SK32695A3 - Method and kits for evaluating risk of developing parodontitis - Google Patents

Description

Metódy a súpravy na hodnotenie rizika vývoja parodontitídy

Oblasť techniky

Vynález sa týka zlepšených metód na zistenie rizika, že pacient prekoná aktívnu parodontitídu alebo že sa vyvinie parodontitídne miesto v ústnej dutine.

Súčasný stav techniky ♦

l

Baktérie zubného povlaku kolonizujú zub a spôsobujú prílyv bakteriálnych toxínov, enzýmov a metabolitov, ktoré môžu viesť k miestnemu vývoju zápalu tkanív gingivy, gingivitíde. Miestna zápalová odpoveď hostitelského tkaniva na napadnutie bakteriálnymi patogénmi zahrňuje infiltráciu mnohých bunkových typov (napr. polymorfonukleárnych leukocytov, lymfocytov, plazmatických buniek, makrofágov), ktoré majú rôznu úlohu pri pôsobení proti napadnutiu tkaniva baktériami a proti ich produktom. U mnohých jedincov vedie pretrvávajúca prítomnosť povlakových patogénov a s tým spojená zápalová odpoveď k parodontitíde, ktorá predstavuje postupujúci rozklad úponu väzivových tkanív na zuby a alveolárne kosti obklopujúce zub.

Aparát väzivového úponu (parodont) sa skladá z cementu, periodontálneho ligamentu a jeho zložiek, vlákien spojujúcich zub s lôžkom alveolárnej kosti. U zdravého zuba je periodontálny úpon presne na spojení medzi zubnou sklovinou a cementom koreňa. Klinicky sa strata periodontálneho úponu na konkrétnom mieste zubu určuje kalibrovanou sondou, ktorou sa meria vzdialenosť medzi cemento-sklonovinovou hranicou a hladinou bázy parodontálneho chobotu, kde parodontálna sonda naráža na odpor pri mechanickej skúške. Keď je prítomná strata úponu, je tam tiež pravdepodobný parodontálny chobot. Keď strata pokračuje prostredníctvom kolonizácie parodontu patogénmi, môže dôjsť k úbytku alveolárnej kosti. Tento rozklad tkaniva možno spomaliť, ale nie napraviť tradičnými liečebnými zásahmi.

V populácii pacientov, ktorí majú parodontitídu, sa rýchlosť postupu ochorenia velmi líši; naviac, u jednotlivého pacienta, ochorenie postupuje značne odlišnou rýchlosťou na rôznych miestach v ústach. Jednotlivé zuby a ich príslušné koreňové povrchy v ústach sú miesta, kde parodontitída môže nastať s rôznym stupňom intenzity. V súčasnosti sa verí, že ochorenie môže postupovať bud chronickým spôsobom, lineárne v čase, alebo epizodickým spôsobom, s prepuknutím chorobnej aktivity, s oddeleným odbobím ústupu. V každom prípade je jasné, že ked je určitá populácia pacientov sledovaná v čase, existujú medzi pacientami a medzi miestami v ústach každého pacienta značné rozdiely vo výskyte klinicky sa prejavujúceho postupu ochorenia.

Perspektívne zisťovanie pacientov a miest so zvýšeným rizikom postupu ochorenia je velmi dôležité pre účinnú zubnú liečbu. Zistenie zvýšeného rizika postupu ochorenia umožňuje včasnú identifikáciu týchto pacientov a miest, ktorí najviac potrebujú liečebné a preventívne ošetrenie na zastavenie fázy rozkladu tkanív pri chorobnom procese.

V súčasnosti neexistujú žiadne účinné prostriedky na hodnotenie rizika pacienta, alebo lokálneho rizika, či dôjde k pokračujúcej strate úponu, t.j. aktívnemu ochoreniu. Klinická miera postupu ochorenia dáva mieru predchádzajúcej chorobnej aktivity, ale neposkytuje prostriedok na rozlíšenie medzi miestami alebo pacientami s vysokým a nízkym rizikom budúcej chorobnej aktivity.

Hostitelská imunitná odpoveď na povlakové patogény predstavuje tvorbu molekúl, ktoré chránia tkanivo pred rozkladnými účinkami prenikajúcich baktérií, ale tiež molekuly tvorené pri hostitelskej odpovedi, ktoré môžu rokladať periodontálne tkanivá. Napríklad: Lymfocyty vytvárajú protilátky proti povlakovýcm patogénom, ktoré neutralizujú baktérie a ich toxické produkty. Počas toho môžu zápalové bunky uvolňovať rôzne hydrolytické enzýmy, ktoré môžu štiepiť a rozkladať bielkoviny a polysacharidy štruktúrnych zložiak periodontálneho tkaniva.

Protilátky proti parodontálnym patogénom sa viažu na patogény alebo na ich produkty za tvorby komplexov antigén3 protilátka. Tieto komplexy antigén-protilátka spôsobujú neutralizáciu a aglutináciu povlakových patogénov a ich produktov. Tieto komplexy rovnako podporujú fagocytózu, zabíjanie a rozklad patogénov a ich produktov polymorfonukleárnymi leukocytmi (PMN). Niektoré z týchto komplexov antigén-protilátka však môžu podporovať druhotné zápalové odpovede z dôvodu ich schopnosti aktivovať komplementový systém, ktorý je kaskádou proteolytických enzýmov schopných aktivovať rôzne zápalové mechanizmy.

β-glukuronidáza (BG), je hydrolytický enzým a je enzýmovym markerom aktivácie PMN, je zapojená do kyslého rozkladu mukopolysacharidov/proteoglykanov. Bola skutočne zaznamenaná zvýšená hladina BG v sulkulárnej tekutine (GCF, gingival creyicular fluid) u parodontitídnych pacientov so zvýšeným výskytom aktívnej parodontitídy. Je teda jasné, že u aktívnej parodontitídy je zvýšené zapojenie PMN k parodontálnym patogénom v tkanive dasien alebo v ich blízkosti.

Zatialčo bakteriálne patogény sú potrebné pre vývoj zápalu ďasien a parodontitídy, meranie prítomnosti alebo neprítomnosti konkrétnych bakteriálnych patogénov nie je samo o sebe dostatočným alebo účinným prostriedkom na predpoveď pravdepodobnosti či dôjde k aktívnemu ochoreniu. V dôsledku toho, úsilie vyvinúť prostriedky na predpoveď budúcej chorobnej aktivity sa zameriava na spojenie s rôznymi molekulami prítomnými v sulkulárnej tekutine presakujúcej v dôsledku odpovedi hostitelských faktorov v priebehu ochorenia (viď Lamster, I. B. et al., Enzýme Activity in Crevical Fluid f or Detection and Prediction of Clinical Attachment Loss in Patients with Chronic Adult Periodontitis, J. Periodontol., 59, 516-523, (1988) (dalej Lamster) a Palcanis, K. G., et al., Elastase as an Indicator of Periodontal Disease Progression, J. Periodontol., 63, 237-242, (1992) (ďalej Palcanis).

