HUT75128A - Screening method using the rzr receptor family - Google Patents

Screening method using the rzr receptor family Download PDF

Info

Publication number
HUT75128A
HUT75128A HU9602670A HU9602670A HUT75128A HU T75128 A HUT75128 A HU T75128A HU 9602670 A HU9602670 A HU 9602670A HU 9602670 A HU9602670 A HU 9602670A HU T75128 A HUT75128 A HU T75128A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
receptor
rzr
ror
melatonin
compounds
Prior art date
Application number
HU9602670A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9602670D0 (en
Inventor
Martin Missbach
Irmgard Wiesenberg
Original Assignee
Ciba Geigy Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ciba Geigy Ag filed Critical Ciba Geigy Ag
Publication of HU9602670D0 publication Critical patent/HU9602670D0/hu
Publication of HUT75128A publication Critical patent/HUT75128A/hu

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6875—Nucleoproteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70567—Nuclear receptors, e.g. retinoic acid receptor [RAR], RXR, nuclear orphan receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Description

A találmány az RZR/ROR receptorcsaládba tartozó receptor vagy annak funkcionális fragmensének olyan vizsgálatokban való felhasználására vonatkozik, amely vizsgálatokban vegyületeket anti-autoimmun, arthritisellenes, tumorellenes, melatoninszerű és/vagy melatonin-antagonista hatás szempontjából tesztelünk. A találmány további tárgya olyan receptor-lígandum komplexek előállítása, amelyek a receptort vagy annak funkcionális fragmensét és a receptor ligandumát tartalmazzák. A találmány tárgya továbbá • · • ·
- 2 eljárás vegyületek tesztelésére az említett agonisták vagy antagonisták kiszűrésére (ligandumok szkrínelésére). Ismertetjük továbbá az eljárással azonosított aktív vegyületeket.
Kis lipofil molekulák mint a retinsav (retinoic acid, RA),
1,25-dihidroxi-Ü3 vitamin (VD), pajzsmirigy hormon (T3) és szteroid hormonok számos fejlődési és fiziológiai folyamatot szabályoznak gerincesekben és gerinctelenekben azáltal, hogy olyan specifikus receptorokhoz kötődnek, amelyek közvetlenül funkcionálnak transzkripciós faktorokként. Ezek a ligandumfüggő transzkripciós faktorok a sejtmagi receptor (nuclear receptor) szupercsalád tagjai.
A sejtmagi receptor szupercsaládba olyan szerkezetileg rokon fehérjék is tartoznak, amelyekre nézve még nem azonosítottak ligandumot, ezért ezeket árva receptoroknak (orphan receptors) nevezik [O'Malley et al., Mól. Endocrinol. 6, 1259-1361 (1992)].
Az ilyen árva receptorokra példák a peroxisoma-proliferátor aktiválta receptorok (PPAR-ek) és a csirke ovalbumin upstream promoter (a promoter előtt kapcsolódó) transzkripciós faktor (COUP-TF). A funkciókbeli nagy eltérés ellenére két konzervált zink-finger egység - amelyek a DNS-hez való kötődésben játszanak szerepet - jelenik meg e szupercsalád mind tagjában.
Az utóbbi időkben egy új árva receptorcsaládot azonosítottak reverz transzkripciós polimeráz láncreakciós (RT-PCR) stratégiával [Becker-Andre et al., Biochem. Biophis. Rés. Com. 194, 1371-1379 (1993); Becker-Andre et al., Keystone Symposium, Feb. 7-13,
1994, Taos, New Mexico, p 376]. Az RZR/ROR-ek monomerekként képesek specifikus válaszelemeikhez (response elements) kötődni, de úgy tűnik, hogy a kötőhelyek bizonyos helyzeteiben kölcsönhatnak
- 3 homodimerekként. Az RZR/ROR-ek konstitutív transzaktivációt mutatnak, és különböző megközelítések ellenére nem izoláltak eddig az RZR/ROR receptorcsaládnak megfelelő ligandumot, és ezért feltételezik, hogy az RZR/ROR-ek inkább konstitutív mint ligandum-indukálható transzaktiváclót hoznak létre.
Meglepő módon azt találtuk, hogy a melatonin az RZR/ROR receptorcsalád természetes liganduma. Korábban csak az volt ismert, hogy a melatonin egy olyan membránreceptor liganduma, amelyet a közelmúltban klónoztak békabőrből [Ebiswawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9±, 6133-6137 (1994)] és emlős szövetekből [Reppert et al. , Neuron, 13 , 1177-1185 (1994)]. A melatonin a tobozmirigy fő hormona, de a tobozmirigyen kívüli szövetekben is termelődik. Világosabbá teszi a kétéltűek bőrszínét azáltal, hogy visszafordítja az MSH (melanotropin) sötétítő hatását. A melatonin a fotoperiodikus információ transzmittere és az évszakonkénti reproduktív ciklusok szabályozója a fotoperiodikus állatokban. Azt is kimutatták, hogy a melatonin részt vesz a termoregulációban és a neuroimmunregulációban (Fraschini és Reiter, szerk., Plenum Press, N.Y., London 1991).
A melatoninnak rövid a felezési ideje állatokban és emberben, ezért meglepő a melatoninra nézve, hogy egy sejtmagi receptor liganduma.
Meglepő továbbá, hogy azonosítottak olyan szintetikus kémiai anyagokat, amelyek az RZR/ROR receptorcsalád mesterséges ligandumainak bizonyultak. Ezek a vegyületek ismertek, és anti-autoimmun, arthritisellenes és/vagy tumorellenes hatással rendelkeznek (EP-A-494047, EP-A-508955, EP-A-548017, EP-A-548018 számú európai szabadalmi bejelentések, valamint a CH-511877 számú • · ;
- 4 • · · · · ·· · ······ • · · · · · ·· · » · ··· svájci és a BE-753532 számú belga szabadalmi bejelentések).
Ezeket a tulajdonságokat be lehet mutatni in vivő kísérletben, például az adjuváns arthritis modellel patkányokban Wiesenberg et al. , Clin. Exp. Immunoi, 78 , 245 (1989) közleménye szerint és a DMBA-tumor modellel patkányokban [Schmidt-Ruppin et al., Experientia, 29, 823-825 (1973)].
Ismeretes, hogy ezek a vegyületek és gyógyszerészetileg elfogadható sóik értékes farmakológiai tulajdonságokkal rendelkeznek reumaszerű típusba sorolható betegségek kezelésében. Ezek közé a betegségek közé tartozik különösen a rheumatoid arthritis, fiatalkori arthritis, ankylosisos spondylitis és más szeronegatív csigolyaizületi gyulladások, a fekélyes vastagbélgyulladás és a Crohn-féle betegség, továbbá a reaktív arthritisek, a kollagén betegségek, úgymint a bőrfarkas (lupus erythematosus) és a scleroderma, a degeneratív reumás betegségek, ízületen kívüli reumatikus és parareumatikus betegségek, például a köszvény, az osteoarthritis és az osteoporosis. Az ilyen típusú vegyületeknek továbbá immunmoduláló és tumorellenes hatása van, és ennélfogva általánosan adagolhatóak a tumor terápiában és az autoimmun alapú vagy rokon betegségek, úgymint sclerosis multiplex, Hashimoto thryditis, fiatalkori diabetes és a psoriasis esetében.
Nem volt várható vagy megjósolható, hogy ezek a vegyületek a RZR/ROR receptorcsalád 1igandumaiként is funkcionálhatnak. A megfigyelt anti-autoimmun, arthritisellenes és/vagy tumorellenes hatás azt jelenti, hogy a ligandumnak a receptorhoz való kötődése megnöveli a receptor affinitását a génekben lévő azon specifikus DNS-régiókkal (az ún. hormonválasz elemekkel) szemben, amelyek részt vesznek a sejtek proliferációjának és/vagy differenciálódát • · • ·
