IT201800005359A1 - Ceppo probiotico Lactobacillus kefiri SGL 13 e suo uso per la prevenzione e il trattamento delle infiammazioni intestinali e nella prevenzione delle neoplasie intestinali - Google Patents
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Description
Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo:
Ceppo probiotico Lactobacillus kefiri SGL 13 e suo uso per la prevenzione e il trattamento delle infiammazioni intestinali e nella prevenzione delle neoplasie intestinali
DESCRIZIONE CAMPO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione riguarda il ceppo probiotico Lactobacillus kefiri SGL 13 ed il suo impiego da solo o in associazione con prebiotici ed estratti vegetali, per la realizzazione di una composizione alimentare e farmaceutica per l’uso come integratore, dispositivo medico o farmaceutico. Viene inoltre descritto l’uso del ceppo probiotico Lactobacillus kefiri SGL 13 nella prevenzione e nel trattamento delle infiammazioni intestinali.
STATO DELLA TECNICA
Le interazioni tra i batteri commensali, le cellule epiteliali intestinali e le cellule immunitarie svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento dell'omeostasi intestinale. Il riconoscimento microbico attraverso specifici recettori induce l'espressione e il rilascio di diversi mediatori immunitari, come chemochine e citochine pro- o antinfiammatorie che contribuiscono ad orchestrare sia la risposta immunitaria innata che adattativa. L'uso dei probiotici per modulare le risposte immunitarie a livello mucosale e sistemico costituisce ad oggi un'alternativa molto interessante per quanto riguarda la prevenzione e la cura delle malattie infettive di diverse immunopatie come le malattie infiammatorie intestinali (IBD) e le allergie o anche i disordini metabolici.
Importanti proprietà immunomodulatorie ed antiinfiammatorie sono attribuibili ad un prodotto fermentato noto come Kefir.
I granuli di kefir rappresentano una composizione complessa di specie microbiche come la predominanza di batteri lattici, batteri acetici, lieviti e funghi. Tali granuli se utilizzati per fermentare il latte danno origine ad una bevanda salutistica chiamata “Kefir” utilizzata da secoli nei paesi caucasici e ad oggi diffusa in tutto il mondo, con effetti salutistici sulle popolazioni che ne fanno un regolare uso. Infatti diverse proprietà benefiche sono state associate al consumo di kefir: immunostimolanti, antimicrobiche, antiinfiammatorie e antitumorali. Pertanto lo studio delle proprietà probiotiche dei microrganismi isolati dal kefir costituisce un campo di grande interesse per lo sviluppo di alimenti funzionali.
Le specie microbiche presenti nei granuli di kefir comprendono: batteri lattici omofermentanti ed eterofermentanti e lieviti fermentanti il lattosio e non. Lactobacillus paracasei ssp. paracasei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus plantarum e L. kefiranofaciens sono le specie predominanti all’interno dei granuli di kefir. Tuttavia, queste specie rappresentano solo il 20% dei lattobacilli nella bevanda finale fermentata, poichè l’80% è costituito da Lactobacillus kefiri.
Diversi studi riportano le proprietà immunomodulanti e antiinfiammatorie di L. kefiri. Il ceppo L. kefiri IM002 è in grado di attenuare la risposta pro-infiammatoria nelle cellule epiteliali intestinali HT-29 indotta da Salmonella Typhimurium, attraverso la riduzione della secrezione di IL-8, uno dei principali mediatori della risposta infiammatoria.
In un più recente studio in vivo, è stato dimostrato che la somministrazione giornaliera per 21 giorni, di un ceppo di L. kefiri nel topo è correlata ad un aumento delle IgA secretorie a livello fecale, che rappresentano un elemento chiave nel mantenimento dell’omeostasi intestinale e nella protezione della mucosa intestinale dai patogeni. Inoltre già a partire da una settimana di somministrazione, si ha una riduzione a livello dell’ileo, delle citochine pro-infiammatorie IL-1 e IL-17A. Dopo 21 giorni, a livello delle placche di Peyer delle citochine IL-6, GM-CSF, IL-17A e IFN–, a livello dei linfonodi mesenterici di IL-6, GM-CSF e IL-17A e nel colon di GM-CSF, IFN– e IL-1.
Sempre a livello dell’ileo gli animali trattati presentano un aumento dei livelli di IL-10, anti-infiammatoria, così come della chemochina CXCL-1 (funzionalmente analoga all’IL-8 umana) coinvolta nel reclutamento dei neutrofili dalla lamina propria all’epitelio, essenziale nella protezione delle coliti indotta da destrano sodio solfato (DSS).
Oltre alla regolazione della risposta immunitaria ed infiammatoria L. kefiri, come molti altri lattobacilli è in grado di prevenire l’invasione da parte di alcuni enteropatogeni a livello intestinale, da un lato sfruttando le proprietà adesive all’epitelio, quindi riducendo i siti di legame per i patogeni, dall’altro attraverso un meccanismo di aggregazione con i patogeni stessi. L'adesione alla mucosa che riveste il tratto intestinale è il primo passo richiesto per un probiotico per interagire con le cellule ospiti e innescare una particolare risposta.
Gli esopolisaccaridi (EPS) prodotti dai fermenti lattici, e in modo particolare da quelle specie che sono poi all’origine dei granuli di kefiri, hanno un ruolo cruciale non solo per i prodotti fermentati (in essi determinano la consistenza, la texture e le proprietà reologiche) ma anche nei processi di prevenzione dei biofilm, attività antiossidante, proprietà anticancro e immunomodulatoria. Gli EPS sono lunghe catene saccaridiche i cui componenti principali sono monosaccaridi quali: glucosio, galattosio, fruttosio e mannosio. I meccanismi attraverso i quali queste molecole attuano le loro proprietà benefiche sono ad oggi ancora poco chiari, ma numerose sono le evidenze che parte degli effetti probiotici dei batteri lattici sono imputabili a composti bioattivi di superficie quali gli EPS.
Un ruolo cruciale nei meccanismi di adesione e aggregazione è svolto anche da altre molecole di superficie, proteine note come S-layer. E’ stata dimostrata la presenza di proteine S-layer in L. kefiri. Diversi studi dimostrano come alla base delle proprietà probiotiche di alcuni ceppi L. kefiri vi è un coinvolgimento di tali proteine. In particolare, esse sono capaci di prevenire l'invasione di cellule Caco-2 da parte della Salmonella enterica e di inibire su cellule Vero l’effetto citotossico delle tossine del Clostridium difficile.
La rimozione mediante estrazione con cloruro di litio ed idrossido di sodio delle S-layer in alcuni ceppi di L. kefiri riduce notevolmente le proprietà adesive di tali ceppi alla mucosa gastrointestinale.
Recenti studi hanno dimostrato che le S-layer di un ceppo di L. kefiri possiedono anche proprietà immunomodulatorie in quanto sono in grado di aumentare la secrezione di citochine IL-6 e IL-10 da parte linee cellulari di macrofagi murini stimolati con LPS di e. coli, rispetto alle cellule trattate solo con LPS.