CGF obsahuje rovnaké molekuly ako sú tvorené hostitelskými bunkami v gingiválnom tkanive alebo gingiválnom sulku. CGF dáva profil tých hostitelských molekúl, ktoré sú prítomné v gingiválnom tkanive a môže byť použitá na indikáciu reakcií a odpovedí prebiehajúcich v tomto tkanive. Súčasný výzkum má tendenciu sa zameriavať na meranie prítomnosti hostitelských molekúl, ktoré by mohli byť spojené s rozkladom gingiválnych tkanív. Takto boli hladiny rôznych zápalových mediátorov (napr. prostaglandínov E2 ), predpokladaných enzýmov hydrolýzy/rozkladu tkanív (napr. β-glukuronidázy a elastázy) a enzymových markerov bunkovej smrti (napr. aspartát aminotransferázy) identifikované v sulkulárnej tekutine a boli hodnotené čo do spojenia s pacientami,. alebo miestami majúcimi zvýšené riziko aktívneho ochorenia v porovnaní s tými, kde sa nenašla žiadna klinická zmena v periodontálnom úpone (vid Lamster a Palcanis). O vzťahu medzi prítomnosťou týchto molekúl a budúcou chorobnou aktivitou nebolo dokázané, že by bol dostatočný na to, aby dával všeobecne prijatelný a spoľahlivý spôsob predpovedi rizika chorobnej aktivity.

Cieľom predmetu vynálezu je poskytnúť spôsob zistenia zvýšeného rizika postupu parodontálneho ochorenia u ľudí a nižších živočíchov.

Ďalším cieľom predmetu vynálezu je poskytnúť diagnostické súpravy užitočné na zistenie a vyhodnotenie rizika postupu ochorenia u pacientov alebo konkrétnych periodontálnych miest u ľudí a nižších živočíchov.

Podstata vynálezu

Predmet vynálezu sa týka spôsobov a súprav na zistenie a vyhodnotenie rizika súčasného alebo neskoršieho vývoja aktívnej parodontitídy a obsahuje: (a) odber sulkulárnej tekutiny; (b) meranie množstva IgA v sulkulárnej tekutine; (c) meranie množstva markeru polymorfonukleárnych leukocytov v sulkulárnej tekutine; (d) porovnanie množstiev získaných v krokoch (b) a (c) oproti štandarde.

Podrobný popis vynálezu

Diagnostické metódy

Predmet vynálezu sa týka diagnostických metód na zistenie pacientov alebo parodontálnych miest s rizikom vývoja aktívnej parodontitídy u Iudí alebo nižších živočíchov. Tieto metódy predstavujú meranie hladín markerov IgA a PMN v GCF, výpočet pomeru ich hodnôt a použitie tohoto pomeru na určenie rizika vývoja aktívnej parodontitídy. Neočakávane sa pre pomer markerov IgA/PMN ukázalo, že odráža rovnováhu alebo nerovnováhu mechanizmov hostitelskej odpovede, ktorá určuje pravdepodobnosť výskytu aktívnej parodontitídy. Keď je pomer merkerov IgA/PMN u pacienta alebo miesta nižší ako pomer markerov IgA/PMN zistený u pacientov alebo miest bez rizika aktívnej parodontitídy, má takýto pacient alebo miesto zvýšené riziko vývoja aktívnej parodontitídy.

Parodontálny úpon, ako sa tu používa, znamená úpon väzivových tkanív, ktorý podopiera zub v lôžku alveolárnej kosti.

Výraz parodontitída, ako sa tu používa, znamená deštruktívne ochorenie tkaniva, ktoré predstavuje stratu periodontálneho úponu a/alebo rezorbciu alveolárnej kosti.

Tkanivo gingivy, ako sa tu používa, znamená gumózne tkanivo a membránu sliznice obklopujúce zub a alveolárny úpon a kosť.

Gingiválny sulkus, ako sa tu používa, znamená priestor medzi vnútornou stranou volnej gingivy a buď sklovinou alebo cementom, v závislosti na úrovni periodontálneho úponu.

Parodontálny chobot znamená abnormálne hlboký gingiválny sulkus spojený s parodontálnym ochorením spôsobený migráciou gingiválneho úponu smerom k vrcholu zubného koreňa.

Aktívna parodontitída, ako sa tu používa, znamená fázu parodontitídy, v ktorej nastáva klinicky detekovatelný nárast straty väzivového tkaniva a/alebo rezorbcie alveolárnej kosti.

Neaktívna parodontitída, ako sa tu používa, odkazuje na ochorenie, pri ktorom nenastáva detekovatelný nárast straty väzivového tkaniva alebo rezorbcie alveolárnej kosti.

Sulkulárna tekutina, a GCF, ako sa tu používajú, znamenajú transudát krvnej plazmy nahromadený v gingiválnom sulku a vytváraný prienikom z kapilár vo volnej gingive.

Gingivitída, ako sa tu používa, znamená zápal gingiválnych tkanív.

Ochorenie (choroba), ako sa tu používa, znamená parodontitídu.

Miesto, ako sa tu používa, znamená konkrétnu lokalizáciu okolo zuba (napr. mesiálnu, distálnu, bukálnu alebo linguálnu stranu koreňa zubu), ktorá je monitorovaná na výskyt parodontitídy.

Marker, ako sa tu používa, znamená jednu alebo viac konkrétnych molekúl, ktoré môžu byť detegované a merané, a ktoré môžu indikovať prítomnosť jedného alebo viac mechanizmov so vzťahom k patogenéze ochorenia.

IgA, ako sa tu používa, odkazuje na imunoglobulín-A sérového typu.

PMN, ako sa tu používa, odkazuje na polymorfonukleárny lekocyt(y).

Vzorka GCF, ako sa tu používa, odkazuje na určité množstvo GCF odobrané z gingiválneho sulku určitého miesta, alebo pacienta.

Testovaná vzorka GCF, ako sa tu používa, odkazuje na vzorku GCF zriedenú do štandardného objemu pufrom, z ktorého sa odoberajú alikvoty pre následné analýzy GCF IgA alebo PMN markerov.

GCF IgA, ako sa tu používa, odkazuje na IgA sérového typu sulkulárnej tekutiny vo vzorke testovanej vzorky GCF. GCF IgA predstavuje IgAl a IgA2 izotypy a nie je obmedzený na IgA protilátku špecifickú voči zvláštnym antigénom.

GCF BG, ako sa tu používa, odkazuje na množstvo aktívnej β-glukuronidázy zistenej v testovanej vzorke GCF.

GCF PMN, ako sa tu používa, znamená sulkulárne polymorfonukleárne leukocyty, ktoré migrujú z gingiválnych tkanív do sulku.

Marker PMN, ako sa tu používa, odkazuje na ktorýkolvek z mnohých zvláštnych markerov pre aktívne polymorfonukleárne leukocyty detegované v testovanej vzorke GCF.

Aktivácia GCF PMN, ako sa tu používa, znamená proces, pri ktorom interakcia GCF PMN s baktériami v sulku, parodontálnom chobote alebo parodontálnom tkanive vedie k tvorbe metabolitov, enzýmov a/alebo vedlajších produktov PMN.

Miera korelácie medzi rizikom vývoja aktívneho ochorenia a pomerom IgA/PMN markerov je závislá na tom, ktorý PMN marker je zvolený. Niektoré pomery IgA/PMN markerov sú ako odpoveď spoľahlivejšie ako iné. Markery PMN vhodné na meranie pre účely predmetu vynálezu zahrňujú tie, ktoré reprezentujú aktiváciu a degranuláciu PMN. Tieto obsahujú, ale bez obmedzenia, βglukuronidázu, hydrolytické enzýmy, elastázu, katepsiny (ako sú katepsín B/L a katepsín G), kolagenázu, enzým myeloperoxidázu a metabolity, ktoré zobrazujú častú aktiváciu PMN, ako sú leukotrieny (napr. LTB4 alebo LTC4). Výhodnými markermi PMN sú elastázy a β-glukuronidáza.