- 5 sának a szabályozásában. Ezen válaszgének transzkripciója vagy serkentődik vagy csillapítódik (up or down regulated) a ligandum-receptor komplex kötődése után. Ezen új felismerések alapján lehetővé válik, hogy ezt a receptorcsaládot további olyan vegyületek (ligandumok) szkrínelésére használjuk fel, amelyeknek anti-autoímmun, arthritisellenes, tumorellenes, melatoninszerű és/vagy melatonin-antagonista hatásuk van.
A találmány tehát előnyösen az RZR/ROR receptorcsaládba tartozó receptor vagy annak funkcionális fragmensének olyan tesztekben való alkalmazására vonatkozik, amely tesztekben anti-autoimmun, arthritisellenes, tumorellenes, melatoninszerű és/vagy melatonin-antagonista hatású vegyületeket azonosítunk.
Ezeket a vegyületeket (ligandumokat) általában agonista vagy antagonista aktivitásuk megállapítására tesztelhetjük az RZR/ROR receptorcsalád tekintetében.
Az RZR/ROR receptorcsalád olyan sejtmagbeli receptorokat foglal magában, amelyek számos doménből állnak, és mindegyik doménnak specifikus funkciója van. A sejtmagi receptorok általában a transzkripció szupressziója vagy aktiválása útján hatnak azután, hogy a ligandum a receptorhoz kötődik. Az RZR/ROR receptorcsalád tagjai affinitást mutatnak bizonyos fajtájú ligandumok iránt. Az RZR/ROR család egyes tagjai például képződhetnek az adott receptort kódoló közös DNS-ről kódolt termék alternatív splicingjával (darabolódásával).
Ezen receptorok funkcionális fragmensei például olyan szerkezetek, amelyek a ligandum szelektivitás tekintetében azonos tulajdonságokkal rendelkeznek, például olyan szerkezetek, amelyek tartalmazzák az RZR/ROR receptorcsalád valamely receptorának a • · • · · · ······ ·*···· · · • · ·· ·« · *··
- 6 ligandumkötő doménjét és a DNS-kötő doménjét, de nem tartalmaznak más domént, vagy amelyekbe más, az RZR/ROR-nek speciális tulajdonságot kölcsönző proteinfragmensek épültek be. Lehetnek ezek között olyan fragmensek is, amelyek a ligandumkötő doménnak más olyan fragmensekkel való kombinációjával vannak felépítve, amelyek lehetővé teszik annak eldöntését, hogy a ligandum kötve van vagy nem, ilyen például egy másik DNS-kötő dómén; vagy olyan szerkezetek, amelyekben a ligandumkötő dómén egy spacer csoporton keresztül szilárd hordozóhoz van kötve a ligandumok szelektív megkötésére (fishing).
Az RZR/ROR-ek fragmenseit, beleértve a funckionális ligandumkötő domént, jelezhetjük továbbá egy vagy több olyan csoporttal, amelyek könnyen azonos!thatóak, például fluoreszcens, kérni lumineszcens vagy radioaktív csoporttal, vagy kapcsolhatjuk avidinhoz, biotinhoz, riporter enzimhez (jelzőenzimhez) vagy bármely olyan csoporthoz, amely könnyen detektálható spektroszkópiás vagy immunogén módszerekkel, így NMR, IR, UV, MS és ELISA mérésekkel. Az ilyen típusú konstrukciókat felhasználhatjuk vegyületkönyvtarak szkrínelésére, amint azt például a Walter et al., TIBTECH, 11, 247-254 (1993) közlemény ismerteti.
Az RZR/ROR receptorcsalád legelőnyösebb tagjai az RZR/RORa, RZR/RORS az RZR/RORy [Hirose et al., Biochem. Biophys. Rés. Comm. 205, 1976-1983 (1994)] . Az RZR/ROR-eket felhasználhatjuk monomerekként vagy dimerekként, ez utóbbiakba beleértendők a homodimerek és a heterodimerek. Ugyancsak alkalmazhatók lehetnek a splicing variánsok, mint az RORal (Giguere et al., Genes and Development 8_, 538-553 (1994) és hasonlók.
• · · · · · · • ·· · ··· ··· ·«···· · · ·· ·· ·· · ···
- 7 Az eddig felismert és az előbbiekben említett szintetikus ligandumok értékes farmakológiai tulajdonságokkal rendelkeznek az autoimmun, reumatoid és/vagy tumor típusú betegségek kezelésében.
A találmány további tárgya eljárás vegyületek anti-autoimmun, arthritisellenes, tumorellenes, melatoninszerű és/vagy melatonin-antagonista aktivitásának tesztelésére, azzal jellemezve, hogy
a) transzfektálunk egy alkalmas gazdaszervezetet olyan expressziós kazettával, amely az RZR/ROR receptorcsalád valamely receptorát vagy annak funkcionális fragmensét kódolja;
b) az említett receptornak megfelelő egy vagy több válaszelemet (response element) és egy riporter gént (reporter gene) egyesítünk és a gazdaszervezetet ezzel a szerkezettel kotranszfektálj uk;
c) hozzáadjuk a tesztelni kívánt vegyületet;
d) mérjük a riporter gén expresszióját.
Az RZR/ROR receptorcsalád receptorait vagy azok funkcionális fragmenseit az előbbiekben definiáltuk.
A gazdaszervezet előnyösen endogén RZR/ROR-től mentes, vagy genetikailag módosítva van, hogy RZR/ROR-től mentes legyen mielőtt transzfektáljuk az RZR/ROR receptorcsalád egy receptorát vagy annak egy funkcionális fragmensét kódoló expressziós kazettával. Előnyös gazdaszervezet például egy baktériumsejt, gomba-, mint például élesztősejt, rovar- vagy emlőssejt. Különösen előnyösek az Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae és a Drosophila sejtek.
Az RZR/ROR receptorcsalád valamely receptora vagy annak funkcionális fragmensének az expressziós kazettái általában tartalmaznak egy promotert, amely operábilisan vagy kapcsolva egy ··· ···
- 8 olyan DNS szekvenciához, amely az RZR/ROR receptorcsalád egy receptorát vagy annak funkcionális fragmensét kódolja és egy olyan DNS szekvenciához, amely transzkripciós terminációs szignálokat tartalmaz.
Alkalmas promoter és termmátor szekvenciákat előnyösen úgy választunk, hogy aktívak legyenek az említett gazdaszervezetben; ezek a szakember számára ismertek. Ezeket egyesíthetjük a struktúrgénnel és adott esetben egy marker csoporttal és más kedvező elemekkel, standard géntechnológiai eljárások alkalmazásával.
Nem korlátozó jellegű példák az előbbiekre a TRP1 gén promotere, az ADHT vagy ADHII gén, savas foszfatáz (PH 05) gén, CUP1 gén, izocitokróm c gén promoterei vagy glikolitikus enzimeket kódoló gének promoterei úgymint TDH3, gliceraldehid-3 -foszfát dehidrogenáz (GAPDH), a GAPDH rövidített változata (GAPFL) , 3-foszfoglicerát kináz (PGK), hexokináz, piruvát dekarboxiláz, foszfofruktokináz, glükóz - 6 - foszfát izomeráz, 3-foszfoglicerát rautáz, piruvát kináz, triózfoszfát izomeráz, foszfoglükóz izomeráz, invertáz és glükokináz gének promoterei vagy az élesztő egy ivari feromonját (a- vagy α-faktort) kódoló gének promotere.
Az expressziós kazetta beépítésére szolgáló transzfekciós eljárások, például plazmid útján vagy a genomba való integrálás útján, általánosan ismertek ég könnyen adaptálhatók arra a kazettára, amely az RZR/ROR receptorcsalád valamely receptorát vagy annak funkcionális fragmensét tartalmazza.
A válaszelemek ismertek, és rendszerint a tesztben alkalmazott RZR/ROR DNS-kötő doménjének specificitásával összhangban választjuk meg azokat. Az RZR/ROR receptorcsalád számára alkalmas • * · · · · · • ·· · ·«··«· • · · · · · · ·· ·· ·· · ··« válaszelemek tartalmazzák például a központi DNS-mag felét (core half site), amelynek szekvenciája T(A/G)GGTCA.