Negli ultimi anni è emersa l’importanza dello studio della sequenza amminoacidica delle S-layer al fine di differenziare i ceppi di L. kefiri e per comprendere meglio i meccanismi coinvolti nella funzionalità di tali proteine. Infatti la variabilità della sequenza dei geni che codificano per le S-layer in particolare a livello del Cterminale, dove si riscontrano le principali differenze di sequenza tra i vari ceppi, può essere sfruttata proprio per distinguere i vari ceppi e individuare quali domini proteici sono principalmente responsabili delle proprietà di adesione e aggregazione.
Un altro meccanismo attraverso cui i probiotici tra cui L. kefiri sono in grado di regolare i processi infiammatori riguarda la produzione di acidi grassi a corta catena (SCFAs). (19). Tra gli SCFAs prodotti, quelli più studiati sono l’acido acetico, l’acido propionico e l’acido butirrico. In generale, gli SCFA, come propionato e butirrato, inibiscono l'espressione indotta da stimoli delle molecole di adesione, la produzione di chemochine e di conseguenza sopprimono il reclutamento monociti/macrofagi e neutrofili, suggerendo un'azione antinfiammatoria. La quantità e la tipologia degli SCFAs prodotti a livello intestinale è correlata allo sviluppo di numerose patologie, tra cui le infiammazioni intestinali (IBD), in particolare è stato suggerito un abbassamento del livello di acido butirrico nei colonociti per contribuire alla genesi della colite ulcerosa.
Per quanto riguarda le proprietà antitumorali è stato dimostrato che un ceppo di L. kefiri è in grado di indurre l’apoptosi in cellule umane di adenocarcinoma gastrico (AGS), in modo dose-dipendente, senza interferire con le cellule mononucleate del sangue periferico. Nelle cellule AGS trattate con L. kefiri si assiste ad una ridotta espressione di Bcl-2 e ad una diminuzione del potenziale di membrana mitocondriale con conseguente rilascio di molecole pro-apoptotiche che causano l'attivazione delle caspasi e alla fine portano all'apoptosi.
Effetti simili sono stati dimostrati anche su linee cellulari umane di leucemia mieloide (HL60/AR).
Tutti questi dati complessivamente supportano il ruolo di L. kefiri nella modulazione delle risposte immunitarie e infiammatorie a livello della mucosa intestinale ma anche a livello sistemico e ne promuovono l’utilizzo per la prevenzione e cura delle malattie intestinali così come anche di altre patologie.
Negli ultimi anni, in tale ambito, sono emersi anche gli effetti benefici di alcuni estratti vegetali come l’Andrographis paniculata con proprietà antimicrobiche, antinfiammatorie e immunostimolanti. L’andrografolide è il maggior componente attivo di tale fitocomplesso, presente soprattutto nelle foglie dell’arbusto. Si tratta di un diterpene lattone tradizionalmente utilizzato nel nord Europa per trattamento e profilassi del raffreddore. Nonostante le attività secondarie come agente antibatterico, anti-virale, immunostimolante, epatoprotettivo ed anti-cancerogeno siano state ampiamente documentate, la sua principale funzione rimane quella di antiinfiammatorio. L’andrografolide impedisce l’attivazione di diverse vie di segnalazione infiammatoria, come la MAPK/ERK TLR3-dipendente o la JAK/STAT stimolata dall’IFN-β. Sono così inibite la sintesi di COX-2, nonché di prostaglandine (PGE2 nello specifico), l’attivazione del fattore di trascrizione Nf-Kb, la sintesi di IFN-β e di citochine pro-infiammatorie. In seguito ad una ridotta maturazione di cellule dendritiche, questo diterpene previene l’attivazione e maturazione di cellule T, cui segue un’ulteriore diminuzione interleuchine infiammatorie, come IL-2 e IL-6, di macrofagi e di IFN-γ nella sorgente flogistica. In seguito a trattamento di cellule murine con andrografolide è stata, dunque, osservata una riduzione generale di fattori dell’infiammazione: i-NOS, PGE2, TNF-α, interferoni ed interleuchine. L’associazione sinergica tra probiotici ed estratti vegetali potrebbe rappresentare una strategia efficace e sicura per potenziare gli effetti benefici di entrambi.
Per arrivare ad ottenere un vantaggio effettivo con l’assunzione del kefir bevanda, in modo tale da permettere di modulare le risposte immunitarie a livello della mucosa intestinale e a livello sistemico, è necessario l’assunzione di quantità elevate dello stesso kefir. Il kefir, ha un sapore aspro e dal punto di vista calorico ha l’inconveniente che dovendolo assumerne più volte al giorno per avere un beneficio, può essere causa di un aumento di peso indesiderato. Il kefir infatti contiene quantità molto variabili di grassi, a seconda del tipo di kefir, principalmente grassi saturi. Infine, per ovviare al gusto non sempre gradevole, è necessaria l’assunzione di zuccheri ed aromatizzanti, spesso calorici. Inoltre la fermentazione non controllata dei granuli di kefir non garantisce la standardizzazione del titolo dei fermenti e delle specie rappresentate.
Scopo della presente invenzione è pertanto quello di fornire una alternativa al kefir bevanda, che abbia gli stessi vantaggi dal punto di vista dei benefici sulla salute, ma che non presenti gli svantaggi noti del prodotto, garantendo una corretta definizione tassonomica dei fermenti, un corretto titolo e la standardizzazione dell’assunzione.
SOMMARIO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione ha lo scopo di fornire un ceppo batterico appartenente alla specie Lactobacillus kefiri, in cui detto ceppo è L. kefiri SGL 13 depositato con il numero di accesso DSM 27331 in data 13/06/2013 presso il Centro Internazionale di deposito Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Il ceppo L. kefiri SGL 13 DSM 27331, è stato depositato a nome di MD’E srl, via Nazionale 339, Castelnuovo Vomano (TE) 64020 Italia, che insieme a Sintal Dietetics fa parte della medesima rete di imprese.
Sotto un ulteriore aspetto l’invenzione concerne una composizione comprendente il ceppo batterico L. kefiri SGL 13, opzionalmente addizionata di eccipienti farmacologicamente accettabili.
L’invenzione concerne ulteriormente una composizione comprendente il ceppo batterico L. kefiri SGL 13, un estratto vegetale di Andrographis paniculata e/o uno o più prebiotici, opzionalmente addizionata di eccipienti farmacologicamente accettabili.
Sotto un ulteriore aspetto l’invenzione concerne la composizione comprendente il ceppo batterico L. kefiri SGL 13, per l’uso come medicamento.
In particolare detto medicamento è per l’uso nel trattamento e nella prevenzione delle infiammazioni intestinali.
DESCRIZIONE DELLE FIGURE
L’invenzione verrà ora descritta in dettaglio e facendo riferimento alle Figure allegate in cui:
Figura 1 riporta la fotografia di un gel di agarosio in cui si vede un’amplificazione con primer specie-specifici: B1 e B2 (bianchi, campioni privi di DNA per verificare l’assenza di contaminazione nella mix di PCR), C+ e C- (controllo positivo e controllo negativo rispetto al DNA amplificato), S (campione amplificato corrispondente a L. kefiri SGL 13 per comparsa della banda da 500 pb a conferma della specie, M (marcatore di peso molecolare).
