HUT78060A - Mikrospóra-specifikus szabályozó elem - Google Patents

Description

DANUBIA SZABADALMI ÉS VÉDJEGY IRODA Kft

Mikrospóra-specifikus szabályozó elem

A találmány tárgyát egy új szabályozó elem képezi, amely a génexpressziónak mikrospóra-specifitást biztosít. Közelebbről, a találmány tárgyát a Brassica napus Bnml-gén mikrospóra-specífikus szabályozó eleme képezi, és a szabályozó elem alkalmazása transzgenikus, hímsteril növények előállítására. Szintén a találmány tárgyát képezi egy eljárás, melynek alkalmazásával a hímtermékenység helyreállítható a hímsteril növények utódaiban. Ezenfelül a találmány tárgyát képezi a mikrospóra-specifikus szabályozó elem alkalmazása is, vírus- és rovarkártevők elleni védelemben.

A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható haszonnövények nemesítése során, valamint a növényvédelemben .

A hibridnövények előállítása során nélkülözhetetlen a virágpor termékenységének ellenőrzés alatt tartása. A virágpor termékenységének szabályozására rendelkezésre állnak olyan hagyományos módszerek, mint a termős szülőként használandó növények kézi kasztrálása, vagy kémiai vegyületekkel való kezelése. Ez utóbbi módszer szerint eljárva a hibrid magokat a kémiailag kezelt termős növények a kezeletlen növényekből származó virágporral való keresztezésével álAktaszámunk: 85755-6198/PÁ

- 2 • 5

Htjuk elő. Azonban mindkét módszer munkaigényes. Ehhez járul még az is, hogy előnyösebb elkerülni környezetünkben a toxikus kemikáliák használatát.

A termékenység szabályozásának egy másik megközelítése a hímsterilitást okozó citoplazma eredetű gén(ek) alkalmazásán alapszik. Ennek a megközelítésnek a nehézsége, hogy bizonyos citoplazma eredetű hímsterilitást okozó gének expressziója együtt jár a gomba eredetű patogénekkel szembeni nagyobb fogékonysággal. Például, a kukoricanövényben kiterjedten alkalmazott cmsT-citotípus a hetvenes évek elején a déli kukoricalevél-rozsda (Southern Corn Leaf Blight) epifita járványhoz vezetett. Bár további citoplazma eredetű hímsterilitás citotípusok váltak hozzáférhetővé, alkalmazásuk nem terjedt el széles körben a potenciális patogénekkel szembeni fogékonyságtól való félelem miatt.

A hibridvonalak előállítási lehetősége gazdaságilag különösen jelentős az olajmagvú termények esetében. Például a Brassica napus Fl hibridvonalak tipikusan 20-70 százalékkal magasabb hozamot biztosítanak,· mint a már ismert vonalak. [Thompson: Adv. Appl. Bioi. 7 1 (1983); Johnston: Euphytica 20 81 (1971)] . A leggazdaságosabb és flexibilis módszer a

Brassica termékenységének szabályozására a Brassica fajokban eredetileg is jelen levő saját-összeférhetetlenségi rendszert használja fel [Gowers: Euphytica 24 537 (1975)].

Azonban bizonyos környezeti feltételek, mint például megemelkedett hőmérséklet esetén, a saját-összeférhetetlenségi rendszer nem megbízhatóan hatásos.

• · . >

- 3 Szükség van tehát olyan eljárásra, amellyel a virágpor termelés ellenőrzés alatt tartható anélkül, hogy a természetesen előforduló hímsterilitás génekre, vagy sajátösszeférhetetlenségi génekre, avagy a hagyományos kézi, illetve kémiai módszerekre hagyatkozzunk.

Fentieknek megfelelően a találmány tárgyát képezi az eljárás hímsteril növények előállítására, amely eljárásban a mikrospórák működését gátló expressziós vektort alkalmazunk.

A találmány tárgyát képezi még egy DNS-regulációs elem, amely mikrospóra-specifikus génexpressziót biztosít.

Ezek és más követelmények teljesíthetőek a találmány egy megvalósítási módja szerint, amely eljárásban izolált DNS-molekulát használunk, amely DNS-molekula mikrospóraspecifikus szabályozó elem, és ahol a DNS-molekula az alábbi nukleotid szekvenciák valamelyikét tartalmazza: (a): 8. azonosítási szám szerinti szekvencia, (b): egy olyan nukleotid szekvencia, amely a 8. azonosítási szám szerinti szekvenciával jelentős szekvencia hasonlóságot mutat, és (c) : amely (a) vagy (b) egy működőképes fragmense.

A találmány tárgyát képezik olyan expressziós vektorok is, amelyek mikrospóra-specifikus szabályozó elemet tartalmaznak. Az ilyen expressziós vektorok tartalmazhatnak promótert is, ahol a promóter működése a mikrospóraspecifikus szabályozó elem kontrollja alatt van. A megfelelő promóterekre példaként szolgál a Bnml-promóter, amely egy portok-specifikus promóter, valamint a CaMV35S-„corepromóter is.

- 4 >

A találmány tárgyát képezi még olyan expressziós vektor is, amely továbbá promóterhez funkcionálisan kapcsolt idegen gént is tartalmaz, ahol az idegen gén terméke a mikrospórák működését gátolja.

A találmány tárgyát képezi továbbá az az eljárás, amely szerint eljárva ilyen expressziós vektorokat alkalmazunk himsteril növények előállítására, amely eljárás része az a lépés, amikor az expressziós vektort csirakezdemény eredetű növényi sejtekbe juttatjuk. Ebben az esetben az idegen gén az alábbiak valamelyike lehet: struktúrgén, antiszensz-gén, ribozim-gén és külső irányító szekvencia-gén. Példaként szolgálhat az ilyen expressziós vektor bejuttatása a Brassica napus csirakezdemény eredetű növényi sejtjeibe.

Az alkalmas struktúrgének az alábbi fehérjéket valamelyikét kódolhatják: diftéria toxin, alkörmös (pokeweed) antivirális fehérje, Aspergillus oryzae RNáz-Tl, barnáz és a rolB-gén terméke.

Az alkalmas antiszensz-gén termék az alábbiak valamelyike lehet: aktin antiszensz RNS, tubulin ant-iszensz RNS, ubiquitin antiszensz RNS, ubiquitin-konjugáló enzim antiszensz RNS, ubiquitin-hordozó fehérje antiszensz RNS, elongációs faktor antiszensz RNS és chalcone-szintáz antiszensz RNS.

Ezenkívül a ribozim-gének vagy a külső irányító szekvencia-gének az alábbi nukleotid szekvenciák valamelyikét tartalmazhatják: aktin nukleotid szekvenciák, tubulin nukleotid szekvenciák, ubiquitin nukleotid szekvenciák, ubiquitin-konjugáló enzim nukleotid szekvenciák, ubiquitin• ·

- 5 hordozó fehérje nukleotid szekvenciák, elongációs faktor nukleotid szekvenciák és chalcone-szintáz nukleotid szekvenciák .

A találmány tárgyát képezi továbbá az az eljárás, amellyel himsteril növények állithatóak elő, a következők szerint:

(A) Mikrospóra-specifikus szabályozó elemet, promótert, és idegen gént tartalmazó expressziós vektort szerkesztünk, ahol a mikrospóra-specifikus szabályozó elem az alábbi nukleotid szekvenciák valamelyikét tartalmazza: (a), 8. azonosítási szám szerinti szekvencia; (b) , egy olyan nukleotid szekvencia, amely a 8. azonosítási szám szerinti szekvenciával jelentős szekvencia hasonlóságot mutat; és (c), (a) vagy (b) fragmense, ahol a mikrospóra-specifikus szabályozó elem a promóterrel együtt szabályozza az idegen gén expresszióját, és ahol az idegen gén terméke gátolja a mikrospórák működését, ily módon hímsteril növényt eredményezve.

Ez az eljárás a (B) lépést'is magába foglalhatja, amely szerint az expressziós vektort csirakezdemény eredetű növényi sejtekbe juttatjuk be.

A találmány tárgyát képezi még az az eljárás is, amely szerint eljárva hím-termékeny hibridnövényt állítunk elő mikrospóra-specifikus szabályozó elem alkalmazásával, úgy, hogy:

(i) egy első - hímsteril - szülőnövényt állítunk elő, amely olyan expressziós vektort tartalmaz, ahol a vektor mikrospóra-specifikus szabályozó elemet, promótert és egy

- 6 >

első idegen gént tartalmaz, ahol a mikrospóra-specifikus szabályozó elem a promóterrel együtt szabályozza az első idegen gén expresszióját, és ahol az első idegen gén terméke gátolja a mikrospórák működését;

(ii) egy második szülőnövény állítunk elő, amely olyan expressziós vektort tartalmaz, ahol a vektor mikrospóraspecifikus szabályozó elemet, promótert és egy második idegen gént tartalmaz, ahol a mikrospóra-specifikus szabályozó elem a promóterrel együtt szabályozza a második idegen gén expresszióját; és (iii) az első és második szülőnövényt keresztezzük, hogy hibrid növényt kapjunk, ahol a hibrid növény mikrospórái expresszálják a második idegen gént, és ahol a második idegen gén terméke kivédi a mikrospóra funkció gátlását, amit az első idegen gén terméke okozna, és ily módon hím-termékeny hibrid növényt kapunk.

Az első idegen gén kódolhat például barnázt és a második idegen gén kódolhat barnáz-inhibitort. Eljárhatunk úgy is, hogy diftéria toxin az első idegen gén terméke és a második idegen gén terméke a diftéria toxin ribozim.

A találmány tárgyát képezi még az az eljárás is, amely alkalmazásával hímsteril hibrid növények termékenysége helyreállítható, úgy, hogy a hímsteril hibrid növényt flavonol aglikonnal kezeljük, ahol a hímsteril növény egy olyan expressziós vektorral rendelkezik, amely (a) , mikrospóra-specifikus szabályozó elemet; (b), promótert; és (c) , idegen gént tartalmaz, ahol a mikrospóra-specifikus

- Ί I szabályozó elem a promóterrel együtt szabályozza az idegen gén expresszióját, amely idegen gén chalcone-szintáz antiszensz RNS-t expresszál, és ily módon flavonol-hiányos mikrospórákat eredményez. Kampferol lehet például egy alkalmas flavonol ágiikon.

A találmány tárgyát képezi továbbá az az eljárás is, amely szerint eljárva vírus, vagy rovar okozta betegséggel szemben ellenálló transzgenikus növények állíthatók elő. Az eljárás során mikrospóra-specifikus szabályozó elemet, promótert és idegen gént tartalmazó expressziós vektort hozunk létre, ahol a mikrospóra-specifikus szabályozó elem az alábbi nukleotid szekvenciák valamelyikét tartalmazhatja: (a), 8. azonosítási szám szerinti szekvencia; (b), egy olyan nukleotid szekvencia, amely a 8. azonosítási szám szerinti szekvenciával jelentős szekvencia hasonlóságot mutat; és (c), (a) vagy (b) fragmense, ahol a mikrospóra-specifikus szabályozó elem a promóterrel együtt szabályozza az idegen gén expresszióját, és ahol az idegen gén terméke gátolja a vírus működését,, illetve egy inszektícíd hatású toxint kódol, ily módon a betegséggel szembeni ellenálló képességet biztosítva a növénynek. A vírus-gátló idegen gén termék az alábbiak valamelyike lehet: vírus burokfehérje, 2'-5'-oligoadenilát-szintetáz, vírusgenom-eredetü antiszensz RNS, és alkörmös antivirális fehérje, ugyanakkor az alkalmas inszekticid hatású toxin a Bacillus thüringiensis endotoxin lehet.

··-· ',·· ·,,'*· fc· ··♦· < · « · * ··· · «····*··

C · v · · » * ·

- 8 I

Az 1. ábra a Bnml cDNS nukleotid szekvenciáját mutatja be (1. azonosítási szám szerinti szekvencia) az annak megfelelő aminosav szekvenciával együtt (2. azonosítási szám szerinti szekvencia) . Az ATG start kodont, a TGA stop kodont és a vélelmezett poliadenilációs szignál szekvenciát kettős aláhúzással jelöltük.

A 2. ábra a Bnml genomi eredetű klón nukleotid szekvenciáját mutatja be (5. azonosítási szám szerinti szekvencia) a promóterrel, kódoló régióval és az egyetlen intronnal együtt (dőlt betűvel jelölve). Az aláhúzással jelölt régió azonos a Bnml cDNS-szekvenciával. Az ATG start kodont, a TGA stop kodont és a vélelmezett poliadenilációs szignálszekvenciát csillagokkal jelöltük.

A 3. ábra a Bnml-promóter klónozásában alkalmazott PCRamplif ikált promóter fragmens nukleotid szekvenciáját mutatja be. Az ATG start kodon az Ncol restrikciós hasító helyen belül található.

A 4. ábra a DP5476-vektor térképét mutatja be, amely vektor tartalmazza a pBlueScript® II SK+ vektor Sall-EcoRI helyei közé illesztett GUS gén-PINII termináló kazettát irányító Brassica napus mikrospóra promótert (Msp Prom). A vektor az E. coli transzformátumok szelektálására szolgáló markert, egy ampicillin-rezisztencia gént (AmpR) is tartalmaz .

Az 5. ábra a DP5477-vektor térképét mutatja be, amely vektor a DP1741 kettős vektor SalI-EcoRI helyei közé illesztett GUS gén-PINII termináló kazettát irányító Brassica napus mikrospóra promótert (Msp Prom) tartalmazza. A «·ν

- 9 ί

DP5477-vektor továbbá a CaMV35S promóter által irányított neomicin-transzferáz gént (NPTII) is tartalmazza, amely szelekciós markerként alkalmazható. A bal és jobb T-DNS határokat egyező sorrendben LB és RB jelöléssel láttuk el.

A leírásban széles körben alkalmazzuk az itt következő szakkifejezéseket. A felsorolt definíciók a találmányi leírás könnyebb megérthetőségét szolgálják.

„Struktúrgénnek nevezzük azt a DNS-szekvenciát, amely hírvivő RNS-be (mRNS) átíródik (transzkripció), amely azután a megfelelő polipeptidre jellemző aminosav szekvenciába átfordítódik (transzláció).

A „promóter olyan DNS-szekvencia, amely a struktúrgén transzkripcióját irányítja. A promóter rendszerint a gén 5' régiójában helyezkedik el, a struktúrgén transzkripciós starthelye szomszédságában. Amennyiben a promóter indukálható promóter, a transzkripció sebessége növekszik az indukáló anyag hatására. Ezzel szemben, amennyiben a promóter állandó (konstitutív) promóter, a transzkripció sebessége nem áll indukáló anyag szabályozása alatt.

A „belső promóter (core promoter) a promóter funkcióhoz nélkülözhetetlen nukleotid szekvenciákat tartalmaz, úgymint a transzkripciós starthely és a TATA box. E definíció szerint a „core-promóter rendelkezhet, vagy sem mérhető aktivitással specifikus szekvenciák hiányában, amelyek egyrészt erősíthetik az aktivitást, vagy másrészt szövetspecifikus aktivitást biztosíthatnak. Példaként szolgál a karfiol mozaikvírus (CaMV) 35S-„core-promótere, amely a 35S-genom transzkripciós starthelyétől 5'-irányban számítva körülbelül 33 nukleotidot tartalmaz.

