HUT72322A - Methods and kits for evaluating risk of developing periodontitis - Google Patents

Description

A találmány tárgya javított eljárás aktív foggyökérhártya-gyulladás kialakulása vagy foggyökérhártya-gyulladási hely kockázatának becslésére a beteg szájüregében.

A plakkbaktériumok megtelepednek a fogon és a bakteriális mérgek, enzimek és metabolitok beáramlását, és ezzel az ínyszövetek helyi gyulladását (fogínygyulladás) segíthetik elő. A helyi gazdaszövet bakteriális patogénekre adott gyulladásos válasza számos sejttípus (például polimorfonukleáris leukocita, limfociták, plazmasejtek, makrofágok) beszúrődését jelenti, amelyek különböző szerepet töltenek be a szövetnek a plakkpatogének és termékeik okozta káros hatásával szembeni tevékenységében. A plakkpatogének és a velük kapcsolatos gyulladásos válasz számos egyénnél foggyökérhártya-gyulladáshoz vezet, ami a fog kötőszövetek és a fogat alátámasztó alveoláris csont fokozodó roncsolódását vonja maga után.

A foggyökérhártya cementumból, foggyökérhártya ínszalagból és az azt összetevő rostokból áll, amelyek összekötik a fogat az alveoláris csont üregével. Egészséges embernél a foggyökérhártya-kötődés éppen a fogzománc és a gyökércementum illeszkedési csúcsán jön létre. Orvosilag a foggyökérhártya-kötődés megszűnését a fog egy speciális helyén a kalibrált foggyökérhártya-próbával határozzák meg, amelynek során mérik a gyökércementum és zománc kötődése, valamint a foggyökérhártya tasak alapja közötti távolságot, utóbbi az a szint, ahol a foggyökérhártya-próba során ellenállás tapasztalható a mechanikai erővel szemben. Ha a kötés lazult, ott valószínűleg fogyökérhártya tasak keletkezett. Ha a lazulás a foggyökérhártya-patogének megtele pedése miatt folytatódik, ez az alveoláris csont károsodásához vezet. Ez a szövetroncsolódás lassítható, de nem fordítható vissza a hagyományos terápiás beavatkozásokkal.

A foggyökérhártya-gyulladásban szenvedő lakossági rétegeken belül a betegség előrehaladási sebessége széles tartományban változik; emellett az egyes betegeknél is jelentős különbség figyelhető meg a betegség kifejlődésében a száj különböző pontjain. Az egyes fogak és gyökérfelületeik mind olyan helyek, ahol a foggyökérhártya-gyulladás foka különböző súlyosságú lehet. Jelenleg az a vélemény, hogy a betegség kifejlődhet krónikus, lineáris módon, vagy epizódszerűen, amikor is a betegség kitörését átmeneti enyhülési szakaszok váltják fel. Mindkét esetben világos, hogy ha a betegpopulációt az időben figyeljük, jelentős különbséget tapasztalunk a betegség orvosilag kimutatható előrehaladásában az egyes betegeknél és az egyes betegek szájában az egyes pontokon.

A betegség előrehaladás megnövekedett kockázatának előrejelzése a betegeknél és a beteg pontoknál igen fontos a hatékony fogkezelés szempontjából. A betegség előrehaladás megnövekedett kockázatának előrejelzése lehetővé teszi azon betegek és pontok korai azonosítását, amelyek leginkább igénylik a gyógyítást vagy megelőző kezelést a betegség szövetroncsoló fázisának megállítására.

Jelenleg nincs hatékony módszer a folyamatos kötődéskárosodás vagyis az aktív betegség kockázatának értékelésére a beteg vagy valamely hely szempontjából. A betegség előrehaladásának klinikai mérései a korábbi betegségaktivitás mértékét regisztrálják, de nem szolgálnak eszközül a betegség jövőbeni aktivitása alacsony illetve magas kockázati szintje közötti értékelésben a betegeknél illetve a beteg pontoknál.

A gazdaszervezetnek a plakkpatogénekre adott immunválasza részben olyan molekulák termeléséből áll, amelyek megvédik az ínyszöveteket a beözönlő baktériumok roncsoló hatásától, részben olyan molekulák termelődéséből, amelyek a gazdaválasz során képződnek, és károsítani tudják a foggyökérhártya szöveteket. Például a limfociták olyan ellenanyagokat állítanak elő a plakkpatogénekkel szemben, amelyek semlegesítik a baktériumokat és mérgező termékeiket. Eközben a gyulladt sejtek különböző hidrolitikus enzimeket szabadíthatnak fel, amelyek elhasíthatják és lebonthatják a fontos foggyökérhártya szövetek szerkezeti elemeinek fehérjéit és poliszacharidjait.

A foggyökérhártya patogének elleni ellenanyagok a patogénekhez vagy termékeikhez kötődnek, antigén-ellenanyag komplexek képződése közben. Ezek az antigén-ellenanyag komplexek résztvesznek a plakkpatogének és termékeik semlegesítésében és összetapadásában. A komplexek emellett elősegítik a patogének és termékeik fagocitózisát, elpusztítását és lebontását a polimorfonukleáris leukociták (PMN-ek) révén. Az antigén-ellenanyag komplexek ugyanakkor másodlagos gyulladásos választ válthatnak ki, mert képesek a komplementer rendszer aktiválására, amely közbülső fokozat a különböző gyulladásos mechanizmusok aktiválására alkalmas proteolitikus enzimekhez.

A beta-glukoronidáz (BG), amely hidrolitikus enzim és a PMN aktiválás enzimatikus markere, részt vesz a mukopoliszacharidok/ /proteoglikánok savas lebontásában. Valóban, a BG megnövekedett koncentrációját tapasztalták az íny és a fogzománc közötti résből vett folyadékban (röviden ínyrésfolyadékban = GCF) olyan foggyökérhártya-gyulladásban szenvedő betegeknél, akiknél az aktív foggyökérhártya-gyulladás gyakoribb előfordulása volt megfigyelhető. Tehát úgy tűnik, hogy az aktív foggyökérhártya-gyulladás együttjár a PMN-ek és a foggyökérhártya patogének fokozott összeütközésével az ínyszövetekben vagy környékükön.

Bár az ínygyulladás vagy foggyökérhártya-gyulladás kifejlődéséhez bakteriális patogénekre van szükség, a speciális bakteriális patogének jelenlétének vagy távollétének mérése önmagában nem elegendően hatékony módszer az aktív betegség megjelenése valószínűségének előrejelzésére. Következésképpen a várható betegségaktivitás előrejelzésére tett erőfeszítés a gazdafaktorválasz által a betegség alatt kiválasztott ínyrésfolyadékban talált különböző molekulatársulásokra összpontosult (lásd Lamster, I.B., és mtsai, Enzyme Activity in Crevicular Fluid fór Detection and Prediction of Clinical Attachment Loss in Patients with Chronic Aduit Periodontitis, J. Periodontol., 5 9, 516-523 oldal, (1988) (a továbbiakban Lamster), és Palcanis,

K.G. és mtsai, Elastase as an Indicator of Periodontal Disease Progression, J. Periodontol., 63 , 237-242 (1992) (a továbbiakban Palcanis).

A GCF ugyanazokat a molekulákat tartalmazza, amelyeket a gazdasejtek az ínyszövetekben vagy ínyrésben termeltek. A GCF tehát az ínyszövetekben jelenlevő gazdamolekula-sorozatot tartalmazza, és felhasználható az ott végbemenő reakciók és vá • · · · · · •••••· « · * · · · · · · ·· ♦·· ·· · , laszok kimutatására. A kutatás jelenleg azoknak a gazdamolekuláknak a jelenlétét igyekszik mérni, amelyek kapcsolatban lehetnek az ínyszövetek roncsolásával. így például az ínyrésben talált különböző gyulladásközvetítőket (például E2 prosztaglandinok), a vélelmezett szövetroncsoló hidrolitikus enzimeket (például beta-glukoronidáz és elasztáz), és a sejthalál enzimmarkereit (például aszpartát aminotranszferáz) értékelték olyan betegeknél és helyi pontoknál, ahol megnövekedett volt az aktív betegség kockázata azokhoz képest, ahol nem volt mérhető klinikai elváltozás a foggyökérhártya-kötődésben (lásd Lamster és Palcanis). Az ezen molekulák jelenléte és a várható betegségaktivitás közötti összefüggés nem bizonyult elég erősnek ahhoz, hogy általánosan elfogadható és megbízható módszert nyújtson a betegségaktivitás kockázatának előrejelzésére.

