HUT73216A - Dna constructs coding for protein ga1 of arabidopsis thaliana, vectors containing the dna constructs, host cells transformed with the vectors, transgenic plants containing the dna constructs, propagation materials thereof; purified protein ga1 ... - Google Patents

Description

A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható új, kedvező tulajdonságokkal bíró transzgenikus növényfajták előállítására.

A találmány szerinti megoldás kidolgozása során végzett munkát részben az Amerikai Egyesült Államok kormánya által rendelkezésünkre bocsátott támogatásból finanszíroztuk. Ezért az Amerikai Egyesült Államok kormányának bizonyos jogai vannak a jelen találmány vonatkozásában.

A jelen bejelentés a 08/261.769 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (benyújtva. 1994. június 17.) részben folytatólagos bejelentése, amely bejelentés a 08/008.996 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (benyújtva: 1993. január 27.) részben folytatólagos bejelentése, amely bejelentés pedig a 07/844.300 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (benyújtva: 1992. február

18.) részben folytatólagos bejelentése. Valamennyi említett bejelentéshez mellékelt találmányi leírás teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi. A, Gibberellinek

A gibberellinek (GA-k) a diterpenoid szerkezetű növényi növekedésű hormonok egy családját képezik, és némelyikük bioaktív, növekedést szabályozó hatóanyag. A GA-k szerepet játszanak olyan egymástól meglehetősen különböző folyamatok szabályozásában, mint például a magok csírázása, a sejtek megnyúlása és osztódása, a levelek növekedése, a szár megnyúlása, a virágzás és a gyümölcshozás. A GA-k már sok fiziológiai és biokémiai tanulmány tárgyát képezték, és tanulmányoztak már számos olyan növényi mutánst, melyek a vad típustól eltérő GA-bioszintézis mintázattal vagy GAválasszal rendelkeztek [Graebe, J.E., Ann. Rév. Plánt Physiol. 38, 419

-3(1987)]. Mindazáltal a GA-szintézisben szerepet játszó gének közül mindeddig egyetlenegyet sem klónoztak meg.

GA-reszponzív törpenövésű mutánsok endogén GA-intermediereinek alapos biokémiai tanulmányozása lehetővé tette a GA-bioszintézis reakcióútjának meghatározását, és azonosítottak bizonyos génlókuszokat, melyek szerepet játszanak a GA-bioszintézisben [e munkák összefoglalása megtalálható: Graebe, J.E.: Ann. Rév. Plánt Physiol. 38, 419 (1987)]. Számos GA-reszponzív törpenövésű mutánst izoláltak különböző növényfajok esetén, például kukorica, borsó és Arabidopsis fajok esetén [Phinney, B.O. és mtsai.: Chemical Genetics and the Gibberellin Pathway in Zea mays L., a Plánt Growth Substance kézikönyvben, szerk.: Waering, P.F. New York. Academic, 101. old. (1982); Ingram, T.J. és mtsai.: Planta 160. 455 (1984); Koomneef, M., Arabidopsis Inf. Sérv. 15, 17 (1978)]. A kukorica törpenövésű mutánsait (dwarf-1, dwarf-2, dwarf-3, dwarf-5) használták fel a kukorica GA-bioszintézis-reakcióútjának jellemzésére, meghatározva a biológiailag fontos metabolitok előállításához vezető specifikus reakciólépéseket [Phinney, B.O. és mtsai.: Chemical Genetics and the Gibberellin Pathway in Zea mays L, a Plánt Growth Substance kézikönyvben, szerk.: Waering, P.F. New York: Academic, 101. old. (1982); Fujioka, S. és mtsai.: Plánt Physiol. 88. 1367 (1988)]. Hasonló tanulmányokat végeztek a borsó (Pisum sativum L.) törpenövésű mutánsaival is [Ingram, T.J. és mtsai.: Planta 160, 455 (1984)]. Arabidopsis fajokból is izoláltak GA-defíciens mutánsokat (gal, ga2, ga3, ga4, ga5); [Koomneef, M., és mtsai.: Theor. Appl. Génét. 58. 257 (1980)]. A GA-mutánsok vonatkozásában az egyik legalaposabb tanulmányt Koomneef és mtsai. készítették [Theor. Appl.

ll

-4Genet. 58, 257 (1980); Koomneef és mtsai.: Génét. Rés. Cainb. 41, 57 (1983)] a kis keresztesvirágú növényfaj, az Arabidopsis thaliana felhasználásával. Etil-metán-szulfonátos (EMS) és gyors neutron mutagenézis alkalmazásával Koomneef kilenc olyan Arabidopsis thaliana alléit izolált, melyek a GAl-lókuszba térképezödtek [Koomneef és mtsai.: Theor. Appl. Génét. 58, 257 (1980); Koomneef és mtsai.: Génét. Rés. Camb. 41. 57 (1983)].

Az Arabidopsis thaliana GA1-mutánsok nem csírázóképesek, GAreszponzívak, hímsteril törpék, és fenotípusuk visszalakítható a vad fenotípussá, GA ismételt alkalmazása útján [Koomneef és van dér Veen: Theor. Appl. Génét. 58, 257 (1980)]. Koomneef és mtsai. az Arabidopsis thaliana GAl-lókusz (2a ábra) genetikai térképe finom szerkezetének meghatározására három gyors neutron bombázással kialakított független alléit (31,89, 29,9 és 6,59), valamint hat etil-metán-szulfonátos mutagenézissel kialakított független alléit (NG4, NG5, d69, A428, d352 és Bo27) használtak fel. A gyors neutronokkal előállított mutánsok egyike, a 31,89-jeiü, nem rekombinált a 2.A ábrán bemutatott hat aléllel, és génen belüli delécióként jellemezték [Koomneef és mtsai.: Génét. Rés. Camb. 41, 57 (1983)].

A GA1-mutánsok csökkent mennyiségben tartalmaznak GA-kat, és a belőlük készített sejtmentes preparátumok ent-kaurén szintetáz aktivitása a vad típushoz képest igen alacsony [Barendse és mtsai.: Physiol. Plánt. 67, 315 (1986); Barendse és Koomneef, Arab. Inf. Sérv. 19, 25 (1982)]. Zeevaart [Plánt Reserach '86 Annual Report of the MSU-DOE Plánt Reserach Laboratory, East Lansrng, Michigan, 130. old. (1986)] arról számolt be, hogy a GA1-mutánsok növekedési képességét ent-kaurén alkalma-5 zása is helyreállította, valamint arról, hogy amennyiben a mutánsok leveleire ¹⁴C-ent-kaurént vitt fel, ez a vegyület GA-kká metabolizálódott. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a GA1-mutánsokban a GA-bioszintézís az ent-kaurén keletkezési lépés előtt van blokkolva, a reakcióút további részét azonban a mutáció érintetlenül hagyta. Mivel a GA1-mutánsok termelnek klorofilleket és karotenoidokat, valószínűtlen, hogy a mutáció a geranilgeranil-pirofoszfát (GGPP) szintézist érintené. Éppen ezért feltételezhető, hogy a GAl-lókusz szerepet játszik a GGPP ent-kaurénné történő átalakulásában oly módon, hogy vagy valamelyik ent-kaurén szintetázt, vagy az aktív enzim kialakulásához szükséges valamely regulátort kódolja. A GAl-lókuszt genomi kivonás eljárás alkalmazásával izolálták [Sun és mtsai.: Plánt. Cell. 4, 119(1992)].

A GAl-gén által kódolt enzim szerepet játszik a GGPP ent-kaurénné történő átalakításában [Barense és Koomneef, Arabidopsis Inf. Sérv. 19, 25 (1982); Barendse és mtsai.: Physiol. Plánt. 67, 315 (1986); Zeevaart, J.A.D.: Plánt Research '86, Annual Report of the MSU-DOE Plánt Research Laboratory, 130-131 old., East Lansing, MI, (1986)], amely a GA-k biosztintézisének egy kulcsfontosságú intermediere [Graebe, J.E.: Alin. Rév. Plánt Physiol 38, 419 (1987)]; lásd I. reakcióvázlat.

Az ent-kaurén szintetázt mindeddig csak részletesen tisztították meg számos különböző növényből [Duncan: Plánt Physiol. 68, 1128 (1981)].

A terpének szintézisében közös lépés a GGPP mevalonátból történő előállítása. A GGPP egy elágazásponti metabolit, amely nem csak a GA-knak, hanem egyéb diterpéneknek is prekurzora, például a klorofillek fitol-láncának, valamint a tetraterpéneknek, például a karotenoidoknak is. A <1

-6GA-reakcióút első specifikus lépése a GGPP ent-kaurénné történő átalakulása, egy kétlépéses ciklizációs reakció során. A GGPP-t az ent-kaurén szintetáz-a részlegesen kopalil-pirofoszfát (CPP) intermedierré ciklizálja, majd a CPP-t az ent-kaurén szintetáz-b azonnal ent-kaurénné alakítja. Mivel az ent-kaurén a GA-reakcióúton kulcsfontosságú intermedier, szintézise feltehetőleg a GA-bioszintézis egy szabályozási pontja. Ennek megfelelően ki is mutatták, hogy az ent-kaurén termelődés változik a fényciklusban, a hőmérsékletben, valamint bizonyos fajok szöveteinek növekedési potenciáljában beálló változások következtében [Chung és Coolbaugh (1986); Moore és Moore (1991); Zeevaart és Gage (1993)].

A különböző gal-allélekben található molekuláris léziók vizsgálatával közvetlen összefüggést állapítottak meg a gal-lókusz genetikai és fizikai térképei között, és az Arabidopsis thaliana genom e régiójára 10‘⁵ cM/nukleotid rekombinációs rátát állapítottak meg [Koomneef: Génét. Rés. Comb. 41, 57 (1983)].

A GAl-gén és a GAl-bioszintézisben szerepet játszó egyéb gének klónozási nehézségeit nagy valószínűséggel az okozta, hogy nem állt rendelkezésre hatékony transzformációs/szelekciós rendszer, és a megfelelő fehérjeszekvenciák sem voltak ismeretesek. Bár gal-mutánsok bizonyos ideje hozzáférhetők voltak, a GAl-gén klónozása nehezen megközelíthető feladat maradt. A jelen találmány szerinti megoldás többek között ezt a problémát oldja meg.

B. Génklónozás

A molekuláris biológia szempontjából rendkívüli jelentősége van, hogy képesek vagyunk azonosítani és megklónozni bizonyos kiválasztott

-7 génszekvenciákat vírusokból, prokariótákból vagy eukariótákból. Az ilyen klónozott génszekvenciákat felhasználhatjuk kívánt géntermékek expresszáltatására, és éppen ezért az ilyen szekvenciákat potenciálisan a katalízistől egészen a gének cseréjéig egy egész sor alkalmazási területen hasznosíthatjuk.

Különböző kiválasztott génszekvenciák izolálására és klónozására számos különböző eljárást fejlesztettek ki. A korai eljárások csak olyan génszekvenciák azonosítását és izolálását tették lehetővé, melyeknek valamely olyan egyedi sajátságuk volt, mint például egy profág integrációs helyéhez közeli lokalizáció, önreplikáló képesség, különleges molekulasúly, rendkívül nagy mennyiségben való előfordulás, stb. [The Bacteriophage Lambda,

A.D. Hershey, szerk.: Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1971); Miller, J.H.: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1972); Molecular Biology of the Gene, Watson, J.D. és mtsai.: (4.szerk.) Benjamin/Cummings, Menlo Park, CA (1987); Damell, J. és mtsai.: Molecular Biology, Scientifíc American Books, NY, NY (1986)]. Mivel ezek a módszerek a génszekvencia valamely különleges sajátságán alapultak, lényegében (vagy teljesen) alkalmatlanok voltak a legtöbb génszekvencia azonosítására és klónozására.

A különleges, azonosítható sajátsággal nem rendelkező génszekvenciák azonosítása céljára jól jellemzett genetikai rendszereket (például Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, kukorica, emlős sejtek, stb.) alkalmaztak. Az ilyen eljárásokban a sejteket vegyszerekkel - például hidroxilamillal, stb. - vagy UV-fénnyel mutagenizálják [Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold spring Harbor Press, Cold

-8Spring Harbor, NY (1972)], de alkalmaznak genetikai eljárásokat is, mint például a transzpozonos címkézés [Davis, R.W. és mtsai.: A Manual fór Genetic Engineering, Advances Bacterical Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1980)], és ily módon észrevehető genetikai hiányossággal rendelkező mutánsokat állítanak elő. A keresett génszekvenciát azon az alapon azonosítják, hogy képes komplementálni (azaz helyreállítani) az ilyen mutáns sejtek genetikai hiányosságait. Az ilyen genetikai azonosítás lehetővé tette a génszekvenciák genetikai jellemzését, valamint olyan genetikai térképek előállítását, melyek az azonosított génszekvenciákat valamely kromoszóma bizonyos régiójába lokalizálták [Taylor, Bacterial. Rév. 34, 155 (1970)]. A rekombináns DNS-technológia módszereinek megjelenésével lehetővé vált az ilyen genetikailag jellemzett génszekvenciák megklónozása (azaz fizikai izolálása). Egy genom véletlenszerűen előállított fragmenseit bejuttathatjuk valamely önreplikálódó vektorba, és ily módon génkönyvtárakat állíthatunk elő, melynek tagjai egyedi DNSffagmenseket tartalmaznak [Maniatis, T. és mtsai.: In: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)]. Amennyiben az ilyen génkönyvtárak egyes tagjait megvizsgáljuk, hogy képesek-e valamely mutáns sejt hiányosságát helyreállítani, lehetőség nyílik a keresett génszekvencia klónozására.

Bár a felsorolt módszerek lehetővé teszik sok génszekvencia azonosítását és klónozását, ezek az eljárások csak abban az esetben alkalmazhatók, ha rendelkezünk olyan gazdasejttel, amely észrevehető hiányosságot eredményező mutációt hordoz, és a génszekvencia olyan génátjuttató rendszerbe

-9(például vektorba) klónozható, amely képes a génszekvenciát a gazdasejtbe juttatni és ott expresszáltatni.

Az a lehetőség, hogy képesek vagyunk bizonyos génszekvenciákat fizikailag izolálni olyan eljárások kifejlesztéséhez vezetett, melyek segítségével lehetséges kívánt génszekvenciákat mutációk vagy vektorok hiányában is izolálni.

Az egyik ilyen eljárás szerint, melyet sétálás a kromoszómán eljárásnak neveznek, egy kívánt szekvenciát izolálhatunk oly módon, hogy először egy olyan génszekvenciát izolálunk, amely képes hibridizálódni egy bizonyos referenciaszekvenciával. Ezt az izolált génszekvenciát azután egy következő hibridizációs kísérletben referenciaszekvenciaként alkalmazzuk, és ily módon megklónozunk egy olyan génszekvenciát, amely közvetlenül az eredetileg izolált szekvencia mellett helyezkedik el, és azzal részlegesen átfedő. Ez az újonnan izolált szekvencia fizikailag közelebb lesz az izolálni kívánt génszekvenciához, mint az eredetileg izolált szekvencia. Ezután az ismertetett lépéseket addig ismételjük, míg sikerül izolálnunk a kívánt génszekvenciát. Szakember számára kézenfekvő, hogy^r ahhoz, hogy genetikai mutánsok vagy vektorok hiányában megklónozhassunk egy kívánt génszekvenciát, szükség van bizonyos kezdeti információra, a kívánt szekvencia nukleotidsorrendjével vagy restrikciós endonukleáz térképével kapcsolatosan.

Eljárhatunk úgy is, hogy egy vírus vagy egy sejt kromoszómáját fizikai térképezéssel jellemezzük, vagy nukleotidsorrend meghatározás alapján, vagy restrikciós endonukleáz hasítási adatok alapján (azaz RFLPtérképezéssel). Az ilyen térképek felhasználásával a kromoszóma restrikciós

- 10fragmenseit megklónozhatjuk, anélkül, hogy az illető fragmensek genetikai funkcióját előzetesen meghatároznánk.

Legújabban lehetőség van gének klónozására oly módon, hogy egy izolált fehérje aminosavsorrendje alapján oligonukleotid molekulákat szintetizálunk. Ezután izolált RNS-transzkriptumokról cDNS-kópiákat készítünk, majd differenciális szubtraktív kolónia vagy könyvtár hibridizációs kísérleteket hajtunk végre, vagy két különböző RNS-forrás felhasználásával, vagy cDNS és RNS felhasználásával, és ily módon azonosítjuk a keresett kiónt.

Bár ezeket az eljárásokat végrehajthatjuk mutánsok vagy génhordozó rendszer hiányában is, mindazáltal ezek az eljárások csak akkor alkalmazhatók kívánt génszekvenciák azonosítására és klónozására, ha a kívánt szekvenciához természet szerint kapcsolódó szekvenciákat már jellemeztek és izoláltak, vagy amennyiben az izolálni kívánt szekvencia vonatkozásában a bázissorrendre vonatkozó adatok vagy restrikciós térkép rendelkezésre állnak. Mivel ilyen adatok gyakran hozzáférhetetlenek, ezek az eljárások gyakran nem alkalmasak valamely keresett génszekvencia azonosítására és megklónozására.

Két általános megközelítési módot írtak le olyan szekvenciák megklónozására, melyek egy bizonyos törzsben jelen vannak, egy másikból pedig hiányoznak. Az első megközelítésmódot, az ún. differenciális szűrővizsgálatot alkalmazták például a Drosophila esc-génjének megklónozására. Deléciót tartalmazó és deléciót nem tartalmazó genomi DNS-fragmensek alkalmazása azonban genomi könyvtárak replikáinak hibridizációs próbájaként technikai nehézséget okoz, mely nehézségek nagy genomok esetén ilyesztően naggyá válnak. Ezen felül a keresett deléciónak le kell fedni a ί

- 11 genomi könyvtárból származó legalább egy teljes inszertet, mely inszert nem tartalmazhat ismétlődő szekvenciákat.

A másik megközelítésmód, a kompetitív hibridizáció, a differenciális szűrővizsgálat egy lehetséges alternatívája. Ezt az eljárást Lamar és mtsai. alkalmazták [Cell 37, 171 (1984)] a humán Y-kromoszómára specifikus kiónok izolálására. E szerint az eljárás szerint összetört női DNS fölöslegét denaturálták és kis mennyiségű férfi DNS-sel hibridizálták (a férfi DNS-t előzőleg ragadósvégűvé tették). A legtöbb férfi eredetű DNS-darab hibridizálódott a női eredetű DNS-darabokkal, és ily módon klónozhatatlan fragmensek keletkeztek, melyeknek nem volt ragadós végük. Az ykromoszómára specifikus fragmensek azonban csak a saját restrikciós enzimmel hasított komplementer szálaikkal voltak képesek hibridizálódni (melyek az y-kromoszómából származtak). Az ilyen hibridizáció eredményeként ragadós végű klónozható fragmensek keletkeztek. Ezt az eljárást sikeresen alkalmazták a Duchenne-féle muszkuláris disztrófia lókuszban található deléciónak, valamint a koroiderémia lókuszban található deléciónak megfelelő DNS-szekvenciák megklónozására.

Sajnos a kompetitív hibridizációs eljárás nem dúsítja fel eléggé a keresett fragmenseket a hibridizációs elegyben. A fent említett eljárások során például a keresett szekvenciák körülbelül 100-szoros mértékben dúsultak fel. Mivel a feldúsulás ilyen kis nagyságrendű, ezt az eljárást csak abban az esetben lehet a gyakorlatban alkalmazni, ha a vizsgált deléció meglehetősen nagy. És valóban, még abban az esetben is, mikor a deléció a genom 0,1 %át érintette, sok feltételezett pozitív kiónt kellett egyenként ellenőrizni radioaktív jelölés és genomi Southem-blot-hibridizáció alkalmazásával (I ·' ·· .....

- 12[Southem, J.: J. Molec. Bioi. 98, 503 (1975)]. Az elmondottak miatt az eljárás a jelenlegi formájában 1 kbp (kilobázispár) nagyságrendű deléciók megklónozására gyakorlatilag nem alkalmas, hacsak nem kis prokarióta genommal van dolgunk.

Összefoglalásként elmondhatjuk, hogy egy mindössze egy mutáció által jellemzett lókuszhoz tartozó DNS klónozása viszonylag egyszerű dolog, amennyiben E. coli vagy S. cerevisiae gazdasejtekkel dolgozunk, vagy más olyan gazdasejtekkel, melyekben a transzformáció és a genomi könyvtárak komplementációja könnyen megoldható feladat. Más élőlények esetén alkalmazhatjuk a sétálás a kromoszómán eljárást genetikailag definiált lókuszok klónozására, amennyiben transzpozonos címkézéssel előállított mutáns rendelkezésre áll, amennyiben a lókuszt egy RFLP-térképen valamilyen markerhez tudjuk kötni, vagy amennyiben rendelkezésre áll a genom rendezett könyvtára. Sajnos sok olyan élőlény létezik, melyek vonatkozásában érdekes fenotípusú mutánsokat izoláltak, de ahol ilyen eljárások még nem fejlesztettek ki, példaként említhetjük az A. thaliana GA-szintézis mutánsait. Elmondhatjuk tehát, hogy az eddig ismertetett eljárások alkalmazásával sok génszekvenciát nem lehet izolálni.

C. Transzgenikus és kiméra növények

A rekombináns DNS és egyéb genetikai eljárások legújabb eredményei lehetővé tették, hogy egy recipiens növénybe egy kívánt génszekvenciát bejuttassunk, és azt ott expresszáltassuk. Az ilyen új eljárások alkalmazásával különböző növényeket úgy manipuláltak, hogy tartalmazzanak olyan génszekvenciákat, melyek normálisan vagy természetesen nincsenek jelen a kiindulási növényben. Az említett eljárások alkalmazásával előállítottak ι

- 13olyan növényeket is, melyek bennük természetesen jelenlévő génszekvenciákat a természetestől eltérő módon expresszálnak.

Az említett eljárásokkal előállított növényeket kiméra- vagy transzgenikus növényeknek nevezik. A kiméranövényekben a növény sejtjei közül csak némelyek tartalmazzák és expresszálják a bejuttatott génszekvenciát, a növény többi sejtje azonban változatlan marad. Ezzel szemben a transzgenikus növények valamennyi sejtje tartalmazza a bejuttatott génszekvenciát.

A transzgenikus növényeket általában egyetlen transzformált növényi sejtből állítják elő. A növények számos családjához tartozó fajok egyedeit regenerálták már egyetlen sejtből kiindulva [Friedt, W. és mtsai.: Prog. Botany 49, 192 (1987); Brúnóid, C. és mtsai.: Molec. Gén. Génét. 208, 469 (1987); Durand, J. és mtsai.: Plánt Sci. 62, 263 (1989), mely közleményeket teljes egészében a technika állásához tartozó kitanítás részeként kell tekinteni].

Számos eljárást kifejlesztettek idegen gének növényei sejtekbe juttatására és expresszáltatására. Az ilyen eljárásokban alkalmaznak például: genetikailag manipulált talajlakó A. timefaciens baktériumból származó Tiplazmidokat [Czako, M. és mtsai.: Plánt. Mól. Bioi. 6, 101 (1986); Jones, J.D.G. és mtsai.: EMBO J. 4, 2411 (1985)], genetikailag manipulált növényi vírusokat, például karfiol mozaikvírust [Shah, D.M. és mtsai.: Science 233, 478 (1986); Shewmaker, C.K. és mtsai.: Virol. 140, 281 (1985)], a növényi sejtekbe mikroinjektálással bejuttatott génszekvenciákat [Crossway, A. és mtsai.: Molec. Gén. Génét. 202, 179 (1986); Potrykus, I. és mtsai.: Molec. Gén. Génét. 199, (1985)], elektroporációt [Fromm, M.E. és mtsai.: Natúré,

-14319, 793 (1986); Morikawa, H. és mtsai.: Gene 41, 121 (1986)], valamint felgyorsított DNS-sel burkolt részecskéket [Bolik, M. és mtsai.: Protoplasma 162, 61 (1991)].

A transzgenikus és kiméranövények előállítási eljárásainak alkalmazásai lehetővé teszik olyan növények előállítását, melyeket klasszikus genetikai módszerekkel nem lehetne előállítani. A kiméra- és transzgenikus növényeket kiterjedten alkalmazzák például a természetes gének expressziójának vizsgálatában. Az említett eljárások amennyiben azokat tápláléknövényeket alkalmazzák, lehetőséget nyújtanak javított táplálékok, növényi szálak, stb. előállítására.

Elő lehet állítani olyan kiméra- és transzgenikus növényeket, melyek a bejuttatott génszekvenciát bizonyos időbeli és térbeli mintázat szerint expresszálják. A bejuttatott génszekvencia expresszióját olyan szabályozó szekvenciák alkalmazásával szabályozhatjuk, melyek a transzkripciót és/vagy transzlációt időben vagy térben változó módon vezérlik.

A találmány tárgyát az Arabidopsis thaliana GA1-lókuszának megfelelő izolált genomi DNS és cDNS képezi, valamint az ilyen DNS-t tartalmazó vektorok, az ilyen vektorokkal transzformált gazdasejtek, a GA1-fehérje expresszióját irányító szabályozó régiók, valamint az ilyen szabályozó szekvenciák alkalmazása heterológ gének expresszálására.

A találmány tárgyát képezi továbbá az antiszensz GA1-DNS, valamint az arról átíródott antiszensz GA1-RNS.

