteine e/o della proteina bersaglio in un contesto di condizioni fisiologiche normali), e hanno indotto anche effetti collaterali importanti. Entrambi gli approcci quindi non sono ad oggi praticabili e terapeuticamente sfruttabili.

[009] Inoltre, è noto che la Ȗ-secretasi è coinvolta anche nell’insorgenza dei tumori. Pertanto, inibitori della Ȗ-secretasi sono un target farmacologico di grande rilevanza anche per tali patologie. In questo caso invece vi sono delle potenziali applicazioni cliniche in fase di studio.

[0010] Analogamente, sono stati riscontrati alti livelli di AȕPP in soggetti affetti da sindrome di Down (DS). Pertanto, una analisi precoce di tale sindrome che sia meno invasiva della villocentesi o amniocentesi e più precisa della translucenza nucale è di altrettanto grande interesse.

RIASSUNTO DELL’INVENZIONE

[0011] Il problema tecnico alla base della presente invenzione è quindi quello di escogitare un metodo per il rilevamento e la quantificazione di marcatori specifici e precoci al fine di fornire valide indicazioni per la diagnosi di tumori e neurodegenerazione nell’AD e nella DS e, conseguentemente, condurre alla identificazione di un target per lo sviluppo di terapie efficaci nel loro trattamento.

[0012] Tale problema è risolto, in accordo con la presente invenzione, da un metodo per il rilevamento e la quantificazione della proteina recettore LRP8 intera, o LRP8-FL (LRP8 Full Length), e dei suoi frammenti C-terminali LICDs (LRP8 IntraCellular Domain) tramite anticorpi selettivamente mirati contro specifiche sequenze bersaglio del recettore stesso o di detti suoi frammenti.

[0013] Un ulteriore oggetto dell’invenzione sono pertanto anticorpi selettivi da impiegare in tale metodo, o loro frammenti leganti i suddetti antigeni.

[0014] Un ancora ulteriore oggetto è un kit per l’attuazione di detto metodo.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE

[0015] Ulteriori caratteristiche e vantaggi del metodo di rilevamento e quantificazione di LRP8 e suoi frammenti secondo l’invenzione diverranno più evidenti dalla seguente descrizione di una forma di realizzazione data a puro titolo di esempio non limitativo con riferimento alle seguenti figure, in cui:

- la figura 1 mostra la sequenza amminoacidica della proteina LRP8;

- la figura 2 mostra la sequenza amminoacidica dell’allineamento della regione C-terminale delle quattro principali differenti isoforme di splicing della proteina LRP8;

- la figura 3 mostra il risultato di una analisi western blotting con diversi anticorpi monoclonali in accordo con la presente invenzione;

- la figura 4 mostra il risultato di una analisi western blotting svolta dopo avere messo a contatto un anticorpo policlonale dell’invenzione con campioni di tessuto cerebrale prelevato sia da pazienti affetti da demenza di Alzheimer sia da soggetti non affetti da Alzheimer;

- la figura 5 mostra un grafico che riporta i dati quantitativi del rapporto tra proteina intera (LRP8-FL) e frammenti C-terminali tra soggetti AD sporadici (SAD), familiari (FAD) e soggetti non affetti (controlli o CTL), in seguito ad analisi densitometrica;

- la figura 6 rappresenta un grafico di confronto tra il rapporto LRP8/LICDs in campioni controllo, SAD e FAD dopo test ELISA;

- la figura 7 mostra due foto del risultato di due immunofluorescenze realizzate impiegando anticorpi secondo la presente invenzione su campioni istologici di soggetti affetti da AD e non affetti da AD;

- le figure 8 e 9 mostrano i risultati di due analisi western blotting che evidenziano la presenza dei frammenti LICDs di LRP8 sia nel liquor (figura 8) sia nel plasma (figura 9).

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

[0016] Le conoscenze attuali indicano che il processamento della proteina AȕPP da parte delle ȕ- e Ȗ-secretasi è certamente un evento cardine nella genesi dell’AD. Probabilmente, la Ȗ-secretasi potrebbe svolgere un ruolo assai rilevante anche nella cancerogenesi, per il processamento di diversi substrati (tra cui AȕPP e LRP8) coinvolti nella promozione o progressione tumorale e nella metastatizzazione.

[0017] In particolare, è noto che la AȕPP è un recettore della superficie cellulare che svolge funzioni fisiologiche sulla superficie dei neuroni rilevanti per la crescita dei neuriti, adesione neuronale e genesi assonica. È anche coinvolta nella motilità cellulare e nella regolazione della trascrizione attraverso interazioni proteina-proteina. Inoltre, agisce come un recettore di membrana della kinesina I mediando il trasporto nell’assone della ȕ-secretasi e della presenilina 1.

[0018] Per quanto riguarda le alterazioni legate al processamento di AȕPP, oltre alla sovraespressione o alle mutazioni specifiche puntiformi del gene AȕPP, forme familiari dell’AD sono causate da mutazioni o delezioni nei geni della presenilina 1 (PSEN1) e 2 (PSEN2): i componenti catalitici dell’enzima proteolitico Ȗ-secretasi. Una delle ipotesi più accreditata sulla causa di dette alterazioni, denominata “ipotesi amiloide”, si basa sul presupposto che il processamento aberrante di AȕPP tramite Ȗ-secretasi induca la formazione di specifici peptidi neurotossici solubili ȕ-amiloidi (Aȕ) i quali, a loro volta, causano neurodegenerazione (Selkoe e Hardy, 2016) che porta alla patogenesi dell’AD.

[0019] Questa teoria, comunque, ha recentemente evidenziato importanti limiti e, in particolare, sono emersi alcuni punti motivo di dibattito: il concetto di “guadagno di funzione” vs. quello di “perdita di funzione” delle preseniline (come componenti catalitiche del complesso enzimatico Ȗ-secretasi) nella genesi dell’AD (Shen, 2014; Shen e Kelleher, 2007); la presenza di numerose e differenti proteine substrati della Ȗ-secretasi che interagiscono con AȕPP, potenzialmente influenzando la formazione di Aȕ (Haapasalo e Kovacs, β011) e la patogenesi dell’AD. Quest’ultima considerazione è suggestiva, ma proprio a causa del numero crescente di substrati della Ȗ-secretasi e la loro reciproca interazione con AȕPP è significativamente inesplorata.

[0020] Pertanto, ad oggi, terapie basate su inibitori della Ȗ-secretasi (volti alla riduzione della produzione di Aȕ), o sul controllo immunologico dei peptidi Aȕ, hanno fallito a livello sia pre-clinico, sia clinico, suggerendo che altre condizioni concorrano allo sviluppo dell’AD in parallelo al processamento di AȕPP tramite Ȗ-secretasi.

[0021] Di conseguenza, allo stato attuale delle conoscenze, non esistono informazioni chiare in merito a quali substrati della Ȗ-secretasi siano effettivamente coinvolti nello sviluppo della AD. Tale condizione non consente quindi di elaborare metodi diagnostici e terapie realmente efficaci nell’individuare precocemente l’AD e nel fornire farmaci mirati ed efficaci.

[0022] Come già anticipato, è noto il coinvolgimento della γ-secretasi anche nello sviluppo dei tumori in quanto alcuni dei suoi substrati (in particolar modo Notch, DCC, caderine, L1-CAM, CD44, etc.) sono direttamente legati a processi della carcinogenesi e/o della metastatizzazione. Di conseguenza, un particolare sforzo scientifico è rivolto verso approcci terapeutici che blocchino l’attività di γ-secretasi, impiegando specifici inibitori o piuttosto “modulatori” anche nei tumori.

[0023] È anche noto che, in generale, sono state riportate nella letteratura scientifica internazionale più di novanta proteine che costituiscono substrati putativi della Ȗ-secretasi, suggerendo un coinvolgimento in una pletora di attività di difficile comprensione.

[0024] L’idea alla base della presente invenzione è stata, quindi, quella di ricercare tra queste proteine quelle che, oltre ad essere substrati della γ-secretasi, fossero espresse a livello neuronale, interagissero anche con l’AβPP, fossero un recettore per l’apoliproteina E (ApoE) e che avessero la porzione transmembrana ed il sito di taglio di y-secretasi più simili all’AβPP.

[0025] Questa idea si è sviluppata in seguito ad una nuova ipotesi rispetto alla cosiddetta “ipotesi amiloide”, in base alla quale esisterebbe un percorso parallelo alla formazione della proteina ȕ-amiloide che coinvolgerebbe differenti substrati della Ȗ-secretasi. Di conseguenza, tra le circa novanta differenti proteine note quali substrati della Ȗ-secretasi, è stata selezionata la proteina LRP8, anche denominata APOER2, la cui sequenza aminoacidica è rappresentata in figura 1 (Uniprot Q14114). Ci si è focalizzati sull’indagine di detta proteina in risposta a differenti condizioni, ossia la valutazione del pattern proteolitico in soggetti affetti AD rispetto a soggetti non affetti da AD.

[0026] L’indagine sulla quantificazione di LRP8 è stata sviluppata mediante un metodo in accordo con la presente invenzione, comprendente una fase di messa a contatto di un campione biologico isolato dal corpo umano con un anticorpo monoclonale o policlonale mirato contro una sequenza amminoacidica specifica della porzione C-terminale di LRP8 identificata dai residui amminoacidici 837-963 (in accordo con la numerazione delle isoforme Q14114-1 e Q14114-4 UniProtKB, figura 2). È stato sorprendentemente osservato che un anticorpo costruito in tal modo è in grado di riconoscere sia la proteina intera del PM di circa 100-105 kDa, sia frammenti Cterminali migranti tra i 18 ed i 75 kDa (substrati di γ-secretasi e possibilmente di altre proteasi) e sia, ancor più sorprendentemente, frammenti più piccoli migranti tra gli 8 ed i 16 kDa in SDS.