Például a RZR/RORu számáa előnyös válaszelem az NANNT(A/G)GGTCA.
A válaszelem(ek)et rendszerint egy olyan rövid fragmens útján inszertáljuk, amelynek alkalmas restrikciós helyei vannak, vagyis például DNS-szintetizátorral szintetizáljuk úgy, hogy megfelelő végekkel legyen(ek) ellátva arra, hogy szokásos módon integrálhassuk a riporter génbe vagy annak közelébe. így például a riporter gént alkalmas restrikciós enzimekkel hasítjuk, és inszertáljuk a válaszelemet. A riporter génbe vagy annak közelébe kifejezés olyan helyet jelent, amely képes arra, hogy befolyásolja a riporter gén transzkripcióját a receptorhoz való kötődéskor. Az RZR/ROR-ek transzkripciós aktivációs tulajdonságai folytán a válaszelemet előnyösen a riporter gén transz vagy cisz transzkripciós aktivációs helyein inszertáljuk, hogy szabályozza a transzkripciót ha egy alkalmas ligandum kötődött a ligandumkötő doménra.
A riporter gének expresszióját mérhetjük például transzkripciós vagy transzlációs szinten, így mérhetünk termelt fehérje mennyiséget, enzimaktivitást vagy sejtnövekedést. Az alkalmas riporter gének jól ismertek. Ezekre példa a kloramfenikol acetiltranszferáz (CAT), β-D-galaktozidáz (lacZ) vagy a bakteriális hibrid luciferáz (luxAB).
Egy más megközelítés a vegyületek szkrínelésére ligandum aktivitás tekintetében az, hogy létrehozunk egy könyvtárat, amely nagy mennyiségű különböző vegyületből áll (vegyületkönyvtár). A receptorokat, például az RZR/ROR-eket vagy azok fragmenseit, • ·· · ······ ···>·» * * • · ·· ·· · ···
- 10 amelyek könnyen detektálható csoportot tartalmaznak (lásd előbb), inkubáljuk ezzel a könyvtárral, és azonosítjuk azokat a vegyületeket, amelyek kötődtek a receptorokhoz. A vegyületkönyvtárak építését széles körben ismerteti a szakirodalom, így például Jung et al., Angewandte Chemie, 104, 375-391 (1992) és az egy gyöngy-egy szekvencia könyvtárakat Kerr et al., J. Am. Chem. Soc.,
115, 2529-2531 (1993) .
A találmány további tárgya eljárás receptor-ligandum komplex előállítására, azzal jellemezve, hogy az RZR/ROR receptorcsalád valamely receptorát vagy annak funkcionális fragmensét inkubáljuk egy olyan vegyülettel, amelynek anti-autoimmun, arthritisellenes, tumorellenes, melatoninszerü és/vagy melatonin-antagonista aktivitása van.
Az RZR/ROR receptorcsalád receptorait vagy azok funkcionális fragmenseit a fentiekben leírtak szerint állítjuk elő, például expresszióval egy alkalmas gazdaszervezetben vagy a természetes környezetből való izolálással [Becker-André et al., Biochem., Biophys. Rés. Com. 194, 1371-1379 (1993)].
Az inkubációs eljárás attól az eljárástól függ, amellyel a receptort nyerjük. Ha például alkalmas gazdaszervezetben történő expresszióval állítjuk elő a receptort, amint azt a fentiekben leírtuk, a tesztvegyületet közvetlenül hozzáadhatjuk a sejtszuszpenzióhoz, vagy ha a vegyületek nern képesek áthatolni a sejtmembránon, alkalmas vivőanyagokat (carrier) kell adagolnunk vagy sejtmentes rendszert kell alkalmaznunk.
Abban az esetben, ha vegyületkönyvtárakat tesztelünk, a receptort rendszerint ennek a könyvtárnak az oldatához vagy szuszpenziójához adjuk hozzá. Ha a receptort rözgítjük egy
- 11 • · · * ··» » *· oldhatatlan hordozóanyaghoz mint egy gyöngyhöz (bead), kis rúdhoz, fóliához vagy cellulózpapírhoz, szintén hozzáadhatjuk a vegyületkönyvtárat a receptorhoz, például úgy, hogy a könyvtárat egy oszlopra adagoljuk, amely a rögzített receptort tartalmazza.
A receptorokon megkötődő vegyületek (ligandumok) azonosítása attól függ, hogyan nyertük a vegyületeket és/vagy a receptorokat. Azon receptorok esetén, amelyek sejtben fejeződnek ki, és amelyek egy riporter gén szabályozó szekvenciájához kötődnek, a vegyületet azonosíthatjuk a riporter gén transzkripciós vagy transzlációs terméke révén; vagy vegyületkönyvtárak szkrínelése esetén, például egy göngy-egy szekvencia könyvtár esetén a gyöngyöket, amelyeknek kötött receptoraik vannak, izolálhatjuk, és a gyöngyökhöz kötődött ligandumot azonosíthatjuk.
A találmány további tárgyát képezi az új ligandumok alkalmazása - amelyeket a fentiek szerint azonos!tottunk, hogy az RZR/ROR receptorcsalád valamely receptorához vagy annak funkcionális fragmenséhez kötődnek - kezelési eljárásokban, különösen autoimmun betegségek, arthritises betegségek, tumorok kezelési eljárásában vagy olyan betegségek kezelési eljárásában, ahol rendszerint melatonint vagy melatonin agonistát vagy antagonistát alkalmaznak, és előnyösebben autoimmun betegségek, arthritises betegségek és/vagy tumorok kezelési eljárásában.
Minthogy mindeddig nincsenek melatonin-antagonista tulajdonságú ligandumok az RZR/ROR receptoron, farmakológiai profiljuk, és lehetséges terápiás értékük jelenleg nem ismeretes.
Az RZR/ROR receptorok alkalmas ligandumai például a melatonin vagy a melatonin származékok, amint azt például az EP-585206 számú európai szabadalmi leírás ismerteti.
- 12 « · · · « * · • S1 · ····· »««··« · · ·· «« ·· * ···
További vegyületek, amelyek az RZR/ROR receptorcsaládhoz kötődnek, például az (1)-(17) általános képletű vegyületek, ahol az (1) és (2) általános képletekben
Rj_ és jelentése 3-5 szénatomos alkilcsoport, 3-5 szénatomos alk-2-én-1-il-csoport vagy 3-5 szénatomos alk-2 - in-1-il-csoport; és különösen allilcsoport, metál1ilcsoport és propinilcsoport;
R2 és Rg jelentése hidrogénatom, 1-5 szénatomos alkilcsoport, 3-5 szénatomos alk-2-én-1-il-csoport, 3-5 szénatomos alk-2-in-l-il-csoport, arilcsoport, aril-(rövidszénláncú alkil)-csoport , telített vagy telítetlen heterociklil-(rövidszénláncú alkil)-csoport vagy rövidszénláncú alkoxi-karbonil)-(rövidszénláncú alkil)-csoport. ;
Rg és R4 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy rövidszénláncú alkilcsoport vagy R^ és R4 együttvéve rövidszénláncú alkilidéncsoport képez;
X jelentése oxocsoport vagy szulfőcsoport; vagy a (3) általános képletű vegyületek, ahol
Rg4 és R35 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, metoxicsoport vagy fluoratom;
R3g jelentése hidrogénatom vagy metoxi-karbonil-csoport;
Rg7 jelentése oxocsoport vagy szulfocsoport;
jelentése hidrogénatom, 1 -6 szénatomos alkilcsoport, ciklopropilcsoport, ciklobutilcsoport, ciklopentilcsoport, ciklohexilcsoport, brómatommati. , klóratommal, fluoratommal vagy jódatommal szubsztituált 1.-6 szénatomos alkilcsoport, fenil3!
csoport, szubsztituálatlan vagy halogénatommal szubsztituált (1-3 szénatomos alkil)-fenil-csoport, indolilcsoport, ♦
λ • · ··
- 13 ··· ··· fc »·♦ morfolinocsoport, metil-morfolino-csoport, aminocsoport, 1-4 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált aminocsoport vagy
1- (2' ,3' ,41 -trimetoxi-benzil) -piperazin-metil-csoport, 2 -pirrolidinoncsoport;