A találmány tárgya eljárás a humán és alsóbbrendű állatok foggyökérhártya-gyulladása kialakulásának megnövekedett kockázata kimutatására.

A találmány további tárgya diagnosztikai készlet a humán és alsóbbrendű állatok foggyökérhártya-gyulladása kialakulásának megnövekedett kockázata kimutatására.

A találmány tárgya eljárás és készlet jelenleg vagy várhatóan később kifejlődő aktív foggyökérhártya-gyulladás kockázatának kimutatására vagy értékelésére, az eljárás lépései: (a) mintavétel az ínyrésfolyadékból; (b) az IgA mennyiség mérése az ínyrésfolyadékban; (c) a polimorfonukleáris leukocita marker mennyiségének mérése az ínyrésfolyadékban; (d) a (b) és (c) lépésekben kapott mennyiségek arányának összehasonlítása az etalonnal.

• ·

Diagnosztikai módszerek

A találmány tárgya diagnosztikai módszer betegek vagy helyi pontok aktív foggyökérhártya-gyulladása kockázatának kimutatására embereknél vagy alsóbbrendű állatoknál. Ezekben az eljárásokban mérik az IgA és PMN marker koncentrációját a GCFben, kiszámítják az értékek arányát, és felhasználják ezt az arányt az aktív foggyökérhártya-gyu'lladás kockázatának becslésére. Az IgA/PMN-marker arány meglepő módon tükrözi a gazdaválasz mechanizmusok egyensúlyát vagy kiegyensúlyozatlanságát, amiből következtetni lehet az aktív foggyökérhártya-gyulladás előfordulására. Ha az IgA/PMN-marker arány a betegre vagy helyi pontra alacsonyabb, mint az aktív foggyökérhártya-gyulladás kockázatának ki nem tett páciensekre talált IgA/PMN-marker arány, a betegnél vagy helyi pontnál megnövekedett az aktív foggyökérhártya-gyulladás kockázata.

A foggyökérhártya-kötődés kifejezés a leírásban a fogat az alveoláris csont üregében támasztó kötőszövetnek a kötődését jelenti.

A foggyökérhártya-gyulladás kifejezés a leírásban a foggyökérhártya-kötődés károsodásában és/vagy az alveoláris csont felszívódásában megnyilvánuló szövetroncsolódási betegséget jelenti .

Az ínyszövet kifejezés a leírásban a fogat, az alveoláris kötést és csontot körülvevő fogínyszövetet és nyálkahártyamembránt jelöli.

A fogínyrés kifejezés a leírásban azt a teret jelöli, amely a szabad íny belső oldala és a fogzománc illetve a cemen • · tűm között van, a foggyökérhártya-kötődés szintjétől függően.

A foggyökérhártya-tasak kifejezés a foggyökérhártya-gyulladás betegséggel kapcsolatos, rendellenesen mély ínyrést jelent, amely az ínykötődésnek a foggyökércsúcs irányába történő eltolódása miatt jön létre.

Az aktív foggyökérhártya-gyulladás kifejezés a leírásban a foggyökérhártya-gyulladásnak azt a szakaszát jelöli, amelyben a kötőszövet kötődés károsodásnak és/vagy az alveoláris csont felszívódásának növekedése orvosilag kimutatható.

Az inaktív foggyökérhártya-gyulladás kifejezés a leírásban olyan betegséget jelent, amelyben nem mutatható ki a kötőszövet kötődés károsodásának és/vagy az alveoláris csont felszívódásának növekedése.

Az ínyrésfolyadék és a CGF kifejezés a leírásban a vérplazmának az ínyrésben összegyűlő izzadmányát jelenti, amely a szabad ínyben levő kapillárisokból való szivárgás következtében jön létre.

A fogínygyulladás kifejezés a leírásban az ínyszövetek gyulladását jelenti.

A betegség kifejezés a leírásban foggyökérhártya-gyulladást jelöl.

A hely kifejezés a leírásban speciális helyeket (például a foggyökérnek a középvonalhoz közelebb eső, az attól távolabb eső, az orcák felé eső vagy a szájpad felé eső felületeit) jelent a fog körül, amelyeket foggyökérhártya-gyulladás jelenléte szempontjából megfigyelünk.

A marker kifejezés a leírásban egy vagy több specifikus molekulát jelent, amelyek kimutathatók és mérhetők, és kimutatják a betegség patológiájával kapcsolatos egy vagy több mechanizmust .

Az Iga kifejezés a leírásban szérum típusú immunglobulin A-t jelent.

A PMN kifejezés a leírásban polimorfonukleáris leukocitákat jelent.

A GCF minta kifejezés a leírásban a beteg ínyréséből vagy a helyről vett GCF bizonyos mennyiségét jelöli.

A GCF tesztminta kifejezés a leírásban a puffer etalon térfogatára hígított GCF mintát jelent, amelyből alikvot részt veszünk a GCF-ben levő IgA vagy PMN-marker megfelelő elemzésére.

A GCF IgA kifejezés a leírásban az ínyrésfolyadékban levő szérum típusú IgA-t jelenti a GCF tesztmintában. A GCF IgA magában foglalja az IgAl és IgA2 izotópokat, és nem korlátozódik az egyes antigénekre specifikus IgA ellenanyagra.

A GCF BG kifejezés a leírásban a GCF tesztmintában kimutatott aktív beta-glukoronidáz mennyiségét jelenti.

A GCF PMN-ek kifejezés a leírásban az ínyrésben levő polimorf onukleáris leukocitákat jelenti, amelyek az ínyszövetekből vándorolnak az ínyrésbe.

A PMN-marker kifejezés a leírásban a GCF tesztmintákban kimutatott aktív polimorfonukleáris leukociták speciális markereinek bármelyikét jelenti.

A GCF PMN-ek aktiválása kifejezés a leírásban azt az eljárást jelöli, amelynek során a GCF PMN-ek kölcsönhatása az ínyrés, a foggyökérhártya-tasak vagy foggyökérhártya-szövetek • ·· baktériumaival PMN metabolitok, enzimek és/vagy melléktermékek képződéséhez vezet.

Az aktív betegség kockázata és az IgA/PMN-marker arány közötti korreláció mértéke a választott PMN-markertől függ. Egyes IgA/PM-marker arányok megbízhatóbb előrejelzők a többinél. Megfelelő mérhető PMN-markerek a találmány szempontjából a PMN-ek aktiválását és degranulálását kimutató anyagok. Ilyenek, nem kizárólagosan, a beta-glukoronidáz, a hidrolitikus enzimek: elasztáz, katepszinek (például a katepszin B/L és a katepszin G), a zselatináz; a mieloperoxidáz enzim és metabolitjai, amelyek a PMN-ek korai aktiválását jelzik, például a leukotriének (például az LTB4 vagy LTC4) . Előnyös PMN-marker az elasztáz és a beta-glukoronidáz.

A GCF IgA/PMN-marker arány kiszámítható többek között a GCF mintában jelenlevő GCF IgA teljes mennyiségének és a GCF mintában levő konkrét PMN-marker teljes mennyiségének hányadosaként, a GCF tesztminta etalon alikvót részében jelenlevő GCF IgA teljes mennyiségének és a GCF tesztminta etalon alikvot részében levő GCF PMN-marker teljes mennyiségének hányadosaként; a GCF tesztmintában levő GCF IgA koncentrációja és a GCF tesztmintákban levő GCF PMN-marker koncentrációja hányadosaként; vagy a GCF IgA koncentráció és a GCF PMN-marker koncentráció hányadosaként.

Többféle módszer ismeretes a GCF összegyűjtésére. Ilyenek például, többek között, az itt hivatkozásként feltüntetett Lamster, Hartley & Vogel, Development of a Biochemical Profile fór Gingival Crevicular Fluid, J. Periodontology, 5.6, (Supple• ·· ment), 13-21, (1985) (a továbbiakban Lamster II) című munkában található eljárások. E gyűjtési módszer alkalmazásával GCF minta nyerhető.

A GCF IgA mérés módszerei

Számos módja van az IgA koncentráció mérésének a GCF mintákban. Ilyenek, nem kizárólagosan, az enzimhez kötött immunszorbens vizsgálat (ELISA) vagy a radioimmunvizsgálat (RIA) mint jelzőrendszer alkalmazása.

