IT201800004532A1

IT201800004532A1 - Composizioni cosmetiche per svariate applicazioni topiche.

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Publication number: IT201800004532A1
Application number: IT102018000004532A
Authority: IT
Priority date: 2018-04-16
Filing date: 2018-04-16
Publication date: 2019-10-16

Description

“Composizioni cosmetiche per svariate applicazioni topiche.”

CAMPO DELL’INVENZIONE

La presente invenzione riguarda delle composizioni cosmetiche contenente come principio attivo glicerofosforilcolina ed un’associazione di almeno 2 fino a 4 amminoacidi essenziali e non essenziali per molteplici applicazioni topiche.

STATO DELLA TECNICA

La glicerofosforilcolina (GPC): caratterizzata dalla seguente formula:

è un importante nutriente presente in tutte le cellule del corpo, principalmente espresso nel fegato, nel cervello e nel tessuto nervoso. È un componente naturale presente in diversi alimenti, come prodotti caseari, crusca d’avena, banane, oltre ad essere un importante componente del latte materno.

La glicerofosforilcolina si ottiene per idrolisi di fosfatidilcolina, componente principale delle lecitine; la sua struttura chimica e il suo basso peso molecolare (PM=257.23) la rendono in grado di attraversare meglio le membrane biologiche e raggiungere il sito, in cui esplicare la propria azione. È infatti una forma deacetilata ed idrosolubile della fosfatidilcolina, nonché un possibile donatore endogeno di colina, tanto da essere ampiamente noto e utilizzato in ambito farmaceutico e nutraceutico per tale scopo. La colina agisce principalmente a due livelli, nervoso e metabolico. In particolare, gioca un ruolo chiave come precursore dell’acetilcolina, uno dei principali neurotrasmettitori del nostro sistema nervoso centrale e periferico. Ha dunque effetti benefici nei disturbi cognitivi (per es. cura dell’Alzheimer), migliora l’attenzione e la memoria.

Altro ruolo significativo della colina è legato al metabolismo dei grassi e del colesterolo, una carenza di colina comporta infatti steatosi epatica (accumulo di trigliceridi nel fegato). Noti sono gli integratori dimagranti o indicati per il trattamento della cellulite.

Derivando dalle lecitine, si può ipotizzare, oltre ad una sua specifica efficacia, anche una capacità veicolante di altri ingredienti per renderli più biodisponibili. Unitamente all’alto grado di sicurezza, risulta infatti priva di tossicità per somministrazione orale.

A livello topico viene impiegata soprattutto in campo medico in associazione con ialuronato di sodio come descritto in WO2012073191 in particolare per restaurare e conservare le membrane mucosali.

In biochimica il termine amminoacidi si riferisce più spesso agli L-α-amminoacidi, di formula generica NH2CHRCOOH, cioè quelli il cui gruppo amminico e il cui gruppo carbossilico sono legati allo stesso atomo di carbonio, chiamato appunto carbonio α, in configurazione L, dotati quindi di relativa attività ottica, con l'unica eccezione della glicina che è achirale in quanto -R = -H.

Essi rappresentano i costituenti essenziali delle proteine. Sono presenti in diversi alimenti, quali carne, uova, legumi, verdure, ecc.

Gli aminoacidi noti sono 20 e si distinguono in essenziali e non, in base al fatto che il nostro organismo riesca o meno a sintetizzarli in quantità sufficiente a far fronte ai propri bisogni. Risultano fondamentali per il mantenimento di uno stato generale di benessere dell’organismo umano, intervengono infatti in diversi processi fisiologici quali, rinnovamento cellulare, produzione di energia, difese immunitarie, circolazione sanguigna, ecc.

SOMMARIO DELL’INVENZIONE

La richiedente ha ora trovato che la glicerofosforilcolina, se associata con specifici amminoacidi di tipo essenziale e non, può essere impiegato quale principio attivo in composizioni cosmetiche per svariate applicazioni topiche.

Pertanto, oggetto della presente invenzione sono composizioni cosmetiche topiche comprendenti come principio attivo:

a) Glicerofosforilcolina e

b) Un’associazione di almeno 2 fino a 4 amminoacidi essenziali e non scelti tra: valina, lisina, metionina, cisteina, arginina, glutammina.

DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Nelle figure 1A, 1B e 1C si riportano delle immagini digitali delle cellule al microscopio a contrasto di fase Leika con luce rovesciata tramite telecamera digitale e software di gestione immagini Motic (ingrandimento 400X) di adipociti non trattati (Figura 1A) trattati con 2 mg/ml (Figura 1B) e 0,4mg/ml (Figura 1C) di attivo la cui composizione specifica viene riportata nel seguente paragrafo e nella parte sperimentale.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE.

Per gli scopi della presente invenzione si intende che gli amminoacidi impiegati nelle composizioni cosmetiche topiche oggetto della presente invenzione sono gli enantiomeri otticamente attivi ed in particolare gli enantiomeri L.

Composizioni topiche oggetto della presente invenzione sono quelle che contengono come componente b) un’associazione di valina e lisina.

Secondo una forma particolarmente preferita la suddetta associazione è presente nelle composizioni topiche cosmetiche sotto forma di una soluzione idroglicerica con un rapporto ponderale glicerina: acqua compreso tra 1:1 e 2:1 contenente la glicerofosforilcolina in quantitativo preferibilmente compreso tra il 15 ed il 25% in peso, valina in un quantitativo preferibilmente compreso tra 1 e 3% in peso sul peso totale di detta soluzione idroglicerica e lisina sotto forma del sale monocloroidrato in un intervallo preferibilmente compreso tra 2 e 5%. Questa formulazione può essere inserita in formulazioni finite liquide, fluide, semifluide o consistenti, scelte tra creme, sieri, gel, emulgel, lozioni spruzzabili. Secondo una ulteriore forma particolarmente preferita la soluzione idroglicerica viene quindi aggiunta alla composizione topica cosmetica finale in concentrazioni comprese tra 1 e 3% in peso sul peso totale di detta formulazione.

Le composizioni topiche cosmetiche in cui il componente b) contiene i suddetti amminoacidi valina e lisina possono essere vantaggiosamente impiegate per il trattamento topico della cellulite.

Infatti, l’attività anticellulite della GPC risulta particolarmente potenziata dai suddetti amminoacidi anch’essi capaci di migliorare il metabolismo dei grassi e l’utilizzo delle riserve energetiche interne. In particolare, la lisina permette al muscolo di usare più efficientemente l'ossigeno, migliorando il metabolismo dei grassi e la tolleranza allo stress, mentre la valina contribuisce al nutrimento del muscolo, specie durante sforzi prolungati o durante attacchi di fame, quando il corpo deve attingere alle proprie riserve interne. Tra l’altro la combinazione dei tre ingredienti risulta particolarmente vantaggiosa anche in termini di sicurezza, l’IC50 in vitro dell’attivo così costituito è infatti di 88,78mg/ml, corrispondente ad una LD50 stimata di 7324mg/kg, che permette di classificarlo come non tossico secondo la legislazione europea vigente (CLP) (LD50 > 2000mg/kg).