g jelentése hidrogénatom, metilcsoport vagy fluoratom;
R4q jelentése szénatom vagy nitrogénatom,· R41 jelentése szénatom vagy nitrogénatom vagy karbonilcsoport;
R42 jelentése szénatom, nitrngénatom vagy kénatom vagy viniléncsoport;
az R40 θ5 ^-41 szubsztituensek közötti kötés egyeskötés vagy kettőskötés lehet azzal a megkötéssel, hogy egyeskötés akkor, ha R4I jelentése karbonilcsoport vagy R^g jelentése nitrogénatom.
A találmány tárgykörébe tartoznak továbbá azok a pro-drogok, amelyek in vivő metabolizmusa folyamán az előbbiekben megadott vegyületek keletkeznek.
E vegyületek előállítási eljárását, továbbá e vegyületek anti-autoimmun, arthritis ellenes és/vagy tumorellenes hatásának példáit ismertetik például a következő közelmények: az EP-447285,
EP-A-494047, EP-506539, EP-A-508955, EP-527687, EP-530087, EP-A548017, EP-A-548018, EP-562956, EP-578620, EP-A-585206, EP-591057 számú európai szabadalmi leírások, illetve bejelentések, az 5283343 és 5206377 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások, továbbá Depreux et al., J. Med. Chem., 37, 3231-3239 (1994), Garrat és Vonhoff, Bioorganic & Medicinái Lett., 4, 1559-1565 (1994) és Copinga et al., J. Med. Chem., 36, 2819-2898 (1993) .
A találmány tárgykörén belül továbbá alkalmas vegyületek például:
• · • · · · • · · · · ·
- 14 a (4) általános képletű vegyületek, ahol
Rg jelentése hidrogénatom; Rg jelentése brómatom; és R7 jelentése metilcsoport; vagy
Rg jelentése hidrogénatom; Rg jelentése jódatom; és R7 jelentése metilcsoport; vagy
Rg jelentése klóratom,· Rg ielentése hidrogénatom; és R7 jelentése metilcsoport; vagy
Rg jelentése hidrogénatom, Rg jelentése metilcsoport; és R7 jelentése klór-propil-csoport; vagy az (5) általános képletű vegyületek, ahol
R10 jelentése CH csoport; és R^j jelentése szulfo- vagy oxocsoport; vagy R10 jelentése oxocsoport vagy NH csoport; és jelentése NH csoport; vagy a (6) általános képletű vegyületek, ahol r12 jelentése oxo- vagy szül főcsoport; és R13 jelentése
CHCH2CH2CH3 képletű csoport; vagy
R12 jelentése oxocsoport és R-^g jelentése metilcsoport; vagy a (7) általános képletű vegyületek, ahol
R-]_4 jelentése oxo- vagy szül főcsoport; vagy a (8) általános képletű vegyületek, ahol
RfS jelentése oxo- vagy szül főcsoport;
a (9) általános képletű vegyületek, ahol
Rfg jelentése metilcsoport, etilcsoport vagy klór-metil-csoport; vagy a (10) általános képletű vegyületek, ahol
R17 jelentése metilcsoport, etilcsoport vagy klór-metil-csoport;
vagy • · *
- 15 • ·· · ······ • · · · · · · • · ·· ·· · ··· vagy a (11) általános képletű vegyületek, ahol
R-20 jelentése NH csoport, CH=CH csoport, oxo- vagy szulfocsoport; R]_q jelentése oxo- vagy szül főcsoport ;
R}_9 jelentése hidrogénatom, metilcsoport, etilcsoport vagy propilcsoport; vagy a (12) általános képletű vegyületek, ahol
R21 jelentése metoxiesoport vagy hidrogénatom;
r22 jelentése NH csoport, CH=CH csoport, szulfocsoport vagy oxocsoport; és
R23 jelentése metilcsoport, ciklopropilcsoport vagy ciklobutilcsoport; vagy a (13) általános képletű vegyületek, ahol
R24 jelentése hidrogénatom vagy metoxiesoport;
r25 jelentése metilcsoport, etilcsoport, propilcsoport, CF3 csoport, CH2Br csoport, CHBrC^C^ csoport, ciklopropilcsoport vagy ciklobutilcsoport; vagy a (14) általános képletű, ahol
R27 jelentése metoxiesoport;
R28 jelentése hidrogénatom vagy COOCH3 csoport;
R29 jelentése hidrogénatom, metilcsoport vagy fluoratom; és R30 jelentése hidrogénatom, metilcsoport, etilcsoport, butilcsoport, propilcsoport, pentilcsoport, hexilcsoport, izopropilcsoport, CH=CHCH3 csoport, ciklohexilcsoport, CH2Br csoport, CH2I csoport, CF3 csoport, ΟβΗςΟί csoport, fenilcsoport, 3,5-diklór-fenil-csoport, 2-indolilcsoport, toluolcsoport, 01(05¾¾ csoport, (CH2)2C6H5 csoport, (013)305¾ csoport, metil-morfolino-csoport, 1-(2',3' ,4'-trimetoxi<
t • · · · · · · • ·· · ······ ······ · · • · «· · · · ···
SO2CH3 csoport; vagy a (15) általános képletú vegyületek, ahol
R31 jelentése NH csoport, oxo- vagy szulfocsoport,
R32 jelentése hidrogénatom vagy fluoratom; és
R33 jelentése propilcsoport, butilcsoport, CH2I csoport, CF3 csoport vagy metilcsoport; vagy a (16) általános képletú vegyületek, ahol
R7 jelentése hidrogénatom '/agy 1-3 szénatomos alkilcsoport;
Rg jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport, arilcsoport, hidroxi
-aril-csoport vagy halogénatom; és
Rg jelentése 1-5 szénatomos alkilcsoport vagy halogénatom; továbbá a (17) általános képletű vegyületek, ahol
Rjq jelentése hidrogénatom vagy metoxicsoport; és R11 jelentése 1-3 szénatomos alkilcsoport, arilcsoport, aril-alkil-csoport vagy halogénatommal szubsztituált 1-3 szénatomos alkilcsoport.
Különösen megemlítendők a (18)-(34) képletű vegyületek.
A találmány további tárgyát képezi melatonin antagonista vagy agonista vegyületek; így előnyösen az (1), (2), (3) általános képletű vegyületek; előnyösen a (4)-(17) általános képletű vegyületek; és legelőnyösebben a (4)-(10) általános képletű, valamint a (18)-(34) képletú vegyületek alkalmazása az RZR/ROR receptorcsalád aktivitásának módosítására, és e vegyületek közül egy vagy több alkalmazása az RZR/ROR receptorcsalád antagonistájaként vagy agonistájaként.
<' *·, • ·
- 17 1. Példa: Az expressziós rendszer összeállítása
A ligandum indukálta aktiváció tesztjét lényegében a Carlberg et al., Natúré, 361, 657-660 (1993) közlemény szerint végezzük.
Az RZR/ROR válaszelemeit Xbal túlnyúlásokat (ragadós vég) tartalmazó kétfonalas oligonukleotidokként klónozzuk egy CAT riporter plazmidba (pBLCAT2) [Luckow et al., Nucleic Acids Rés., 15, 5490 (1987)], amelynek tk promotere előtt Xbal hely van. Ezt az inszertet automatikus DNS-szintetizátorral szintetizáljuk, és a felső szál válaszelemének a szekvenciájára a SEQ ID NO: 1 szekvenciáját adjuk meg:
GTAGGTCATGACCTAC SEQ ID NO: 1
Drosophila SL-3 sejteket [2xl06 60 mm-es Petri-csészékként; J. Embryol. Expl. Morphol., 22, 353-365 (1972)] tenyésztünk egy éjjelen át Schneider-féle médiumban (Gibco), melyet 15% aktívszénnel kezelt fetális borjúszérummal egészítettünk ki. Transzfekció céljából liposzómákat hozunk létre úgy, hogy 5 gg riporter plazmidot (válaszelem inszerttel), 3 gg referencia plazmidot (pRSVS-gal) és 1 μg RZR/RORa expressziós vektort [Carlberg et al., Natúré, 361, 657-660 (1993)] 11 gg N-[1-(2,3-dioleil-oxi)-propil]-N,N,N-trimetil-ammónium-metil-szulfáttal (Boehringer-Mannheim) inkubálunk 15 percen át szobahőmérsékleten 100 gl ossztérfogatban. Miután 0,9 ml Schneider-féle médiummal felhígítottuk, a liposzómákat hozzáadjuk a sejtekhez.
2. példa: A szelektivitás tesztelése
A vizsgálandó vegyületeket (etanolban oldva, teszt koncentráció 1 gM, lásd 1. táblázat), amelyekről ismert, hogy aktívak a
ι • · ·