Az ELISA-n alapuló GCF IgA mérési módszereket az itt következő, hivatkozásként feltüntetett Sengupta és mtsai., The Effect of Treatment on IgG, IgA, IgM and alpha-2-Macroglobulin in Gingival Crevicular Fluid from Patients with Chronic Aduit Periodont itis, Arch. Órai Bioi., 6., 425-431 (1988. június) (a továbbiakban Sengupta) írja le. Az ott ismertetett eljárás és az ELISA módszerek módosításai nem-humán, előnyösen nem-főemlős, anti humán IgA elfogó ellenanyagot használnak, amely poliklonális vagy monoklonális anti-IgA ellenanyag készítmény. Az alkalmazott elfogó ellenanyag IgA-ra specifikus, és nem lép keresztreakcióba a humán IgG-vel, IgM-mel, IgE-vel vagy IgD-vel.

Ezt az anti-IgA elfogó ellenanyagot rendszerint szilárd hordozóra, például mikrotitráló tenyészlemezre vagy szilárd részecskékből álló mátrixra, például látexre térhálósítják.

A tesztmintával való inkubálás során ez az elfogó ellenanyag kifogja a GCF IgA-t a tesztminta pufférből, amelyben a GCF-et feloldottuk, vagy közvetlenül a GCF mintából, és megtartja azt az adott immunvizsgálathoz használt szilárd hordozón/részecskemátrixon. Az elfogott IgA-t azután el lehet • ·· • · választani a GCF minta többi alkotórészétől, általában vagy a GCF IgA komplexet tartalmazó felület leöblítésével, vagy annak a részecskemátrixnak a kiszűrésével, amelyhez a kifogott IgA kötődik. Ezt követően a kifogott ellenanyag-GCF IgA komplexet ellenanyag enzim konjugáttal kezelik, például peroxidázkonjugált nyúl IgG-vel.

Ez az ellenanyag-enzim konjugátum olyan ellenanyagot tartalmaz, amely a humán IgA immunglobulinra specifikus, és nem lép keresztreakcióba az anti-IgA elfogó ellenanyaggal. Ezt az ellenanyagot általában vagy kromogén enzimhez (például torma peroxidázhoz, alkálikus foszfatázhoz, béta-galaktozidázhoz vagy glükozidázhoz) vagy biotinhoz konjugálják/kötik. Miután a biotinilezett ellenanyag komplexet képezett az elfogott IgAval, egy antibiotin ellenanyag-enzim konjugátummal (például a fent említett kromogén enzimek egyikét használva) vagy egy avidin-kromogén enzim konjugátummal inkubálják. Ezt az elfogott ellenanyag-IgA-ellenanyag-kromogén enzim komplexet azután a megfelelő konjugált enzimek (például torma peroxidáz esetén o-fenilén-diamin-dihidroklorid vagy alkálikus foszfatáz esetén p-nitro-foszfát) számára megfelelő kromogén szubsztráttal reagáltatják. A keveréket ezután megfelelő pufferben inkubálják a színes reakció elősegítésére, amelynek abszorbanciája és/vagy intenzitása arányos az elfogó ellenanyaghoz kötött IgA menynyiséggel (az ELISA metodológia alapjainak ismertetése az itt hivatkozásként feltüntetettt következő munkákban található: Notermans, S. és mtsai, The Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) fór the Detection and Determination of Clostridium • · botulinum Toxins A, B, and E, Methods in Enzymology, 8.4, 223 -238 (1984) (a továbbiakban Notermans); Butler J.E., The Amplified ELISA: Principles of and Applications fór the Comparative Quantitation of Class and Subclass Antibodies and the Distribution of Antibodies and Antigens in Biochemical Separates, Methods in Enzymology, 73 , 483-523 (1981) (a továbbiakban Butler) ;

Sigma Immuno Chemicals Catalog 1992 (Sigma Chemical Company) (a továbbiakban Sigma); Engvall, E. és mtsai, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA, III. Quantification of Specific Antibodies by Enzyme-Labeled Anti-Immunoglobulin in Antigen-Coated Tubes, J. of Immunoi., 109, 129-139 (1972) (a továbbiakban Engvall); Kató, K., és mtsai, Enzyme-Linked Immunoassay: Conjugation of the FAB Fragment of Rabbit IgG with beta-Galactosidase from E. coli and Its Use fór Immunoassay, J. of Immunoi., 116, 1554-1564 (1976) (a továbbiakban Kató); és Guesdon, J.L., Magnetic Solid Phase Enzyme Immunoassay fór the Quantitation of Antigens and Antibodies: Application to Humán Immunoglobin E., Methods in Enzymology, 73 , 471-482 (1981) .

Megfelelő nem-humán elfogó ellenanyagok lehetnek az egér, nyúl, tengerimalac és kecske antiszérumok (lásd Sengupta és Butler munkáit) .

Megfelelő szilárd hordozók a polisztirol, szűrőpapír, nitrocellulóz, nylon, ferromágneses gömbök és a cián-bromiddal aktivált papír. A polisztirol és a nitrocellulóz az előnyösek (lásd Butler; Pappas M.G.,Recent Applications of the Dot-ELISA in Immunoparasitology, Vet. Parasitology, 2 9 , 105-129 (1988);

Lehtonen O.P. és mtsai, Antigén Attachment in ELISA, J. Immunoi.

Methods, 34 , 61-70 (1980); Smith K.O., és mtsai,

Magnetic

Transfer Devices fór Use in Solid-Phase Radioimmunoassays, J. Infect. Dis., 136, 329-336 (1977); Hendry, R.M., és mtsai,

Detection and Identification of Influenza Antigens by Nylon-Coupled Enzyme Linked Immmuno Assay, J. Virol. Methods, 6., 9-17 (1983), (a továbbiakban Hendry); Maiolini, R., és mtsai, A Sandwich Method of Enzymoimmunoassay. I. Application to Rat and

Humán alpha-Fetoprotein, J. Immunoi. Methods, 8., 223-234 (1975); és Samanta A.K., és mtsai, Enzyme Immunoassay of Testosterone Using Nitrocellulose Discs as the Solid Phase, J. Clin. Chem. Biochem. , 2 8 , 943-947 (1990), ezek mindegyike hivatkozás ként van feltüntetve).

A részecskemátrixok lehetnek polisztirol, látex, nylon, mágneses gyöngyök, üveg, agaróz és szefaróz . A polisztirol gyöngy és a látex előnyös (lásd Nilsson B., A Generál Reagent fór Amplifying ELISAs, J. Immunoi. Methods, 114, 89-93 (1988); Hendry; Gundersen, S.G., Magnetic Bead Antigén Capture, Enzyme-Linked Immunoassay in Microtitre Trays fór Rapid Detection of Schistosomal Circulating Anodic Antigén, J. Immunoi. Methods, 148, 1-8 (1992); Okú, Y., Development of a Highly Sensitive Bead-ELISA to Detect Bacterial Protein Toxins, Microbiol . Immunoi., 32., 807-816 (1988); és Harada, T., és mtsai, Detection of Mucosal and Serum Antibodies Specific fór the Capsular Polysaccharide of Haemophilus influenza Type B by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, Microbiol. Immunoi., 2 9 , 591-600 (1985) ; és

Sigma, ezek mind hivatkozásként vannak feltüntetve).

Megfelelő ellenanyag-enzim konjugátok és elfogó ellenanyag párok az IgG vagy IgM izotópok egér, kecske és nyúl anti-humán ellenanyagai torma peroxidázzal (HPR) , alkálikus foszfátázzál, béta-galaktozidázzal vagy glükozidázzal, alkálikus pirofoszfatázzal vagy ureázzal konjugálva (lásd Sigma; Notermans; Butler; Kató; Engvall; és Cerrone, M.C., és mtsai, Description of a Urease-Based MicroELISA fór the Analysis of Limiting Dilution Microcultures, J.Immunoi. Methods, 13 8, 65-75 (1991) (a továbbiakban Cerrone), ezek mind hivatkozásként vannak feltüntetve).

Konjugált retek peroxidázzal, alkálikus foszfatázzal és ureázzal használható megfelelő kromogén szubsztrátok az o-fenilén-diamin-dihidroklorid, a p-nitro-foszfát és a karbamid, megfelelő pH-jelzővel kiegészítve (lásd Notermans; Butler; Cerrone; és Sigma).