Per dimostrare ciò la Richiedente ha condotto saggi in vitro e in vivo per investigare l’efficacia della suddetta associazione.

È stato dapprima valutata la stimolazione della lipasi, enzima che intervenendo nel processo di lipolisi, è in grado di scindere i trigliceridi in digliceridi e acidi grassi.

L’ingrediente risulta in grado di incrementare l’attività della lipasi a tutte le concentrazioni testate ed, in particolare, il risultato più significativo si registra dopo 30 minuti, testando il 2% d’attivo, (dove per attivo si intende la suddetta soluzione idroglicerica contenente GPC, valina e lisina nei suddetti intervalli di concentrazione), con un incremento dell’attività dell’enzima dell’83.5%.

Sono state investigate anche la potenziale riduzione dell’accumulo di grasso ed il consumo di ossigeno su colture cellulari di pre-adipociti.

Lo scopo del primo test è quello di confrontare adipociti trattati e non con il nostro attivo e valutare la capacità di quest’ultimo di ridurre l’accumulo intracellulare di lipidi; sostanze che dimostrino infatti di agire sull’adipogenesi e/o sulla lipolisi, causando in vitro la riduzione del contenuto lipidico dell’adipocita, possono essere utilizzate come agenti snellenti, tonificanti, stimolanti il metabolismo e coadiuvanti nel trattamento della cellulite. L’attivo infatti alle 72h, ha un’efficacia nel ridurre l’accumulo di grasso intracellulare dei lipidi del 23.81%.

Relativamente al consumo di ossigeno, alle concentrazioni di attivo testate, la percentuale di riduzione di ossigeno alle 72h è doppia o tripla rispetto agli adipociti non trattati, suggerendo un incremento del metabolismo cellulare a conferma del risultato del test precedente.

Alla luce degli incoraggianti risultati in vitro è stato dunque condotto anche uno studio in vivo della durata di due mesi su 20 soggetti di sesso femminile, di età compresa tra 20 e 50 anni, con cellulite di livello da lieve a severo e sono stati analizzati diversi parametri, quali irregolarità del pannicolo adiposo, compattezza cutanea e circonferenza coscia. È stata formulata una crema base contenete il 2% di attivo e già dopo un mese di trattamento, con una sola applicazione al giorno, si evidenziano risultati incoraggianti relativi sia alla riduzione delle irregolarità del pannicolo adiposo (-5,2%) che alla compattezza cutanea (R0=-7.1%) misurata mediante R0 (comportamento passivo della cute all’applicazione della forza di suzione. Una diminuzione di R0 corrisponde ad un aumento della compattezza cutanea). Al secondo mese di trattamento si assiste ad ulteriore miglioria in termini di irregolarità e compattezza cutanea, rispettivamente -11,5% e -13,4%. Anche in termini di riduzione circonferenza cosce si evidenzia una leggera, ma statisticamente significativa, variazione della misurazione distale e prossimale della circonferenza coscia destra e sinistra, rispettivamente -0.2 cm e -0.3 cm.

Derivando dalle lecitine, si può ipotizzare, oltre ad una sua specifica efficacia, anche una capacità veicolante di altri ingredienti per renderli più biodisponibili.

In una tale ottica le composizioni topiche oggetto della presente invenzione oltre a contenere la GPC come veicolante, possono contenere il componente b) preferibilmente scelto tra un’associazione di metionina, arginina, cisteina e glutammina.

Infatti, la richiedente ha trovato che queste composizioni topiche cosmetiche se impiegate in ambito tricologico portano effetti benefici sul rinvigorimento e sulla crescita dei capelli contrastandone la caduta.

La metionina e la cisteina sono aminoacidi solforati, precursori della cheratina, componente principale e fondamentale per lo stato di salute del capello. Gli aminoacidi solforati, mediante ponti disolfuro, sono in grado di formare strutture particolarmente resistenti che conferiscono al capello maggiore forza e stabilità. Inoltre, entrambi concorrono alla protezione del capello dallo stress ossidativo.

L’arginina invece è precursore dell’ossido nitrico, importante mediatore endogeno della vasodilatazione e della trasmissione degli impulsi nervosi. Questo aminoacido risulta dunque importante per il capello, perché consente una migliore irrorazione sanguigna delle radici, che si traduce in un maggiore apporto di sostanze nutritive ed in una conseguente stimolazione della crescita del capello stesso.

Infine la glutammina, sintetizzata dall’organismo a partire dall’acido glutammico, contribuisce alla crescita dei capelli, mediante stimolazione della secrezione dell’ormone della crescita GH. Il corpo la produce autonomamente ma, a partire da una certa età e in particolari situazioni di affaticamento o stress, non è più in grado di produrla in quantità sufficiente. Per questo motivo, in età adulta, una integrazione di glutammina è importante per stimolare la formazione dei capelli.

Secondo un’altra forma preferita, delle composizioni topiche cosmetiche secondo la presente invenzione, in cui la GPC ha funzione principalmente di veicolo il componente b) comprende invece un’associazione di metionina, arginina e glutammina.

Questo tipo di composizioni topiche cosmetiche sono in particolare adatte per contrastare i segni dell’età quindi come antiaging.

Gli aminoacidi arginina e metionina risultano fondamentali per la sintesi di creatina, componente di notevole importanza per il metabolismo energetico delle cellule. La creatina infatti, fornendo energia alle cellule, favorisce la formazione del tessuto connettivo, inoltre promuove le naturali funzioni della pelle, inducendo le cellule a produrre più proteine, come collagene ed elastina, stimola inoltre il metabolismo della pelle e il rinnovamento cellulare.

Una maggiore sintesi di collagene comporta a sua volta anche una migliore capacità della pelle di immagazzinare acqua, con conseguente aumento dell’idratazione, donando alla pelle un aspetto sicuramente più fresco e levigato.

La glutammina invece regola l’equilibrio acido-base della pelle, rallentando la formazione di rughe e l’invecchiamento cellulare. Questo aminoacido viene sintetizzato dal corpo, ma con l’avanzare dell’età, la quantità prodotta risulta insufficiente e le conseguenze non sono da sottovalutare, in quanto è indispensabile per la sintesi delle proteine. In caso di carenza di glutammina, l’organismo preleva la proteina dalla massa muscolare esistente e la converte in glutammina ed energia. In questo modo si perdono le proteine muscolari, i fasci muscolari si assottigliano e la pelle diventa più flaccida.

Si riportano a scopo illustrativo i test in vitro ed in vivo sulle composizioni cosmetiche oggetto della presente invenzione contenenti come componente b) un’associazione di valina e lisina che dimostrano l’attività anticellulite delle suddette composizioni.