-iájuk a sejtekhez 8 órával azután, hogy RZRa-val transzfektáltunk. 40 óra múlva összegyűjtjük a sejteket, és meghatározzuk a CAT aktivitást [CAT meghatározás, standard géntechnológiai eljárás, lásd például Gorman et al . , P-ioiec. Cél. Bioi, 2, 1044-1051 (1982)]. Az 1. táblázatban meuadott értékek a CAT aktivitások átlagos aktivációját mutatják be három független kísérlet mérései alapján, összehasonlítva a tiszta oldószer (etanol) hozzáadásával kapott eredményekkel. A találmány szerinti vegyületek specifikus hatásának bemutatására a kiserieteket elvégeztük párhuzamosan a D3 vitamin receptorral (VDR) és a retinsav receptorokkal (RAR és RXR) , úgy, hogy válaszelemként: a SEQ ID NO: 2 és 3 szekvenciákat [Carlberg et al. , Natúré, 3 6 1, 657-660 (1993)] alkalmaztuk.
AGAGGTCAAGGAGGTCACT SEQ ID NO: 2
AGGGTTCACCGAAAGTTCA SEQ ID NO: 3 t ’ • · · · · ·
1. táblázat: A szelektivitás vizsgálatának eredményei ······ · · • · ·· ·· · · · ·
Vegyület A CAT expresszió fold stimulációja aktiválás adjuváns válaszelem
RZRa VDR RAR RXR arthritisben
(3) 3,25 1,2 1, 1 1 , o SEQ 1
(4) 4,5 1,2 1 , 2 1,0 + SEQ 1
(5) 5,2 1,0 1 , o 0,9 -h SEQ 1
(6) 5 , 0 1,2 0, 9 1,0 + SEQ 1
melatonin 4,8 1,1 1 , 1 1,2 φ SEQ 1
D vitamin 0,9 10,3 1 , 0 1,0 - SEQ 2
tiszta
transz RA 1,2 1,0 10,4 1,5 - SEQ 3
9 -c i s z RA 1,1 2,1 1 , 4 5,3 - SEQ 3
A táblázat világosan mutatja, hogy az RZR/RORa válasza specifikus a vegyületek egy bizonyos osztályára nézve.
3. példa: A dózis válasz vizsgálata
A vizsgálandó vegyületek különböző mennyiségeit adjuk az olyan tesztrendszerekhez, amelyek a (3), (4), (6) vegyületeket vagy melatonint tartalmaznak a 2. táblázat szerint, továbbá RZR/RORa-t és SEQ ID NO: 1-et, amint azt a 2. példában ismertettük (lásd 2. táblázat).
• · ···»»· · · ·· · · ·· · ···
2. táblázat: A dózis válasz tesztelése
Koncentráció Fold stimuláció, ha a vegyület
[nM] (3) (4) (6) melatonin
1000 4,2 4 , 1 5,1 4,8
333 4,4 4 , 0 5,2 5,0
100 4,3 4 , 2 5, 0 5,0
33 4,15 4 , 1 4,3 5,0
10 2,9 4,2 2 , 3 3,0
3,3 1,8 4,0 1,4 2,1
1 1,3 2 , 5 1, 1 1,0
0,33 1,1 1,7 1, o 1,0
0,1 0,9 1,3 1,1 1,0
0 1,0 1,0 1,0 1,0
Ez a példa bemutatja a 3, 4, 6 vegyületek és a melatonin nagy affinitását az RZR/RORa receptorral szemben, ha nanomolos koncentrációtartományban alkalmazzuk azokat.
Az adott tesztvegyületek specificitása (1. táblázat) és affinitása (2. táblázat) összehasonlítható volt, ha akár az
RZR/RORu-t akár az RZRS-t alkalmaztuk.
4. példa: A felismerő helyek tesztelése
A tesztet a 2. példában leírt módon megismételjük a (3) vegyületet alkalmazva RZR/ROR-en és az alábbi válaszelemeket
AGAGGTCAAAAGGTCA SEQ ID NO : 4
TGACCTACTTATAAGTAGGTCA SEQ ID NO : 5
GTAGGTCACTATAAGTAGGTCA SEQ ID NO : 6
TCAGGTCATGACCTGA SEQ ID NO: 7
GTAGGT CATAAGTAGGT CA SEQ ID NO : 8
A CAT aktivitás növekedését (lásd 1. példa) az oldószerhez viszonyítva a 3. táblázat foglalja össze.
3. táblázat: A CAT aktivitás az oldószerhez viszonyítva
SEQ ID NO Fold stimuláció az oldószerhez viszonyítva
4 6 , 8
5 1,75
6 5,8
7 6,2
8 1,8
A példa azt mutatja be, hogy a válasz specifikus a válaszelemben lévő bizonyos szekvenciára.
• ·
- 22 Szekvencia jegyzék (1) Általános információk:
(i) Bejelentő:
(A) Név: Ciba-Geigy AG (B) Utca: Klybeckstr. 141 (C) Város: Basel (E) Ország: Svájc (F) Irányítószám: 4002 (G) Telefon: +41 61 69 11 11 (H) Telefax: +41 61 696 79 76 (I) Telex: 962 991 (ii) A találmány címe: Szkrinelési eljárás az RZR receptorcsalád alkalmazásával (iii) Szekvenciák száma: 8 (iv) Számítógépi olvasható forma:
(A) Közepes típus: Floppy disk (B) Számítógép: IBM PC kompatibilis (C) Operációs rendszer: PC-DOS/MS-DOS (D) Szoftver: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (2) Információk a SEQ ID NO: 1 számú szekvenciáról (i) Szekvencia jellemzők:
(A) Hossz: 16 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyes (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (genomikus)
- 23 (ix) Jellemzők:
(A) Név/kulcs: fehérje kötés (B) Hely: 1..16 (D) Egyéb információ: /kötött molekularész = RZR/ROR /standard név = POTT (xi) Szekvencia leírás: SEQ ID NO: 1
GTAGGTCATG ACCTAC 16 (2) Információk a SEQ ID NO: 2 számú szekvenciáról
(1) Szekvencia jellemzők: (A) Hossz: 19 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyes (D) Topológia: lineáris
(ii) Molekulatípus: DNS (genomikus) 1
(ix) Jellemzők: (A) Név/kulcs: fehérje kötés (B) Hely: 1..19
(D) Egyéb információ: /kötött molekularész
(xi) Szekvencia leírás: SEQ ID NO: 2
AGAGGTCAA GGAGGTCACT 19
(2) Információk a SEQ ID NO: 3 számú szekvenciáról (i) Szekvencia jellemzők:
(A) Hossz: 19 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyes (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (genomikus)
- 24 (ix) Jellemzők:
(A) Név/kulcs: fehérje kötés (B) Hely: 1..19 (D) Egyéb információ: /kötött molekularész = RXR és RAR (xi) Szekvencia leírás: SEQ ID NO: 3
AGGGTTCACC GAAAGTTCA 19 (2) Információk a SEQ ID NO: 4 számú szekvenciáról (i) Szekvencia jellemzők:
(A) Hossz: 16 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyes (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (genomikus) (ix) Jellemzők:
(A) Név/kulcs: fehérje kötés (B) Hely: 1..16 (D) Egyéb információ: /standard név = CRUBPI (xi) Szekvencia leírás: SEQ ID NO: 4
AGAGGTCAAA AGGTCA 16 (2) Információk a SEQ ID NO: 5 számú szekvenciáról (i) Szekvencia jellemzők:
(A) Hossz: 22 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyes (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (genomikus) t i
I» ··· ···
- 25 (ix) Jellemzők:
(A) Név/kulcs: fehérje kötés (B) Hely: 1..22 (D) Egyéb információ: /standard név = IP10 (xi) Szekvencia leírás: SEQ ID NO: 5
TGACCTACTT ATAAGTAGGT CA 22 (2) Információk a SEQ ID NO: 6 számú szekvenciáról (i) Szekvencia jellemzők:
(A) Hossz: 22 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyes (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (genomikus) (ix) Jellemzők:
(A) Név/kulcs: fehérje kötés (B) Hely: 1..22 (D) Egyéb információ: /standard név = DR8 (xi) Szekvencia leírás: SEQ ID NO: 6
GTAGGTCACT ATAAGTAGGT CA 22 (2) Információk a SEQ ID NO: 7 számú szekvenciáról (i) Szekvencia jellemzők:
(A) Hossz: 16 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyes (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (genomikus) ·
- 26 • · · · · · · • ·· · ······ ······ · · • · ·· ·· · ··· (ix) Jellemzők:
(A) Név/kulcs: fehérje kötés (B) Hely: 1..16 (D) Egyéb információ: /standard név = TREpalPO (xi) Szekvencia leírás: SEQ ID NO: 7
TCAGGTCATG ACCTGA 16 (2) Információk a SEQ ID NO: 8 számú szekvenciáról (i) Szekvencia jellemzők:
(A) Hossz: 19 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyes (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (genomikus) (ix) Jellemzők:
(A) Név/kulcs: fehérje kötés (B) Hely: 1..19 (D) Egyéb információ: /standard név = DR5GT (xi) Szekvencia leírás: SEQ ID NO: 8
GTAGGTCATA AGTAGGTCA