A találmány szempontjából megfelelő pufferek, többek között, a foszfátpuffér (0,001-0,1M) pH=6,6-7,4 értéken, 0,10-0,20 M NaCl-dal és 0,01%-0,l% Tween-nel, vagyis röviden a PBST. Az előnyös puffér a PBST, amely 0,01 M foszfátpuffér pH=7,01 értéken, 0,05% Tweent tartalmazó 0,15 M sóoldatban.

A találmány szempontjából megfelelő ELISA vizsgálatok olyan oldatokban is végezhetők, ahol színváltozással járó reakciók mutatják a jelenlevő IgA koncentrációját. Ilyen színváltozási reakciókat kromogén enzimekkel, például torma peroxidázzal, alkálikus foszfatázzal és ureázzal lehet megvalósítani, vagy fluorogén szubsztrátokhoz lehet kapcsolni. (Lásd Notermans; Butler; Sigma; és Magnusson, K.E., és mtsai, Fluoroscence-Linked Immunosorbent Assay (FLISA) fór Quantitation of Antibodies to Food Antigens, Immunoi. Invest., 16 , 227-240 (1987), ezek mind hivatkozásként vannak feltüntetve).

Ezek a színváltozásos vizsgálatok spektrofotometriásán vagy vizuális értékeléssel mennyiségileg értékelhetők. Ilyen vizsgálatok végezhetők PBST oldatokkal, amelyek az enzim-ellenanyag konjugátumok egyikét és a megfelelő kromogén szubsztrátot tartalmazzák. Az oldatok színváltozását össze lehet vetni egy színetalon sorozatéval, amely a kromogén szubsztrátok specifikus IgA koncentrációk okozta színváltozásainak felel meg az etalon tesztmintákban. A színváltozás összehasonlítása a megfelelő színetalonnal· megadja az IgA koncentrációt a tesztmintában

A fent említett ellenanyag konjugátumok kromogén szubsztrátjai lehetnek o-fenilén-diamin-diklorid a torma peroxidáz esetében; p-nitro-foszfát az alkálikus foszfatáz esetében; és karbamid + pH-jelző az ureáz esetében.

A színetalon sorozatot ismert IgA koncentrációval rendelkező etalonteszt minta sorozatban végzett kolorimetriás vizsgálattal lehet előállítani, azonosítva az intenzitásban és/vagy abszorpcióban azonos színetalonokkal. A színetalonokat táblázat formájában lehet elrendezni, amely a minták között várhatóan található IgA koncentrációk széles tartományának megfelelő színintenzitás/abszorpció értékeket tartalmazza.

Ezeket az immunvizsgálatokat el lehet végezni szilárd fázisú hordozókon, gyöngyökön, géleken, más részecskéken vagy szűrőkön, mikor is a színt változtató végtermékeket szilárd fázisú hordozón kötjük meg.

Megfelelő szilárd hordozók a polisztirol, szűrőpapír és a nitrocellulóz. A polisztirol és a nitrocellulóz az előnyösek.

Használható részecskemátrixok a polisztirol, látex, nylon,

.... .... ,. .... .,,, . ’. ^:··. : · ·* ·* ·· ... .»* : ;

mágneses gyöngyök, üveg, agaróz és sepharose. A poliszéiról gyöngy és a látex előnyösek.

Amint a fent leírt oldatvizsgálatoknál is, a GCF IgA koncentrációk vizuális meghatározása a GCF minta kolorimetriás reakciója intenzitásának összehasonlításával valósítható meg a GCF IgA koncentrációtartományt képviselő színetalon sorozattal.

Színetalon sorozat úgy állítható elő, hogy ismert IgA koncentrációjú etalon tesztmintákkal kolorimetriás vizsgálatsorozatot végzünk, majd meghatározzuk azokat a színetalonokat, amelyek megfelelnek ezek intenzitás- és/vagy abszorpcióértékének. A színetalonokat azután térkép formájában el lehet rendezni, ezen azok a színintenzitás és abszorpcióértékek találhatók, amelyek a tesztmintában véárhatóan előforduló IgA koncentrációk széles tartományának felelnek meg.

Másik eljárás GCF tesztminták IgA koncentrációjának mérésére a radioimmunvizsgálat (RIA). Az eljárás alkalmazására példát ismertetnek Nerenberg és Prasad, a Methods in Enzymology, 73, Immunochemical Techniques Part B., 666-691 (1981) munkában, ez itt hivatkozásként van feltüntetve.

GCF PMN-marker mérési eljárás

Az aktivált PMN-ek jelenlétét kimutató markerek lehetnek beta-glukoronidáz, hidrolitikus enzimek, például elasztáz, katepszinek (például katepszin G és katepszin B/L), zselatináz, a mieloperoxidáz enzim és metabolitok, amelyek jelzik a PMN-ek korai aktiválását, például a leukotriének (például LTB4 vagy LTC4). Előnyös PMN-markerek a beta-glukoronidáz (BG) és az elasztáz.

A BG különböző módszerekkel elemezhető, köztük, nem kizárólagosan, kolorimetriás és fluorometriás módszerekkel.

A BG kolorimetriás mérési módszerét Lamster II írja le. Ezek a kolorimetriás mérések a fentolftáléin felszabadulását mérik fenolftalein-glukoronsavból. E vizsgálatokkal meghatározható a GCF BG koncentráció mind kvantitatív eljárással, például spektrofotometriásán, mind vizuális úton.

A GCF BG koncentrációk meghatározhatók spektrofotometriásán úgy, hogy a tesztminta alikvót (50 μΐ) részét 100 μΐ, pH=4,5 értékű, 0,075 M acetátpuffer, 50 μΐ 0,15 M NaCl oldat és 50 μΐ 0,03 M fenolftalein-glukoronsav elegyének oldatához adjuk 4,5-ös pH-értéken, majd 56 °C-on 2 órán át inkubáljuk. A reakció 350 μΐ 0,1 M-os, pH=ll értékű 2-amino-2-metil-1-propanol puffer hozzáadásával fejeződik be. 550 nm-nél mérjük az abszorbanciát, vakreagenssel összevetve, és összehasonlítjuk a fenolftáléin etalon görbével. Az eredményből kiszámítható az egyes GCF tesztminták BG koncentrációja.

A GCF BG koncentrációk vizuálisan is meghatározhatók a fent ismertetett spektrofotometriás módszer módosításával. Konkrétan a tesztminta a fenti módszerrel elemezhető a 2-amino-2-metil-l-propanol puffer hozzáadásáig bezárólag. Ekkor a színabszorbanciát/intenzitást vizuálisan össze kell hasonlítani a BG etalongörbe abszorbancia/intenzitás tartományát bemutató színtérképpel. A tesztminta színintenzitás/abszorbancia értékét vizuálisan összevetjük a GCF tesztminta BG koncentrációját bemutató etalon görbével.

A fenti módszer további módosítása a fenolftalein-gluku ronsav helyettesítése p-nitro-fenil-E-D-glukoronid kromogén szubsztráttal. Ebben az esetben a BG általi hidrolízist követő sárga szín szolgál a tesztminta BG koncentrációjának mértékéül.

A GCF BG fluorometriás módszerrel is meghatározható mennyiségileg, amint azt az itt hivatkozásként feltüntetett Popé, M., és mtsai, J.Dental Research, 7 0 , Abstract 704, 1991.

április, munka leírja. A fluorometriás vizsgálat során spektrofotometriás/vizuális módon mérik a fluoreszcens molekula beta-glukoronsav származékából a fluoreszcens melléktermék felszabadulását. A BG fluorometriás vizsgálatát más alkalmazásokra dolgozták ki. Ilyen vizsgálati eljárást ismertetnek Papasian és mtsai, a Rapid Identification of Escherichia coli with a Fluorogenic beta-D-Glucoronidase Assay, Diag. Microbiol. Infect. Dis., 8.(4), 255-8 (1988 . december) munkában, amely itt hivatkozásként van feltüntetve. Ezek a technikák alkalmazhatók a BG kimutatására GCF-ben, a fenolftalein-glukoronsav helyett 4-metil-umbilliferil-E-D-glukoronid fluorogén prekurzor szubsztrátot alkalmazva, majd a BG mennyiségét az inkubálás során felszabaduló fluoreszcens melléktermék, a 4-metil-umbelliferőn mennyisége alapján meghatározva, a Lamster II-ben leírtak szerint. A felszabaduló fluoreszcens melléktermék koncentrációját 360 nm-es UV-fénynél mérjük, és a fluoreszcencia intenzitását ismert BG koncentrációjú tesztmintákkal kapott fluoreszcencia etalon görbék fluoreszcenciaintenzitásával való összehasonlítással kapj uk.