Figura 2 riporta i grafici dell’attività antiinfiammatoria del Lactobacillus kefiri in cocultura con la linea cellulare intestinale HT-29 stimolata con LPS. A) vitalità cellulare espressa come numero di cellule vitali, B) vitalità cellulare espressa come % di sopravvivenza, C) dosaggi di IL-8 nei campioni non trattati (NT controllo), nei campioni stimolati con LPS (10 ng/ml) e nei campioni trattati con Lactobacillus kefiri vitale ed inattivato termicamente (10x10<+9>CFU/pozzetto).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
La presente invenzione ha lo scopo di fornire un ceppo batterico appartenente alla specie Lactobacillus kefiri, in cui detto ceppo è L. kefiri SGL 13 depositato con il numero di accesso DSM 27331 in data 13/06/2013 presso il Centro Internazionale di deposito Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.
Sotto un ulteriore aspetto l’invenzione concerne una composizione comprendente il ceppo batterico L. kefiri SGL 13, opzionalmente addizionata di eccipienti farmacologicamente accettabili.
Il ceppo batterico L. kefiri SGL 13 viene vantaggiosamente preparato sotto forma di composizione. Idonee composizioni possono essere in forma di polveri, capsule, compresse, granulato, gocce e sciroppi, chewing gum. I range di utilizzo del fermento vanno da 1 miliardo/dose a 20 miliardi/dose, preferibilmente tale range va da 200 miliardi/dose a 20 miliardi/dose, più preferibilmente da 50 miliardi/dose a 40 miliardi/dose.
L’invenzione concerne ulteriormente una composizione comprendente il ceppo batterico L. kefiri SGL 13, e un estratto vegetale.
In una forma preferita, detto estratto vegetale è un estratto di Andrographis paniculata, Curcuma, Boswellia serrata, tocotrienoli (anche estratti da vegetali ricchi in vitamina E che hanno attività antiossidante), finocchio (Foeniculum vulgare), liquirizia (Glycyrrhiza glabra), zenzero (Zingiber officinale), Melissa (Melissa officinalis), Altea (Althaea officinalis), menta (Mentha L.), timo (Thymus L.) e rosmarino (Rosmarinus officinalis oli essenziali OE o estratti secchi ES), thè verde. In una forma ancora più preferita, detto estratto vegetale è un estratto di Andrographis paniculata.
Le possibili composizioni possono essere: semplici polveri premiscelate, forme farmaceutiche finite: capsule, compresse, bustine, gocce e sciroppi, chewing gum. I range di utilizzo del fermento vanno da 1 miliardo/dose a 20 miliardi/dose per il fermento e da 0.1 g/dose a 1 g/dose per l’estratto di Andrographis paniculata.
Nella presente invenzione quando si impiega la definizione:
- “prebiotico” si intende ogni sostanza che, presente nel cibo, non viene assorbita dall'organismo, ma è utilizzata dalla flora intestinale. I prebiotici sono nella grande maggioranza carboidrati, in particolare oligosaccaridi. I prebiotici favoriscono la crescita e l'attività di specie batteriche importanti per la salute digestiva dell'organismo ospite; e
- “probiotico” si intende un microorganismo vivo, non patogeno, presente negli alimenti o aggiunti ad essi che, somministrato in quantità adeguata, apporta un beneficio alla salute dell'ospite. I batteri lattici (LAB, Lactic Acid Bacteria), per la maggior parte rappresentati dai lactobacilli, e i bifidobatteri sono i più comuni tipi di microrganismi probiotici.
Vantaggiosamente, la composizione comprendente il ceppo batterico L. kefiri SGL 13 può ulteriormente comprendere uno o più prebiotici oppure detta composizione può ulteriormente comprendere un estratto vegetale e uno o più prebiotici.
In una forma preferita, detto prebiotico è scelto dal gruppo consistente in GOS (gluco-oligosaccaridi), FOS (frutto-oligosaccaridi), Fibra di Guar, Inulina, MOS (mannanoligosaccaridi), pectine, Glucomannano.
Vantaggiosamente le composizioni comprendenti:
- il ceppo batterico L. kefiri SGL 13;
- il ceppo batterico L. kefiri SGL 13 e un estratto vegetale di Andrographis paniculata;
- il ceppo batterico L. kefiri SGL 13 e uno o più prebiotici;
- il ceppo batterico L. kefiri SGL 13, un estratto vegetale di Andrographis paniculata e uno o più prebiotici, hanno attività probiotica.
Le composizioni secondo l’invenzione possono essere in forma solida o liquida. Nelle composizioni secondo la presente invenzione i dosaggi sono in un range che va da 1 miliardo/dose a 20 miliardi/dose per il fermento SGL 13, preferibilmente tale range va da 200 miliardi/dose a 20 miliardi/dose, più preferibilmente da 50 miliardi/dose a 40 miliardi/dose, in un range che va a da 0.1 g/dose a 5 g/dose per il prebiotico e in un range che va a da 0.1 g/dose a 1 g/dose per l’estratto di Andrographis paniculata.
Le composizioni secondo l’invenzione possono essere impiegato per l’uso come medicamento.
Le composizioni secondo la presente invenzione hanno un’azione antinfiammatoria, immunomodulante e antitumorale, infatti permettono di modulare le risposte immunitarie e infiammatorie a livello della mucosa intestinale e a livello sistemico, al fine di garantire il mantenimento dell'omeostasi del sistema gastrointestinale prevenendo l’insorgenza di malattie cancerose intestinali.
Idonee composizioni possono essere in forma di polveri, capsule, compresse, granulati, gocce e sciroppi, chewing gum.
In particolare detto medicamento è per l’uso nel trattamento e nella prevenzione delle infiammazioni intestinali e nel trattamento e nella prevenzione delle neoplasie intestinali. In particolare, dette infiammazioni intestinali possono essere scelte dal gruppo consistente in colite ischemica, colite linfocitica, colite ulcerosa, colite da diversione, pauciti, morbo di Crohn ed enterocoliti tra cui la necrotizzante e tutte la malattie infiammatorie acute e croniche intestinali in genere (IBDs).
Pertanto il presente lavoro riguarda l’identificazione e la caratterizzazione delle proprietà probiotiche del ceppo L. kefiri SGL 13 e il suo utilizzo ai fini terapeutici sopra specificati.
Le composizioni secondo l’invenzione possono essere ulteriormente impiegate per l’uso alimentare e come integratore.
Idonee composizioni alimentari possono essere in forma di bevanda, preferibilmente un succo di frutta, caffè, tè e un soft drink. [
L’invenzione concerne inoltre un dispositivo medico o farmaceutico comprendente le composizioni comprendenti:
- il ceppo batterico L. kefiri SGL 13;
- il ceppo batterico L. kefiri SGL 13 e un estratto vegetale di Andrographis paniculata;
- il ceppo batterico L. kefiri SGL 13 e uno o più prebiotici; e
- il ceppo batterico L. kefiri SGL 13, un estratto vegetale di Andrographis paniculata e uno o più prebiotici.
Le composizioni comprendenti le associazioni tra L. kefiri SGL 13 e l’estratto vegetale di Andrographis paniculata e uno o più prebiotici permettono di potenziare gli effetti benefici della formulazione risultante dall’associazione.