Claims (25)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Az RZR/ROR receptorcsalád valamely receptorának vagy annak funkcionális fragmensének alkalmazása olyan tesztekben, amelyekben anti-autoimmun, arthritisellenes, tumorellenes, melatoninszerű és/vagy melatonín-antagonista hatású vegyületeket azonosítunk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti receptor alkalmazása, ahol a receptor RZR/RORa, RZR/RORfi vagy RZR/ROR^<
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti receptor alkalmazása, ahol a receptor RZR/RORa.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti receptor alkalmazása, ahol a receptor monomer vagy diiner.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti receptor fragmensének alkalmazása, ahol a funkcionális fragmens a funkcionális ligandumkötő domént tartalmazza.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti receptor olyan fragmensének alkalmazása, amely egy vagy több könnyen azonosítható csoporttal van jelezve.
  7. 7. Eljárás vegyületek anti-autoimmun, arthritisellenes, tumorellenes, melatoninszerű és/vagy melatonin-antagonista aktivitásának tesztelésére, azzal jellemezve, hogy
    a) transzfektálunk egy alkalmas gazdaszervezetet olyan expressziós kazettával, amely az 1. igénypont szerinti valamely receptort kódolja;
    b) az említett receptornak megfelelő egy vagy több válaszelemet (response element) és egy riporter gént (reporter gene) • I» • · · · · ·
    - 28 egyesítünk és a gazdaszervezetet ezzel a szerkezettel kotranszfektálj uk;
    c) hozzáadjuk a tesztelni kívánt vegyületet;
    d) mérjük a riporter gén expresszióját.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, ahol az RZR/ROR receptor RZR/RORa, RZR/RORÜ vagy RZR/ROR^.
  9. 9. A 7. igénypont szerinti eljárás, ahol az RZR/ROR receptor RZR/RORu.
  10. 10. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nemtranszfektált gazdaszervezetként endogén RZR/ROR-től mentes gazdaszervezetet alkalmazunk.
  11. 11. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdaszervezetként baktérium-, gomba-, rovar- vagy emlőssejtet használunk.
  12. 12. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdaszervezetként élesztősejtet vagy Drosophila sejtet használunk .
  13. 13. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az RZR/ROR receptorra specifikus válaszelemet használunk.
  14. 14. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan válaszelemet alkalmazunk, amely a T(A/G)GGTCA DNS-szekvenciát tartalmazza.
  15. 15. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a riporter gén expresszióját transzkripciós vagy transzlációs szinten mérhetjük.
  16. 16. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy riporter génként kloramfenikol acetiltranszferázt (CAT), lacZ-t és bakteriális hibrid luciferázt (lux AB) használunk.
    ··· ···
    - 29
  17. 17. Eljárás vegyületek anti-autoimmun, arthritisellenes, tumorellenes, melatoninszerű és/vagy melatonin-antagonista hatásának tesztelésére, azzal jellemezve, hogy vegyületkönyvtárat az 1. igénypont szerinti receptorokkal inkubálunk, és kiválasztjuk azokat a vegyületeket, amelyek a receptorhoz kötődnek.
  18. 18. Eljárás receptor-3.igandum komplex előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti valamely receptort anti-autoimmun, arthritisetlonas, tumorellenes, melatoninszerű és/vagy melatonin-antagonista hatású vegyülettel inkubálunk.
  19. 19. A 18. igénypont eljárás, ahol a receptor
    RZR/RORa, RZR/RORS vagy RZR/ r ar
    20. A 18 . igénypont szerlm: i eljárás, ahol a receptor RZR/RORa. 21. A 18 . igénypont szerinti eljárás, ahol a receptor monomer vagy dimer. 22. A 18 . igénypont szerinti eljárás, ahol a receptor a funkcionális ligandumkötő domént tartalmazó > fragmens. 23. A 22 . igénypont szerinti élj árás, ahol a fragmenst
    könnyen azonosítható csoporttal jelezzük.
  20. 24. Melatonin-antagonista vagy agonista alkalmazása az
    RZR/ROR receptorcsalád aktivitásának módosítására.
  21. 25. Az (1), (2) vagy (3) általános képletű vegyületek alkalmazása az RZR/ROR receptorcsalád aktivitásának módosítására, ahol a képletekben
    Rj_ és R5 jelentése 3-5 szénatomos alkilcsoport, 3-5 szénatomos alk-2-én-l-il-csoport vagy 3-5 szénatomos alk-2 - in-1-il-csoport; és különösen allilcsoport, metallilcsoport és propinilcsoport;
    • · * · ... *··
    - 30 Rg és Rg jelentése hidrogénatom, 1-5 szénatomos alkilcsoport, 3-5 szénatomos alk-2-én-l-il-csoport, 3-5 szénatomos alk-2-in-l-il-csoport, arilcsoport, aril-(rövidszénláncú alkil)-csoport , telített vagy telítetlen heterociklil-(rövidszénláncú alkil)-csoport vagy (rövidszénláncú alkoxi-karbonil)-(rövidszénláncú alkil)-csoport;
    R3 és R4 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy rövidszénláncú alkilcsoport vagy R3 és R4 együttesen rövidszénláncú alkilidéncsoportot képez;
    X jelentése oxocsoport vagy szulfocsoport;
    R34 és R35 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, metoxicsoport vagy fluoratom;
    R3g jelentése hidrogénatom vagy metoxi-karbonil-csoport;
    R37 jelentése oxocsoport vagy szulfocsoport;
    R3g jelentése hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkilcsoport, ciklopropilcsoport, ciklobutilcsoport, ciklopentilcsoport, ciklohexilcsoport , brómatommal, klóratommal, fluoratommal vagy jódatommal szubsztituált 1-6 szénatomos alkilcsoport, fenilcsoport; (1-3 szénatomos alkil)-fenil-csoport, amely szubsztituálatlan vagy halogénatommal van szubsztituálva, indolilcsoport, morfolinocsoport, metil-morfolino-csoport, aminocsoport, 1-4 szénatomos alkilcsoporttal szubsztituált aminocsoport vagy 1-(2 1 ,3 1 ,41 -trimetoxi-benzil)-piperazin-metil-csoport, 2-pirrolidinoncsoport;
    R39 jelentése hidrogénatom, metiicsoport vagy fluoratom;
    R4q jelentése szénatom vagy nitrogénatom;
    R41 jelentése szénatom vagy nitrogénatom vagy karbonilcsoport;
    <· * * * >
    - 31 ♦ · ···« » · · ··· ···
    R42 jelentése szénatom, nitrogénatom vagy kénatom vagy viniléncsoport;
    az R40 és R44 közötti kötés egyes- vagy kettőskötés azzal a megkötéssel, hogy egyeskötés, ha R44 jelentése karbonilcsoport vagy R4Q jelentése nitrogénatom.
  22. 26. A 24. igénypont szerinti vegyületek alkalmazása az
    RZR/ROR receptorcsalád antagonistájaként vagy agonistájaként.
  23. 27. Olyan ligandum, amely ligandum alkalmazása kezelési eljárásban, amely ligandum azonosítva van, hogy az RZR/ROR receptorcsalád valamely receptorához vagy annak funkcionális fragmenséhez kötődik.
  24. 28. A 26. igénypont szerinti ligandum alkalmazása autoimmun betegségek, arthritises betegségek és/vagy tumorok kezelési eljárásában .
  25. 29. A 26. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a ligandum melatonin vagy melatoninszármazék.
HU9602670A 1994-03-30 1995-03-18 Screening method using the rzr receptor family HUT75128A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP94810196 1994-03-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9602670D0 HU9602670D0 (en) 1996-11-28
HUT75128A true HUT75128A (en) 1997-04-28