[0027] In particolare, la sequenza amminoacidica C-terminale dei residui amminoacidici 837-963 è costituita dalla sequenza:

IALLCMSGYLIWRNWKRKNTKSMNFDNPVYRKTTEEEDEDELHIGRTAQIGHVYPA AISSFDRPLWAEPCLGETREPEDPAPALKELFVLPGEPRSQLHQLPKNPLSELPVVK SKRVALSLEDDGLP (SEQ. I.D.1).

[0028] Preferibilmente, all’interno della suddetta sequenza, sono state identificate sotto-sequenze particolarmente efficaci, scelte nel gruppo costituito dai residui amminoacidici: 837-857 (IALLCMSGYLIWRNWKRKNTK, SEQ I.D. 2), 850-864 (NWKRKNTKSMNFDNP, SEQ I.D.3), 863-878 (NPVYRKTTEEEDEDEL, SEQ I.D.4), 874-887 (DEDELHIGRTAQIG, SEQ I.D. 5), 882-898 (RTAQIGHVYPAAISSFD, SEQ I.D. 6), 898-917 (DRPLWAEPCLGETREPEDPA, SEQ I.D. 7), 915-940 (DPAPALKELFVLPGEPRSQLHQLPKN, SEQ I.D. 8), 940-963 (NPLSELPVVKSKRVALSLEDDGLP, SEQ I.D.9).

[0029] Più preferibilmente, le sequenze dei residui 874-887 (SEQ I.D. 5) e 940-963 (SEQ I.D.9) sono quelle che hanno dato risultati migliori in termini di riconoscimento di frammenti C-terminali, LICDs come definiti nella presente descrizione, e dell’intera proteina LRP8.

[0030] Come qui usato, con il termine "amminoacido" si intende indicare sia amminoacidi naturali che non e analoghi amminoacidici e mimetici. Gli amminoacidi naturali comprendono i 20 (L)-ammino acidi utilizzati durante la biosintesi delle proteine, così come altri, ad esempio la 4-idrossiprolina, idrossilisina, desmosina, isodesmosine, omocisteina, citrullina e ornitina. Gli amminoacidi non naturali includono, ad esempio, i (D)-ammino acidi, norleucina, norvalina, p-fluorofenilalanina, etionina e simili. Gli analoghi di amminoacidi includono forme modificate di amminoacidi naturali e non naturali. Tali modifiche possono includere, per esempio, la sostituzione o rimpiazzo di gruppi chimici e molecole sugli amminoacidi o mediante derivatizzazione dell'amminoacido (es. o-bromo-L-fenilalanina). Amminoacidi mimetici comprendono, per esempio, strutture organiche che presentano proprietà simili funzionalmente, come carica e spaziatura delle cariche, alle caratteristiche dell’amminoacido di riferimento. Ad esempio, una struttura organica che imita arginina (Arg o R) avrebbe una porzione di carica positiva localizzata nello spazio molecolare simile ed avente lo stesso grado di mobilità come il gruppo ε-aminico della catena laterale dell’amminoacido naturale Arg.

[0031] Le sequenze amminoacidiche secondo l’invenzione costituiscono polipeptidi o frammenti, varianti o loro derivati isolati dal corpo umano nel senso che non sono nel loro ambiente naturale. Preferibilmente, derivano da tecnologia ricombinante ed espressione in cellule ospiti dalle quali sono separate, frazionate o parzialmente o sostanzialmente purificate in accordo con metodiche convenzionali.

[0032] Con riferimento agli anticorpi sviluppati contro le suddette sequenze, frammenti, varianti, derivati o analoghi si intende qualsiasi anticorpo o peptide anticorpale che mantiene la proprietà di legame antigenico. Sequenze amminoacidiche alterate sono sequenze in cui sono presenti sostituzioni, delezioni o inserzioni di amminoacidi in accordo con quanto descritto in precedenza.

[0033] Un ulteriore oggetto è una sequenza nucleotidica in grado di essere tradotta e trascritta nelle suddette sequenze che sviluppano anticorpi specifici per l’impiego nel metodo della presente invenzione. Queste sequenze nucleotidiche possono essere prodotte tramite convenzionali metodiche di biologia molecolare che impiegano ad esempio la retrotrascrizione in sistemi virali noti (Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Sambrook and Russel, Cold Spring Harbor).

[0034] È da notare che i termini anticorpo ed immunoglobulina nella presente descrizione possono essere usati in modo intercambiabile ed identificano ugualmente una molecola legante antigeni che comprende almeno il dominio variabile di una catena pesante e normalmente almeno i domini variabili di una catena pesante e di una catena leggera, oppure anticorpi a singola catena, oppure minibodies (Harlow et al., Antibodies, “A laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 2014).

[0035] Il metodo dell’invenzione può essere scelto tra uno qualsiasi dei metodi analitici noti comprendenti la suddetta fase di messa a contatto dell’anticorpo contro una qualsiasi o più delle sequenze prima descritte. Preferibilmente, il metodo è scelto tra ELISA (diretto, sandwich, ecc.), separazione e rilevamento tramite flusso laterale, elettroforesi mono e bidimensionale, Western Blotting, immunoprecipitazione seguita da una qualsiasi delle precedenti metodiche, RIA, elettroforesi o HPLC o FPLC o una qualsiasi metodica cromatografica seguita da una tecnica di rilevamento quale quella precedente, risonanza plasmonica di superficie (SPR) o simili approcci basati sulla interferometria in cui gli anticorpi dell’invenzione sono usati sia come molecole di cattura che come molecole di interazione, spettroscopia di massa dopo purificazione del campione biologico con HPLC, metodiche cromatografiche di tipo nano-HPLC. Essendo queste metodiche ampiamente note al tecnico del settore non verranno qui riportate.

[0036] Indipendentemente dalla metodica analitica impiegata, i campioni biologici separati dal corpo umano possono essere pretrattati prima di essere sottoposti alle tecniche di indagine. I campioni biologici, infatti, possono derivare da fluidi o da tessuti corporei. In particolare, i fluidi possono essere liquido cefalorachidiano (CSF), plasma, sangue intero, fluido lacrimale, urina, secrezioni corporee, mentre i tessuti possono essere tessuto cerebrale, brushing nasale, tessuto epiteliale delle mucose. Nel caso di impiego di un campione biologico di tessuto cerebrale, il metodo di rilevamento comprende una fase preparatoria di frantumazione del campione in accordo con metodiche convenzionali (ad esempio sonicazione, omogeneizzazione con solventi, tamponi, detergenti ed altre soluzioni) seguita da precipitazione/isolamento della frazione proteica. La frazione proteica è poi incubata con l’anticorpo della presente invenzione. Successivamente, i campioni così preparati sono sottoposti ad analisi di rilevamento secondo una qualsiasi delle suddette metodiche. Qualora il campione biologico sia di tipo istologico e quindi destinato ad analisi immunoistochimica, viene ad essere sottoposto a preventiva fissazione, in accordo con metodi del tutto convenzionali.

[0037] Le sequenze bersaglio specifiche di riconoscimento da parte degli anticorpi sono state identificate dopo numerose sperimentazioni mirate a trovare quelle sequenze che caratterizzano in modo molto selettivo sia la proteina LRP8-FL sia suoi frammenti C-terminali, definiti LICDs, e derivanti dal processamento di LRP8 da parte della γ-secretasi o da altri enzimi endoproteolitici quali metalloproteasi, aspartilproteasi, serino proteasi e cisteino proteasi. È da notare che in condizioni normali LRP8 viene processata in modo da rilasciare pochi frammenti C-terminali all’interno della cellula.

[0038] In particolare, è noto dalla letteratura scientifica che frammenti C-terminali di LRP8 di lunghezza compresa tra 20 e 24 kDa sono prodotti in seguito al blocco della γ-secretasi operato dall’inibitore DAPT (Hoe e Rebeck, 2005; Hoe et al., 2006). La presente invenzione, invece, mette in evidenza come frammenti più piccoli, ossia frammenti da 8 a 16 kDa, siano più importanti nella diagnosi di molte patologie in quanto sono stati trovati in grandi quantità in campioni biologici isolati dal corpo umano di soggetti malati. Pertanto, nella presente descrizione il termine LICDs identifica i frammenti C-terminali di LRP8 migranti in SDS-PAGE tra 8 e 16 kDa. Questi frammenti, come spiegato in precedenza, comprendono le suddette sequenze amminoacidiche e sono vantaggiosamente riconosciuti dagli anticorpi sviluppati in modo da riconoscere tutti i LICDs, ossia sia i frammenti più piccoli tra 8 e 16 kDa, sia altri frammenti di peso molecolare maggiore (substrati di γ-secretasi e possibilmente anche di altre proteasi) migranti tra i 18 ed i 75 kDa.

[0039] Le analisi condotte con il metodo dell’invenzione hanno portato a trovare una quantità di LICDs particolarmente elevata, ed una contemporanea riduzione della quantità di proteina LRP8 intera, in campioni di pazienti AD rispetto ai controlli non AD.