Pomer GCF markerov IgA/PMN možno odvodiť, medzi iným, vydelením celkového množstva GCF IgA prítomného vo vzorke GCF celkovým množstvom PMN markeru, ktorý je predmetom záujmu, prítomného vo vzorke GCF; vydelením celkového množstva GCF IgA prítomného v štandardnom alikvóte testovanej vzorky GCF celkovým množstvom GCF PMN markeru prítomného v štandardnom alikvóte testovanej vzorky CGF; vydelením koncentrácie GCF IgA prítomného v testovanej vzorke GCF koncentráciou GCF PMN markeru prítomného v testovanej vzorke GCF; alebo vydelením koncentrácie GCF IgA koncentráciou GCF PMN markeru.

Existujú rôzne metódy odberu GCF. Takéto metódy obsahujú medzi iným, metódu popísanú v Lamster, Hartley a Vogel Development of Biochemical Profile for Gingival Crevocular Fluid, J. Periodontology, 56 (Suppl.), 13-21, (1985) (ďalej Lamster II) . čo sa tu uvádza v literárnom odkaze. Použitím tejto uvedenej metódy odberu možno získať vzorku GCF.

Metódy merania GCF IgA

Existujú tiež rôzne spôsoby merania hladín IgA vo vzorkách GCF. Obsahujú (ale bez obmedzenia) testy využívajúce enzýmové imunosorbčné stanovenia (ELISA, enzýme linked immunosorbent assays) a rádioimunostanovenie (RIA) ako detekčné systémy.

Metódy merania GCF IgA pomocou ELISA sú popísané v Sengupta et al. , The Effect of Treatment on IgG, IgA, IgM and alpha-2-Macroglobulin in Gingival Crevicular Fluid front Patients with Chronic Adult Periodontitis, Árch. Oral. Biol. 33, # 6, pp. 425-431 (jún 1988) (ďalej Sengupta). uvedené tu ako literárny odkaz. Popísaná metóda a modifikácia ELISA metód používa záchytné protilátky voči ľudskému IgA, iné ako ľudské a výhodne iné ako od primátov; sú nimi preparáty polyklonálnych alebo monoklonálnych anti-IgA protilátok. Použitá záchytná protilátka je špecifická pre IgA a nedáva skríženú reakciu s ľudským IgG, IgM, IgE alebo IgD.

Táto záchytná protilátka je typicky viazaná buď na pevnú podložku, akou je mikrotitračná kultivačná platnička, alebo na časticovú matricu, ako je latex.

Počas inkubácie s testovanou vzorkou táto záchytná protilátka zachytáva GCF IgA bud zo vzorkového pufru, v ktorom bola vzorka GCF rozpustená, alebo priamo zo vzorky GCF ako takej, a zachytáva ju na pevnej podložke/časticovej matrici, použitej v predmetnom imunostanoveni. Zachytený IgA môže byť potom oddelený od ostatných zložiek vzorky GCF, obyčajne bud premytím povrchu, na ktorý je GCF IGA viazaný ako komplex, alebo filtrovaním časticového komplexu, na ktorý je zychytený IgA viazaný. Následne je komplex záchytnej protilátky a IgA vystavený enzýmovému konjugátu inej protilátky, ako je konjugát králičieho IgG s peroxidázou.

Tento konjugát protilátka-enzým využíva protilátku, ktorá je špecifická voči ľudskému IgA imunoglobulínu a nedáva skríženú reakciu so záchytnou anti-IgA protilátkou. Táto protilátka je konjugovaná/viazaná buď na chromogénny enzým (napr, chrenovú peroxidázu [HRP], alkalickú fosfatázu, βgalaktozidázu alebo glukozidázu) alebo na biotin. V prípade, keď komplex tvorí biotinylovaná protilátka a zachytený IgA, nasledujúca inkubácia je s enzýmovým konjugátom anti-biotinovej protilátky (pri použití napr. niektorého vyššie spomenutého chromogénneho enzýmu), alebo s konjugátom avidínu a chromogénneho enzýmu. Vyššie spomenuté komplexy záchytná protilátka-IgA-protilátka-chromogénny enzým môžu vystavené chromogénnemu substrátu príslušného byť potom pre daný konjugovaný enzým (napr. o-fenyléndiamín dihydrochlorid pre HRP resp. p-nitrofenylfosfát pre alkalickú fosfatázu). Zmes sa potom inkubuje vo vhodnom pufri, aby prebehla farebná reakcia, a výsledná absorbancia a/alebo intenzita je úmerná množstvu IgA viazaného na záchytnú protilátku (základy metodológie ELOSA viď Notermans S. et al., The Enzyme-Linked I mínu no s orbe nt Assay (ELISA) for the Detection and Determination of Clostridium botulinum Toxins A, B, and E_f METHODS IN ENZYMOLOGY 84, 223-238 (1984) (ďalej Notermans): Butler J. E., The Amplified ELISA: Princíples and Application for the Comparative Quantitation of Class and Subclass and Distribution of Antibodies and Antigens in Biochemical Separates, METHODS IN ENZYMOLOGY 73 483-523 (1981) (ďalej Butler); Sigma Immuno Chemicals Catalog 1992 (Sigma Chemical Company) (ďalej Sigma): Engvall E. et al., Enzýme linked Immunosorbent assay, ELISA, III. Quantitation of Specific Antibodies by Enzyme-Labeled Anti-Immunoglobulin in Antigén Coated Tubes, J. OF IMMUNOL. 109, 129-139 (1972) (ďalej Engvall): Kato K. et al., Enzyme-Linked immunoassay:

Conjugation of the FAB Fragment of Rabbit IgG with betaGalactosidase from E. coli and Its Use for Immunoassay, J. OF IMMUNOL. 116, 1554-1564 (1976) (ďalej Kato): a Guesdon J. L., Magnetic Solid Phase Enzýme Immunoassay for the Quantitation of Antigenes and Antibodies: Application to Human Immunoglobin E, METHODS IN ENZYMOLOGY 73, 471-482 (1981) (všetko zahrnuté ako literárne odkazy).

Vhodné záchytné protilátky, iné ako Iudské, sú antisérum z myši, králika, morčaťa a ovce (viď Sengupta a Butler)♦ Vhodné pevné podložky predstavujú polystyrén, filtračný papier, nitrocelulózu, nylon, feromagnetické guličky a CNBr-aktivovaný papier. Prednosť sa dáva polystyrénu a nitrocelulóze (viď Butler; Pappas M. G., Recent Application of the Dot-ELISA in Immunoparasitology, VET. PARASITOLOGY 29, 105-129 (1988);

Lehtonen O. P. et al., Antigén attachment in ELISA, J. IMMUNOL. METHODS 34, 61-70,(1980); Smith K. O. et al., Magnetic Transfer Devices for Use in Solid-Phase Radioimmunoassays and EnzymeLinked Immunosorbent Assays, J. INFECT. DIS. 136, S329-336 (1977); Hendry R. M. et al., Detection and Identification of Influenza Antigens by Nylon-Coupled Enzýme Linked Immuno Assay,

J. VIROL. METHODS 6, 9-17 (1983) (ďalej Hendry); Maiolini R. et al., Sandwich method of Enzymoimmunoassay. I. Application to Rat and Human alpha-Fetoprotein, J. IMMUNOL. METHODS 8, 223-234 (1975) a Samanta A. K. et al., Enzýme Immunoassayl of Testosterone Using Nitrocellulose Discs as the Solid Phase, J. CLIN. CHEM. BIOL. 28, 943-947 (1990), všetko zahrnuté v literárnych odkazoch).