Family

ID=8218235

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9602670A HUT75128A (en) 1994-03-30 1995-03-18 Screening method using the rzr receptor family

Country Status (8)

Country Link
US (2) US5958683A (hu)
EP (1) EP0753147A1 (hu)
JP (1) JPH09511334A (hu)
AU (1) AU2109695A (hu)
CA (1) CA2182700A1 (hu)
FI (1) FI963028A (hu)
HU (1) HUT75128A (hu)
WO (1) WO1995027202A1 (hu)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2746313B1 (fr) * 1996-03-22 1998-04-17 Adir Utilisation de la melatonine et des ligands melatoninergiques pour l'obtention de compositions pharmaceutiques destinees a la prevention et au traitement du diabete et des complications diabetiques
EP0835660A1 (en) * 1996-10-14 1998-04-15 Gaston Edmond Filomena Merckx Products containing methylcobalamin for the treatment of multiple sclerosis or other demyelinating conditions
FR2776388B1 (fr) * 1998-03-20 2006-04-28 Lipha Utilisation de recepteurs de la famille ror pour le criblage de substances utiles pour le traitement de l'atherosclerose
ES2194466T3 (es) 1998-06-02 2003-11-16 Arthromics Plc Compuestos que interaccionan con el receptor de la hormona tiroidea para el tratamiento de la enfermedad fibrotica.
GB9924057D0 (en) * 1999-10-11 1999-12-15 Novartis Ag Organic compounds
FR2813315B1 (fr) * 2000-08-23 2002-10-18 Genfit S A Procede d'identification de substances utiles pour le traitement de l'inflammation mettant en oeuvre l'element de reponse du recepteur ror du gene ikbalpha
WO2003091700A2 (en) * 2002-03-26 2003-11-06 Centocor, Inc. Epitope mapping using nuclear magnetic resonance
JP2006502970A (ja) * 2002-04-29 2006-01-26 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト レチノイン酸関連オーファンレセプターアルファ（ｒｏｒ−アルファ）のリガンド結合ドメインの結晶構造
WO2004047855A2 (en) * 2002-11-27 2004-06-10 Develogen Aktiengesellschaft Fur Entwicklungsbiologische Forschung Proteins involved in the regulation of energy homeostasis
AU2003302741A1 (en) * 2002-12-10 2004-06-30 The Regents Of The University Of California A method for creating nuclear receptor activity modulating pharmaceuticals
WO2005037324A1 (en) * 2003-10-16 2005-04-28 Irm Llc Methods and compositions for modulating circadian rhythm
WO2014026329A1 (en) * 2012-08-15 2014-02-20 Merck Sharp & Dohme Corp. N-alkylated indole and indazole compounds as rorgammat inhibitors and uses thereof
WO2014026328A1 (en) * 2012-08-15 2014-02-20 Merck Sharp & Dohme Corp. 3-cyclohexenyl substituted indole and indazole compounds as rorgammat inhibitors and uses thereof