ESEMPIO 1 -VALUTAZIONE IN VITRO DELL’AUMENTO DELL’ENZIMA LIPASI

1.1. Campione testato: campione contenente il 2% di attivo (soluzione idroglicerica in cui il rapporto glicerina: acqua è compreso tra 1:1 e 2:1 contenente:

• 15-25% in peso sul peso totale della soluzione idroglicerica di Glicerofosforilcolina, • 1- 3% peso sul peso totale della soluzione idroglicerica di valina

• 2- 5%. in peso sul peso totale di detta soluzione idroglicerica di lisina sotto forma del sale monocloroidrato).

1.2 Scopo del test:

Scopo del test è di valutare l’incremento dell’azione dell’enzima lipasi da parte di un campione in una reazione di idrolisi dei trigliceridi catalizzata dall’enzima stesso, mediante analisi degli acidi grassi liberi a diversi tempi, con saggio colorimetrico.

Il test consiste in due fasi distinte: l’allestimento di una reazione enzimatica in vitro che consente la lisi dei trigliceridi a partire da olio di oliva in presenza di lipasi pancreatica porcina e, successivamente, un saggio colorimetrico per la determinazione degli acidi grassi liberi formatisi in diverse condizioni sperimentali.

L’enzima, in presenza del substrato (olio di oliva) e in opportune condizioni di incubazione, catalizza la seguente reazione:

Trigliceridi H2O → Digliceride Acidi grassi

Il dosaggio degli acidi grassi consente di valutare indirettamente l’attività enzimatica e l’idrolisi dei trigliceridi.

1.3 Esecuzione del test

1.3.1-Trattamento ed esposizione

La lipasi, di origine pancreatica porcina, è stata sciolta in acqua deionizzata poco prima dell’uso alle concentrazioni di 2000 U/ml. Come fonte di trigliceridi è stato utilizzato olio d’oliva. Il tampone utilizzato per la reazione è Tris HCl 200 mM, pH =7,7. Il test è stato condotto in presenza ed in assenza della sostanza da testare a diverse concentrazioni.

I seguenti reagenti sono incubati a 37°C: acqua deionizzata (150 μL), tampone (100 μL), olio di oliva (300 μL) nel caso del controllo negativo. Nel caso del campione, l’acqua è stata sostituita con 150 Μl della soluzione da testare. Il campione è stato testato diluito in acqua in modo che le concentrazioni finali nella miscela siano: 2%, 1% e 0,5%. In seguito, è stata aggiunta la soluzione enzimatica (200 μL) e la reazione è stata lasciata sviluppare per 15 minuti e 30 minuti a 37°C gradi. Al termine dello sviluppo, la reazione è stata bloccata con l’aggiunta di 300 μL di etanolo al 95%.

5μL di soluzione contenente gli acidi grassi liberi formati vengono utilizzati per il dosaggio colorimetrico, eseguito mediante un apposito kit, che fornisce i reagenti necessari allo sviluppo delle reazioni di seguito descritte.

In presenza dell’enzima AcilCoA sintetasi (AcilCS) e adenosin-5’-trifosfato (ATP) gli acidi grassi liberi sono converti in acil-CoA, adenosin-5’-monofosfato (AMP) e pirofosfato. L’AcilCoA reagisce con l’ossigeno (O2) in presenza dell’Acil-coA ossidasi (ACOD) formando 2,3-enoilcoenzimaA. Il risultante H2O2 converte l’acido 2,4,6-tribromo-3-idrossibenzoico (TBHB) e la 4-ammonoantipirina (4-AA) in un colorante rosso in presenza di perossidasi (POD).

I campioni vengono letti alla lunghezza d’onda 550 nm, prima e dopo dell’aggiunta di ACOD e la reazione viene condotta a temperatura ambiente.

Acidi grassi CoA ATP → acil-CoA AMP pyrophasphate Acil-CoA O2 → enoilcoA H2O2

H2O2 4-AA TBHB → colorazione H2O2 HBr

1.3.1 Espressione dei risultati

Il risultato è espresso come percentuale di incremento di formazione degli acidi grassi secondo la formula:

% incremento = ODcampione – ODCN/ ODCN *100

1.4 Risultati e conclusioni

1.4.1 Risultati

I risultati sono riportati nella seguente tabella

Commento

Il campione è in grado di aumentare l’attività dell’enzima lipasi alla concentrazione del 2% e 1%. La massima attività si riscontra dopo 30 minuti di reazione.

1.4.2 Conclusioni

Sulla base dei risultati riportati l’attivo mostra capacità di incrementare l’attività dell’enzima lipasi.

1.5 Bibliografia

1) Rapi Gupta, Pooja Rathi, Namita Gupta e Sapna Bradoo. (2003) Lipase assays for conventional and molecular screening: an overview. Biotechnol. Appl. Biochem 37: 63-71.

2) Shimiza S et al. (1980) Anal. Biochem. 107, 193-198

3) ED Korn. (1959) Clearing factor, a Heparin-activated Lipoprotrein Lipase. Isolation and characterization of the Enzyme from normal Rat Heart. J Biochem 215: 1 -14 ESEMPIO 2- VALUTAZIONE IN VITRO DELL’ATTIVITA’ DI RIDUZIONE DELL’ACCUMULPO LIPIDICO A SEGUITO DI TRATTAMENTO CON L’ATTIVO SU COLTURE DI PREADIPOCITI.

2.1. Campione testato:

Campione: attivo (soluzione idroglicerica in cui il rapporto ponderale glicerina: acqua è compreso tra 1:1 e 2:1 contenente:

• 15-25% in peso sul peso totale della soluzione idroglicerica di Glicerofosforilcolina,

• 1- 3% peso sul peso totale della soluzione idroglicerica di valina

• 2- 3%. in peso sul peso totale di detta soluzione idroglicerica di lisina sotto forma del sale monocloroidrato).

2.2. Controlli

Controllo Fornitore

Terreno di coltura DMEM Bianco SIGMA

2.3 Test

➢ Determinazione dei lipidi intracellulari dopo esposizione al campione testato rispetto a un controllo negativo non trattato su adipociti differenziati 3T3-L1 mediante colorazione con oil red O.

➢ Acquisizione immagini digitali delle cellule attraverso microscopio a luce rovesciata e telecamera con software Motic.

2.4 Scopo del test

Scopo del test è quello di valutare se i campioni testati sono in grado ridurre l’accumulo intracellulare di lipidi in cellule di adipociti sottoposti a trattamento a diversi dosaggi, per confronto con adipociti non trattati.

Nel corpo umano il grasso in eccesso viene accumulato sotto forma di trigliceridi in cellule predisposte a questa funzione che sono gli adipociti e che si ritrovano nel tessuto adiposo bianco e bruno.

Il tessuto adiposo bianco è presente come grasso viscerale e subcutaneo con depositi più o meno estesi e svolge la funzione di principale riserva energetica dell'organismo, consentendo la mobilizzazione dei grassi durante le fasi di elevata richiesta e nei momenti di privazione di cibo. Oltre alla regolazione del bilancio energetico dell'organismo, i fattori secreti dal tessuto adiposo bianco svolgono un ruolo chiave nella modulazione dei processi metabolici, sensibilità insulinica e risposte immunologiche.