[0040] LRP8 è una proteina recettore di tipo I transmembrana la cui sequenza amminoacidica è riportata in figura 1 (SEQ. I.D.14) ed è disponibile ad esempio nella banca dati Uniprot con il numero identificativo Q14114. È noto che tale proteina possiede quattro principali differenti isoforme da splicing (SEQ I.D. 15, SEQ I.D. 16, SEQ I.D. 17, SEQ I.D. 18) il cui allineamento delle rispettive regioni C-terminali è riportato in figura 2.

[0041] In accordo con la presente invenzione, sono state identificate le suddette sequenze in corrispondenza dell’estremità C-terminale di LRP8 quali siti bersaglio per il riconoscimento da parte di anticorpi specifici selettivi.

[0042] In particolare, sono stati sviluppati anticorpi policlonali e monoclonali. Sia gli anticorpi policlonali sia quelli monoclonali sono stati creati mediante convenzionali metodiche che pertanto non verranno qui descritte in dettaglio. Per quanto riguarda gli anticorpi monoclonali, è stato scelto di impiegare quale immunogeno preferibilmente la sequenza SEQ. I.D. 5 con l’aggiunta di una cisteina Cys all’estremità C per l’accoppiamento con KLH o analoga proteina o peptide avente capacità di legarsi a sua volta a proteine bersaglio di interesse, quali appunto le sequenze secondo la presente invenzione o più in generale apteni comunque dotati di scarsa capacità immunogena, in modo da potenziarne tale capacità. Un riferimento alle metodiche per la produzione di tali anticorpi è ad esempio riscontrabile in “Critical Steps in the Production of Polyclonal and Monoclonal Antibodies: Evaluation and Recommendations”, Marlies Leenaars, Coenraad F. M. Hendriksen (ILAR Journal, Volume 46, Issue 3, 1 January 2005, Pages 269–279) in cui si possono trovare anche specifici riferimenti bibliografici su quali siano le condizioni delle singole fasi operative.

[0043] In ogni caso, quando si utilizzano anticorpi policlonali, il siero prelevato dal mammifero immunizzato (ad esempio topo, coniglio, capra, cavallo) con i suddetti antigeni viene trattato convenzionalmente in modo da purificare gli anticorpi sviluppati mediante ad esempio cromatografica di immunoaffinità. Inoltre, gli anticorpi possono essere umanizzati, xenogenici o chimerici uomo-murino.

[0044] Per quanto riguarda la produzione di anticorpi monoclonali, la tecnica dell’ibridoma è ampiamente nota e prevede in generale l’impiego di linee cellulari immortali create mediante fusione cellulare o altre tecniche come la trasformazione diretta di linfociti B con DNA oncogenico o transfezione con virus (ad esempio M. Schreier et al. “Hybridoma Techniques”, 1980; Hammerling et al., “Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas”,1981; Kennet et al., Monoclonal Antibodies, 1980; Harlow et al., Antibodies, “A laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition, 2014). In particolare, sono stati prodotti cloni di ibridomi depositati presso il Centro di Biotecnologie Avanzate (CBA)/Interlab Cell Line Collection dell'IRCCS Azienda Ospedaliera Universitaria San Martino IST, Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, di Genova (Italia) con i numeri 17E11C2 e 25F7F1.

[0045] Le sequenze degli anticorpi delle linee cellulari 17E11C2 e 25F7F1 sono state identificate dalla GenScript e sono riportate rispettivamente nelle seguenti Tabelle. Per l’identificazione sono stati usati come materiali il reagente TRIzol® (Ambion, Cat. No.: 15596-026), il kit di sintesi PrimeScript<TM >1st Strand cDNA (Takara, Cat. No.: 6110A). Il metodo prevede l’isolamento dell’RNA totale dalle cellule degli ibridomi seguendo il manuale del TRIzol®Reagent. L’RNA totale è stato poi retro-trascritto in cDNA usando sia i primer anti-senso isotipo-specifici sia i primer universali seguendo il manuale di PrimeScript<TM >1st Strand cDNA Synthesis Kit. Frammenti di anticorpo della catena pesante e della catena leggera sono stati amplificati secondo la procedura operativa standard (SOP) di rapida amplificazione delle estremità di cDNA (RACE) di GenScript. I frammenti degli anticorpi amplificati sono stati clonati separatamente in un vettore standard di clonazione. La PCR su colonie è stata realizzata per selezionare cloni con inserti di dimensione corretta. La sequenza di consenso è stata fornita. Per l’analisi delle sequenze si può usare qualsiasi programma gratuito online adatto, preferibilmente NCBI Nucleotide BLAST, IMGT/V Quest program e NCBI IgBLAST.

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Tabella 1

Catena pesante: sequenza DNA (414 bp)

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Tabella 2

Catena pesante: sequenza amminoacidica (138 aa)

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Tabella 3

Catena leggera: sequenza DNA (393 bp) (SEQ I.D. No.21)

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Tabella 4

Catena leggera: sequenza amminoacidica (131 aa) (SEQ I.D. No.22)

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Tabella 5

Catena pesante: sequenza DNA (414 bp) (SEQ I.D. No.23)

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Tabella 6

Catena pesante: sequenza amminoacidica (138 aa)

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Tabella 7

Catena leggera: sequenza DNA (393 bp) (SEQ I.D. No.25)

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Tabella 8

Catena leggera: sequenza amminoacidica (131 aa)

[0046] Un ulteriore oggetto della presente invenzione è quindi un anticorpo monoclonale o policlonale in grado di legarsi ad una qualsiasi delle suddette sequenze per uso in un metodo di identificazione e quantificazione di LRP8 e suoi frammenti LICDs. Questi anticorpi possono essere prodotti tramite coltura di cellule ospiti ricombinanti modificate dopo iniezione di un vettore di espressione quale un plasmide costruito in modo da trasferire nel patrimonio genetico dell’ospite le sequenze nucleotidiche codificanti le sequenze amminoacidiche di interesse. Le sequenze nucleotidiche che codificano per detti anticorpi possono comprendere qualsiasi poliribonucleotide o polideossiribonucleotide che può essere un RNA o DNA nonmodificato o modificato. Questi sistemi di espressione possono essere progettati in modo da includere molecole segnale al fine di identificare e separare dalla coltura le molecole di interesse in maniera efficace. Tra i vettori di espressione che possono essere impiegati gB324 è il preferito, ma anche pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2 ed altri ancora noti nel settore possono essere usati.

[0047] Analogamente, preferibilmente, gli anticorpi prodotti in accordo con la presente invenzione comprendono una molecola segnale, cioè una molecola capace di essere rilevata tramite le suddette metodiche analitiche, quale ad esempio un fluoroforo, un radioisotopo, un enzima, un metallo pesante. Inoltre, gli anticorpi o immunoglobuline possono essere molecole intere o frammenti anticorpali. Le immunoglobuline sono notoriamente IgG, IgM, IgA, IgE, IgD e relative sottoclassi, composte da due catene leggere (L) e due catene pesanti (H), entrambe le catene essendo costituite da regioni costante (CL, CH) e variabile (VL, VH). I frammenti possono essere ad esempio frammenti Fv a singola catena, frammenti F(ab’), frammenti F(ab), F(ab’)β.

[0048] Un diverso oggetto della presente invenzione è una sequenza amminoacidica scelta tra le sequenze SEQ I.D. 1-9, come descritte in precedenza, per uso in un metodo di rilevazione e quantificazione di LRP8 e suoi frammenti LICDs.

[0049] Un ancora ulteriore oggetto della presente invenzione è un kit diagnostico per la determinazione di patologie associate all’aberrante processamento della proteina LRP8. Tale kit comprende preferibilmente una micropiastra i cui pozzetti sono rivestiti da un anticorpo prodotto in accordo con quanto spiegato in precedenza, un contenitore per un campione di controllo comprendente la proteina LRP8 e/o suoi frammenti C-terminali di 8-16 kDa, un contenitore per una sostanza diluente per il campione di controllo ed uno per il campione da testare, un contenitore per un tampone, un contenitore per una soluzione substrato, un contenitore per una soluzione di terminazione della reazione, un contenitore per un tampone di lavaggio. In aggiunta, il kit comprende un foglietto illustrativo con le spiegazioni di come preparare i campioni, tempi di incubazione e lavaggi, condizioni di lettura con fotometro del segnale rilevato.

[0050] In accordo con una forma preferita dell’invenzione, il kit può comprendere un campione di riferimento o una tabella di dati prestabiliti di confronto tra valori e/o tipologie di molecole rilevate e corrispondenti quantità riferite a condizioni considerate non patologiche e condizioni patologiche.

[0051] Oltre alle tecniche mediante ELISA come sommariamente descritto sopra (paragrafo 0048) e descritte successivamente in dettaglio (vedi paragrafo 0059), il kit può comprendere l’uso di applicazioni quali la “SPR” (Surface Plasmon Resonance) utilizzando un metodo ottico per misurare l'indice di rifrazione vicino alla superficie di un sensore. Questa superficie è un lato di una cella di flusso, attraverso la quale, una soluzione acquosa (tampone di corsa) viene fatta passare con una velocità continua. Per consentire il rilevamento di un'interazione, una molecola (ligando) viene immobilizzata sulla superficie del sensore. La molecola con la quale si vuole valutare un’interazione (analita) viene iniettata in soluzione acquosa, che abbia la stessa composizione del tampone di corsa, attraverso la cella di flusso, tramite un flusso continuo. Quando l'analita si lega al ligando, l'accumulo di proteine sulla superficie del sensore causa un aumento dell'indice di rifrazione. Questo cambiamento dell'indice di rifrazione viene misurato in tempo reale e il risultato viene rappresentato come unità di risposta (UR) in funzione del tempo (sensogramma).