A találmány tárgyát képezik továbbá GA1-fehérjét kódoló DNS-t tartalmazó vektorok, valamint eljárások a GA1-DNS által kódolt GA1fehérje expresszálására, alkahnas gazdasejtben.

- 15A találmány tárgyát képezik továbbá antiszensz GAl-DNS-t tartalmazó vektorok, valamint eljárások antiszensz GA1-RNS expresszálására valamely gazdasejtben.

A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti GA1fehérjét kódoló DNS-sel transzformált gazdasejtek, valamint az ilyen gazdasejtek alkalmazása GA1-DNS fenntartására vagy a találmány szerinti GA1fehérje expresszálására.

A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti antiszensz GA1-DNS-sel transzformált gazdasejtek, valamint az ilyen gazdasejtek alkalmazása GA1-DNS fenntartására, vagy a találmány szerinti GAl-fehéije expressziójának gátlására.

A találmány tárgyát képezik továbbá az egyéb Arabidopsis thaliana fehérjéktől lényegében mentes GA1-fehérje, a GA1-fehérjéhez kötődni képes ellenanyagok, valamint a GA1-fehérje és a hozzá kötődő ellenanyagok alkalmazásai.

A találmány tárgyát képezik továbbá kiméra- és transzgenikus növények, melyek a GA1-fehérjét kódoló vagy antiszensz GA1-DNS szekvenciával vannak transzformálva, vagy valamely heterológ génnel vannak transzformálva, amely a GAl-gén szabályozó szekvenciáinak szabályozása alatt áll.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás növények növekedésének befolyásolására, a találmány szerinti GA1-fehérjét kódoló vagy antiszensz GA1-DNS alkalmazásával.

- 16A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás növények növekedésének befolyásolására, rekombináns úton előállított találmány szerinti GA1fehérje alkalmazásával.

A találmány tárgyát képezi továbbá a GA1-fehérje és a GA1fehérjéhez kötődni képes ellenanyagok alkalmazása a GA1-fehérje expressziójának kimutatására, valamint olyan szabályozó fehérjék izolálására, melyek a GA1-kénszekvenciához kötődnek.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.

Az 1. ábrán a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerinti dúsító és klónozó eljárás vázlatát láthatjuk. A DNS-fragmenseket folytonos vonallal jelöltük, a biotinilezett DNS-fragmenseket vonalkázott rudakkal, a Sau3A-adaptereket üres rudakkal, az avidin gyöngyöket pöttyözött körökkel, a radióaktívan jelölt fragmenseket csillaggal jelöltük.

A 2.A és 2.B ábrán az Arabidopsis thaliana GA1-lókuszának genetikai és fizikai térképét láthatjuk.

2.A ábra: 9 Arabidopsis thaliana ga-l-allél (29,9, NG5, NG4, d69, A428, d325, 6,59, Bo27, 31,89) genetikai térképe cM xl0‘² egységekben megadva [Koomneef és mtsai.: Génét. Rés. Camb. 41, 57 (1983)]. A 31,89-allélben feltételezett deléciót vízszintes vonallal jelöltük.

2.B ábra: a GA1-régió fizikai térképe. A középső folytonos vonal a GAl-lókuszt magába foglaló Landsberg erecta DNS Hindin restrikciós térképe. A Hindin restrikciós hasítóhelyeket a vízszintes vonal alá nyúló függőleges jelzések mutatják. A középső folytonos vonal alatti számok a megfelelő HindlII restrikciós fragmens méretét jelzik, kilobázispár egységekben. A 31,89-allélban található deléció helyét vonalkázott rúddal jelöltük. A rest-

- 17rikciós térkép fölötti vízszintes vonalak a ÁGAl-3-jelü λ-klónban és a pGAl-2-plazmidban [a Budapesti Szerződés értelmében 1993. január 7-én letétbe helyezve az American Type Culture Collection (ATCC) intézetnél, Rockville, Maryiland, U.S.A., 20852, ahol az ATCC 75394 nyilvántartási számot kapta], valamint a pGAl-4 kozmidklónban [a Budapesti Szerződés értelmében 1993. január 7-én letétbe helyezve az American Type Culture Collection (ATCC) intézetnél, Rockville, Maryiland, U.S.A., 20852, ahol az ATCC 75395 nyilvántartási számot kapta] található szekvenciák méretét jelölik. A vízszintes vonalak alatti diagram a GAl-gén intronjainak (vonalak) és exonjainak (üres téglalapok) elhelyezkedését mutatja, az 1,2 kb-s Hindin restrikciós fragmensen belül, valamint a 6,59-jelű inszerciós mutációs alléi, valamint a d352-, A428- és Bo27-jelü pontmutációs allélek elhelyezkedését.

A 3.A és 3.B ábrákon a 31,89- és 5,69-jelű DNS-ek delécióinak és inszercióinak azonosítását láthatjuk. Az ábrákon Southem-blot eljárásokkal készített autoradiogrammokat láthatunk, melyeket egyrészt (A ábra) a pGAl-1 plazmid 250 bázispáros Sau3A-fragmensével, másrészt pedig (B ábra) a pGAl-2 plazmid (ATCC 75394) 6 kb-os fragmensével hibridizáltunk, amely átfedi a 31,89-allél teljes deléciós régióját (l.B ábra). Mind az A, mind pedig a B ábrán látható biot HindlII-al emésztett DNS-eket tartalmaz, mely DNS-eket a Landsberg erecta fajból (1. sáv), valamint a 3 ga-1 mutánsból: 31,89 (2. sáv), 29,9 (3. sáv), valamint 6,59 (4. sáv) izoláltunk. A B ábrán látható nyilak a 31,89-jelü és a 6,59-jelű allétokból származó megváltozott hosszúságú Hindin ffagmenseket jelölik (sorrendben 4,2 kb, valamint 1,3 és 3,3 kb).

il

- 18Α 4.Α, 4.Β és 4.C ábrákon GAl-gént tartalmazó vad típusú és transzgenikus növényekről készített fényképeket és Southem-blotokat láthatunk.

4. A ábra: hat hetes Arabidopsis thaliana Landsberg erecta növényekről készített fényképfelvétel. Balról jobbra haladva: egy ga-1 mutáns (31,89) egy transzgenikus ga-1 mutáns (31,89), amely tartalmazza a pGAl-4 plazmid (ATCC 75395) 20 kb-os inszertjét, valamint egy vad típusú Landsberg erecta növényt. A B és C ábrákon autoradiogrammokat láthatunk olyan Southem-blot kísérletekről, melyekben hibridizációs próbaként egyrészt a pGAl-2-plazmid (ATCC 75394) 6 kb-os ffagmensét (B ábra), másrészt pedig a pOCA18-DNS-t (C ábra) alkalmaztuk, mely DNS a pGAl-4plazmid (ATCC 75395) vektor része (lásd 2. ábrát). Mind a B, mind a C ábrákon látható biotok Hindin emésztett DNS-mintákat tartalmaznak, melyeket a következő növényekből izoláltunk: Landsberg erecta (B ábra 1. sáv), Columbia (B ábra 2. sáv, C ábra 1. sáv), 31,89-allél (B ábra 3. sáv, C ábra 2. sáv), valamint két T3-generációs transzgenikus GAl-mutáns (31,89), melyek a pGAl-4-plazmiddal (ATCC 75395) voltak transzformálva (B ábra 4. és 5. sáv; C ábra 3. és 4. sáv).

Az 5. ábrán a 2,8 kb-os mRNS kimutatását láthatjuk GAl-cDNS hibridizációs próbák alkalmazásával. Az ábrán egy autoradiogrammot láthatunk, amely egy RNS-blot kísérletről készült, amelyben hibridizációs próbaként ³²P-jelzett 0,9 kb-os GAl-cDNS-t vagy cab-cDNS-t (klorofíl a/b-kötő fehérje génje) alkalmaztunk. Az RNS-t vad típusú négy hetes növényekből (1. sáv), öt hetes vad típusú növényekből (2. sáv), éretlen vad típusú becő- 19termésekböl (3. sáv), valamint négy hetes 31,89-jelü ga-1-mutáns növényekből (4. sáv) izoláltuk.

A 6. ábrán a GAl-gén részleges cDNS-szekvenciáját láthatjuk. A GAl-mRNS-sel komplementer GAl-DNS-szál az ábrán 5'^3'-irányban látható. A d352-jelü GA1-variáns a bemutatottal megegyező szekvenciájú, azzal az eltéréssel, hogy a 425. pozícióban G- helyett A-bázis szerepel. Az A428-jelű GA1-variáns szintén a bemutatottal megegyező szekvenciájú, azzal az eltéréssel, hogy a 420. pozícióban a C- helyett T-bázis szerepel. A Bo27-jelü GA1-variáns szekvenciája is megegyezik az ábrán bemutatottal, azzal az eltéréssel, hogy a 246. pozícióban C helyett T található.

A 7. ábrán a GAl-gén részleges cDNS-szekvenciáját láthatjuk. Az ábrán bemutatott GAl-DNS-szál a GAl-mRNS analógja, és a 6. ábrán bemutatott DNS-szál komplementere. A d352-jelü GA1-variáns szekvenciája azonos az ábrán bemutatottal, azzal az eltéréssel, hogy a 479. pozícióban C helyett T található. Az A428-jelű GAl-variáns szekvenciája azonos az ábrán láthatóval, azzal az eltéréssel, hogy a 484. pozícióban G helyett A található. A BO27-jelü GAl-variáns szekvenciája azonos az ábrán láthatóval, azzal az eltéréssel, hogy a 658. pozícióban a G helyett A található.

A 8. ábrán a GA1-fehérje teljes aminosavsorrendjét láthatjuk, melyet a 9. ábrán látható cDNS-szekvencia alapján határoztunk meg.

A 9. ábrán a 2,6 kb-os GAl-cDNS nukleotid szekvenciáját és az abból kikövetkeztetett aminosavsorrendet láthatjuk. A nukleotid szekvenciát a GenBank adatbázis számára felajánlottuk, U11034-es nyilvántartási számon. Az első nukleotid a 2406 bázispáros nyílt leolvasási fázis startkódonjának első nukleotidja. A szekvencia fölött csúcsokon álló háromszögekkel jelöl«· «4 «4 • · « *· · · »·· 9 ··· • s. · · ♦· • 4 ·« ···«· íl

-20tük az intronok pozícióit, ahogy azt a genomi DNS és cDNS szekvenciák összevetéséből megállapítottuk. A gal-6-, 7-, 8- és 9-jelü allélekben található nukleotid pontmutációkat aláhúzással jelöltük, és a mutációnak megfelelő bázis jelét a szekvencia fölé írtuk. A gal-4-allél tartalmaz egy rövid, 14 nukleotid hosszúságú deléciót, a 2375 és 2388 nukleotidok között, amint azt két nyíllal meg is jelöltük.

A 10. ábrán a GAl-lókusz fizikai térképét láthatjuk. A felső vízszintes vonal a Hindin restrikciós térképet ábrázolja, és a vastag vonal a GAlgén kódoló régióját jelöli. A feltételezett TATA-boxot (TATAAA), valamint a poliA-szignált (AATAAA) nyilakkal jelöltük. A gal-3 mutánsban található 5 kb-os deléció helyzetét két nyíllal jelöltük. A restrikciós térkép alatt található diagrammok a GAl-gén két cDNS klónjából (2,6 kb és 0,9 kb) levezetett intronok (vonalak) és exonok (sötét téglalapok) helyzetét mutatja. A 0,9 kb-os 5. exonja 48 nukleotiddal hosszabb volt (üres téglalap). A különböző allétokban található mutációk pozícióit a 2,6 kb-os cDNS diagrammja mellett megjelöltük: gal-2 (inverzió vagy inszerció), gal-4 (14 bázispáros deléció), valamint gal-1, 6, 7, 8, 9 (pontmutációk).

All. ábrán az Arabidopsis GA1-génjének E.co/z-ban történő túltermeltetését láthatjuk, T7 RNS polimeráz expressziós rendszer alkalmazásával. Az 1. és 4. sávban indukálatlan (-IPTG) nyers kivonatok képét láthatjuk, a 2. és 5. sáv pedig indukált sejtek (+IPTG) zárványfrakcióját tartalmazza, mely sejtek sorrendben a 0,9 kb-os és 2,6 kb-os GAl-cDNS-eket tartalmazták. A 3. és 6. sávban gélből tisztított GA1-proteinek képeit láthatjuk, sorrendben: 30 kD (rövidített) és 86 kD.

-21 ·· ···· • · V ··· · • · « ·· *·

A 12.A-12.E ábrákon a GGol és copalol GC-MS-azonosítását láthatjuk hidrolizált-metanolos E. coli extraktumokból. Az A és E ábrák tömegspektrumok, m/z = 290 értéknél (GGol és copalol molekula ionja). Az A és B ábrán sorrendben a GGol és a copalol autotentikus standardjait láthatjuk. A C, D és E ábrákon hidrolizált E. coli extraktumok tömegspektrumait láthatjuk, melyek sorrendben a következő plazmidokat tartalmazzák: pACCRT-E (GGPP szintáz), pACCRT-E és pGAl-40 (30 kD rövidített GAl-fehérje), pACCRT-E és pGAl-43 (86 kD GAl-fehérje).

A 13. ábrán Arabidopsis eredetű oldható fehérjefrakciók GA1fehérjeszintjeinek immunbiot analízisét láthatjuk, GA1-ellenszérum alkalmazásával. Két hetes Arabidopsis magoncokból készített fehérjeextraktumokat centrifugálással frakcionáltunk (100 000 g) és a felülúszó frakciót 8 %-os SDS-PAGE gélen elválasztottuk. A fehérje gélblottot 30 kD GA1ellenszérummal inkubáltuk, valamint peroxidázzal konjugált kecskében termeltetett antinyúl ellenszérummal, a detektálást pedig ECL-reagens hozzáadása után autoradiográfiával végeztük. Az ábrán látható felvétel sávjai a következőket tartalmazták: 15 nm pGAl-43-at hordozó E. coli-\)ó\ izolált géltisztított 86 kD fehérje (1. sáv); 50 mg CaMV 35S promóter-antiszensz GA1-konstrukciót tartalmazó transzgenikus növényekből izolált 100 g-felülúszó (2. sáv); CaMV 35S promóter-GAl (3. sáv); CaMV 35STEV-NTR-GA1 (4. és 5. sáv) Landsberg erecta (6. sáv).

A 14. ábrán a GAl-fehérje izolált borsókloroplasztokba történő importját láthatjuk. Az 1. és 2. sávban immunoblottokat láthatunk, melyek sorrendben a következőkről készültek: pGAl-43-at hordozó E. co//-ból izolált géltisztított 86 kD fehérje 10 ng-ja, valamint a CaMV 35S-TEV-NTR-GA1 ·· »··· • · · « ··· · • · · ί ·· ·· ·

-22génfúziót hordozó transzgenikus Arabidopsis-bó\ izolált 10 000 g-felülúszól5 mg-ja. A 3-5. sávokban különféleképpen kezelt ³⁵S jelzett GA1fehérjepreparátumokról készült fluorogrammot láthatunk. A 3. sávban látható minta egy in vitro transzlációs tennék, amely ³⁵S-jelzett GA1-fehérjét tartalmaz. A 4. és 5. sávokban jelölt fehérjemintákat láthatunk, intakt borsók, kloroplasztok által történt feltétel után, melyet proteázos felvétel követett, sorrendben 0,1 % Triton X-100 jelenlétében és anélkül.

A 15. ábrán a GAl-fehérje szekvenciájának összehasonlítását láthatjuk a dohányból szánnazó szeszkviterpén cikláz (tobsqpc), kaszbén szintáz, valamint limonén szintáz szekvenciájával. A konszenzus szekvenciában nagy betűkkel jelölt aminosavak azokat az aminosavakat jelölik, melyek mind a négy fehérjében azonosak. Amennyiben az első három peptid közül legalább egyben az aminosav megegyezik a GA1-fehérjében található aminosawal, a konszenzus szekvenciában ezt az aminosavat kis betűvel jelöltük. A pontok azt jelzik, hogy az adott pozíciókban nincs homológia az első három fehérje és a GAl-fehérje között. A feltételezett kétértékű ion pirofoszfát komplex kötőhelyet (DDXXD) bekeretezéssel jelöltük. A GA1szekvenciában a DXDDTA-szekvenciamotívumot félkövér betűkkel jelöltük.

A genomi kivonás eljárás alkalmazásával izoláltunk egy GA-szintézisben szerepet játszó gént. A genomi kivonás egy olyan eljárás, amelyben feldúsítunk és klonálisan izolálunk egy olyan génszekvenciát, amely egy bizonyos nukleínsav populációban jelen van, de egy másik populációból hiányzik. Az alábbiakban leírt eljárások, melyek a GAl-gén megklónozását • » » « ··

-23 mutatják be, lehetővé teszi, hogy más olyan géneket is megklónozzunk, melyek szerepet játszanak a GA-szintézisben.

A, kz Arabidopsis thaliana GA1-génje

A genomi kivonás eljárást alkalmazva megklónoztunk egy gént, amely szerepet játszik a GA-szintézisben, melyet az Arabidopsis thaliana GA1lókusza kódolt (ezután ezt a gént GA1-génnek fogjuk nevezni, lásd 1. példa).

A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik olyan vektorok, melyek tartalmaznak GAl-fehéijét vagy annak fragmensét kódoló genomi DNS-t vagy cDNS-t. Közelebbről az ilyen találmány szerinti vektorok alkalmasak az egyéb Arabidopsis thaliana eredetű DNS-tŐl lényegében mentes GA1-szekvencia nagy mennyiségben történő előállítására.

A leírásban használt értelemben növény kifejezést olyan értelemben használjuk, hogy az többsejtes differenciálódott élőlényt jelent, amely képes fotoszintézist végrehajtani, a kifejezés vonatkozik mind zárvatermő (egyszikű és kétszikű), mind pedig nyitvatermő növényekre.

A leírásban használt értelemben a növényi sejt kifejezés a növények strukturális és fiziológiai egységét jelenti. A növényi sejt kifejezés minden olyan sejtre vonatkozik, amely valamely növény része, vagy valamely növényből származik. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott bizonyos sejtek olyan differenciált sejtek, melyek valamely élő növény részei; sejttenyészetben tenyésztett differenciált sejtek; tenyészetben tartott differenciálatlan sejtek; valamint differenciálatlan szövetek sejtjei, mind például kallusz vagy tumorszövetek sejtjei.

-24A leírásban használt értelemben a növényi sejt utódja kifejezés bármely sejtre vagy szövetre vonatkozhat, amely valamely növényi sejtből származik, ilyen lehet például a kallusz; növényi részek, mint például szár, gyökér, gyümölcs, levél vagy virág; növények; növényi magvak; virágpor;

valamint növényi embriók.

A szaporító anyag kifejezés vonatkozik minden olyan növényi anyagra, amely alkalmas szexuális vagy aszexuális szaporításra, vagy szaporítható in vivő vagy in vitro. Az ilyen szaporító anyag előnyösen lehet például a regenerált növényből származó protoplaszt, sejt, kallusz, egyéb szövet, embrió vagy mag.

A transzgenikus növény kifejezés olyan növényt jelöl, melynek genetikus anyagába exogén DNS van stabilan beépülve. A kifejezés vonatkozik mindazon növényekre, melyek sejtjeibe vagy protoplasztjaiba valamilyen módon exogén DNS-t juttattunk, a bejuttatás módja lehet például csupasz DNS bejuttatása a cirkuláris lineáris vagy supercoiled formában, de bejuttatható a DNS nukleoszómákban, kromoszómákban vagy sejtmagok formájában vagy azok részeként, bejuttatható a DNS egyéb molekulákkal komplexálva vagy asszociálva, vagy líposzómákba, szferoplasztokba, sejtekbe vagy protoplasztokba zárva.

A mutáció kifejezés a genetikai anyagban létrejött knnutatható változást jelent, amely átadható az utódsejteknek, és lehetséges, hogy a következő generációknak is átadható, aminek eredményeképpen mutáns sejtek vagy mutáns élőlények keletkeznek. Amennyiben a mutáns sejt leszármazottai egy többsejtű élőlényben kizárólag szomatikus sejtek lesznek, az élőlényben egy mutáns sejteket tartalmazó pont vagy terület keletkezik. A sze-25xuálisan reprodukálódó élőlényekben a szaporító sejtekben bekövetkezett mutációk a gaméták útján átjuthatnak a következő generációba, aminek eredménye olyan egyedek keletkezése lesz, amely a mutáns sajátságot mind szomatikus, mind pedig szaporító sejtjeiben hordozza. Mutáció lehet bármely kimutatható nem természetes változás, amely befolyásolja a kémiai vagy fizikai összetételt, mutabilitást, replikációt, fenotípusos működést, vagy ezek kombinációja, de keletkezhet egy vagy több dezoxi ribonukleotid rekombinációja útján is; nukleotidok hozzáadódhatnak, deléciót szenvedhetnek, helyettesítödhetnek, invertálódhatnak, vagy áthelyeződhetnek új pozícióba inverzióval vagy anélkül. Mutációk keletkezhetnek spontán módon, de indukálhatok kísérleti úton is, mutagének alkalmazásával. A mutáció eredményeként egy nukleinsav molekula mutáns változata jön létre. A mutáns nukleinsav molekulából mutáns polipeptid származhat.

A faj kifejezés valóságosan vagy potenciálisan egymással kereszteződő természetes populációk csoportját jelöli. Egy nukleinsav molekulában vagy fehérjében bekövetkező fajra jellemző variáció egy olyan változás a nukleinsav vagy aminosav sorrendben, amely a különböző fajokban előfordul, és a kérdéses molekula DNS szekvenciájának meghatározása útján azonosítható.

Egy adott szekvencia fenntartására alkalmas vektorok sok különböző gazdasejtrendszer esetén ismeretesek, és az ilyen vektorok szakember számára könnyen átalakíthatok úgy, hogy tartalmazzák a GA1-szekvenciát, és azt egy kívánt gazdasejtben fenntartsák. Ilyen vektorok lehetnek többek között plazmidok és vírusok, és alkalmas gazdaszervezetek lehetnek például

-26eukarióta élőlények és sejtek, például élesztő-, rovar-, növényi, egér- vagy humánsejtek, valamint prokarióta élőlények, például E.coli és B. subtilis.

A leírásban használt értelemben akkor mondjuk, hogy valamely DNS lényegében mentes egyéb Arabidopsis thaliana DNS-ektől, ha a mintában vagy vektorban az Arabidopsis thaliana eredetű DNS-szekvenciák közül kizárólag a megadott szekvencia van jelen.

A leírásban használt értelemben a DNS-konstrukció kifejezés rekombináns, ember által előállított DNS-t jelöl.

A leírásban használt értelemben a GA1-szekvencia fragmense a GA1-szekvencia valamennyi polinukleotid részletére vonatkozik. A legelőnyösebb fragmensek azok, amelyek a GA1-enzim aktív helyét kódoló részletet vagy a GAl-gén szabályozó régióit tartalmazó részletet foglalnak magukban.

A találmány további előnyös megvalósítási módját jelentik olyan expressziós vektorok, melyek alkalmasak a GA1-fehérje nagy mennyiségben történő termeltetésére, oly módon, hogy az lényegében mentes legyen egyéb Arabidopsis thaliana fehérjéktől.

A leírásban akkor mondjuk, hogy egy fehérje lényegében mentes minden egyéb Arabidopsis thaliana fehéijétől, ha a kérdéses mintában az egyetlen Arabidopsis thaliana fehérje az expresszált fehérje. A kérdéses mintában jelen lehetnek ugyan olyan fehérjék, melyek egyéb Arabidopsis thaliana fehérjékkel homológok, a mintát még ebben az esetben is lényegében mentesnek mondjuk egyéb Arabidopsis thaliana fehérjéktől mindaddig, amíg a mintában található homológ fehérjék nem Arabidopsis thaliana-ban található génekről expresszálódtak.

V

-27Egy nukleinsav molekuláról, például DNS-molekuláról akkor mondjuk, hogy képes expresszálni egy polipeptidet, ha tartalmaz olyan nukleotid szekvenciákat, melyek magukban foglalnak transzkripciós és transzlációs szabályozó információt, és az ilyen szekvenciák funkcionálisan hozzá vannak kapcsolva a polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciákhoz. Egy funkcionális kapcsolat olyan kapcsolat, ami által a szabályozó DNSszekvenciák, és az expresszáltatni kívánt DNS-szekvencia oly módon van összekapcsolva, hogy az lehetővé tegye a génszekvencia expresszióját. A szabályozó régiók pontos természete, amely a génszekvencia expresszálásához szükséges, élőlényről élőlényre változhat, de általában magában foglal egy promoter régiót, amely prokarióták esetén tartalmazza mind a promótert (ami az RNS transzkripció iniciálódását irányítja), mind pedig azokat a szekvenciákat, melyek RNS-sé átíródva jelezni fogják a génszintézis iniciációjának helyét. Az ilyen régiók általában magukba foglalják azokat az 5'-végi nem kódoló szekvenciákat, melyek szerepet játszanak a transzkripció és transzláció iniciálásában, ilyenek például a TATA-box, a “sapkázó” szekvencia (capping sequence), a CAAT-szekvencia, és hasonlók.