A GCF BG koncentrációk kimutathatók enzimbefogó módszerrel is. Ilyen módszerekre példákat ismertetnek Holt és mtsai, az

Enzyme Capture Assay fór Rapid Detection of Escherichia coli in Oysters, Appl. Environ. Microbiol., 55, (1), 229-32 (1989. január) című munkában, amely hivatkozásként van feltüntetve. A GCF BG tesztmintákban való kimutatása során e technika humán BG (E. coli BG-vel szembeni) elleni ellenanyag készítményeket használ, és az antihumán BG ellenanyag készítményt mikrotitráló lemezhez vagy más megfelelő felülethez rögzíti. Ezután a tesztmintát hozzáadják és inkubálják, amint az a Lamster II-ben olvasható .

A GCF elasztáz koncentráció különböző módszerekkel vizsgálható, köztük, nem kizárólagosan, kolorimetriás vizsgálattal, ELISA-val és fluorometriás módszerekkel. Ezekben az eljárásokban rendszerint kromogén vagy fluorogén termékek szabadulnak fel a peptidszármazékokból, melyeket specifikusan elasztázzal hidrolizáltunk.

A kolorimetriás és fluorometriás módszerek alkalmazhatók a GCF elasztázkoncentráció mennyiségi meghatározására, például spektrofotometriás módszerekkel és vizulásan.

A fluorometriás vizsgálatok spektrofotometriás/vizuális módon mérik a fluoreszcens molekula peptidilszármazékából felszabaduló flouoreszcens mellékterméket. A GCF elasztázkoncentráció mérésére szolgáló különböző fluorometriás módszereket ismertetnek Cox, S.W., és Eley B.M., Detection of Cathepsin Band L-, Elastase, Tryptase-, Trypsin- and Dipeptidyl Peptidase IV-like Activities in Crevicular Fluid from Gingivitis and Periodontitis patients with Peptidyl Derivatives of 7-Amino-4Trifluormethyl Coumarin, J.Perio. Rés., 24 , 353-361 (1989) (a továbbiakban CoxI), és Cox és mtsai, A Simple, Combined Fluorogenic and Chromogenic Method fór the Assay of Proteases in Gingival Crevicular Fluid, J. Perio. Rés., 25 , 164-171 (1990) (a továbbiakban Cox II), mindkét munka hivatkozásként van feltüntetve .

A GCF minta PMN elasztáz koncentrációja mérésére megfelelő kolorimetriás módszereket ismertet a Cox II, Asman B., Peripheral PMN cells in Juvenile Periodontitis: Increased Release of Elastase and of Oxygen Radicals after Stimulation with Opsonized Bacteria, J. Clin. Periodontol., 15, 360-364 (1988), (a továbbiakban Asman), és Kramer és mtsai, Measurement of Free Humán Leukocyte Elastase/alpha-1 Proteinase Inhibitor Complexes by an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, J. Immunological Methods, 131, 41-48 (1990) (a továbbiakban Kramer), Suomalainen K., Characteristics of Neutral Proteases in Inflamed Humán Gingiva, Scand. J. Dent. Rés., 97, 346-354 (1989) (a továbbiakban Soumalainen), és Palcanis, ezek itt hivatkozásként vannak feltüntetve .

A GCF IgA/PMN-marker arány meghatározása

A GCF IgA/PMN-marker arány kiszámítható mind a betegre, mind az adott helyi pontra. Az egy betegre érvényes koncentráció meghatározására megállapítjuk a GCF IgA és PMN-marker koncentrációkat az összes vizsgálandó helyről vett GCF mintában, és meghatározzuk az összes helyről vett GCF mintában az IGA/PMN-marker arányt. Másfelől, a száj összes pontjáról vett GCF mintára kapott IgA/PMN-marker arányokból kiszámítjuk az átlagértékeket, ez adja az adott betegre jellemző IgA/PMN-marker arányt.

A GCF IgA és a PMN-marker arány abszolút értéke a mért PMN-marker, a jelzőrendszer és az eredmény kifejezésére használt egységek függvénye. A GCF IgA kifejezhető a GCF-ben levő IgA tömegével (vagyis ng/minta), az egy mintában levő ELISA egységek össz-számával (vagyis abszorbanciaegységekben), RIA egységek számával mintánként, vagy a vizuális ELISA vizsgálat etalonskáláján levő pontokban. A PMN-markerek, például a BG és elasztáz kifejezhető enzimegység/minta értékkel, a spektrofotometriás vizsgálatban kapott abszorbanciaegységekben, fluoreszcencia egységekben, vagy a vizuális enzimbefogó vizsgálat etalonskáláján levő pontértékekkel. Az egy mintára megadott IgA ELISA egységek, például abszorbanciaegységek alkalmazása eltérő abszolút értékeket ad a GCF IgA/BG arányra, az IgA nanogramm/minta értékekkel összevetve. Tehát a találmány minden megvalósítására kalibrálni kell a kimutatott IgA/PMNmarker koncentrációk kifejezésére használt konkrét értékeket.

Az IgA/PMN-marker arány kalibrálása

Az IgA és PMN-marker koncentrációmérés eredményeinek összehasonlítására szolgáló etalont klinikai vizsgálatokkal lehet létrehozni. Az etalon előállításának egyik módja a normál egészséges személyek és a foggyökérhártya-gyulladásos betegek populációinak longitudinális értékelése a megfelelő IgA/PMNmarker arányokkal összevetve, a klinikai paraméterek megfelelő változásainak figyelembevételével. A GCF IgA és PMN-marker koncentrációk mennyiségi értékelésére szolgáló módszer során a populációkra kapott IgA/PMN-marker arányok használhatók, figyelembe véve a statisztikai standard eltéréseket; bizonyos aránytartományokat alacsonynak, közepesnek illetve magasnak veszünk az aktív foggyökérhártya-gyulladás kockázata kategorizálása céljából.

A foggyökérhártya-gyulladás szempontjából egészséges csoportok (vagyis ahol a tasak nem mélyebb 4 mm-nél, és nincs 2 mm nél nagyobb kötődésveszteséget mutató hely), és a felnőtt foggyökérhártya-gyulladásos betegek csoportjai vonhatók be egy vizsgálatba. Előnyösen legalább 10 személy legyen minden csoportban; előnyösebben legalább 40 személy legyen csoportonként. A GCF mintákat egy előre meghatározott teszthely sorozatról vesszük, előnyösen legalább két helyről személyenként. Előnyösebben a mintákat legalább 4 helyről gyűjtjük személyenként. Azután meghatározzuk a GCF IgA és PMN-marker koncentrációkat a fent ismertetett egy vagy több speciális vizsgálati módszerrel vagy máshogy. Ezután összerakjuk az alapvető klinikai méréseket, például az egyes páciensek szájában az összes konkrét helyre kapott eredményeket, például a foggyökérhártya-kötődési szintet vagy az alveoláris csont magasságot. A pácienseknek azután a szokásos foggyökérhártya-kezelést adjuk, például tömést, gyökérkezelést, és kioktatjuk őket a normál száj higiéniai szokásokról, rábírjuk őket azok betartására egy bizonyos időtar tamra, előnyösen körülbelül 6 és körülbelül 12 hét közötti időtartamra. A megadott időtartam után az összes pácienst visszahívjuk, és meghatározzuk foggyökérhártya-kötődési veszteségi szintjüket. Azok a betegek és helyek, ahol jelentős a betegség előrehaladási foka, aktív betegeknek/helyeknek számítanak. A betegség előrehaladásának jelentős fokát a megnövekedett vesz • ·

- 24 teség, például legalább egy adott helyen nagyobb mint 2 mm kötődési veszteség és/vagy kimutatható csontveszteségi szint (vagyis a mérési technika statisztikai hibájánál nagyobb veszteség) jellemzi. Az egyes betegek arányértékének összehasonlítására szolgáló etalont úgy határozzuk meg, hogy az aktív betegségben szenvedő pácienscsoport átlagos GCF IgA/PMN-marker arányait és az aktív betegségben nem szenvedő csoport arányértékeit kiszá mítjuk. (A továbbiakban ezeket az értékeket aktív csoport átlag-nak, illetve nem-aktív csoport átlag-nak nevezzük). Érvényes etalonról beszélünk, ha a nem-aktív csoport átlag és az aktív csoport átlag közötti különbség nagyobb a standard eltérések összegénél. Kiszámítjuk az egyedi helyek arányértékeinek összehasonlítására szolgáló etalont is, az aktív betegséget mutató helyek és az azt nem mutató helyek GCF IgA/PMN-marker arányainak átlagai alapján (a továbbiakban ezeket az értékeket aktív hely átlag-nak illetve nem-aktív hely átlag-nak nevezzük). Ahhoz, hogy az etalon érvényes legyen, a nem-aktív hely átlag és az aktív hely átlag közötti különbségnek nagyobbnak kell lennie standard eltérésük összegénél.