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH459216A (de) * 1965-10-29 1968-07-15 Geigy Ag J R Verfahren zur Herstellung von neuen Azinen
CH511877A (de) * 1969-07-17 1971-08-31 Ciba Geigy Ag Verfahren zur Herstellung eines neuen Thiosemicarbazons
DE2632747A1 (de) * 1975-08-06 1977-02-24 Ciba Geigy Ag Azine von sechs- und siebengliedrigen thiazaheterocyclen
DE3269209D1 (en) * 1982-01-22 1986-03-27 Ciba Geigy Ag Substituted thiazolidinylic esters of mineral acids
US4771056A (en) * 1985-08-29 1988-09-13 Roman Rozencwaig Method of medical treatment with serotonin antagonists
US5283343A (en) * 1987-08-17 1994-02-01 Whitby Research, Inc. 2-aryl substituted N-acetyltryptamines and process of preparing such
US4981784A (en) * 1987-12-02 1991-01-01 The Salk Institute For Biological Studies Retinoic acid receptor method
US5151446A (en) * 1989-09-25 1992-09-29 Northwestern University Substituted 2-amidotetralins as melatonin agonists and antagonists
US6492137B1 (en) * 1989-11-16 2002-12-10 The Salk Institute For Biological Studies Response element compositions and assays employing same
FR2658818B1 (fr) * 1990-02-27 1993-12-31 Adir Cie Nouveaux derives a structure naphtalenique, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
EP0641565B1 (en) * 1990-09-28 2000-03-15 I.F.L.O. S.a.s. di Giorgio e Aldo Laguzzi Contraceptive and menstrual cycle controlling drug having oncostatic properties
US5177091A (en) * 1990-12-06 1993-01-05 Ciba-Geigy Corporation Use of carbazones as novel active ingredients in medicaments
AU679899B2 (en) * 1991-03-18 1997-07-17 Salk Institute For Biological Studies, The Response element compositions and assays employing same
FR2674524B1 (fr) * 1991-03-25 1993-05-21 Adir Nouveaux amides alkyl heterocycliques, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
AU658175B2 (en) * 1991-04-12 1995-04-06 Novartis Ag Use of 2-iminothiazolidin-4-one derivatives as novel pharmaceutical active ingredients
FR2680366B1 (fr) * 1991-08-13 1995-01-20 Adir Nouveaux derives d'arylethylamines, leurs procedes de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
FR2680507B1 (fr) * 1991-08-23 1993-10-08 Adir Cie Nouvelles naphtylethylurees et naphtylethylthiourees, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
US5206377A (en) * 1991-12-05 1993-04-27 Whitby Research, Inc. Compounds useful as antiproliferative agents
TW211005B (hu) * 1991-12-18 1993-08-11 Ciba Geigy Ag
EP0548017A1 (de) * 1991-12-18 1993-06-23 Ciba-Geigy Ag Neue Thiazole
FR2689124A1 (fr) * 1992-03-27 1993-10-01 Adir Nouvelles naphtylalkylamines, leur procédé de préparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
IL105240A (en) * 1992-04-07 1999-04-11 Neurim Pharma 1991 The use of melatonin in the preparation of a drug for the treatment of benign prostatic hyperplasia
IT1254995B (it) * 1992-06-24 1995-10-11 Farmaco contenente melatonina e/o agonisti, con somministrazione particolarmente efficace nelle patologie che interferiscono con i ritmi circandiani
IT1255199B (it) * 1992-07-01 1995-10-20 Franco Fraschini Farmaco sintetizzato analogo della melatonina particolarmente efficacenelle patologie che interferiscono con i ritmi circadiani
FR2696453B1 (fr) * 1992-10-02 1994-12-23 Adir Nouveaux arylalkyl(thio)amides, leur procédé de préparation, et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent.
US5403851A (en) * 1994-04-05 1995-04-04 Interneuron Pharmaceuticals, Inc. Substituted tryptamines, phenalkylamines and related compounds

Also Published As

Publication number Publication date
WO1995027202A1 (en) 1995-10-12
CA2182700A1 (en) 1995-10-12
HU9602670D0 (en) 1996-11-28
US5958683A (en) 1999-09-28
MX9603966A (es) 1997-12-31
JPH09511334A (ja) 1997-11-11
US6218359B1 (en) 2001-04-17
EP0753147A1 (en) 1997-01-15
FI963028A (fi) 1996-09-27
FI963028A0 (fi) 1996-07-31
AU2109695A (en) 1995-10-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6844168B1 (en) Compositions comprising polynucleotides encoding human fibroblast growth factor receptor and uses thereof
Petermann et al. Oncogenic EWS-Fli1 interacts with hsRPB7, a subunit of human RNA polymerase II
Schäfer et al. Effect of cell history on response to helix–loop–helix family of myogenic regulators
Murphy et al. Isolation of a cDNA encoding the vascular type-1 angiotensin II receptor
Frattali et al. Relationship between alpha subunit ligand occupancy and beta subunit autophosphorylation in insulin/insulin-like growth factor-1 hybrid receptors.
HUT75128A (en) Screening method using the rzr receptor family
KR100719080B1 (ko) 사이토킨에 대한 세포반응을 조절하는 치료 및 진단 시약
Hedvat et al. The isolation and characterization of MINOR, a novel mitogen-inducible nuclear orphan receptor.
JPH07502651A (ja) 老化細胞由来ｄｎａ合成阻害因子
Kataoka et al. Signaling events initiated by transforming growth factor-beta 1 that require Gi alpha 1.
US5721096A (en) Methods of screening for compounds with ability to alter apolipoprotein AI gene expression
JPH11501515A (ja) ニューロン制限サイレンサー因子蛋白質
EP1235934B1 (en) Screening method for candidate drugs
US20040014024A1 (en) Screening assay for antagonists of FGFR-mediated malignant cell transformation and tumor formation
JP2002526099A (ja) Ｎｌｋ１−相互作用タンパク質
DE69935414T2 (de) Humanes h-TRCP Protein
WO1995005389A1 (en) Sequence-specific glycoconjugate transcriptional antagonists
AU733874B2 (en) Novel CREBa isoform
US6576444B2 (en) IRAK3 polynucleotides
JPH11503308A (ja) ヒトｓｔａｔ４
KR100493460B1 (ko) 암 세포에서 발현되는 ｆｇｆｒ2 이성체
AU9244798A (en) Screening method using the RZR receptor family
WO2003053467A1 (fr) Medicament pour regenerer les tissus et les vaisseaux et procede permettant de le produire
JPH07505524A (ja) Ｉｆｎ受容体認識因子，そのタンパク質配列および使用方法
US7259254B2 (en) Mutants and assay system to identify USP/RXR ligands

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: NOVARTIS AG, CH

DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee