KR20190068860A

KR20190068860A - Znf746의 인산화-타이로신 잔기 특이적 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20190068860A
Application number: KR1020170169065A
Authority: KR
Inventors: 이연종; 신주호; 김효정
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2017-12-11
Filing date: 2017-12-11
Publication date: 2019-06-19
Also published as: KR102085673B1

Abstract

본 발명은 파킨슨병 유래 단백질인 ZNF746의 특정 위치의 타이로신이 인산화되는 것을 감지하여, 파킨슨병을 포함한 퇴행성 뇌질환을 조기에 진단할 수 있도록 하는 항체 및 이를 포함하는 조성물 및 키트에 대한 것이고, 또한 이를 이용한 퇴행성 뇌질환의 진단 방법 및 관련 약물의 스크리닝 방법에 대한 것이다. 본 발명의 항체 등은 퇴행성 뇌질환, 특히 파킨슨병을 조기에 발견 하여, 적절한 치료제 및 치료 방법을 환자에게 제공할 수 있도록 하는 효과를 가진다.

Description

ZNF746의 인산화-타이로신 잔기 특이적 항체 및 이의 용도 {Antibodies to ZNF746 Phosphorylated Tyrosine Residue and the use}

본 발명은 파킨슨병 유래 단백질인 ZNF746의 특정 위치의 타이로신이 인산화되는 것을 감지하여, 파킨슨병을 포함한 퇴행성 뇌질환을 조기에 진단할 수 있도록 하는 항체 및 이를 포함하는 조성물 및 키트에 대한 것이며, 상기 항체를 이용하여 퇴행성 뇌질환을 진단하는 방법 및 관련 약물의 스크리닝 방법에 대한 것이다.

급속히 노령화 사회로 진입하는 현대에는 대표적 퇴행성 운동장애 뇌질환인 파킨슨 환자의 수도 급격하게 증가 추세에 있다. 하지만, 주요 병변인 도파민 신경세포의 사멸 및 집적체의 형성을 제어할 수 있는 치료제는 전무하기 때문에 신규 질환 타겟의 발굴이 필요한 실정이며, 뿐만 아니라 질환을 조기에 진단할 수 있는 질환 특이적인 신규 마커의 발굴은 상당한 신경퇴행이 나타나기 이전에 질환을 조기에 발견하여 적절한 조절 치료를 적용하는데 중요하다.

파킨슨병은 발병 원인이 완전히 밝혀지지 않은 "특발성"(特發性, idiopathic) 퇴행(退行)성 신경질환(neurodegenerative disease)에 속하는 것으로, 떨림(tremor), 강직(rigidity) 및 서행(bradykinesis) 등의 증상이 나타난다. 병리학적인 소견으로는 뇌 흑색질(Substantia nigra)에서 도파민 신경세포(dopaminergic neuron)가 소실되어 80% 이상의 도파민의 농도가 감소된 도파민 결핍 증상이 나타나고, 이로서 운동회로 조절의 이상으로 행동학적 이상이 나타난다[Levine 등, Trends Neurosci. 27: 691-697, 2004; Dauer 등, Neuron 39: 889-909, 2003; Moore 등, Brain Res. 30: 119-135, 1971]. 또한, 파킨슨병 환자에서는 루이체(Lewy body)라고 불리는 세포질 내 침전물(cytoplasmic inclusion) 형성이 관찰되고 이의 주 구성단백질은 알파시누클레인(alpha-synuclein)으로 보고되고 있다. 이러한 사실에 근거하여 파킨슨병에서 알파시누클레인이 중요한 역할을 할 것으로 추정하고 있다 [Spillantini 등, Nature 388: 839-840, 1997]. 또한, 산화적 스트레스(oxidative stress)와 미토콘드리아 기능부전(mitochondria dysfunction)도 파킨슨병 발병 기작에 관련이 있을 것으로 추정되고 있다[Grunblatt 등, J. Neural Transm. 111: 1543-1573, 2004].

c-Abl은 non-receptor 타이로신 키나이제로서 산화스트레스 또는 DNA 손상에 의해 활성이 증가하며, 최근 c-Abl의 활성화가 각종 퇴행성 질환 환자의 뇌에서 보고되고 있다. 즉, c-Abl 의 과활성화에 의한 신경세포 독성 기전이 퇴행성 질환인 파킨슨, 알츠하이머, 축색 경화증에서 광범위하게 나타나는 것으로 알려져 있다. 특히 c-Abl의 저해제가 파킨슨 및 축색 경화증 환자에게서 증상을 호전시킨다는 사실이 보고되었으나, 저해제 자체의 독성이 임상 적용에 있어서 큰 단점으로 지적되었다. c-Abl 기질 단백질의 연구 및 이의 타겟 분자의 발굴은 보다 안전하고 효과적인 치료제 개발을 제시할 수 있다.