Ettől kezdve ugyanazon IgA és PMN-marker vizsgálati módszerek használata esetén bármely páciens, akinek a szájára megadott átlagos IgA/PMN-marker arány értéke nagyobb egy standard eltérésnél a nem-aktív csoport átlag alatt, az alacsony kockázatú páciensek közé sorolható. Ugyanígy, azok a páciensek, standard akiknek IgA/PMN-marker arány értéke alacsonyabb egy eltérésnél az aktív csoport átlag fölött, a nagy kockázatúak közé sorolhatók. Azok a páciensek, akiknek átlagos

- 25 -	·······. .. .... • · · · • ’· *··. : : .· ♦· -· .. :	··· · • «
IgA/PMN-marker arány értéke az aktív csoport	átlag fölötti	egy
standard eltérés és a nem-aktív csoport	átlag alatti	egy
standard eltérés közé esik, a mérsékelt	kockázatúak	közé

sorolhatók .

Ehhez hasonlóan az aktív és nem-aktív hely átlagok meghatározására ugyanezen módszereket alkalmazva, bármely hely, amelynek IgA/PMN-marker arány értéke magasabb mint egy standard eltérés a nem-aktív hely átlag alatt, kis kockázatú, és bármely hely, amelynek IgA/PMN-marker arány értéke alacsonyabb mint egy standard eltérés az aktív hely átlag fölött, nagy kockázatú hely. Azok a helyek, amelyeknek átlagos IgA/PMN-marker arány értéke az aktív hely átlag fölötti egy standard eltérés és a nem-aktív hely átlag alatti egy standard eltérés között van, mérsékelt kockázatúak.

Diagnosztikai készletek

A találmány tárgyát emberben, alsóbbrendű állatban jelenleg vagy későbbiekben kialakuló aktív foggyökérhártya-gyulladás kockázatának kimutatására alkalmas diagnosztikai termékek képezik. Ezek a diagnosztikai termékek jó eszközök az IgA és a PMN-marker mennyiségének mérésére az ínyrésfolyadékban a száj üreg egy vagy több helyén a vizsgálandó embereknél és alsóbbrendű állatoknál.

Ilyen diagnosztikai termékekre példaként említhetők a páciensek vagy helyek betegsége előrehaladási kockázatának értékelésére és kimutatására alkalmas diagnosztikai készletek emeberek és alsóbbrendű állatok részére.

A páciensek/helyek IgA/PMN-marker aránya meghatározására • · · · · »

- 26 alkalmas diagnosztikai készletek tartalmazzák az IgA és a kiválasztott PMN-marker jelenlétének vizsgálatához szükséges anyagokat.

A spektrofotometriás ELISA vizsgálatokhoz a készletben lennie kell egy vagy több GCF minta begyűjtésére alkalmas eszköznek, hogy el tudjuk végezni az IgA és PMN-marker koncentráció mérését a GCF-ben. E célból a készlet tartalmazhat előrevágott szűrőpapír csúcsokat, kapilláriscsöveket, kapilláris pipettákat, mikropipettákat, az ínyrés öblítésére szolgáló reagenseket (például gyöngyökhöz, gélekhez vagy mágneses részecskékhez térhálósán kötött specifikus ellenanyagokat, melyekkel össze lehet gyűjteni az IgA-t és BG-t az ínyrésből).

Az IgA elemzésére szolgáló készlet tartályokat, kémcsöveket, tenyészcsöveket, reagensüvegeket és mikrocentrifugacsövekét tartalmazhat puffer sóoldatokkal, amelyek magukba foglalják a szükséges reagenseket és/vagy amelyekben elkészítjük a tesztmintákat, és elvégezzük a vizsgálatot az IgA kimutatására a GCF-ben. Ilyen komponensek lehetnek a foszfátpufferes sós Tween oldat, amely 0,001-0,1 M foszfátpuffért (pH= 6,6-7,4) , 0,1-0,2 M NaCl-ot és 0,01-10% Tween-t tartalmaz, vagyis PBST-t, és olyan PBST-oldatok, amelyek tartalmazzák a szükséges reagenseket és kromogén szubsztrátokat. A PBST előnyösen 0,01 M foszfátpuffért (pH=7,01), 0,15 M NaCl-oldatot és 0,05% Tween-t tartalmaz.

A diagnosztikai készletekben lehetnek inkubációs tartályok is, amelyekbn lefolytatható a vizsgálat. A megfelelő inkubációs tartályok lehetnek kémcsövek, tenyészcsövek, küvetták és mikro27 titráló lemezek. Előnyös inkubációs tartályok a mikrotitráló lemezek. Az inkubációs tartályok előnyösebben 96 lyukú polisztirol mikrotitráló lemezek, például Nunc Immunoplate 1 lemezek (Roskilde, Dánia).

A diagnosztikai készletek tartalmazhatnak eszközt az IgAnak a tesztmintából való kifogására és a mikrotitráló lemez lyuka alján való megtartására az ELISA vizsgálat során, ez például antiszérum lehet. Megfelelő antiszérum a nem-humán anti-humán IgA elfogó ellenanyag, például a poliklonális vagy monoklonális anti-IgA ellenanyag készítmény, amely specifikus az IgA-ra, és nem ad keresztreakciót a humán IgG-vel, IgM-mel, IgE-vel vagy IgD-vel. Az antiszérum előnyösen nem-főemlős eredetű, előnyösebben kecske antihumán IgA. Még előnyösebben kecske IgG antihumán-IgA antiszérum és nátrium-karbonát/-hidrogén-karbonát puffér, előnyösen 0,1M puffér pH=9,6 értéken. Az elfogó ellenanyag inkubálása hidrogén-karbonát pufferben mikrotitráló lemezeken 48 órán át 4 °C-on lehetővé teszi, hogy az elfogó ellenanyag a mikrotitráló lemez lyukainak aljához kötődj ön.

A diagnosztikai készletben szükség lehet antiszérum származékra is, hogy kimutatható legyen az elfogó ellenanyag által megkötött IgA. Az antiszérum származék előnyösen ugyanaz a típus, mint a fent említett jelöletlen antiszérum. Megfelelő jelölések lehetnek az enzimatikus jelölés (például torma peroxidázzal, alkálikus foszfatázzal vagy ureázzal), a biotinos jelölés, radioaktív jelölés és fluoreszcens jelölés. Előnyös antiszérum a torma peroxidázzal jelölt kecske IgG antihumán-IgA.

• ·· · ····

Ha a készlet biotinnal jelölt anti-IgA antiszérumot tartalmaz, avidines jelölő konjugátumot is be kell vinni, PBST pufferben. Az avidines jelölő konjugátum specifikusan kötődik a biotinhoz, és lehetővé teszi az IgA-val és az elfogó ellenanyaggal komplexbe vitt biotin-jelölt anti-IgA-antiszérum kimutatását. Megfelelő avidinjelölés a konjugátumban lehet enzim (például torma peroxidáz vagy alkálikus foszfatáz), radioaktív jelölés és fluoreszcens jelölés. Előnyös avidines jelölő konjugátum az avidin-enzim konjugátum, előnyösebb az avidin torma peroxidáz konjugátum.