Si riportano di seguito Esempi di realizzazione della presente invenzione forniti a titolo illustrativo.
ESEMPI
Esempio 1: Isolamento del ceppo
Il ceppo è stato isolato da granuli di kefir. I granuli sono stati risospesi in latte, incubati per 30 minuti a 37°C e isolati sul terreno selettivo LAMVAB (LV) per lattobacilli resistenti alla vancomicina.
Per ottenere 1 litro di terreno LAMVAB è stata preparata la soluzione A, sciogliendo in 500 ml di acqua distillata i seguenti componenti:
MRS Broth 52.2 g/l
L-Cisteina 0.25 g/l
Verde Bromocresolo (in etanolo 0,25%) 3 ml/l
La soluzione A è stata portata a pH 5 con HCl 4 N e sterilizzata in autoclave a 110°C per 30 minuti. Successivamente è stata preparata la soluzione B, risospendendo 18 g di agar in 500 ml di acqua distillata, sterilizzata anch’essa a 110°C per 30 minuti. Dopo essere state raffreddate a 55°C, le soluzioni A e B sono state unite. Il terreno agarizzato è stato addizionato di 20 mg/l di vancomicina prima di essere versato in piastra.
RISULTATI:
l ceppo è stato isolato da granuli di kefir attraverso l’utilizzo del terreno selettivo per lattobacilli vancomicina resistenti LAMVAB (LV). Dopo incubazione a 37°C in anaerobiosi o/n, sulle piastre di LV sono state osservate diverse tipologie di colonie; quelle che presentavano una morfologia bastoncellare al microscopio ottico sono state ristrisciate su piastre di MRS agar addizionate dello 0.05% di cisteina, al fine di ottenere colture di un singolo ceppo ognuna isolate tra loro.
Le colonie di L. kefiri risultano di medie dimensioni, opache con un puntino centrale più bianco al centro, regolari e convesse; la morfologia del microrganismo al microscopio può essere descritta come microrganismi a forma di bastoncino corto, spesso e regolare.
Esempio 2: Caratterizzazione molecolare
Il ceppo isolato è stato identificato inizialmente mediante crescita su terreno selettivo LAMVAB, come descritto nel paragrafo precedente e osservazione diretta della morfologia delle colonie cresciute in piastra e della morfologia cellulare in seguito ad osservazione al microscopio ottico.
L’attribuzione certa del genere e della specie è stata effettuata invece mediante tecniche di analisi del DNA ribosomiale 16S e caratterizzazione biochimica.
Risultati:
Il ceppi di lattobacilli selezionati mediante isolamento con il terreno LV sono stati classificati tassonomicamente mediante lo studio dell’intero gene 16S. Una regione lunga circa 1500 bp è stata amplificata con primer generici per eubatteri, sequenziata e poi allineata mediante BLAST con banche dati pubbliche. I risultati hanno permesso la classificazione certa con la sua ascrizione alla specie Lactobacillus kefiri. A supporto ed identificazione del ceppo si sono aggiunti i risultati Maldi Tof di seguito mostrati.
Il ceppo di L. kefiri SGL 13 è stato depositato presso la collezione internazionale europea DSMZ, struttura che possiede lo status di IDA (International Depositary Authority), con un “patent deposit” avente i seguenti dati: L. kefiri SGL 13 DSM 27331 in data 13/06/2013.
Inoltre il microrganismo è stato amplificato con primer specie-specifici, verificando la positività mediante la comparsa dell’amplicone delle dimensioni attese di 500 pb. Questo ulteriore dato ci permette di attribuire in maniera univoca la specie, e di avere uno strumento di controllo e monitoraggio della coltura in esame durante le fasi di fermentazione e liofilizzazione. La figura 1 mostra il risultato dell’amplificazione di L. kefiri SGL 13 con primer specie-specifici.
Analisi della sequenza 16S
Il genoma del microrganismo è stato estratto mediante kit commerciale (Macherey Nagel) seguendo quanto indicato dalla ditta produttrice. Il DNA è stato utilizzato nella concentrazione di 50-100 ng per la reazione di amplificazione del gene 16S. Le reazioni di amplificazione sono state effettuate con il termociclatore Biometra T professional (Biometra, Göttingen, Germania). Le condizioni di amplificazione usate sono state quelle che hanno dato le migliori rese di amplificato. Tutte le reazioni sono state condotte utilizzando un volume finale di 25 μl.
I componenti utilizzati in tutte le reazioni di amplificazione sono:
DyNAzyme (Finnzymes, Espoo, Finland) come DNA polimerasi termostabile (1 U per reazione) e il suo tampone di reazione 10⋅ Optimized DyNAzyme buffer (100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, pH 8,8 a 25°C);
miscela di nucleotidi trifosfato (8 mM, Euroclone, Siziano, Italy).
set di primer (100 M, Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Germany);
DNA genomico;
acqua sterile.
Di seguito sono riportati i primer utilizzati, il termociclo e l’amplicone atteso.
Primer: 16S-27 For 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (SEQ ID NO:1) 16-1552 Rev 5’-AAGGAGGTGWTCARCCGCA-3’ (SEQ ID NO:2)
Termociclo: 95°C 5’
Amplicone: 1552 bp
Il frammento di circa 1550 bp è stato sequenziato (MWG Biotech, Ebersberg, Germany) ed è stato allineato con la banca dati di Blast (NCBI, nucleotide blast) per ottenere la corretta identificazione della specie.
PCR specie-specifica
Lo stesso DNA è stato utilizzato come templato per un set di primer specie-specifici per L. kefiri SGL 13. Tali primer producono un frammento di circa 500 bp se il DNA amplificato appartiene alla specie in oggetto.
I primer, il termociclo e l’amplicone sono riportati di seguito.
Primer: Lk15’-CAACAATCAAAGGGGTTGTTG-3’ (SEQ ID NO:3)
Lk2 5’-TCACTAGGAGTAATTGAACCA-3’ (SEQ ID NO:4)
Termociclo: 95°C 10’
Amplicone: 500 bp
La visualizzazione dei prodotti di amplificazione è stata effettuata mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio (1-2%). Tale analisi è stata condotta caricando sul gel un volume della miscela di reazione di 10-15 l parallelamente al marcatore di peso molecolare (MassRuler Low Range DNA Ladder, Fermentas).
Profilo del ceppo in MALDI-TOF MS
Per ottenere un profilo di Maldi Tof identificativo il campione è stato così preparato: una coltura batterica di L. kefiri SGL 13 cresciuta overnight è stata raccolta in modo da avere un quantitativo di cellule sufficienti alla rilevazione (5 miliardi). Il pellet cellulare è stato lavato con soluzione fisiologica per rimuovere residui di terreno fermentato e risospeso in 300 µl di acqua distillata e 900 µl di etanolo puro. La sospensione è stata ben omogenizzata. Il campione è stato poi centrifugato a 13.000 rpm per 2 minuti e lasciato asciugare all’aria dopo aver rimosso il surnatante. Il campione è stato conservato a -20°C in attesa dell’analisi.