Časticové matrice, ktoré môžu byť použité, sú polystyrén, latex, nylon, magnetické guličky, sklo, agaróza a sefaróza. Prednosť sa dáva časticiam polystyrénu a latexu (viď Nilsson B., A General Reagent f or Amplyfiyng ELISAs, J. IMMUNOL.METHODS 114, 89-93 (1988); Hendry; Gunderson S. G., Magnetic Bead Antigén Capture, Enzyme-Linked Immunoassay in Microtitre Trays for Rapid Detection of Schistosomal Circulating Anodic Antigén, J. IMMUNOL. METHODS 148, 1-8 (1992); Oku Y., Development of Highly Sensitive Bead-ELISA to Detect Bacterial Protein Toxins, MICROBIOL. IMMUNOL. 32, 807-816, (1988) a Harada T. et al., Detection of Mucosal and Sérum Antibodies for the Capsular Polysaccharide of Heamophilus influenza Type B Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, MICROBIOL. IMMUNOL. 29, 591-600, (1985); a Sigma, všetko zahrnuté v literárnych odkazoch).

Vhodné páry konjugátu protilátka-enzým a záchytnej protilátky môžu obsahovať myšie, ovčie a králičie protilátky IgG alebo IgM izotypy proti ludským IgA, konjugované na chrenovú peroxidázu (HRP), alkalickú fosfatázu, β-galaktozidážu alebo glukozidázu, alkalickú pyrofosfatázu alebo ureázu (viď Sigma; Notermans; Butler; Kato; Emgvall; a Cerrone M.C., Description of a UreaseBased MicroELISA for the Analysis of Limitíng Dilution Microcultures, J. IMMUNOL. METHODS 138, 65-75 (1991) (ďalej Cerrone). uvedené v odkazoch).

Vhodné chromogénne substráty na použitie s konjugovanou HRP, alkalickou fosfatázou a ureázou sú o-fenyléndiamín dihydrochlorid, p-nitrofosfát resp. močovina plus pH indikátor (viď Notermans; Butler; Cerrone a Sigma).

Príslušné pufre na použitie v predmete vynálezu obsahujú medzi iným, fosfátom (0.001 - 1 M) pufrovaný (pH 6.6 - 7.4) solný roztok (0.10 - 0.20 N NaCl) s Tweenom (0.01 - 0.1 %), napr. PBST. Výhodný je PBST pufer, ktorý obsahuje 0.01 M fosfátový pufer pH 7.01 v 0.15 N solnom roztoku s obsahom 0.05 % Tweenu.

ELISA pri použití v predmete vynálezu môže tiež prebiehať v roztokoch, kde na zistenie prítomného IgA sú vizuálne sledované reakcie sprevádzané zmenou farby. Takéto reakcie sprevádzané zmenou zafarbenia môžu prebiehať pri použití chromogénnych enzýmov ako je chrenová peroxidáza, alkalická fosfatáza a ureáza, a môžu byť tiež spojené s fluorogennými substrátmmi (viď Notermans; Butler; Sigma a Magnusson K. E. et al. _f Fluorescence/Linked Inonunosorbent Assay (FLISA) f or Quantitation of Antibodies to Food Antigens, IMMUNOL. INVEST. 16, 227-240 (1987), včlenené do literárnych odkazov).

Tieto stanovenia so zmenou zafarbenia sa môžu používať spolu s kvantitatívnym stanovením spektrofotometrickými spôsobmi, alebo prostredníctvom vizuálneho stanovenia. Tieto stanovenia predstavujú použitie PBST roztokov, ktoré obsahujú jeden z konjugátov enzým-protilátka a jeho príslušný chromogénny substrát. Zmena zafarbenia týchto roztokov môže byť porovnávaná podía tabulky, ktorá sa skladá z farebných štandárd zodpovedajúcich zmenám zafarbenia spojených s konkrétnymi koncentráciami IgA v štandarných testovaných vzorkách. Priradením zmeny zafarbenia k príslušnej farebnej štandarde sa určí hladina IgA v testovanej vzorke.

Príslušné chromogénne substráty hore spomínaných konjugátov protilátok môžu obsahovať o-fenyléndiamín dihydrochlorid, keď sa používa chrenová peroxidáza, pnitrofosfát, keď sa používa alkalická fosfatáza a močovina plus pH indikátor, keď sa používa ureáza.

Skupinu farebných štandárd možno pripraviť pomocou kolorimetrických testov pre štandardné testované vzorky s obsahom známeho rozsahu koncentrácií IgA a identifikáciou farebných štandárd, ktoré im zodpovedajú intenzitou alebo absorbciou.. Tieto farebné štandardy môžu byť potom usporiadané do tabulky, ktorá obsahuje rozsah intenzít/absorbcií, ktoré zodpovedajú širokej škále koncentrácií IgA pravdepodobne sa vyskytujúcich v testovaných vzorkách.

Tieto imunostanovenia môžu byť spojené s podložkami v pevnej fáze, guliôkami, gélmi, inými časticami alebo filtrami, u ktorých sa na podložke v pevnej fáze zachytáva konečný produkt so zmenou zafarbenia.

Časticové matrice, ktoré môžu byť použité, predstavujú polystyrén, latex, nylon, magnetické guličky, sklo, agarózu a sefarózu. Prednosť sa dáva časticiam polystyrénu a latexu.

Tak ako pri stanoveniach vo vzorkách popísaných vyššie, vizuálne kvantitatívne stanovenie hladín GCF IgA sa prevedie porovnaním intenzity kolorimetrickej reakcie pre vzorku GCF so sériou farebných štandárd reprezentujúcich rôzne hladiny GCF IgA.

Sériu farených štandárd možno pripraviť pomocou série kolorimetrických testov pre štandardné testované vzorky obsahujúce známy rozsah koncentrácií IgA a identifikáciou farebných štandárd, ktoré in zodpovedajú intenzitou alebo absorbciou. Tieto farebné štandardy môžu byť potom usporiadané do tabulky, ktorá obsahuje rozsah intenzít/absorbcií, čo zodpovedá širokému rozsahu koncentrácií IgA pravdepodobne sa vyskytujúcich v testovaných vzorkách.

Inou metódou merania množstva IgA v testovaných vzorkách odvodených od GFC je rádioimunostanovenia (RIA, radioimmunoassay). Príklad tejto metódy je popísaný v Nerenberg a Prasad Methods in Enzymology, 73, IMMUNOCHEMICAL TECHNIQUES PART B, 666-691 (1981), včlenené do odkazov.

Metódy merania GCF markerov PMN

Markery pre prítomnosť aktivovaných PMN predstavujú β-glukuronidázu, hydrolytické enzýmy elastázu, katepsíny (ako sú katepsín B/L a katepsín G), kolagenázu, enzým myeloperoxidázu a metabolity, ktoré zobrazujú skoré aktivačné deje PMN, ako sú leukotriény (napr. LTB4 alebo LTC4).

BG možno merať rôznymi metódami, ktoré predstavujú, ale bez obmedzenia, kolorimetricke a fluorometrické metódy.

Kolorimetrické metódy na meranie BG sú popísané v Lamster

II. Tieto kolorimetrické stanovenia používajú meranie uvolnenia fenolftaleinu z kyseliny fenolftalein-glukurónovej. Tieto stanovenia môžu byť používané na určenie hladín GCF BG ako kvantitatívne, napríklad prostredníctvom spektrofotometrie, tak prostredníctvom vizuálneho stanovenia.