위와 같이, c-Abl의 인산화 특이 항체가 퇴행성 뇌질환 병변의 진단 마커로 사용될 수 있으나, c-Abl 인산화 항체의 감도가 낮으며, 변형이 잘 되고, 무엇보다 파킨슨 질환에 대한 특이성이 없다. 따라서, c-Abl의 인산화 기질 단백질 중에서 파킨슨 질환에 특이적인 질병 단백질의 발굴은 해당 뇌질환에 대한 선택적인 진단 마커로서의 가치를 가질 수 있다.

이에 본 발명자들은 파킨슨병 환자에게서만 축적이 발견되는 독성 단백질인 ZNF746의 특정 잔기가 환자의 뇌에서 활성화된 c-Abl에 의해 인산화되는 것을 확인하고, 이를 감지하여 파킨슨병 진단용 마커로 활용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

미국 특허 US2014/0378536

본 발명의 목적은 ZNF746의 Y137 인산화 펩타이드 내 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편 또는 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 ZNF746의 Y137 인산화 펩타이드 내 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편 또는 항체를 포함하는 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 ZNF746의 Y137 인산화 펩타이드 내 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편 또는 항체를 포함하는 퇴행성 뇌질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 ZNF746의 Y137 인산화 여부를 조사하는 것을 포함하는 퇴행성 뇌질환 진단 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 후보 물질과 ZNF746을 접촉시키고, ZNF746의 Y137이 인산화되었는지 여부를 조사하고, 상기 후보 물질이 인산화를 저해 또는 촉진하는지 판단하는 과정을 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 ZNF746의 Y137 인산화 펩타이드 내 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편 또는 항체를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 에피토프는 C-ETLVSLD(phosphorylated-Y)AISKPEV-NH2 이며, 이는 ZNF746 단백질의 137번째 Y(타이로신)가 인산화되어 있는 서열이다.

또한, 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 ZNF746 단백질은 인간, 원숭이, 마우스 및 침팬지로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항원 결합 단편 또는 항체는 퇴행성 뇌질환 진단용이며, 바람직하게는 파킨슨병 진단을 위한 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 양태로서, 본 발명은 ZNF746의 Y137 인산화 펩타이드에 결함하는 항원 결합 단편 또는 항체를 포함하는 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물에 대한 것이다.

다른 양태로서, 본 발명은 ZNF746의 Y137 인산화 펩타이드에 결함하는 항원 결합 단편 또는 항체를 포함하는 퇴행성 뇌질환 진단용 키트에 대한 것이다.

다른 양태로서, 본 발명은 ZNF746의 Y137잔기의 인산화 여부를 조사하는 것을 포함하는 퇴행성 뇌질환 진단 방법에 대한 것이다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 인산화 여부의 조사는 Y137의 인산화된 타이로신을 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 항원항체 반응을 통해 수행되는 것인 퇴행성 뇌질환의 진단 방법이며, 상기 퇴행성 뇌질환은 바람직하게는 파킨슨병일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 양태로서, 후보 물질과 ZNF746을 접촉시키고, ZNF746의 Y137의 인산화여부를 조사하고, 상기 후보 물질이 상기 인산화를 저해 또는 촉진하는지를 판단하는 과정을 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료제의 스크리닝 방법을 포함한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 인산화 여부의 조사는, Y137의 인산화된 타이로신을 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 항원항체 반응을 통해 수행되는 것인 퇴행성 뇌질환 치료제의 스크리닝 방법에 대한 것이며, 상기 퇴행성 뇌질환은 바람직하게는 파킨슨병일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 ZNF746의 특정 위치의 타이로신인 Y137이 인산화되는 것을 감지하여, 파킨슨병을 포함한 퇴행성 뇌질환을 조기에 진단할 수 있도록 하는 항체 및 이를 포함하는 조성물 또는 키트와, 이를 이용한 퇴행성 뇌질환의 진단 방법 및 관련 약물의 스크리닝 방법에 대한 것이다. 본 발명의 항체 등은 퇴행성 뇌질환, 특히 파킨슨병을 조기에 발견 하여, 적절한 치료제 및 치료 방법을 환자에게 제공할 수 있도록 하는 효과를 가진다. 퇴행성 질환에 있어, 조기 진단은 치료 효과를 비약적으로 향상시킬 수 있다는 점에서 의미가 있다.