Al momento dell’analisi il campione è stato risospeso con 50 µl di acido formico al 70%. Dopo risospensione sono stati aggiunti altri 50 µl di acetonitrile e il tutto è stato mescolato vigorosamente. Il campione è stato così centrifugato a 13.000 rpm per 2 min. 1 µl del surnatante è stato posto al centro di uno spot in una piastra MALDI monouso e fatto asciugare all’aria. L’aggiunta di 1µl di una matrice realizzata in materiali organici (acido α-ciano-4-idrossicinnamico) ha determinato l’avvio dell’analisi Maldi Tof.
Il Maldi Tof MS è stato effettuato con un sistema MicroFlex LT usando le condizioni indicate dal manuale d’uso. Gli ioni generati dal laser ad azoto alla lunghezza d’onda di 337 nm sono stati catturati in maniera lineare in un range di massa da 2 a 20 KDa Lo strumento è collegato al software Biotyper 2.0 (Bruker Daltonics) in grado di acquisire i dati in arrivo, elaborarli in spettri di massa e confrontarli con spettri di riferimento presenti nel database interno (3.740 spettri di 319 generi e 1.946 specie diverse). Per ogni piastra MALDI contenente 24 campioni è stato incluso un test standard per calibrare e validare l’analisi.
Il grado di corrispondenza con lo spettro tipico di ogni microrganismo presente nel database determina l’attribuzione di un valore di punteggio “score value” che esprime il grado di certezza con cui viene proposta l’identificazione per la specie in esame. Punteggi con valore superiore a 2,000 sono considerati affidabili nell’identificazione a livello di specie, valori compresi tra 1,700 e 1,900 sono invece attribuibili ad un’identificazione certa a livello di genere.
Il ceppo è stato analizzato in triplo utilizzando 3 diverse colture batteriche.
Sequenziamento del genoma
Il genoma di L. kefiri SGL 13 è stato completamente sequenziato preparando due librerie analizzate su piattaforma Illumina HiSEq2500 e su piattaforma PacBio RS. Il ceppo è stato coltivato in terreno MRS a 37°C per 24 ore per poter estrarre il DNA. Il DNA genomico è stato estratto con il kit di purificazione Wizard (Promega), secondo le istruzioni della casa produttrice.
Il sequenziamento condotto sulla piattaforma HiSeq 2500 (Illumina) con protocollo Nextera XT. Le sequenze in formato FASTQ ottenute tramite sequenziamento di una libreria paired-end su piattaforma HiSeq2500 sono state filtrate tramite Casava 1.8.3 di Illumina. L’analisi della qualità è stata effettuata sui dati preventivamente filtrati tramite Illumina Chastity. Successivamente le reads contenenti il controllo PhiX sono state eliminate tramite un protocollo interno. Inoltre le reads contenenti la sequenza (parziale) dell’adattatore sono state troncate, mantenendo una lunghezza minima di reads leggibile di 50 bp. Il secondo controllo di qualità è stato effettuato impiegando il software FASTQC (nella versione 0.10.0). I dati ottenuti dal sequenziamento del genoma tramite strumentazione PacBio RS sono stati processati e filtrati impiegando la suite di programmi informatici SMRT Analysis. I dati delle Continuous Long Read (CLR) sono stati filtrati sulla base della lunghezza (>35) e della qualità delle Reads (>0.75). I dati finali riguardanti l’analisi statistica sulle Reads prodotte grazie a PacBio.
Il primo passaggio per ottenere un assemblaggio del genoma de-novo è rappresentato dal miglioramento della qualità delle sequenze FASTQ Illumina, rifilando le basi di bassa qualità grazie al programma bbduk, un componente della suite di programmi BBMap 34.46. Le sequenze così filtrate sono state composte e aggregate all’interno di contig impiegando ABySS 1.5.1. I contig sono stati collegati e posti all’interno di super-scaffolds grazie alle CLR reads ottenute da PacBio, che forniscono informazioni sulla continuità di ciascun contig rispetto agli altri, all’interno del genoma. Questa operazione di allineamento è stata effettuata grazie con BLASR. La stima circa l’orientamento, l’ordine e la distanza tra i singoli contig è stata ottenuta impiegando SSPACE-LongRead scaffolder 1.0. Le regioni mancanti all’interno dei super-scaffold sono state (parzialmente) chiuse in modo automatico con il programma GapFiller 1.10. Il metodo sfrutta la dimensione dell’inserto tra le reads ottenute tramite sequenziamento su piattaforma Illumina.
Il genoma è stato annotato usando il software Prokka.
Risultati:
Il genoma di L. kefiri SGL13 è stato assemblato in 10 scaffold finali, presenta una dimensione approssimativa di circa 2.408.480 bp con un contenuto medio di GC del 41.9%. Il genoma contiene 3271 geni di cui 1609 a funzione nota. Inoltre, sono state identificate 37 famiglie di geni enzimi carboidrati attivi (CAZymes) e un singolo gene di resistenza alla bacitracina che non si trova su un elemento trasponibile. Di conseguenza, non c'è rischio di trasferibilità della resistenza agli antibiotici a microrganismi patogeni.
Il documento dell'Autorità europea per la sicurezza alimentare (EFSA) relativo alla sicurezza dei probiotici raccomanda che i ceppi commerciali non presentino una resistenza agli antibiotici trasferibile. Pertanto SGL 13 può essere considerato sicuro per il consumo umano e può essere usato in combinazione con antibiotici senza il rischio di trasferibilità di resistenza agli antibiotici e, a causa delle sue proprietà probiotiche, questo ceppo rappresenta un buon candidato per la produzione di un prodotto a base di questo fermento lattico.
Esempio 3: Caratterizzazione fenotipica e biochimica
Colorazione di Gram
La colorazione di Gram è un tipo di colorazione differenziale che permette di classificare i batteri in Gram-positivi e Gram-negativi.
Questo test d’identificazione, che è stato realizzato mediante Gram Color Kit (Liofilchem), è suddiviso in 4 step, intervallati da lavaggi con acqua distillata, ognuno dei quali prevede il trattamento con un particolare reagente che viene lasciato agire per circa 1 minuto sulla superficie di un vetrino su cui è stata precedentemente deposta una colonia microbica da terreno solido, stemperata con una goccia d’acqua sterile. La sospensione così ottenuta viene poi fissata al calore con un becco Bunsen.
I reagenti utilizzati in ordine di applicazione sono:
cristalvioletto,
liquido di Lugol,
soluzione decolorante (alcool etilico),
safranina.
Alla fine, i batteri Gram-positivi appaiono colore violetto, mentre i Gram-negativi rosso o rosa.
Risultati:
Il ceppo di L. kefiri SGL 13 è stato analizzato anche sul profilo biochimico mediante colorazione di Gram, test della catalasi, test dell’ossidasi e sistema API 50CH. I risultati ottenuti hanno confermato che: il ceppo è gram positivo, catalasi e ossidasi negativo e fermenta gli zuccheri come mostrato in Tabella 1.
Tabella 1: caratterizzazione biochimica mediante sistema API 50CH di L. kefiri SGL 13.
Saggio della catalasi
Tale saggio serve a verificare la presenza dell’enzima catalasi in una coltura batterica, in grado di detossificare il perossido di idrogeno.