[0052] Tale tecnologia, potrebbe essere utilizzata per rilevare la presenza e l’affinità del recettore LRP8 e/o suoi frammenti, presenti in un campione biologico, verso gli anticorpi monoclonali e/o policlonali descritti nella presente invenzione. In particolar modo, tale approccio prevede che il kit provveda gli anticorpi (ad esempio 17E11C2 o 25F7F1) quali ligandi e che siano immobilizzati sulla superficie del sensore, con opportuno buffer, al fine di ricercare il recettore LRP8 o suoi frammenti, in un campione biologico d’interesse. Tale campione dovrebbe presentarsi in forma liquida (plasma, liquor, saliva, urine…) ed essere opportunamente trattato prima di essere iniettato all’interno della cella di flusso per misurarne il binding e quindi la SPR rispetto ad un campione di controllo di riferimento negativo (un campione proveniente da soggetto sano o un campione privo di LRP8 o LICDs) e ad uno positivo (ad esempio una curva di taratura con note quantità di LRP8 o di LICDs). Pertanto, il kit comprenderà almeno un biosensore o chip provvisto di un supporto trasparente su un lato del quale è depositato uno strato metallico (generalmente oro o argento) avente una superficie libera sulla quale sono fissati gli anticorpi secondo la presente invenzione, almeno una cartuccia di supporto microfluidico all’interno della quale viene fatto scorrere un tampone contenente l’analita da rilevare, un contenitore per il tampone dell’analita.

[0053] Un’altra possibilità per lo sviluppo di test diagnostici volti a rilevare la presenza di LRP8, suoi frammenti o dei LICDs in campioni biologici d’interesse, come quelli sopracitati, si basa sull’utilizzo di uno stick di materiale plastico che ha al suo interno un tampone. Tale kit sfrutta la capacità di un campione liquido di migrare lungo questo tampone per capillarità (lateral flow). Nel tampone esposto al liquido biologico da analizzare si trova un anticorpo specifico per l’antigene ricercato (in un tipico esempio si potrebbe utilizzare il monoclonale 17E11C2 coniugato a molecole indicatrici colorate quali ad esempio oro colloidale). Il complesso antigene-anticorpo si muove per capillarità seguendo il campione biologico fino alle due strisce che inizialmente sono invisibili: la prima è quella dove è immobilizzato l’altro anticorpo che riconosce l’antigene (nel nostro esempio potrebbe essere l’anticorpo 25F7F1 fissato sul supporto), mentre la seconda striscia è di controllo ed è quella dove è immobilizzato un anticorpo in grado di riconoscere il frammento cristallizabile (Fc) degli anticorpi che si trovano sul tampone. Questa striscia rappresenta un controllo positivo per l’avvenuta migrazione del campione sul tampone per capillarità. L’avvenuto legame di LRP8 e/o suoi frammenti e/o degli LICDs alla prima striscia e degli anticorpi di controllo alla seconda striscia è evidenziato dalla colorazione di tali bande.

Se la striscia di controllo si colora significa che gli anticorpi specifici per LRP8, suoi frammenti e gli LICDs trasportati dal flusso capillare del campione hanno attraversato necessariamente la prima striscia; se la prima striscia è colorata vuol dire che sono presenti nel campione biologico LRP8 e/o suoi frammenti e/o gli LICDs. È possibile utilizzare anche dei lettori ottici per valutare le differenti intensità di colore sviluppate dalla reazione tra il campione e la prima striscia. Pertanto, il kit comprenderà un supporto a forma di nastro allungato dotato di una superficie sulla quale sono presenti una serie di elementi capillari in successione, un primo elemento (il pad campione) che assorbe un fluido campione, un secondo elemento (cuscinetto coniugato) in cui è immagazzinato un coniugato anticorpo-molecola segnale (colorante), un terzo elemento dotato di una o più aree (spesso chiamate strisce) in cui una molecola di cattura del coniugato è stata immobilizzata.

[0054] Qui di seguito vengono riportate alcune realizzazioni dell’invenzione date a puro titolo di esempio non limitativo dell’invenzione.

PREPARAZIONE DI ANTICORPI SPECIFICI PER LRP8

[0055] In accordo con la presente invenzione, l’isoforma 1 di LRP8, che è sequenzialmente la più lunga, è stata usata per studi in vitro tramite tecniche di clonazione che impiegano cDNA per l’espressione sia della sua forma selvatica che di una isoforma marcata al C-terminale con la sequenza tag myc-DDK. Il corrispondente clone è stato acquistato dalla OriGene, Cat. No. RC220963. In seguito, su detti cloni è stata identificata la regione transmembrana (descritta nel sito Uniprot: http://www.uniprot.org/uniprot/Q14114, ed identificabile usando il software pubblico AGADIR o TMPred disponibili sul sito https://expasy.org/). È stato visto che tale regione è conservata in tutte e quattro le isoforme ed è rappresentata dalla sequenza VIGIIVPIVVIALLCMSGYLI (SEQ. I.D.10). Inoltre, è stata identificata la sequenza VV-IA (SEQ I.D.11) quale sito putativo di taglio da parte della Ȗ-secretasi, tale sito essendo identico al sito di AȕPP che genera il frammento Aȕ-40. È stata anche identificata la sequenza DNPVY (SEQ I.D.12) quale motivo sito necessario per l’internalizzazione e l’interazione con le proteine adattatori come JNK e Dab1. È noto invece che la sequenza

AISSFDRPLWAEPCLGETREPEDPAPALKELFVLPGEPRSQLHQLPKNPLSELPVVK SK (SEQ I.D. 13), presente solo nelle isoforme 1 e 4, è tipica dei mammiferi, è determinata dall’esone 18 nell’essere umano ed è apparentemente legata ai processi di memoria ed attività della Relina, di cui LRP8 è un recettore (Telese et al., 2015).

[0056] In particolare, la suddetta sequenza DEDELHIGRTAQIG (SEQ. I.D. 5) è presente in tutte e quattro le isoforme e consiste in una breve sequenza con amminoacidi carichi ed è localizzata tra la sequenza DNPVY di internalizzazione e la sequenza dell’esone 18. La suddetta sequenza NPLSELPVVKSKRVALSLEDDGLP (SEQ I.D.9) è invece localizzata alla fine della sequenza 18 dell’esone.

[0057] Sono state selezionate queste sequenze SEQ I.D.5 e SEQ I.D.9 quali migliori antigeni per sviluppare anticorpi monoclonali. Sono stati ottenuti un totale di due anticorpi policlonali e due linee cellulari monoclonali di ibridomi contro dette sequenze. In sintesi, la tecnica di produzione di anticorpi monoclonali da ibridomi prevede l’immunizzazione (con una sequenza peptidica antigenica della proteina di interesse) di un animale (in genere, topo, ratto o coniglio) dal quale vengono prelevate plasmacellule dalla milza. In particolare, nella presente invenzione sono stati immunizzati topi BALB/c. Le plasmacellule sono immortalizzate mediante fusione con cellule di mieloma murino SP2/0 ed in seguito sono selezionate quelle secernenti anticorpi diretti contro l’antigene di interesse, utilizzato nell’immunizzazione dell’animale. Più dettagliatamente, le singole plasmacellule secernono anticorpi diretti contro uno specifico epitopo della proteina antigenica e gli anticorpi monoclonali sono quindi ottenibili da una linea cellulare derivata da una singola plasmacellula. Una volta stabili, le linee clonali di ibridomi forniscono una quantità pressoché infinita di anticorpi. Gli anticorpi secreti dalle cellule possono essere usati tal quali (sopranatanti) o ulteriormente purificati e/o concentrati mediante tecniche cromatografiche su colonna ad esempio per affinità con peptidi (opportunamente fissati su supporto) con le sequenze precedentemente identificate. Nel presente caso gli anticorpi ottenuti da ibridomi provenienti da topi immunizzati con peptidi SEQ I.D.5 e SEQ I.D.9 sono stati inizialmente utilizzati tal quali come sopranatanti cellulari ottenuti dagli ibridomi derivati e, successivamente, sono stati purificati mediante cromatografia per affinità utilizzando peptidi con le medesime sequenze SEQ I.D. 5 e SEQ I.D. 9 come peptidi di cattura nella resina legante.

Le due linee di ibridomi sopra descritte sviluppano anticorpi che riconoscono sia l’intera proteina LRP8 sia i suoi differenti frammenti C-terminali. In particolare, è stato trovato che ibridomi sviluppati immunizzando gli animali contro le sequenze SEQ. I.D.5 e 9 con una cisteina al C-terminale sono in grado di produrre anticorpi che riconoscono sia la proteina LRP8 tal quale, sia i frammenti di 18-25 kDa, i quali sono substrati della Ȗ-secretasi, sia diversi frammenti più corti di 8-16 kDa, definiti collettivamente LICDsdominio intra cellulare LRP8 derivato, simili ai frammenti AICDs derivati da taglio di AȕPP da parte di Ȗ-secretasi o da parte di altre proteasi come quelle specificate in precedenza. Anche gli anticorpi policlonali (coniglio) GS1 e GS2 sono stati realizzati utilizzando le SEQ I.D.5 e SEQ I.D.9, rispettivamente. A titolo esemplificativo, in figura 3, viene rappresentato il risultato di una analisi western blotting in cui il lisato cellulare, ottenuto da cellule N2A transfettate con un cDNA codificante per la proteina LRP8 (Origene, Cat. No. RC220963) e sottoposto ad analisi SDS-PAGE e western blotting con gli anticorpi policlonali GS1 e GS2 (corsie 1, 5), con i monoclonali 25F7F1 e 17E11C2 (corsie 2 e 3) e con altri monoclonali di cui alle SEQ I.D.3, 4 e 8 (corsie 4, 6 e 7, rispettivamente). Nella corsia 8 vi è un controllo negativo mentre nella corsia 9 l’ibridazione è stata effettuata utilizzando un anticorpo commerciale vs LRP8 (Sigma Aldrich Cat No. SAB1306331) quale controllo positivo. Tutti gli anticorpi sono stati utilizzati alla concentrazione finale di 1 µg/ml. È evidente quindi che sia gli anticorpi policlonali, sia gli anticorpi dei cloni o ibridomi secondo la presente invenzione sono in grado di identificare non solo la proteina intera LRP8 ed i frammenti da 18-25 kDa, ma vantaggiosamente anche i frammenti 8-16 kDa, come indicato dai riquadri in figura 3. In altre parole, il risultato dell’analisi ha messo in evidenza come le sequenze antigeniche di LRP8 descritte in precedenza siano un bersaglio selettivo e specifico per l’identificazione di LRP8 e dei suoi frammenti in colture cellulari.

ANALISI SU CAMPIONI DI CERVELLO UMANO

[0058] In principio sono stati analizzati i livelli proteici di LRP8 e dei suoi frammenti C-terminali tramite SDS-PAGE in buffer Tris-Tricina seguita da Western Blotting. I campioni derivano dalla corteccia temporale e frontale di cervello umano di 10 pazienti sofferenti di AD confrontati con 9 pazienti non-AD, entrambi i gruppi essendo sottoposti agli anticorpi denominati GS1 e GS2 sviluppati rispettivamente contro le sequenze SEQ. I.D. 5 e SEQ. I.D. 9. Sono anche stati analizzati campioni di differenti aree cerebrali (cortecce cerebellari frontale e temporale) di un gruppo di soggetti (N.5) con AD familiare (FAD) aventi mutazioni sul gene PSEN1, codificante per presenilina 1.

[0059] In particolare, per ciascun paziente, circa 100 mg di tessuto cerebrale sono stati omogenati in RIPA buffer per γ0” in un omogeneizzatore a rotore-statore e successivamente centrifugati a 10000xg a 4°C per circa 20 min. Il sov ranatante è stato sottoposto ad analisi della frazione proteica estratta mediante tecnica elettroforetica (SDS-PAGE) in gel di acrilamide al 12,5% (separating) in buffer di Tris-Tricina. Il gel con le proteine separate è stato poi trasferito su membrana in PVDF 0,22 µm in buffer di trasferimento, e la membrana medesima marcata con anticorpo primario specifico GS1 per LRP8 e secondario anti-coniglio, tale da riconoscere l’anticorpo primario e marcato con HRP (GE Healthcare, Cat. No. RPN4201). Successivamente, mediante chemiluminescenza, si è proceduto alla rilevazione delle bande proteiche su lastra radiografica.

[0060] In figura 4, viene mostrata una lastra radiografica ottenuta con il suddetto procedimento, in cui le corsie rappresentano i segnali ottenuti da altrettanti campioni cerebrali di soggetti non-AD (controlli) e AD preparati come in precedenza ed incubati con GS1. Come si può notare, le corsie indicate con SAD e FAD mostrano un segnale che identifica una presenza significativa di frammenti C-terminali di LRP8 compresi tra 8 e 16 kDa ed una parallela diminuzione della proteina intera di 105 kDa rispetto ai controlli (corsie Controlli), come indicato dalle frecce esemplificative della figura 4. Sul lato destro dell’immagine del WB sono riportati i pesi molecolari del marcatore.

[0061] Le lastre fotografiche ottenute dagli esperimenti di Western Blot sono digitalizzate dall’acquisizione con uno strumento di imaging (Gel Doc EZ System, Biorad). Di tali immagini digitalizzate è stata effettuata un’analisi densitometrica che consiste nel valutare la densità del segnale proteico con il software informatico ImageLab (Biorad): tale software permette di selezionare le bande proteiche e di assegnare a loro un valore numerico a seconda dell’intensità delle bande. L’analisi densitometrica è stata così eseguita: per ciascun paziente è stato messo in rapporto il valore della proteina intera LRP8 e il valore normalizzato dei frammenti LICDs. Sono stati ottenuti i valori medi del rapporto tra proteina intera LRP8/frammenti LICDs per ciascun gruppo analizzato (controlli, SAD e FAD) con relativo errore standard medio. L’analisi indica che nei campioni SAD sono stati trovati in media 4,2 volte più frammenti di LICDs rispetto ai controlli. Tale valore è dato dal rapporto tra il valore medio LRP8 proteina intera/frammenti LICDs dei campioni controllo (20,51) vs SAD (4,82). Infatti, in figura 5 il grafico mostra il rapporto tra proteina intera LRP8 e LICDs rispettivamente in campioni controllo (CTL), campioni di pazienti con SAD e campioni di pazienti con FAD. Se l’analisi viene estesa al confronto del rapporto tra l’intera proteina LPR8 e i suoi frammenti LICDs nei campioni analizzati, è possibile notare l’importante e significativa riduzione dell’intera proteina ed il parallelo incremento dei frammenti LICDs nei casi FAD e SAD (figura 4) rispetto ai campioni dei soggetti controllo non dementi, con conseguente diminuzione del rapporto tra la proteina intera e i frammenti compresi tra 8 e 16 kDa.

[0062] Sono stati ottenuti risultati sovrapponibili anche impiegando la tecnica Sandwich ELISA. Per poter valutare specificatamente la presenza dei LICDs, i campioni sono stati preparati utilizzando dei concentratori centrifughi (Centricon 30, Millipore, Cat. No. MRCF0R030) che hanno un filtro molecolare in grado di separare le proteine al di sotto dei 30 kDa, da quelle che hanno un peso superiore, in maniera tale da isolare la frazione che contiene i LICDs (al di sotto dei 30 kDa) da quella con il recettore intero (frazione sopra i 30 kDa). Le piastre multi-well da 96 pozzetti sono state preparate con una sostanza che fa da coating (Na carbonato/bicarbonato 0.1 M – rapporto 70:30) per 16 h per poter immobilizzare l’anticorpo (GS1 o GSβ) sulla parete delle multiwell da 96 pozzetti. Il giorno seguente i pozzetti sono stati lavati con soluzione contenente PBS+0,05% Tween 20 e successivamente è stata aggiunta una soluzione di PBS+10% di siero di capra (NGS) per 3 h a temperatura ambiente per effettuare il blocco dei siti aspecifici. I campioni preparati in precedenza (frazioni sopra i 30 kDa e frazioni sotto i 30 kDa) sono aggiunti al pozzetto, dopo rimozione della soluzione di blocco, e sono stati incubati per 16 h a 4°C. Successivamente sono stati effettuati 5 lavaggi con soluzione contenente PBS+0,05% Tween 20 e aggiunto il secondo anticorpo anti-LRP8 (anticorpo prodotto da ibridomi di topi 25F7F1) capace di legarsi agli antigeni immobilizzati dal primo anticorpo. I pozzetti sono stati nuovamente lavati per 5 volte con la soluzione contenente PBS+0,05% Tween β0 per rimuovere l’eccesso di anticorpo ed è stato aggiunto un anticorpo secondario anti-topo coniugato con HRP (GE Healthcare, Cat. No. RPN4201 o analogo). Dopo incubazione a 37°C per 1 ora, i pozzetti sono stati lavati cinque volte come descritto in precedenza ed è stata aggiunta una soluzione di tetrametilbenzidina (TMB, Sigma), substrato della perossidasi. Dopo aver lasciato reagire per 10 minuti a temperatura ambiente, la reazione è stata fermata con soluzione di acido solforico 1 M e sono state effettuate delle letture dell’assorbanza a 450 nm utilizzando uno spettrofometro con alloggiamento per piastre multiwell (VICTOR 3, Perkin Elmer). Nella figura 6 è possibile osservare i risultati ottenuti dagli esperimenti ELISA: analogamente a quanto osservato negli esperimenti di WB, anche con quest’altra tecnica è possibile osservare una riduzione del rapporto tra recettore intero (frazione sopra i 30 kDa) e LICD (frazione sotto i 30 kDa) nei pazienti con AD sporadico e familiare rispetto al gruppo di controllo. Infatti, in figura 6 è riportato un grafico relativo al rapporto tra recettore intero e LICDs (frazioni sopra riportate) dei valori ottenuti mediante tecnica ELISA, per ciascuno dei campioni appartenenti ai tre gruppi analizzati: controlli non-AD (CTL), SAD e FAD. Anche da questa analisi è possibile vedere come l’andamento dei valori del rapporto tra recettore intero e LICDs sia significativamente più alto nei controlli che nei soggetti con AD (SAD e FAD). Alternativamente, con questa tecnica è tuttavia anche possibile, ai fini diagnostici, confrontare i soli dati relativi ai LICDs o alla proteina intera (LRP8-FL) ottenibili dai campioni con sospetto diagnostico, rispetto ai livelli dei medesimi ottenuti da campioni di riferimento non affetti da demenza o rispetto ad una curva di taratura.