Amennyiben szükséges a GAl-gén 3'-végi nem kódoló régióját is izolálhatjuk a fent leírt eljárások alkalmazásával. Erre a régióra a benne jelenlévő transzkripciós terminációs szabályozó szekvenciák miatt lehet szükség, ilyenek például a terminációs és poliadenilációs szignálok. Ily módon ha a GAl-gén természetes 3'-végi nem kódoló régióját megtartjuk, rendelkezésünkre állnak a transzkripciós terminációs szignálok is. Amennyiben a GAlgén eredeti transzkripciós terminációs szignáljai a kiválasztott gazdasejtben ♦ · « »

-28nem működnek kielégítően, alkalmazhatunk egyéb 3’-végi régiót is, amely a gazdasejtben működőképes.

Akkor mondjuk, hogy két DNS-szekvencia (mint például a GAl-gén promóter régiója és kódoló szekvenciája) funkcionálisan össze van kapcsolva, amennyiben a két DNS-szekvencia közötti kapcsolat 1) nem eredményez frame-shift-mutációt, 2) nem akadályozza, hogy a promóter régió szekvenciája irányítsa a GA1-génszekvencia transzkripcióját, és 3) nem akadályozza, hogy a GA1-génszekvencia a promóter régió szekvenciájának irányítása alatt átíródjék. Az elmondottak értelmében egy promóter régió akkor van funkcionálisan hozzá kapcsolva egy DNS-szekvenciához, ha a promóter képes a DNS-szekvencia transzkripcióját elősegítem.

A leírásban használt értelemben a sztringens hibridizációs körülmények olyan körülményeket jelentenek, melyeket szakember általában alkalmazna, ha azt akarná, hogy a hibridizálódó komplementer DNS vagy DNS és RNS láncok között legalább 90 % homológia legyen. Kisebb mértékű homológia is kívánatos lehet, például legalább 70 %-os homológia, vagy előnyösen legalább 80 %-os homológia, ami a hibridizációs körülmények változtatásával valósítható meg.

Mindössze három feltétel teljesülése szükséges ahhoz, hogy egy denaturált DNS-szál hibridizálódjék. 1) Szükséges, hogy a mintában legyen komplementer szál egy szálú formában. 2) Az egy szálú DNS-t tartalmazó oldat ionerősség elég nagy kell hogy legyen ahhoz, hogy a bázispárok kialakulhassanak; ez a gyakorlatban azt jelenti, hogy a sókoncentráció nagyobb kell hogy legyen 0,2 mól/l-nél. 3) A DNS-koncentrációnak elég nagynak kell lennie ahhoz, hogy intermolekuláris ütközések számottevő gyakorisággal ♦ · · · il ”

-29lejátszódjanak. Az említett 3) feltétel csak a hibridizáció sebességét érinti, azt nem befolyásolja, hogy a renaturálódás/hibridizáció be fog-e következni.

A szakember által alkalmazott hibridizációs körülmények leírása megtalálható könnyen hozzáférhető laboratóriumi kézikönyvekben, például a Curent Protocol in Molecular Biology, I. kötet, 2.10 fejezet, kiadó: John Wiley & Sons (1994), vagy Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1989), mely kézikönyvek teljes terjedelmükben a technika állásához tartozó kitanítás részét képezik. Ahogy a szakember számára kézenfekvő a hibridizációs sztringencia végeredményben tükrözi mind a hibridizációs körülményeket, mind pedig a hibridizációt követő mosási körülményeket, és szakember számára jól ismertek azok a lehetőségek, melyek alkalmazásával a feltételek változtatása útján a kívánt eredményeket elérheti. Az előhibridizációs oldatnak elégséges mennyiségű sót és nem specifikus DNS-t kell tartalmaznia ahhoz, hogy a szilárd hordozó nem specifikus helyeihez aspecifikus DNS hibridizálódjon, a megfelelő hőmérsékleten, és a kívánt előhibridizációs idő alatt.

Alkalmazhatunk például ismert hibridizációs elegyeket, mint például a Church és Gilbert féle hibridizációs elegyet [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1991 (1984)], melynek összetétele a következő: 1 % kristályos tisztaságú marhaszérum albumim; 1 mmól/1 EDTA; 0,5 mmól/1 NaHPO₄, pH=7,2; 7 % SDS. Az elöhibridizáció és a hibridizáció 65 °C-on játszódik le. A mosást kétszer 5 percig végezzük, 65 °C-on, 2x SSC oldat alkalmazásával (az lxSSC oldat összetétele a következő: 0,15 mól/1 NaCl, 0,015 mól/1 Nacitrát; pH=7,0), majd két 30 perces mosás következik 1 % SDS-t tartalmazó • · · ·

-302x SSC oldatban 65 °C-on, ezután pedig két 5 perces mosás következik szobahőmérsékleten 0,lx SSC oldattal.

Sztringens hibridizáció végrehajtása során eljárhatunk úgy is, hogy az előhibridizációs oldat a következőket tartalmazza: 6x SSC (egyszeres erősségű citrát oldat), 5x Denhardt-oldat, 0,05 % Na-pirofoszfát, valamint 100 pg/ml nem specifikus DNS, RNS vagy fehérje, például heringspermaDNS. Egy alkalmas sztringens hibridizációs elegy összetétele például a következő lehet: 6x SSC, lx Denhardt-oldat, 100 pg/ml nem specifikus DNS, RNS vagy fehérje, például élesztő tRNS és 0,05 % nátrium-pirofoszfát.

A DNS-DNS-analízist végezhetjük az alábbi eltérő körülmények között is:

1) Előhibridizáció szobahőmérsékleten és hibridizáció 68 °C-on;

2) Mosás 0,2x SSC/0,1 % SDS oldat alkalmazásával, szobahőmérsékleten;

3) Amennyiben kívánatos, további mosásokat hajthatunk végre 42 °Con 0,2x SSC/0,1 % SDS oldatban (közepes sztringecitású mosás); vagy

4) Kívánság szerint a további mosásokat végrehajthatjuk 0,lx SSC/0,1 % SDS oldatban 68 °C-on is (magas sztringencia.).

További eltérő ám hasonló reakciókörülményeket szintén találhatunk Sambrook és mtsai. Molecular Cloning című kézikönyvében (Cold Spring Harbor, 1989). Kívánság szerint formamid is alkalmazható az előhibridizációs vagy a hibridizációs oldatokban.

Szakember számára nyilvánvaló, hogy a felsorolt hibridizációs feltételek nem egyértelműen meghatározottak vagy nem kizárólagosak, és szakem• · · ·

-31 bér ezeket a feltételeket meg tudja változtatni valamely kívánt cél elérése érdekében.

Tehát, a GAl-gén expresszálásához szükség van olyan transzkripciós és transzlációs szignálokhoz, melyet az alkalmas gazdasejt felismer.

A találmány tárgyát képezi a GAl-gén által kódolt fehérje (vagy annak működőképes származéka) expresszálása mind prokarióta mind eukarióta sejtekben. Előnyös prokarióta gazdasejtek például: E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia fajok, stb. A legelőnyösebb eukarióta gazdaszervezet az E. coli. Különösen fontos bakteriális gazdaszervezetek a következők: E. coli KI2 294-es törzs (ATCC 31446), E. coli χ1776 (ATCC 31537), E. coli W3110 (F lambda’, prototróf; ATCC 27325), valamint egyéb enterobaktérium fajok, mint például a Salmonella typhimurium vagy Serratia marcescens, valamint különböző Pseudomonas fajok. Prokarióta gazdaszervezetben termeltetve a GAl-gén terméke nem glikolizálódik. A prokarióta gazdasejtet úgy kell megválasztani, hogy az expressziós plazmidban találhat replikonnal és szabályozó szekvenciákkal kompatibilis legyen.

Alihoz, hogy a GAl-gént (vagy annak működőképes származékát) prokarióta sejtben expresszáltatni tudjuk (például E. coli, B. subtilis, Pseudomonas, Streptomyces, stb. sejtekben), szükséges, hogy a GAl-gén kódoló szekvenciáját funkcionálisan hozzákapcsoljuk egy működőképes prokarióta promóterhez. Az ilyen promóterek lehetnek konstitutívak, vagy előnyösebben szabályozhatók (azaz indukálhatok vagy derepresszálhatók). Konstitutív promóterek példáiként megemlítjük a λ-bakteriofág intpromóterét, a pBR322-plazmid β-laktamáz génjének bla-promóterét, vala• · «

-32mint a pDR325-plazmid klóramfenikol ac«til transzferáz génjének CATpromóterét, és hasonlókat. Indukálható prokarióta promóterek példáiként megemlítjük a λ-bakteriofág fő jobboldali és baloldali promótereit (P_L és P_R), az E. coli trp-, recA-, lacZ-, lacl- és gal-promótereit, a B. subtilis aamiláz- [Ulmanen, I., és mtsai.: J. Bacteriol. 162. 176 (1985)] és ς-28specifikus promótereit [Gilman, M.Z.: és mtsai.: Gene sequence 32. 11 (1984)], a bacillus nemzetség bakteriofágjainak promótereit [Gryczan, T.J.: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., NY (1982)], valamint a sztreptomicesz promótereket [Ward, J.M. és mtsai.: Mól. Gén. Génét. 203. 468 (1986)].

A prokarióta promóterekről összefoglalást közölt Glick, B.R. (J. Ind. Microbiol. 1, 277 (1987)]; Cenatiempo, Y. [Biochimie 68, 505 (1986)], valamint Gottesman, S. [Ami. Rév. Génét. 18,415 (1984)].

A prokarióta sejtekben történő expresszióhoz szükséges egy riboszómakötő hely jelenléte is, a gén kódoló szekvenciájától 5'-irányban. Alkalmas riboszómakötő helyek leírását megtalálhatjuk például Gold, L. és mtsai. közleményében [Ann. Rév. Microbiol. 35, 365 (1981)].

Előnyös eukarióta gazdaszervezetek például az élesztők, egyéb gombák, rovarsejtek, emlőssejtek in vivő vagy szövettenyészetben. Alkalmas emlőssejtek többek között a fíbroblaszt eredetű VERŐ- vagy CHO-K1sejtek, a linfoid-eredetü sejtek, mint például az SP2/0-AG14-jelü hibridóma sejtek vagy a p3x63Sg8-jelű mielóma sejtek, valamint ezek származékai. Az előnyös emlős gazdasejtek, mint például az SP2/0- és a J558L-sejtek, valamint a neuroblasztóma sejtvonalak, mint például az IMR 332 sejtvonal nagyobb kapacitással képesek végrehajtani a poszt-transzlációs módosításokat.

-33Számos különböző vektorrendszer rendelkezésre áll a GAl-gén emlős gazdasejtekben történő expresszálására. A gazdasejttől függően transzkripciós és transzlációs szabályozó szekvenciák széles választékát alkalmazhatjuk. A transzkripciós és transzlációs szabályozó szekvenciák származhatnak például virális forrásból, például adenovírusból, marhapapilloma-vírusból, majom vírusból és hasonlókból, mely forrásokban a szabályozó szekvenciák olyan génszekvenciával vannak összekapcsolva, mely génszekvencia nagy mennyiségben expresszálódik. Alkalmazhatjuk azonban emlős eredetű expressziós termékek promótereit is, például aktin-, kollagén- és miozinpromótereket, és hasonlókat. Választhatunk olyan transzkripciós iniciációs szabályozó szekvenciákat, melyek gátolhatok vagy aktiválhatok, és ily módon a kívánt génszekvencia expresszi ója modulálható. Előnyösek az olyan szabályozó szekvenciák, melyek hőérzékenyek, és ezek alkalmazásával a hőmérséklet változtatására az expresszió gátlódik vagy iniciálódik, és előnyösek az olyan szabályozó szekvenciák is, melyek különböző vegyületekkel (például metabolitokkal) szabályozhatók.

Az élesztő gazdasejtek jelentős előnye, hogy képesek végrehajtani a poszt-transzlációs peptid módosításokat. Kívánt fehérjék élesztőben történő termeltetésére rendelkezésre áll számos rekombináns DNS-stratégia, melyek szerint erős promóterszekvenciákat és magas kópiaszámú plazmidokat alkalmaznak a kívánt fehérje termeltetésére. Az élesztősejtek felismerik a klónozott emlős eredetű géneken található szignálszekvenciákat, és szekretálja a szignálszekvenciákat hordozó peptideket (azaz a prepeptideket).

··· · ιί

-34Amennyiben az élesztőseteket glükózban gazdag táptalajon növesztjük, bármely olyan expressziós rendszert alkalmazhatunk, melyek a nagy mennyiségben termelődő glikolitikus enzimek promóter és terminátor szekvenciáinak alkalmazását alapulnak. Az ismert glikolitikus génszekvenciák rendkívül hatékony transzkripciós szabályozó szekvenciákat is tartalmaznak. A fenti célokra alkalmas szabályozó szekvenciák például a foszfoglicerát kináz gén promóter és terminátorszekvenciái.

További előnyös gazdasejtek a rovarsejtek, például a drozofilalárvából származó sejtek. Amennyiben gazdasejtként rovarsejteket alkalmazunk, használhatjuk például a drozofíla alkohol dehidrogenáz promóterét [Rubin, G.M.: Science 240. 1453 (1988)]. A bacullóvírus eredetű vektorok is alkalmassá tehetők a GAl-gén nagy mennyiségben történő expresszáltatására rovarsejtekben [Jasny, B.R.: Science 238. 1653 (1987); szerzők: Miller, D.W. és mtsai.: Genetic Engineering szerk.: Setlow, J.K. és mtsai., Plenum, 8. kötet, 277-297. old (1986)].

Ahogy azt már ismertettük, ahhoz, hogy a GAl-gént eukarióta gazdasejtekben tudjuk expresszáltatni, eukarióta szabályozó régiók alkalmazására van szükség. Az ilyen szabályozó régiók általában magukba foglalnak egy olyan promóter régiót, amely elégséges az RNS-szintézis iniciálására. Előnyös eukarióta promóterek példáiként megemlítjük az egér-metallotionein-1gén promóterét [Hamer, D. és mtsai.: J. Mól. Appl. Gén. 1, 273 (1982)]; a herpesz-vírus TK-promóterét (McKnight, S.: Cell 31, 355 (1982)]; az SV-40 korai promótert [Benoist, C. és mtsai.: Natúré (London) 290. 304 (1981)]; valamint az élesztő gal4-génjének promóterét [Johnston, S.A. és mtsai.:

• ·· ·

-35Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79, 6971 (1982); Silver, P.A. és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81, 5951 (1984)].

Amint az közismert, az eukarióta inRNS transzlációja az első metionin kódonnál kezdődik. Éppen ezért előnyös gondoskodni arról, hogy a GAl-gén (vagy annak működőképes származéka) kódoló szekvenciája és az eukarióta promóter közötti kapcsoló régió ne tartalmazzon metionint kódoló kódont (azaz AUG-kódont). Ilyen kódon jelenléte az említett régióban vagy fúziós fehérje termelődését eredményezné (abban az esetben, ha az AUGkódon azonos leolvasási fázisban található a GAl-gén kódoló szekvenciájával), vagy ún. frame-shift mutáció keletkezik (abban az esetben, ha az AUG-kódon nincs a GAl-gén kódoló szekvenciájával azonos leolvasási fázisban).

A GAl-gén kódoló szekvenciáját és a funkcionálisan hozzá kapcsolt promótert bejuttathatjuk a recipiens prokarióta vagy eukarióta sejtbe nem replikálódó DNS (vagy RNS) molekula fonnájában, mely molekula lehet lineáris, vagy előnyösebben kovalensen zárt cirkuláris molekula. Mivel az ilyen molekulák nem képesek autonóm módon replikálódni, a GAl-gén expressziója ebben az esetben a bejuttatott szekvencia tranziens expressziója révén valósul meg. Megvalósulhat azonban permanens expresszió is, amennyiben a bejuttatott szekvencia beépül a gazdasejt kromoszómájába.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint olyan vektort alkalmazunk, mely képes a kívánt génszekvenciát a gazdasejt kromoszómájába integrálni. Azokat a sejteket, melyek a bejuttatott DNS-t stabilan a kromoszómájukba integrálódva tartalmazzák, oly módon szelektálhatjuk, ♦ ·9·

-36hogy a kívánt szekvenciával együtt egy vagy több marker-gént is bejuttatunk, melyek lehetővé teszik azon gazdasejtek kiválasztását, melyek tartalmazzák az expressziós vektort. A marker-gén például prototrófíát biztosíthat egy auxotróf gazdasejt számára, rezisztenssé teheti azt valamilyen káros hatóanyaggal szemben, például antibiotikumokkal, nehézfémekkel (például rézzel) és hasonlókkal szemben. A szelektálható marker-gén szekvenciáját közvetlenül hozzá kapcsolhatjuk az expresszáltatni kívánt gén DNSszekvenciájához, de bejuttathatjuk azt a sejtbe kotranszfekció útján is. További szekvenciaelemekre is szükség lehet az egyszálú RNS-kötő fehérjék és az mRNS-közötti komplexek optimális kialakulásához. Ezek a szekvencialemek lehetnek többek között splicing szignálok, valamint transzkripciós promóterek, enhanszerek és terminációs szignálok. Az ilyen szekvencialemeket tartalmazó cDNS-expressziós vektorok leírása megtalálható például Okayama, H. közleményében [Molec. Cell. Bioi. 3, 280 (1983)].

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a bejuttatandó szekvenciát plazmid eredetű vagy virális vektorba juttatjuk, amely a recipiens gazdasejtben képes autonóm módon replikálódni. Erre a célra számos különböző vektor alkalmazható. A megfelelő plazmid- vagy virálisvektor kiválasztásának szempontjai többek között a következők: milyen könnyű a vektort tartalmazó recipiens sejteket felismerni és elválasztani azoktól a recipiens sejtektől, amelyek nem tartalmaznak vektort; az adott gazdasejtben kívánatos vektorkópiaszám; valamint: kívánatos-e, hogy a vektor képes legyen ingázni különböző fajokhoz tartozó gazdasejtek között. Előnyös prokarióta vektorok például az £. coliban replikálódni képes ···· <ί ·· ·· ··

-37 plazmidok (például: pBR322, ColEl, pSCIOl, pAYCYC 184, ttVX). Az ilyen plazmidok leírását megtalálhatjuk például Maniatis, T. és mtsai. kézikönyvében [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)]. Bacillus-fajokban alkalmazható plazmidok például a pC194, pC221, pT127, és hasonlók. Ilyen plazmidok leírását megtalálhatjuk Gryczan, T. kézikönyvében [The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY, 307-329. old (1982)]. Alkalmas sztreptomícesz plazmid például a pIJlOl [Kendall, K. J. és mtsai.: J. Bacteriol. 169, 4177 (1987)], és alkalmas sztreptomícesz bakteriofág például a <j>C31 [Chater, K.F. és mtsai.: Sixth Intemational Symposium on Actinomycetales Biology, Akadémiai Kiadó, Budapest, Magyarország, 45-54. old. (1986)]. A pszeudomonasz-fajokban alkalmazható plazmidok összefoglalását megtalálhatjuk John, J.F. és mtsai. [Rév. Infect. Dis. 8, 693 (1986)], valamint Izaki, K. közleményében [Jpn. J. Bacteriol. 33,729 (1978)].

Előnyös eukarióta vektorok például a BPV, vakcínia, SV40, 2mikronos cirkuláris DNS és hasonlók, valamint ezek származékai. Az ilyen vektorok szakember számára jól ismertek [Botstein, D. és mtsai.: Miami Vntr. Symp., 19, 265 (1982); Broach, J.R. The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor, NY, 445-470. old. (1980); Broach, J.R.: Cell 28, 203 (1982); Bollon, D.P. és mtsai.: J. Clin. Hematol. Oncol. 10, 39 (1980); Maniatis, T.: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, 3. kötet, Gene sequence Expression, Academic Press, NY, 563-608. old. (1980)].

» ·

-38Amennyiben előállítottuk a vektort vagy a DNS-szekvenciát, amely tartalmazza a kívánt konstrukció(ka)t, és azt expresszióra előkészítettük, a DNS-konstrukció(ka)t a megfelelő gazdasejtbe számos különböző eljárás alkalmazásával bejuttathatjuk, például: transzformáció, transzfekció, konjugáció, protoplasztfúzió, elektroporáció, kálciumfoszfátos kicsapás, közvetlen mikroinjektálás, és hasonlók. A vektor bejuttatása után a recipiens sejteket olyan szelektív táptalajon növesztjük, amely szelekciós előnyt biztosít a vektort tartalmazó sejtek számára. A megklónozott génszekvencia(k) expressziója a GA1-géntermék vagy annak íragmensei termelődését eredményezi. Az expresszió történhet közvetlenül a transzformált sejtekben, mint olyanokban, de történhet a transzformált sejtek differenciálódásának indukálása után is (például neuroblasztóma és hasonló sejtek esetén brómdezoxiuracil hozzáadása után).

Az alkalmas gazdasejtben történő expressziót követően a GA1fehérjét közismert eljárások alkahnazásával könnyen izolálhatjuk, ilyen eljárások például az immunkromatográfía vagy a HPLC, melyek alkalmazásával egyéb Arabidopsis thaliana fehérjéktől mentes GA1-fehérjét állíthatunk elő.

A sétálás a kromoszómán eljárás alkalmazásával szakember kőnynyen izolálhat más teljes hosszúságú genomi GA1-kópiát, csakúgy mint olyan kiónokat, melyek a GA1-kódoló régió 5'-végi szabályozó szekvenciáját tartalmazzák. A leírásban használt értelemben a teljes hosszúságú genomi kópia kifejezés olyan DNS-szegmenst jelöl, amely tartalmazza egy protein teljes kódoló régióját.

A leírásban használt értelemben a szabályozó szekvenciák kifejezés olyan DNS-szekvenciákat jelent, melyek képesek funkcionálisan hozzájuk

-39·· ·.·· « ..

· ·· ··· kapcsolt DNS/RNS-szekvenciák transzkripcióját és/vagy transzlációját irányítani. Ilyen szabályozó szekvenciák lehetnek többek között: promóterek, riboszómakötő helyek, valamint szabályozó fehérjék kötőhelyei. Szakember számára nem okoz nehézséget bizonyos szabályozószekvenciák azonosítása, oly módon, hogy valamely kódoló régiótól 5'-irányban található szekvenciákat összehasonlít ismert szabályozó szekvencia motívumokkal, például olyan szekvenciákkal, melyeket a motívumkereső és konszenzusszekvencia kereső számítógépes programok felismernek.

Részletezve: a találmány szerinti GAl-DNS-szekvenciát használtuk fel egy Arabidopsis thaliana genomi DNS-könyvtár átvizsgálására, a sétálás a kromoszómán eljárás alkalmazásával. Arabidopsis thaliana genomi DNS-könyvtárakat kereskedelmi forgalomban be lehet szerezni (Clontech Laboratories Inc., American Type Culture Collection), de elő lehet ilyeneket állítani a szakirodalomból ismert eljárások alkalmazásával is [Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989)]. Olyan átfedő szekvenciákat tartalmazó kiónok izolálása útján, melyek egy bizonyos szekvenciától 5'- vagy 3'-irányban helyezkednek el, azonosítottunk és izoláltunk olyan szekvenciákat, melyek képesek hibridizálódni a 6. ábrán látható szekvenciával. Ilyen szekvenciákat tartalmaznak a pGAl-4 (ATCC 75395) és a ZGAl-3-jelű vektorok.

A szabályozó szekvenciák általában a kódoló régiótól 5'-irányban helyezkednek el. A találmány szerinti előnyös szabályozó szekvenciák azok, melyek a GAl-gén startkódonjától (ATG/Met) 5'-irányban -2. kb és 0. bp között helyezkednek el. Az előnyösebb szabályozó szekvenciák körülbelül -40500. bp és 0. bp között helyezkednek el, a legelőnyösebbek pedig körülbelül -250. bp és 0. bp között.

A szakirodalomból közismert eljárások alkalmazásával és a leírásban feltárt kiónok felhasználásával lehetségessé vált a GAl-gén működőképes származékainak előállítása, csakúgy mint a GAl-gén szabályozó szekvenciáinak izolálása. Az ilyen származékok szakember számára lehetővé teszik, hogy egy adott biológiai aktivitást valamilyen specifikus szekvenciához és/vagy struktúrához kapcsoljon, majd ezután megtervezzen és előállítson olyan származékokat, melyek megváltozott biológiai vagy fizikai sajátságokkal rendelkeznek. Az ilyen szabályozó régiók szakember számára lehetővé teszik, hogy a szabályozó elem működőképes származékához funkcionálisan hozzákapcsoljon nem homológ (azaz nem GA1-eredetű) szekvenciaelemeket, és ily módon valamely kívánt hibridstruktúrát állítson elő, melynek hibridsajátságai vannak.

Működőképes származékokat előállíthatunk például helyspecifikus mutagenézis alkalmazásával [Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989)]. A helyspecifíkus mutagenezis lehetővé teszi működőképes származékok előállítását olyan specifikus oligonukleotidok alkalmazásával, melyek tartalmazzák a kívánt mutáns DNS-szekvenciát.

Bár a bejuttatandó szekvenciavariáció pozíciója előre meghatározott, maga a mutáció nem szükségszerű, hogy előre meghatározott legyen. Annak érdekében például, hogy egy adott helyen előállítsuk az optimális mutációt, alkalmazhatunk egy bizonyos célrégióban véletlenszerű mutagenezist is, és • : .·· •· ·· ···

-41 az újonnan előállított génszekvenciákat szűrővizsgálatnak vethetjük alá az elérni kívánt optimális aktivitáskombináció vonatkozásában.