Hladiny GCF BG môžu byť stanovené prostredníctvom spektrofotometrie pridaním alikvótu (50 μΐ) testovanej vzorky k 100 μΐ roztoku 0.075 M acetátového pufru pri pH 4.5, 50 μΐ 0.15 M solného roztoku NaCl, a 50 μΐ 0.03 M kyseliny fenolftalein-glukurónovej pri pH 4.5 a inkubáciou pri 56 °C po dobu 2 hodín. Reakcia je ukončená pridaním 350 μΐ 0.1 M 2amino-2-metyl-l-propanolového pufru pri pH 11. Meria sa absorbancia pri 550 nm oproti blanku činidiel a porovnáva sa s fenolftaleinovou štandardnou krivkou. Výsledky sa používajú na výpočet hladiny BG prítomnej v každej vzorke GCF.

Hladiny GCF BG môžu byť určené prostredníctvom vizuálnych stanovení modifikáciou spektrofotometrických stanovení uvedených vyššie. Konkrétne môže byť testovaná vzorka analyzovaná ako vyššie až po pridaní 2-amino-2-metyl-lpropanolového pufru, vrátane. V tomto čase je absorbancia/ intenzita vizuálneho zafarbenia porovnávaná so zafarbením v tabulke, reprezentujúca zafarbenie v rozsahu BG štandardnej krivky. Priradenie absorbanie/intenzity vizuálneho zafarbenia vzorky ku štandardnej krivke ukazuje hladinu BG v testovanej vzorke GCF.

Ďalšou modifikáciou hore uvedeného testu je náhrada kyseliny fenolftalein-glukurónovej chromogénnym substrátom p-nitrofenyl-S-glukuronidom. V tomto prípade môže slúžiť uvolnenie žltého zafarbenia, ktoré nasleduje po hydrolýze katalyzovanej BG, ako miera hladiny BG v testovanej vzorke.

GCF BG môže byť tiež kvyntif ikovaná pomocou fluorometrických stanovení, ako je popísané v Pope et al., J. DENTAL RESEARCH 70, Abstract 704, apríl 1991, zavedené tu do odkazov. Fluorometrické stanovenia predstavujú spektrofotometrické/vizuálne meranie uvolnenia fluorescenčného vedlajšieho produktu z fluorescenčnej molekuly derivátu kyseliny Sglukurónovej. Fluorometrické stanovenia BG boli vyvinuté pre iné použitia. Takéto stanovenia sú popísané v Papasian et al.,

Rapid Identif ication of Escherichia coli with a Fluorogeníc beta-Glucuronidase Assay, DIAG. MICROBIOL.INFECT. DIS. 8 (4), 255-258 (december 1988), začlenené do odkazov. Tieto techniky môžu byť upravené na detekciu BG v GCF náhradou kyseliny fenolftalein-glukurónovej f luorogénnym prekurzorom substrátu 4metylumbiliferyl-S-D-glukuronidom a následným určením hladiny BG podía množstva fluorescenčného vedľajšieho produktu, 4metylumbiliferónu, uvoľneného BG počas inkubácie, ako je popísané v Lamster II. Hladina uvoľneného fluorescenčného vedľajšieho produktu je stanovená expozíciou reakčnej zmesi na 360 nm UV svetlo a porovnávaná voči intenzite fluorescencie vykazovanej štandardnou krivkou s fluorescenciou rôznych testovaných vzoriek obsahujúcich známe koncentrácie BG.

Hladiny GCF BG môžu byť tiež stanovené použitím záchytného enzýmového stanovenia. Príklady takýchto technik sú popísané v Holt et al., Enzýme Capture Assay f or Rapid Detection of Eschericha coli in Oysters, APPL. ENVIR. MICROBIOL. 55 (1),

229-232 (január 1989), zavedené tu v odkazoch. Použitie tejto techniky na detekciu GCF BG v testovaných vzorkách sa uskutoční prípravou preparátov protilátok proti ľudskej BG (na rozdiel od E. coli BG) a prichytením preparátu protilátky proti ľudskej BG na mikrotitračnú platničku alebo iný vhodný povrch. Následne sa pridávajú testované vzorky a tieto sú inkubované ako v Lamster II.

Hladiny GCF elastázy môžu byť stanovené rôznymi metódami, ktoré obsahujú (ale bez obmedzenia) kolorimetrické stanovenia, ELISA a fluorometrické metódy. Typicky tieto stanovenia obsahujú uvoľnenie chromogénnej alebo fluorogénnej zlúčeniny z derivatizovaného peptidu, ktorý je špecificky hydrolyzovaný elastázou.

Kolorimetrické a fluoprimetrické stanovenia môžu byť použité na kvantitatívne stanovenie hladín GCF elastázy napr. spektrofotometrickými prostriedkami a prostredníctvom vizuálneho stanovenia.

Fluorometrické stanovenia obsahujú spektrofotometrické/ vizuálne merania uvoľňovania fluorescenčného vedľajšieho produktu z peptidyl- derivátu fluorescenčnej molekuly. Rôzne fluorometrické metódy merania hladín GCF elastázy sú popísané v Cox S. W. a Eley B.M., Detection of Cathepsin B- and L-, Elastase-, Tryptase-, Trypsin-, and Dipeptidyl Peptidase IVlike Activities in Crevicular Fluid Írom Gingivitis and Periodontitis Patients with Peptidýl Derivatives of 7-Amino-4Trifluoromethyl Coumarin, J. PERIO. RES. 24, 353-361 ( 1989) (ďalej Cox I) a v Cox S. W. et al. , A Simple, Combined Fluorogenic and Chromogenic Method for the Assay of Proteases in Gingival Crevicular Fluid, J. PERIO. RES. 25, 164-171 (1990) (ďalej Cox II). obe začlenené do odkazov.

Vhodné kolorimetrické metódy merania hladín PMN elastázy vo vzorkách GCF sú popísané v Cox II. Asman B., Peripheral PMN cells in Juvenile Periodontitis: Increased Release of Elastase and Oxygen Radicals after Stimulation with Opsonized Bacteria, J. CLIN. PERIODONTOL. 15, 360-364, (1988) (ďalej Asman). a

Kramer et al., Measurement of Free Human Leukocyte Elastase/ alpha-1 Proteinase Inhibítor Complexes by an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, J. IMMUNOLOGICAL METHODS 131, 41-48 (1990) (ďalej Kramer). Suomalainen K., Characteristics of Neutrál Proteases in Inflamed Human Gingiva, SCAND. J. DENT. RES. 97, 346-354 (1989) (ďalej Suomalainen) a v Palcamis, všetko uvedené tu v odkazoch.

Stanovenie pomeru GCF IgA/PMN-marker

Pomer GCF IgA/PMN-marker môže byť vypočítaný buď pre pacienta alebo miesto. Na stanovenie hladín pre jednotlivého pacienta sú hladiny GCF IgA a PMN-markera pre každú vzorku GCF z každého miesta, o ktoré je záujem a pomer GCF IgA/PMN-marker je potom určený pre každú vzorku GCF z každého miesta. Následne môže byť vypočítaná stredná hodnota pomerov GCF IgA/PMN-marker zo všetkých testovaných miest ústnej dutiny, čo dáva pomer GCF IgA/PMN-marker pre daného pacienta.