A „mikrospóra-specifikus szabályozó elem alatt olyan DNS-szekvenciát értünk, amely a hozzá kapcsolódó gén magasabb szintű transzkripcióját biztosítja a mikrospórákban, a növény egy vagy több más szövetével összehasonlítva. Példaként szolgál az itt leírt Bnml-gén, amely a fejlődés kétmagvú és három-magvú fázisaiban a mikrospórákban expresszálódik. A Bnml-gén mikrospóra-specifikus szabályozó eleme képes arra, hogy egy idegen gén expresszióját irányítsa a mikrospórákban, de nem működőképes a portok fal, a bibe, vagy a csészelevél szöveteiben.

Az „izolált DNS-molekula egy olyan DNS-fragmens, amely nem épült bele egy szervezet genomi eredetű DNS-ébe. Például, a Bnml-gén mikrospóra-specifikus szabályozó eleme egy olyan DNS-fragmens, amelyet elválasztottunk a Brassica napus genomi eredetű DNS-étől. Egy másik példa az izolált

DNS-molekulára a kémiai szintézissel előállított DNSmolekula, amely nem része egy szervezet genomi eredetű DNSének.

Az „enhanszer olyan DNS-szabályozó elem, amely képes a transzkripció hatékonyságát fokozni, függetlenül az enhanszer és a transzkripciós starthely egymáshoz viszonyított távolságától, vagy irányítottságától.

A „komplementer DNS (cDNS) olyan egyszálú DNSmolekula, amely a reverz-transzkriptáz enzim segítségével mRNS-mintáról (templát) készül. Rendszerint a reverz transzkripció indításához egy, a mRNS részeihez komplementer prímért használunk. A technika állása szerint a cDNS ··· · • · · ·

- 11 kifejezést használjuk akkor is, ha olyan kettős-szálú DNSmolekuláról van szó, ahol ezt az egyszálú DNS-t, annak komplementer szálja kiegészíti.

Az „expresszió kifejezést használjuk a géntermék bioszintézisére. Például struktúrgén esetében az expresszió magába foglalja a struktúrgén transzkripcióját mRNS-be és a mRNS transzlációját egy vagy több polipeptiddé.

A „klónozó vektor olyan DNS-molekula - mint például plazmid, kozmid vagy bakteriofág - amely képes a gazdasejtben független módon szaporodni (replikáció). A klónozó vektorok rendszerint tartalmaznak egy vagy több (kis számú) restrikciós endonukleáz felismerő helyet, ahova idegen DNSszekvenciák előre meghatározott módon beilleszthetők, anélkül, hogy a vektor egy lényeges biológiai funkciója károsodjon. A vektor ugyanakkor tartalmaz jelölő (marker) gént is, amely alkalmas a klónozó vektorral történő transzformáció után a transzformált sejtek azonosítására és szelektálására. Rendszerint tetraciklin- vagy ampicillinrezisztenciát biztosító géneket használunk, mint marker gének.

Az expressziós vektor olyan DNS-molekula, amelyik tartalmazza a gazdasejtben kifejeződő gént. A génexpressziót rendszerint bizonyos szabályozó elemek szabályozása alatt hozzuk létre, úgymint konstitutív vagy indukálható promoterek, szövet-specifikus szabályozó elemek és enhanszerek. Az ilyen génről azt mondjuk, hogy „funkcionálisan kapcsolt a szabályozó elemekhez.

A leírásban az idegen gén kifejezés alatt értjük az olyan DNS-szekvenciát, amely funkcionálisan kapcsolt legalább egy heterológ szabályozó elemhez. Például a Bnmlstruktúrgénen kívül bármely gént idegen génnek tekintünk, ha annak a génnek az expressziója a Bnml-gén mikrospóraspecifikus szabályozó elemének a szabályozása alatt áll.

A „rekombináns gazdaszervezet bármely prokarióta vagy eukarióta sejt lehet, amely vagy klónozó vektort, vagy expressziós vektort tartalmaz. A kifejezés magába foglalja azokat a prokarióta vagy eukarióta sejteket is, amelyeket genetikai módszerekkel manipuláltunk, hogy a gazdasejt genomjában vagy kromoszómáján a klónozott gén(eke)t tartalmazzák .

A „transzgenikus növény olyan növény, amelynek egy vagy több növényi sejtjében expressziós vektor található.

Eukariótákban az RNS-polimeráz II katalizálja a struktúrgén átírását mRNS-be. Megszerkeszthető egy olyan DNS-molekula, amely egy RNS-polimeráz II templátot tartalmaz, amelyikről az átírt RNS-szekvencia komplementer lesz egy adott mRNS-sel. Az így kapott átírt RNS-t- „antiszensz RNS-nek nevezzük és a DNS-szekvenciát, amely az antiszensz RNS-t kódolja, „antiszensz gén-nek nevezzük. Az antiszensz RNS-molekulák képesek arra, hogy kötődjenek mRNSmolekulákhoz és így a mRNS transzlációját gátolják.

A „ribozim olyan RNS-molekula, amelyik katalitikus centrumot tartalmaz. A kifejezés magába foglalja az RNSenzimeket, ön-splicing RNS-eket, és az önmagukat hasító RNS-eket. A ribozimet kódoló DNS-molekulát „ribozim génnek nevezzük.

A „külső irányító szekvencia olyan RNS-molekula, amely az RNáz P-t - egy endogén ribozimet - egy adott intracelluláris mRNS-fajtához irányítja, és így annak a bizonyos mRNS-nek RNáz P hasítását teszi lehetővé. A külső irányító szekvenciát kódoló DNS-szekvenciát „külső irányító szekvencia gén-nek nevezzük.

Két nukleinsav molekuláról akkor állíthatjuk, hogy „jelentős szekvencia hasonlóság-gal rendelkeznek, ha nukleotid szekvenciáik legalább 65 százalékban hasonlóak. Szekvencia hasonlóság vizsgálatokat végrehajthatunk például a FASTA program felhasználásával (Genetics Computer Group, Madison, WI). Hasonló módon végrehajthatunk szekvencia hasonlóság vizsgálatokat a BLASTP program használatával is (Experimental GENIFO® BLAST NetWork Service) [ld. Altschul és mtsai.: J. Mól. Bioi. 215 403 (1990)]. Lásd még

Pasternak és mtsai.: „Sequence Simiiarity Searches,

Multipie Sequence Alignments and Molecuiar Tree Building, Methods in Plánt Molecuiar Biology and Biotechnology, (szerk. Glick és mtsai.) 251-267 CRC Press, (1993).

Mikrospóra-specifikus gének a technika állása szerint ismertek. Lásd például: [Wing és mtsai.: Plánt. Molec.

Bioi. 14 17 (1989), Albani és mtsai.: Plánt. Molec. Bioi.

605 (1990), Guerrero és mtsai.: Mól. Gén. Génét. 224 161 (1990), Twell és mtsai.: Development 109 705 (1990), van

Tunen és mtsai.: The Plánt Cell 2 393 (1990), Albani és mtsai.: Plánt. Molec. Bioi. 16 501 (1991), Twell és mtsai.:

Genes & Development 5 496 (1991)', Albani és mtsai.: The

Plánt Journal 2 331 (1992)]. A Mascarenhas által ismerte14 tett elképzelés szerint [Mascarenhas: Ann. Rév. Plánt Physiol. Plánt Mól. Bioi. 41 317 (1990)] a mikrospóragenezis során expresszált gének „korai és „késői gének csoportjára oszthatók. A korai gének transzkriptumai először nem sokkal a meiózis után mutathatóak ki, és az érett pollenben csökkentett mennyiségben, vagy egyáltalán nem mutathatók ki. Ezzel szemben a késői gének expressziója a mikrospóra mitózissal közel egyidőben kezdődik és folyamatosan tart, ahogy a pollen érése folyik. Hozzátehetjük, hogy a mikrospóra-genezis során expresszálódó egyes gének nem oszthatók be se a korai, se a késői gén csoportba.

Mascarenhas osztályozási rendszere szerint a leírásban szereplő Bnml-gén a korai gének csoportjába tartozik. Ennek következtében a Bnml-gén szabályozó eleme funkcionálisan különbözik a késői gének, - mint például a kukorica Zml3génje [Guerrero és mtsai., 1. fentebb], a dohány NTP303génje [Weterings és mtsai.: Plánt Mól. Bioi. 18 1101 (1992)], a paradicsom LAT51-génje [McCormick: Trends Génét. 7 298 (1991)], a petúnia chalcone flavonon-izomeráz gén [chiA P_A2 promóter; van Tunen és mtsai.: The Plánt Cell 2 393 (1990)] és a Brassica campestris Bcpl gén [Theerakulpisut és mtsai.: The Plánt Cell 3 1073 (1991)] szabályozó elemétől.

A korai gének csoportján belül további müködésbeli különbségeket is találunk, ha összehasonlítjuk a mRNSszintézis megoszlását. A LAT52 gén például az endospermiumban expresszálódik, a' LAT59 endospermiumban és a gyökerekben expresszálódik, míg a LAT56 expressziója a • ·· · ··

- 15 gyökerekben történik [Twell és mtsai.: Mól. Gén. Génét. 217 240 (1989); Wing és mtsai.: 1. fentebb; McCormick: The Plánt Cell 5 1265 (1993)]. Ezzel ellentétben a Bnml-gén nem kerül expresszióra sem a gyökerekben, sem a fejlődő magokban (lásd még a 2. példát). Továbbá, Northern-blot analízis tanúsítja, hogy a Bnml-gén expressziós szintje magasabb, mint a Brassica napus Bp4-, Bpl9- és BplO-gének expressziós szintjei [Albani és mtsai.: (1990, 1991, 1992), 1. fentebb] . Lásd még a 2. példát is. Ez a megfigyelés arra utal, hogy a Bnml-promóter erősebb, mint a Bp4-, Bpl9- és BplOgének promóterei.

Hozzátehetjük még, hogy a korai gén szabályozó elemek müködésbeli variációit feltárhatjuk transzformálási tanulmányok segítségével. A Brassica oleracea SLG₃₃ gén pollenspecifikus szabályozó eleme például a transzgenikus növények pollenjében elsődlegesen a kétmagvú fejlődési állapotban indukál génexpressziót [Thorsness és mtsai.: Develop. Bioi. 143 173 (1991); Dzelzkalns és mtsai.: The Plánt Cell 5 855 (1993)] . Ehhez járul még az is, hogy az- SLG₁₃ szabályozó elem nem indukál génexpressziót transzgenikus növények tapetumában [Thorsness és mtsai.: 1. fentebb]. Ezzel szemben a Bnml-szabályozó elem az egymagvú fejlődési állapot kezdetétől indukálja a génexpressziót transzgenikus növények mikrospóráiban, éppúgy mint a tapetum eredetű sejtekben (ld. az 5. példát).

így tehát a Bnml-gén funkcionális alapon megkülönböztethető más ismert korai génektől.

A funkcionális különbségen túl, számos adatbázist vé• ·

- 16 gigvizsgáltunk a nukleotid szekvenciák összehasonlítására, de nem találtunk a 3. ábrán feltüntetett Bnml mikrospóraspecifikus szabályozó elem nukleotid szekvenciával (8. azonosítási szám szerinti szekvencia) azonos vagy hasonló szekvenciát. Az azonos vagy hasonló szekvenciák hiánya megmagyarázza azt a tényt, hogy eddig még nem volt lehetséges általánosan elfogadott elveket vagy szerkezeti kritériumokat kidolgozni a mikrospóra-specifitást közvetítő DNSszekvenciák felismerésére. Ez közelebbről igaz a Brassica fajok mikrospóra-specifikus génjeinek szabályozó elemeire. Ennek következtében Brassica mikrospóra-specifikus szabályozó elem izolálása genomi eredetű klóntárból nem hajtható végre úgy, hogy mikrospóra-specifikus génexpressziót közvetítő konszenzus szekvenciára szkrínelünk.

Ebből adódik, hogy a találmány szerinti új mikrospóraspecifikus szabályozó elemet úgy nyertük, hogy először mikrospóra-specifikus géneket kódoló cDNS-moiekulákat izoláltunk, majd a cDNS-molekulákat próbaként használva egy alkalmas genomi eredetű klóntárból azonosítottuk a megfelelő géneket.

Szabályozó elem izolálása mikrospóra-specifikus génből

A. Mikrospóra-specifikus géneket kódoló cDNS-molekulák izolálása.

A mikrospóra-specifikus géneket tartalmazó cDNS-klóntár előállításának első lépéseként teljes RNS-t izoláltunk mikrospórákból. Előnyösen az RNS-t a késői egymagvú - korai kétmagvú mikrospórákból izoláltuk, amelyeket az ·♦ ·»»· • · *·* · • « ♦ · embriogenezis indukálására négy napon át tenyésztettük. Legelőnyösebb módon az ilyen mikrospórákat Brassica napusból nyerjük.

A teljes RNS izolálása mikrospórákból megoldható a technika állása szerint ismert módszerekkel. Általánosságban az RNS-izolálási technikák részei: egy eljárás a növényi sejtek feltárására, egy módszer az RNS RNáz irányított lebomlásának megakadályozására, és egy eljárás az RNS elválasztására a szennyező DNS-től, fehérjétől és poliszaharidoktól. Teljes RNS izolálható például mikrospórákból a következő módon: folyékony nitrogénben lefagyasztjuk a növényi szövetet, a mikrospórák elroncsolására a fagyasztott szövetet mozsárban, mozsártörővei porítjuk, a megőrült szövetet fenol/kloroform oldattal extraháljuk a fehérjék eltávolítására, és az RNS-t lítiumkloridos szelektív kicsapással elválasztjuk a visszamaradó szennyezőktől. Lásd például Ausubel és mtsai. (szerk.): Current Protocols in Molecular Biology 4.3.1-4.3.4 Wiley Interscience, (1990), [következőkben: „Ausubel.], úgyszintén [Sharrock és mtsai.: Genes and Development 3. 1745 (1989)] .

Egy másik eljárás szerint teljes RNS úgy is izolálható mikrospórákból, hogy a megőrölt növényi szövetet guanidínium-izotiocianáttal extraháljuk, majd szerves oldószerekkel extraháljuk, és az RNS-t a szennyezőktől differenciál centrifugálással választjuk el. Lásd például

Strommer és mtsai.: „Isolation and Characterization of

Plánt mRNA, megjelent: Methods in Plánt Molecular Biology ·*· tv·

- 18 and Biotechnology, (szerk. Glick és mtsai.) 49-65 CRC

Press, (1993) .

Ahhoz, hogy meg tudjuk szerkeszteni a cDNS-klóntárat, a teljes RNS-preparátumból izolálni kell a poli(A)⁺ RNS-t. Az oligo(dT)-cellulóz kromatográfia sztenderd módszerével poli (A)⁺ RNS izolálható a teljes RNS-ből, lásd például

Strommer és mtsai., fentebb említve.