Un’ansata di cellule prelevate da una coltura su terreno solido è stata stemperata in una goccia di perossido d’idrogeno al 30%. L’ immediata comparsa di effervescenza è indice della presenza di catalasi.
L’effervescenza è dovuta all’ossigeno che si sviluppa nella reazione:
Saggio dell’ossidasi
Il saggio dell’ossidasi è un test enzimatico utilizzato per individuare la presenza nei batteri dell’enzima citocromo-ossidasi. Esso risulta positivo per i batteri aerobi e anaerobi facoltativi. Sono stati utilizzati gli Oxidase Test Discs (Liofilchem), ovvero dischi di carta di 3 mm di diametro imbibiti con tetrametil-p-fenilendiammina cloridrato (reattivo di Kovacs). Il disco è stato inumidito con 2 gocce di acqua distillata e strisciato con un’ansata di una colonia pura.
Lo sviluppo di una colorazione blu entro 30 secondi, dimostra l’ossidazione del substrato contenuto nel disco. In questo caso il microrganismo è ossidasi positivo, se invece non avviene alcun sviluppo di colore il microrganismo sarà ossidasi negativo.
Profilo di fermentazione degli zuccheri (API)
Per la caratterizzazione biochimica di L. kefiri SGL 13 è stata utilizzata la galleria API 50 CH con il terreno di inoculo API 50 CHL (BioMérieux, Milano, Italy). La galleria è composta da 50 microprovette contenenti substrati disidratati per la rilevazione dell’attività enzimatica e della fermentazione degli zuccheri. La sospensione batterica con una torbidità di 2 McFarland è stata distribuita nelle microprovette, e l’anaerobiosi è stata ottenuta ricoprendole con olio di paraffina sterile. Il metabolismo del substrato ad opera del batterio durante il periodo di incubazione a 37°C è evidenziato da un viraggio cromatico del terreno in seguito all’acidificazione del mezzo. La lettura delle reazioni è stata effettuata sulla base di una tabella di lettura, dove sono stati registrati i risultati, e l’identificazione è stata eseguita utilizzando un software informatico (www.apiweb.biomerieux.com).
Esempio 4: caratteristiche probiotiche di L. kefiri SGL 13
Tolleranza all’ambiente gastro-intestinale
Al fine di valutare la tolleranza ai succhi gastro-intestinali, è stata determinata la vitalità nel tempo mediante conteggio su piastra del ceppo isolato, dopo essere stato messo a contatto con:
• pepsina sintetica;
• pancreatina sintetica;
• diverse concentrazioni di sali biliari;
• diverse concentrazioni di NaCl;
• terreni di crescita a pH acido.
-Test di resistenza alla pepsina
La soluzione di pepsina costituita da 3 g/l di pepsina derivata dalla mucosa gastrica di maiale (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), è stata ottenuta solubilizzando la pepsina in polvere in soluzione salina sterile allo 0.5% di NaCl (p/v), e il pH e stato aggiustato a 3. Partendo da colture cresciute overnight in 10 ml di terreno MRS broth addizionato dello 0.05% di L-cisteina a 37°C per circa 18 ore, in presenza di O2, sono state raccolte circa 10<9>cellule/ml per centrifugazione a 4000 rpm per 10 minuti. Successivamente le cellule così pellettate sono state lavate con una soluzione salina sterile allo 0.09% di NaCl (p/v) e sottoposte al medesimo ciclo di centrifugazione. Il lavaggio è stato ripetuto una seconda volta nelle stesse condizioni.
Per simulare il passaggio attraverso il tratto gastrico, le cellule sono state risospese 10 ml di soluzione di pepsina a pH3. La sospensione così preparata è stata incubata a 37°C in anaerobiosi per 2 ore, misurando il numero di CFU/ml a 0, 90 e 120 minuti, mediante conteggio in piastra.
Per monitorare la crescita anche in assenza della pepsina, il ceppo in esame è stato inoculato in due soluzioni saline sterili allo 0.5% (p/v), a pH 3, una contenente la pepsina e una priva di essa (campione di controllo). I campioni sono stati incubati nelle stesse condizioni descritta in precedenza.
La resistenza del ceppo trattato è stata espressa come percentuale di sopravvivenza rispetto al controllo.
- Test di resistenza alla pancreatina
La soluzione di pancreatina costituita da 1 g/l di pancreatina da pancreas di maiale (Sigma-Aldrich), è stata ottenuta solubilizzando la polvere in soluzione salina sterile allo 0.5% di NaCl (p/v), e il pH è stato aggiustato a 8. A partire da colture cresciute overnight a 37°C per circa 18h, in presenza di O2, in 10 ml di terreno MRS broth, addizionato dello 0.05% di L-cisteina, sono state raccolte circa 10<9>cellule/ml per centrifugazione a 4000 rpm per 10 minuti. Con lo stesso ciclo di centrifugazione, le cellule sono state lavate con una soluzione salina sterile allo 0.09% di NaCl (p/v).
Successivamente le cellule sono state lavate in un tampone di neutralizzazione (PBS - 8 g/l NaCl, 0.2 g/l KCl, 1.44 g/l Na2HPO4, 0.24 g/l KH2PO4) a pH 7 sterile e, per simulare il passaggio attraverso l’intestino, sono state risospese in 10 ml di soluzione di pancreatina a pH 8. La sospensione è stata incubata a 37°C in anaerobiosi per 4 ore, facendo la stima del numero di CFU/ml a 0, 60 e 240 minuti mediante conteggio in piastra.
Per monitorare la crescita in assenza della pancreatina, il ceppo in esame è stato inoculato in due soluzioni saline sterili allo 0.5% (p/v), a pH 8, una contenente la pancreatina e l’altra priva di essa (campione di controllo). I campioni sono stati incubati nelle stesse condizioni descritta in precedenza.
La resistenza dei ceppi trattati è stata espressa come percentuale di sopravvivenza rispetto al controllo.
- Test di resistenza a sali biliari, pH e NaCl
L’analisi è stata effettuata su colture batteriche cresciute overnight. Sono state raccolte approssimativamente 10<9>cellule/ml per centrifugazione a 4000 rpm per 10 minuti. Le cellule sono state poi lavate con 2 ml di soluzione fisiologica sterile (NaCl 9 g/l) e, dopo centrifugazione a 4000 rpm per 10 minuti, sono state risospese in MRS broth contenente:
0%, 0.5%, 1%, 2%, 3% di sali biliari (p/v, Sigma-Aldrich);
0%, 2%, 6%, 10% di NaCl (p/v, Oxoid);
pH 6.3, 3.5, 2, 1.5 aggiustato con HCl 4 N.
Le soluzioni sono state incubate a 37°C in anaerobiosi per 24h, per ogni inoculo la densità ottica a 600 nm è stata registrata a 0h, 2h e 24h, mentre la stima del numero di CFU/ml è stata effettuata a 0h e 24h, mediante conteggio in piastra.
Risultati: Caratteristiche probiotiche di L. kefiri SGL13
Tolleranza all’ambiente gastro-intestinale
Il microrganismo è stato testato al fine di assicurare il suo transito gastro-intestinale e garantire la sua sopravvivenza e il raggiungimento in piena vitalità della sezione intestinale dove deve esplicare la sua attività fisiologica. Tale ceppo è stato quindi saggiato nelle seguenti condizioni ambientali:
1. resistenza alla pepsina in ambiente acido
2. resistenza alla pancreatina in ambiente basico
3. resistenza ad alte concentrazioni di sali biliari
4. resistenza ad ambiente acido
5. resistenza ad elevate concentrazioni saline
L. kefiri SGL 13 ha mostrato una buona tolleranza all’ambiente grastro-intestinale. In particolare i risultati hanno evidenziato una buona percentuale di sopravvivenza dopo 1h e anche dopo 4h di incubazione in presenza di pancreatina a pH 8. Analoghi risultati sono stati ottenuti dopo 1 ora e 30 minuti e dopo 2 ore e 30 minuti di incubazione in presenza di pepsina a pH 3. I risultati ottenuti vengono riportati nella tabella 2 sottostante:
Tabella 2: Resistenza alla pepsina e alla pancreatina di L. kefiri SGL 13
Il microrganismo risente leggermente della presenza di sali biliari a concentrazioni superiori al 2% (circa 10 volte superiori a quelle fisiologiche), mostrando comunque una buona sopravvivenza anche in presenza del 3%. Risultati mostrati in tabella 3. Ciò lo rende idoneo all’utilizzo come probiotico.
Tabella 3: Resistenza ai sali biliari di L. kefiri SGL 13
Resistenza in ambiente acido
La sopravvivenza di L. kefiri SGL 13 in ambiente acido è compromessa nell’arco delle 24 ore a pH inferiore a 3, mentre a pH 3 si assiste ad una riduzione della crescita di circa 1 unità logaritmica, come mostrato in tabella 4.
Tabella 4: Resistenza in ambiente acido di L. kefiri SGL 13
Resistenza ad elevate concentrazioni saline
Come mostrato in tabella 5, L. kefiri SGL 13 mostra una buona tolleranza ad elevate concentrazioni saline, in quanto la sua sopravvivenza è garantita fino al 6% di NaCl, a concentrazioni superiori (10%) il tasso di crescita subisce un decremento di circa un’unità logaritmica.
Tabella 5: Resistenza ad elevate concentrazioni saline di L. kefiri SGL 13
Esempio 5: Adesione al monostrato di cellule intestinali
Per valutare l’attività di adesione del ceppo L. kefiri SGL 13 alla linea enterocitaria umana HT29, 1 x 10<8>cellule batteriche sono state addizionate ad un monostrato epiteliale di cellule HT29 (1.23 x 10<6>cellule) e incubate per 1,5 h. Al termine dell’incubazione, il monostrato cellulare è stato lavato con PBS per 4 volte e le cellule batteriche adese sono state quantificate mediante Real Time PCR, con l’utilizzo di primer genere-specifici (Candela M, Seibold G, Vitali B, Lachenmaier S, Eikmanns BJ, Brigidi P. Real-time PCR quantification of bacterial adhesion to Caco-2 cells: competition between bifidobacteria and enteropathogens. Res. Microbiol. (2005) 156:887-895).
Come controllo positivo sono stati utilizzati gli enteropatogeni aderenti Salmonella Typhimurium e E.coli ETEC H10407, mentre come controllo negativo il ceppo non aderente E. coli B44.
Risultati: Adesione al monostrato di cellule intestinali
L’attività di adesione del ceppo L. kefiri SGL 13 alla linea enterocitaria umana HT29 è stata valutata contando il numero di microrganismi adesi alle cellule HT29 tramite Real time PCR. Il risultato ottenuto è stato 9.32E+3/100 cellule HT29, pertanto L. kefiri SGL 13 può essere considerato un ceppo fortemente adesivo (valore di riferimento adesione Salmonella 6.77E+5/100 cellule HT29 e 157 di E. coli B44/100 cellule HT29).
Esempio 6: Profilo di resistenza agli antibiotici
La sensibilità agli agenti antimicrobici del ceppo di L. kefiri SGL 13 è stata saggiata mediante le MIC Test Strip (Liofilchem), un metodo quantitativo per la determinazione della concentrazione minima inibente (MIC) di un singolo agente antimicrobico nei confronti dei microrganismi. Il kit è costituito da strisce di carta impregnate con un gradiente di concentrazioni predefinite dell’antibiotico, costituito da 15 diluizioni comprese nell’intervallo delle diluizioni usato nei metodi convenzionali per la determinazione della MIC.
Le colture in fase stazionaria sono state diluite in tampone MRD (Liofilchem) in modo da avere una torbidità pari allo standard McFarland 3. 100 µl di questa soluzione sono stati spatolati sulla superficie di terreno MRS agar addizionato dello 0.05% di L-cisteina in piastra, in modo da produrre una crescita omogenea. Dopo aver lasciato asciugare completamente la superficie dell’agar, la strip è stata depositata al centro della piastra con i valori di MIC rivolti verso l’alto. Le piastre così allestite sono state incubate con il coperchio rivolto verso l’alto a 37°C in anaerobiosi per 48 ore.
Quando la striscia del kit viene applicata sulla superficie inoculata del terreno agarizzato in piastra, il gradiente predefinito è rilasciato dalla striscia al terreno stesso, così, dopo l’incubazione, si può osservare una zona di inibizione ellittica, simmetrica e centrata lungo la striscia. Il valore di MIC, espresso in µg/ml, è stato letto nel punto di intersezione tra il bordo dell’ellisse di inibizione e la striscia di carta.
Risultati: Profilo di resistenza agli antibiotici
Di seguito viene riportata la tabella 6 che mostra il profilo di resistenza agli antibiotici testati sul ceppo L. kefiri SGL 13, mediante l’utilizzo delle MIC Test Strip.
Tabella 6: profilo di resistenza agli antibiotici di L. kefiri SGL 13
Esempio 7: valutazione dell’attività antifiammatoria del di L. kefiri SGL 13: dosaggi dell’II-8
La capacità antinfiammatoria del L. kefiri SGL 13 è stata saggiata utilizzando la linea enterocitaria umana HT-29. Dapprima è stata valutata la dose consona di LPS al fine di ottenere una risposta infiammatoria con tale linea cellulare. Per cui una curva dose-risposta è stata effettuata coltivando le cellule HT-29 in DMEM, con 10-15% di Siero fetale bovino, 1% di L-glutamina, 1% Pennicillina e Streptomicina, a 37°C e 5% di CO2 per 2-3 giorni. A confluenza le cellule sono state stimolate con concentrazioni crescenti di LPS da 1 ng/ml a 1000 ng/ml per 22 ore
Identificata la concentrazione di 10 ng/ml come ottimale, si sono eseguite prove di cocultura, in cui le cellule HT-29 a confluenza sono state preincubate per 2 ore con Lactobacillus kefiri 1x10<+9>CFU/pozzetto sia in forma vitale che inattivata termicamente e successivamente stimolate con LPS per altre 22 ore.