Il tessuto adiposo dell'uomo adulto mantiene la capacità di aumentare il numero di adipociti, suggerendo che la differenziazione dei preadipociti può avvenire in qualunque momento in risposta a stimolazioni nutritive e ormonali. Un aumento del tessuto adiposo bianco, oltre che ad una iperplasia degli adipociti, può essere legato ad un aumento della loro dimensione (ipertrofia). I trigliceridi all’interno degli adipociti formano infatti dei vacuoli che possono occupare la prevalenza dello spazio citoplasmatico e far aumentare di molto il volume della cellula.

Sostanze che dimostrino di agire sull’adipogenesi e/o sulla lipolisi causando in vitro la riduzione del contenuto lipidico dell’adipocita, possono essere utilizzate come agenti snellenti, tonificanti, stimolanti il metabolismo e coadiuvanti ne trattamento della cellulite.

In questo test, la riduzione del contenuto lipidico nelle cellule è stata evidenziata tramite colorazione delle cellule trattate con Oil Red O, un colorante specifico in grado di legarsi ai lipidi e quantificabile spettrofotometricamente.

2.5 Esecuzione del test

2.5.1 Modello cellulare

Il modello sperimentale in vitro consiste in una linea cellulare di pre-adipociti di topo 3T3-L1 (ATCC CL-173<TM>), che possiede la capacità di differenziare in adipociti dopo un opportuno trattamento.

2.5.2 Preparazione del campione

Il campione è stato sciolto in terreno di coltura DMEM high glucose addizionato di FBS al 10% e antibiotici (Penicillina 2000 UI/ml, Streptomicina 1000 UI/ml, Gentamicina 0,05mg/ml) alle seguenti concentrazioni: 2 e 0,4 mg/ml, decise sulla base di una citotossicità preliminare.

2.5.3 Trattamento ed esposizione

Le cellule sono state seminate in piastre da 12 pozzetti alla concentrazione di 40000 cellule/pozzetto e coltivate fino al 100% di confluenza in DMEM 10% CS. Dopo 48 h è stata indotta la differenziazione in adipociti mediante l’aggiunta di 0,5mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 1μM di Dexametasone e 1μg/ml di insulina in DMEM 10% FBS. Dopo 48h di trattamento, le cellule sono state passate a mantenimento in solo DMEM 10% FBS e 1μg/ml di insulina fino alla comparsa di variazioni morfologiche indicative della trasformazione in adipociti. A questo punto è stato aggiunto terreno di coltura fresco contenente la sostanza da testare. Cellule non trattate sono state utilizzate come controllo negativo. Ogni campione è stato testato in sestuplicato. Dopo 72 h di esposizione, è stata effettuata la rivelazione dei lipidi tramite colorazione con Oil Red O.

2.5.4 Colorazione con Oil Red O

Il Red Oil O è un colorante impiegato per la marcatura e quantificazione dei lipidi intracellulari.

Le cellule vengono prima fissate con 500μl di formalina al 10% per 2 h, quindi i pozzetti vengono lavati con isopropanolo al 60% e lasciati asciugare completamente. Si aggiungono 200μl di colorante in soluzione alla concentrazione di 2,3 mg/ml incubando le cellule per 10’ e lavando poi il colorante in eccesso. Dopo aver lasciato asciugare i pozzetti, il colorante viene eluito con isopropanolo e 200 µl di ogni campione vengono trasferiti in una piastra da 96 pozzetti. La lettura viene effettuata con un colorimetro (Tecan, Sunrise) equipaggiato con lettore di piastre, a 550 nm, con gli opportuni bianchi.

2.5.5 Interpretazione dei dati

La riduzione dell’accumulo di grassi negli adipociti viene calcolata rispetto al controllo negativo:

% riduzione lipidi = 100 – OD550 media campione X 100

OD550 media controllo negativo

2.5.6 Documentazione fotografica

Alla fine del trattamento, per evidenziare morfologicamente il numero ed il volume dei vacuoli presenti negli adipociti trattati e nei controlli, sono state acquisite immagini digitali delle cellule al microscopio a contrasto di fase Leika con luce rovesciata tramite telecamera digitale e software di gestione immagini Motic (ingrandimento 400X).

2.6 Risultati

2.6.1 Determinazione dei lipidi intracellulari (vedi tabella seguente)

Campione Valori OD OD media %Riduzione lipidica

0.5850

0.4850

Controllo negativo 0.4960 0.4902 -------

0.4610

0.4680

0.4390

Attivo: 0.4770

2 mg/ml 0.3810 0.3942 19.37 (8.81)

0.3620 P<0,05

0.3250

0.3810

0.5430

Attivo: 0.4 mg/ml 0.4010

0.3600 0.3878 23.81 (9.41)

0.3980 P < 0,05

0.3030

0.3220

2.6.2 Immagini al microscopio

Come risulta da una comparazione fotografica della Figura 1A in cui si riporta l’immagine delle cellule non trattate ovvero il controllo negativo con rispettivamente le immagini delle cellule di adipociti trattate rispettivamente con 2mg/ml (Figura 1B) e 0,4mg/ml (figura 1C) di attivo si nota una considerevole riduzione di vacuoli lipidici nei materiali trattati; i risultati migliori si ottengono quando la concentrazione dell’attivo è 0,4 ml e ciò è confermato anche risultati nella tabella riportata al paragrafo precedente dove l’efficacia maggiore si ha alla concentrazione 0.4 mg/ml (23.81% di riduzione).

ESEMPIO 3 – VALUTAZIONE IN VITRO DEL CONSUMO DI OSSIGENO IN COLTURE CELLULARI DI PREADIPOCITI

3.1. Campione testato

• 1- 3% peso sul peso totale della soluzione idroglicerica di valina

3.2 Controlli

Controllo Fornitore

Terreno di coltura DMEM Bianco SIGMA

3.3 Esecuzione

3.3.1 Modello cellulare

3.3.2 Preparazione del campione

3.3.3 Trattamento ed esposizione

Le cellule sono state seminate in piastre da 12 pozzetti alla concentrazione di 40000 cellule/pozzetto e coltivate fino al 100% di confluenza in DMEM 10% CS. Dopo 48 h è stata indotta la differenziazione in adipociti mediante l’aggiunta di 0,5mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 1μM di Dexametasone e 1μg/ml di insulina in DMEM 10% FBS. Dopo 48h di trattamento, le cellule sono state passate a mantenimento in solo DMEM 10% FBS e 1μg/ml di insulina fino alla comparsa di variazioni morfologiche indicative della trasformazione in adipociti. A questo punto è stato aggiunto terreno di coltura fresco contenente la sostanza da testare. Cellule non trattate sono state utilizzate come controllo negativo. Ogni campione è stato testato in triplicato.

Subito dopo l’applicazione del campione e fino a 72 ore, è stata misurata e registrata la concentrazione di ossigeno nel medium.