Kettős-szálú cDNS-molekulák szintetizálhatok poli(A)⁺

RNS-ről a technika állása szerint ismert módszerek alkalmazásával. Lásd pl. Ausubel, 5.5.2-5.6.8 old. Másrészről, kettős-szálú DNS szintetizálható a kereskedelemben kapható reagens-készletek felhasználásával is. Ilyen reagenskészletek beszerezhetőek például az alábbi cégektől: GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD) ; Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) ; Promega Corporation (Madison, WI) ; és Stratagene® Cloning Systems (La Jolla, CA).

A mikrospóra cDNS-klóntár megszerkesztéséhez különböző klónozó vektorokat használhatunk fel. cDNS-klóntár készíthető például egy bakteriofág eredetű vektorban,, mint például a ÁgtlO vektorban. Huynh és mtsai.: „Constructing and Screening cDNA Libraries in XgtlO and Xgtll, megjelent: DNA Cloning: A Practical Approach I., Glover (szerk.) 4978, IRL Press, (1985).

Úgy is eljárhatunk, hogy kettős szálú DNS-molekulákat illesztünk plazmid vektorba, mint például a pBlueScript® vektorba (Stratagene® Cloning Systems; La Jolla, CA) , vagy a LambdaGEM®-4 vektorba (Promega Corp.) vagy más kereskedelemben hozzáférhető vektorba. Megfelelő klónozó vektorok r

- 19 beszerezhetőek még az Amerikai típuskultúra gyűjteményből (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD) is. A klónozott cDNS-molekulák amplifikálása érdekében a cDNS-klóntárat sztenderd módszerek alkalmazásával prokarióta gazdaszervezetbe juttatjuk. A mikrospóra cDNSklóntár például kompetens DH5 E. coli sejtekbe juttatható, amely beszerezhető a következő forrásból: GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD).

A cDNS-klóntárból a mikrospóra-specifikus géneket kódoló cDNS-klónokat differenciál szkrínelés segítségével izolálhatjuk. Egyláncú cDNS-próbák szintetizálhatóak például radioaktív nukleotidok jelenlétében, olyan mikrospórákból izolált poli(A)⁺ RNS alkalmazásával, amelyet vagy az embriogenezis indukálása érdekében kezelt mikrospórákból („Mi-RNS) izolálunk, vagy olyan mikrospórákból nyerünk, amelyeket az embriogenezis megakadályozása érdekében kezelünk („Mx-RNS). Azokat a cDNS-klónokat, amelyek az Mi-RNSről szintetizált cDNS-próbákkal hibridizálnak, de nem hibridizálnak az Mx-cDNS-próbákkal, izoláljuk a további analízis céljára. A differenciál szkrínelés technika a technika állása szerint kellőképpen ismert módszer. Lásd például: Sargent: „Isolation of Differentially Expressed Genes megjelent: Guide to Molecular Cloning Techniques, Berger és mtsai. (szerk.) 423-432, Academic Press, (1987); [Tedder és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 208 (1988)]. Ennek a technikának az alkalmazását az 1. példa mutatja be.

A mikrospóra-specifikus cDNS-klónok előállításának alapmódszere módosítható, amennyiben megszerkeszthető egy olyan cDNS-klóntár-származék, amelyben a mikrospóraspecifikus cDNS-klónok nagyobb számban fordulnak elő [Hedrick és mtsai.: Natúré 308 149 (1984)]. Például kettősszálú, EcoRI végekkel rendelkező cDNS-t készítünk Mi-RNSből kiindulva, és ezt kisméretű, tompa végekkel rendelkező, Mx-RNS-ből készített cDNS-fragmensek ötvenszeres feleslegével keverjük össze. A cDNS keveréket felmelegítjük, hogy a kettős-szálú cDNS „megolvadjon (szétváljon), az egyszálú cDNS-molekulákat hibridizálni hagyjuk és a kettős-szálú cDNS-molekulákat klónozó vektor EcoRI helyére beillesztjük. A leírt körülmények között nagy valószínűséggel csak azok az Mi-cDNS molekulák regenerálódnak mindkét végükön EcoRI helyeket tartalmazó kettős-szálú fragmenssé, amely cDNSmolekulák az Mx-cDNS-ben nem rendelkeznek komplementer fragmenssel. Ld. Ausubel, 5.8.9-5.8.15 old.

A cDNS-klónok számos technika alkalmazásával analizálhatóak, mint például Northern-blot analízis, Southern-blot analízis, restrikciós géntérképezés és szekvencia analízis, ahogy ezeket az 1.-3. példákban bemutatjuk.

B. Mikrospóra-specifikus gének izolálása genomi eredetű klóntárból

A leírás szerinti eljárások felhasználhatóak olyan cDNS-klónok izolálására, amelyek mikrospóra eredetű szövetben expresszálódó fehérjéket kódolnak. Mikrospóraspecifikus cDNS-klónok - mint például a Bnml cDNS-klón - az alább részletezett általános megközelítés alapján felhasználhatók antiszensz konstrukciókban a mikrospóra funkciók

Ζ gátlására. Továbbá, az ilyen cDNS-klónok próbákként is alkalmazhatóak a megfelelő gének izolálására genomi eredetű klóntárból.

A technika állása szerint ismert módszerek alkalmazásával egy növényi genomi eredetű klóntár elkészíthető. Lásd például: Slighton és mtsai.: „Construction of λ Clone

Banks megjelent: Methods in Plánt Molecular Biology and Biotechnology, (szerk. Glick és mtsai.) 121-146 CRC Press, (1993). Növényi eredetű genomi DNS egy előnyös forrása a Brassica napus eredetű DNS. Genomi eredetű DNS izolálható például Brassica napus-ból származó szövetből a növényi szövet roncsolásával Sarkosyl felületaktív anyag segítségével, a lizátum proteináz K-val történő emésztésével, majd az oldhatatlan törmelék eltávolítására centrifugálást alkalmazunk, a tiszta lizátumból a nukleinsavat izopropanol alkalmazásával kicsapjuk, és a felszuszpendált DNS-t cézium-klorid sűrűség-gradiensen tisztítjuk [ld. Ausubel 2.3.12.3.3 old.].

Genomi eredetű klóntár · készítésére alkalmas DNSfragmenseket kaphatunk a genomi eredetű DNS véletlenszerű vágásával, vagy a genomi DNS részleges emésztésével, restrikciós endonukleázokat alkalmazva [ld. például Ausubel 5.3.2-5.4.4 old. és Slightom és mtsai.: ld. fentebb].

Genomi DNS-fragmensek beilleszthetőek vektorba, például egy bakteriofág vagy kozmid vektorba, a technika állása szerint ismert hagyományos eljárásokat használva, mint például restrikciós enzimes emésztést alkalmazva a megfelelő végek kialakítására, alkalikus foszfatáz kezelést alkalmaz22 va a DNS-molekulák nem kívánatos kapcsolódásának megelőzésére, és a megfelelő ligázok felhasználásával történő ligálást alkalmazva. Az ilyen manipulációkban felhasználható technikákat megtalálhatjuk Slightom publikációjában [Slightom és mtsai.: 1. fentebb] és jól ismertek a technika állása szerint. Lásd még Ausubel 3.0.5-3.17.5 old.

Úgy is eljárhatunk, hogy a növényi eredetű genomi klóntárakat a kereskedelmi forgalomban szerezzük be, mint például Clontech Laboratories Inc, (Palo Alto, CA) vagy Stratagene® Cloning Systems (La Jolla, CA).

A genomi kiónokat tartalmazó klóntárat egy vagy több mikrospóra-specifikus cDNS-klónnal szkríneljük sztenderd technikákat alkalmazva [ld például Ausubel 66.0.3-6.6.1 old.; Slightom és mtsai.: 1. fentebb; Raleigh és mtsai.: Genetics 122 279 (1989)]. A 4. példa leírja azt az eljárást, amelyet a Brassica napus genomi eredetű klóntár szkrínelésénél felhasználtunk.

C. Mikrospóra-specifikus szabályozó elem azonosítása.

A genomi eredetű kiónokat számos különböző módszer segítségével analizálhatjuk, mint például restrikciós analízis, Southern-blot analízis, primer extenziós analízis és DNS-szekvencia analízis. A primer extenziós analízis - vagy SÍ nukleáz védéses analízis - például felhasználható a klónozott gén transzkripciója vélelmezett starthelyének azonosítására. Ld. például Ausubel 4.8.1-4.8.5 old.; Walmsley és mtsai.: Quantitative and Qualitative Analysis of Exogenous Gene Expressíon by the SÍ Nuclease Protection

Assay megjelent: Methods in Molecular Biology VII. Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (szerk.) 271-281 Humana Press Inc., (1991). A 4. példa leírja az alkalmazott Southern-blot analízist, restrikciós térképezést és a szekvencia analízist, amit a Bnml-gén jellemzésénél alkalmaztunk .

A szerkezet analízise önmagában nem vezethet a klónozott Bnml-génhez tartozó mikrospóra-specifikus szabályozó elem azonosítására, mert nem ismert még a model a Brassica napus mikrospóra-specifikus szabályozó szekvenciákra. Ily módon a szabályozó elem azonosítására kizárólag a funkcionális analízis alkalmazható.

Az ilyen funkcionális analízis általános megközelítési módja szerint a genomi eredetű klón fragmenseit egy, reporter gént tartalmazó expressziós vektorba szubklónozzuk, az expressziós vektort különböző növényi szövetekbe juttatjuk, és a szöveteket megvizsgáljuk, hogy hol történik reporter gén átmeneti expresszió. A mikrospóra-specifikus szabályózó elem jelenléte a genomi eredetű szubklónban igazoltnak tekinthető, ha a reporter gén expressziója megfigyelhető mikrospóra szövetben, ellenben, a reporter gén expressziója nem jön létre nemmikrospóra eredetű szövetekben, mint például bibe vagy csészelevél szövetben.

A technika állása szerint jól ismertek azok a módszerek, amelyekkel genomi eredetű kiónból fragmensek nyerhetőek. Előnyösen, enzimes emésztést alkalmazunk, hogy a genomi eredetű DNS-fragmensek egymáshoz illeszkedő delécióit • ·

- 24 (nested deletion) kapjuk. Lásd például: Ausubel 7.2.17.2.20 old.; An és mtsai.: „Techniques fór Isolating and Characterizing Transcription Promoters, Enhancers, and Terminators megjelent: Methods in Plánt Molecular Biology and Biotechnology, (szerk. Glick és mtsai.) 155-166 CRC

Press, (1993) .

Például, annak lehetősége, hogy a szabályozó elem „upstream azaz az 5'-irányban helyezkedik el a transzkripciós starthelytől számítva, bizonyítható azzal, hogy az 5'irányban elhelyezkedő régiót is tartalmazó DNS-fragmenst szubklónozzuk, a DNS-fragmenst akár az 5'-3'-irányban, akár a 3'-5'-irányban emésztjük, úgy, hogy egymáshoz illeszkedő deléciókat kapjunk, és az így kapott kis fragmenseket expressziós vektorokba klónozzuk, hogy velük átmeneti expressziót váltsunk ki.

A megfelelő expressziós vektor kiválasztása attól a módszertől függ, amelyikkel az expressziós vektort a gazdasejtekbe be akarjuk juttatni. Egy expressziós vektor rendszerint a következőket tartalmazza: (1), prokarióta DNSelemek, amelyek a bakteriális replikációs kezdőpontot és egy antibiotikum-rezisztencia markert kódolnak, a bakteriális gazdasejtben az expressziós vektor szaporodásának és szelekciójának biztosítására; (2), eukarióta eredetű DNSelemek, amelyek a transzkripció indítását szabályozzák, mint például egy promóter; (3), DNS-elemek, amelyek a transzkriptum feldolgozását szabályozzák, mint például a transzkripciós termináló/poliadenilációs szekvencia; és (4) , egy reporter gén, amely funkcionálisan kapcsolódik a •t

DNS-elemekhez, amelyek a transzkripció indítását szabályozzák. Alkalmazható reporter gének a következők lehetnek: βglükuronidáz, β-galaktozidáz, klóramfenikol-acetiltranszferáz, luciferáz, és más hasonlók. Előnyösen a reporter gén vagy a β-glükuronidáz gén (GUS), vagy a luciferáz gén. A növényi expressziós vektorok és reporter gének általános leírása megtalálható: Gruber és mtsai.: „Vectors fór Plánt Transformation megjelent: Methods in Plánt Molecular Biology and Biotechnology, (szerk. Glick és mtsai.) 89-119 CRC Press, (1993). Másrészről, GUSexpressziós vektorok és GUS-gén kazetták beszerezhetőek Clontech Laboratories, Inc.-tói (Palo Alto, CA) , míg luciferáz expressziós vektorok és luciferáz gén kazetták beszerezhetőek a Promega Corporation-tól (Madison, WI).

A kipróbálásra szánt genomi fragmenseket tartalmazó expressziós vektorokat bejuttathatjuk protoplasztokba, vagy eredeti szövetekbe, illetve izolált sejtekbe. Előnyösen, az expressziós vektorokat eredeti szövetekbe juttatjuk be. Növényi szövetek tenyésztésének általános módszerei megtalálhatóak például: Miki és mtsai.: „Procedures fór Introducing Foreign DNA intő Plants megjelent: Methods in Plánt Molecular Biology and Biotechnology, (szerk. Glick és mtsai.) 67-88 CRC Press, (1993).

Az expressziós vektorok növényi szövetbe történő bejuttatásának módszerei közé tartozik a növényi szövet közvetlen fertőzése, vagy együtt-tenyésztése Agrobacterium tumefacíens-szel [Horsch és mtsai.: Science 227 1229 (1985)].

Agrobacterium vektor-rendszerek és az

- 26 Agrobacterium-közvetítette gén-transzfer módszereinek leírása megtalálható: [Gruber és mtsai.: 1. fentebb; Miki és mtsai.: 1. fentebb; Moloney és mtsai.: Plánt Cell Reports _8 238 (1989)].

Úgy is eljárhatunk, hogy az expressziós vektorokat közvetlen gén-transzfer útján juttatjuk be a növényi szövetekbe, úgymint mikrolövedék-közvetített célba juttatás, DNS mikroinjekció, elektroporáció és más hasonló technikák. Lásd például: [Gruber és mtsai.: 1. fentebb; Miki és mtsai.: 1. fentebb; Klein és mtsai.: Biotechnology 10 268 (1992)]. Például expressziós vektorok bejuttathatóak a növényi szövetekbe mikrolövedék-közvetített célba juttatással, biolisztikus ( „biolistic) készülék használatával.