Az ily módon előállított működőképes származékok rendelkezhetnek minőségileg azonos biológiai aktivitással, mint a természetesen előforduló szekvencia, amennyiben egy heterológ génhez funkcionálisan hozzá vannak kapcsolva. A származék azonban lényegesen különbözhet a természetes szekvenciától olyan sajátságok vonatkozásában, mint például a fítohonnonok hatására bekövetkező indukció szint mértéke.

Szakember számára kézenfekvő, hogy az előállított származék működőképességét rutinszerű vizsgálati eljárásokkal lehet értékelni. Egy helyspecifikus mutagenezissel előállított működőképes származékot például funkcionálisan hozzákapcsolhatunk egy riportergénhez, például a βglükuronidázhoz (GUS), majd a kiméra gént kvantitatív szűrővizsgálatnak vethetjük alá fítohormon-reszponzibilitás vonatkozásában, kiméra vagy transzgenikus növényekben, vagy pedig egy tranziens expressziós rendszerben.

A GA1-szabályozóelemek és egy riportergén felhasználásával előállíthatunk olyan mutációkat, melyek megváltoztatják a GAl-promóter szövetspecifitását vagy erősségét. A GA1-szabályozó elemek szekvenciájának analízise által szakember képes felismerni a GAl-promóterben jelenlévő különböző fehérjekötő szekvenciamotívumokat, és a mutagenezist ezekbe a régiókba irányíthatja.

A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik a GA1-fehérjéhez kötődni képes ellenanyagok is.

-42 Részletezve: a GA1-fehérjéhez kötődni képes ellenanyagokat számos különböző - a szakirodalomból ismert - eljárás alkalmazásával előállíthatunk. Közelebbről, egy ilyen eljárás szerint a GA1-fehérjét megtisztítjuk vagy egy expresszáló gazdasejtböl vagy egy növényi szövetből, és a tisztított fehérjét alkalmas emlős gazdaszervezet immunizálására használjuk fel. Szakember számára nem okoz gondot az ismert eljárások adaptálása útján akár poliklonális, akár monoklonális anti-GAl-ellenanyagokat előállítani [Harlow: Antibodies, Cold Spring Harbor Press (1989)].

Eljárhatunk úgy is, hogy az anti-GAl-ellenanyagokat szintetikus peptidek alkalmazásával állítjuk elő. A leírásban feltárt GA1-génszekvencia által kódolt aminosavsorrend felhasználásával előállíthatunk olyan szintetikus peptidet, amely megfelelő gazdaszervezetbejuttatva olyan ellenanyagok képződését fogja kiválasztani, melyek képesek kötődni a GA1-fehérjéhez.

A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezi egy eljárás a GAl-gén expressziójának kimutatására, vagy a GAl-fehérje jelenlétének kimutatására, valamely sejtben vagy szövetben.

Közelebbről, a találmány szerinti ellenanyagok és DNS-szekvenciák alkalmazásával szakember könnyen átalakíthat valamely ismert vizsgálati eljárási elrendezést, például az in situ hibridizációt, az ELISA-eljárást, valamint a fehérje vagy nukleinsav blotolási eljárásokat, oly módon, hogy alkalmazásukkal kimutathatóvá váljon a GA1-fehérjét kódoló RNS vagy a GAl-fehérje jelenléte. Az ilyen kimutatási eljárások alkalmazásával lehetőség nyílik azon specifikus szövetek és sejtek azonosítására, melyekben a GAl-gén átíródik, vagy expresszálódik.

• ·

B. A GAl-gént utánzó expressziós mintázatú géneket tartalmazó transzgenikus és kiméra növények

A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezi egy eljárás olyan kiméra- vagy transzgenikus növények előállítására, melyek tartalmaznak egy vagy több kívülről bejuttatott gént, amely a GA1-génnel azonos időbeli és térbeli mintázat szerint expresszálódik.

Részletezve: olyan kiméra- vagy transzgenikus növényt állítunk elő, amely egy kívülről bejuttatós expressziós modult tartalmaz. Az expressziós modul a GAl-gén szabályozó elemeit tartalmazza, funkcionálisan a heterológ génhez kapcsolva.

Amint azt korábban már leírtuk, a GAl-gén szabályozó régiója a GA1-fehérje startkódonjától (Met) számítva körülbelül a -2. kb és 0. bázispár közötti régióban található, 5'-irányban. Szakember számára nem jelent nehézséget olyan expressziós modulok előállítása, melyek tartalmazzák ezt a régiót vagy ennek a régiónak valamely fragmensét.

A szakirodalomból jól ismertek olyan eljárások, melyek alkalmazásával heterológ géneket valamely szabályoz régióhoz kapcsolhatunk, majd a heterológ gén expresszióját növényekben megvalósíthatjuk [Weisbach és mtsai.: Methods fór Plánt Molecular Biology, Academic Press, San Diego, CA (1988)]. Szakember számára nem jelent nehézséget az olyan növényi sejtek transzformálására alkalmas eljárások GA1-szabályozó szekvenciaelemek alkalmazására történő adaptálása, mint például az elektroporáció, Ti-plazmid közvetítette transzformáció, részecskék felgyorsítása, valamint növények regenerálása. A találmány szerinti expressziós modulokkal mindazon növények transzformálhatok, melyekből protoplasztot i

-44lehet izolálni, és a protoplasztokat lehet oly módon tenyészteni, hogy azokat teljes növénnyé regeneráljuk. Az expresszió hatékonysága az alkalmazott növényektől függően a különböző fajokban különböző lesz. Mindazáltal szakember számára nem jelent nehézséget azonosítani azokat a növényváltozatokat, melyekben a GA1-szabályozó szekvenciaelemek működőképesek.

A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezi egy eljárás a GA1-fehérjét kódoló RNS transzlációjának modulálására kiméra vagy transzgenikus növényekben.

A leírásban használt értelemben a modulálás kifejezés a transzláció természetesen meglévő mértékének fokozását vagy csökkentését jelenti.

Közelebbről, a GA1-fehérjét kódoló RNS transzlációját csökkenthetjük például az ántiszensz klónozási stratégia alkalmazásával. Az antiszensz klónozási stratégiáról kimutatták, hogy növényi rendszerekben is hatékonyan alkalmazható, és szakember számára nem jelent nehézséget az ilyen klónozási stratégia adaptálása a GAl-gén felhasználásával [Oeller és mtsai.: Science 254, 437 (1991)].

Általánosságban az antiszensz klónozási stratégia olyan expressziós modul előállítását jelenti, amely egy olyan RNS-t kódol, amely komplementer (antiszensz) a GA1-fehérjét kódoló RNS-sel (szensz-RNS). Amennyiben az antiszensz RNS-t olyan sejtben expresszáltatjuk, amelyik a szensz-szálat is expresszálja, a két RNS-szál között hibridizáció fog bekövetkezni, amely a transzláció gátlódását eredményezi.

A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezi egy eljárás a GAl-fehérje aktivitásának modulására.

Il

-45 Közelebbről, a GA1-fehérje aktivitása valamely transzgenikus vagy kiméra növényben gátolható oly módon, hogy a növényt olyan expressziós modullal transzformáljuk, amely anti-GAl-ellenanyagot kódol. Az expresszálódott ellenanyag kötődni fog a szabad GA1-fehérjéhez, és ily módon meggátolja a fehérje működését.

Szakember számára kézenfekvő, hogy a szakirodalomból ismert eljárások alkalmazásával nem jelent nehézséget olyan DNS-t előállítani, amely anti-GAl-ellenanyagot kódol. Általánosságban az ilyen DNS-t cDNSformájában állítják elő, olyan mRNS-ből kiindulva, melyet anti-GAlellenanyagokat termelő hibridóma sejtekből izoláltak. Az ilyen hibridóma sejtek előállítására alkalmas eljárásokat a korábbiakban már ismertettünk.

C. Növényi génexpresszió tanulmányozására alkalmas expressziós rendszer

A találmány egy további megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezi egy eljárás azon molekuláris kölcsönhatások és fehérjék azonosítására, melyek a GAl-gén indukciójáért felelősek.

Közelebbről, a GAl-gén szabályozó szekvenciáinak alkalmazásával lehetséges olyan fehérjéket izolálni, melyek ezekhez a szekvenciákhoz kötődnek.

A szakirodalomban közismertek olyan eljárások, melyek lehetővé teszik, hogy olyan szabályozó faktorokat izoláljunk, melyek kötődnek egy adott DNS-szekvenciához. Egy ilyen eljárás például az affinitáskromatográfía. A szabályozó szekvenciát tartalmazó DNS-t alkalmas szilárd hordozón immobilizáljuk - ilyen hordozó lehet például a szefaróz® - és a hordozót a kromatográfiás eljárás során affinitásmátrixként használjuk [Arcangioli B. és mtsai.: Eur. J. Biochem, 179, 359 (1989)].

-46A GAl-gén szabályozó elemeihez kötődő fehérjéket olyan növényi szövetekből nyerhetünk, melyek a GAl-gént expresszálják. Az ily módon előállított extraktumot olyan oszlopra visszük fel, amely immobilizált GA1szabályozó régiót tartalmaz. Azokat a fehérjéket, melyek nem kötődnek a DNS-szekvenciához, az oszlopról lemossuk, azokat a fehérjéket pedig, amelyek kötődnek a DNS-szekvenciához, az oldatról sógradiens alkalmazásával távolítjuk el. Az ily módon izolált fehérjéket tovább tisztíthatjuk olyan eljárások alkalmazásával, mint például az ioncserés kromatográfia, a nagy hatékonyságú folyadékkromatográfía (HPLC), valamint a méretkizárásos kromatográfia.

A DNS-kötő fehérje jelenlétét a tisztítás során gél-retardációs vizsgálati eljárás alkalmazásával könnyen kimutathatjuk [Gamer, M.M. és mtsai.: Nucl. Acid Rés., 9, 3047 (1981) és Fried, M. és mtsai.: Nucl. Acid Rés. 9, 6506(1981)].

Amennyiben a DNS-kötő fehérjét megtisztítottuk, meghatározhatjuk a fehérje részleges N-terminálís aminosavsorrendjét. Eljárhatunk úgy is, hogy a fehérjét tripszinnel térképezzük, és meghatározzuk valamelyik kapott fragmens aminosavsorrendjét.

A következő lépésben a meghatározott aminosavsorrendet oligonukleotid hibridizációs próba előállítására használjuk fel. A hibridizációs próba szekvenciáját azokra a kódonokra alapozhatjuk, melyekről ismert, hogy az adott élőlény gyakrabban használja azokat (kódonpreferencia), de eljárhatunk úgy is, hogy a hibridizációs próbát úgy állítjuk elő, hogy tartalmazza valamennyi lehetséges kódon kombinációját, amely a polipeptidet kódolja (degenerált oligonukleotid).

-47Az így előállított hibridizációs próbát azután felhasználhatjuk cDNS vagy genomi könyvtárak átvizsgálására, a DNS-kötő fehérje kódoló szekvenciáinak izolálása céljából. Miután izoláltuk a DNS-kötő fehérje génjét, a kötő fehérjét kódoló DNS szekvenciáját meghatározhatjuk, és a gént felhasználhatjuk a fehérje expressziós rendszerben történő nagy mennyiségű termelésére, vagy végrehajthatunk rajta mutációs analízist, hogy pontosabban meghatározzuk azokat a funkcionális régiókat a protein szerkezetében, melyek a DNS-sel kölcsönhatásba lépnek.

Eljárhatunk úgy is, hogy a GA1 regulációs szekvenciaelemekhez kötődő fehérjéket olyan klónokból izoláljuk, melyek ezeket a fehérjéket expresszálják, a Southwestem-blot eljárás alkalmazásával [Sharp, Z.D. és mtsai.: Biochim Biophys Acta, 1048, 306 (1990); Gunther, C.V. és mtsai.: Genes Dev. 4, 667 (1990); és Walker, M.D. és mtsai.: Nucleic Acids Rés. 18,1159 (1990)].

A Southwestem-blot-eljárásban jelzett DNS-szekvenciát alkalmazunk egy cDNS expressziós könyvtár szűrővizsgálatára, oly módon, hogy a könyvtár kiónjai által expesszált fehérjéket egy filteren immobilizáljuk, kolónia- vagy plakk-transzfer útján. A jelzett DNS-szekvenciák hozzá fognak kötődni azokhoz a kolóniákhoz vagy plakkokhoz, melyek olyan fehérjét expresszálnak, amelyik képes megkötni az adott DNS-szekvenciát. A jelzett DNS-szekvenciát kötő fehérjét expresszáló klónból ezután izolálhatjuk a cDNS-inszertet, amelyik a DNS-kötő fehérjét kódolja, és azt meg is szekvenálhatjuk. Az izolált DNS-t felhasználhatjuk arra, hogy a fehérjét további tisztítás és tanulmányozás céljából nagyobb mennyiségben termeltessük, vagy arra, hogy izoláljuk a cDNS-szekvenciákat megfelelő genomi

-48szekvenciákat, vagy pedig arra, hogy működőképes kötöfehérje származékokat állítsunk elő.

D. Egyéb növényi fajokból izolált GA1-génnel homológ DNS-szekvenciák

Az eddigiekben leírt Arabidopsis thaliana fajból izolált DNSszekvenciák felhasználásával lehetőség nyílik arra, hogy egyéb növényfajokból homológ DNS-szekvenciákat izoláljunk.

Közelebbről, a 6. ábrán látható GAl-DNS-szekvencia, vagy annak egy ffagmense felhasználásával szakember rutin eljárások alkalmazásával át tud vizsgálni egyéb növényfajtákból előállított genomi- vagy cDNSkönyvtárakat, hogy a GA1-génnel jelentős homológiát mutató ekvivalens DNS-szekvenciákat izoláljon. Az ilyen homológ szekvenciák izolálása útján lehetségessé válik a GAl-gén evolúciójának vizsgálata a növényfajok között.

Ezen felül azáltal, hogy megvizsgáljuk a különbségeket a különböző forrásokból izolált GA1-fehérjék enzimaktivitásai között, és megvizsgáljuk a különbségek összefüggéseit a szekvenciákban mutatkozó különbségekkel, lehetővé válik, hogy bizonyos működésbeli különbségeket a fehérje bizonyos szerkezeti régióihoz kössünk.

Az eddigiekben feltárt találmány tárgyát elsősorban a GAl-gén képezi. Szakember számára kézenfekvő, hogy a leírásban feltárt eljárások alkalmazásával izolálni lehet más olyan DNS-szekvenciákat is, melyek a GAszíntézisben szerepet játszó enzimeket kódolnak.

Miután általánosságban jellemeztük a találmány szerinti megoldást, a továbbiakban azt a bemutatott példákon keresztül kívánjuk részletesebben <1

-49szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk, kivéve azt az esetet, ha ezt kifejezetten jelezzük.

/. példa

A genomi kivonás eljárást az Arabidopsis thaliana Landsberg erecta DNS és a gal-31,89-DNS felhasználásával a korábbiakban leírtak szerint hajtottuk végre [Straus és Ausubel: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1889 (1990)] az alábbi módosításokkal.

DNS-t izoláltunk az Arabidopsis thaliana Landsberg erecta növényből, valamint a gal mutánsból (31,89), és a DNS-t CsCl-gradienscentrifúgálással tisztítottuk, Ausubel és mtsai. eljárásai szerint [Current Protocols in Molecular Biology, 1. kötet, Greene Publishing Associates/Wiley-Interscience, New York (1990)]. Az első kivonási ciklusban 0,25 pg Landsberg erecta DNS-t megemésztettünk Sau3A-enzimmel, és

12,5 pg összetört, fotobiotinilált 31,89-gal-mutáns-DNS-sel hibridizáltuk. Minden következő ciklusban 10 pg biotiniált 31,89-DNS-t adtunk a hibridizációs reakcióelegyhez. A hibridizációkat legalább 20 órán keresztül hajtottuk végre, 65 °C-on, 3 pg/ml DNS-koncentráció alkalmazásával. Öt kivonási ciklus után a földúsított terméket Sau3A-adapterekkel ligáltuk, PCReljárással amplifikáltuk, majd a pUC13-vektor Smal-hasítóhelyére ligáltuk.

A végrehajtott öt kivonásos hibridizációs ciklus után az oldatban maradt DNS-ffagmensek nagy mennyiségben tartalmaztak olyan szekvenciákat, melyek a vad típusú DNS-ben jelen vannak, a 31,89-DNS-ből azonban hiányoznak. Ezeket a DNS-fragmenseket polimeráz láncreakció (PCR) alkalmazásával amplifikáltuk, és megklónoztuk. A hat megvizsgált klón egyike *« ♦ · · · · »· « · · * < ·

-50(pGAl-1) tartalmazott egy 250 bázispáros Sau3A-fragmenst, amely a 31,89DNS-ből hiányzott.

A Landsberg erecta változatból és három különböző gal-alléiból (31,89, 29,9 és 6,59) izolált, HindlII-emésztett DNS 1-1 pg-ját 1 %-os agaróz gélben elválasztottuk, majd a DNS-t GeneScreen membránra (New England Nuclear) vittük át, és gélből tisztított, ³²P-vel jelzett próbákkal hibridizáltuk. Hibridizációs próbaként a 250 bázispáros fragmenst, valamint a pGAl-1 és a pGAl-2 (ATCC 75394) plazmidok 6 kb-os inszertjeit alkalmaztuk (3. ábra). A hibridizációs körülmények megegyeztek a Church és Gilbert által leírt körülményekkel [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1991 (1984)].

A pGAl-1 inszertje a vad típusú Landsberg erecta DNS egy 1,4 kbos HindlII-fragmensével hibridizálódott, valamint a 29,9- és 6,59-jelü galmutánsok hasonló fragmensével, de nem hibridizálódott a 31,89-DNS-sel (3A ábra).

Abból a célból, hogy meghatározzuk a 31,89-DNS-ben található pGAGl-1 plazmidban azonosított deléció hosszát, a pGAl-1 DNS-t hibridizációs próbaként használtuk a 31,89-jelű deléciónak megfelelő nagyobb méretű genomi fragmensek izolálása céljából. Ezeket a megklónozott fragmenseket a 2B ábrán láthatjuk.

A XGAl-3-fágot egy XFIX-vektorban létrehozott Landsberg erecta genomi könyvtárból izoláltuk [Voytas és mtsai.: Genetics 126. 713 (1990)], hibridizációs próbaként ³²P-jelzett pGAl-1 DNS-t használtunk. A pGAl-2 plazmidot (ATCC 75394) úgy állítottuk elő, hogy a XGA1-3 6 kb-os SalI/EcoRI-fragmensét a pBluescriptII-SK-vektor (Stratagene) Xhol és il

-51 EcoRI hasítóhelyeire ligáltuk. A pGAl-4 plazmidot (ATCC 75395) Arabidopsis thaliancM\ (ökotípus: Columbia) a pOCA18-jelü lineáris vektorban előállított genomi DNS-könyvtárból izoláltuk [Olszewski és mtsai.: Nucl. Acid. Rés. 16, 10765 (1988)], amely tartalmazza a klónozott DNS hatékony növényi genomokba történő juttatásához szükséges T-DNS határolószekvenciákat [Olszewski és mtsai.: Nucl. Acid. Rés. 16, 10765 (1988)].

A pGAl-2 plazmidot (ATCC 75394), amely tartalmaz egy 6 kb-os fragmenst, amely magába foglalja a pGAl-1 plazmid inszertjét (2B ábra), hibridizációs próbaként alkalmaztunk egy Southem-blot eljárásban, amelyet HindIII-al emésztett DNS-en hajtottunk végre, amelyet egyrészt vad típusú Arabidopsis thaliana növényből, másrészt néhány gal-mutánsból izoláltunk. Ahogy azt a 3B és 4B ábrákon láthatjuk, a pGAl-2 (ATCC 75394) mind a négy HindlII-fragmenshez hibridizálódott (1,0 kb, 1,2 kb, 1,4 kb és 5,6 kb) a vad típusú DNS esetén, míg ezek a hibridizálódó fragmensek a 31,89 mutánsok DNS-éböl hiányoztak. A deléciós mutáció következtében keletkezik egy extra HindlII-ffagmens (4,2 kb) a 31,89-DNS-ben. Ezen eredmények és további restrikciós térképezés (adatokat nem közlünk) alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a 31,89-DNS-ben található deléció 5 kb hosszúságú, ami az Arabidopsis thaliana genom 0,005 %-ának felel meg (5 kb/10⁵ kb; lásd 2B ábra).

Három különböző bizonyíték utal arra, hogy a 31,89-mutánsban található 5,0 kb hosszúságú deléció a GAl-lókusznak felel meg. Először, RFLPtérképezéssel - melyet Nam, H.G. eljárása szerint hajtottunk végre [Plánt Cell 1, 699 (1989)], hibridizációs próbaként XGAl-3-DNS-t alkalmazva ·« ··«« · ·· • · · ·» ♦ · ♦ ·· · · ·«

-52 (2Β ábra) - kimutattuk, hogy a XGAl-3-DNS a telomer proximális régióba térképeződik, a 4-es kromoszóma csúcsán, amely pozíció megegyezik azzal a hellyel, ahova a GAl-lókuszt Koomeeff és mtsai. korábban térképezték [J. Hered. 24, 265 (1983)].

Másodszor, a pGAl-4-kozmidklón (ATCC 75395; 2B ábra) amely tartalmaz egy 20 kb-os vad típusú (Columbia) DNS-ből származó inszertet, amely áthidalja a 31,89 mutánsban található deléciót, komplementálta a 31,89 mutánsban található gal-mutációt, amit az Agrobacterium tumefaciens alkalmazásával előállított transzfonnánsok fenotípusának vizsgálata alapján állapítottunk meg (4A ábra).

A 8. ábrán látható aminosav-szekvenciának megfelelő DNSszekvenciát, a 6. és 7. ábrákon látható cDNS-szekvenciát, valamint a 9. ábrán látható teljes hosszúságú cDNS-szekvenciát a pGAl-4-jelü kozmidklón foglalja magába (ATCC 75395). Ezen kozmidklón szekvenciája tartalmaz még GAl-intronokat is.

A 31,89-jelü gal-mutánsból izolált gyökér explantumokat a pGAl-4DNS-t tartalmazó LBA4404-jelü Agrobacterium tumefaciens törzzsel fertőztünk, és kanomicinrezisztens (Km¹) transzgenikus növényeket szelektáltunk, Valvekens és mtsai. eljárásának alkalmazásával [Valvekens és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5536 (1988)]. Regeneráltunk 130 olyan Km^r-növényt, melyek képesek voltak magukat hozni külső GA hozzáadása nélkül (TI-nemzetség). Megvizsgáltuk négy különböző TI-növény 50-300 magját, és valamennyi esetben 100 %-os kapcsoltságot találtunk a GA1 és a Km^r fenotípus között, melyek megközelítőleg 3:1 arányban szegregálódtak a gal/Km^s fenotípussá (T2-nemzetség).

il

-53Transzgenikus gal- és vad típusú növények magjait agaróz-lemezeken csíráztattuk, melyek tartalmaztak lx Murashige & Skoog sókat, valamint 2% szaharózt, és vagy tartalmaztak vagy nem tartalmaztak kanamicint (MSlemezek). A 31,89-jelü gal-mutánsok magjait az MS-lemezeken történő csíráztatás előtt négy napon keresztül 100 pmól/l-es GA3-oldatban áztattuk. A hét napos magoncokat talajba ültettük.

A dvarf-fenotípus kimutatása céljából a csíráztatás után már nem adtunk további Ga₃-ad a 31,89 mutánshoz. A Southem-blot analíziseket a

3. ábra magyarázatában leírtak szerint végeztük. A pGAl-4-klónban (ATCC 75395) található inszertet a Columbia-ökotípusból izoláltuk. Ahogy azt az ábra B részén az 1. és 2. sávban láthatjuk, a pGAl-2 (ATCC 75394) hibridizációs próba azonosított egy RFLP-t a Landsberg (5,6 kb) és a Columbia (5,0 kb) ökotípusokból izolált DNS-ek között. Az ábra B részén az 1., 2., és 3. sávokban látható DNS-t CsCl-sürüséggradiens-centrifugálással tisztítottuk, a 4. és 5. sávban látható DNS-t pedig miniprep-eljárással tisztítottuk. Ezzel magyarázható, hogy az 1., 2. és 3. sávokban látható hibridizált csíkok mobilitása kis mértékben különbözik a 4. és 5. sávban látható csíkokétól.

Néhány egymástól független T2-generációs transzgenikus növény, melyek a 31,89-genomba integrálódva tartalmazták a pGAl-4 inszertet (ATCC 75395), növekedésükhöz nem igényelték külső GA hozzáadását. A csírázási képesség, a szár növekedése, valamint a maghozás ezekben a transzgenikus növényekben a vad típusú növényekkel azonos módon ment végbe, külső GA hozzáadása nélkül. A pGAl-2-klón (ATCC 75394) 6 kbos fragmensét hibridizációs próbaként alkalmazó Southem-blot analízis ki• ··

-54mutatta, hogy két egymástól független T3-generációs transzgenikus növényben jelen volt mind az endogén GAl-31,89-lókusz (4,2 kb) mind pedig a vad típusú GA1-DNS (5,0, 1,4, 1,2 és 1,0 kb HindlII-fragmensek; lásd 4B ábra).

További Southem-blot analízissel - hibridizációs próbaként a pOCA18 vektort alkalmazva, amely tartalmazza a T-DNS határolószekvenciákat - kimutattuk, hogy a határoló fragmensek közül mindössze kettő volt jelen mindkét transzgenikus növény genomjában (4C ábra). Ezek az eredmények arra utaltak, hogy a vad típusú GA1-DNS mindkét transzgenikus növény esetén a genom egyetlen lókuszába integrálódott be.

Harmadszor, hogy vitathatatlan bizonyítékot szerezzünk arra vonatkozóan, hogy a 31,89-mutáns 5,0 kb hosszúságú deléciója a GA1-fókusznak felel meg, kimutattuk, hogy négy további gal-alléi tartalmaz különbözőségeket a vad típusú szekvenciához képest a 31,89 mutánsból hiányzó régióban, olyan mértékben, ahogy azt a genetikai térkép alapján várni lehetett. Ahhoz, hogy ezt az analízist elvégezhessünk, izoláltunk egy részleges GA1cDNS-klónt (0,9 kb; szekvenciáját lásd a 6. ábrán). Az izolált klón tartalmazta a poliA-szignált, és megfelelt az 1,2 kb-os HindlII-fragmensnek (2B ábra). A klónt égy olyan cDNS-könyvtárból izoláltuk, melyet becőtermésekből (a termések magházaiból) izolált RNS-ből készítettünk, az Arabidopsis thaliana Columbia ökotípusából. A cDNS és genomi DNS-szekvenciák öszszehasonlítása útján az 1,2 kb-os HindlII-fragmensben 4 exont és 3 intront azonosítottunk (2B ábra, szekvenciaadatokat nem közlünk). Ennek a cDNSklónnak a vizsgálata kimutatta, hogy az 1,2 kb-os HindlII-fragmens a GA1• ·« d ········*

-55gén 3'-végén helyezkedik el, és arra utalt, hogy a 31,89, Bo27, 6,59, d352 és A428-jelü gal-alléi mutációk feltehetőleg szintén a GAl-gén 3'-végére lokalizálhatók.

Gyors neutron mutagenézissel a 31,89-alIéIon kívül két másik galallélt is előállítottak: 6,59 és 29,9 [Koomneef és mtsai.: Génét. Rés. Camb. 41, 57 (1983)]. Amint azt a 3B ábrán láthatjuk a 6,59 DNS-ben az 1,2 kb-os HindlII-fragmens helyett két új fragmens található, melyek mérete 1,3 kb és

3.3 kb, anélkül, hogy a szomszédos 1,4 kb-os és 5,6 kb-os ffagmensek mérete megváltozott volna. További Southem-blot analízis valamint a 6,59 DNS-templátokon előállított PCR-termékek közvetlen szekvencianalízise útján arra a következtetésre jutottunk, hogy a 6,59-allél tartalmaz egy

3.4 kb-os vagy annál nagyobb inszerciót az 1,2 kb-os HindlII-fragmensben, amely a cDNS-klón által definiált utolsó intronban található (2B ábra). A pGAl-2 (ATCC 75394; 2B ábra) és a pGAl-4-vektorokat (ATCC 75395) hibridizációs próbaként alkalmazva végrehajtva Southem-blot vizsgálatok kimutatták, hogy a 29,9-DNS-ben nem található észrevezető deléció vagy inszerció. A genetikai térképen (2A ábra) további három gal-alléi - A428, D352 és Bo27 - volt a 6,59-allél közelében lokalizálható. A Bo27-A428- és D352-jelű mutáns DNS-eket templátként használva előállított PCRtermékek közvetlen szekvenálásával megállapítottuk, hogy mind a három mutáns az 1,2 kb-os HindlII-fragmens utolsó két exonjainak valamelyikében tartalmazott egy-egy nukleotid cserét (2B ábra). A Bo27-jelü mutáns, amely a genetikai térkép egyik oldalát definiálja, a legtávolabbi GAl-exonban tartalmazott egy egyedüli nukleotidcserét. A Bo27-, A428- és D352mutánsokban található egyedi nukleotidcserék misszens mutációkat eredmé-

-56nyeztek, amely eredmény konzisztens azzal, hogy az A428- és D352- mutánsok szivárgó fenotípusúak [Koomneef és mtsai.: Génét. Rés. Camb. 41, 57 (1983)]. Nem valószínű, hogy az általunk azonosított báziscserék a Bo27-, A428- és D352-mutánsokban véletlenszerű PCR-hibák következményei lennének, vagy a GAl-lókusz rendkívül polimorf természete okozta volna ezeket, mivel az NG4 és NG5 DNS-ekből kiindulva amplifikált 1,2 kb-os HindlII-ffagmens mindkét esetben a vad típusú szekvenciát tartalmazta. Ezen felül a PCR-termékeket közvetlenül szekvenáltuk, és a szekvenciaanalízist minden alléi esetében kétszer hajtottuk végre, két egymástól független amplifíkáció termékein.

A Koomneef és mtsai. [Génét. Rés. Camb. 41, 57 (1983)] által megadott rekombinációs gyakoriság felhasználásával a különböző gal-allélek esetén a számított rekombinációs gyakoriság körülbelül 10‘⁵ cM volt bázispáronként, a GAl-lókuszon belül. A rekombinációs gyakoriság számítást egyrészt az A428- vagy d352- és Bo27-jelü (2A ábra) gal-allélek közötti szakirodalomban megadott 0,5x 10’² cM rekombinációs gyakoriság értékre alapoztuk, másrészt saját megfigyelésünkre, amely szerint a d352- és Bo27-, valamint az A428- és Bo27-allélben található mutációk sorrendben 432 és 427 bázispámyira szeparálódtak. Ez a számítás arra utalt, hogy a 29,9- és Bo27-mutánsok által definiált teljes GAl-lókusz hossza közelítőleg 7 körülbelül A lókusz hosszúságának ezen becsült értéke lehetővé teszi, hogy a lókusz kódolhassa a GAl-cDNS hibridizációs próba alkalmazásával vad típusú növényekben talált 2,8 kb hosszúságú mRNS-t (5. ábra).

A poly(A)⁺-RNS-t teljes növények esetén négy hetes és öt hetes növényekből izoláltuk, a gyökér és becőtermés-RSN-t azonban éretlen becő-57termeseKDOi valamint oizonyos viragportoxoKDoi es szaraxooi izoláltuk, ahogy azt előzőleg már leírtuk [Ausubel és mtsai.: Current Protocols in Molecular Biology, 1. kötet, Greene Publishing Associates/WileyInterscience, New York (1990); Maniatis és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual 197-201. oldal, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)]. Valamennyi mintából közelítőleg 2 pg RNS-t 1 %-os. agaróz gélben méret szerint elválasztottunk [Maniatis és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual 197-201. oldal, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)], majd GeneScreen-membránra vittük át az RNS-t, és ³²P-jeIzett 0,9 kb-os EcoRI-DNS-fragmenssel hibridizáltuk, ami a GAl-cDNS-ből származott (5. ábra). Az RNS-blotot hibridizáltuk még egy ³²P-jelzett 1,65 kb-os Arabidopsis thaliana cűó-génből származó EcoRI-el fragmenssel is [AB-165; Leutwiler és mtsai.: Nucl. Acid. Rés. 14, 4051 (1986)]. A cabpróba csökkent mértékű hibridizációja a 3. sávban azt jelzi, hogy a cab-gént a becötennések nem nagy mértékben expresszálják.

Amint az várható volt, a 2,8 kb-os RNS-t nem lehetett kimutatni a deléciós mutánsban (5. ábra). Az Arabidopsis thaliana kapcsoltsági térképe közelítőleg 600 cM-es, a genom mérete pedig körülbelül 1,0χ 10⁸ bázispár (Goodman és mtsai.: közzé nem tett eredmények). Ez megfelel körülbelül 6x 10⁶ cM/bázispár értéknek, mely érték jól egyezik az általunk megfigyelt GAl-lókuszbeli rekombinációs gyakorisággal.

Az Arabidopsis thaliana GA1-génjének megklónozása lehetőséget nyitott számukra egy egész sor kísérlet elvégzésére, melyek a GAbioszintézis szabályozásának és helyének vizsgálatát célozták. Mivel a GA- 58 bioszintézis első specifikus intermediere az ent-kaurén, valószínű, hogy az ent-kaurén előállításához szükséges GAl-gén a GA-bioszintézis szabályozásának egyik kulcspontja [Graebe, J.E.: Ann. Rév. Plánt Physiol. 38, 419 (1987); Moore, T.C., Biochemistry and Physiology of Plánt Hormones, 113-135. oldal, Springer-Verlag, New York (1989)]. És valóban, kimutatták, hogy az ent-kaurén bioszintézis elsősorban gyorsan fejlődő szövetekben játszódik le, például életlen magokban, hajtáscsúcsokban, petiolákban, valamint a fiatal növekedésben lévő intemódusok közelében található pálhalevelekben [Moore, T.C.: Biochemistry and Physiology of Plánt Hormones, 113-135. oldal, Springer-Verlag, New York (1989); Chung és Coolbaugh: Plánt Physiol. 80, 544 (1986)].

A genomi kivonáson alapuló eljárás nem túlzottan munkaigényes, és a jelen leírásban közölt eredmények arra utalnak, hogy a genomi kivonás eljárást rutinszerűen alkalmazhatjuk egyéb nem esszenciális Arabidopsis thaliana gének megklónozására is. Mindössze egy olyan eljárásra van szükségünk, melynek segítségével nagy gyakorisággal lehet deléciókat előállítani. A gyors neutronokkal előidézett mutagenézis mellett, amely a 31,89 mutánsban a gal-deléciót létrehozta [Koomneef és mtsai.: Génét. Rés. Camb. 41, 57 (1983); Dellaert, L.W.M.: X-ray- and Fást Neutron-Induced Mutations in Arabidopsis thaliana, and the Effect of Dithiothreitol upon the Mutant Spectrum, doktori értekezés, Wageningen (1980); Koonmeef és mtsai.: Mutation Research 93, 109 (1982)], kimutatták, hogy a röntgen- és gammasugárzás is alkalmas rövid életképes deléciók létrehozására az Arabidopsis thaliana növényben, a chl-3-lókuszban [Wilkinson és Crawford: Plánt Cell 3, 461 (1991)], a tt-3-lókuszban [B. Shirley és ·· · ·· 9 9 · · < · · ·· · · • · · · * · *

-59H.M.Goodman, közzé nem tett eredmény], valamint a gl-l-lókuszban [D. Marks: Mól. Generál Genetics, 241, 586 (1993)].

2. példa

Antiszensz GA1-RNS expresszálása

A korábbiakban leírtak szerint előállítottunk egy expressziós vektort oly módon, hogy a szensz GAl-RNS-szállal komplementer RNS-t expresszáljon. Az antiszensz GA1-RNS kontitutív módon expresszálódik, mivel az adott gazdanövényben konstitutív módon expresszálódó promótert alkalmazunk az expresszió szabályozására, például a karfiol mozaikvírus 35S-promóterét: Eljárhatunk úgy is, hogy az antiszensz RNS-t szövetspecifíkus módon expresszáljuk, szövetspecifikus promóterek alkalmazásával. Amint azt már korábban leírtuk, a szakirodalomból ilyen promóterek jól ismertek. Egy kísérletben például úgy járunk el, hogy a pPO35-jelü antiszensz konstrukciók [Oeller és mtsai.: Science 254, 437 (1991)] elhasítjuk Bamhlés SACI-enzimekkel, a tACC2-cDNS-szekvencia eltávolítása céljából. A tACC2 eltávolítása után a vektort az E. coli DNS-polimeráz I klenó fragmensével kezeljük, a túlnyúló végek feltöltése céljából, majd a 6. ábrán látható szekvenciát tompavég ligálás alkalmazásával a vektorba ligáljuk, oly módon, hogy a szálat funkcionálisan hozzákapcsoljuk ahhoz a promóterhez, amely a GAl-ansztiszensz RNS-szekvenciát átírja. A ligáit vektorral alkalmas E. coli törzset transzformálunk.

Az összeligált vektort tartalmazó kolóniákat szűrővizsgálatnak vetjük alá kolóniahibridizáció vagy Southem-blot eljárás alkalmazásával, és izoláljuk azokat a vektorokat, melyek a GAl-cDNS-t olyan orientációban tártálil

4**4 • 4 * ·

-60mazzák, hogy a vektor antiszensz RNS-t fog termelni, amennyiben a GA1szekvencia a vektorban található 35S-promóterröl átíródik.

Az antiszensz GA1-vektort, melyet olyan kolóniából izoláltunk, mely megfelelő orientációjú inszertet tartalmazott, a korábban leírt eljárások valamelyikének alkalmazásával növényi sejtekbe juttatjuk, például elektroporációval vagy agrobaktérium/Ti-plazmid által közvetített transzformációval.

A transzformált sejtekből regenerált növények antiszensz GA1-RNS-t expresszálnak. Az expresszált GAl-mRNS kötődik a szensz GA1-RNSszálhoz, és így annak transzlációját megakadályozza.

3. példa

Az Arabidopsis thaliana GA1-géniének teljes hosszúságú cDNS- és aminosav-szekvenciája

A már leírt, valamint az alábbi eljárások alkalmazásával előállítottunk egy cDNS-klónt, amely tartalmazta a GAl-gén teljes cDNS-szekvenciáját (pGAl-29). Az ebben a kiónban található GA1-szekvenciákat meghatároztuk, és összehasonlítottuk a pGAl-4-jelü kozmid-klónban található genomi szekvenciákkal. A 9. ábrán bemutatjuk a GAl-fehérje teljes cDNSszekvenciáját (melyet a pGAl-41-klón alapján határoztunk meg, amely a pGAl-29-klón származéka). Az intronok elhelyezkedését a genomi klón és a cDNS-klón (pGAl-29) szekvenciáinak összehasonlítása útján határoztuk meg. Az ábrán a szekvenciák fölött látható fordított nyilak az intronok kapcsolódási pontjait jelzik. Az azonosított mutációkat (például gal-6 C -> T és gal-8 C -> A) nevük megjelölésével és az adott báziscsere feltüntetésével a ·· #««·

-61 natív szekvenciában szereplő adott bázis fölött jeleztük. A gal-4 gal-7 és gal-9 DNS-ek helyzetét szintén megjelöltük.

A cDNS-szekvencia alapján meghatároztuk a GA1-fehérje teljes aminosav-sorrendjét, és azt a 8. ábrán mutatjuk be.

4. példa

A GAl-gén jellemzése

A. A 2,6 kb-os GAl-cDNS-klón izolálása

A 2,6 kb-os cDNS-klónt, a pGAl-29-et oly módon izoláltuk, hogy Arabidopsis thaliana Columbia ökotípus zöld becőterméseiből izolált RNSből készített cDNS-könyvtárat szűrővizsgálatnak vetettünk alá [Giraudat és mtsai.: Plánt Cell 4, 1251 (1992)] ³²P-jelzett 0,9 kb-os GAl-cDNShibridizációs próba alkalmazásával [Sun és mtsai.: Plánt Cell 4,119 (1992)].

B, Plazmidelőállítás

A GAl-gén első ATG-kódonja körüli szekvenciát PCR-eljárás alkalmazásával úgy módosítottuk, hogy tartalmazzon vagy egy AflIII- vagy pedig egy Ncol-hasítóhelyet. Az AflIII-hasítóhely kialakítása nem változtatja meg a kódoló szekvenciát. Az ATG-kódon környékén az Ncol-hasítóhely kialakítása a 2. kódonban egy báziscserét eredményezett (TCT -> GCT; Ser -> Alá). A PCR-eljárással amplifikált 0,5 kb-os AflIII/Sphl- és NcoI/Sphl-DNS-ffagmenseket a pUC19-vektor AflIII és Sphl helyeire (pGAl-41), valamint a pUC18-vektor Ncol (HindlII-helyből átalakítva) és Sphl helyeire klónoztuk (pGAl-32). A megklónozott PCR-ffagmenseket megszekvenáltuk, hogy ellenőrizzük, hogy az amplifikáció során nem történt-e mutáció. A teljes hosszúságú GA1-fehérjét kódoló szekvencia további

-62részét a pGAl-29-plazmidból hasítottuk ki Sphl- és EcoRI-enzimekkel (vagy Klenow-enzimmei tompavégüvé alakítottuk a fragmenst), majd a fragmenst a pGA 1-41-plazmid Sphl és HincII helyeire ligáltuk, és ily módon előállítottuk a teljes hosszúságú GAl-cDNS-t, amely az iniciációs kódonnál AflIII hasítóhelyet tartalmazott. Ezután a GAl-cDNS teljes kódoló régióját kihasítottuk AflIII- és BamhI-enzimekkel egy 2,5 kb-os DNS-fragmensként, majd ezt a pET-8c-vektor [Studier és mtsai.: Methods Enzvmol.185, 60 (1990)] Ncol és BamHI hasítóhelyeire inszertáltuk. A kapott plazmidot, amely a 2,5 kb-os GAl-cDNS-t transzlációs fúzió útján a T7-promóter szabályozása alatt tartalmazta, pGAl-43-nak neveztük el. Ezt a plazmidot alkalmaztuk a teljes hosszúságú GA1-fehérje E. coli sejtekben történő expresszálására. A 0,9 kb-os cDNS kódoló szekvenciájának maradékát a pGAl-24-vektorból Sphl- és BamHI-enzimekkel hasítottuk ki, majd a fragmenst a pGA 1-32-vektor SpHI és Bamhl helyeire ligáltuk. Ezután a 0,9 kb-os kódolószekvenciát Ncol és BamHI hasítással kivágtuk, majd a pET8-vektorba klónoztuk. A kapott plazmidot pGAl-40-nek neveztük el, és ezt a konstrukciót alkalmaztuk a 30 kD molekulatömegű rövidített GA1fehérje E. coli sejtekbe történő expresszálására.

A GAl-cDNS 2,5 kb-os AflIII/BamHI-fragmensét fuzionáltattuk a CaMV-35S-promóterrel, amely tartalmazta a dohánykarcoló vírusból származó kettős enhanszert és 5'-végi nem transzlálódó régiót, a következő eljárás szerint. A pRTL2-vektorból [Restrepo és mtsai.: Plánt Cell 2, 987 (1990)] kihasítottunk egy 1,2 kb-os HindlII-fragmenst, amely tartalmazta a CaMV-35S-promótert a kettős enhanszerrel, a TEV-NTR-szekvenciát, valamint a CaMV-35S-poliadenilációs szignált, és ezt a fragmenst a pSK4· * ·· ··«« <1

-63vektor HindlII-helyére ligáltuk. A 2,5 kb-os AflUI/BamHI-cDNS-fragmenst a fenti plazmid Ncol és BamHI hasítóhelyeire inszertáltuk, oly módon, hogy a GAl-cDNS szenszorientációban került a CaMV-35S-promóter és a TEVNTR-szignálszekvencia mögé (pGAl-48). Ezután a pGAl-48-vektorból kihasítottuk a 2,6 kb-os EcoRI/BamHI-fragmenst, amely hordozta a TEVNTR-GAl-DNS-t, és a fragmenst T4-DNS-polimeráz alkalmazásával tompavégűvé alakítottuk. Ezt a fragmenst azután a pSP64-vektor (poli-A; Promega) HincII helyére ligáltuk, abból a célból, hogy poli-A-farkazott GAl-transzkriptumokat tudjunk előállítani in vitro, az SP6-polimeráz alkalmazásával (pGAl-84). A pGAl-48-vektor egy 4 kb-os Smal/Sallfragmensét, amely tartalmazta a CaMV-35S-TEV-NTR-GAl-génfuziót, beinszertáltuk a pBIN19-jelü bináris vektor Smal és Sáli helyeire [Bevan, M., Nucl. Acids Rés. .12, 8711 (1984)], és az így kapott plazmidnak a pGAl-49-nevet adtuk.

A pGAl-29-vektorban a 2,6 kb-os cDNS a pSK-vektorból származó EcoRI-helyre van beinszertálva, és a T7-promóter mögött antiszensz orientációban helyezkedik el. Ezt a plazmidot ezután EcoRI-el hasítottuk, majd ismételten ligáltuk, és a transzformánsokat szűrővizsgálatnak vetettük alá, olyan plazmidokat keresve, amelyek az inszertet ellenkező orientációban tartalmazták. A kapott plazmidot pGAl-30-nak neveztük. A 2,6 kb-os GA1cDNS-t ezután a pGAl-29- és pGAl-30-vektorokból Xbal és KpnI restrikciós enzimekkel végzett hasítással kivágtuk, majd a pBIN19-35S-vektor Xbal és KpnI helyeire inszertáltuk, melyek a CaMV-35S-promóter és a nosterminátor között helyezkednek el. A pBIN19-35S-vektort dr. Mark Conklingtól kaptuk ajándékba, és a plazmidot úgy állították elő, hogy a nos-64terminátort a pWPF126-vektorba inszertálták [Fitzmaurice és mtsai.: Plánt Mól. Bioi. 20, 177 (1992)]. Az eredményül kapott plazmidokat pGAl-45nek (szenszorientáció), valamint pGAl-47-nek (antiszensz orientáció) neveztük el.

C. A vad típusú és mutáns GA1-DNS szekvenciaanalízise

A GA1-genomi DNS- és cDNS-szekvenciákat a didezoxi-eljárás alkalmazásával határoztuk meg [Ausubel és mtsai.: Current Protocols in Molecular Biology, Green Publ. Assoc./Wiley-Interscience (1990)] szekvenáz enzim (Biochemical Corp.) alkalmazásával, mind egyszálú, mind kétszálú DNS-templáton. A GAl-9-mutáns 1,4 kb-os HindlII-DNSfragmensét polimeráz láncreakcióval (PCR) amplifikáltuk, majd ismételten amplifíkáltuk asszimetrikus PCR-eljárás alkalmazásával, majd az egyszálú DNS-templátokat közvetlenül megszekvenáltuk [Innis és mtsai.: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego (1990)]. A 12. intron-tól a 15. exonig terjedő részt magába foglaló

1,4 kb-os DNS-fragmenseket a gal-1- és ga 1-4-mutánsokból izolált genomi DNS-templátról amplifíkáltuk, PCR-eljárás alkalmazásával. Ezeket a PCReljárással amplifikált DNS-fragmenseket a pSK-vektor Smal-hasítóhelyére klónoztuk, és a DNS-szekvenciákat néhány független kiónból izolált kettősszálú DNS-templáton határoztuk meg.

Az Arabidopsis thaliana GA1-lókuszának megfelelő genomi kiónokat (10-20 kb), valamint egy parciális cDNS-klónt (0,9 kb) már munkánkat megelőzően izolálták [Sun és mtsai.: Plánt Cell 4, 119 (1992)]. Izoláltak egy további GAl-cDNS-klónt is, melynek mérete 2,6 kb volt, oly módon, hogy átvizsgáltak egy Arabidopsis thaliana Columbia ökotípusból készített becő-65termést cDNS-könyvtárból 5x 10⁵ cDNS-klónt. A GAl-lókusz teljes szerkezetének jellemezése céljából meghatároztuk a cDNS-klónok és a GA1genomi kiónok szekvenciáját (9. és 10. ábra). A 2,6 kb-os cDNS közel teljes hosszúságú, mivel korábban meghatároztuk, hogy a GAl-mRNS 2,8 kb hosszúságú [Sun és mtsai.: Plánt Cell 4, 119 (1992)]. Feltételezhető, hogy a

2,6 kb-os cDNS 48-50 pozícióiban található ATG-kódon a GA1-fehérje transzlációs startpontja, mivel ez az első ATG-kódon, hosszú nyitott leolvasási fázis követi, amely 2,406 bázispár hosszú, valamint egy poli-A-farok (9. ábra), és ez a klón egy 86 kD-os fehérjét kódol, amely az alábbiakban elmondottak értelmében megegyezik a GA1-fehérje kezdeti méretével. A

2,4 kb-os nyílt leolvasási fázis körülbelül 7 kb hosszúságú genomi DNS-t fog át, amely 15 exont és 14 intront tartalmaz (10. ábra). Valamennyi intron 5'-GT és 3'-AG splice-junction konszenzus szekvenciát tartalmaz. A feltételezett startkódontól 5'-irányban a -287. és -280. nukleotidok között található a szekvenciában egy feltételezett TATA-box (TATAAACA), valamint poliadenilációs szignálok tandem ismétlődései (AATAAA), amelyek a transzlációs stopkódontól 3'-irányban 117-128 nukleotid távolságban helyezkednek el.

Továbbá Southem-blot analízis segítségével - melyet hibridizációs próbaként egy részleges GA1-cDNS-t alkalmazva (a 10. ábrán látható 0,9 kb-os fragmens) kevéssé sztringens hibridizációs körülmények között hajtottunk végre (a hibridizációt és a mosást 52 °C-on hajtottuk végre, azonos pufferben) - kimutattuk, hogy jelen van egy további DNS-fragmens is, mind a vad típusú Arabidopsis thaliana Landsberg erecta ökotípusban,

-66mind pedig a gall-3-mutánsban. Ez a gén lehetséges, hogy egy gallhomológot kódol, vagy valamilyen rokon terpén ciklázt.

Koomneef és mtsai. (Génét. Rés., Camb. 41, 57 (1983)] előállították a GAl-lókusz finom szerkezetű genetikai térképét, kilenc gall-alléi alkalmazásával, melyeket ezt követően Sun és mtsai. [Plánt Cell 4, 119 (1992)] átneveztek. Az 1. táblázatban és a 9. valamint 10. ábrákon összefoglaljuk a kilenc gal-mutáció közül nyolcnak a természetét és pozícióját. A mutációk közül ötöt: gal-2 (inverzió vagy inszerció), gal-3 (5 kb-os deléció), valamint gal-6, 7, 8 (pontmutációk) elhelyeztünk a korábban leírt fizikai térképen [Sun és mtsai.: Plánt Cell 4, 119 (1992)]. A gal-7 mutáns, amely a genetikai térkép egyik szélét definiálja, a legtávolabbi exonban (5. exon) tartalmazott egy pontmutációt, a 0,9 kb-os cDNS-ben (10. ábra). Mindezáltal a

2,6 kb-os cDNS izolálása során kiderült, hogy a 0,9 kb-os cDNS valószínűleg vagy klónozási melléktermék, vagy a 6. intronban bekövetkezett pontatlan transzkripciós termináció eredménye. PCR-eljórásokat és DNSszekvenciaanalízist hajtottunk végre annak érdekében, hogy meghatározzuk további három gal-allél pozícióját: gal-1, 4, 9. Ezek közül az allélek közül kettő, a gal-1 és 4, a gal genetikai térkép másik szélét definiálják, míg a gal-9 a genetikai térkép közepén helyezkedik el, és átfed a gal-3 deléciós mutációval. A szekvenciaanalízis alapján kiderült, hogy a gal-4 mutáns egy rövid, 14 nukleotid hosszúságú deléciót tartalmaz az utolsó exonban (15. exon, 9. és 10. ábra). A gal-1 és a gal-9 mutánsok egyedi báziscseréket tartalmaznak sorrendben a 12. intron 3-végi splicejunction helyén (AG -> AA), valamint a 6. exonban (TGG -> TAG, amber kódon). Ebben a három allélben a mutációk a 0,9 kb-os cDNS által definiált kódoló szekvenciáktól

-673'-irányban helyezkedtek el (10. ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a 0,9 kb-os cDNS nem kódol működőképes GA1-fehérjét.

1. táblázat

A különböző GA1-mutánsok természete és a mutációk elhelyezkedése

Mutáns	A mutáció természete Pozíció a szekvenciában	Pozíció a genomi szekvenciában
gal-1	AG-> AA 3' splice junction		12. intron
gal-2	> 3,4 kb inszerció vagy inverzió		4. intron
gal-3	5 kb-os deléció	Az ATG-kódontól 5'-irányban Az ATG-kódontól körülbelül 1 kb-tól 1621-ig 5'-irányban körülbelül 1 kb-tól all. exonig
gal-4	14 nukleotid hoszszúságú deléció	2375-2388-ig	15. exon
gal-6	TCT -> TTT Ser Phe	452	4. exon
gal-7	GAA-> AAA Glu Lys	631	5. exon
gal-8	GGA ->AGA Gly Arg	457	4. exon
gal-9	TGG -» TAG Trp STOP	818	6. exon

A különböző gal-mutációk pozíciója (1. táblázat és 10. ábra) jól megfelel a genetikai térképen található helyzetükkel [Koomneef és mtsai.: Génét. Rés. Camb. 41,57 (1983)]; azzal az eltéréssel, hogy a gal-7 mutáció a gal-2 és a gal-9 mutáció közé lokalizálódik a mi fizikai térképünkön, ami ellentétes azzal, hogy a genetikai térkép szélére van lokalizálva. A gal-6, 7 és 8 közötti rekombinációs gyakoriságot figyelembe véve a gal-lókuszon

-68belüli rekombinációs gyakoriságot korábban körülbelül 10'¹³ cM/nukleotidra becsültük [Sun és mtsai.: Plánt Cell 4, 119 (1992)]. Ezt az értéket a gal-6, gal-9 és gal-4 mutánsok felhasználásával tovább finomítottuk, és GA1lókuszon belüli rekombinációs gyakoriság körülbelül l,2x lO'¹' cM/nukleotidra becsültük. Ez az érték jó egyezésben van az Arabidopsis genomon belüli rekombinációs gyakorisággal (körülbelül 5,2x lO⁶ cM/nukleotid; [Hauge és mtsai.: Plánt J. 3, 745 (1993)].

5. példa

Komplementációs analízis

Annak eldöntése érdekében, hogy a 2,4 kb-os nyílt leolvasási fázis a GAl-cDNS-ben az ArabidopsisAow. működőképes fehérjét kódol-e, a GAl-cDNS-t expresszáltattuk gal-3 deléciós mutáns növényekben. A

2,6 kb-os GAl-cDNS-t transzkripciósán fuzionáltattuk a CaMV-35Spromóterrel, mind szensz (pGAl-45), mind pedig antiszensz (pGAl-47) orientációban, a pBIN19 bináris vektorban. A GAl-cDNS expressziójának maximalizálása céljából a 2,4 kb-os kódoló szekvenciát transzlációsán is fuzionáltattuk a CaMV-35S-promóterrel, amely tartalmazta a dohánykarcoló vírus kettős enhanszerét és 5'-végi nem transzlálódó régióit is (TEV-NTR). A TEV-NTR-szekvenciáról kimutatták, hogy mind in vivő mind pedig in vitro fokozza a transzláció hatékonyságát [Carrington és Freed: J. Virol. 64, 1590 (1990)].

A CaMV-35S-TEV-NTR-GAl-génfuziót tartalmazó DNS-fragmenst a pBIN19 bináris vektorba inszertáltuk, és a kapott plazmidot pGAl-49-nek neveztük el. A pGAl-45-, 47- és 49-jelű plazmidokat, melyek a génfuziókat (I

-69tartalmazták, a gal-3-genomba Agrobacterium tumefaciens által közvetített transzformáció útján juttattuk be. Regeneráltunk néhány független kanomicinrezisztens (Km) transzgenikus növényt (TI-generáció), melyek jelzése 3, 7 és 8 volt, és sorrendben a pGAl-45, 47 és 49 vektort tartalmazták. Valamennyi TI-növény, melyek a szenszorientációjú GA1konstrukciókat tartalmazták (pGAl-45 és pGAl-49) külső GA hozzáadása nélkül is képes volt magot hozni. Valamennyi TI-generációs transzgenikus növény magjai (növényenként 30-400) 100 %-os kapcsoltságot mutatott a GA1⁺ és Km^r fenotípusok vonatkozásában, melyek közül legtöbb (valamennyi pGAl-45 leszármazási vonal és hét pGAl-47 leszármazási vonal) körülbelül 3:1 arányban szegregálódott GalTKanomicin szenzitív (Km^s) fenotípussá (T2-generáció). Valamennyi T2-generációhoz tartozó GA1⁺/Km^r transzgenikus növény felnövekedett és magok hozott külső GA-kezelés nélkül. Ez az eredmény arra utal, hogy a 2,4 kb-os nyitott leolvasási fázis aktív GA1-fehérjét kódol, amely komplementálta a ga 1-3-mutációt ezekben a transzgenikus növényekben. Regeneráltunk hét Km^rTl-növényt a kontrol pGA 1-47-vektorral (antiszensz GA1) transzformált növények közül. Ezek a transzgenikus növények az eredeti gal-3 növényekhez hasonló fenotípusúak voltak, és valamennyinek szüksége volt exogén GA₃-kezelésre, a vegetatív növekedéshez, a virágzáshoz és maghozáshoz.

6. példa

A GA1-fehérje funkcionális analízise

A GAl-fehérje működésének tanulmányozása céljából E. coli gazdasejtekben túltermeltettük mind a teljes hosszúságú (2,6 kb), mind pedig a il

- 70rövidített (0,9 kb) GAl-cDNS által kódolt fehérjéket. A 3. ábrán láthatjuk, hogy a 2,6 kb-os cDNS a pGAl-43-vektorban a teljes hosszúságú GA1fehérjét kódolja, melynek molekulatömege 86 kD (2. sáv), a 0,9 kb-os cDNS pedig a pGAl-40-vektorban rövidített GA1-fehérjét termel, melynek molekulatömege 30 kD (5. sáv). Mind a 30 kD molekulatömegű, mind pedig a 86 kD molekulatömegű fehérjét £. coli extraktumokból tisztítottuk, fehérjezárványok izolálása útján [Marston: DNA Cloning: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England (1987)], majd ezt követően a fehérjéket SDS-poliakrilamid-gélelektroforézisnek vetettük alá, majd elektroelúciónak. A gélből tisztított fehérjék (Coomassie Blue) festéssel SDS-poliakrilamid gélen egyetlen csíkot adtak (11. ábra, 3. és 6. sáv). A 30 kD molekulatömegü fehérjét tovább vizsgáltuk N-csoport-analízissel, és kimutattuk, hogy a hat N-terminális aminosavának sorrendje megegyezik a cDNS-szekvencia alapján vált aminosavsorrenddel. A 86 kD molekulatömegű fehérje N-terminusa azonban blokkolva volt. A gélből tisztított fehérjékkel nyulakat immunizáltunk, és ily módon ellenanyagokat állítottunk elő mind a 30 kD mind pedig a 86 kD molekulatömegű GA1-fehérjék ellen.

Sandmann és Misawa (FEMS Micro. Lett. 90, 253 (1992)] kimutatták, hogy az Erwinia uredovora crtE-génje GGPP-szintázt kódol, amely a famezil pirofoszfát GGPP-vé történő átalakulását katalizálja. A crtE-gént hordozó E. coli sejtek nagy mennyiségű GGPP-t halmoznak fel [Sandmann és Misawa: FEMS Micro. Lett. 90, 253 (1992)]. Ez a megfigyelés ellentétben áll az E. coli sejtek normális működésével, melyek GGPP-t csak nyomnyi mennyiségben termelnek. Egy pACCRT-E elnevezésű plazmidot, amely tartalmazza a crtE-gént, kotranszformáltunk egyrészt a pGAl-40

-71 kontrollplazmiddal (0,9 kb GAl-cDNS), másrészt pedig a pGAl-43vektorral (2,6 kb GAl-cDNS) E. coli sejtekbe. A GGPP-t és CPP-t extraháltuk a kizárólag pACCRT-E-vektort tartalmazó sejtekből, a pACCRT-E és pGAl-40-vektorokat tartalmazó sejtekből, valamint a pACCRT-E és pGAl43-vektorokat tartalmazó sejtekből, és a hidraulizált extraktumokat gátkromatográflioz kapcsolt tömegspektrométerrel (GC/MS) analizáltuk. A termékeket teljes pásztázású GC/MS-eljárással azonosítottuk. A 12. ábrán a tömegspektrumokat láthatjuk, m/z 290 értéknél, amely a genarilgenariol (GGol) és a kopalol molekula ionjainak mérete. Azon sejtek extraktumai, melyek kizárólag a pACCRT-E-vektort és a pACCRT-E, valamint az pGAl-40-vektorokat tartalmazták, nagy mennyiségű GGol-t tartalmazott, de nem lehetett bennük kopalol jelenlétét kimutatni (12C és D ábrák). Ezzel szemben meglehetősen nagy mennyiségű kopalol halmozódott fel azokban a sejtekben, amelyek hordozták mind a pACCRT-Ε-, mint pedig a pGAl-43vektorokat, és ennek következtében termeltek mind GGPP-szintázt, mind pedig a 86 kD molekulatömegü GA1-fehérjét (4E ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a GAl-cDNS 24 kb-os nyílt leolvasási fázisa által kódolt 86 kD molekulatömegű fehérje az ent-kaurén szintáz-A enzim, amely katalizálja a GGPP CPP-vé történő átalakulását. A rövidített, 30 kD mokekulatömegű GA1-fehérje nem rendelkezik ezzel az enzimaktivitással.

♦ · · *

7. példa

A GAl-fehérje mennyisége vad típusú és transzgenikus leszármazási vonalakban. melyek különböző génfúziókat tartalmaznak

A. Arabidopsis gyökér explantumok transzformálása Agrobacterium tumefaciens közvetítésével

A korábban ismertetett transzformációs eljárást alkalmaztuk [Valvekens és mtsai. (1988)], kisebb módosításokkal [Sun és mtsai.: Plánt Cell 4, 119 (1992)]. A pGAl-45-, 47- és 49-jelü vektorokat elektroporációval juttattuk be az agrobaktérium LBA4404-törzsbe [Ausubel és mtsai.: Current Protocols in Molecular Biology, New York, Green Publishing Associates/Wiley-Interscience (1990)]. A plazmid inszertjének stabilitását az LBA4404-törzsben az NaOH/SDS mini preparációs eljárással tisztított plazmid-DNS restrikciós emésztése és géleletroforetikus elválasztása útján [Ausubel és mtsai.: Current Protocols in Molecular Biology, New York, Green Publishing Associates/Wiley-Interscience (1990)].

Az LBA4404-törzs egyedi plazmidokat hordozó friss, egy éjszakás tenyészetét használtuk fel négy hetes gal-3-mutánsokból izolált gyökérexplantumok fertőzésére. A Km² transzgenikus növényeket Valvekens és mtsai. eljárása szerint regeneráltuk [Valvekens és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5536 (1988)]. A transzgenikus növények magjait MS-agar lemezeken csíráztattuk, melyek kanamicint tartalmaztak (50 pg/ml). A ki nem csírázott magokat nyolc nap elteltével olyan MSlemezekre vittük át, melyek 100 pmól/1 GA3-at és 50 pg/ml ganamicint tartalmaztak, hogy vizsgálni tudjuk a GA⁺/Km^r és GA’/Km^s szegregációt.

<1

-73Mind a szensz, mind pedig az antiszensz konstrukciókat tartalmazó konstrukciós Arabidopsis növényekben összehasonlítottuk a GA1-fehérje szinteket a vad típusú növényekben mérhető fehérjeszintekkel (Landsberg erecta ökotípus), immunblot-analízis alkalmazásával (13. ábra). Az entkaurén szintetáz aktivitás legnagyobb részét tartalmazó felülúszó frakciókat a szövetek extrahálása és centrifügálás útján állítottuk elő [Bensen és Zeevaart: J. Plánt Growth Regül. 9, 237 (1990)]. A vizsgált három túltermelő leszármazási vonal blotján egy 76 kD-os föfehérjecsík jelölődött GA1ellenanyagokkal (13. ábra, 3.,4. és 5. sávok). Ez a fehérje nagyobb mennyiségben halmozódott fel azokban a növényekben, melyek a CaMV-35STEV-NTR-GA1-konstrukciókat tartalmazták (4. és 5. sávok), mint azokban a növényekben, melyek a CaMV-35S-GAl-konstrukciót tartalmazták. Ez a fehérjecsík a 2. és 6. sávokban nem található, ezek a sávok sorrendben az antiszensz konstrukcióval transzformált transzgenikus leszármazási vonalból, valamint a vad típusú növényekből extrahált fehérjéket tartalmazzák. A vizsgálati eljárás érzékenysége olyan nagy, hogy alkalmazásával az E. coli sejtekben termeltetett gélből tisztított 86 kD molekulatömegü GA1-fehérje körülbelül 1 ng-ját ki lehet mutatni. Mivel az endogén GAl-gén rendkívül kis mértékben expresszálódik [Sun és mtsai.: Plánt Cell 4, 119 (1992)], nem meglepő, hogy a GA1-ellenanyagok nem voltak képesek kimutatni az endogén GA1-fehérje jelenlétét a vad típusú növényekben.

Ezen felül megvizsgálhatjuk az endogén GAl-gén expressziós mintázatát, egy promóter-glükuronidáz (GUS) génfüzió alkalmazásával. Az ilyen analízisből nyert adatokat felhasználhatjuk arra, hogy növényi szervekre « · · il

- 74specifíkus promóterek és cDNS-gének fúzióinak alkalmazásával manipulálni tudjuk a GA-bioszintézist különböző növényi szervekben.

Immunbiot analízisek

Kéthetes Arabidopsis magoncokból fehérjekivonatot készítettünk, majd azt 10 000 g-vel 10 percig végzett centrifugálással frakcionáltuk, majd 100 000 g-vel 90 percig 4 °C-on centrifugáltunk [Bensen és Zeevaart: J. Plánt. Growth Regül. 9, 237 (1990)]. A 100 000 g-s felülúszó frakciókat (egyenként 50 mg-ot) 8 %-os SDS-PAGE-gélre vittünk fel, elektroforetizáltuk, majd GeneScreen membránra vittük át az elválasztott fehérjéket (DuPont-New England Nuclear). Az immunbiot analízist a szakirodalomban leírtak szerint végeztük [Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]. A membránokat 1000-szer hígított 30 kD-GAlantiszérummal (elsődleges ellenanyag) inkubáltuk, majd pedig 2500-szor hígított peroxidázzal konjugált kecskében termeltetett antinyúl ellenszérummal (másodlagos ellenanyag, Sigma), a detektálást pedig erősített kemilumieszcens reagenssel (ECL, Amersham) autoradiográfía alkalmazása útján végeztük.

8. példa

GAl-fehérjék túltermeltetése E. coli sejtekben, eljárások GA1-ellenanyagok előállítására

A pGAl-40 és pGAl-43 konstrukciókat a BL21(DE3)-jelű DE3lizogén E. coli törzsbe transzformáltuk [Studier és mtsai.: Methods Enzymol. 185. 60 (1990)]. A GAl-cDSN expresszióját 0,4 mmól/1 • Β «

- 75 izopropil-B-D-tiögalaktopiranozid (IPTG) hozzáadásával indukáltuk, 600 nm-nél mért 0,8 abszorbanciaértéknél, 37 °C-on végzett 2 órás inkubáciA óval. A tenyészetek 30 ml-éből a sejteket centrifügálással begyűjtöttük, megmostuk, majd ismét felszuszpendáltuk őket 10 ml 50 mmól/l-es Tris-pufferben (pH = 8,0), amely 2 mmól/1 EDTA-t is tartalmazott. A sejteket jégen ultrahanggal kezeltük Branson microtip alkalmazásával, 4-es beállítási értéknél, négy 20 másodperces pulzus alkalmazásával. A szonikát sejteket 1 % Triton Χ-100-al kevertük össze, 5 percig jégen állni hagytuk, majd 10 percig 4 °C-on 12 000 g-vel centrifugáltuk, a fehérjezárványok izolálása céljából [Marsion: DNA Cloning: A Practical Approach, Oxford England, IRL Press (1987), kisebb módosításokkal].

Az E. coli extraktumok fehérjezárvány-frakcióiból SDSpoliakrilamid-gélelektroforézis, valamint elektroelúció alkalmazásával (Schleicher és Schuell-féle elektroszeparációs rendszerben) megtisztítottuk a 30 kD és 86 kD molekulatömegü GA1-fehérjéket. A tisztított fehérjék az SDS-poliakrilamid géleken Coomassie Blue festéssel egyetlen csíkot adtak. Mind a 30, mind pedig a 86 kD molekulatömegü GA1-fehérjék ellen nyúl ellenanyagokat termeltettünk, a gélből tisztított fehérjék komplett Freund-féle adjuvánsban történő szubkután injektálása útján [Harlow és Lane: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]. Az N-csoport analízis céljára a fehérjéket SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel tisztítottuk, majd Immobilon membránra vittük át őket (Millipore), 10 % metanolt tartalmazó Tris-glicinpufferben. A membránt először Ponceau S festékkel festettük meg, majd • *

-76ioncserélt vízben festéktelenítettük, és ezután a 30 kD és 86 kD molekulatömegű fehérjéket tartalmazó csíkokat N-csoport analízis céljára kivágtuk.

9. példa

A GAl-cDNS és a GGPP szintáz gén ko-expresszióia E. coli sejtekben

A CCP-felhalmozódás kimutatás céljából a HMS174 (DE3)-jelű

E. coli törzset kotranszformáltuk a 2,5 kb-os GAl-cDNS-t tartalmazó pGAl-43-vektorral, valamint a CRT-E-jelü GGPP szintáz gént tartalmazó pACCRT-E-vektorral. Kontrolkísérletként a pACCRT-E-plazmidot a rövidített GAl-cDNS-t tartalmazó pGAl-40-vektorral is kontranszformáltuk a HMS174 (DE3)-törzsbe. Minden egyes 200 ml-es tenyészet esetén úgy jártunk el, hogy 200 ml LB-táptalajba 4 ml friss, egy éjszakás tenyészetet oltottunk be, a táptalaj tartalmazott 30 pg/ml klóramfemnikolt és 100 pg/ml ampicillint is, majd a beoltott tenyészetet 37 °C-on erős rázatással inkubáltuk. Amikor a 600 mn-en mért abszorbanciaérték elére a 0,9-et, a tenyészethez 200 μΐ 0,1 mól/l-es IPTG-oldatot adtunk, majd a tenyészetet további egy órán át 37 °C-on inkubáltuk. A sejteket ezután centrifíigálással kiülepítettük, 100 ml pufferrel mostuk (10 mmól/1 Tris, pH=8,0, 0,1 mól/l NaCl, 1 mmól/1 EDTA, pH=8,0), majd a sejteket fagyasztva szárítottuk.

A, A GGPP és CPP extrahálása E. coli sejtekből

A fagyasztva szárított sejteket 1 ml vízben felszuszpendáltuk, majd 3x 2 ml metanollal extraháltuk őket 0 °C-on. A centrifugálást követően a tiszta metanol-víz-extraktumokat vákuumban betöményítettük, 30 °C-on rotációs betöményítőkészülék alkalmazásával. A betöményített oldathoz kis mennyiségben vizet adtunk, majd ismét betöményítettük, hogy eltávolítsuk a il

-ΊΊ maradék metanolt is a vizes oldatból. A betöményített oldatot ezután 2 ntl-re hígítottuk 25 mmól/l-es Na₂CO₃ oldat alkalmazásával, majd a kapott oldatot 3x 1 ml hexánnal extraháltuk. A megmaradt vizes fázist összegyűjtöttük GC/MS-analízis céljára.

B. A pirofoszfát oldat hidrolízise, és a geronilgeraniol és kopalol analízise GC/MS-eliárás alkalmazásával

A pirofoszfát oldat 1/50 részét elhidrolizáltuk 18 egység bakteriális lúgos foszfatáz (Takara, Japán) alkalmazásával, 100 rnmól/1 Tris-HCloldatban (pH-9,0), amely 2 mmól/1 MgCl₂-t is tartalmazott, a reakciót 15 órán keresztül 30 °C-on végeztük, majd három hexános extrakció következett. Az összegyűjtött hexános extraktumokat enyhe N₂-áramban dekoncentráltuk, majd a maradékot 200 μΐ hexánban feloldottuk, és ennek a mintának 1 μΙ-ét teljes pásztázású GC/MS-elj árassal analizáltuk. A GC/MSeljárást egy Finnigan MÁT INCOS 50 tömegspektrométerrel hajtottuk végre, amely egy HP 5890A gázkromatográfhoz volt kapcsolva (Finnigan MÁT), amely kapilláris oszloppal volt felszerelve (DB-1, 0,32 mm idx30m, J & W Scientific Inc. USA), a szakirodalomban leírtak szerint [Saito és mtsai.: Plánt Cell Physiol, 32, 239 (1991)]. A kísérleteket kétszer megismételtük. Az autotentikus genarilgenariol és kopalol mintákat Dr. T. Takigawa bocsátotta rendelkezésünkre (Kurare Central Research Institute) valamint Dr. T. Nakano (Venezuela Science Institute).

10. példa

Szekvenciaösszehasonlítás egyéb terpén ciklázokkal

A különböző peptidek közötti szekvenciahomológia keresésre a National Center fór Biotechnology Intézetnél rendelkezésre álló BLAST hálózati rendszert [Altschul és mtsai.: J. Mól. Bioi. 215. 403 (1990)], valamint a FatA és BestFit GCG számitógépes programokat használtuk. A szekvenciaillesztéseket az említett GCG-program PileUp és LineUp részprogramjainak alkalmazásával hajtottuk végre.