[0063] Analisi immunoistochimiche hanno inoltre confermato i suddetti risultati. Infatti, è stato osservato che sugli stessi campioni di cui in precedenza una colorazione intensa e diffusa (immagine a sinistra di figura 7) è presente nella porzione parenchimale dei campioni AD dovuta alla presenza di anticorpi contro SEQ. I.D. 5 marcati con anticorpo secondario fluorescente specifico che, dopo il suo legame all’anticorpo primario, viene eccitato alla lunghezza d’onda di 578 nm ed emette a 603 nm nel range del rosso (Alexa Fluor 568 della ditta Thermo Fisher o analoghi). Al contrario, nei campioni controllo si osserva una colorazione neuronale ed intracellulare (immagine a destra di figura 7).

ANALISI NEL PLASMA E NEL LIQUOR (CSF)

[0064] Parallelamente alle suddette indagini, sono stati processati campioni di plasma e liquor di soggetti AD e non-AD allo scopo di identificare e quantificare la presenza di LRP8 e dei LICDs come marcatore periferico. Sono stati anche valutati campioni di soggetti MCI (Mild Cognitive Impairment o Decadimento Cognitivo Lieve) nei quali secondo alcuni studiosi l’AD si troverebbe nel suo stadio più precoce. Anche questa indagine è stata svolta tramite tecnica SDS-PAGE seguita da Western Blotting (figura 8) dopo messa a contatto dell’anticorpo GS1 in campioni di CSF proveniente dai ventricoli cerebrali (prelevati post-mortem) di soggetti controllo (linee 1 e 4 di figura 8), di un soggetto con SAD (linea 2) ed un caso familiare (linea 3, FAD) con mutazione nel gene PSEN1. La procedura è identica a quella descritta al paragrafo 0056. Come si può notare dal risultato dell’analisi mediante Western Blotting di figura 8, i frammenti LICDs sono presenti solo nei casi AD rispetto ai casi non-AD, mentre la proteina intera è presente in tutti i soggetti, come indicato dai riquadri. Nei campioni di plasma umano, analogamente, è stato rilevato un significativo incremento di LICDs nei casi AD (linee 7-10 del Western Blotting di figura 9) rispetto ai controlli (linee 1-6 di figura 9).

[0065] I dati ottenuti dalle analisi suddette realizzate sia su tessuti di cervello umano che di CSF e plasma, suggeriscono che un incremento dei LICDs rappresenta un valido indice o marker diagnostico per l’individuazione dell’AD anche nelle fasi precoci.

[0066] In aggiunta, alternativamente o parallelamente a quanto sopra descritto, alcune tecniche possono anche avvalersi della valutazione della riduzione di LRP8 FL (vedi 0059); infatti anche la contemporanea diminuzione della quantità della proteina intera LRP8 confermerebbe la presenza di AD e di AD precoce.

LISTATO DELLE SEQUENZE

<110>

<120> Metodo per rilevare la presenza e la quantità del recettore LRP8 e dei suoi frammenti proteolitici, kit di rilevamento e relative anticorpi

<130> B17-217

<160> 17

<170> PatentIn versione 3.5

<210> 1

<211> 127

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ile Ala Leu Leu Cys Met Ser Gly Tyr Leu Ile Trp Arg Asn Trp Lys

1 5 10 15

Arg Lys Asn Thr Lys Ser Met Asn Phe Asp Asn Pro Val Tyr Arg Lys

20 25 30

Thr Thr Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Leu His Ile Gly Arg Thr Ala

35 40 45

Gln Ile Gly His Val Tyr Pro Ala Ala Ile Ser Ser Phe Asp Arg Pro

50 55 60

Leu Trp Ala Glu Pro Cys Leu Gly Glu Thr Arg Glu Pro Glu Asp Pro

65 70 75 80

Ala Pro Ala Leu Lys Glu Leu Phe Val Leu Pro Gly Glu Pro Arg Ser

85 90 95

Gln Leu His Gln Leu Pro Lys Asn Pro Leu Ser Glu Leu Pro Val Val

100 105 110

Lys Ser Lys Arg Val Ala Leu Ser Leu Glu Asp Asp Gly Leu Pro 115 120 125

<210> 2

<211> 28

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ile Ala Leu Leu Cys Met Ser Gly Tyr

1 5

Leu Ile Trp Arg Asn Trp Lys Arg Lys Asn Thr Lys

10 15 25

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Asn Trp Lys Arg Lys Asn Thr Lys Ser Met Asn Phe Asp Asn Pro 1 5 10 15

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Asn Pro Val Tyr Arg Lys Thr Thr Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Leu 1 5 10 15

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Asp Glu Asp Glu Leu His Ile Gly Arg Thr Ala Gln Ile Gly

1 5 10

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Arg Thr Ala Gln Ile Gly His Val Tyr Pro Ala Ala Ile Ser Ser Phe 1 5 10 15

Asp

<210> 7

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Asp Arg Pro Leu Trp Ala Glu Pro Cys Leu Gly Glu Thr Arg Glu Pro 1 5 10 15 Glu Asp Pro Ala

20

<210> 8

<211> 26

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Asp Pro Ala Pro Ala Leu Lys Glu Leu Phe Val Leu Pro Gly Glu Pro 1 5 10 15 Arg Ser Gln Leu His Gln Leu Pro Lys Asn

<210> 9

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Asn Pro Leu Ser Glu Leu Pro Val Val Lys Ser Lys Arg Val Ala Leu 1 5 10 15

Ser Leu Glu Asp Asp Gly Leu Pro

20

<210> 10

<211> 21

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Val Ile Gly Ile Ile Val Pro Ile Val Val Ile Ala Leu Leu Cys Met 1 5 10 15

Ser Gly Tyr Leu Ile

20

<210> 11

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Val Val Ile Ala

1

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Asp Asn Pro Val Tyr

1 5

<210> 13

<211> 59

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Ala Ile Ser Ser Phe Asp Arg Pro Leu Trp Ala Glu Pro Cys Leu Gly 1 5 10 15

Glu Thr Arg Glu Pro Glu Asp Pro Ala Pro Ala Leu Lys Glu Leu Phe 20 25 30

Val Leu Pro Gly Glu Pro Arg Ser Gln Leu His Gln Leu Pro Lys Asn 35 40 45

Pro Leu Ser Glu Leu Pro Val Val Lys Ser Lys

50 55

<210> 14

<211> 963

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Met Gly Leu Pro Glu Pro Gly Pro Leu Arg Leu Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Leu Gln His Leu Ala Ala Ala 20 25 30 Ala Ala Asp Pro Leu Leu Gly Gly Gln Gly Pro Ala Lys Asp Cys Glu 35 40 45

Lys Asp Gln Phe Gln Cys Arg Asn Glu Arg Cys Ile Pro Ser Val Trp 50 55 60

Arg Cys Asp Glu Asp Asp Asp Cys Leu Asp His Ser Asp Glu Asp Asp 65 70 75 80

Cys Pro Lys Lys Thr Cys Ala Asp Ser Asp Phe Thr Cys Asp Asn Gly 85 90 95

His Cys Ile His Glu Arg Trp Lys Cys Asp Gly Glu Glu Glu Cys Pro 100 105 110

Asp Gly Ser Asp Glu Ser Glu Ala Thr Cys Thr Lys Gln Val Cys Pro 115 120 125

Ala Glu Lys Leu Ser Cys Gly Pro Thr Ser His Lys Cys Val Pro Ala 130 135 140

Ser Trp Arg Cys Asp Gly Glu Lys Asp Cys Glu Gly Gly Ala Asp Glu 145 150 155 160

Ala Gly Cys Ala Thr Leu Cys Ala Pro His Glu Phe Gln Cys Gly Asn 165 170 175

Arg Ser Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Cys Asp Gly Asp Asp Asp Cys 180 185 190

Gly Asp Gly Ser Asp Glu Arg Gly Cys Ala Asp Pro Ala Cys Gly Pro 195 200 205

Arg Glu Phe Arg Cys Gly Gly Asp Gly Gly Gly Ala Cys Ile Pro Glu Arg Trp Val Cys Asp Arg Gln Phe Asp Cys Glu Asp Arg Ser Asp Glu 225 230 235 240

Ala Ala Glu Leu Cys Gly Arg Pro Gly Pro Gly Ala Thr Ser Ala Pro 245 250 255

Ala Ala Cys Ala Thr Ala Ser Gln Phe Ala Cys Arg Ser Gly Glu Cys 260 265 270

Val His Leu Gly Trp Arg Cys Asp Gly Asp Arg Asp Cys Lys Asp Lys 275 280 285

Ser Asp Glu Ala Asp Cys Pro Leu Gly Thr Cys Arg Gly Asp Glu Phe 290 295 300

Gln Cys Gly Asp Gly Thr Cys Val Leu Ala Ile Lys His Cys Asn Gln 305 310 315 320

Glu Gln Asp Cys Pro Asp Gly Ser Asp Glu Ala Gly Cys Leu Gln Gly 325 330 335

Leu Asn Glu Cys Leu His Asn Asn Gly Gly Cys Ser His Ile Cys Thr 340 345 350

Asp Leu Lys Ile Gly Phe Glu Cys Thr Cys Pro Ala Gly Phe Gln Leu 355 360 365

Leu Asp Gln Lys Thr Cys Gly Asp Ile Asp Glu Cys Lys Asp Pro Asp 370 375 380

Ala Cys Ser Gln Ile Cys Val Asn Tyr Lys Gly Tyr Phe Lys Cys Glu 385 390 395 400 Cys Tyr Pro Gly Tyr Glu Met Asp Leu Leu Thr Lys Asn Cys Lys Ala 405 410 415