Transzformációs vizsgálatokat használtunk olyan DNSszekvenciák azonosítására, amelyek a génexpresszió szabályozását mikrospóra-specifikus módon végzik. Közelebbről, egy mikrospóra-specifikus szabályozó elemet találtunk, amely egy 820 bázíspár nagyságú DNS-fragmensen belül helyezkedik el, amely viszont a Bnml transzlációs starthelyétől számítva az 5'-3'-iránnyal ellentétesen helyezkedik el, közvetlenül a starthely mellett. A mikrospóra-specifikus szabályozó elem nukleotid szekvenciáját a 3. ábrán mutatjuk be (8. azonosítási szám szerinti szekvencia). Ily módon a találmány tárgyát képezi az olyan DNS-molekula, amely a 8. azonosítási szám szerinti nukleotid szekvenciával, és mikrospóra-specifikus szabályozó elem funkcióval rendelkezik .

A mikrospóra-specifikus szabályozó elem variációi lét• ·

- 27 rehozhatóak a 8. azonosítási szám szerinti nukleotid szekvencia nukleotidjainak deiéciójával, vagy nukleotidok hozzáadásával és/vagy az egyes nukleotidok cseréjével. Az ilyen variációk előállíthatóak például oligonukleotidirányított mutagenezissel, linker-szkennelő mutagenezissel, polimeráz láncreakció alkalmazásával létrehozott mutagenezissel és más hasonlókkal ld. Ausubel 8.0.3-8.5.9 old. Általánosságban lásd még: Directed Mutagenesis: A Practical Approach, McPherson (szerk.), IRL Press, (1991). Ily módon a találmány tárgyát képezik az olyan DNSmolekulák, amelyek a 8. azonosítási szám szerinti nukleotid szekvenciával lényeges szekvencia hasonlóságot mutató nukleotid szekvenciával rendelkeznek, és mikrospóraspecifikus promóterként működnek.

Másfelől, végrehajthatunk deléciós analízist, hogy pontosabban beazonosíthassunk egy vagy több mikrospóraspecifikus szabályozó elemet a 820 bázispár nagyságú mikrospóra-specifikus szabályozó elemen belül. Ily módon a találmány tárgyát képezik még a 8. azonosítási .szám szerinti nukleotid szekvencia „funkcionális fragmensei, amelyek mikrospóra-specifikus szabályozó elemként alkalmazhatóak.

Mikrospóra-specifikus szabályozó elem alkalmazása a pollen termelés szabályozására

A. Hímsteril növények előállítása.

A találmány tárgyát képezi az az eljárás, amely szerint eljárva mikrospóra-specifikus szabályozó elemet alkalmazunk a pollen termelés szabályozására. Közelebbről, a találmány tárgyát képezi az az eljárás, amely szerint eljárva hímsteril növényeket állítunk elő úgy, hogy Bnml szabályozó szekvenciát alkalmazunk egy idegen gén expressziójának serkentésére mikrospórákban. A Bnml mikrospóra-specifikus szabályozó elem a génexpressziót a kétmagvú állapotot közvetlenül megelőzően kezdve, és a három-magvú állapoton keresztül végig, indukálja a mikrospóra fejlődés során. Az expresszió adott szövetre és fejlődési állapotra korlátozott, ezért a Bnml szabályozó elem alkalmazása a hímsterilitás létrehozására előzetesen is kivédi a hatósági engedélyezési aggályokat, amelyek idegen gének termékeinek különböző más szövetekben - beleértve a növények ehető részeit is - felszaporodására vonatkoznak.

A hímsterilitás kiváltásának egy általános megközelítése az az eljárás, amikor olyan expressziós vektort szerkesztünk, amelyben a mikrospóra-specifikus szabályozó elem funkcionálisan kapcsolódik egy olyan nukleotid szekvenciához, amely a mikrospóra funkció gátlására alkalmas fehérjét kódol. A mikrospóra funkció gátlására alkalmas .fehérjék magukba foglalnak olyan fehérjéket, amelyek gátolják a sejtmüködés szempontjából létfontosságú makromolekulák szintézisét, olyan enzimeket, amelyek lebontják a sejtműködés szempontjából létfontosságú makromolekulákat, olyan fehérjéket, amelyek megváltoztatják a metabolizmusát vagy bioszintézisét a növényi hormonoknak, és olyan fehérjéket, amelyek a mikrospórák speciális funkcióját gátolják.

Megszerkeszthető például egy expressziós vektor, amelyben a mikrospóra-specifikus szabályozó elem funkcionálisan

- 29 kapcsolódik olyan nukleotid szekvenciához, amely protein szintézis inhibitort kódol. A diftéria toxin például egy jól ismert protein szintézis inhibitor eukariótákban. Diftéria toxin gént kódoló DNS-molekulák beszerezhetőek az amerikai típuskultúra gyűjteményből ATCC No. 39359 vagy ATCC No. 67011 azonosító számon (American Type Culture Collection, Rockville, MD). A kitanítás részeként az alkörmös (pokeweed) antivirális fehérje egy másik, alkalmazható protein szintézis inhibitor.

Úgy is eljárhatunk a mikrospóra funkció gátlása érdekében, hogy a biológiailag fontos makromolekulák lebontására képes enzimeket kódoló DNS-szekvenciákat alkalmazunk. Például Mariani és mtsai. [Mariani és mtsai.: Natúré 347 737 (1990)] kimutatták, hogy akár az Aspergillus oryzae RNázTl, akár a Bacillus amylolíguefaciens „barnáz-nak nevezett RNáza, a tapetumban expresszálva, a tapetum eredetű sejteket tönkreteszi és így hím-terméketlenséget okoz. Ily módon a mikrospóra funkció gátolható olyan expressziós vektor alkalmazásával, amely mikrospóra-specifikus szabályozó elemet tartalmaz, ami funkcionálisan kapcsolt a barnáz génhez. Más, számba jöhető enzimek között említjük a DNázokat, proteázokat és lipázokat.

Az ilyen, mikrospóra-gátló enzimeket kódoló gének előállíthatóak kémiai szintézissel, az irodalomban ismertetett nukleotid szekvenciák alapján. RNáz-Tl és barnáz gének például szintetikusan előállíthatóak, kölcsönösen primerként használt hosszú oligonukleotidok alkalmazásával. Lásd például Ausubel 8.2.8-8.2.13 old. Lásd még: [Wosnick és mtsai.: Gene 60 115 (1987)]. Továbbá, rendelkezésünkre állnak olyan technikák, amelyek a polimeráz láncreakció alkalmazásával lehetővé teszik 1,8 kilobázis nagyságú gének szintézisét is. Az RNáz-Tl kémiai szintézise megtalálható az alábbi publikációkban: [Adang és mtsai.: Plánt Molec.

Bioi. 21 1131 (1993); Bambot és mtsai.: PCR Methods and

Applications 2 266 (1993); Quaas és mtsai.: Eur. J. Biochem. 173 617 (1988)], míg a barnáz gén nukleotid szekvenciáját Hartley írta le [Hartley: J. Molec. Bioi. 202 913 (1988)].

Másféle megközelítés szerint eljárva a pollen funkció gátlását a növényi hormonok, úgymint auxinok és gibberellinek metabolizmusának megváltoztatásával lehet létrehozni. Például az Agrobacterium rhizogenes rolB-génje egy enzimet kódol, amely beleavatkozik az auxin metabolizmusba a szabad indolok indoxil-p-glükozidokból történő felszabadulásának kataiizálásával [Estruch és mtsai.: EMBO J. 11 3125 (1991)]. Spena közölte [Spena és mtsai.: Theor. Appl. Génét. 84 520 (1992)]·, hogy a rolB-gén portokspecifikus expressziója dohányban olyan növényeket eredményezett, amelyekben az indol-3-ecetsav szintje megemelkedett, a gibberellin aktivitás lecsökkent, és a portokok összezsugorodtak, amelyekben a pollen termelés jelentősen lecsökkent. Mivel a rolB-gén expressziója mikrospórákban várhatóan emeli az indol-3-ecetsav szintjét a portok szövetében, a rolB-gén egy újabb például szolgál olyan génekre, amelyek a pollen termelés szabályozására alkalmazhatóak. Slightom közli a rolB-gén nukleotid szekvenciáját [Slightom

- 31 és mtsai.: J. Bioi. Chem. 261 108 (1985)].

Annak érdekében, hogy expresszáljunk egy, a mikrospóra funkció gátlását létrehozó fehérjét, olyan expressziós vektort szerkesztünk, amelyben a fehérjét kódoló DNSszekvencia funkcionálisan kapcsolt olyan DNSszekvenciákhoz, amelyek a gén transzkripció szabályozását mikrospóra-specifikusan végzik. Az expressziós vektorral szemben támasztott általános követelmények az átmeneti expressziós rendszerrel kapcsolatosan a leírásban már szerepeltek. Itt azonban a cél az, hogy az expressziós vektort növényi embrionális szövetbe juttassuk, oly módon, hogy az idegen fehérje a felnőtt növény mikrospóráiban, egy későbbi fejlődési fázisban kerüljön expresszióra. A mitotikus stabilitás epikromoszómális replikációt biztosító növényi vírusvektorok alkalmazásával érhető el.

A mitotikus stabilitás elérésének egy másik és előnyös módja az expressziós szekvenciák beépítése a gazdaszervezet kromoszómájába. Ilyen mitotikus stabilitás biztosítható az

5. példában leírt, Agrobacterium-közvetített transzformációs technikával.

Idegen gén transzkripciója szabályozható egy mikrospóra-specifikus gén promóterével, vagy egy vírus eredetű promóterrel, mint például a karfiol mozaíkvírus (CaMV) promóterrel, a fügenövény mozaikvírus promóterrel és más hasonlóval [Gruber és mtsai.: 1. fentebb]. Előnyösen a promóter egy mikrospóra-specifikus gén promótere vagy a CaMV35S-core-promótere. Előnyösebben a promóter egy mikrospóra-specifikus gén promótere, közelebbről a Bnml• ·

- 32 promóter.

Úgy is eljárhatunk, hogy az idegen gén transzkripcióját egy portok-specifikus gén promóterével szabályozzuk. Ezen a módon a sejtfunkciót gátló idegen gén mikrospórákban és portok sejtekben expresszálható. Portok-specifikus gének és promóterek a technika állása szerint ismertek [lásd például McCormick és mtsai.: „Anther-specific Genes: Molecular

Characterization and Promoter Analysis in Transgenic Plants megjelent: Plánt Reproduction: From Flórái

Induction to Pollination, Lord és mtsai. (szerk.) 128-135 (1989); Scott és mtsai.: Nemzetközi szabadalmi bejelentés, közzétételi szám: WO 92/11379 (1992); van dér Meer és mtsai.: The Plánt Cell 4 253 (1992)]. A leírás szerinti módszerek felhasználhatóak publikált nukleotid szekvenciával rendelkező portok-specifikus promóter kémiai szintézisére .

A transzformált sejtek szelektálása érdekében az expressziós vektor szelekcióra alkalmas marker gént tartalmaz, mint például herbicid-rezisztencia gént, vagy antibiotikum-rezisztencia gént. Ilyen gének például rezisztenciát biztosíthatnak foszfinotricin, glifozát, szulfonilureák, atrazin, imidazolinon ellen, vagy olyan aminoglikozid antibiotikumok ellen, mint neomicin, kanamicin és G418 (genticin). Előnyösen a szelektálható marker gén a neomicin-foszfotranszferáz gén (nptll-gén).

Az expressziós vektor a mikrospóra-specifikus szabályozó elem szabályozása alá tartozó idegen fehérjét kódoló cDNS-szekvenciákat is tartalmazhat, éppúgy, mint egy kons• ·

- 33 titutív promóter szabályozása alá eső, szelektálható marker gént. Úgy is eljárhatunk, hogy a szelektálható marker gént külön szelekciós expressziós vektor segítségével juttatjuk be a gazdasejtekbe, a mindkét vektorral együttesen történő transzformálás útján.

Másik megközelítés szerint a hímsterilitás kiváltható olyan expressziós vektor alkalmazásával is, amelyben a mikrospóra-specifikus szabályozó elem funkcionálisan kapcsolt egy antiszensz RNS-t kódoló nukleotid szekvenciához. Az antiszensz RNS-molekulák kapcsolódása a megcélzott mRNSmolekulákhoz a transzláció hibridizációs leállításával jár [Paterson és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 4370 (1987)]. Ily módon az alkalmas antiszensz RNS-molekula komplementer szekvenciával rendelkezne avval a mRNSfajtával, amelyik egy sejtfunkcióhoz szükséges fehérjét kódol.

Antiszensz RNS-molekulák például alkalmazhatóak aktint, tubulint, ubiquitint, ubiquitin-konjugáló enzimet, ubiquitin-hordozó fehérjét vagy elongációs faktort kódoló mRNS-ek transzlációjának gátlására. Az ilyen géneket kódoló DNS-molekulák sztenderd technikák segítségével izolálhatóak. Például, növényi aktin géneket ír le Shah és Baird [Shah és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 1022 (1982); Baird és mtsai.: EMBO J. _6 3223 (1987)]. Növényi tubulin génekről számol be Raha, Ludwig és Yamada [Raha és mtsai.: Plánt Mól. Bioi. 9 565 (1987); Ludwig és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 5833 (1987); Yamada és mtsai.: Plánt Physiol. 103 1467 (1993)]. Növényi ubiquitin géneket • » • · izolált Gausing és Xia [Gausing és mtsai.: Eur. J. Biochem. 158 57 (1986); Xia és mtsai.: Plánt Physiol. 104 805 (1994)]. Pramanik [Pramanik és mtsai.: Plánt Physiol. 102 1049 (1993)] számolt be a lucerna ubiquitin-hordozó fehérje klónozásáról és Picton [Picton és mtsai.: Plánt Physiol.

103 1471 (1993)] paradicsom eredetű ubiquitin-konjugáló enzimet izolált. Az árpa eredetű elongációs faktor gén klónozását Sutton írta le [Sutton és mtsai.: Plánt Physiol.

104 807 (1994)]. A publikált nukleotid szekvenciák alapján további, a találmány szerinti eljárásokban alkalmazható géneket kódoló DNS-molekulák szintetizálhatóak a leirás szerint .

Ugyanakkor antiszensz RNS-molekulák olyan mRNS-ekhez is irányíthatóak, amelyek a pollen fejlődés számára létfontosságú fehérjéket kódolnak. A chalcone-szintáz (CHS) például a flavonoidok bioszintézisének a kezdőlépését katalizálja, és a CHS aktivitás hiányát teszik felelőssé az abnormális pollen funkcióért és/vagy kifejlődésért [Coe és mtsai.: J. Hered. 72 318 (1981); Taylor és mtsai.: J. Hered. 83 11 (1992); van dér Meer és mtsai.: The Plánt Cell 4 253 (1992)]. Jelentőségteljes, hogy a flavonoid hiányos pollen nem funkcióképes önmegtermékenyítés esetében [Taylor és mtsai.: 1. fentebb]. Ezért tehát a hímsterilitás előidézhető a flavonoid bioszintézis gátlásával, egy olyan expressziós vektor alkalmazásával, amely a chalcone-szintáz A-génjének 3', lefordításra nem kerülő régiója ellen termel antiszensz RNS-t [van dér Meer és mtsai.: 1. fentebb]. Koes és mtsai írták le a chalcone-szintáz Ά-gén klónozását és » · ' · · · · • · · · ··· · ·»···* · * ·· ·« ·· * »

- 35 jellemzését [Koes és mtsai.: Gene 81 245 (1989); Koes és mtsai.: Plánt Molec. Bioi. 12 213 (1989)].

Úgy is eljárhatunk, hogy olyan expressziós vektor szerkesztünk, amelyben a mikrospóra-specifikus szabályozó elem funkcionálisan kapcsolt egy ribozimet kódoló nukleotid. szekvenciához. Megszerkeszthetek olyan ribozimek, amelyek egy mRNS-molekula adott célszekvenciájára irányuló endonukleáz aktivitással rendelkeznek. Steinecke és mtsai.

[Steinecke és mtsai.: EMBO J. 11 1525 (1992)] például dohány protoplasztokban ribozimekkel a neomicinfoszfotranszferáz gén expressziójának a 100 százalékot is elérő gátlását érték el. Újabban Perriman [Perriman és mtsai.: Antisense Research and Development 3 253 (1993)] dohány protoplasztokban a kloramfenikol acetil-transzferáz aktivitás gátlását érték el egy olyan vektor alkalmazásával, amely módosított „kalapácsfej (hammerhead) ribozimet expresszált. A találmányi leírás szerint a ribozimek alkalmas céltárgyként szolgáló RNS-molekulái közé értendők azok a mRNS-fajták, amelyek - a leírás szerint - a mikrospóra funkció számára létfontosságú fehérjéket kódolnak.

Egy további megközelítés szerint úgy is eljárhatunk, hogy expressziós vektorokat szerkesztünk, amelyekben a mikrospóra-specifikus szabályozó elem olyan RNStranszkriptumok termelését irányítja, amelyek a megcélzott mRNS-molekulák RNáz P segítségével történő hasítását képesek elősegíteni. Ennek a megközelítésnek megfelelően megszerkeszthető egy külső irányító szekvencia, amely az endogén ribozimet, az RNáz P-t a sejten belüli mRNS egy adott fajtájához irányítja, amelyet ezt követően a sejt eredetű ribozim hasítja [Altman és mtsai.: USA szabadalom, lajstromszám: 5,168,053; Yuan és mtsai.: Science 263 1269 (1994)]. Előnyösen, a külső irányító szekvencia 10-15 nukleotidból álló szekvenciátartalmaz, amely komplementer egy, a mikrospóra funkció szempontjából létfontosságú fehérjét kódoló mRNS-fajtával, valamint egy 3'-NCCA nukleotid szekvenciát tartalmaz, ahol N előnyösen purin. A külső irányító szekvencia transzkriptumai a megcélzott mRNS-fajtához kapcsolódnak oly módon, hogy a mRNS és a komplementer külső irányító szekvencia között bázispárosodás jön létre, elősegítve a mRNS RNáz P hasítását a bázispárosodott régió 5'végén elhelyezkedő nukleotidnál.

Úgy is eljárhatunk, hogy egy mikrospóra-specifikus szabályozó elem és egy portok-specifikus gén promóterének kombinációjával szabályozzuk az antiszensz-géneket, ribozimgéneket és külső irányító szekvenciákat.

A transzgenikus növénynek nem feltétlenül az összes mikrospórája expresszálja a sejtfunkciót gátló .idegen gént. Azonban az 5. példában bemutatjuk a bizonyítékokat arra, hogy a Bnml mikrospóra-specifikus szabályozó elem az idegen gén expresszióját a tapetum eredetű sejtekben is indukálja, amely létfontosságú a mikrospóra kialakulásához. így tehát a Bnml szabályozó szekvenciák különösen alkalmasak a teljes hímsterilitás biztosítására.

Kétségtelen, hogy további mechanizmusok is kidolgozhatóak, olyan mikrospórák funkciójának gátlására, amelyek nem expresszálnak idegen gént. Az idegen gén például kódolhat « · * ·4·

- 37 olyan fehérjét, amely egy diffundáló molekula termelését serkenti, amely molekula alkalmas az életképes mikrospórák funkcióját gátolni. A rolB-gén expresszióját követő indol3-ecetsav szint emelkedése, vagy a diftéria toxin termelés biztosíthatja ezt az eredményt.

Ezen túl, a Bnml mikrospóra-specifikus szabályozó elem funkcionálisan hozzákapcsolható más, funkcionálisan stabil makromolekulát kódoló DNS-szekvenciához, amely képes mikrospórákat, pollent vagy azok szerkezeti komponeseit (pl. sejtfal) lebontani. Ezen az úton, az egyik mikrospórában termelődött makromolekulák a mikrospóra lebontását követően bejutnak a szomszédos rekeszbe és ott más mikrospórákra vagy pollenre hatnak.

Ez a megközelítés különösen vonzó heterozigóták esetében, ahol a kifejlődő pollenszemcséknek csak az 50 százaléka expresszálja a lebontó gént. Itt hasonlóképpen, az idegen gént nem tartalmazó mikrospóráknak, vagy pollenszemcséknek a funkcióját az idegen gént expresszáló mikrospórákból vagy pollenszemcsékből felszabaduló makromolekulák működése fogja meggátolni. Mivel a Bnml szabályozó elem szövetfüggően serkenti a génexpressziót, a steril növény további szövetei normális módon fejlődhetnek.

Végül egy olyan expressziós vektor is megszerkeszthető, ahol az idegen gén expresszióját a kitanítás szerint egy Bnml szabályozó elem és egy portok-specifikus promóter szabályozza .

B. Hímtermékenység helyreállítása az FI hibridben.

A leírás szerinti eljárások alkalmazhatóak transzgenikus himsteril növények előállítására, hogy ezen az úton beltenyésztett vonalak irányított keresztezésével nagy mennyiségben FI hibrideket állítsunk elő. Ha a transzgenikus hímsteril növényeknek nem az összes ivarsejtje tartalmazza az idegen gént, amely gátolja a mikrospóra funkciót, akkor az FI hibridek egy része hím-termékeny fenotípussal fog rendelkezni. Másrészről, amennyiben az idegen gén a transzgenikus hímsteril növény összes hímivarsejtjében jelen van, az FI hibridek hímsteril fenotípussal fognak rendelkezni, mert az idegen gén által indukált sterilitás lesz a domináns. Ezenfelül az FI hibridek hímsteril fenotípussal rendelkeznek, ha az idegen gén expressziója a szomszédos sejtek károsítását eredményezi, így kívánt esetben egy hímtermékenységet helyreállító rendszert alkalmazunk, hogy biztosítsuk a hím-termékeny Fi hibridek előállítását. Az ilyen termékenység-helyreállító rendszernek különös jelentősége van, amikor a .betakarított termék a mag.

Az egyik lehetséges eljárás szerint a hímtermékenységet úgy állítjuk helyre, hogy transzgenikus hímsteril növényeket olyan transzgenikus hím-termékeny növényekkel keresztezünk, amelyek mikrospóra-specifikus szabályozó elem szabályozása alatt álló termékenység-helyreállító gént tartalmaznak. A termékenység-helyreállító gén például kódolhat olyan fehérjét, amelyik specifikusan a sejtkárosító gén termékére irányul. A kitanítás részeként idézzük Mariani » »·

699· • Λ [Mariani és mtsai.: Natúré 357 384 (1992)] munkáját, aki portok sejtekben barnáz inhibitort expresszáló - elnevezése „barstar - hím-termékeny növényeket keresztezett olyan hímsteril növényekkel, amelyek portok sejtekben barnázt expresszáltak. A „barstar nukleotid szekvenciáját Hartley közölte [Hartley: J. Mól. Bioi. 202 913 (1988)].

Úgy is eljárhatunk, hogy a termékenység-helyreállító gént alkalmazzuk arra, hogy a sejtkárosító fehérjét kódoló mRNS-ekhez irányított RNS-molekulákat állítsunk elő. Hímtermékenység helyreállítása például elérhető oly módon, hogy hím-termékeny növényekben diftéria toxin ribozimeket vagy antiszensz RNS-t expresszálunk, a diftéria toxin hatásainak semlegesítésére a hímsteril növényekben. így a hímtermékenység helyreállítható az FI hibridekben azzal, hogy olyan hím-termékeny transzgenikus növényt állítunk elő, amely egy adott fajta RNS-molekulát vagy polipeptidet szintetizál, amely a hímsteril transzgenikus növényben az expresszált adott idegen gén hatásait ellensúlyozza.

A hímtermékenység helyreállítására úgy is .eljárhatunk, hogy kémiai vegyületet alkalmazunk. A kitanítás szerint hímsterilitás indukálható oly módon, hogy a chalconeszintáz expresszióját tesszük lehetetlenné és ezzel a flavonoid bioszintézist gátoljuk. Flavonol aglikonok bevitele alkalmazható a biokémiai hiány kivédésére és a pollen funkció helyreállítására [Mo és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 1713 (1992); Vogt és mtsai.: The Plánt Cell _6 11 (1994)]. Az előnyösen alkalmazható flavonol aglikonok mint például a kampferol - a flavonoid váz C gyűrűjének • ·

- 40 kettes és hármas pozíciójú szénatomja között telítetlen kötést tartalmaznak, valamint egy szubsztituálatlan hidroxil csoportot tartalmaznak a C gyűrű hármas pozíciójában [Vogt és mtsai.: 1. fentebb],

Mikrospóra-specifikus szabályozó elem alkalmazása növényi megbetegedések gátlására

A találmány tárgyát képezi még az az eljárás is, amelylyel a kártevők okozta betegségek megakadályozhatóak. A találmány tárgyát képezi különösen az az eljárás, amely szerint eljárva expressziós vektort tartalmazó transzgenikus növényeket állítunk elő, amely expressziós vektorokban Bnml szabályozó szekvenciák serkentik vírusok és rovarok elleni védekezésre alkalmazható makromolekulák expresszióját.

A növényi vírusok körülbelül 20 százaléka adódik át egyik generációról a másikra a magok útján [Matthews: Plánt Virology 3. kiadás, Academic Press, Inc. (1991); Mink: Ann. Rév. Phytopathol. 31 375 (1993)]. A magokkal történő átvitel történhet akár a csirakezdemény közvetlen inváziója útján, vagy akár a fertőzött ivarsejteken keresztül, a csírakezdemény közvetett inváziója során. Mink szerint [Mink: 1. fentebb] legalább kilenc olyan vírus van, amelyről feltételezhető, hogy pollen útján terjed növényről-növényre, és legalább négy viroid, amelyet pollen közvetít magra és termős növényekre. így tehát a Bnml mikrospóra-specifikus szabályozó elem alkalmazható arra, hogy ezeknek a vírusoknak és viroidoknak az átvitelét gátolja.

A vírusfertőzés elleni védelem biztosításának egy meg• ·

- 41 valósítási módja szerint Bnml szabályozó elemet alkalmazunk a vírusburok-fehérje expressziójának serkentésére. A vírusburok-fehérje felhalmozódása a transzformált növényi sejtekben ellenálló képességet biztosít a vírusfertőzéssel, és/vagy a vírus okozta betegség kifejlődésével szemben. Az ellenálló képesség azzal a vírussal, vagy annak rokonvírusaival szemben lép fel, amelyből a burokfehérje-gén származik. Lásd: Beachy és mtsai.: „Vírus Resistance Through Expression of Coat Protein Genes megjelent: Biotechnology in Plánt Disease Control 3. kiadás, Chet (szerk.) 89-104

Wiley-Liss, Inc. (1993) . Transzformált növények útján került átvitelre burokfehérje-közvetített ellenálló képesség lucerna mozaikvírus ellen, uborka mozaikvírus ellen, dohány sáv-(„streak)vírus, burgonya X vírus, burgonya Y vírus, dohány karc-(„etch)vírus, dohány csörgő-(„rattle)vírus és dohány mozaikvírus ellen.

Úgy is eljárhatunk a vírus eredetű megbetegedés elleni védelemben, hogy mikrospóra-specifikus szabályozó elemhez funkcionálisan kapcsolt, emlős·eredetű 2'-5'-oligoadenilátszintetázt tartalmazó vektort alkalmazunk. Truve írja le [Truve és mtsai.: Bio/Technology 11 1048 (1993)] patkány eredetű cDNS-klónozását és nukleotid szekvenciáját, amely cDNS az emlősök interferon indukálta vírusellenes válaszának egy komponensét, 2'-5'-oligoadenilát-szintetázt kódol. Truve és mtsai. írják le azt is, hogy 2'-5'-oligoadenilátszintetázt expresszáló transzgenikus növények vírusfertőzésekkel szemben védettnek bizonyultak szabadföldi körülmények között.

·· · · · · · · ·····» ·· ·· · * «· · *

- 42 A vírusfertőzéssel szembeni védelem biztosításának harmadik megközelítésében a találmány szerinti mikrospóraspecifikus szabályozó elemet alkalmazzuk a vírus genom antiszensz RNS expressziójának irányítására. Antiszensz RNS Rezain közlése szerint [Rezain és mtsai.: Plánt Molec.

Bioi. 11 463 (1988)] alkalmazható például az uborka mozaikvírussal szembeni ellenállás átvitelére. Hasonló módon, Day közlése szerint [Day és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. 88 6721 (1991)] antiszensz RNS alkalmazható a paradicsom arany-mozaikvírussal szembeni ellenállás átvitelére is.

Egy negyedik megközelítés szerint a vírusfertőzés elleni védelem biztosítására egy mikrospóra-specifikus szabályozó elemet alkalmazunk az alkörmös antivirális fehérje (PAP) expressziójának irányítására, amely fehérje a Phytolacca americana sejtfalában található riboszóma-gátló fehérje. Lodge [Lodge és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 7089 (1993) ] kimutatta, hogy a PAP-expresszáló transzgenikus növények a növényi vírusok széles spektrumával szembeni ellenállással rendelkeznek. Lodge .és munkatársai eljárást is közölnek PAP cDNS izolálására.

Úgyszintén a találmány tárgyát képezi a Bnml szabályozó elem alkalmazása védettség biztosítására olyan rovarkártevők ellen, mint például tripsz, amelyek a Thysanoptera rendbe tartozó pollen-fogyasztó ízeltlábúak. A megközelítés szerint egy Bnml szabályozó elemet alkalmazunk az inszekticid hatású toxin gének expressziójának serkentésére. A Gram-pozitív Bacillus thüringiensis baktérium például olyan polipeptideket termel, amelyek toxikusak különböző • ·

- 43 rovarkártevőkre, de nincs hatásuk gerincesekre és hasznos rovarokra. Lásd Thompson: „Biological Control of Plánt Pests and Pathogens: Alternative Approaches megjelent: Biotechnology in Plánt Disease Control, Chet (szerk.) 275290 Wiley-Liss, Inc. (1993). Az alkalmas Bacillus thüringiensis toxinok crylA δ-endotoxinokat tartalmaznak, amelyek erősen toxikusak pikkelyesszárnyú rovarokra, és tartalmaznak crylIIA δ-endotoxinokat, amelyek erősen toxikusak fedelesszárnyú rovarokra.