A GAl-fehérje kikövetkeztetett aminosavsorrendjét (802 aminosav) a GeneBank adatbázisban található szekvenciákkal összehasonlítva kiderült, hogy a GA1-fehérjében egy 124 aminosavból álló részlet (328-451), valamint egy 165 aminosavból álló részlet (334-498) homológiát mutat sorrendben a dohány szeszquiterpén cikláz [Facchini és Chappell: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11008 (1992)] szekvenciájával (72 % homológja, 36 % azonosság), valamint a mentol limonén szintázával (72 % homológia), 32 % azonosság; [Colby és mtsai.: J. Bioi. Chem. 268, 23016 (1993)]. A kasztorbab kaszbén szintáza [Colby és mtsai.: J. Bioi. Chem. 268, 23016 (1993)], egy diterpén cikláz, szintéz szekvenciahasonlóságot mutat (72 % homológia, 30 % azonosság) a GAl-fehérje egy 182 aminosavhosszúságú részletével (329-510-ig). A 15. ábrán láthatjuk a kikövetkeztetett GA1-szekvencia (327-604-íg), valamint az említett három terpén cikláz részleges szekvenciáinak részleges egymás alá rendezését. A DDXXD szekvenciarészlet, amelyről feltételezik, hogy szerepet játszik a prenil szubsztrát kétértékű ionpirofoszfát komplexének megkötésében [Ashby és mtsai.: Molecular Biology of Atherosclerosis, Elsevier Science Publishers B.V., Amszterdam

-79(1990)] a GA1-fehérje szekvenciájában nem található meg. Ez a szekvenciarészlet a másik három terpén ciklázban nagy mértékben konzervatív, és megtalálható néhány más prenil transzferázban is [Facchini és Chappell: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11088 (1992); Jennings és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6038 (1991)]. Ezek az enzimek valamennyiben allil pirofoszfátok kondenzációs reakcióit katalizálják, mely reakciók ciklikus terpének kialakulásához vezetnek, vagy magasabbrendű prenil pirofoszfátok kialakulásához. Ezzel szemben, a GA1 olyan ciklizációs reakciót katalizál’ amelyben a pirofoszfát csoport nem távolítódik el. Egy az előbbitől eltérő aszparaginsavban gazdag szekvenciamotívumot DXDDTA- azonosítottunk a GA1-szekvenciában is a 377-382. aminosavak között. Ez a szekvencia megtalálható a Zymomonas mobilis-bő\ (GenBank/EMBL No. X73561) és a Bacillus acidocaldarius-ból (Ochs et al., 1992) izolált szkvalén-hopén ciklázokban is. Ezek az enzimek egy triterpén, a szkvalén közvetlen ciklizációját katalizálják, mely reakció hopanoidok kialakulásához vezet; a szkvalén szubsztrát nem tartalmaz pirofoszfátot. Az említett két enzim és a GA1-fehérje közös katalitikus sajátsága, hogy terpenoid vegyületek gyürüzáródási reakcióit katalizálják. Bár a szkvalén-hopén ciklázok nem tartalmaznak a GA1-fehérjével homológ szekvenciájú hosszabb régiókat, de a DXDDTA-szekvenciamotívum szerepet játszhat ezen enzimek katalitikus aktivitásában.

• >

···

11. példa

In vitro szintetizált GA1-fehérje importálása intakt borsó kloroplasztokba

A pGAl-84-plazmidot, amely TEV-NTR-GAl-cDNS-t tartalmaz, EcoRI-enzimmel végzett inkubálás útján linearizáltuk, és a linearizált plazmidot in vitro transzkripciós kísérletben templátként használtuk, digunaozin-trifoszfát (Pharmacia) és SP6 RNS polimeráz (New England BioLab) jelenlétében [Krainer és mtsai.: Cell 36. 93 (1984)]. A kapott 5'sapkázott GAl-transzkriptumokat in vitro transzláltuk, Promega által forgalmazott nyúl retikulocita transzlációs rendszer alkalmazásával, ³⁵S-jelzett metionin/cisztein (ICN) felhasználásával, a Promega cég által mellékelt leírás szerint. A transzlációs elegyet 10 000 g-vel centrifugáltuk 4 °C-on 15 percen keresztül. A poszriboszomlális felülúszót importálási kísérletekre használtuk fel. A fehérjeimportálási kísérleteket intakt borsókloroplasztok alkalmazásával Grossman és mtsai. eljárása szerint végeztük [J. Bioi. Chem. 257. 1558 (1982)], csekély módosítással [Kohom és mtsai.: J. Cell Bioi 102. 972 (1986)]. A borsókloroplasztokkal történő inkubálás után a reakcióelegyhez 200 pg/ml X-típusú proteázt (termolizin, Sigma) adtuk a reakcióelegyhez, az intakt kloroplasztok által fel nem vett fehérjék degradálása céljából. A termolizines kezelés során a reakciótérfogat 1/10 részének megfelelő mennyiségű 0,1 %-os Triton X-100 oldatot adtunk a reakcióelegyhez. Az intakt kloroplasztokat ezután 35 % Percoll-ban végrehajtott centrifugálással tisztítottuk, majd SDS-poliakrilamid-gélben elválasztottuk a kloroplasztokban levő fehérjéket, majd a gélt autoradiográfíának vetettük alá.

·*· · • *

-81 Az immunobiot és az in vitro fehérjeimport kísérletek azt mutatták, hogy a GA1-fehérje be tud jutni a kloroplasztokba, ahol érési folyamaton megy keresztül. A GA1-fehérje első 50 N-terminális aminosava szerinben (26 %) és treoninban (12 %) gazdag, és ennek a fehérjerészletnek a becsült pl-értéke 10,2. Ezek a sajátságok megegyeznek sok kloroplaszt-fehérje tranzitpeptidjének a tulajdonságaival [Keegstra és mtsai.: Ann. Rév. Plánt Physiol. Plánt. Mól. Bioi. 40, 471 (1989)]. Az SP6 RNS polimeráz és a nyúl retikulocita transzlációs rendszer felhasználásával in vitro megszintetizáltunk egy ³⁵S-metionin/cisztein jelzett 86 kD molekulatömegű GA1-fehérjét (14. ábra 3. sáv). Ennek az in vitro transzlációval előállított fehérjének a mérete azonos az E. coli sejtekben expresszált fehérje méretével (14. ábra 1. sáv). Amennyiben a 86 kD molekulatömegü in vitro transzlációval előállított terméket borsó kloroplasztokkal inkubáltuk, a fehérje átalakult egy kisebb 76 kD molekulatömegű fehérjévé, amely a kísérletben védettnek bizonyult a kívülről hozzáadott proteáz általi emésztéssel szemben (6. ábra 4. sáv). Ezt a fehérjét a proteáz degradálta amennyiben a kloroplasztok szerkezetét 0,1 % Triton X-100 hozzáadásával szétromboltuk (14. ábra 5. sáv). Immunbiot analízis alkalmazásával kimutattuk, hogy a GAl-cDNS-röl a transzgenikus növények által termelt GA1-fehérje 76 kD molekulatömegü fehérjeként viselkedett (14. ábra 2. sáv). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy in planta a GA1-fehérjék a kloroplasztokba szállítódnak, és ott érési folyamaton mennek keresztül.

ιί

12. példa

A GA1-fehérjét kódoló RNS transzlációjának modulálása

A GA1-fehérjét kódoló RNS-transzlációját a növényekben oly módon modulálhatjuk, hogy előállítunk egy expressziós vektort, amely egy funkcionálisan kapcsolt promoter segítségével képes antiszensz GA1-RNS transzkripcióját előidézni. A növényt azután az antiszensz GAl-RNS-t kódoló vektorral transzferáljuk.

13. példa

A GA1-fehérjét kódoló DNS klónozása

A GA1-fehérjét oly módon klónozzuk meg, hogy sztringens hibridizációs körülmények között kívánt DNS-molekulát a 9. ábrán látható szekvenciával vagy annak fragmensével vagy ezek antiszensz szekvenciáival hibridizáltatunk. A próbaszekvenciával hibridizálódó DNS-molekulákat kiválasztjuk, és azokkal gazdasejtet transzformálunk. A GA1-fehérjét expresszáló transzformánsokat szelektáljuk és klónozzuk.

14. példa

A GA1-fehérjét kódoló DNS klónozására alkalmas hibridizációs körülmények

A GA1-fehérjét kódoló DNS klónozására alkalmas hibridizációs körülmények a következők.

1) előhibridizáció: 65 °C, 1 óra;

2) hibridizáció: 65 °C-on, egy éjszakán át hibridizációs pufferben;

3) mosás: 2x 5 percig 2xSSC pufferben 65 °C-on, majd 2x 30 percig 2xSSCpufferben, majd 1,0 % SDS-ben 65 °C-on; és

4) mosás: 2x 5 percig szobahőmérsékleten 0,lx SSC-ben.

75. példa

Molekulatömeg markerek

A rekombináns úton előállított GA1-fehérjét szakember számára közismert eljárások alkalmazásával tisztítjuk [Current Protocol in Molecular Biology, 2. kötet, 10. fejezet, John Wiley & Sons, Publishers (1994)]. Mivel ismeretes a fehérje kikövetkeztetett aminosav sorrendje, a fehérje fontos molekulatömege meghatározható, és lehetőség van arra, hogy a fehérjét gélelektroforézises kísérletekben molekulatömeg markerként alkalmazzuk. A GA1-fehérje kikövetkeztetett aminosavsorrendje alapján számított molekulatömege: körülbelül 93 kDa.

A leírásban idézett valamennyi közlemény teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi.

Bár a találmány szerinti megoldást részben annak előnyös megvalósítási módjain keresztül szemléltettük, szakember számára kézenfekvő, hogy a találmány szerinti megoldásnak további változatai is léteznek, és a bejelentésben kinyilvánított igényünk vonatkozik a találmány szerinti megoldás valamennyi variációjára, alkalmazására, vagy adaptálására, melyek általánosságban a találmány szerinti megoldás elvi alapjain állnak, beleértve azokat az eltéréseket is a jelen leírásban feltárt megoldásoktól, melyek a szakember kötelesé tudása alapján végrehajthatók, az előzőekben és a leíráshoz csatolt szabadalmi igénypontokban feltárt alapvető sajátságok alkalmazásával.

• «· ·

ί

-84SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 903 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS-böl mRNS

EREDETI FORRÁS: Arabidopsis thaliana

KL 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTGGAGGAAT TCCTTTTTTT ΊΤΠΤΠΤΓΓ TGGCTTTGAG TGAAGTACAT AGGACCCATC 60

TATATATACT TTGAAATATA TTCATATAAA AATAGAATGT TCAAATGTAT ATTTTTTGGC 120

CCAACACACA AACCTTGTAA GCTTTAGCTC TTTCTTGGCG TATATATCTT TTAAGACCGG 180

AGAATCGTAC GGTACATCAA TGTTTATTCC TCGAGCTATC TCAAGCAACG ATGGGAATGC 240

TACTTCGAAT CCGATTGGCA TATGCTCATC ATTTTCGTCT TCTAGCTTCC CAATATTTTC 300

CCGGAAAAAC GTGATTCCTT TGTTGCATTG ATGAGGAAAG AGATTCCATG ATCTTAGAGG 360

AACGACGCAT GCAAGGGTAT TGATGAGACG ATCATGATAA GAGAAGAGAT ACGCATCTCC 420

CCAAGAACCA TCGCIAAAGTT GGTTCTCGGG GATCCATTTC ACGGCGGAGG GAAACGCCGG 480

AGTTTTATCT CCGGCATCGA TCAATGCAAC CCAAGCTGTA TCGTAAGCCG ATATCGTAAT 540

TTCCCCGTCC GTTAGGTTTC TCAAGATCGT TTTCACACTC TTCACTGCTT CTTTGAATGC 600

ATTACTATTA CTTCCAACAC TAATCTGAGG AGCATCTTCT CCTTGAAGCT GTTGCCACTC 660

ATGTATTAGA GGCAAATCAT GTTGAACCTC TTGAGAATTA ATGTATTCTT GAGTTCGAAG 720

CTTTGAACAA TGTATGGAAC CGCTTCTGGA TTTGTCTCTA GCGACATTGA GAGGAGATCC 780

TGAGATGGTA AGGAAAGAAG AAGATATTGT TGTTTTAGTA GAACTGAGAA AGGTTGTACT 840

TGGAATGGAG TTTAGAACAT GATACTGAAG AGACATGGCT TTAAAAAAAA AAAAAAGGAA 900

TTC

903 il

- 85 A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 903 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

EREDETI FORRÁS: Arabidopsis thaliana

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAATTCCTTT ΓΓΓΓΓΓΓΓΠ TAAAGCCATG TCTCTTCAGT ATCATGTTCT AAACTCCATT 60

CCAAGTACAA CCTTTCTCAG TTCTACTAAA ACAACAATAT CTTCTTCTTT CCTTACCATC 120

TCAGGATCTC CTCTCAATGT CGCTAGAGAC AAATCCAGAA GCGGTTCCAT ACATTGTTCA 180

AAGCTTCGAA CTCAAGAATA CATTAATTCT CAAGAGGTTC AACATGATTT GCCTCTAATA 240

CATGAGTGGC AACAGCTTCA AGGAGAAGAT GCTCCTCAGA TTAGTGTTGG AAGTAATAGT 300

AATGCATTCA AAGAAGCAGT GAAGAGTGTG AAAACGATCT TGAGAAACCT AACGGACGGG 360

GAAATTACGA TATCGGCTTA CGATACAGCT TGGGTTGCAT TGATCGATGC CGGAGATAAA 420

ACTCCGGCGT TTCCCTCCGC CGTGAAATGG ATCGCCGAGA ACCAACTTTC CGATGGTTCT 480

TGGGGAGATG CGTATCTCTT CTCTTATCAT GATCGTCTCA TCAATACCCT TGCATGCGTC 540

GTTGCTCTAA GATCATGGAA TCTCTTTCCT CATCAATGCA ACAAAGGAAT CACGTTTTTC 600

CGGGAAAATA TTGGGAAGCT AGAAGACGAA AATGATGAGC ATATGCCAAT CGGATTCGAA 660

GTAGCATTCC CATCGTTGCT TGAGATAGCT CGAGGAATAA ACATTGATGT ACCGTACGAT 720

TCTCCGGTCT TAAAAGATAT ATACGCCAAG AAAGAGCTAA AGCTTACAAG GTTTGTGTGT 780

TGGGCCAAAA AATATACATT TGAACATTCT ATTTTTATAT GAATATATTT CAAAGTATAT 840

ATAGATGGGT CCTATGTACT TCACTCAAAG CCAAAAAAAA AAAAAAAAAA GGAATTCCTG 900

CAG 903

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 2587 bázispár ·«··

-86TÍPUSA: nukl’einsav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: cDNS

EREDETI FORRÁS: Arabidopsis thaliana

SAJÁTSÁG:

NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS

ELHELYEZKEDÉS: 48..2453

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTTCTTCACT AAATACTTAG ACAGAGAAAA CAGAGCTTTT TAAAGCC ATG TCT CTT 56 Met Ser Leu

CAG TAT CAT GTT CTA AAC TCC ATT CCA AGT ACA ACC TTT CTC AGT TCT104

Gin Tyr His Val Leu Asn Ser Ile Pro Ser Thr Thr Phe Leu Ser Ser

1015

ACT AAA ACA ACA ATA TCT TCT TCT TTC CTT ACC ATC TCA GGA TCT CCT152

Thr Lys Thr Thr Ile Ser Ser Ser Phe Leu Thr Ile Ser Gly Ser Pro

25 3035

CTC AAT GTC GCT AGA GAC AAA TCC AGA AGC GGT TCC ATA CAT TGT TCA 200

Leu Asn Val Alá Arg Asp Lvs Ser Arg Ser Gly Ser De His Cys Ser

45’50

AAG CTT CGA ACT CAA GAA TAC ATT AAT TCT CAA GAG GTT CAA CAT GAT 248

Lys Leu Arg Thr Gin Glu Tyr Ile Asn Ser Gin Glu Val Gin His Asp

6065

TTG CCT CTA ATA CAT GAG TGG CAA CAG CTT CAA GGA GAA GAT GCT CCT 296

Leu Pro Leu Ile His Glu Trp Gin Gin Leu Gin Gly Glu Asp Alá Pro

7580

CAG ATT AGT GTT GGA AGT AAT AGT AAT GCA TTC AAA GAA GCA GTG AAG344

Gin De Ser Val Gly Ser Asn Ser Asn Alá Phe Lys Glu Alá Val Lys

9095

AGT GTG AAA ACG ATC TTG AGA AAC CTA ACG GAC GGG GAA ATT ACG ATA 392

Ser Val Lys Thr Ile Leu'Arg Asn Leu Thr Asp Gly Glu Ile Thr Ile

100 105 110115

TCG GCT TAC GAT ACA GCT TGG GTT GCA TTG ATC GAT GCC GGA GAT AAA 440

Ser Alá Tyr Asp Thr Alá Trp Val Alá Leu De Asp Alá Gly Asp Lys

120 125130

ACT CCG GCG TTT CCC TCC GCC GTG AAA TGG ATC GCC GAG AAC CAA CTT488

Thr Pro Alá Phe Pro Ser Alá Val Lys Trp De Alá Glu Asn Gin Leu

135 140145 • ··· • · ··

-87SSWŐ1F SSf ftítíWiBÁ W^{XT c<rr}

150 155 160

CTC ATC AAT ACC CTT GCA TGC GTC GTT GCT CTA AGA TCA TGG AAT CTC

Leu Ile Asn Thr Leu Alá Cys Val Val Alá Leu Arg Ser Trp Asn Leu

165 170 175

584

632

GGG AAG CTA GAA GAC GAA AAT GAT GAG CAT ATG CCA ATC GGA TTC GAA

Gly Lys Leu Glu Asp Glu Asn Asp Glu His Met Pro Ile Gly Phe Glu

200 205 210

680

GTA GCA TTC CCA TCG TTG CTT GAG ATA GCT CGA GGA ATA AAC ATT GAT Val Alá Phe Pro Ser Leu Leu Glu Ile Alá Arg Gly Ile Asn Ile Asp

215 220 225

728

GTA CCG TAC GAT TCT CCG GTC TTA AAA GAT ATA TAC GCC AAG AAA GAG

Val Pro Tyr Asp Ser Pro Val Leu Lys Asp De Tyr Alá Lys Lys Glu

230 235 240

776

CTA AAG CTT ACA AGG ATA CCA AAA GAG ATA ATG CAC AAG ATA CCA ACA

Leu Lys Leu Thr Arg De Pro Lys Glu Ile Met His Lys Ile Pro Thr

245 250 255

824

ACA TTG TTG CAT AGT TTG GAG GGG ATG CGT GAT TTA GAT TGG GAA AAG

Thr Leu Leu His Ser Leu Glu Gly Met Arg Asp Leu Asp Trp Glu Lys

260 265 270 275

872

CTC TTG AAA CTT CAA TCT CAA GAC GGA TCT TTC CTC TTC TCT CCT TCC

Leu Leu Lvs Leu Gin Ser Gin Asp Gly Ser Phe Leu Phe Ser Pro Ser

280 285 290

920

TCT ACC GCT TTT GCA TTC ATG CAG ACC CGA GAC AGT AAC TGC CTC GAG

Ser Thr Alá Phe Alá Phe Met Gin Thr Arg Asp Ser Asn Cys Leu Glu

295 300 305

968

TAT TTG CGA AAT GCC GTC AAA CGT TTC AAT GGA GGA GTT CCC AAT GTC

Tyr Leu Arg Asn Alá Val Lys Arg Phe Asn Gly Gly Val Pro Asn Val

310 315 320

1016

TTT CCC GTG GAT CTT TTC GAG CAC ATA TGG ATA GTG GAT CGG TTA CAA

Phe Pro Val Asp Leu Phe Glu His Ile Trp Ile Val Asp Arg Leu Gin

325 330 335

1064

CGT TTA GGG ATA TCG AGA TAC TTT GAA GAA GAG ATT AAA GAG TGT CTT

Arg Leu Gly De Ser Arg Tyr Phe Glu Glu Glu De Lys Glu Cys Leu

340 345 350 355

GAC TAT GTC CAC AGA TAT TGG ACC GAC AAT GGC ATA TGT TGG GCT AGA

Asp Tyr Val His Arg Tyr Trp Thr Asp Asn Gly De Cys Trp Alá Arg

360 365 370

TGT TCC CAT GTC CAA GAC ATC GAT GAT ACA GCC ATG GCA TTT AGG CTC

Cys Ser His Val Gin Asp Ile Asp Asp Thr Alá Met Alá Phe Arg Leu

375 380 385

TTA AGA CAA CAT GGA TAC CAA GTG TCC GCA GAT GTA TTC AAG AAC TTT

Leu Arg Gin His Gly Tyr Gin Val Ser Alá Asp Val Phe Lys Asn Phe

390 395 400

1160

1208

1256

-88GAG AAA GAG GGA GAG TIT TTC TGC TTT GTG GGG CAA TCA AAC CAA GC A1304

Glu Lys Glu Gly Glu Phe Phe Cys Phe Val Gly Gin Ser Asn Gin Alá

405 410415

GTA ACC GGT ATG TTC AAC CTA TAC CGG GCA TCA CAA TTG GCG TTT CCA 1352 Val Thr Gly Met Phe Asn Leu Tyr Arg Alá Ser Gin Leu Alá Phe Pro

420 425 430435

AGG GAA GAG ATA TTG AAA AAC GCC AAA GAG TTT TCT TAT AAT TAT CTG 1400 Arg Glu Glu Ile Leu Lys Asn Alá Lys Glu Phe Ser Tyr Asn Tyr Leu

440 445450

CTA GAA AAA CGG GAG AGA GAG GAG TTG ATT GAT AAG TGG ATT ATA ATG1448

Leu Glu Lys Arg Glu Arg Glu Glu Leu Ile Asp Lys Trp Ile Ile Met

455 460465

AAA GAC TTA CCT GGC GAG ATT GGG TTT GCG TTA GAG ATT CCA TGG TAC 1496 Lys Asp Leu Pro Gly Glu Ile Gly Phe Alá Leu Glu Ile Pro Trp Tyr

470 475480

GCA AGC TTG CCT CGA GTA GAG ACG AGA TTC TAT ATT GAT CAA TAT GGT1544

Alá Ser Leu Pro Arg Val Glu Thr Arg Phe Tyr Ile Asp Gin Tyr Gly

485 490495

GGA GAA AAC GAC GTT TGG ATT GGC AAG ACT CTT TAT AGG ATG CCA TAC 1592 Gly Glu Asn Asp Val Trp Ile Gly Lvs Thr Leu Tyr Arg Met Pro Tyr

500 505 510 ‘515

GTG AAC AAT AAT GGA TAT CTG GAA TTA GCA AAA CAA GAT TAC AAC AAT 1640 Val Asn Asn Asn Gly Tyr Leu Glu Leu Alá Lys Gin Asp Tyr Asn Asn

520 525530

TGC CAA GGT CAG CAT CAG CTC GAA TGG GAC ATA TTC CAA AAG TGG TAT 1688 Cys Gin Alá Gin His Gin Leu Glu Trp Asp Ile Phe Gin Lys Trp TyT

535 540545

GAA GAA AAT AGG TTA AGT GAG TGG GGT GTG CGC AGA AGT GAG CTT CTC 1736 Glu Glu Asn Arg Leu Ser Glu Trp Gly Val Arg Arg Ser Glu Leu Leu

550 555560

GAG TGT TAC TAC TTA GCG GCT GCA ACT ATA TTT GAA TCA GAA AGG TCA 1784 Glu Cvs Tvt Tvt Leu Alá Alá Alá Thr Ile Phe Glu Ser Glu Arg Ser

565 ' ' 570575

CAT GAG AGA ATG GTT TGG GCT AAG TCA AGT GTA TTG GTT AAA GCC ATT1832

His Glu Arg Met Val Trp Alá Lys Ser Ser Val Leu Val Lys Alá De

580 585 590595

TCT TCT TCT TTT GGG GAA TCC TCT GAC TCC AGA AGA AGC TTC TCC GAT 1880 Ser Ser Ser Phe Gly Glu Ser Ser Asp Ser Arg Arg Ser Phe Ser Asp

600 605610

CAG TTT CAT GAA TAC ATT GCC AAT GCT CGA CGA AGT GAT CAT CAC TTT 1928 Gin Phe His Glu Tyr Ile Alá Asn Alá Arg Arg Ser Asp His His Phe

615 620625

AAT GAC AGG AAC ATG AGA TTG GAC CGA CCA GGA TCG GTT CAG GCC AGT 1976 Asn Asp Arg Asn Met Arg Leu Asp Arg Pro Gly Ser Val Gin Alá Ser

630 635640

CGG CTT GCC GGA GTG TTA ATC GGG ACT TTG AAT CAA ATG TCT TTT GAC2024

Arg Leu Alá Gly Val Leu De Gly Thr Leu Asn Gin Met Ser Phe Asp

645 650655 ·· • 9 ·· ···♦ φ* < ··· //

-89CTT TTC ATG TCT CAT GGC CGT GAC GTT AAC AAT CTC CTC TAT CTA TCG 2072

Leu Phe Met Ser His Glv Arg Asp Val Asn Asn Leu Leu Tnt Leu Ser

660 665 ' 670675

TGG GGA GAT TGG ATG GAA AAA TGG AAA CTA TAT GGA GAT GAA GGA GAA 2120 Trp Gly Asp Trp Met Glu Lys Trp Lys Leu T\t Glv Asp Glu Gly Glu

680 685690 '

GGA GAG CTC ATG GTG AAG ATG AT A ATT CTA ATG AAG AAC AAT GAC CTA2168

Gly Glu Leu Met Val Lys Met Ile Ile Leu Met Lys Asn Asn Asp Leu

695 700705

ACT AAC TTC TTC ACC CAC ACT CAC TTC GTT CGT CTC GCG GAA ATC ATC 2216

Thr Asn Phe Phe Thr His Thr His Phe Val Arg Leu Alá Glu Ile Ile

710 715.720

AAT CGA ATC TGT CTT CCT CGC CAA TAC TTA AAG GCA AGG AGA AAC GAT 2264 Asn Arg De Cys Leu Pro Arg Gin Tyr Leu Lys Alá Arg Arg Asn Asp

725 730735

GAG AAG GAG AAG ACA ATA AAG AGT ATC GAG AAG GAG ATG GGG AAA ATG 2312 Glu Lys Glu Lys Thr Ile Lys Ser Met Glu Lvs Glu Met Glv Lvs Met