3.3.4 Determinazione del contenuto di ossigeno

La concentrazione di O2 presente nel terreno di coltura delle cellule, dopo trattamento con il prodotto alle diverse concentrazioni, è stata valutata mediante ossimetro Presens Microx 4. La misura è stata effettuata nel tempo per un totale di 72 ore di esposizione. Tutte le misurazioni sono state effettuate dopo aver isolato il medium cellulare dall’aria con un sovranatante non miscibile al fine di prevenire alterazioni del risultato causate dallo scambio di ossigeno tra medium ed atmosfera. Il test è stato effettuato in triplicato.

3.4 Risultati e conlusioni

3.4.1 Misura dell’ossigeno

Come si evince dai dati riportati nelle suddette tabelle, si assiste ad un incremento della riduzione % di ossigeno (- 21.5% per la concentrazione di 2 mg/ml a 72 ore) nel medium delle cellule trattate proporzionale alla dose di prodotto applicata e in aumento nel tempo rispetto al medium delle cellule non trattate. Questo è un indice della capacità del prodotto di stimolare il consumo di ossigeno da parte delle cellule.

3.4.2 Conclusioni

Sulla base dei dati sopra riportati possiamo concludere che l’attivo aumenta il consumo di ossigeno nel medium di coltura di adipociti misurato fino a 72 ore di trattamento.

3.5 Bibliografia

Si riportano di seguito le seguenti pubblicazioni scientifiche che sono state utilizzate come spunto per condurre le prove sperimentali del presente esempio e dell’esempio 2.

1 Karla A. Temple, Xheni Basko, Margaret B., Allison and Matthew J. Brady.

Uncoupling of 3T3- L1 gene expression from lipids accumulation during adipogenesis. FEBS Lett.2007, 581(3): 469-474.

2 Katija Z., et al Protocol for effective differentiation of 3T3-L1 cells to adipocytes, Analytical Biochemistry 425 (2012) 88-90

3 Mak-Soon Lee, In-Sook Kwun and Yangha Kim. Eicosapentaenoic acid increases lipolysis through up-regulation of the lipolytic gene expression and down-regulation of the adipogenic gene expression in 3T3-L1 adipocytes. Genes Nutr (2008) 2: 327-330.

4 Lise Madsen, Rasmus K. Petersen, Morten B. Sorensen, Claus Jorgensen, Philip Hallenborg, Lone Pridal et al. Adipocytes differentiation of 3T3-L1 preadipocytes is dependent on lipoxygenase activity during the initial stages of the differentiation process. Biochem. J. (2003) 375: 539-549.

5 Juan C. Calvo, David Rodbard, Aspandiar Katki, Sidney Chernick et al. Differentiation of 3T3-L1 preadipocytes with 3-Isobutyl-1-methilxanthine and dexamethasone stimulates cell-associated and soluble chondroitin 4-Sulfate proteoglycans. J.Biol.Chem (1991) 266(17): 11237-11244.

6 Thomas R. Russell and Ren-Jye Ho. Conversion of 3T3 fibroblasts into adipose cells:

triggering of differentiation by prostaglandin F2α and 1-methil-3-isobutylxanthine. Proc.Natl,Acad.Sci ESA (1976) Vol 73 (12): 4516-4520.

7 Henn Kutt and Theodore T. Tsaltas. Staining properties of Oil red O and Method of partial purification of the commercial product.Clin. Chem (1959), 5: 149-160.

8 Mario A Trelles and Serge R. Mordon. Adipocyte membrane lysis observed after cellulite treatment is performed with radiofrequency. Aesth Plast Surg (2009) 33: 125-128.

ESEMPIO 4 STUDIO CLINICO

4.1 Introduzione

La cellulite è generalmente definita come un’alterazione del tessuto adiposo spesso accompagnata da fenomeni di stasi venosa del microcircolo, che può presentarsi con diversi stadi di avanzamento.

La cellulite colpisce circa il 80-90% delle donne e si verifica in genere dopo la pubertà.

Nel corso degli ultimi decenni, tre principali teorie contrastanti sono emerse sulla eziopatogenesi della cellulite, con alterne fortune. Queste teorie indicano, rispettivamente, le seguenti cause del problema:

1. edema derivante da un’eccessiva idrofilia della matrice intercellulare;

2. alterazioni del microcircolo;

3. una diversa conformazione anatomica del tessuto sottocutaneo nelle donne rispetto agli uomini.

È necessario distinguere tra la forma di cellulite definita come "grasso localizzato" e la forma definita" Pannicolopatia-edematosa fibrosclerotica” (PEF) (Binazzi, 1983), dal momento che corrispondono a diverse eziologie e differenti evoluzioni cliniche.

La definizione di grasso localizzato indica un accumulo anomalo di depositi di grassi nel tessuto adiposo sottocutaneo in genere localizzato nella zona dei glutei, cosce e ginocchia; questi depositi di grasso possono o meno essere accompagnati da alterazioni del microcircolo.

La cellulite intesa come "Pannicolopatia-edematosa fibrosclerotica" può rappresentare un’evoluzione del "grasso localizzato", che colpisce le cellule adipose, ma anche il tessuto interstiziale e i piccoli vasi. Inizia generalmente con un edema interstiziale innescato da una permeabilità anomala del vaso sanguigno, che provoca una trasudazione di plasma il quale si accumula e ristagna nel tessuto È necessario distinguere tra la forma di cellulite definita come "grasso localizzato" e la forma definita "Pannicolopatia-edematosa fibrosclerotica” (PEF) (Binazzi, 1983), dal momento che corrispondono a diverse eziologie e differenti evoluzioni cliniche.

La cellulite intesa come "Pannicolopatia-edematosa fibrosclerotica" può rappresentare un’evoluzione del "grasso localizzato", che colpisce le cellule adipose, ma anche il tessuto interstiziale e i piccoli vasi. Inizia generalmente con un edema interstiziale innescato da una permeabilità anomala del vaso sanguigno, che provoca una trasudazione di plasma il quale si accumula e ristagna nel tessuto interstiziale tra le cellule adipose e provoca la dissociazione dei singoli adipociti e la formazione di edema (prima fase della cellulite).

Lo sviluppo di questo processo nel corso degli anni provoca una reazione anomala del sistema immunitario del tessuto adiposo dell’individuo inducendo un’alterazione della microcircolazione (seconda fase della cellulite).

In una fase successiva ha luogo la formazione del micronodulo che consiste in una struttura nodulare arrotondata di dimensioni 150-200 micron, circondata da una capsula di fibrille di collagene (terza fase di cellulite).

Quando diversi micronoduli si sviluppano, si creano macronoduli (5-20 nm), che possono essere rilevati attraverso la palpazione digitale e sono dolorosi alla palpazione.

4.2 Scopo del test

Questo studio è stato effettuato sul prodotto in esame al fine di valutare la sua efficacia nel ridurre la visibilità delle imperfezioni cutanee della cellulite su 20 volontari sani di sesso femminile presentanti livelli cellulitici da lievi a severi

A tale scopo, i seguenti parametri sono stati valutati:

1) Analisi morfologica delle zone trattate mediante DermaTOP-blue (Eotech, France), sistema laser blu body scanner in grado di quantificare la variazione dei volumi delle irregolarità del pannicolo adiposo, a T0 (valori basali), dopo 30 e 60 giorni (T30 e T60) di utilizzo quotidiano del prodotto (una volta al giorno).