Geiser publikálta [Geiser és mtsai.: Gene 48 109 (1986)] egy crylA(b) δ-endotoxin gén klónozását és nukleotid szekvenciáját. Több helyen leírásra került növények transzformálása olyan vektorokkal, amelyek crylA(b) δendotoxin gént tartalmaznak [Williams és mtsai.: Bio/Technology 10 540 (1992); [Köziéi és mtsai.: Bio/Technology 11 194 (1993); valamint Fujimoto és mtsai.: Bio/Technology 11 1151 (1993)]. Lereclus leírja [Lereclus és mtsai.: Bio/Technology 10 418 (1992)] egy olyan plazmid megszerkesztését, amely crylIIA-t és crylAc-t kódoló struktúrgéneket tartalmaz. Továbbá Adang [Adang és mtsai.: Plánt Molec. Bioi. 21 1131 (1993] írja le egy szintetikus crylIIA gén nukleotid szekvenciáját, amely gént a növényi sejtekben való optimális expressziót szem előtt tartva terveztek meg. Másrészről, δ-endotoxin géneket kódoló DNSmolekulák beszerezhetőek az Amerikai típuskultúra gyűjteményből (Rockville, MD) a következő azonosítási számok szerint: ATCC Nos 40098, 67136, 31995 és 31998.

Például szolgál az európai kukorica-fúró - Ostrinia nubilalis - amely fő kukorica-kártevő Észak-Amerikában és Európában. Kikelés után a legtöbb másod-ivadék frissen kikelt kukorica-fúró lárva a levélhónaljakban összegyűlt pollennel, és a burok és gyökérnyak szöveteivel táplálkozik. Ahogy a lárva elkezdi a gyökérnyakon belüli táplálkozást, védetté válik a kémiai peszticidek hatásától. Köziéi kimutatta [Köziéi és mtsai.: 1. fentebb], hogy a crylA(b) gént expresszáló transzgenikus kukoricanövények ellenállók voltak a kukorica-fúró ismételt erős fertőzésével szemben.

A következő listán soroljuk fel azokat a további inszekticid hatású toxinokat, amelyek alkalmasak mikrospóra-specifikus expresszálásra.

(1) Vitaminkötő fehérje, mint például avidin. Lásd az 07/911,864 azonosító számú USA szabadalmi bejelentést, amely kitanítást ad avidin és avidin homológok, mint rovarkártevők elleni lárvicidek alkalmazásáról.

(2) Enzim inhibitor, például proteáz vagy amiláz inhibitor. Lásd például Abe munkáját [Abe és mtsai.: J. Bioi. Chem. 2 62 16793 '(1987)] - a rizs ciszteinproteináz inhibitor nukleotid szekvenciája - , Huub közlését [Huub és mtsai.: Plánt Molec. Bioi. 21 985 (1993)] - dohány proteináz I. inhibitort kódoló cDNS nukleotid szekvenciája - , és Sumitani publikációját [Sumitani és mtsai.: Biosci. Biotech. Biochem. 57

1243 (1993)] - a Streptomyces nitrosporeus a-amiláz inhibitor nukleotid szekvenciája.

(3) Rovarspecifikus hormon vagy feromon, mint például egy ekdiszteroid és juvenil hormon, ezek variánsai, eze·· ·

- 45 ken alapuló mímetikumok, vagy ezek antagonistája illetve agonistája. Lásd például Hammock közlését [Hammock és mtsai.: Natúré 344 458 (1990)] a klónozott juvenil hormon-észteráz bakulovírusban történő expressziójáról, amely észteráz a juvenil hormon egyik inaktivátora.

(4) Rovarspecifikus peptid vagy neuropeptid, amely expressziója esetén gátolja a kérdéses kártevő életműködését. Lásd például Regan közlését [Regan: J. Bioi. Chem. 269 9 (1994)] - expressziós klónozás rovar diuretikus hormon receptort kódoló DNS-t eredményez - , és Pratt munkáját [Pratt és mtsai.: Biochem. Biophys. Rés. Comm. 163 1243 (1989)] - allosztatin azonosítása Diploptera puntata-ban. Lásd még Tomalski és munkatársai 5,266,317 lajstromszámú USA szabadalmát, akik rovarspecifikus, paralízist okozó neurotoxinokat kódoló géneket írnak le.

(5) Rovarspecifikus méreganyag, amelyet a természetben kígyó, darázs, stb. termel. Lásd például Pang és mtsai közleményét [Pang és mtsai.: Gene 116 165 (1992)], akik egy skorpió eredetű, a rovarokra toxikus hatású peptidet kódoló gén növényekben megvalósított heterológ expresszióját írják le.

(6) Olyan enzim, amely monterpén, szeszkviterpén, szteroid, hidroxámsav, fenilpropanoid-származék, vagy más, inszekticid aktivitású nem-fehérje természetű molekula hiperakkumulációjáért felelős.

• · · · · · · • · · · ··· · • · · · · · · (7) Olyan enzim, amelynek szerepe van egy biológiailag aktív molekula módosításában - beleértve a transzlációt követő módosításokat - ; például egy glikolítikus enzim, egy proteolítikus enzim, egy lipolítikus enzim, egy nukleáz, cikláz, transzamináz, észteráz, hidroláz, foszfatáz, kináz, foszforiláz, polimeráz, elasztáz, kitináz és glukanáz, akár természetes, akár szintetikus. Lásd például Scott és munkatársai WO 93/02197 számú PCT szabadalmi bejelentését, amely egy kalláz gén nukleotid szekvenciáját írja le. Kitináz kódoló szekvenciával rendelkező DNSmolekulák beszerezhetőek például az Amerikai típuskultúra gyűjteményből ATCC 39637 és 67152 azonosítási számok szerint. Lásd még Kramer közleményét [Kramer és mtsai.: Insect Biochem. Molec. Bioi. 23 691 (1993)] aki kitanítást ad a dohány horgasféreg(„hookworm)-kitinázt kódoló cDNS nukleotid szekvenciáról, és Kawalleck közleményét [Kawalleck és mtsai.: -Plánt Molec. Bioi. 21 673 (1993)] aki megadja a petrezselyem ubi4-2 poliubiquitin gén nukleotid szekvenciáját.

(8) Olyan molekula, amely serkenti a jelátvitelt („signal transduction). Lásd például Botella közlését [Botella és mtsai.: Plánt Molec. Bioi. 24 757 (1994)] a mungóbab kalmodulin cDNS-klónok nukleotid szekvenciájáról, és Griess munkáját [Griess és mtsai.: Plánt Physiol. 104 1467 (1994)] aki megadja egy kukorica eredetű kalmodulin cDNS-klón nukleotid szekvenciáját.

• · • ·

- 47 (9) Rovarspecifikus antitest vagy egy abból származó immuntoxin. Ily módon a rovar emésztőrendszer egy kritikus metabolikus funkcióját megcélzó antitest a megfelelő enzimet inaktiválja és ezzel elpusztítja a rovart. Vesd össze: Taylor és mtsai.: Enzimes inaktiválás transzgenikus dohányban egyláncú antitest fragmensek termelésével című, 497. sz. kivonat,

Seventh Int'1 Symposium on Molecular Plant-Microbe

Interactions (1994).

Az általános találmányi leírást könnyebben megérthetővé tehetjük a következő példákra hivatkozva. A példákkal a találmányi leírást kívánjuk - nem korlátozó értelemben - illusztrálni . példa

Brassica napus mikrospóra cDNS-klóntár létrehozása és szkrinelése

Késői egymagvú/korai kétmagvú Brassica napus cv Topas mikrospórákat 32,5 °C-on négy napig tenyésztettünk az embriogenezis megindításához. Ouellet által leírt guanidínium-izotiocianát módszerrel [Ouellet és mtsai.: Plánt Journal 2, 321 (1992)] poli (A)⁺ RNS-t izoláltunk a mikrospórákból. A poli(A)⁺ RNS-ből a Riboclone® cDNS szintézis rendszerrel (Promega Corp.; Madison, WT) kettős-szálú cDNS-t szintetizáltunk, majd azt klónoztuk a LambdaGEM®-4 klónozó vektorba (Promega Corp.).

A cDNS-klóntárat mikrospóra-specifikus kiónokra differenciálisán szkríneltük, úgy, hogy két azonos kontakt másolatot („duplicate lift) készítettünk és ezt ³²P-vel jelölt, a klóntár készítésében felhasznált mikrospóra RNS(Mi-RNS)próbával, vagy az embriogén válaszok megakadályozása érdekében 24 óráig 25 °C-on tartott, majd három napig 32 °C-on tartott mikrospórából származó, ³²P-vel jelölt RNS(MxRNS)-próbával vizsgáltunk. Három cDNS-klónt (Mi-cDNS-3, -4 és -5) amelyek hibridizálódtak a Mi-RNS-hez de nem a MxRNS-hez megtisztítottunk és részletesebben jellemeztünk.

Mindegyik izolált cDNS-klón Southern-blot-ját hibridizáltuk az egész mikrospóra klóntárat tartalmazó ³²P-vel jelölt cDNS-próbákkal. A biot negatív kontrollként napin DNSt és lambda vektor karokat tartalmazott. Mind a Mi-cDNS-3 és a Mi-cDNS-4 a teljes cDNS-próbával hibridizált, és úgy találtuk, hogy körülbelül 800 bázispár nagyságú inszerteket tartalmaznak. A nukleotid szekvencia analízis kimutatta, hogy a Mi-cDNS-3 és a Mi-cDNS-4 azonos, és valószínűleg azért tartalmaztak teljes cD-NS-inszerteket mert mindkét cDNS ugyanarra a nukleotidra végződött. A mikrospóraspecifikus cDNS-klónt Bnml-nek neveztük el. A Bnml cDNS nukleotid szekvenciája (1. azonosítási szám szerinti szekvencia) az ennek megfelelő aminosav szekvenciával (2. azonosítási szám szerinti szekvencia) az 1. ábrán látható.

2. példa

Northern-blot analízis a Bnml cDNS-próba segítségével

A Bnml-gén expressziós megoszlásának a jellemzését « ·

Northern-blot analízissel végeztük. Ezek a vizsgálatok kimutatták, hogy a Bnml cDNS hibridizál egész rügyekből, virágokból és portokokból származó RNS-sel, de nem hibridizál gyökerekből, szárakból, levelekből, bibékből és fejlődő magokból izolált RNS-sel. A Bnml RNS expressziója nagyon erős volt a három-magvú és kétmagvú mikrospórákban, de lényegében hiányzott a mikrospóra fejlődés egymagvú és tetrad állapotában. A Northern-blot analízisek eredményei szerint a Bnml-RNS expressziója nagyobb mértékben jelentkezik a mikrospóra fejlődés során, mint a Brassica Bp4, BplO és Bpl9 mikrospóra-specifikus kiónjaié. [Albani és mtsai.: Plánt Molecular Biology 15, 605 (1990); Albani és mtsai.: Plánt Molecular Biology 16, 501 (1991); Albani és mtsai.:

The Plánt Journal 2, 331 (1992)].

A Bnml-klón részletesebb jellemzésére egymagvú mikrospórákat 32,5 °C-on tenyésztettünk négy napig az embriogenezis megindításához, illetve 24 °C-on négy napig, hogy a pollen kifejlődhessen. Mikrospóra embriókat izoláltunk a fejlődés globuláris-, szív-, torpedó- és sziklevélfázisaiból. Az RNS-minták Northern-blot analízise alacsony Bnml expressziós szintet mutatott az embriogenezisre késztetett mikrospórákban, jelentősen magasabb expressziós szintet mutatott a pollenra indukált mikrospórákban. Az embrió fejlődés globuláris-, szív-, torpedó- és sziklevélfázisaiból vett RNS minták nem hibridizáltak a Bnml próbával .

• ·

3. példa

Southern-blot analízis a Bnml cDNS-próba segítségével

Az alább részletezett Southern-blot analízishez és genomi szkrínhez a hibridizációkat 42 °C hajtottuk végre, a következő összetételű hibridizációs keverék használatával:

50% formamid, lOx Denhardt oldat (lOOx: 10 gramm polivinilpirrolidon, 10 gramm marha szérumalbumin, és 10 gramm Ficoll 400, 500 mL steril vízben), 5x SSC puffer (20x: 3 M nátrium-klorid és 0,3 M trinátrium-citrát x 2H₂O, pH 7,0), 50 mM nátrium-foszfát (pH 7,0), 1 % nátrium-dodecilszulfát, és 5 mg/mL hő-denaturált lazacsperma-DNS. A biottokat erősen sztringens mosás után (O.lx SSC, 65 °C) röntgenfilmmel inkubáltuk különböző ideig, hogy elérjük az optimális expozíciót.

Egy kísérlet-sorozatban ‘B. campestris cv Candle, B. napus cv Topas, B. oleracea alboglabra, feketefenyő, Arabidopsis thaliana, napraforgó, dohány, árpa és kukorica DNS-minták Southern-blot-ja ellen próbáltuk a Bnml-et. Az eredmények alapján a feketefenyő, az árpa és ,a keresztesvirágúak tartalmazzák a Bnml-gént, míg a napraforgó, a dohány vagy a kukorica nem tartalmazza.

4. példa

Bnml genomi eredetű klón izolálása

B. napus cv Westar genomi eredetű DNS-ének részleges

Sau3A emésztésével és a DNS-fragmensek beillesztésével (átlagos inszert nagyság körülbelül' 8 kilobázis) a pTZ18Rplazmid részlegesen feltöltött Sáli helyére, egy Brassica • ·

- 51 napus genomi eredetű klóntárat hoztunk létre [Mead és mtsai.: Protein Eng. 1_ 67 (1986); Nantel és mtsai.: Plánt Molecular Biology 16, 955 (1991)]. Nantel és munkatársai módszerét követve [Nantel és mtsai.: 1. fentebb] a klóntárat 42 frakcióban gyűjtöttük, mindegyik frakcióból egy kisebb mennyiséget EcoRI-vel emésztettünk, és az EcoRI emésztés eredményeit Southern-blot analízissel vizsgáltuk, hogy azonosítani tudjuk a Bnml cDNS-nek megfelelő genomi eredetű kiónokat tartalmazó frakció(ka)t.

Minden pozitívan hibridizáló frakcióból körülbelül 10,000 telepet szkríneltünk Hybond-N filtereken (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) ³²P-dCTP random primerrel jelölt cDNS-próba felhasználásával. A hibridizáló telepeket 2-2 példányban - telephálós vizsgáló lemezekre vittük át másodlagos szkrínelésre. A potenciálisan pozitív telepeket még egy harmadik, végleges szkrínen vittük át, hogy egyedi, pozitív telepeket izoláljunk. A szkrínelés harmadik fordulója után öt, erősen pozitív jelet adó kiónt azonosítottunk.

Restrikciós térképeket készítettünk a teljes Bnml cDNSt használva próbának az öt pozitív genomi eredetű kiónról. A kísérlet eredményei szerint az öt klónból három ugyanazt a genomi eredetű fragmenst tartalmazta. Részletesebben jellemeztük a megmaradó két kiónt és egyet ebből a három kiónból (Bnml-8, -31 és -5) . A restrikciós térképezés és a Southern-blot analízis kizárta a Bnml-5-öt, mint a továbbiakban alkalmazható genomi eredetű’klónt.