Absolútna hodnota pomeru GCF IgA k PMN-markeru je funkciou konkrétneho merania PMN-markera, použitého detekčného systému a jednotiek používaných na vyjadrenie výsledkov. GCF IgA môže byť vyjadrený hmotnosťou IgA prítomného v GCF (napr. ng/vzorka), celkovým počtom ELISA jednotiek (napr. jednotiek absorbancie) na vzorku, RIA jednotkami na vzorku, alebo číselným výsledkom na štandardnej stupnici pre vizuálne ELISA stanovenia. PMN-markery, napr. BG alebo elastáza, môžu byť vyjadrené v enzýmových jednotkách/vzorku, v absorbčných jednotkách spektrofotomretrického stanovenia, v jednotkách fluorescencie alebo ako čísený výsledok na štandardnej stupnici pre vizuálne záchytné enzýmové stanovenie. Použitie IgA ELISA jednotiek, ako sú jednotky absorbancie, bude poskytovať iné absolútne hodnoty pomeru GCF IgA/BG ako by poskytlo použitie nanogramov IgA na vzorku. Takto musí byť každé prevedenie predmetu vynálezu kalibrované ku konkrétnym hodnotám používaným na vyjadrovanie detegovaných hladín IgA/PMN-markerov.

Kalibrácia pomeru GCF IgA/PMN-marker

Štandardy, voči ktorým môžu byť výsledky merania koncentrácií IgA a PMN-markeru porovnávané možno stanoviť prostredníctvom klinických testov. Jednou metódou odvodenia štandardy je dlhodobé hodnotenie populácie normálnych zdravých pacientov a parodontitických pacientov čo do korelácie ich príslušných pomerov GCF IgA/PMN-marker s nasledujúcimi zmenami ich klinických parametrov. Pre dané konkrétne prostriedky kvantifikácie koncentrácií GCF IgA a PMN-markerov môžu byť, s volnosťou pre stanovenie štatistickej odchýlky, pomery IgA/PMNmarker získané v týchto populáciách používané na kategorizáciu určitého rozsahu pomerov ako prislúchajúcich nízkemu, miernemu alebo vysokému riziku aktívnej parodontitídy.

Do štúdie môžu byť zahrnuté skupiny parodontiticky zdravých pacientov (napr. bez chobotov väčších ako 4 mm do hĺbky a bez miest majúcich väčšiu ako 2 mm stratu úponu) a skupiny dospelých parodontických pacientov. Výhodne je v každej skupine najmenej 10 pacientov; výhodnejšie 40 pacientov v každej skupine. Vzorky GCF sa odoberajú u každého pacienta z viacerých vopred určených testovacích miest, výhodne najmenej z dvoch na jedného pacienta. Výhodnejšie sa vzorky odoberajú néjmenej zo 4 miest na pacienta. Hladiny GCF IgA a PMN-markera sú potom určené jedným alebo viacerými konkrétnymi stanoveniami ako sú popísané vyššie, alebo inakšie. Zhromaždia sa potom základné klinické merania, ako úroveň parodontálneho úponu alebo výška alveolárnej kosti, pre každé konkrétne miesto v ústach každého pacienta. Pacienti môžu dostať bežne parodontálne udržovacie ošetrenie, ako odstránenie povlaku a masáž koreňov a sú inštruovaní, aby dodržovali bežné návyky orálnej hygieny počas štandardného časového obdobia, výhodne po asi 6 až asi 12 týždňov. Po určitom časovom období sú všetci pacienti znovu zavolaní a sú stanovené príslušné hladiny straty úponu. Pacienti a miesta vykazujúce zmysluplnú hladinu postupu ochorenia sa označia ako pacient/miesto s aktívnym ochorením. Zmysluplné hladiny postupu ochorenia možno doložiť väčšou stratou, ako najmenej v jednom mieste viac ako 2 mm straty úponu, alebo preukázateľnou hladinou straty kosti (t.j. stratou väčšou ako štatistická chyba techniky merania). Na určenie štandardy, voči ktorej sa porovná hodnota pomeru jednotlivého pacienta, sa potom vypočítajú stredné hodnoty [mean] pomerov IgA/PMN-marker pre skupinu pacientov, u ktorých sa vyvinulo aktívne ochorenie a skupinu, u ktorej sa aktívne ochorenie nevyvinulo.(Ďalej sa na tieto hodnoty odkazuje ako na stred aktívnej skupiny resp. stred neaktívnej skupiny). Rozdiel medzi stredom neaktívnej skupiny a stredom aktívnej skupiny musí byť väčší ako je súčet ich štandardných odchýliek, aby štandardy boli platné. Na určenie štandardy, voči ktorej sa porovná hodnota pomeru jednotlivého miesta, sa tiež vypočítajú stredné hodnoty pomerov IgA/PMN-marker miest, v ktorých sa vyvinulo aktívne ochorenie a miest, v ktorých sa aktívne ochorenie nevyvinulo (dalej sa na tieto hodnoty odkazuje ako na stred aktívnych miest resp. stred neaktívnych miest). Rozdiel medzi stredom neaktívnych miest a stredom aktívnych miest musí byť väščí ako súčet ich štandardných odchýliek aby štandardy boli platné.

Po tom, keď sa použijú rovnaké metódy na stanovenie IgA a PMN-markera, každý pacient, ktorého stredná hodnota pomeru IgA/PMN-marker pre celé ústa je vyšší ako jedna štandardná odchýlka pod stredom neaktívnej skupiny, je zaradený ako pacient s malým rizikom. Podobne pacienti, ktorých stredná hodnota pomeru IgA/PMN-marker je nižšia ako jedna štandardná odchýlka nad stredom aktívnej skupiny sú zaradení ako pacienti s vysokým rizikom. Tí pacienti, ktorých stredná hodnota pomeru

IgA/PMN-marker zapadá medzi jednu štandardnú odchýlku nad stredom aktívnej skupiny a jednu štandardnú odchýlku pod stredom neaktívnej skupiny sú zaradení ako pacienti s miernym rizikom.

Podobne, ked sa použijú rovnaké metódy stanovenia IgA a PMN-markera ako na stanovenie stredov aktívnych a neaktívnych miest, každé miesto, ktorého hodnota pomeru IgA/PMN-marker je vyššia ako jedna štandardná odchýlka pod stredom neaktívnych miest, je zaradené ako miesto s malým rizikom a každé miesto, ktorého hodnota pomeru IgA/PMN-marker je nižšia ako jedna štandardná odchýlka nad stredom aktívnych miest je zaradené ako miesto s vysokým rozokom. Tie miesta, ktorých stredná hodnota pomeru IgA/PMN-marker zapadá medzi jednu štandardnú odchýlku nad stred aktívnych miest a jednu štandardnú ochýlku pod stredom neaktívnych miest, sú zaradené ako miesta s miernym rizikom.

Diagnostické súpravy

Predmet patentu sa týka tiež diagnostických výrobkov užitočných na detekciu alebo hodnotenie rizika súčasného alebo neskoršieho vývoja aktívnej parodontitídy u Iudí alebo nižších živočíchov. Tieto diagnostické výrobky predstavujú prostriedky na meranie množstva IgA a prostriedky na meranie množstva PMN-markera prítomných v gingiválnej sulkulárnej tekutine v jednom alebo na viacerých miestach ústnej dutiny človeka alebo nižšieho živočícha, u ktorého sa robí diagnóza.

Príkladom takýchto diagnostických výrobkov sú diagnostické súpravy užitočné na detekciu alebo hodnotenie rizika postupu ochorenia pre pacientov alebo miesta u Iudí alebo nižších živočíchov.

Diagnostická súprava používaná na určenie pomeru IgA/PMNmarker pre pacientov/miesta obsahuje materiály potrebné na stanovenie prítomnosti IgA a určitého PMN-markera.