2) Valutazione del rassodamento dell’area trattata mediante Cutometer® attraverso la misurazione della compattezza a T0 (valori basali), dopo 30 e 60 giorni (T30 e T60) di utilizzo quotidiano del prodotto (una volta al giorno).

3) Misurazione delle circonferenze delle cosce mediante metro millimetrato (misura distale e prossimale delle circonferenze della coscia destra e sinistra). I valori misurati a T30 e T60 sono stati confrontati con il valore basale (T0) per valutare gli effetti del trattamento sulla circonferenza delle cosce e la significatività dei risultati è stata calcolata ad ogni tempo sperimentale. Viene inoltre monitorato il peso corporeo.

4) Inoltre, le volontarie hanno risposto ad un questionario, al fine di esprimere la loro opinione sulla gradevolezza, sulla texture e sull’efficacia del prodotto.

4.3 Aspetti regolatori

Il test è stato condotto in accordo con i principi della dichiarazione di Helsinki (Principi etici per la ricerca medica che coinvolge soggetti umani, 59th WMA General Assembly, Seoul, October 2008) ed in accordo con le linee guida COLIPA per la valutazione dell’efficacia di prodotti cosmetici (maggio 2008).

4.4 Pannello di volontari

Per rispettare i requisiti etici imposti dagli studi sull'uomo, sono stati applicati i seguenti criteri:

➢ i volontari sono stati reclutati secondo i criteri di arruolamento e di esclusione più sotto specificati;

➢ tutti i volontari sono stati informati circa lo scopo e il tipo di studio, i possibili rischi, ed hanno fornito liberamente il loro consenso informato;

➢ prima che i volontari fossero esposti al prodotto in esame, sono state ottenute dallo sponsor informazioni circa il profilo tossicologico dello stesso (vedi paragrafo sulla limitazione di responsabilità, sopra);

➢ sono state prese tutte le precauzioni necessarie ad evitare reazioni cutanee eccessive o effetti indesiderati sulla salute dei volontari durante lo studio;

➢ sono state predisposte misure di sicurezza in caso di reazioni avverse.

4.5 Reclutamento dei volontari

Lo studio è stato effettuato su 20 volontarie di sesso femminile, presentanti livelli cellulitici da lievi a severi (Hexsel Dal’Forno & Hexsel (CSS)), che sono state identificate a partire dal database dei volontari del Centro Studi clinici Abich e che sono state valutate idonee alla partecipazione allo studio in quanto non affette da patologie alle aree in esame.

Le volontarie sono state informate circa la natura dello studio, gli impegni che esso richiedeva e i possibili rischi. Solo dopo la firma del consenso informato è stato concesso l'accesso allo studio.

Tutti i partecipanti hanno contestualmente firmato un modulo che permette il trattamento dei dati personali, secondo la legge italiana sulla "privacy" (Testo unico sulla privacy. D.Lgs 196/2003).

Sono stati applicati i seguenti criteri per l'interruzione dello stesso:

➢ -volontari che non hanno seguito le condizioni illustrate nel documento informativo ➢ volontari ai quali è subentrata una patologia di qualunque natura o che abbiano sviluppato delle condizioni che possano interferire con l'esito dello studio

➢ volontari che hanno deciso di cessare la partecipazione allo studio

➢ volontari che abbiano manifestato segni o sintomi di intolleranza durante la somministrazione del trattamento

Per tutta la durata dello studio ai volontari è stato richiesto di astenersi dall’utilizzo di prodotti analoghi nella zona in esame.

4.6 Struttura dello studio

Lo studio è stato effettuato con modalità osservazionale in aperto.

4.6.1 Condizioni ambientali

Lo studio è stato effettuato in condizioni ambientali standard, per ogni tempo di lettura, monitorando e mantenendo costanti la temperatura e l’umidità ambientali.

4.6.2 Area cutanea valutata

L’analisi morfologica è stata effettuata sull’area delle cosce.

4.6.3 Modalità di applicazione

Il prodotto è stato applicato una volta al giorno da ciascuna volontaria presentante livelli cellulitici, da lievi, a severi. I soggetti hanno utilizzato il prodotto per 60 giorni nell'area del girovita, dei fianchi, del ventre e dei glutei secondo indicazioni dello Sponsor ed il normale uso del prodotto. Ciascuna volontaria ha applicato un generoso strato di prodotto sulla pelle asciutta delle zone interessate massaggiando fino a completo assorbimento.

4.6.4 Analisi morfologica e materiali

Sono state utilizzate le seguenti apparecchiature e materiali:

➢ L’analisi morfologica cutanea è stata effettuata mediante Derma TOP-blue di Eotech

Derma TOP-blue è uno scanner cutaneo 3D ottimizzato per fornire misure precise e riproducibili della topografia cutanea utili in campo dermatologico e cosmetico senza la necessità di utilizzare repliche siliconiche. Lo strumento utilizza, per l’acquisizione, la visualizzazione e l’analisi dei dati, il software dermaTOP basato sul programma OPTOCAT di Breuckmann.

L’accuratezza e la riproducibilità delle misure sono garantite da un sistema studiato per il posizionamento del volontario che permette la misurazione precisa della stessa area ai diversi tempi di analisi e dal software utilizzato optoCAT per l’acquisizione, la visualizzazione e l’analisi dei risultati il quale estrae dalle immagini acquisite la medesima area per l’analisi ai diversi tempi di misura e la sovrappone, allineandola, a quella precedente.

Il parametro analizzato per valutare l’efficacia anticellulite è il Volume negativo, che consiste nel volume, espresso in mm<3>, delle irregolarità del pannicolo adiposo presenti tra la superficie del profilo in esame e un piano di riferimento ideale perfettamente liscio.

L’analisi del parametro volume negativo è stata effettuata a T0 (valori basali), dopo 30 e 60 (T30 e T60) giorni di applicazione del prodotto (una volta al giorno).

Le rilevazioni sono state effettuate a livello delle cosce destra e sinistra di ogni volontaria e sono poi stati calcolati i valori medi.

E’ stato inoltre impiegato un termoigrometro ambientale (Courage-Khazaka GmbH -Germania) per monitorare temperatura ed umidità.

4.6.5 Misurazioni

L’efficacia del prodotto è stata valutata all’inizio del trattamento (T0), dopo 30 e 60 (T30 e T60) giorni di applicazione quotidiana.

Le misurazioni sono state effettuate sul lato destro e sinistro di ciascun volontaria. I risultati sono stati calcolati come media dei valori ottenuti a destra ed a sinistra.