Ala Ala Gly Lys Ser Pro Ser Leu Ile Phe Thr Asn Arg His Glu Val 420 425 430

Arg Arg Ile Asp Leu Val Lys Arg Asn Tyr Ser Arg Leu Ile Pro Met 435 440 445

Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Asp Val Glu Val Ala Thr Asn Arg Ile 450 455 460

Tyr Trp Cys Asp Leu Ser Tyr Arg Lys Ile Tyr Ser Ala Tyr Met Asp 465 470 475 480

Lys Ala Ser Asp Pro Lys Glu Gln Glu Val Leu Ile Asp Glu Gln Leu 485 490 495

His Ser Pro Glu Gly Leu Ala Val Asp Trp Val His Lys His Ile Tyr 500 505 510

Trp Thr Asp Ser Gly Asn Lys Thr Ile Ser Val Ala Thr Val Asp Gly 515 520 525

Gly Arg Arg Arg Thr Leu Phe Ser Arg Asn Leu Ser Glu Pro Arg Ala 530 535 540

Ile Ala Val Asp Pro Leu Arg Gly Phe Met Tyr Trp Ser Asp Trp Gly 545 550 555 560

Asp Gln Ala Lys Ile Glu Lys Ser Gly Leu Asn Gly Val Asp Arg Gln 565 570 575 Thr Leu Val Ser Asp Asn Ile Glu Trp Pro Asn Gly Ile Thr Leu Asp 580 585 590

Leu Leu Ser Gln Arg Leu Tyr Trp Val Asp Ser Lys Leu His Gln Leu 595 600 605

Ser Ser Ile Asp Phe Ser Gly Gly Asn Arg Lys Thr Leu Ile Ser Ser 610 615 620

Thr Asp Phe Leu Ser His Pro Phe Gly Ile Ala Val Phe Glu Asp Lys 625 630 635 640

Val Phe Trp Thr Asp Leu Glu Asn Glu Ala Ile Phe Ser Ala Asn Arg 645 650 655

Leu Asn Gly Leu Glu Ile Ser Ile Leu Ala Glu Asn Leu Asn Asn Pro 660 665 670

His Asp Ile Val Ile Phe His Glu Leu Lys Gln Pro Arg Ala Pro Asp 675 680 685

Ala Cys Glu Leu Ser Val Gln Pro Asn Gly Gly Cys Glu Tyr Leu Cys 690 695 700

Leu Pro Ala Pro Gln Ile Ser Ser His Ser Pro Lys Tyr Thr Cys Ala 705 710 715 720

Cys Pro Asp Thr Met Trp Leu Gly Pro Asp Met Lys Arg Cys Tyr Arg

725 730 735

Ala Pro Gln Ser Thr Ser Thr Thr Thr Leu Ala Ser Thr Met Thr Arg 740 745 750

Thr Val Pro Ala Thr Thr Arg Ala Pro Gly Thr Thr Val His Arg Ser Thr Tyr Gln Asn His Ser Thr Glu Thr Pro Ser Leu Thr Ala Ala Val 770 775 780

Pro Ser Ser Val Ser Val Pro Arg Ala Pro Ser Ile Ser Pro Ser Thr 785 790 795 800

Leu Ser Pro Ala Thr Ser Asn His Ser Gln His Tyr Ala Asn Glu Asp 805 810 815

Ser Lys Met Gly Ser Thr Val Thr Ala Ala Val Ile Gly Ile Ile Val 820 825 830

Pro Ile Val Val Ile Ala Leu Leu Cys Met Ser Gly Tyr Leu Ile Trp 835 840 845

Arg Asn Trp Lys Arg Lys Asn Thr Lys Ser Met Asn Phe Asp Asn Pro 850 855 860

Val Tyr Arg Lys Thr Thr Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Leu His Ile 865 870 875 880

Gly Arg Thr Ala Gln Ile Gly His Val Tyr Pro Ala Ala Ile Ser Ser 885 890 895

Phe Asp Arg Pro Leu Trp Ala Glu Pro Cys Leu Gly Glu Thr Arg Glu 900 905 910

Pro Glu Asp Pro Ala Pro Ala Leu Lys Glu Leu Phe Val Leu Pro Gly 915 920 925

Glu Pro Arg Ser Gln Leu His Gln Leu Pro Lys Asn Pro Leu Ser Glu 930 935 940

Leu Pro Val Val Lys Ser Lys Arg Val Ala Leu Ser Leu Glu Asp Asp 945 950 955 960

Gly Leu Pro

<210> 15

<211> 183

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(183)

<400> 15

Thr Ala Ala Val Pro Ser Ser Val Ser Val Pro Arg Ala Pro Ser Ile 1 5 10 15

Ser Pro Ser Thr Leu Ser Pro Ala Thr Ser Asn His Ser Gln His Tyr 20 25 30

Ala Asn Glu Asp Ser Lys Met Gly Ser Thr Val Thr Ala Ala Val Ile 35 40 45

Gly Ile Ile Val Pro Ile Val Val Ile Ala Leu Leu Cys Met Ser Gly 50 55 60

Tyr Leu Ile Trp Arg Asn Trp Lys Arg Lys Asn Thr Lys Ser Met Asn 65 70 75 80

Phe Asp Asn Pro Val Tyr Arg Lys Thr Thr Glu Glu Glu Asp Glu Asp 85 90 95

Glu Leu His Ile Gly Arg Thr Ala Gln Ile Gly His Val Tyr Pro Ala 100 105 110

Ala Ile Ser Ser Phe Asp Arg Pro Leu Trp Ala Glu Pro Cys Leu Gly 115 120 125

Glu Thr Arg Glu Pro Glu Asp Pro Ala Pro Ala Leu Lys Glu Leu Phe 130 135 140

Val Leu Pro Gly Glu Pro Arg Ser Gln Leu His Gln Leu Pro Lys Asn 145 150 155 160

Pro Leu Ser Glu Leu Pro Val Val Lys Ser Lys Arg Val Ala Leu Ser 165 170 175

Leu Glu Asp Asp Gly Leu Pro

180

<210> 16

<211> 91

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Asn Glu Asp Ser Lys Met Gly Ser Thr Val Thr Ala Ala Val Ile Gly 1 5 10 15

Ile Ile Val Pro Ile Val Val Ile Ala Leu Leu Cys Met Ser Gly Tyr 20 25 30

Leu Ile Trp Arg Asn Trp Lys Arg Lys Asn Thr Lys Ser Met Asn Phe 35 40 45

Asp Asn Pro Val Tyr Arg Lys Thr Thr Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu 50 55 60

Leu His Ile Gly Arg Thr Ala Gln Ile Gly His Val Tyr Pro Ala Arg 65 70 75 80 Val Ala Leu Ser Leu Glu Asp Asp Gly Leu Pro

85 90

<210> 17

<211> 124

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

Thr Ala Ala Val Pro Ser Ser Val Ser Val Pro Arg Ala Pro Ser Ile 1 5 10 15

Ser Pro Ser Thr Leu Ser Pro Ala Thr Ser Asn His Ser Gln His Tyr 20 25 30

Ala Asn Glu Asp Ser Lys Met Gly Ser Thr Val Thr Ala Ala Val Ile 35 40 45

Gly Ile Ile Val Pro Ile Val Val Ile Ala Leu Leu Cys Met Ser Gly 50 55 60

Tyr Leu Ile Trp Arg Asn Trp Lys Arg Lys Asn Thr Lys Ser Met Asn 65 70 75 80

Phe Asp Asn Pro Val Tyr Arg Lys Thr Thr Glu Glu Glu Asp Glu Asp 85 90 95

Glu Leu His Ile Gly Arg Thr Ala Gln Ile Gly His Val Tyr Pro Ala 100 105 110

Arg Val Ala Leu Ser Leu Glu Asp Asp Gly Leu Pro

115 120

<210> 18

<211> 183

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

Thr Ala Ala Val Pro Ser Ser Val Ser Val Pro Arg Ala Pro Ser Ile 1 5 10 15

Ser Pro Ser Thr Leu Ser Pro Ala Thr Ser Asn His Ser Gln His Tyr 20 25 30

Ala Asn Glu Asp Ser Lys Met Gly Ser Thr Val Thr Ala Ala Val Ile 35 40 45

Gly Ile Ile Val Pro Ile Val Val Ile Ala Leu Leu Cys Met Ser Gly 50 55 60

Tyr Leu Ile Trp Arg Asn Trp Lys Arg Lys Asn Thr Lys Ser Met Asn 65 70 75 80

Phe Asp Asn Pro Val Tyr Arg Lys Thr Thr Glu Glu Glu Asp Glu Asp 85 90 95

Glu Leu His Ile Gly Arg Thr Ala Gln Ile Gly His Val Tyr Pro Ala 100 105 110

Ala Ile Ser Ser Phe Asp Arg Pro Leu Trp Ala Glu Pro Cys Leu Gly 115 120 125

Glu Thr Arg Glu Pro Glu Asp Pro Ala Pro Ala Leu Lys Glu Leu Phe 130 135 140

Val Leu Pro Gly Glu Pro Arg Ser Gln Leu His Gln Leu Pro Lys Asn 145 150 155 160

Pro Leu Ser Glu Leu Pro Val Val Lys Ser Lys Arg Val Ala Leu Ser Leu Glu Asp Asp Gly Leu Pro

180

<210> 19

<211> 57

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 19

atgggatgga gctggatctt tctcttcctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt ccactct 57

<210> 20

<211> 90

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 20

gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgtg ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgtaagg cttctggata caaattcact 90

<210> 21

<211> 15

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 21

gactacttta tgaac 15

<211> 42

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 22

tgggtgaaga agagccatgg aaagagcctt gagtggattg ga 42

<210> 23

<211> 51

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 23

gttattaatc cttacaacgg tggtactaga tacaaccaga agttcaaggg c 51

<210> 24

<211> 96

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 24

aaggccacat tgactgttga caagtcctcc agcacagcct acatggagct caacagcctg 60

acatttgagg actctgcagt ctattactgt gcaagg 96

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> Homo sapiens

gagacggtag accttgcctg gtttgttcac 30

<210> 26

<211> 33

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 26

tggggccaag ggactctggt cactgtctct gca 33

<210> 27

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser

<210> 28

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr <210> 29

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29

Asp Tyr Phe Met Asn

1 5

<210> 30

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

Trp Val Lys Lys Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 31

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly

<210> 32

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Asn Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30

<210> 33

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

Glu Thr Val Asp Leu Ala Trp Phe Val His

1 5 10

<210> 34

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

1 5 10

<210> 35

<211> 57

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 35

atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagt 57

<210> 36

<211> 69

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 36

gatgttttga tgacccaaac tccaccctcc ctgcctgtca ctcttggaga tcaggcctcc 60

atctcttgc 69

<210> 37

<211> 48

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 37

agatctagtc agagtattgt atatagtaat ggaaacacct acttagaa 48

<210> 38

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 38

tggtacctgc agaagccagg ccagtctcca aagctcctga tctac 45

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 39

aaagtttcca accgattttc t 21

<210> 40

<211> 96

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 40

ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 60

agagtggagg ctgaggatct gggaatttat tactgc 96

<210> 41

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 41

tttcaaggtt cacatgttcc gctcacg 27

<210> 42

<211> 30

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 42

ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa 30

<210> 43

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser

<210> 44

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 44

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys

20

<210> 45

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 45

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15

<210> 46

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 46

Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15

<210> 47

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 47

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

<210> 48

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 48

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys 20 25 30

<210> 49

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 49

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr

1 5

<210> 50

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

1 5 10

<210> 51

<211> 57

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 51

atgggatgga gctggatctt tctcttcctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt ccactct 57

<210> 52

<211> 90

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 52

gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgtg ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgtaagg cttctggata caaattcact 90

<210> 53

<211> 15

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 53

gaccacttta tgaac 15

<210> 54

<211> 42

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 54

tgggtgaaga agaaccatgg aaagagcctt gagtggattg gg 42

<210> 55

<211> 51

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 55

gttattaatc cttacaacgg tggtactagg ctcaacccga agtttaaggg c 51

<210> 56

<211> 96

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 56

aaggccacat tgactgttga caagtcctcc agcacagtct acatggagct caacagcctg 60

acatttgagg actctgcagt ctattactgt gcaagg 96

<210> 57

<211> 30

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 57

gagactatag accttgcctg gtttgcttat 30

<210> 58

<211> 33

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 58

tggggccagg ggactctggt cactgtctct gca 33

<210> 59

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 59

Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser

<210> 60

<211> 30

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 60

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr

20 25 30

<210> 61

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 61

Asp His Phe Met Asn

1 5

<210> 62

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 62

Trp Val Lys Lys Asn His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 63

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 63

Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Arg Leu Asn Pro Lys Phe Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 64

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 64

Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr Met Glu 1 5 10 15

Leu Asn Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30

<210> 65

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

Glu Thr Ile Asp Leu Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 66

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 66

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

1 5 10

<210> 67

<211> 57

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 67

atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgctac cagcagt 57

<210> 68

<211> 69

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 68

gatgttttga tgactcaaac tccaccctcc ctgcctgtca ctcttggaga tcaggcctcc 60

atctcttgc 69

<210> 69

<211> 48

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 69

agatctagtc agagtattgt atatagtaat ggaaaaacct atttagaa 48

<210> 70

<211> 45

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 70

tggtacctgc agaagccagg ccagtctcca aagctcctga tgtac 45

<210> 71

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 71

aaagtttcca accgattttc t 21

<210> 72

<211> 96

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 72

ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 60

agcgtggagg ctgaggatct gggaatttat tactgc 96

<210> 73

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 73

tttcaaggtt cacatgttcc gctcacg 27

<210> 74

<211> 30

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 74

ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa 30

<210> 75

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 75

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Thr Ser Ser

<210> 76

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys

20

<210> 77

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 77

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15

<210> 78

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 78

Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Met Tyr 1 5 10 15

<210> 79

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 79

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 80

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Lys Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys 20 25 30

<210> 81

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 81

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr

1 5

<210> 82

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 82

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 1 5 10

Claims (9)

1. Rivendicazioni del brevetto per invenzione industriale avente per titolo: “METODO PER RILEVARE LA PRESENZA E LA QUANTITA’ DEL RECETTORE LRP8 E DEI SUOI FRAMMENTI PROTEOLITICI, KIT DI RILEVAMENTO E RELATIVI ANTICORPI" RIVENDICAZIONI 1. Metodo per il rilevamento e la quantificazione di LRP8 e suoi frammenti C-terminali in un campione biologico umano, comprendente una fase di messa a contatto di detto campione isolato dal corpo umano con un anticorpo monoclonale e/o policlonale mirato contro almeno una sequenza amminoacidica specifica di una porzione C-terminale di LRP8, detta sequenza essendo consistente nei residui amminoacidici C-terminali 837-963 o una sequenza all’interno di detti residui 837-963 scelta nel gruppo costituito dai residui amminoacidici 839-857, 850-864, 863-878, 874-887, 882-898, 898-917, 915-940, 940-963.
2. 2. Metodo, secondo la rivendicazione 1, in cui detti residui amminoacidici di dette sequenze sono, rispettivamente: IALLCMSGYLIWRNWKRKNTKSMNFDNPVYRKTTEEEDEDELHIGRTAQIGHV YPAAISSFDRPLWAEPCLGETREPEDPAPALKELFVLPGEPRSQLHQLPKNPL SELPVVKSKRVALSLEDDGLP (SEQ. I.D. 1), IIVPIVVIALLCMSGYLIWRNWKRKNTK (SEQ I.D. 2), NWKRKNTKSMNFDNP (SEQ I.D. 3), NPVYRKTTEEEDEDEL (SEQ I.D. 4), DEDELHIGRTAQIG (SEQ I.D. 5), RTAQIGHVYPAAISSFD (SEQ I.D. 6), DRPLWAEPCLGETREPEDPA (SEQ I.D. 7), DPAPALKELFVLPGEPRSQLHQLPKN (SEQ I.D. 8), NPLSELPVVKSKRVALSLEDDGLP (SEQ I.D.9)
3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detta fase è realizzata all’interno di un procedimento di rilevamento e quantificazione scelto tra ELISA, separazione e rilevamento tramite flusso laterale, elettroforesi mono o bidimensionale, Western Blotting, immunoprecipitazione seguita da una qualsiasi delle precedenti metodiche, RIA, elettroforesi o HPLC o FPLC o una qualsiasi cromatografia seguita da una tecnica di rilevamento, risonanza plasmonica di superficie, analisi interferometrica in cui gli anticorpi dell’invenzione sono usati sia come molecole di cattura che come molecole di interazione, spettroscopia di massa dopo purificazione del campione biologico con HPLC, metodiche cromatografiche di tipo nano-HPLC.
4. 4. Sequenza amminoacidica in accordo con una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 2 come antigene, per uso in un metodo di produzione di anticorpi monoclonali o policlonali.
5. 5. Sequenza polinucleotidica codificante una qualsiasi delle sequenze amminoacidiche secondo la rivendicazione 1 o 2.
6. 6. Anticorpo monoclonale o policlonale mirato contro la proteina recettore LRP8 umana e suoi frammenti C-terminali come in rivendicazione 1 o 2.
7. 7. Kit per il rilevamento e la quantificazione di LRP8 umana e suoi frammenti C-terminali 837-963, comprendente una micropiastra in cui alcuni pozzetti sono rivestiti da un anticorpo in accordo con la rivendicazione 6, un contenitore per un campione di controllo comprendente una determinata aliquota di proteina LRP8 e di suoi frammenti C-terminali secondo la rivendicazione 1 o 2, un contenitore per una sostanza diluente per il campione di controllo ed uno per il campione da testare, un contenitore per tampone, un contenitore per una soluzione substrato, un contenitore per una soluzione di terminazione della reazione, un contenitore per un tampone di lavaggio.
8. 8. Kit per il rilevamento e la quantificazione di LRP8 umana e suoi frammenti C-terminali 837-963, comprendente almeno un biosensore o chip provvisto di un supporto trasparente su un lato del quale è depositato uno strato metallico avente una superficie libera sulla quale sono fissati gli anticorpi secondo la rivendicazione 6, almeno una cartuccia di supporto microfluidico all’interno della quale viene fatto scorrere un tampone contenente l’analita da rilevare, un contenitore per il tampone dell’analita.
9. 9. Kit per il rilevamento e la quantificazione di LRP8 umana e suoi frammenti C-terminali 837-963, comprendente un supporto a forma di nastro allungato dotato di una superficie sulla quale sono presenti una serie di elementi capillari in successione, un primo elemento che assorbe un fluido campione, un secondo elemento in cui è immagazzinato un coniugato anticorpo-molecola segnale, un terzo elemento dotato di una o più aree in cui una molecola di cattura del coniugato è stata immobilizzata.