Az IgA-elfogó ellenanyag komplex kimutatását látható kromofor segítségével olyan megoldani, amely puffereit Megfelelő pufferek lehetnek Megfelelő kromofor rendszerek diagnosztikai készlettel lehet kromofor rendszert tartalmaz. az acetát és citrát pufferek, az o-fenilén-diamin és a p-nitro-foszfát. Ha a puffer orto-fenilén-diamint tartalmaz, a puffer ben lehet körülbelül 0,01% és körülbelül 1% közötti mennyiségű hidrogén-peroxid.

A pH-nak a humán PMN-marker optimális enzimműködésével összhangban tartására a diagnosztikai készlet puffért tartalmazhat. Megfelelő pufferek a 4,9-es pH-hoz képest 0,5 értéken belüli pK_a értékkel rendelkező pufferek, például az acetát puffer. Előnyös puffer a nátrium-acetát puffer. Ha acetátot alkalmazunk, az előnyös koncentráció körülbelül 0,01 M és körülbelül 0,5 M között van. A puffer előnyös pH-ja körülbelül 4,5 és körübelül 5,5 között van. A pH értéke előnyösebben körülbelül 4,9.

• · · · · · ·

- 29 A diagnosztikai készlet tartalmazhat antihumán beta-glukoronidázt is, amely polisztirolhoz vagy más szilárd hordozóhoz lehet kötve, például szűrőpapírhoz, nitrocellulózhoz, gélekhez, mikrokapszulákhoz vagy gyöngyökhöz. Az anti-humán BG ellenanyagot előnyösen polisztirolhoz, még előnyösebben polisztirol mikrotitráló lemezhez kötjük.

A humán BG jelenlétének kimutatásához a diagnosztikai készlet tartalmazhatja a humán BG kromogén szubsztrátját is. Ilyen szubsztrátok lehetnek a beta-D-glukoronsav konjugátjai, például a fenolftalein-glukoronsav, a 4-nitrofenil-beta-D-glukoronid, és a 4-metil-umbelliferil-beta-D-glukoronid. Előnyös szubsztrát a fenolftalein-glukoronsav. Ha fenolftalein-glukoronsavat alkalmazunk, azt előnyösen oldat formájában, körülbelül 4,5 és körülbelül 5,5 közötti pH-η adagoljuk be.

A diagnosztikai készlet tartalmazhat sóoldatot is, amellyel leöblítjük a reagenseket az ELISA lemezekről az IgA ELISA vizsgálat inkubálás! lépései között. Megfelelő sós öblítőoldatok lehetnek a foszfátpufferes sóoldatos Tween oldatok.

Hidrogén-klorid-oldat adható az ELISA reakciókhoz azok leállítására a spektrofotometriásán leolvasható abszorbancia mérése előtt. Ezért a készlet tartalmazhat hidrogén-klorid-oldatot is, az ELISA vizsgálat befejezésére. A hidrogén-kloridot előnyösen körülbelül 0,1 M koncentrációjú oldat formájában adagoljuk be.

A BG vizsgálat befejezése céljából hasznos lehet egy puffer bevitele. Megfelelő pufferek az amino-alkoholok, például a 2-amino-alkoholok. Előnyös puffer a 2-amino-2-metil-1-propai · ·· ···· ·«·· • · · · * ··· · · · · • · · · · ♦·· ·· 9 * nol. A puffért előnyösen körülbelül 0,01 M és körülbelül 1 M közötti koncentrációjú vizes oldat formájában alkalmazzuk; előnyösebben körülbelül 0,1 M koncentrációban. A puffer előnyösen körülbelül 9 és körülbelül 13 közötti pH-jú; előnyösebben a puffer pH-ja körülbelül 11.

Célszerű lehet etalon görbéket bevinni a diagnosztikai készletbe a megfelelő vizsgálatokhoz. Ilyen etalon görbék segítségével lehet átalakítani a vizsgálatok során kapott, abszorbanciaegységekben és színintenzitásban kifejezett megfelelő IgA és PMN-marker eredményeket a tesztminták Iga és PMN-marker koncentrációivá. Tehát a megfelelő vizsgálatok egységeit (például abszorbanciaegységeket és színintenzitást) ki lehet fejezni a koncentráció függvényeként (például mg/ml vagy gg/μΐ IgA egységben, vagy egység/ml PMN-marker aktivitásban). Az etalongörbék előállíthatok etalon tesztoldatok segítségével, melyek a GCF-ben előforduló IgA és PMN-marker koncentrációk teljes tartományát képviselik, az etalon oldatokkal elvégzik a megfelelő IgA és PMN-marker kolorimetriás vizsgálatokat, majd grafikusan ábrázolják a kapott eredményeket. Ilyen grafikus ábrázolás lehet az etalon tesztoldatoknak a megfelelő vizsgálatok során kapott abszorbanciaértékeinek és a megfelelő tesztmintákhoz adott Iga vagy a PMN-marker koncentrációknak a felvitelével kapott görbe.

Példák. Eljárások és diagnosztikai készletek

A következő, nem-kizárólagos példák a találmány szerinti eljárások és diagnosztikai készletek illusztrálására szolgálnak.

• · ·

- 31 1. példa

A példa a találmány szerinti eljárást illusztrálja.

Az aktív betegség kockázatának mérésére szolgáló spektrofotometriás eljárás első lépése a GCF minták összegyűjtése foggyökérhártya-gyulladásos páciensenként 16-20 helyről. A mintavételt a Lamster II-ben leírtak szerint végezzük.

A GCF IgA koncentrációjának ezt követő spektrofotometriás mérése a Sengupta munkájában leírtak szerint; a GCF BG elemzése a Lamster II-ben leírtak szerint történik. Azután kiszámítjuk az átlagos IgA/hely értékeket (vagyis ng IgA/30 másodperc öszszegyűjtött GCF) és az átlagos BG/hely értékeket (vagyis BG egység aktivitás/30 másodperc GCF). Ezután kiszámítjuk az egyes páciensekre az átlagos IgA/BG arányt [vagyis az (átlagos IgA/hely)/(átlagos BG/hely) értéket] .

Vegyük például, hogy egy pácienstől (MG) a fentiek szerint GCF mintát veszünk, és a páciensre azt kapjuk, hogy az átlagos IgA/GCF minta/hely 45 ng és az átlagos BG/GCF minta/hely 2,3 egység. Ebből következik, hogy az átlagos IgA/BG arány az MG páciensre 19,6.

Ugyanezt a fenti spektrofotometriás módszert alkalmazva a klinikai vizsgálat azt mutatja, hogy azoknál a pácienseknél, akiknél aktív foggyökérhártya-gyulladás áll fenn, 21,1 + 7,2 az átlagos IgA/BG arány; ugyanakkor azoknál a pácienseknél, akiknél nincs kötődési veszteség, az átlagos IgA/BG arány 125,2+46,6 értéket mutat.

A klinikai vizsgálat ereményeit etalonként használva, és az MG arányait ezzel összehasonlítva azt kapjuk, hogy az MG ··♦· ···· • · · · · . .

·· ♦·♦ .. . ;

- 32 páciens IgA/BG aránya kevesebb mint egy etalon eltéréssel van az aktív foggyökérhártya-gyulladásban szenvedő betegek átlagértéke fölött. Teát az MG páciensre az aktív foggyökérhártya-gyulladás kifejlődésének magas kockázata jellemző (> 80% valószínűség).

. példa

A példa a találmány szerinti eljárást illusztrálja, és az IgA és BG mennyiségi meghatározásának vizuális módszerét írja le.

A GCF-mintát Lamster II módszerrel gyűjtjük be; a GCF IgA elemzése Sengupta eljárás szerint történik, kivéve, hogy a kromogén reakciót a színváltozás és a GCF IgA koncentrációkat képviselő etalon színintenzitás sorozat összehasonlítása alapján értékeljük.

A GCF BG elemzést a Lamster II-ben leírtak szerint végezzük, azzal a kivétellel, hogy a BG koncentrációkat a vizsgálati oldat színváltozásának és a humán GCF-ben talált GCF BG koncentrációtartományon belüli kromogén BG reakció színintenzitásait képviselő színetalonok összehasonlításával értékeljük .

Azokat a színetalonokat, amelyekkel a színváltozásokat összevetjük, IgA ELISA és BG enzimvizsgálatokkal készítjük egy tesztsorozat segítségével. Minden tesztminta különböző ismert IgA és BG koncentrációt tartalmaz, és együttesen széles IgA és BG koncentrációtartományt képvisel. Azután összehasonlítjuk az egyes minták kromogén színreakcióját a megfelelő színezéket tartalmazó egyedi oldatokéval, így a vizsgált IgA és BG « *· ·

- 33 mintákkal azonos színű oldatsorozatot kapunk, amelynek tagjai különböző IgA és BG koncentrációkat képviselnek. Ez az oldatsorozat egy színintenzitás etalon, amellyel a kockázati értékelésnek alávetett páciensektől kapott GCF mintákkal végzett kromogén színreakciók eredményeit összehasonlíthatjuk.

Az IgA/BG arányt a vizsgált GCF minták IgA és BG színintenzitásának és a mátrixtáblán levő színetalonoknak az összevetésével határozzuk meg, a mátrixtáblán az Y tengely a humán GCF-ben talált növekvő BG koncetrációkat tartalmazza, az X tengelyen a növekvő IgA koncentráció van feltüntetve. A mátrixtáblán levő pont, melyet az X és Y koordináták megfelelő értékei segítségével határozunk meg, a magas, közepes és alacsony kockázatúnak megítélt területek egyikére esik; az Y tengelyhez közelebb eső háromszög alakú terület alacsony IgA/BG arányt és egyben magasabb kockázatot jelent.

3. példa

A példa egy, a találmány szerinti diagnosztikai készletet mutat be.

Az IgA/BG elemzésére szolgáló spektrofotometriás készletet mikrotitráló lemez leolvasóval és spektrofotométerrel együtt használjuk a vizsgálati eredmények meghatározására.

A GCF minták vételére a készlet 20 előrevágott szűrőpapírcsíkot tartalmaz.

A GCF IgA elemzéshez a készlet tartalmaz: 20 mikrocentrifuga csövet PBST oldattal (0,01 M foszfát puffer pH=7,01 értéken, 0,15 M NaCl oldat és 0,05% Tween); 50 ml PBST • ·

- 34 öblítőoldatot; 4 mikrotitráló lemezt; 10 ml kecske anti-humán IgA antiszérumot 1:256 000 arányban hígítva, 0,1 M karbonát/hidrogén-karbonát pufferben, 9,6-os pH-értéken; 10 ml, peroxidázzal jelölt kecske antihumán IgA-t, l:4000-es hígításban, PBST pufferben; 10 ml 0,1 M citrátpuffért, amely 30 mg% orto-fenilén-diamint és 0,3% hidrogén-peroxidot tartalmaz; 10 ml 0,1 M HC1 oldatot, és etalongörbét tartalmaz IgA vizsgálathoz.

A BG vizsgálatra szolgáló készlet tartalmaz: 10 ml 0,075 M acetátpuffért 4,9-es pH-értéken; 5 ml 0,03 M fenolftalein-glukoronsav oldatot 4,5-es pH-értéken; 5 ml 0,15 M NaCl oldatot; 50 ml 0,1 M 2-amino-2-metil-1-propanol puffért pH=ll értéken; valamint egy BG vizsgálati etalongörbét.

A készlet emellett mátrixtáblát is magába foglal, amelynek X tengelye növekvő IgA értékeket képvisel, az Y tengelyt úgy kalibráltuk, hogy a humán GCF növekvő BG értékeit ábrázolja, a táblán kijelölt zónák vannak, a megfelelő IgA és BG koordináták pontokat határoznak meg a kijelölt zónákban, melyek magas, közepes és alacsony kockázati kategóriákat jelentenek.

4. példa

A példa egy másik, a találmány szerinti készletet mutat be.

Az IgA/elasztáz arány elemzésére szolgáló spektrofotometriás készlet tartalmaz:

GCF mintavételre: 20 előrevágott szűrőpapírcsíkot.

GCF IgA elemzéshez: 20 mikrocentrifuga csövet PBST oldattal (0,01 M foszfátpuffér pH=7,01 értéken, 0,15 M NaCl oldatot és 0,05% Tween-t); 50 ml PBST öblítőoldatot; 4 mikrotitráló le35

mezt; 10 ml kecske anti-humán IgA antiszérumot 1:256000 arányban hígítva, 0,1 M karbonát/hidrogén-karbonát pufferben pH=9,6 értéken; 10 ml, peroxidázzal jelölt kecske anti-humán IgA-t 1:4000 arányban hígítva, PBST pufferben; 10 ml 0,1 M citrátpuffert, amely 30 mg% orto-fenilén-diamint és 0,3 % hidrogén-peroxidot tartalmaz; 10 ml 0,1 M HCI oldatot, valamint egy etalon IgA vizsgálati görbét.

Az elasztázvizsgálathoz: 2 ml TST puffért ( 50 mM Tris

HCl-t pH=7,0 értéken, 0,15 M NaCl-ot és 1% Triton Χ-100-at, Cox II szerint), két fehér műanyag tálcát, 40 darab 6 mm átmérőjű Whatman 3 MM papírkorongot, amelyeket elasztáz szubsztráttal impregnáltunk (vagyis 250 μΜ metoxi-szukcinil-Ala-Ala-Pro-Val-7-amino-4-trifluormetil-kumarinnal 50 mM Tris HCl-ben, pH=9,0 értéken és 350 mN NaCl-dal és 5% dimetil-formamiddal, egy éjszakán át szárítva), és 1 ml 1%-os p-dimetil-amino-fahéjaldehidet 1,0 M HCl-ban.

A megfelelő minták kromogén színreakcióját aztán összehasonlítjuk megfelelő színezéket tartalmazó oldatokkal, így a vizsgált IgA és elasztáz mintákkal azonos színű oldatsorozatot kapunk, amelynek tagjai különböző IgA és elasztáz koncentrációkat képviselnek. Ez az oldatsorozat színintenzitás etalont jelent, amellyel a kockázati értékelésnek alávetendő páciensektől vett GCF minták kromogén színreakció-vizsgálati eredményeit összehasonlítjuk.

Az IgA/elasztáz arányt a vizsgált GCF minták IgA és elasztáz színintenzitásának és a mátrixtábla színetalonjainak összevetésével állapítjuk meg, a táblán az Y tengelyen a humán *··· ♦··· *·· ··«· ....

. · ··· » * ·* »‘ • · · · · · , ·· «·« .. , ;

- 36 GCF-ben talált elasztázkoncentrációk szerepelnek növekvő sorrendben, és az X tengely növekvő IgA koncentrációkat képvisel. A mátrixtáblán a koordináták által meghatározott pont a magas, közepes vagy alacsony kockázatúnak kijelölt területre esik; az Y tengelyhez közelebb eső terület jelenti a magasbb kockázatot.

Claims (6)

1. Eljárás az adott időben vagy később kialakuló aktív foggyökérhártya-gyulladás kockázatának kimutatására vagy értékelésére, amely a következő lépésekből áll:

a) mintavétel az ínyrésfolyadékból;

b) IgA mennyiségének meghatározása ínyrésfolyadékban;

c) polimorfonukleáris leukocita marker mennyiségének mérése az ínyrésfolyadékban;

d) a (b) és (c) lépésekben kapott mennyiségek arányának összehasonlítása az etalonnal.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az IgA teljes mértékben szérum típusú IgA és a polimorfonukleáris leukocita marker beta-glukoronidáz.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az IgA teljes mértékben szérum típusú IgA és a polimorfonukleáris leukocita marker elasztáz.

4. Készlet (kit) jelenleg vagy később kialakuló aktív foggyökérhártya-gyulladás kockázatának kimutatására vagy értékelésére, amely tartalmaz: (a) az IgA mennyiségének egy vagy több ínyrésfolyadék mintában való mérésére szolgáló eszközt;

(b) a polimorfonukleáris leukocita marker mennyiségének egy vagy több ínyrésfolyadék mintában való mérésére szolgáló eszközt;

(c) etalont, amellyel összevetjük az (a) és (b) lépésekben kapott átlagok alapján meghatározott mennyiségek arányát.

···· ···· • ·

- · ··· • · · ·· ···

5. A 4. igénypont szerinti készlet, azzal jellemezve, hogy a polimorfonukleáris leukocita marker mennyiségének mérésére szolgáló eszköz beta-glukoronidázt mérő eszköz.

6. A 4. igénypont szerinti készlet, azzal jellemezve, hogy a polimorfonukleáris leukocita marker mennyiségének mérésére szolgáló eszköz elasztázt mérő eszköz.