4.6.6 Valutazione del rassodamento dell’area trattata

Apparecchiature e materiali

➢ -Multiprobe Adapter Systems MPA® (Courage-Kkazaka), dotato di Cutometer®, utilizzato per la valutazione dell’elasticità e della compattezza cutanea

➢ Termoigrometro ambientale (Courage-Khazaka GmbH - Germany).

La sonda misuratrice del Cutometer® (2mm di diametro) viene posizionata perpendicolarmente sull’area cutanea da analizzare.

Si crea, all’interno della sonda, un gradiente negativo di pressione pari a 450 mBar (aspirazione), che provoca la penetrazione della cute all’interno dell'apertura della sonda (range: da 1 a 10 mm); quando s'interrompe la pressione negativa, la cute ritorna al suo stato originale. Il tempo di aspirazione e di rilascio sono pari a 2 secondi, secondo lo standard suggerito dal produttore.

Ogni misurazione (aspirazione rilascio) è stata effettuata tre volte consecutive per ogni misurazione. La curva risultante da tali misurazioni evidenzia le qualità viscoelastiche della pelle. Secondo questo tipo di misurazione i seguenti parametri critici verranno in particolare analizzati:

R0 = Uf = rappresenta il comportamento passivo della cute all'applicazione della forza di suzione ed esprime la compattezza della pelle; tanto minore è questo valore tanto più la pelle è compatta;

Misurazioni

Le misure della compattezza sono state effettuate a T0 (valori basali), dopo 30 (T30), e dopo 60 (T60) giorni di applicazione del prodotto (una volta al giorno). Le rilevazioni sono state effettuate a livello delle cosce destra e sinistra di ogni volontaria.

4.6.7 Misurazione della circonferenza cosce e monitoraggio del peso corporeo

Le misure della circonferenza delle cosce sono state effettuate all’inizio e alla fine dello studio, con un nastro misuratore in mm, ed i valori a T30 e T60 sono stati confrontati con i valori basali per valutare l'effetto del trattamento sulla riduzione della circonferenza e la significatività dei risultati ottenuti. Per ogni volontario sono eseguite due misure per coscia (misura prossimale e misura distale della coscia destra e sinistra). Inoltre la misura del peso è stata effettuata ad ogni tempo di analisi ed i valori sono stati confrontati con i quelli basali.

Tutte le misure sono state effettuate nelle stesse condizioni sperimentali, con il volontario nella stessa posizione. Le misure di circonferenza della coscia sono state rilevate esattamente nello stesso punto ad ogni tempo di lettura con l'aiuto di un nastro graduato posto dietro il volontario, che ha permesso di individuare con precisione il punto di misura, valutando la sua distanza dal pavimento e registrando le coordinate personali di ogni volontario.

Apparecchiature e materiali

Sono state utilizzate le seguenti apparecchiature e materiali

➢ Penna dermografica e nastro graduato per l’identificazione dell’area da misurare; ➢ Nastro misuratore graduato in mm per la misurazione della circonferenza;

Pesapersone meccanica (Laica S.p.A.) per il monitoraggio del peso.

Tempi sperimentali

La valutazione della circonferenza cosce e del peso corporeo è stata effettuata prima dell’applicazione del prodotto (T0), dopo 30 giorni (T30) e 60 giorni (T60) di applicazione dello stesso (una volta al giorno).

4.7 Risultati e conclusioni

4.7.1 Risultati

4.7.1.1 Misurazione del volume negativo (mm<3>)

Le tabelle qui sotto riportano le medie relative ai valori di volume negativo espressi in mm3 (tabella 1a), i valori medi di variazione percentuale calcolati come media delle singole variazioni percentuali di ciascuna coscia, a T30vsT0 e a T60vsT0, i relativi valori di significatività calcolati tramite test di Student (analisi intra-gruppo) (tabella 1b). La distribuzione dei valori ottenuti nelle misurazioni ai diversi tempi sperimentali è stata confrontata con analisi intra-gruppo (T30vsT0 e T60vsT0) mediante test di Student. Valori di p<0.05 sono stati considerati significativi.

Tabella A- Valori medi di volume negativo (mm<3>)

Tempo Coscia sinistra Coscia destra Media sinistradestra

T0 -60,7549 -58,2511 -59,5030

T30 -55,4882 -55,8369 -55,6626

T60 -54,8832 -49,2492 -52,1562

Tabella B- Variazione percentuale media dei valori di Volume negativo (mm3) e relativo valore p del Test di Student

Tempo Coscia sinistra Coscia destra Media sinistradestra

T30vsT0 -5,5 -4,88 -5,2*

T60vsT0 -9.8 -13,2 -11,5*

* Valori p relativi a variazioni statisticamente significative

4.7.1.2 Misurazioni della compattezza cutanea(R0)

L’efficacia dei prodotti è stata valutata all’inizio del trattamento (T0), dopo 30 (T30) e 60 (T60) giorni di applicazione. Le misurazioni sono state effettuate sul lato destro e sinistro di ciascuna volontaria.

Le tabelle qui sotto riportano le medie di R0 (tabella A) e i valori medi di variazione percentuale calcolati come media delle singole variazioni percentuali di ciascun volontario, a T30, T60 vs T0 (Tabella B) Valori di p<0.05 sono stati considerati significativi.

Tabella A Valori medi di R0

TEMPO Coscia sinistra Coscia destra Media sinistradestra

T0 0,2171 0,2005 0,2088

T30 0,1892 0,1836 0,1864 T60 0,1723 0,1739 0,1731

Tabella B Variazione percentuale media dei valori di R0

TEMPO Coscia sinistra Coscia destra Media Sinistra destra T30vsT60 -7.0 -7.1 -7.1*

T60vsT0 -14,5 -12.3 -13.4*

* Valori p relativi a variazioni statisticamente significative

4.7.1.3 Misurazione della circonferenza cosce e monitoraggio del peso corporeo

Le tabelle qui sotto riportano la variazione della circonferenza cosce dopo 30 giorni (T30) e 60 giorni (T60) di applicazione del prodotto (Tabella A) ed il relativo valore di significatività calcolato tramite test di Student (Tabella B). Valori di p<0.05 sono stati considerati significativi.

Tabella A-Riduzione media della circonferenza cosce (cm)

* Valori p relativi a variazioni statisticamente significative

Le variazioni della circonferenza coscia ottenute non sono associate a variazioni di peso statisticamente significative.

4.7.2 Conclusioni

Sulla base dei risultati ottenuti con la procedura sperimentale adottata, si può quindi concludere che il prodotto nei soggetti che si sono sottoposti al test, determina:

• Un miglioramento della morfologia del pannicolo adiposo a livello delle cosce dopo 60 giorni di utilizzo quotidiano del prodotto. In particolare il Volume Negativo risulta diminuito di un valore pari al 5,2% dopo 30 giorni di applicazione e di un valore pari al 11,5% dopo 60 giorni di applicazione; queste variazioni sono statisticamente significative (p<0.05).

• Un miglioramento della compattezza (R0) a livello delle cosce dopo 60 giorni di utilizzo quotidiano. In particolare R0 risulta diminuito di un valore pari al 7,1% dopo 30 giorni e di un valore pari a 13,4% dopo 60 giorni di utilizzo del prodotto; queste variazioni sono statisticamente significative (p<0.05).