Na spektrofotometrickú ELISA analýzu je potrebné vybaviť súpravu prostriedkami na odber jednej alebo viac vzoriek GCF, aby bolo možné uskutočniť meranie hladín GCF IgA a PMN-markera. Pre tento účel môže súprava obsahovať vopred vystrihnuté kúsky filtračného papiera, kapilárne trubičky, kapilárne pipety, mikropipety, činidlá na prepláchnutie gingiválneho sulku (napríklad špecifické protilátky naviazané na častice, gély alebo magnetické častice na odobratie IgA alebo BG zo sulku).

Na analýzu IgA môže súprava obsahovať nádobky, skúmavky, kultivačné skúmavky, flaštičky s činidlami a mikrocentrifugačné skúmavky s obsahom pufrovacieho solného roztoku, ktorý obsahuje potrebné činidlá, a/alebo používané na prípravu testovaných vzoriek a realizáciu testov na detekciu prítomného GCF IgA. Tieto zložky môžu obsahovať fosfátom pufrovaný soľný roztok s Tweenom, obsahujúci fosfát (0.001 - 1 M) pufrovaný na pH = 6.6 - 7.4, NaCl (0.10 - 0.20 N) s Tweenom (0.01 - 10 %), t.j. PBST, a roztoky PBST s obsahom potrebných činidiel a chromogénnych substrátov. Výhodne PBST obsahuje 0.01 M fosfátový pufer (pH 1.01), soľ (0.15 N NaCl) a 0.05 % Tween.

Diagnostické súpravy môžu tiež obsahovať inkubačné nádobky, v ktorých prebieha stanovenie. Medzi vhodné inkubačné nádobky môžu byť zaradené skúmavky, kultivačné skúmavky, kyvety a mikrotitračné platničky. Výhodné inkubačné nádobky sú mikrotitračné platničky. Ešte výhodnejšími inkubačnými nádobkami sú 96 miestne polystyrénové mikrotitračné platničky, ako Nunc Immunoplate 1 (Roskilde, Dánsko).

Diagnostická súprava môže tiež obsahovať prostriedok na zachytenie IgA z testovanej vzorky a na jej udržanie na dne mikrotitračného otvoru počas priebehu ELISA, ako je napr. antisérum. Vhodné antiséra môžu obsahovať záchytné” protilátky proti ľudskému IgA, iné ako ľudské, ako sú preparáty polyklonálnych alebo monoklonálnych anti-IgA protilátok, ktoré sú špecifické pre IgA a nedávajú skríženú reakciu s ľudským IgG, IgM, IgE alebo IgD. Výhodne je antisérum iného pôvodu ako od primátov, výhodnejšie je ovčie antisérum proti ľudskému IgA. Ešte výhodnejšie je ovčie IgG antisérum voči ľudskému IgA a pufer uhličitanu/hydrouhličitanu sodného, výhodne 0.1 M pufer s pH 9.6. Inkubácia záchytnej protilátky v hydrogénuhličitanovom pufri v mikrotitračnéj platničke po 48 hodinách pri 4 ’C umožní prichytenie záchytnej protilátky ku dnu otvorov mikrotitračnéj platničky.

Do diagnostickej súpravy môže byť potrebné pridať derivatizované antisérum, aby sa umožnila detekcia IgA zadržaného záchytnou protilátkou. Výhodne je derivatizované antisérum rovnakého druhu ako neznačené antisérum, spomenuté vyššie. Vhodné značenie môže predstavovať enzýmové značenie (ako je chrenová peroxidáza, alkalická fosfatáza a ureáza), značenie biotinom, rádioaktívne značenie a fluorescenčné značenie. Výhodným antisérom je chrenovou peroxidázou označený IgG proti ludskému IgA.

Ked súprava obsahuje biotinom značené anti-IgA antisérum, musí byť prítomný tiež konjugát avidin-značka v PBST pufre. Tento konjugát avidin-značka sa špecificky viaže na biotin a umžňuje detekciu biotinom značeného anti-IgA antiséra viazaného v komplexe s IgA a záchytnou protilátkou. Vhodné značenie avidínu v konjugáte predstavuje enzýmové značenie (ako je chrenová peroxidáza alebo alkalická fosfatáza), rádioaktívne značenie a fluorescenčné značenie. Výhodným konjugátom avidinznačka je konjugát avidin-značka, výhodnejším konjugát avidínchrenová peroxidáza.

Na umožnenie detekcie komplexu IgA-záchytná protilátka, prostredníctvom tvorby viditelného chromoforu, môže diagnostická súprava obsahovať pufer s obsahom chromoforového systému. Vhodné pufre predstavujú acetátový a citrátový pufer. Vhodné chromoforové systémy sú orto-fenyléndiamín, p-nitrofosfát. Ked pufer obsahuje orto-fenyléndiamín, môže pufer obsahovať tiež asi 0.01 až asi 1 % peroxidu vodíka.

Na udržanie pH v rozsahu, ktoré je konzistentné s optimálnou funkciou enzýmu ludského PMN-markera, môže diagnostická súprava obsahovať pufer. Vhodné pufre sú pufre s pKa v rozsahu 0.5 pH jednotiek od 4.9, ako je acetátový pufer. Vhodný je pufer octanu sodného. Ked sa používa acetát, výhodnou je koncentrácia od asi 0.01 M do asi 0.5 M. Výhodné pH pufru je od asi 4.5 do asi 5.5. Výhodnejšie je pH asi 4.9.

Diagnostická súprava môže obsahovať protilátku proti ludskej β-glukuronidáze, ktorá môže byť viazaná na polystyrén alebo inú pevnú podložku., ako je filtračný papier, nitrocelulóza, gély, mikrokapsule alebo guličky. Výhodne je protilátka proti ludskej BG viazaná na polystyrén a výhodnejšie je viazaná na polystyrénovú mikrotitračnú platničku.

Na detekciu prítomnosti íudskej BG môže diagnostická súprava obsahovať tiež chromogénny substrát pre ľudskú BG. Takéto substráty sú konjugáťy kyseliny β-D-glukurónovej, ako sú kyselina fenolftalein-glukurónoná a 4-metylumbeliferyl-fi-Dglukuronid. Výhodným substrátom je kyselina fenolftaleinglukurónová. Ked je prítomná, kyselina fenolftalern-glukurónová sa dodáva vo forme roztoku s pH od asi 4.5 do asi 5.5.

Diagnostická súprava môže tiež obsahovať solný roztok na premývanie činidel z ELISA[platničiek medzi inkubačnými krokmi pri ELISA stanovení IgA. Vhodné premývacie roztoky sú fosfátom pufrovaný solný roztok s Tweenom.

Roztok HC1 sa môže pridávať k ELISA reakciám na ich zastavenie pred spektrofotometrickým odčítaním absorbancie. Preto môže súprava tiež obsahovať roztok HC1, ktorý sa použije na zastavenie ELISA testu; Výhodná koncentrácia HC1 v roztoku je asi 0.1 M.

Pre účel zastavenia BG testu môže byť užitočné pridať pufer. Vhodné pufre obsahujú aminoalkoholy, ako 2-aminoi alkoholy. Výhodným pufróm je 2-amino-2~metyl-l-propanol. Výhodne je pufer vo vodnom' roztoku v koncentrácii od asi 0.01

M do asi 1 M; výhodnejšia je koncentrácia asi 0.1 M. Výhodne má í

pufer pH od asi 9 do asi 13; výhodnejší je pufer s pH asi 11.