• · • ·

- 52 A Bnml-8 és Bnml-31 5'-irányban elhelyezkedő szakaszának hosszát a Bnml-gén 5'-végének amplifikálásával határoztuk meg, amihez megszintetizáltuk a következő oligonukleotidokat. Ezek univerzális vagy reverz szekvenáló primerekkel együtt felhasználhatóak az amplifikálásra:

MSP-1 (3. azonosítási szám szerinti szekvencia):

5' GGCCGAATTCGCCGCCGCGGCGAAGGTAGA 3'

EcoRI

MSP-2 (4. azonosítási szám szerinti szekvencia)

5' GGCCGAATTCCTGCCTTACCCGTCTCAGCCACG 3'

EcoRI

Az MSP-1 és MSP-2 szekvenciákat úgy alakítottuk ki, hogy egymástól körülbelül 230 bázispárral különböző fragmenseket hozzanak létre. A primereket 65 °C-on lx polimeráz láncreakciós (PCR), 2,5 mM MgCl₂-ot tartalmazó pufferben (Perkin-Elmer Corp., Norwolk, CT) anneáltuk.

Két sávot - az egyik 2,7 kilobázis, a másik 3,2 kilobázis - amplifikáltunk Bnml-8-ból, MSP-1 és MSP-2 primereket használva sorrendben megfeleltetve, a reverz szekvenáló primerrel együtt. A nem várt 500 bázispár különbségről feltételeztük, hogy egy intron jelenlétének köszönhető. A genomi eredetű klón kódoló régióját szekvenáltuk és egyetlen, 361 bázispár nagyságú intron jelenlétét tudtuk kimutatni. A 2. ábra a Bnml genomi eredetű klón nukleotid szekvenciáját mutatja be (5. azonosítási szám szerinti szekvencia) együtt az 5'-irányban elhelyezkedő és kódoló régiókkal.

* ········ ········ ·· ·· *· * ·

- 53 *

A PCR fragmensek nukleotid szekvenciájának meghatározására mindegyik fragmenst EcoRI-gyel emésztettük és egy 1,3 kilobázis nagyságú fragmenst a pTZ18R-plazmid EcoRI-HincII helyére szubklónoztuk. A ligáit DNS-molekulákat a DH5aMCR E. coli törzsbe juttattuk. A szubklónozott PCR fragmenseket Sequenase reagens-készlet (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH) alkalmazásával szekvenáltuk, amely Sanger dideoxy-alapú láncterminációs eljárását alkalmazza [Sanger és mtsai.: J. Mól. Bioi. 94, 441 (1975)].

Azt találtuk, hogy a PCR fragmensek csak 535 bázispárt tartalmaznak az 5'-irányban elhelyezkedő lefordítatlan szekvenciából. Ezután az eredeti Bnml genomi eredetű klónból egy 2,95 kilobázis nagyságú PvuII-BamHI fragmenst szubklónoztunk, hogy további 5'-irányban elhelyezkedő szekvenciákat kapjunk. A vélelmezett promóter régió teljes 820 bázisának szekvenálására primer „sétát alkalmaztunk.

5. példa

Transzgenikus canola növények transzformálása és analízise

A Bnml-promóter működésének vizsgálatára a következő PCR primerpárt terveztük meg, amelly segítségével a promóter 5'-végére egy Sáli hasító helyet alakítunk ki, és az ATG kodonnál egy Ncol hasító helyet hozunk létre:

• « «····· ·· ·· *» ·· 9 ·

- 54 MSP-8 (6. azonosítási szám szerinti szekvencia):

-820

5' GGCCGTCGACGCATCAAAGTGATGCGGAAGGAG 3'

Sáli

MSP-7 (7. azonosítási szám szerinti szekvencia):

5' CCCGGGTCTAGAACGTTGCCATGGTCTTTGCGTCG 3' .

Xbal Ncol

Az MSP-8 primer a -820-as nukleotidtól kezdve az 5'irányban elhelyezkedő régió 23 nukleotidját tartalmazza, és a klónozás elősegítésére magába foglal egy 5'-irányban elhelyezkedő Sáli hasító helyet is. Az MSP-7 primer az ATG start kodont közrevevő 23 nukleotidot tartalmaz, és úgy lett megszerkesztve, hogy a Bnml-gén start kodonjánál egy Ncol hasító helyet alakítson ki. Az MSP-7 primer a klónozás elősegítésére még egy Xbal hasító helyet is tartalmaz.

Ezeket a primereket alkalmazva egy 844 bázispár nagyságú fragmenst amplifikáltunk, klónoztunk és szekvenáltunk. A DNS-fragmens a promóter régió 820 bázispárját tartalmazta közvetlenül a Bnml-gén ATG start helyétől 5'-irányban. A 844 bázispár nagyságú fragmens nukleotid szekvenciáját (8. azonosítási szám szerinti szekvencia) a 3. ábrán mutatjuk be.

A promóter fragmenst Ncol-Sáli-gyei emésztettük, és egy Ncol-EcoPl fragmenshez ligáltuk, - amely fragmens GUS reporter gént, és a burgonya proteináz-inhibitor (PINII) génből a 3' lefordítatlan régiót (terminátor) tartalmazza, ··»· « • · · · · · · # · · ··· · « · · · · · ·· ·* ·· ·« ι «

- 55 - és a Sall-EcoRI helyekre klónoztuk mind a pBlueScript®II SK⁺- (Stratagene® Cloning Systems, La Jolla, CA) és DP1741vektorokba, hogy sorrendben megfeleltetve a DP5476- (4. ábra) és DP5477- (5. ábra) vektorokat állítsuk elő. A DP1741 abban különbözik a pBHOl. 1-vektortól [Jefferson: Plánt Molecular Biology Reporter 5 387 (1987)], hogy a nopalinszintáz 5' és 3' szabályozó szekvenciák helyett CaMV35S szabályozó szekvenciákat tartalmaz az NPTII szelektálható marker gén expressziójának szabályozására.

A DP5477 kettős konstrukciót - sziklevél eredetű levélnyelek Agrobactérium-alapú együtt-tenyésztése útján - B. napus cv Westar növénybe transzformáltuk Moloney általános módszerét alkalmazva [Moloney és mtsai.: Plánt Cell Reports _8 238 (1989)]. A transzgenikus canola növényekből izolált mikrospórák - amelyet GUS-aktivitásra analizáltunk - négyből három esetben intenzív festődést mutattak, míg a negyedik enyhe kék festődést mutatott. Úgy tűnik, hogy a GUSexpresszió elsődlegesen a mikrospórákban lokalizálódik, mivel más szövetek - beleértve· a portok falat,_ a bibét és csészelevelet - nem festődtek. Azonban a rekeszeken belüli anyag kékre festődött, jelezve ezzel, hogy lehetséges kismértékű, tapetumhoz kötött expresszió is. A GUSexpresszió legnagyobb részt az egymagvú és kétmagvú mikrospórákhoz kötődik, és valószínű, hogy az expresszió meiózis-utáni, mert a mikrospórák 25-50 százaléka nem festődött .

Bár az előzőekben a találmány különösen előnyös megvalósítási módjait ismertetettük, az igényelt oltalmi kör nem • · « · korlátozható kizárólag a bemutatott konkrét megvalósításokra. Szakember számos olyan módosítást illetve változtatást végre tud hajtani az ismertetett konkrét megvalósítási módokon, melyek eredményeként létrejött megoldások nem térnek el a találmányi gondolattól, és ezért a csatolt szabadalmi igénypontok által meghatározott oltalmi körön belül maradnak .

A leírásban említett összes publikáció és szabadalmi írat a technika állása szerint a szabadalmi bejelentéshez kapcsolódóan megkívánt ismereteket szemlélteti. Az összes publikáció és szabadalmi irat, melyeket referenciaként feltüntettünk, éppúgy a kitanítás részének tekintendő, mintha minden egyes idézett publikáció és szabadalmi irat esetén külön jeleztük volna, hogy azokat a maguk teljességében a kitanítás részeként kell figyelembe venni.

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 786 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: genomi DNS SAJÁTSÁG:

NÉV/KULCS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 24-569

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ACAAAACTTC CGACGCAAAG AAA ATG GCA ACG TTC TCA GTT CTG TCT ACC Met Alá Thr Phe Ser Val Leu Ser Thr l 5

TTC

GCC

GCG

GCG

GCA

ATT

ACG

TTG

CAA

CTA

CTC

CTA

GTT

CCA

GCT

TCA

98

Phe 10

Alá

Alá

Alá

Alá

Ile 15

Thr

Leu

Gin

Leu

Leu 20

Leu

Val

Pro

Alá

Ser 25

GCC

TCT

CCT

CAC

ATG

AAA

TAC

ATT

GAC

GCT

ATC

TGC

GAT

CGC

TCC

CAC

146

Alá

Ser

Pro

His

Met 30

Lys

Tyr

Ile

Asp

Alá 35

Ile

Cys

Asp

Arg

Ser 40

His

GAC

CAA

GAT

TAC

TGC

GTT

AAA

ACA

TTG

ACC

ACC

AAC

CCC

CCT

ACA

GCT

194

Asp

Gin

Asp

Tyr 45

Cys

Val

Lys

Thr

Leu 50

Thr

Thr

Asn

Pro

Pro 55

Thr

Ála

GCT

CCC

ATT

GGC

CTG

AAT

CCA

CTG

GCC

GAG

GTG

ATG

GCG

CTC

ACC

ATA

242

Alá

Pro

Ile 60

Gly

Leu

Asn

Pro

Leu 65

Alá

Glu

Val

Met

Alá 70

Leu

Thr

ile

GCC

CAC

GCC

GAG

AAG

ACA

GCG

GCT

TTC

GTG

GCT

GAG

ACG

GGT

AAG

GCT

290

Alá

His 75

Alá

Glu

Lys

Thr

Alá 80

Alá

Phe

Val

Alá

Glu 85

Thr

Gly

Lys

Alá

GAT

CAA

ACG

TTT

ACT

GAG

TAC

CAC

AAG

GCC

TAC

TTA

GCC

GTG

GTG

GCT

338

Asp 90

Gin

Thr

Phe

Thr

Glu 95

Tyr

His

Lys

Alá

Tyr 100

Leu

Alá

Val

Val

Alá 105

GAT

CTC

AAG

AGC

GCA

AAC

CTG

AAG

CTC

AAG

CAA

TCC

CCT

GAC

ACT

GCT

386

Asp

Leu

Lys

Ser

Alá 110

Asn

Leu

Lys

Leu

Lys 115

Gin

Ser

Pro

Asp

Thr 120

Alá

CAC

TAC

GAC

GTT

AGG

TCT

TCG

ACC

GAC

CAG

ATG

AAG

CGC

GTG

GAG

GGA

434

His

Tyr

Asp

Val 125

Arg

Ser

Ser

Thr

Asp 130

Gin

Met

Lys

Arg

Val 135

Glu

Gly

TTA

GTT

GCC

AGC

AAA

AAT

GAC

CAG

GCT

TCA

ACT

ACT

CTT

AAG

GAA

ATG

482

Leu

Val

Alá 140

Ser

Lys

Asn

Asp

Gin 145

Alá

Ser

Thr

Thr

Leu 150

Lys

Glu

Met

ACG

GTG

CAG

ATG

GAG

AAA

CTT

CTT

GAT

CTT

GCA

GCT

AGT

GCC

GCC

GAT

530

Thr

Val 155

Gin

Mec

Glu

Lys

Leu 160

Leu

Asp

Leu

Alá

Alá 165

Ser

Alá

Alá

Asp

• ·

- 58 GCT GTG GAC GAC GAT GAT GAG AAC ATC CAC CGT CGC GTC TGATTTTAAA 579

Alá Val Asp Asp Asp Asp Glu Asn Ile His Arg Arg Val 170 175 180

CCGGTCCGGT	TTCGTTTTTT	TGTGTTCACA	ATACAAAATA	TAATAAATAA	ATGAATATAC	639
ATATACACAC	ACACAAATGT	GTTGTGATAA	ACTAGTAATT	AAGTTTTTGA	AATATTTGCA	699
GAACTAATGT	TGTCAATATT	TTTGGCATAT	ATAAAGAGTC	TGCTGTATTA	TCTTTTTATA	759
AAACTAAATA	TAAATCTGAT	TTGTATC				786

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 182 aminosav

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met 1

Alá

Thr

Phe

Ser 5

Val

Leu

Ser

Thr

Phe 10

Alá

Alá

Alá

Alá

Ile 15

Thr

Leu

Gin

Leu

Leu 20

Leu

Val

Pro

Alá

Ser 25

Alá

Ser

Pro

His

Met 30

Lys

Tyr

Ile

Asp

Alá 35

Ile

Cys

Asp

Arg

Ser 40

His

Asp

Gin

Asp

Tyr 45

Cys

Val

Lys

Thr

Leu 50

Thr

Thr

Asn

Pro

Pro 55

Thr

Alá

Alá

Pro

Ile 60

Gly

Leu

Asn

Pro

Leu 65

Alá

Glu

Val

Met

Alá 70

Leu

Thr

Ile

Alá

His 75

Alá

Glu

Lys

Thr

Alá 80

Alá

Phe

Val

Alá

Glu 85

Thr

Gly

Lys

Alá

Asp 90

Gin

Thr

Phe

Thr

Glu 95

Tyr

His

Lys

Alá

Tyr 100

Leu

Alá

Val

Val

Alá 105

Asp

Leu

Lys

Ser

Alá 110

Asn

Leu

Lys

Leu

Lys 115

Gin

Ser

Pro

Asp

Thr 120

Alá

His

Tyr

Asp

val 125

Arg

ser

Ser

Thr

Asp 130

Gin

Met

Lys

Arg

Val 135

Glu

Gly

Leu

Val

Alá 140

Ser

Lys

Asn

Asp

Gin 145

Alá

Ser

Thr

Thr

Leu 150

Lys

Glu

Met

Thr

Val 155

Gin

Met

Glu

Lys

Leu 160

Leu

Asp

Leu

Alá

Alá 165

Ser

Alá

Alá

Asp

Alá 170

Val

Asp

Asp

Asp

Asp 175

Glu

Asn Ile His Arg Arg Val 1Θ0 • ·

- 59 - ” ·

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 30 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGCCGAATTC GCCGCCGCGG CGAAGGTAGA 30

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGCCGAATTC CTGCCTTACC CGTCTCAGCC ACG 33

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 2039 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS • ·