La determinazione dell’IL-8 rilasciata è stata quantificata in ELISA (Sigma Aldrich). Risultati: valutazione dell’attività antifiammatoria del L. kefiri SGL 13: dosaggi dell’II-8
La capacità antinfiammatoria del L. kefiri SGL 13 è stata saggiata utilizzando la linea enterocitaria umana HT-29 andando a valutare il rilascio di IL-8. Come dimostrato in Fig.2 le cellule non trattate (NT) hanno una produzione basale di IL-8 pari a 30 pg/ml, stimolate con LPS per 22 ore si ha un incremento dell’IL-8 superiore a 4 volte. Il pretrattamento con L. kefiri, sia esso in forma vitale che non, riduce significativamente la produzione di IL-8 di circa la metà. Ciò dimostra come il trattamento di L. kefiri SGL 13 determini una risposta infiammatoria più moderata rispetto a quando non presente.
Esempio 8: Sperimentazione animale: associazione L. kefiri SGL 13 ed estratto di Andrographis paniculata nella prevenzione e nel trattamento delle infiammazioni intestinali
La sperimentazione ha lo scopo di valutare l’efficacia di un prototipo integratore a base di L. kefiri SGL 13 ed estratto vegetale di Andrographis paniculata nel ridurre l’infiammazione intestinale indotta in topi C57BL/6 mediante somministrazione di destrano sodio solfato (DSS) 1.5% nell’acqua da bere.
Considerando le proprietà benefiche documentate in letteratura del probiotico L. kefiri e dell’estratto vegetale di Andrographis paniculata, il presente progetto mira a valutare l’efficacia della loro associazione come utile supplemento e ausilio alle tradizionali terapie per le infiammazioni intestinali.
La loro sinergia potrebbe incrementare l’efficacia delle loro singole azioni, andando a colmare i limiti di quei trattamenti che prevedono l’utilizzo solo dell’uno o dell’altro.
A tale scopo saranno utilizzati 40 topi suddivisi in 4 gruppi sperimentali: primo gruppo (controllo negativo), secondo gruppo (test tossicità) alimentato con prototipo integratore, terzo gruppo (controllo positivo) sottoposto a trattamento con DSS 1.5% e quarto gruppo (test efficacia) sottoposto a trattamento con DSS 1.5% più prototipo integratore.
La sperimentazione complessivamente di 38 giorni sarà organizzata in 4 distinte fasi: adattamento degli animali alle condizioni di stabulazione (1 settimana), somministrazione del prototipo integratore (1 settimana), induzione dell’infiammazione con 1.5% DSS (9 giorni), interruzione del trattamento con 1.5% DSS (2 settimane) e sacrificio degli animali.
Gli obiettivi che il progetto si propone sono i seguenti:
1. Verificare l’assenza di effetti avversi e la tolleranza del prototipo di integratore a base di fermento lattico Lactobacillus kefiri SGL 13 ed estratto vegetale Andrographis paniculata.
2. Valutare l’induzione dell’infiammazione intestinale ottenuta mediante la somministrazione di destrano sodio solfato (DSS) 1.5% e descrivere le varie fasi (acuta, cronica, remissione) e la loro durata.
3. Caratterizzare il microbiota intestinale e verificare la colonizzazione da parte del fermento lattico lactobacillus kefiri SGL 13 somministrato.
4. Valutare la produzione (quantità e tipologia) di acidi grassi a corta catena (SCFAs) da parte della microflora intestinale.
5. Valutare l’efficacia del prototipo integratore nel ridurre i livelli di infiammazione indotta dal DSS.
6. Valutare, post-mortem, il grado di infiammazione a livello intestinale mediante analisi istologica.
7. Valutare, post-mortem, eventuali segni di tossicità ed alterazioni anatomopatologiche a livello epatico e renale.
In ogni fase sperimentale verranno prelevati per ciascun animale appartenente ai 4 gruppi campioni di feci e sarà effettuato anche un prelievo di sangue. Verranno inoltre monitorati il consumo di cibo/acqua e il peso corporeo di tutti gli animali. Nei soli gruppi sottoposti a trattamento con DSS (gruppi 3 e 4) inoltre sarà calcolato il DAI score, un indice di progressione del grado di infiammazione intestinale che si basa sulla contemporanea valutazione di tre diversi parametri: consistenza delle feci, presenza di sangue e perdita di peso.
Al sacrificio verranno prelevati da ciascun topo i seguenti organi: fegato, milza, intestino tenue, intestino crasso.
A livello epatico verrà verificata l’assenza di tossicità e di alterazioni in seguito alla somministrazione del prototipo integratore. Per quanto riguarda la milza verrà valutato l’incremento di peso rispetto ai controlli. A livello dell’intestino tenue verranno valutate alterazioni anatomo-patologiche e verrà eseguito il dosaggio delle IgA secretorie, mentre nel crasso oltre alle alterazioni anatomo-patologiche verranno eseguiti i seguenti dosaggi: Mieloperossidasi (MPO), Cicloossigenasi-2 (COX-2), Ossico nitrico sintasi inducibile (i-NOS).
Tutti i parametri da monitorare e le analisi da effettuare durante la sperimentazione sono riassunti nella tabella sottostante.
Dalla descrizione dettagliata e dagli Esempi sopra riportati, risultano evidenti i vantaggi conseguiti mediante il ceppo batterico della presente invenzione. In particolare, il ceppo di L. kefiri SGL 13 si è mostrato sorprendentemente e vantaggiosamente adatto alla preparazione di composizioni per l’uso medico nel trattamento delle infiammazioni intestinali e come composizioni ad attività probiotica.
Claims (13)
- RIVENDICAZIONI 1. Un ceppo batterico appartenente alla specie Lactobacillus kefiri, in cui detto ceppo è L. kefiri SGL 13 depositato con il numero di accesso DSM 27331 in data 13/06/2013.
- 2. Composizione comprendente il ceppo batterico secondo la rivendicazione 1.
- 3. Composizione comprendente il ceppo batterico secondo la rivendicazione 1, e un estratto vegetale.
- 4. Composizione secondo la rivendicazione 3, in cui detto estratto vegetale è un estratto di Andrographis paniculata.
- 5. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 4, ulteriormente comprendente un prebiotico.
- 6. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 5, ed eccipienti farmacologicamente accettabili.
- 7. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 6, in cui detta composizione ha attività probiotica.
- 8. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 7, in cui detta composizione è in forma solida o liquida.
- 9. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 8, per l’uso come medicamento.
- 10. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 9, per l’uso nella prevenzione e nel trattamento delle infiammazioni intestinali e nel trattamento e nella prevenzione delle neoplasie intestinali.
- 11. Composizione secondo la rivendicazione 10, in cui dette infiammazioni intestinali sono scelte dal gruppo consistente in colite ischemica, colite linfocitica, colite ulcerosa, colite da diversione, pauciti, morbo di Crohn ed enterocoliti tra cui la necrotizzante e tutte la malattie infiammatorie acute e croniche intestinali in genere (IBDs).
- 12. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 2 a 7, per l’uso alimentare.
- 13. Dispositivo medico comprendente il ceppo batterico appartenente alla specie Lactobacillus kefiri, in cui detto ceppo è L. kefiri SGL 13 depositato con il numero di accesso DSM 27331 in data 13/06/2013.
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