• Una riduzione (media delle variazioni ottenute nella coscia destra e nella coscia sinistra) pari a -0.3 cm nella regione prossimale delle cosce e pari a -0.2cm nella regione distale delle cosce dopo 60 giorni di utilizzo del prodotto. Tali variazioni sono statisticamente significative (p<0.05) e non sono associate a variazioni significative di peso.

4.7.3 Bibliografia

Cellulite: nature and aetiopathogenesis. F. Terranova, E. Berardesca and H. Maibach. International Journal of Cosmetic Science, 2006, 30, 157–167

Curri S.B., Adiposità localizzata e pannicolopatia edemato-fibrosclerotica, SEPEM, Milano, 1990, pp117. Novità nel trattamento topico della cellulite. E. Bocchietto e L. Pecis Smalls L. K., Lee Y. C., Whitestone J., Kitzmiller W.J., Wickett R.R., Visscher O.M. Quantitative model of cellulite: three-dimensional skin surface topography, biophysical characterization and relationship to human perception. International Journal of Cosmetic Science vol.27 issue 5 October 2005. p.295-295

Hexsel D. Dal Forno TO, Cignachi S. Definition, clinical aspects, associated conditions, and differential diagnosis. In: Goldman MP, Bacci PA, Leibaschoff G, Hexsel D, Angelini F, eds.

Cellulite – Pathophysiology and Treatment. Taylor&Francis, New York (NY), 2006: 7–30.

S. Dikstein, Instrumental Analysis in Individual Cosmetic Consultation, Cosmetics & Toiletries, Vol.98, Nov.1983.

Stanton A. Glantz, Statistica per discipline Biomediche, Quinta edizione, McGrawHill, 2003. “Cosmetology – Theory and Practice” Volume I, Karlheinz Schrader, Andreas Domsch, 2005.

P. Elsner, H.F.Merk, H.I. Maibach. “COSMETICS Controlled Efficacy Studies and Regulation”, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1999.

RIFERIMENTI

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OECD SERIES ON PRINCIPALES OF GLP AND COMPLIANCE MONITORING

“Quality assurance and GLP” 26 Oct.1999.

Consensus documents Number 5.

OECD SERIES ON PRINCIPALES OF GLP AND COMPLIANCE MONITORING

“Compliance of laboratory suppliers with GLP principles” 30 Sept.2000.

Consensus documents Number 7.

OECD SERIES ON PRINCIPALES OF GLP AND COMPLIANCE MONITORING

“The application of to GLP principles to short term studies” 15 Sept.1999.

Consensus documents Number 8.

OECD SERIES ON PRINCIPALES OF GLP AND COMPLIANCE MONITORING

“The role and responsibility of the Study Director in the GLP studies” 15 Sept.1999.

ESEMPIO 5 si riportano di seguito alcuni esempi formulativi delle composizioni cosmetiche oggetto dell’invenzione a scopo illustrativo, ma non limitativo.

Preparazioni topiche per il trattamento degli inestetismi della cellulite:

Alcol 5.0-15.0%

Additivo reologico 0.7-1.2%

Sistema conservante e chelante 0.4-1.0%

Principio Attivo 1.0-3.0%

Funzionali complementari* 1.0-7.0%

Regolatore di pH q.b. a pH desiderato

Acqua q.b.

*Consigliata l’associazione con Xsolve (INCI Name: Ethyl Ximenynate, Lecithin)

Lozione e prodotti hair-care anti-caduta:

Alcol 10-30%

Sistema conservante e chelante 1.0%-5.0%

Principio Attivo 1.0-3.0%

Funzionali complementari 1.0-3.0%

Regolatore di pH q.b. a pH desiderato

Acqua q.b.

Applicazioni skin-care anti-età:

Sistema emulsionante* 3.0-10.0%

Fase lipofila 5.0-20.0%

Additivo reologico 0.2-0.5%

Sistema conservante e chelante 1.0-1.5%

Principio Attivo 1.0-3.0%

Funzionali complementari** 0.5-3.0%

Regolatore di pH q.b. a pH desiderato

Fragranza 0.2-0.3%

Acqua q.b.

*Consigliato Phytocream (INCI Name: Potassium Palmitoyl Hydrolyzed Wheat Protein, Glyceryl Stearate, Cetearyl Alcohol), Supreme (INCI Name: Polyglyceryl-3 Rice Branate, Cetearyl Alcohol, Sucrose Stearate), Hitecream (INCI Name: Potassium Palmitoyl Hydrolyzed Oat Protein, Behenyl Alcohol, Palm Glycerides, Sodium Stearoyl Glutamate, Sucrose Palmitate)

** Consigliata l’associazione con Dolcevia (INCI Name: Stevioside )

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Composizioni cosmetiche topiche comprendenti come principio attivo: a) Glicerofosforilcolina e b) Un’associazione di almeno 2 fino a 4 amminoacidi essenziali e non essenziali scelti tra: valina, lisina, metionina, cisteina, arginina, glutammina.
2. Composizioni cosmetiche topiche secondo la rivendicazione 1 contenenti come componente b) un’associazione di valina e lisina.
3. Composizione cosmetiche topiche secondo la rivendicazione 2 in cui detta associazione di a) e b) è contenuta in una soluzione idroglicerica in cui il rapporto ponderale glicerina ed acqua è compreso tra 1: 1 e 2:1.
4. Composizioni cosmetiche topiche secondo la rivendicazione 3, in cui detta soluzione idroglicerica contiene la glicerofosforilcolina in quantitativo compreso tra il 15 ed il 25% in peso, valina in un quantitativo compreso tra 1 e 3% in peso sul peso totale di detta soluzione idroglicerica e lisina, preferibilmente sotto forma del sale monocloroidrato, in un intervallo compreso tra 2 e 5% in peso sul peso di detta soluzione.
5. Composizioni cosmetiche topiche secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 2-4, in cui dette composizioni topiche finite sono liquide, fluide, semi-fluide o consistenti, scelte tra creme, sieri, gel, emulgel, lozioni spruzzabili.
6. Composizioni topiche cosmetiche secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 3-5, contenenti tra 1 e 3% in peso di detta soluzione idroglicerica sul peso totale di detta composizione topica cosmetica.
7. Composizioni topiche cosmetiche secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 2-6, per uso nel contrastare gli inestetismi della cellulite.
8. Composizioni topiche cosmetiche secondo la rivendicazione 1, in cui il componente b) è un’associazione di metionina, arginina, cisteina e glutammina.
9. Le composizioni topiche cosmetiche secondo la rivendicazione 8 per uso nel contrastare la caduta dei capelli.
10. Composizioni topiche cosmetiche secondo la rivendicazione 1, in cui il componente b) è un’associazione di metionina, arginina e glutammina.
11. Composizioni topiche cosmetiche secondo la rivendicazione 10 per uso nel contrastare i segni dell’età.