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCCAGGGTTC	CGCACCGCAT	CAAAGTGATG	CGGAAGGAGT	AATTATTCTG	TAAATTTAAA	60
TATTTAGTCT	TACATTGTTC	AAATTTTTAT	gttttatatt	ATTTTATTTT	TTGATTTTGA	120
CGATTTAAGT	ATATTTGAAT	TTTTTTAAGA	AAAATACATA	ATTAAAATGG	gtacccgaac	190
TCGAATCTGA	ATCGAACCCA	CAATGATTCG	AACAAAATTC	AAACCAAAAT	TTATAAATAT	240
TCCAATACGA	TTGAATTTTC	TAATATAAGA	ATCAGAAATC	TGAATAGATT	AACTGAATTC	300
AAACAGGTAT	AAGAGTGTCC	ACCCCAACAA	ATCCCTTAGT	ACAATATATA	GTTATAAATA	360
ATTCAATAAA	ctatttcatt	ATGCACAGCG	CGGACTACTA	CTAGTATAGT	ATAATGTATG	420
TCAAATAAAA	CTTCAGTGAA	ATGTGTTCAT	ATTAGATTAG	ACCACTTCTT	TTCTATGATC	490
ACCAAGGACC	TCAACACTTG	TCACGACATA	GCTCAATTTT	CTAAACAAAG	AAAGAAGATC	540
ACAGACGATT	TTTTCGTTGA	CTAAATCTAT	ACAAACCACA	TACTATTTAG	ATAGGTTCTC	600
CAAATTTAGC	AAATATAAGC	aaacttttag	TAAAAACCTT	ACGCATTTTA	CATCAATTCT	660
TAATATAGTA	GTTTCCAAGA	ATATCAAACG	TCCCTGACCA	AGCCCTAGGT	gtacttgtat	720
ATATACCCAC	CCACAAACTA	AAAGCAAATC	AACATACAGA	AAACTGAATA	ACAACCGGAA	780
GAAAAAAGAG	AAAAAAATAA	ATAAAACAAA	acttccgacg	CAAAGAAAAT	GGCAACGTTC	840
TCAGTTCTGT	CTACCTTCGC	CGCGGCGGCA	ATTACGTTGC	AACTACTCCT	AGTTCCAGCT	900
TCAGCCTCTC	CTCACATGAA	ATACATTGAC	GCTATCTGCG	ATCGCTCCCA	CGACCAAGAT	960

TACTGCGTTA AAACATTGAC CACCAACCCC CCTACAGCTG CTCCCATTGG CCTGGTACTC 1020

ATCTTTAAAC CACTGTCTCT TTGTTTGCGT TAAATCACAG AAGAAATTTA CGTTTGAATT 1080

ATGGTTTATT CAGTTTATTT GGCAGTCCGG TAATATGTAA TCCGAAAATC TTCTAACATT 1140

AGTCGAAAAA CATTTTAAAC AGACAATCCG ACAATGTGAT ACTTTTTTCC ACACTGTAGC 1200

ATCTAGTGTG TTTATACCGC AGCTGGCCGG ATTAGCTAGC TGCATATATA TTAAAAAAAA 1260

ATCATGTTTA CTTAATATGT TTCAAAAATA CAACTGCATA TGCTTTACGT GTGAAAGAGC 1320

TTAAACGAGA ATGATCATTA GTATTAATAC TAATAAAATC TCTTTATTAT CTCTAGAATC 1380

CACTGGCCGA GGTGATGGCG CTCACCATAG CCCACGCCGA GAAGACAGCG GCTTTCGTGG 1440

CTGAGACGGG TAAGGCTGAT CAAACGTTTA CTGAGTACCA CAAGGCCTAC TTAGCCGTGG 1500

TGGCTGATCT CAAGAGCGCA AACCTGAAGC TCAAGCAATC CCCTGACACT GCTCACTACG 1560

ACGTTAGGTC TTCGACCGAC CAGATGAAGC GCGTGGAGGG ATTAGTTGCC AGCAAAAATG 1620

ACCAGGCTTC AACTACTCTT AAGGAAATGA CGGTGCAGAT GGAGAAACTT CTTGATCTTG 1680

CAGCTAGTGC CGCCGATGCT GTGGACGACG ATGATGAGAA CATCCACCGT CGCGTCTGAT 1740

TTTAAACCGG TCCGGTTTCG TTTTTTTGTG TTCACAATAC AAAATATAAT AAATAAATGA 1900

ATATACATAT ACACACACAC AAATGTGTTG TGATAAACTA GTAATTAAGT TTTTGAAATA TTTGCAGAAC TAATGTTGTC AATATTTTTG GCATATATAA AGAGTCTGCT GTATTATCTT TTTATAAAAC TAAATATAAA' TCTGATTTGT ATCAATTGTT GGACAACCCA AAAGCGCCAA GACATCACCT GGTACAAACA TATTGACTTT TGTAAGCTTA TCGATACCGT CGACCTCGA

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGCCGTCGAC GCATCAAAGT GATGCGGAAG GAG 33

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 35 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

1860

1920

1980

2039

CCCGGGTCTA GAACGTTGCC ATGGTCTTTG CGTCG • ·

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 859 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy '

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomi DNS

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CATAGTCGAT	CTTAGGGCCG	TCGACGCATC	AAAGTGATGC	GGAAGGAGTA	ATTATTCTGT	60
ΑΑΑΊΤΤΑΑΑΤ	ATTTAGTCTT	ACATTGTTCA	AATTTTTATG	ΤΤΓΤΑΤΑΤΤΑ	TTTTATTTTT	120
TGATTTTGAC	GATTTAAGTA	TATTTGAATT	TTTTTAAGAA	AAATACATAA	TTAAAATGGG	180
TACCCGAACT	CGAATCTGAA	TCGAACCCAC	AATGATTCGA	ACAAAATTCA	AACCAAAATT	240
TATAAATATT	CCAATACGAT	TGAATTTTCT	AATATAAGAA	TCAGAAATCT	GAATAGATTA	300
ACTGAATTCA	AACAGGTATA	AGAGTGTCCA	CCCCAACAAA	TCCCTTAGTA	CAATATATAG	360
TTATAAATAA	TTCAATAAAC	TATTTCATTA	TGCACAGCGC	GGACTACTAC	TAGTATAGTA	420
TAATGTATGT	CAAATAAAAC	TTCAGTGAAA	TGTGTTCATA	TTAGATTAGA	CCACTTCTTT	480
TCTATGATCA	CCAAGGACCT	caacacttgt	CACGACATAG	CTCAATTTTC	TAAACAAAGA	540
AAGAAGATCA	CAGACGATTT	TTTCGTTGAC'	TAAATCTATA	CAAACCACAT	ACTATTTAGA	600
TAGGTTCTCC	AAATTTAGCA	AATATAAGCA	AACTTTTAGT	AAAAACCTTA	CGCATTTTAC	660
ATCAATTCTT	AATATAGTAG	TTTCCAAGAA	TATCAAACGT	CCCTGACCAA	GCCCTAGGTG	720
TACTTGTATA	TATACCCACC	CACAAACTAA	AAGCAAATCA	ACATACAGAA	AACTGAATAA	780
CAACCGGAAG	AAAAAAGAGA	AAAAAATAAA	TAAAACAAAA	CTTCCGACGC	AAAGACCATG	840

GCAACGTTCT AGACCCGGG

Claims (26)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Izolált DNS-molekula, amely mikrospóra-specifikus szabályozó elem, és amely DNS-molekula nukleotid szekvenciája (a) a 8. azonosítási szám szerinti szekvencia, vagy (b) olyan nukleotid szekvencia amely legalább 65% hasonlóságot mutat a 8. azonosítási szám szerinti szekvenciával, vagy (c) (a)- vagy (b)-szekvencia funkcionális fragmense.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti DNS-molekula, amely a 8.

   azonosítási szám szerinti nukleotid szekvenciát tartalmazza.
3. 3. Expressziós vektor, amely 1. igénypont szerinti mikrospóra-specifikus szabályozó elemet tartalmaz.
4. 4. A 3. igénypont szerinti expressziós vektor, amely tartalmaz továbbá promótert, amely promóter működése a mikrospóra-specifikus szabályozó elem által szabályozott.
5. 5. A 4. igénypont szerinti expressziós vektor, amely promóterként a Bnml-promótert, egy portok-specifikus promóter, vagy a CaMV35S-core-promótert tartalmazza.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti expressziós vektor, amely promóterként a Bnml-promótert tartalmazza.
7. 7. A 4. igénypont szerinti expressziós vektor, amely tartalmaz idegen gént is, amely idegen gén funkcionálisan kapcsolt a promóterhez.
8. 8. A 7. igénypont szerinti expressziós vektor, amely a mikrospórák működését megakadályozó géntermékű idegen gént tartalmaz.
9. 9. Eljárás hímsteril növények előállítására a 8. igénypont szerinti expressziós vektor alkalmazásával, azzal jellemezve, hogy az idegen génként struktúrgént, antiszenszgént, ribozimgént vagy külső irányító szekvencia gént tartalmazó expressziós vektort embriogén növényi sejtekbe juttatjuk.
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a struktúrgénként fhérjét, közelebbről diftéria toxint, alkörmös antivirális fehérjét, Aspergillus oryzae RNáz-Tl-et, barnázt vagy a rolB-génterméket tartalmazó expressziós vektort alkalmazunk.
11. 11. A 9. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az antiszensz-génként aktin antiszensz RNS-t, tubulin antiszensz RNS-t, ubiquitin antiszensz RNS-t, ubiquitinkonjugáló enzim antiszensz RNS-t, ubiquitin-hordozó fehérje antiszensz RNS-t, elongációs faktor antiszensz RNS-t vagy chalcone-szintáz antiszensz RNS-t kódoló gént tartalmazó expressziós vektort alkalmazunk.
12. 12. A 9. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a ribozimgénként aktin nukleotid szekvenciákat, tubulin nukleotid szekvenciákat, ubiquitin nukleotid szekvenciákat, ubiquitin-konjugáló enzim nukleotid szekvenciákat, ubiquitin-hordozó fehérje nukleotid szekvenciákat, elongációs faktor nukleotid szekvenciákat vagy chalcone65 szintáz nukleotid szekvenciákat tartalmazó gént hordozó expressziós vektort alkalmazunk.
13. 13. A 9. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a külső irányító szekvencia génként aktin nukleotid szekvenciákat, tubulin nukleotid szekvenciákat, ubiquitin nukleotid szekvenciákat, ubiquitin-konjugáló enzim nukleotid szekvenciákat, ubiquitin-hordozó fehérje nukleotid szekvenciákat, elongációs faktor nukleotid szekvenciákat vagy chalcone-szintáz nukleotid szekvenciákat tartalmazó gént hordozó expressziós vektort alkalmazunk.
14. 14. A 9. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a vektort embriogén növényi sejtként Brassica napus sejtbe juttatjuk.
15. 15. Transzgenikus növény, amely 8. igénypont szerinti expressziós vektort tartalmaz.
16. 16. Eljárás hímsteril· növény előállítására, azzal jellemezve, hogy:

    (a) a 8. azonosítási szám szerinti szekvenciát, (b) a

    8. azonosítási szám szerinti szekvenciával legalább 65% hasonlóságot mutató nukleotid szekvenciát vagy (c) (a)- vagy (b)-szekvencia fragmensét tartalmazó mikrospóra-specifikus szabályozó elemet, promótert és idegen gént tartalmazó expressziós vektort állítunk elő, amelyben a mikrospóra-specifikus szabályozó elem a promóterrel együtt az idegen gén expresszióját szabályozza, és az idegen gén terméke a mikrospórák működését gátolja, és ily módon hímsteril növényt hoz létre.

    ···
17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az expressziós vektort embriogén növényi sejtekbe juttatjuk .
18. 18. Eljárás hímtermékeny hibrid növény előállítására mikrospóra-specifikus szabályozó elem alkalmazásával, azzal jellemezve, hogy:

    (i) az 1. igénypont szerinti mikrospóra-specifikus szabályozó elemet, promótert, és egy első idegen gént tartalmaz expressziós vektort tartalmazó hímsteril első szülőnövényt állítunk elő, amely expressziós vektorban a mikrospóra-specifikus szabályozó elem a promóterrel együtt az első idegen gén expresszióját szabályozza, és amely első idegen gén terméke gátolja a mikrospórák működését; majd (ii) mikrospóra-specifikus szabályozó elemet, promótert és második idegen gént tartalmazó expressziós vektort tartalmazó második szülőnövényt állítunk elő, amely expressziós vektorban a mikrospóra-specifikus szabályozó elem a promóterrel együtt az második idegen gén expresszióját szabályozza; és (iii) az első szülőnövényt a második szülőnövénnyel keresztezzük, és így olyan hibrid növényt állítunk elő, amelynek mikrospórái a második idegen gént expresszálják, és amely hibrid növényben második idegen gén terméke kivédi az első idegen gén terméke által okozott mikrospóra működés gátlást, és ily módon hím-termékeny hibrid növényt állítunk elő.
19. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első idegen génként barnázt, és második idegen génként barnáz-inhibitort kódoló géneket tartalmazó expressziós vektorokat alkalmazunk.
20. 20. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első idegen génként diftéria toxint és második idegen génként diftéria toxin-ribozimot kódoló géneket tartalmazó expressziós vektorokat alkalmazunk.
21. 21. Eljárás hímsteril hibrid növény termékenységének helyreállítására, azzal jellemezve, hogy (a) a 8. azonosítási szám szerinti szekvenciát vagy (b) a 8. azonosítási szám szerinti szekvenciával legalább 65% hasonlóságot mutató nukleotid szekvenciát vagy (c) (a)- vagy (b)-szekvencia fragmensét tartalmazó mikrospóra-specifikus szabályozó elemet, promótert és idegen gént hordozó expressziós vektort tartalmazó hímsteril hibrid növényt flavonol aglikonnal kezelünk, amely expressziós vektorban a mikrospóra-specifikus szabályozó elem a promóterrel együtt az idegen gén expresszióját szabályozza, az idegen gén chalcone-szintáz antiszensz RNS-t expresszál, és ily módon flavonol-hiányos mikrospórák jönnek létre,
22. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy flavonol aglikonként kampferőit alkalmazunk.
23. 23. Eljárás vírus vagy rovar okozta betegséggel szemben ellenálló transzgenikus növény előállítására, azzal jellemezve, hogy:

    (a) a 8. azonosítási szám szerinti szekvenciát, (b) a

    8. azonosítási szám szerinti szekvenciával legalább 65% hasonlóságot mutató nukleotid szekvenciát vagy (c) (a)- vagy (b)-szekvencia fragmensét tartalmazó mikrospóra-specifikus szabályozó elemet, promótert és idegen gént tartalmazó expressziós vektort állítunk elő, amelyben a mikrospóra-specifikus szabályozó elem a promóterrel együtt az idegen gén expresszióját szabályozza, és az idegen gén terméke a vírus működését gátolja, vagy az idegen gén inszekticid hatású toxint kódol, és ily módon a betegséggel szemben ellenállóképesség alakul ki a növényben .
24. 24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az expressziós vektort embriogén növényi sejtbe juttatjuk.
25. 25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vírus-gátló idegen génként vírusburok-fehérjét, 2'-5'oligoadenilát-szintetázt, vírus-genom antiszensz RNS-t, vagy alkörmös antivirális fehérjét kódoló gént tartalmazó expressziós vektort állítunk elő.
26. 26. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy inszekticid hatású toxinként Bacillus thüringiensis endotoxint kódoló gént tartalmazó expressziós vektort alkalmazunk .