740 745 750‘ 755

GTT GAG TTA GCA TTG TCG GAG AGT GAC ACA TTT CGT GAC GTC AGC ATC 2360 Val Glu Leu Alá Leu Ser Glu Ser Asp Thr Phe Ara Asp Val Ser Ile

760 765770

ACG TTT CTT GAT GTA GCA AAA GCA TTT TAC TAC TTT GCT TTA TGT GGC 2408

Thr Phe Leu Asp Val Alá Lys Alá Phe Tyr Tyr Phe Alá Leu Cys Gly

775 780785

GAT CAT CTC CAA ACT CAC ATC TCC AAA GTC TTG TTT CAA AAA GTC2453

Asp His Leu Gin Thr His Ile Ser Lvs Val Leu Phe Gin Lvs Val

790 795800

TAGTAACCTC ATCATCATCA TCGATCCATT AACAATCAGT GGATCGATGT ATCCATAGAT 2513

GCGTGAATAA TATTTCATGT AGAGAAGGAG AACAAATTAG ATCATGTAGG GTTATCAAAA 2573

AAAAAAAAAA AAAA

2587

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 802 bázispár

TÍPUSA: aminosav

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: fehérje • * · 1 ·· 9· ··· *♦ il

-90Α 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Ser Leu Gin Tyr His Val Leu Asn Ser Ile Pro Ser Thr Thr Phe 15 1015

Leu Ser Ser Thr Lvs Thr Thr He Ser Ser Ser Phe Leu Thr Ile Ser

2530

Gly Ser Pro Leu Asn Val Alá Arg Asp Lys Ser Arg Ser Gly Ser Ile 35 4045

His Cys Ser Lys Leu Arg Thr Gin Glu Tyr Ile Asn Ser Gin Glu Val 50 5560

Gin His Asp Leu Pro Leu Ile His Glu Trp Gin Gin Leu Gin Gly Glu 65 70 7580

Asp Alá Pro Gin Ile Ser Val Gly Ser Asn Ser Asn Alá Phe Lys Glu 85 9095

Alá Val Lys Ser Val Lys Thr Ile Leu Arg Asn Leu Thr Asp Gly Glu 100 105110

De Thr Ile Ser Alá Tyr Asp Thr Alá Trp Val Alá Leu Ile Asp Alá 115 120125

Gly Asp Lys Thr Pro Alá Phe Pro Ser Alá Val Lys Trp Ile Alá Glu 130 135140

Asn Gin Leu Ser Asp Gly Ser Τη, Gly Asp Alá Tvt Leu Phe Ser T>t 145 150 155160 ’

His Asp Arg Leu Ile Asn Thr Leu Alá Cvs Val Val Alá Leu Arg Ser 165 170175

Trp Asn Leu Phe Pro His Gin Cys Asn Lys Gly Ile Thr Phe Phe Arg 180 185190

Glu Asn Ile Gly Lys Leu Glu Asp Glu Asn Asp Glu His Met Pro De 195 ' 200205

Glv Phe Glu Val Alá Phe Pro Ser Leu Leu Glu Ile Alá Arg Gly Ile 210 215220

Asn Ile Asp Val Pro Tyr Asp Ser Pro Val Leu Lvs Asp Ile Tyr Alá

225 230 23524Ó

Lys Lys Glu Leu Lys Leu Thr Arg Ile Pro Lys Glu Ile Met His Lys 245 250255

De Pro Thr Thr Leu Leu His Ser Leu Glu Gly Met Arg Asp Leu Asp 260 265270

Trp Glu Lys Leu Leu Lys Leu Gin Ser Gin Asp Gly Ser Phe Leu Phe 275 280285

Ser Pro Ser Ser Thr Alá Phe Alá Phe Met Gin Thr Arg Asp Ser Asn 290 295300

Cys Leu Glu Tyr Leu Arg Asn Alá Val Lys Arg Phe Asn Gly Gly Val 305 310 315320

··		•	··
« ·	•	··	• ·
···	•	•	·*
•	r ·	•
··	··	··«	··

il

-91 Pro Asn Val Phe Pro Val Asp Leu Phe Glu His He Trp He Val Asp 325 330335

Arg Leu Gin Arg Leu Gly Ile Ser Arg Tvr Phe Glu Glu Glu Ile Lys 340 345350

Glu Cys Leu Asp Tyr Val His Arg Tvr Trp Tlír Asp Asn Gly Ile Cys 355 360365

Trp Alá Arg Cys Ser His Val Gin Asp Ile Asp Asp Thr Alá Met Alá 370 375380

Phe Arg Leu Leu Arg Gin His Gly Tyr Gin Val Ser Alá Asp Val Phe 385 390 395 '400

Lys Asn Phe Glu Lys Glu Gly Glu Phe Phe Cys Phe Val Gly Gin Ser 405 410415

Asn Gin Alá Val Thr Gly Met Phe Asn Leu Tyr Arg Alá Ser Gin Leu 420 425430

Alá Phe Pro Arg Glu Glü Ile Leu Lys Asn Alá Lys Glu Phe Ser Tyr 435 440445

Asn Tyr Leu Leu Glu Lys Arg Glu Arg Glu Glu Leu Ile Asp Lys Trp 450 455460

De De Met Lvs Asp Leu Pro Gly Glu De Gly Phe Alá Leu Glu De

465 ’ 470 475480

Pro Trp Tyr Alá Ser Leu Pro Arg Val Glu Thr Arg Phe Tyr Ile Asp 485 490495

Gin Tyr Gly Gly Glu Asn Asp Val Trp Ile Gly Lys Thr Leu Txr Arg 500 505510

Met Pro Tyr Val Asn Asn Asn Gly Tyr Leu Glu Leu Alá Lys Gin Asp 515 520525

Tyr Asn Asn Cys Gin Alá Gin His Gin Leu Glu Trp Asp Ile Phe Gin 530 535540

Lys Trp Tyr Glu Glu Asn Arg Leu Ser Glu Trp Gly Val Arg Arg Ser 545 550 555560

Glu Leu Leu Glu Cys Tyr Tyr Leu Alá Alá Alá Thr Ile Phe Glu Ser 565 570575

Glu Arg Ser His Glu Arg Met Val Trp Alá Lys Ser Ser Val Leu Val 580 585590

Lys Alá Ile Ser Ser Ser Phe Gly Glu Ser Ser Asp Ser Arg Arg Ser 595 600605

Phe Ser Asp Gin Phe His Glu Tyr Ile Alá Asn Alá Arg Arg Ser Asp 610 615620

His His Phe Asn Asp Arg Asn Met Arg Leu Asp Arg Pro Gly Ser Val 625 630 635640

Gin Alá Ser Arg Leu Alá Gly Val Leu De Gly Thr Leu Asn Gin Met 645 650655

Ser Phe Asp Leu Phe Met Ser His Gly Arg Asp Val Asn Asn Leu Leu 660 665670

-92Tyr Leu Ser Trp Gly Asp Trp Met Glu Lys Trp Lvs Leu Tst Gly Asp 675 680685

Glu Gly Glu Gly Glu Leu Met Val Lys Met lle üe Leu Met Lys Asn 690 695700

Asn Asp Leu Thr Asn Phe Phe Thr His Thr His Phe Val Arg Leu Alá 705 710 715720

Glu He lle Asn Arg De Cys Leu Pro Arg Gin Tyr Leu Lys Alá Arg 725 730735

Arg Asn Asp Glu Lys Glu Lys Thr lle Lys Ser Met Glu Lys Glu Met 740 745750

Gly Lys Met Val Glu Leu Alá Leu Ser Glu Ser Asp Thr Phe Arg Asp 755 760765

Val Ser lle Thr Phe Leu Asp Val Alá Lys Alá Phe Tyr Tyr Phe Alá 770 775780

Leu Cys Gly Asp His Leu Gin Thr His He Ser Lys Val Leu Phe Gin

785 790 79580Ó

Lys Val

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 279 bázispár

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: nem releváns

MOLEKULATÍPUS: peptid

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Lys Leu Alá Asp Thr Leu Asn Leu üe Asp De lle Glu Arg Leu Gly 15 1015 lle Ser Tyr His Phe Glu Lys Glu lle Asp Glu lle Leu Asp Gin He

2530

Xaa Xaa Tyr Asn Gin Asn Xaa Xaa Xaa Ser Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 4045

Cys Asn Asp Leu Cys Thr Ser Alá Leu Gin Phe Arg Leu Leu Arg Gin 50 5560

His Gly Phe Asn He Ser Pro Glu He Phe Ser Lys Phe Gin Asp Glu

70 7580

-93Asn Glv Xaa Xaa Lvs Phe Lys Glu Ser Leu Alá Ser Asp Val Leu Gly

90 95

Leu Leu Asn Leu T\t Glu Alá Ser His Val Arg Thr His Alá Asp Asp 100 ' 105110 lle Leu Glu Asp Alá Leu Alá Phe Ser Thr lle His Leu Xaa Xaa Xaa 115 120125

Xaa Xaa Xaa Glu Ser Alá Alá Pro His Xaa Xaa Leu Ly s Ser Pro Leu 130 135140

Arg Glu Gin Val Thr His Alá Leu Glu Gin Cys Leu His Lys Gly Val

145 150 155160

Pro Arg Val Glu Thr Arg Phe Phe De Ser Ser lle Tyr Asp Lys Glu

165 170175

Gin Ser Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn

180 185190

Asn Val Leu Leu Arg Phe Alá Lys Leu Asp Phe Asn Leu Leu Gin Met

195 200205

Leu His Lys Gin Glu Leu Alá Gin Val Ser Arg Trp Trp Lys Asp Leu 210 215220

Asp Phe Val Thr Thr Leu Pro Tyr Alá Arg Asp Arg Val Val Glu Cys

225 230 ’ 235240

Tyr Phe Trp Alá Leu Gly Val Tyr Phe Glu Pro Gin Tyr Ser Gin Alá 245 250255

Arg Val Met Leu Val Lys Thr lle Ser Met lle Ser lle Val Asp Asp

260 265270

Thr Phe Asp Alá Tyr Gly Thr

275

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 279 bázispár

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: nem releváns

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asp Ser Val Glu Thr Val De Leu De Asp Leu Leu Cys Arg Leu Gly 15 10 15

Val Ser Tyr His Phe Glu Asn Asp lle Glu Glu Leu Leu Ser Lys lle

25 30

-94Xaa Xaa Phe Asn Ser Gin Xaa Xaa Xaa Pro Asp Leu Val Asp Glu Lys

40 45

Glu Cys Asp Leu Tyr Thr Alá Alá Ile Val Phe Arg Val Phe Arg Gin 50 55 ·60

Iis Gly Phe Lys Met Ser Ser Asp Val Phe Ser Lys Phe Lys Asp Ser

70 7580

Asp Gly Xaa Xaa Lys Phe Lys Glu Ser Leu Arg Gly Asp Alá Lys Gly 85 9095

Met Leu Ser Leu Phe Glu Alá Ser His Leu Ser Val His Gly Glu Asp 100 105110

Ile Leu Glu Glu Alá Phe Alá Phe Thr Lys Asp Tyr Leu Xaa Xaa Xaa 115 120125

Xaa Xaa Xaa Gin Ser Ser Alá Val Glu Xaa Xaa Leu Phe Pro Asn Leu 130 135140

Lys Arg His Ile Thr Asn Alá Leu Glu Gin Pro Phe His Ser Gly Val

145 150 155160

Pro Arg Leu Glu Alá Arg Lys Phe Ile Asp Leu Tyr Glu Alá Asp Ile 165 170175

Glu Cys Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn 180 185190

Glu Thr Leu Leu Gin Phe Alá Lvs Leu Asp Tyr Asn Arg Val Gin Leu 195 200' 205

Leu His Gin Gin Glu Leu Cvs Gin Phe Ser Lys Trp Trp Lys Asp Leu 210 215220

Asn Leu Alá Ser Asp De Pro T\r Alá Arg Asp Arg Met Alá Glu Ile

225 230 235240

Phe Phe Trp Alá Val Alá Met Tvr Phe Glu Pro Asp Tyr Alá His Thr 245 250 '255

Arg Met Ile Ile Alá Lvs Val Val Leu Leu Ile Ser Leu Ile Asp Asp

260 ' 265270

Thr Ile Asp Alá Tyr Alá Thr

275

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 279 bázispár

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: nem releváns

-95 MOLEKULATÍPUS: peptid

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asp Gin üe Arg Gin Leu Glu Leu Ile Asp Asp Leu Gin Arg Met Gly 15 1015

Leu Ser Asp His Phe Gin Asn Glu Phe Lys Glu Ile Leu Ser Ser Ile 20 2530

Xaa Xaa Tyr Leu Asp His His Tyr Tyr Lys Asn Pro Phe Pro Lys Glu 35 4045

Glu Arg Asp Leu Tyr Ser Thr Ser Leu Alá Phe Arg Leu Leu Arg Glu 50 5560

His Gly Phe Gin Val Alá Gin Glu Val Phe Asp Ser Phe Lys Asn Glu 65 70 7580

Glu Gly Xaa Xaa Glu Phe Lys Glu Ser Leu Ser Asp Asp Thr Arg Gly 85 9095

Leu Leu Gin Leu Tyr Glu Alá Ser Phe Leu Leu Thr Glu Gly Glu Thr 100 105110

Thr Leu Glu Ser Alá Arg Glu Phe Alá Thr Lys Phe Leu Xaa Xaa Xaa 115 120125

Xaa Xaa Xaa Glu Glu Lys Val Asn Glu Gly Gly Val Asp Gly Asp Leu 130 135140

Leu Thr Arg Ile Alá Tyr Ser Leu Asp Ile Pro Leu His Trp Arg Ile

145 150 155160

Lys Arg Pro Asn Alá Pro Val Trp Ile Glu Trp Tyr Arg Lvs Arg Pro 165 170175

Asp Xaa Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn 180 185190

Pro Val Val Leu Glu Leu Alá Ile Leu Asp Leu Asn Ile Val Gin Alá 195 200205

Gin Phe Gin Glu Glu Leu Lys Glu Ser Phe Arg Trp Trp Arg Asn Thr 210 215220

Gly Phe Val Glu Lys Leu Pro Phe Alá Arg Asp Arg Leu Val Glu Cys

225 230 235240

Tyr Phe Trp Asn Hír Gly Ile Ile Glu Pro Arg Gin His Alá Ser Alá 245 250255

Arg Ile Met Met Gly Lys Val Asn Alá Leu Ile Thr Val Ile Asp Asp 260 265270

Ile Tyr Asp Val Tyr Gly Thr

275 • · · « · · · • · · · · •· · · ·· • · · · · · · <1

-96A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 279 bázispár

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: nem releváns

MOLEKULATÍPUS: peptid

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asp Leu Phe Glu His Ile Trp Ile Val Asp Arg Leu Gin Arg Leu Gly 15 1015

Ile Ser Arg T\t Phe Glu Glu Glu Ile Lys Glu Cvs Leu Asp Tvr Val 20 2530'

His Arg Tvr Trp Thr Asp Asn Glv Ile Cvs Trp Alá Arg Cvs Ser His 35 ' 4045

Val Gin Asp Ile Asp Asp Thr Alá Met Alá Phe Arg Leu Leu Arg Gin 50 5560

His Gly Tvr Gin Val Ser Alá Asp Val Phe Lvs Asn Phe Glu Lys Glu 65 ' ' 70 7580

Gly Glu Phe Phe Cys Phe Val Gly Gin Ser Asn Gin Alá Val Thr Gly 85 90 '95

Met Phe Asn Leu Tyr Arg Alá Ser Gin Leu Alá Phe Pro Arg Glu Glu 100 105110

Ile Leu Lvs Asn Alá Lys Glu Phe Ser Tyr Asn Tyr Leu Leu Glu Lys 115' 120125

Arg Glu Arg Glu Glu Leu Ile Asp Lys Trp Ile Ile Met Lys Asp Leu 130 135140

Pro Gly Glu He Gly Phe Alá Leu Glu He Pro Trp Tyr Alá Ser Leu 145 150 155160

Pro Arg Val Glu Thr Arg Phe Tyr Ile Asp Gin Tyr Gly Gly Glu Asn 165 170175

Asp Val Trp He Gly Lys Thr Leu Tyr Arg Met Pro Tyr Val Asn Asn 180 185190

Asn Gly Tyr Leu Glu Leu Alá Lys Gin Asp Tyr Asn Asn Cys Gin Alá 195 200205

Gin His Gin Leu Glu Trp Asp Ile Phe Gin Lys Trp Tyr Glu Glu Asn 210 215220 ·

i

-97Arg Leu Xaa Ser Glu Trp Gly Val Arg Arg Ser Glu Leu Leu Glu Cys

225 230 235 240

Tyr T>t Leu Alá Alá Alá Thr Ile Phe Glu Ser Glu Arg Ser His Glu 245 250 255

Arg Met Val Trp Alá L\s Ser Ser Val Leu Val Lys Alá Ile Ser Ser 260 265 270

Ser Phe Gly Glu Ser Ser Asp

275

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 279 bázispár

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ: nem releváns

TOPOLÓGIÁJA: nem releváns

MOLEKULATÍPUS: pepiid

A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asp Leu Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Leu Gin Arg Leu Glv 15 1015

De Ser Xaa Xaa Phe Glu Xaa Glu Ile Lvs Glu Xaa Leu Asp Xaa Xaa

2530

Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 4045

Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Thr Alá Xaa Alá Phe Arg Leu Leu Arg Gin 50 5560

His Gly Xaa Gin Val Ser Xaa Asp Val Phe Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Glu 65 70 7580

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Gly 85 9095

Met Xaa Asn Leu Tvr Xaa Alá Ser Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Xaa 100 ' 105110

Ile Leu Xaa Xaa Alá Xaa Glu Phe Ser Xaa Xaa Tyr Leu Xaa Xaa Xaa 115 120125

Xaa Xaa Xaa Glu Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Leu 130 135140

Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Alá Leu Glu He Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

145 150 155160 ·

-98Pro Arg Val Glu Thr Arg Phe Xaa Ile Asp Xaa T\t Xaa Xaa Xaa Xaa

165 170175

Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn 180 185190

Asn Xaa Xaa Leu Glu Leu Alá Lys Xaa Asp Tyr Asn Xaa Xaa Gin Alá 195 200205

Gin His Gin Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Lys Trp Xaa Xaa Xaa Xaa 210 215220

Xaa Leu Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Leu Xaa Glu Cys 225 230 235240

Tyr Xaa Xaa Alá Xaa Alá Xaa De Phe Glu Xaa Xaa Xaa Ser His Xaa 245 250255

Arg Met Xaa Xaa Alá Lys Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa 260 . 265270

Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

Claims (29)

SZ AB AD ALMI IGÉNYPONTOK

1. DNS-konstrukció, amely az Arabidopsis thaliana GA1-génjének aminosavsorrendjét kódoló DNS-t tartalmaz.

2. Az 1. igénypont szerinti DNS-konstrukció, amely a pGAl-29vektorban található GAl-DNS-szekvenciával megegyező szekvenciájú, vagy a 9. ábrán látható bármely DNS-szekvenciával megegyező szekvenciájú GAl-gént magába foglaló DNS-t tartalmaz.

3. DNS-konstrukció, amely a 8. ábrán látható aminosavsorrendet kódoló DNS-t tartalmaz.

4. Vektor, amely 1-3. igénypontok bármelyike szerinti szekvenciát tartalmaz.

5. Gazdasejt, amely 4. igénypont szerinti vektorral van transzformálva.

6. Az 5. igénypont szerinti gazdasejt, amely baktérium-, élesztő-, növényi, rovar-, vagy emlőseredetű.

7. A 6. igénypont szerinti gazdasejt, amely növényi eredetű.

8. A 7. igénypont szerinti gazdasejt, amely kétszikű növényi eredetű.

9. Növény, amely 8. igénypont szerinti növényi sejtből van regenerálva.

10. A 9. igénypont szerinti növény utódai.

11. A 10. igénypont szerinti növény szaporítóanyagai.

12. Mag, amely a 10. igénypont szerinti utódban termelődik.

• « ·

- 100-

13. Eljárás GA1 -fehérje expresszálására, azzal jellemezve, hogy:

i) gazdasejtet funkcionálisan egy promóterhez kapcsolt 1-3. igénypontok bármelyike szerinti DNS-konstrukcióval transzformálunk;

ii) a transzformált gazdasejttel a DNS-konstrukcióból kiindulva GA1fehérjét termeltetünk.

14. Eljárás valamely gén növényekben történő expresszálására, oly módon, hogy a gén a GA1-génre jellemző időbeli vagy térbeli mintázattal expresszálódjék, azzal jellemezve, hogy:

i) a gént funkcionálisan a GAl-gén szabályozó szekvenciáihoz kapcsoljuk, és ily módon egy expressziós modult állítunk elő, és ii) a növényt az i) lépés szerinti expressziós modullal transzformáljuk.

15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szabályozó szekvenciaként a GAl-gén kódoló régiójától 5'-irányban körülbelül -2 kb és 0 bp között található szekvenciát alkalmazzuk.

16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szabályozó szekvenciaként a GAl-gén kódoló régiójától 5'-irányban körülbelül 500 bp és 0 bp között található szekvenciát alkalmazzuk.

17. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szabályozó szekvenciaként a GAl-gén kódoló régiójától 5'-irányban körülbelül 250 bp és 0 bp között található szekvenciát alkalmazzuk.

18. Eljárás GA1-fehérjét kódoló RNS-transzlációjának modulálásra növényben, azzal jellemezve, hogy:

i) előállítunk egy antiszensz GAl-RNS-t kódoló expressziós vektort;

ii) a növényt az i) pont szerint expressziós vektorral transzferáljuk.

- 101 -

19. Eljárás GAl-fehérje aktivitásának modulálására növényben, azzal jellemezve, hogy:

i) előállítunk egy expressziós vektort, amely GA1-fehérjéhez kötődni képes ellenanyagot vagy ellenanyagfragmenst kódol;

ii) az előállított expressziós vektorral transzformáljuk a növényt.

20. Ellenanyag vagy ellenanyagfragmens, amely képes GA1fehérjéhez kötődni.

21. Fehérje, amely képes kötődni a GAl-gén szabályozó régiójához.

22. Eljárás a GAl-gént expresszáló sejtek vagy szövetek azonosítására, azzal jellemezve, hogy:

i) a sejteket vagy szöveteket olyan hatóanyaggal inkubáljuk, amely képes a GA1-fehérjéhez vagy a GA1-fehérjét kódoló RNS-hez kötődni; és ii) kimutatjuk a megkötődött hatóanyag jelenlétét.

23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy GA1fehérjéhez kötődni képes hatóanyagként ellenanyagot vagy ellenanyagfragmenst alkalmazunk.

24. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy GA1fehérjét kódoló RNS-hez kötődni képes hatóanyagként RNS-t vagy DNS-t alkalmazunk.

25. Izolált DNS-konstrukció, amely lényegében egy olyan nukleinsav szekvenciából áll, amely:

i) GAl-polipeptidet kódol, és ii) képes hibridizálódni a 9. ábrán látható DNS-szekvenciával, annak fragmensével, vagy ezek antiszensz szekvenciáival, abban az esetben, ha a hibridizáció sztringens hibridizációs feltételek mellett végezzük.

- 102-

26. GA1-fehérjét kódoló izolált DNS-molekula, amely DNS-molekula az alábbi lépéseket tartalmazó eljárás alkalmazásával lett előállítva:

i) egy kívánt DNS-molekulát a 9. ábrán látható DNS-szekvenciával, annak valamely ffagmensével vagy ezek antiszensz szekvenciájával hibridizáltatjuk, sztringens hibridizációs körülmények között;

ii) kiválasztjuk a kívánt szekvenciával hibridizálódó DNS-molekulák populációját; és iii) az ii) lépés szerinti DNS-molekulák közül kiválasztjuk a GA1fehérjét kódoló DNS-molekulákat.

27. A 25. vagy 26. igénypont szerinti DNS-molekula, amely az alábbi lépéseket tartalmazó eljárás alkahnazásával lett előállítva:

i) elöhibridizáció: 65 °C, egy óra;

ii) hibridizáció: 65 °C, egy éjszakán keresztül, hibridizációs pufferben;

iii) mosás: 2x 5 percig 2xSSC-pufferben 65 °C-on, majd 2x 30 percig 1,0 % SDS-t tartalmazó 2xSSC pufferben, 65 °C-on; és iv) mosás: 2x 5 percig, szobahőmérsékleten, O,lxSSC-pufferben.

28. Eljárás GA1-fehérjét kódoló DNS-molekula klónozására, azzal jellemezve, hogy:

i) elöhibridizáció: 65 °C, egy óra;

ii) hibridizáció: 65 °C, egy éjszakán keresztül, hibridizációs pufferben;

iii) az ii) lépés szerinti DNS-sel gazdasejtet transzformálunk; és iv) a GA1-fehérjét expresszáló transzformánsokat kiszelektáljuk.

·»·

- 103 -

29. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hibridizációs körülmények lényegében a következők:

i) előhibridizáció: 65 °C, egy óra;

ii) hibridizáció: 65 °C, egy éjszakán keresztül, hibridizációs pufferben;

iii) mosás: 2x 5 percig 2xSSC-pufferben 65 °C-on, majd 2x 30 percig 1,0 % SDS-t tartalmazó 2xSSC pufferben, 65 °C-on; és iv) mosás: 2x 5 percig, szobahőmérsékleten, O,lxSSC-pufferben.