도 1은 사람의 ZNF746 아미노산 서열 중, 타이로신 인산화 가능한 몇 가지 후보 부위 분석을 나타낸 것이다.
도 2는 ZNF746 아미노산 중, Y121, Y137, Y403 부위의 돌연변이 유발 후에 세포에 발현시킨 후 형광표지 등으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 ZNF746 인산화를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 것이다. 또한 도 3B 는 다양한 포유류에서의 ZNF746 서열의 유사 구조를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 표지된 ZNF746 단백질을 발현하는 플라스미드로 세포 형질도입 후, 면역침강 하여 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 KAP과 PARIS 단백질의 분포 양상을 특이 항체를 이용하여 면역 형광 염색으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 SH-SY5Y 세포주에 ZNF746 야생형 또는 돌연변이들을 과발현시킨 후, 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 ZNF746 야생형 및 돌연변이를 과발현 후, Lamp2A , Lamp2B, Lmap2C의 발현량을 측정한 결과이다.
도 8은 ZNF746 야생형 및 돌연변이를 과발현 후, Lamp2A, parkin 및 FLAG-PARIS의 발현을 특이 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도9A는 ZNF746 Y137 인산화 특이 항체의 정제 과정을 나타낸 도식도이며, 도9B는 상기 항체를 이용하여, ZNF746 야생형 또는 Y137F 돌연변이를 발현하는 SH-SY5Y 세포를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 마우스 뇌조직으로부터 분리한 조직의 단백질에 대하여, c-Abl, ZNF746 및 이들의 인산화 정도를 해당 특이 항체를 이용하여 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 파킨슨 마우스 모델의 뇌에서 조직을 분리한 후, c-Abl, ZNF746 및 이들의 인산화 정도를 해당 특이 항체를 이용하여 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 발명은 ZNF746의 Y137 인산화 펩타이드 내 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편 또는 항체에 대한 것으로서, 상기 에피토프는 ZNF746 단백질의 137번째 Y(타이로신)가 인산화되어 있는 서열번호 1의 서열(ETLVSLDYAISKPEV)을 포함한다.

ZNF746(Zink Finger 746)은 파킨-의존성 단백질이며, 파킨슨병 환자의 뇌에서 과발현된다. 다른 이름으로는 PARIS 라고 부른다. 기존에 알려진 바에 따르면, ZNF746(PARIS)의 수준은 파킨(Parkin)에 의해 조절되며, 파킨이 잘못 조절될 경우, PARIS 의존성 신경세포의 손실을 유도한다. 그러나, ZNF746은 파킨슨병 이외의 다른 질환을 가진 환자의 병변에서도 관찰되며, 파킨슨병에만 특이적으로 나타나는 것은 아니므로, 파킨슨병 진단에 더욱 특이적인 항체의 개발이 필요하였다.

본 발명에서는 상기 ZNF746의 특정 부위의 인산화 여부를 관찰하여, 그것이 파킨슨병에만 특이적인 현상인지 여부를 밝혀내었고, 특히 파킨슨병 환자의 병변에서 ZNF746의 137째 잔기의 타이로신(Y, tyrosine)이 인산화되어 있다는 점을 발견하면서, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 용어 “에피토프”(항원결정기, Antigenic determinant)는 항체, B세포, T세포 등의 면역계가 항원을 식별하게 해주는 항원의 특정 부분으로서, 에피토프를 식별하는 항체의 특정 부분은 항원 결합부위 또는 항원 결정부위라고 한다. 본 발명에서 에피토프는 상기 ZNF746의 137번째 잔기의 타이로신이 인산화된 서열을 포함하는 것이며, 보다 바람직하게는 C-ETLVSLD(phosphorylated-Y)AISKPEV-NH2 인 아미노산 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 “항원결정부위”는 본 발명의 에피토프에 결합하는 항체의 특정 서열을 의미하는 것이며, 항체 가변부위에 위치하게 된다. 본 발명의 ZNF746 단백질의 Y137 타이로신 인산화 부위를 포함하는 에피토프를 인식하는 부분이며, 상기 항원 결정부위를 포함하는 항체라면 모두 적용될 수 있다.

본 발명에 사용된 용어 "항체" 또는 "그의 기능적 부분"은 당업계에 인지된 용어이고, 공지된 항원, 특히 이뮤노글로불린 분자 및 이뮤노글로불린 분자의 면역학적 활성 부분 (즉, 항원에 면역특이적으로 결합하는 결합 부위를 함유하는 분자)에 결합하는 분자 또는 분자의 활성 단편을 지칭하는 것으로 이해된다. 본 발명에 따른 이뮤노글로불린은 임의의 유형 (IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 및 IgY) 또는 클래스 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1및 IgA2) 또는 서브클래스의 이뮤노글로불린 분자일 수 있다. 상기 항체의 기능적인 부분에는 단일쇄 가변영역단편 (scFv), (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 상기 단일쇄 가변영역(scFv)은 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 링커 펩타이드를 통해 연결되어 단일쇄 폴리펩티드 형태를 취하는 항체 단편을 의미한다.

"항체"는 모노클로날 항체, 폴리클로날, 키메라, 단일 쇄, 이중특이적, 유인원화, 인간 및 인간화 항체, 낙타류 항체, 디아바디 뿐만 아니라 그의 기능적 부분 또는 활성 단편을 포함하는 것을 의미한다. 공지된 항원에 결합 하는 분자의 활성 단편의 예는 Fab 이뮤노글로불린 발현 라이브러리의 생성물 및 상기 언급된 임의의 항체 및 단편의 에피토프-결합 단편을 포함하여 Fab 및 F(ab')2 단편을 포함한다. 이러한 활성 단편은 다수의 기술에 의해 본 발명의 항체로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 정제된 모노클로날 항체는 펩신과 같은 효소로 절단되고, HPLC 겔 여과에 적용될 수 있다. 이어서, Fab 단편을 함유하는 적절한 분획은 막 여과 등에 의해 수집되고 농축될 수 있다.

"인간화 항체"는 비인간 공여자 이뮤노글로불린으로부터 유래된 CDR을 갖고, 분자의 나머지 이뮤노글로불린-유래된 부분은 하나 (또는 하나 이상)의 인간 이뮤노글로불린(들)으로부터 유래한 것인 조작된 항체의 한 유형을 지칭한다. 인간화 항체는 추가로 그의 프레임워크 영역 중 하나 이상이 인간 또는 영장류 아미노산을 갖는 가변 영역을 갖는 항체를 지칭할 수 있다. 또한, 프레임워크 지지 잔기는 결합 친화도를 보존하도록 변경될 수 있다.

상기 항체는 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 같은 다양한 분자와 결합하여 변형될 수 있다. 변형된 항체는 화학적으로 항체를 변형하여 수득할 수 있다. 이러한 변형 방법은 당업계에서 통상적으로 사용된다.

또한, 상기 항체는 비인간 항체로부터 유래한 변형 부위(variable region)와 인간 항체로부터 유래한 불변 부위(constant region)가 결합된 키메라 항체(chimeric antibody)로 수득되거나, 또는 인간이 아닌 항체로부터 유도된 상보성 결정 부위를 포함하여 인간 항체로부터 유도된 구조 부위(frame work region, FR)와 불변부위가 결합된 인간화 항체(humanized antibody)로 수득될 수 있다. 이러한 항체는 당업계에 알려져 있는 방법을 이용하여 제조될 수 있다.

본 발명에서 항체는 상기 ZNF746 단백질의 Y137 타이로신 인산화 부위를 포함하는 에피토프를 인식하는 항원 결정부위를 포함하는 항체로서, 단일클론항체, 다중클론항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 경우, 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 그러나, 바람직하게는 다중클론항체이며, 다만 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 ZNF746 단백질은 인간, 원숭이, 마우스, 소, 침팬지로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 보다 바람직하게는 인간 또는 마우스로부터 유래된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 항원결합단편 또는 항체는 퇴행성 뇌질환을 진단하기 위한 용도로서 사용될 수 있다. 퇴행성 뇌질환은 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 여러 가지 증상을 유발하는 질환으로서, 발병이 서서히 진행되고, 오랜 기간동안 정상적인 기능을 하다가 증상이 나타나며, 일단 증상이 나타나면 사망시까지 수년 혹은 수 십년에 걸쳐 지속적으로 질병이 진행된다. 대표적인 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머 병, 파킨슨병, 진행성 핵상 마비, 다계통 위축증, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증, 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이소체 질환, 파킨스-ALS-치매 복합증 등이 있으며, 본 발명에서는 특히 파킨슨병 질환의 진단을 위한 항체로서 ZNF746 의 인산화된 Y137 잔기를 사용하였다.

또한 본 발명은 ZNF746의 Y137 인산화 펩타이드에 결합하는 항원 결합 단편 또는 항체를 포함하는 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물에 대한 것이다. 상기 조성물에는 항원 결합 단편 또는 항체 외에도 항체의 구조를 안정하게 유지시켜주는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다. 상기 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물을 이용하면, ZNF746의 Y137 인산화 부위를 특이적으로 인식하는 항체의 양을 분석함으로서, 상기 위치에서의 인산화 여부를 보다 쉽게 조사할 수 있다.

또한 본 발명은 ZNF746의 Y137 인산화 펩타이드에 결합하는 항원 결합 단편 또는 항체를 포함하는 퇴행성 뇌질환 진단용 키트에 대한 것이다.

상기 키트에는 ZNF746의 Y137 인산화 펩타이드에 결합하는 항원 결합 단편 또는 항체 이외에도 키트로 사용되기에 적합하도록 하기 위한 다른 성분들이 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예를들어, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자, dNTPs 및 프라이머를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 시료 내의 ZNF746의 Y137 인산화 펩타이드의 존재를 측정하기 위한 것이면 어떤 것이든 제한 없이 사용될 수 있다. 즉, 키트 내지 시료에 존재하는 ZNF746의 Y137 인산화 펩타이드의 검출은 당업계에 공지된 통상의 기술 내지 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법으로는 ZNF746의 Y137 인산화 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블로팅 방법(Western Blotting) 등을 예로 들 수있다. 또한, 96-웰 내부에 다수의 항체를 고정화하여 한꺼번에 많은 수의 시료를 분석하는 ELISA 변형법이 이용될 수 있다.

상기 키트에는 항체를 이용하여 각종의 면역화학적 반응을 수행하기에 적합한 물질들, 예를 들어, 항체의 보존제, 완충액 등이 포함될 수 있다. 또한, 추가적인 시약을 포함할 수 있으며, 일 예로써는, 발색 효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드로 표지한 접합체(conjugate)로 2차 항체 등이 있다. 발색효소는 퍼록시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 또는 산성 포스파타제(acid phosphatase)(예: 양고추냉이 퍼록시다제(horseradishperoxidase))일 수 있고, 형광물질인 경우, 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸이 가능하다. 또한, 키트는 효소와 발색반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고, 결합된 복합체만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 키트에 있어서, 환자로부터 수득된 시료를 ZNF746의 Y137 인산화 펩타이드에 결합하는 항원 결합 단편 또는 항체와 접촉시키는 경우, 시료는 항체와 접촉 전에 알맞은 정도로 희석될 수 있고, 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기위해 고형상에 고정될 수 있다. 고형상은 유리나 플라스틱, 예를 들어 미세역가플레이트(microtiter plate), 막대, 비드(bead) 또는 미세비드(microbead) 등이 될 수 있다.

또한, 본 발명은 ZNF746의 Y137잔기의 인산화 여부를 조사하는 것을 포함하는 퇴행성 뇌질환 진단 방법에 대한 것이다. 상기 진단은 Y137의 인산화된 타이로신을 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 항원 항체반응을 통해 수행되는 것인 퇴행성 뇌질환의 진단 방법이다.

마지막으로, 본 발명은 후보 물질과 ZNF746을 접촉시키고, ZNF746의 Y137 위치에서 인산화여부를 조사하고, 상기 후보 물질이 인산화를 저해 또는 촉진하는지를 판단하는 과정을 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료제 스크리닝 방법에 대한 것이다.

본 발명의 스크리닝 방법에서, 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 퇴행성 뇌질환, 특히 파킨슨병 치료제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정 되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

c- Abl에 의한 ZNF746 인산화부위 후보 선정

도 1에 도시된 바와 같이, ZNF746 단백질은 N-terminus의 Kruppel-associated box (KRAB) 도메인과 C-terminus의 zinc fingers 도메인 구조를 가진 전사억제 단백질이다. ZNF746의 인산화 부위를 발견하기 위하여, In silico 인산화 예측 프로그램 (NetPhos 3.1 Server)에 의해 인산화 가능성이 큰 부위가 KRAB 도메인의 Y121, Y137과 중간 부위의 Y403임을 예측하였다(도1A). 실제 c-Abl에 의한 인산화 사이트 검증을 위해 각각의 타이로신(Y)을 phenylalanine (F)으로 치환한 돌연변이를 ZNF746이 과발현된 플라스미드에 도입하여 클로닝하였으며, 시퀀싱을 통해 돌연변이 도입을 검증하였다. ZNF746 야생형(WT, Wild type) 및 각각의 돌연변이된 ZNF746을 FLAG로 표지하고, 이를 일시적 주입법(transient transfection)을 통해 SH-SY5Y 세포에 발현시킨 후, FLAG 특이 항체를 이용한 면역형광염색을 통해 확인하였다. 여기에서 핵은 DAPI로 염색하였다. 도2B에서, 형질도입이 성공적으로 이루어졌음을 확인하였다.

<실시예 2>

c- Abl에 의한 ZNF746 인산화 부위 확인

실시예 1에서 선정한 ZNF746 돌연변이 및 ZNF746 야생형에 대하여, 각각의 인산화 정도를 확인하기 위하여, 인산화타이로신(pY) 특이적 항체로 검증하기 위하여 아래와 같이 실험을 수행하였다. HEK-293FT 세포에 각 잔기를 발현시킨 후, ZNF746의 인산화타이로신을 FLAG 특이 항체를 이용하여 면역 침강한 후, 인산화타이로신 검출 항체를 이용하여 웨스턴블랏을 통해 확인하였다. 그 결과, 도 3A에서 보듯이, Y137 잔기가 c-Abl에 의한 주요 인산화 사이트임을 확인하였다.

또한, 다양한 포유류의 ZNF746 Ortholog에 대하여, Y137 부위를 확인하기 위한 다중 서열정렬(multiple alignment)을 시행하였다. 사람(H. sapiens), 침팬지(P. troglodytes), 히말라야 원숭이(M. mulatta), 소(M. musculus), 쥐(R. norvegicus)의 ZNF746 Homolog를 분석한 결과, Y137 부위의 아미노산 서열이 진화론적으로 잘 보존되어 있음을 확인하였다(도 3B).

<실시예 3>

ZNF746 Y137의 인산화에 의한 유전자 발현 억제 효과

KAP-1은 KRAB 도메인을 통해 ZNFs와 결합 후 다양한 전사억제 인자들과 (histone deacetylase complex, histone methyl transferase etc.) 결합하여 타겟 유전자의 발현을 억제하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. (도 5) 이 때, ZNF746의 Y137의 인산화가 KRAB 도메인을 통한 KAP-1 결합에 영향을 주는지 여부를 확인하기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다. SH-SY5Y 세포에 FLAG-ZNF746, HA-KAP을 발현하는 플라스미드를 형질 도입한 후 전체 단백질 용출물에 대해서 FLAG 에 대한 특이 항체를 이용한 면역침강 (IP:FLAG) 실험 후 ZNF746과 KAP 단백질의 상호 결합을 표시된 항체를 이용하여 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 그 결과, KAP과 ZNF746가 정상일 경우에는 모두 결합되는 것을 도 4A에서와 같이 확인하였다.

또한, ZNF746 의 Y137의 타이로신을 페닐알라민으로 치환하여 돌연변이를 일으킨 후(Y137F), 상기와 같은 방법으로 SH-SY5Y 세포에 FLAG-ZNF746 야생형(WT) 또는 돌연변이들 (Y121F, Y137F), 그리고 HA-KAP을 발현하는 플라스미드를 표시된 조합으로 형질도입한 후, 웨스턴블랏으로 확인하였다. 그 결과, 돌연변이를 일으킨 Y137F에서는 KAP과 ZNF746의 결합이 현저히 떨어지는 것을 확인하였다 (도 4B). 이는 Y137 인산화가 KAP와 결합 및 타겟 유전자의 발현을 저해하는데 관여하고 있음을 보여주는 결과이다.

<실시예 4>

ZNF746p 인산화에 의한 세포독성 확인

ZNF746은 과발현 시 세포 독성을 유발하는 것으로 보고되어 있으나, 야생형 ZNF746에 의한 세포 독성이 인산화부위 돌연변이에서는 감소된다. 이를 확인하기 위하여, SH-SY5Y 세포주에 ZNF746 야생형 및 Y121F, Y403F 및 Y137F 돌연변이들을 과 발현시킨후 48시간 동안 배양하였다. 세포 독성을 trypan blue exclusion 에세이를 통해 확인하였다. (그룹 당, n=5). 그 결과, 야생형 ZNF746에 의한 40%정도의 세포 사멸이 Y137F 돌연변이를 포함한 Y121F, 그리고 Y403F 돌연변이에서 20~30% 수준으로 약해지는 것을 확인하였다. 또한 동일한 방법으로 ZNF746 및 c-Abl을 발현시킨 결과, 두 유전자를 각각 발현시킨 경우 보다, 동시에 발현시킨 경우에는 세포 독성이 더욱 증가하여 세포 생존능이 감소하는 것을 확인하였다. (도 6B)

위와 같이 ZNF746 및 c-Abl을 과 발현시킨 SH-SY5Y 세포에 c-Abl 저해제인 STI를 10μM의 농도로 처리하여 44시간 배양한 후, 세포독성을 측정하였다. STI는 c-Abl 키나아제 특이적인 저해제로서, 세포 독성을 억제하는 효과를 가진다. 그 결과, 도 6C에서 보듯이, STI를 처리할 경우, 세포 생존능이 증가되었으며, 이는 c-Abl의 발현이 저해될 경우, c-Abl에 의한 세포 독성 뿐만 아니라, ZNF746에 의한 세포독성 또한 감소되는 결과를 보여준다.

상기 확인된 세포 독성 감소 효과에 대하여, ZNF746 및 이의 돌연변이와 c-Abl을 조합하여 과발현한 후, 48시간동안 배양하고 trypan blue exclusion으로 확인하였다. 앞서 실험했던 바, ZNF746 및 c-Abl을 과발현한 경우 세포독성이 증가되었음을 확인하였다. 그러나, ZNF746 돌연변이인 Y121F, Y137F, Y403F와 함께 c-Abl을 과발현한 경우에는 세포 독성이 감소하며, 세포 생존률이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. (도 6D)

<실시예 5>

타겟 단백질의 선정( Lamp2a )

ZNF746의 인산화에 의한 분자 타겟으로서, Lamp2a 단백질의 전사 억제 효과가 있는지 여부를 확인하였다. Low serum (FBS 5 %)에서 배양한 SH-SY5Y 세포에 ZNF746 야생형 및 돌연변이를 과 발현 시킨 후 (48 hrs) Lamp2A(A), Lamp2B(B), 그리고 Lam2C(C)의 mRNA 발현량을 RTQ-PCR을 통해 정량 (n = 3)하였다. 그 결과, Lamp2a의 경우, 다른 isoform과 다르게, ZNF746의 Y137 부위에 대한 인산화에 특이적으로 조절된다. 즉, 도 7A에서 보듯이, ZNF746에 의한 Lamp2a의 전사 억제가 Y137F 돌연변이에 의해서는 나타나지 않았다.

위와 같은 Lamp2a에 대한 발현 억제 효과를 웨스턴 블랏으로 재 확인하였다. SH-SY5Y 세포에 ZNF746 야생형 및 Y137F를 과 발현시킨후 (44 hrs) low serum (5% FBS, 50 hrs)에서 배양 시 Lamp2A, parkin 및 FLAG-PARIS의 발현을 특이 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다(β-actin: loading control). 각 샘플 그룹에서 Lamp2a 웨스턴 블랏 밴드의 강도를 정량하여, β-actin의 밴드 강도로 표준화한 결과를 그래프로 나타내었다. 그 결과, Lamp2a 의 단백질 발현량이 도 8에 도시된 바와 같이, Y137F 돌연변이에서 현저하게 억제된 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 6>

ZNF746 인산화 특이 항체의 개발

Y137 인산화 ZNF746 펩타이드(CETLVSLD( phosphorylated - Y)AISKPEV)(중간의 tyrosine (Y)는 인산화된 형태임.)를 주입하여 토끼에서 ZNF746 인산화를 검출할 수 있는 항혈청을 생산하였다. 인산화 및 비인산화 펩타이드를 conjugation 시킨 컬럼을 이용하여 인산화된 ZNF746만을 인지하는 인산화 특이 ZNF746 항체를 정제하였다. 즉, 토끼에서 얻은 항혈청을 1차적으로 인산화 펩티드가 conjugation 된 컬럼에 통과시켜 Y137 인산화 ZNF746 특이 결합 항체 및 인산화 여부와 관계없이 펩티드의 다른 아미노산 부위에 결합하는 ZNF746 항체들을 컬럼에 결합시켰다. Y137 인산화 ZNF746 특이 결합 항체 및 이외의 ZNF746 항체들은 low pH glycine elution 버퍼로 회수한 후 바로 중화시켰다. 이렇게 얻은 항체 혼합물은 2번째 컬럼인 Y137 비인산화 ZNF746 펩티드가 conjugation된 컬럼에 통과시킴으로써 Y137 인산화 ZNF746 특이 결합 항체만이 컬럼에 결합하지 않고 elution 되어 정제를 마무리 할 수 있었다.

위와 같이 정제된 항체를 이용하여, ZNF746의 Y137 인산화를 검출하였다. 그 결과, c-Abl을 동시에 발현시킨 ZNF746은 검출 빈도가 매우 강하고, Y137F 돌연변이의 경우에는 전혀 검출이 되지 않았다. (도 9B)

<실시예 7>

뇌의 노화와 ZNF746의 연관성 실험

ZNF746 인산화와 뇌조직 노화와의 연관성을 확인하기 위해 8개월령과 34개월령의 마우스 중뇌 흑질을 포함한 기저핵 조직을 검출하고, 전체 단백질 용출물에 대하여, c-Abl 및 ZNF746 및 이들의 인산화 정도를 이를 실시예 6에서 정제된 특이 항체를 활용하여 웨스턴 블랏으로 확인하였다(β-actin: loading control). 또한 웨스턴 블랏 밴드 강도를 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 측정한 후, 전체 c-Abl에 대한 인산화 및 c-Abl의 상대적인 밴드 강도를 8개월령 및 34개월령 샘플에 대해서 정량화하여 8 개월령 샘플의 정량값을 기준으로 34개월령 샘플의 상대적인 측정값을 막대 그래프로 표현하였다. (8개월령 n=4 ; 34개월령 n=6). Total ZNF746에 대한 인산화 ZNF746의 상대적인 밴드 강도를 adult 및 old 샘플에 대해서 정량화 한 후, Adult 샘플의 정량값을 기준으로 old 샘플의 상대적인 측정값을 막대 그래프로 표현 (n = 4 adult; 6 old mice). 그 결과, 노화 뇌조직에서 c-Abl의 인산화가 눈에 띄게 증가된 것을 확인하였다.

<실시예 8>

파킨슨 마우스 모델에서 ZNF746의 인산화

파킨슨 마우스 모델 구축을 위하여 미토콘드리아 독소인 MPTP를 복강 주입한 마우스와, Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)를 대조군으로 주입한 마우스로부터 중뇌 흑질 (SN) 조직을 분리하였다. 전체 단백질 용출물에 대하여, c-Abl, ZNF746 및 이들의 인산화 정도를 해당 특이 항체를 이용하여 웨스턴 블랏으로 확인하였다(β-actin: loading control). 그 결과, 도 11A에서 보듯이, c-Abl의 인산화는 줄어든 반면, ZNF746의 Y137 인산화는 유의적으로 증가됨을 확인하였다. 이는 Y137이 파킨슨병을 진단하는데 특이적인 마커로 사용될 수 있음을 보여주는 결과이다.

또한 웨스턴 블랏 밴드 강도를 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 측정한 후, 전체 c-Abl에 대한 인산화 및 c-Abl의 상대적인 밴드 강도를 두 그룹의 샘플에 대해서 정량화 (n = 3 per group)하여, DPBS 샘플의 정량값을 기준으로 MPTP 샘플의 상대적인 측정값을 막대 그래프로 표현하였다. 그 결과, 도 11B 및 도 11C에서 보듯이, 인산화 c-Abl의 정도는 MPTP 주입 시 감소되었으나, PARIS, 즉 Y137의 인산화 정도는 MPTP 주입에 의해서 증가되는 것을 확인하였다.

이와 같은 결과는, c-Abl의 인산화의 경우, 일시적으로 변화할 수 있지만, 기질 단백질 ZNF746의 인산화는 세포 사멸과 비례하여 안정적으로 증가되며, 이는 파킨슨 진단 마커로서 보다 안정적으로 이용될 수 있는 가능성을 제시하는 것이다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

ZNF746의 Y137 인산화 펩타이드내 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단편 또는 항체.
제1항에 있어서, 상기 에피토프는 서열번호 1의 타이로신(Y)이 인산화된 C-ETLVSLD(phosphorylated)YAISKPEV-NH2 인 항원 결합 단편 또는 항체.
제1항에 있어서, 상기 ZNF746 단백질은 인간, 원숭이, 마우스, 소, 침팬지로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질로부터 유래된 것인 항원 결합 단편 또는 항체.
제1항 내지 제3항에 있어서, 상기 항원 결합 단편 또는 항체는 퇴행성 뇌질환 조기 진단용인 것인, 항원 결합 단편 또는 항체.
제4항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병인 항원 결합 단편 또는 항체.
ZNF746의 Y137 인산화 펩타이드에 결합하는 항원 결합 단편 또는 항체를 포함하는 퇴행성 뇌질환 진단용 조성물.
ZNF746의 Y137 인산화 펩타이드에 결합하는 항원 결합 단편 또는 항체를 포함하는 퇴행성 뇌질환 진단용 키트.
ZNF746의 Y137잔기의 인산화 여부를 조사하는 것을 포함하는 퇴행성 뇌질환 진단 방법.
제8항에 있어서, 상기 인산화 여부의 조사는 Y137의 인산화된 타이로신을 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 항원항체 반응을 통해 수행되는 것인 퇴행성 뇌질환의 진단 방법.
제8항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병인 것을 특징으로 하는 진단 방법.
후보 물질과 ZNF746을 접촉시키고,
ZNF746의 Y137 위치에서 인산화여부를 조사하고,
상기 후보 물질이 인산화를 저해 또는 촉진하는지를 판단하는 과정을 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료제 스크리닝 방법.
제11항에 있어서, 상기 인산화 여부의 조사는 Y137의 인산화된 타이로신을 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 항원-항체 반응을 통해 수행되는 것인 퇴행성 뇌질환 치료제 스크리닝 방법.
제11항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병인 것을 특징으로 하는 치료제 스크리닝 방법.