Môže byť užitočné ίpridať do diagnostickej súpravy i

štandardné krivky pre príslušné stanovenie. Takéto štandardné krivky môžu byť používané na konverziu výslekov stanovenia IgA resp. PMN-markerov, ktoré sa získajú v jednotkách, ako sú absorbančné jednotky alebo intenzita zafarbenia, na hladiny IgA a PMN-markera v testovaných vzorkách. Výsleky v jednotkách príslušného stanovenia (napr. absorbančné jednotky alebo intenzita zafarbenia) môžu byť teda vyjadrené ako funkcie hladiny alebo koncentrácie (napr. mg/ml alebo /4g//xl IgA alebo jednotky/ml aktivity PMN-markera). Štandardné krivky sa môžu získať prípravou štandarných testovaných roztokov reprezentujúcich úplný rozsah koncentrácií IgA a PMN-markera v GCF, následným testovaním týchto štandardných roztokov príslušnými kolorimetrickými stanoveniami IgA a PMN-markera a grafickým znázornením výslekov. Takýmto grafickým vyjadrením môže byť vynesenie príslušných hodnôt absorbancií pre štandardné testované roztoky, ktoré sú výslekom príslušných stanovení, oproti koncentráciám buď IgA alebo PMN-markera, ktoré sú určené hladinami pridanými do príslušných testovaných vzoriek.

Príklady realizácie vynálezu

Metódy a príklady diagnostických súprav

Nasledovné neobmedzujúce príklady objasňujú reprezentatívne metódy a realizáciu diagnostických súprav podlá koncepcie predmetu vynálezu.

Príklad 1

Nasledovný príklad je reprezentatývnym príkladom metódy predmetu vynálezu.

Spektrofotometrický spôsob merania rizika aktívneho ochorenia obsahuje počiatočný odber vzoriek GCF zo 16 - 20 miest u parodontitického pacienta. Odber sa robí tak, ako je popísané v Lamster II.

Následná spektrofotometrická analýza hladiny GCF IgA sa robí tak, ako je popísané v Sengupta; analýza GCF BG sa robí spôsobmi popísanými v Lamster II. Potom sa vypočíta pomer IgA/miesto (napr. ng IgA na GCF odobratý za 30 sekúnd) a priemer BG/miesto (napr. jednotky BG aktivity na GCF odobratý za 30 sekúnd). Potom sa vypočíta stredná hodnota pomeru IgA/BG pre každého pacienta (t.j. pre každý subjekt (priemer IgA/miesto)/priemer BG/miesto).

Takto napríklad sa odoberie GCF od pacienta MG spôsobom popísanom vyššie a u tohoto pacienta je stanovené, že priemer IgA/vzorka GCF/miesto je 45 ng a priemer BG/vzorka GCF/miesto je 2.3 jednotky. Potom sa vypočíta, že stredná hodnota pomeru IgA/BG pre pacienta MG je 19.6.

Pri použití spektrofotometrickej metódy rovnakej ako klinická štúdia, sa ukázalo, že pacienti, s už vyvinutou aktívnou parodontitídou, majú strednú hodnotu pomeru IgA/BG 21.1 ± 7.2, zatialčo pacienti, u ktorých nedošlo k žiadnej strate úponu, majú strenú hodnotu pomeru IgA/BG 125.2 ± 46.6.

Pri použití výslekov klinickej štúdie ako štandardy a porovnaním výsledkov pomeru pacienta MG oproti tejto štandarde je pomer IgA/BG pacienta MG menší ako jedna štandardná odchýlka nad stredom týchto subjektov, u ktorých sa vyvinula aktívna parodontitída. Preto je u MG vysoké riziko ( > 80 %-ná pravdepodobnosť) vývoja aktívnej parodontitídy.

Príklad 2

Nasledovný príklad je iný reprezentatívny príklad metódy predmetu vynálezu: vizuálna kvantifikačná metóda pre IgA a BG.

GCF sa odoberie podía metódy Lamster II; analýza GCF IgA sa urobí podía metódy Senqupta s tou výnimkou, že chromatografická reakcia je hodnotená porovnaním zmeny zafarbenia reakčnej zmesi so sadou intenzít zafarbenia príslušiacich k určitému rozsahu koncentrácií GCF IgA.

Analýza GCF BG sa urobí spôsobmi popísanými v Lamster II s tou výnimkou, že hladiny BG sa vyhodnotia porovnaním zmeny zafarbenia reakčnej zmesi so sadou farebných štandárd reprezentujúcich intenzity chromogenických reakcií BG pre sadu hladín GCF BG zistených v ludskom GCF.

Štandardy zafarbenia, oproti ktorým sú zmeny zafarbenia porovnávané, sa získajú pomocou IgA ELISA a enzýmového stanovenia BG so sadou testovaných vzoriek. Každá vzorka obsahuje inú známu koncentráciu IgA a BG a táto sada spolu reprezentuje široký rozsah koncentrácií IgA a BG. Ku chromogénnej reakci pre každú príslušnú vzorku sú potom priradené jednotlivé roztoky obsahujúce príslušné farbivá pre vytvorenie sady roztokov s rovnakým zafarbením ako testované vzorky IgA a BG, výsledkom čoho je sled farebných roztokov, reprezentujúcich rôzne koncentrácie IgA a BG. Táto sada roztokov je štandardou intenzity zafarbenia, oproti ktorej mmožno porovnávať výsleky stanovenia chromogénnych farebných reakcií vzoriek GCF odobraných od pacientov, u ktorých sa má hodnotiť riziko.

Pomer IgA/BG sa určuje priradením intenzít zafarbenia zo stanovenia IgA a BG v GCF vzorkách podía farebných štandárd na základe usporiadanej tabulky, ktorej os Y reprezentuje stúpajúce koncentrácie BG zistené v ludskom GCF a ktorej os X reprezentuje stúpajúce koncentrácie IgA. Bod v usporiadanej tabulke, určený podía hodnôt osi X a Y, spadá do oblasti, pre ktorú je určené vysoké, mierne alebo nízke riziko; plocha trojuholníka priliehajpca k osi Y, reprezentujúca nízky pomer IgA/BG, predstavuje vyššie riziká.

Príklad 3

Nasledovný príklad je reprezentatívny príklad súpravy podía predmetu vynálezu.

Spektrofotometrická súprava pre anlýzu IgA/BG je navrhnutá na použitie s obsahom mikrotitračných platničiek a spektrofotometrom na odčítanie výsledkov stanovení.

Na odber GCF obsahuje súprava 20 vopred vystrihnutých páskov filtračného papiera.

Na analýzu GCF IgA súprava obsahuje: 20 mikrocentrifugačných skúmaviek s obsahom PBST (0.01 M fosfátový pufer pH 7.01, soľný roztok 0.15 N NaCI a 0.05 % Tween); 50 ml premývacieho roztoku PBST; 4 mikrotitračné platničky; 10 ml ovčieho antiséra proti Iudskému IgA riedeného 1 : 256 000 v uhličitanovom/hydrogénuhličitanovom pufre s pH 9.6; 10 ml peroxidázou označenú protilátku proti Iudskému IgA v riedení 1 : 4 000 v PBST pufre; 10 ml 0.1 M citrátového pufru s obsahom 30 mg % orto-fenyléndiamínu s percentami peroxidu vodíka; 10 ml 0.1 M roztoku HC1 a štandardnú krivku pre stanovenie IgA.

Na stanovenie BG súprava obsahuje: 10 ml 0.075 M acetátového pufru s pH 4.9; 5 ml 0.03 M roztoku kyseliny fenolftalein-glukurónovej, pH 4.5; 5 ml 0.15 N NaCI solného roztoku; 50 ml 0.1 M 2-amino--2-metyl-l- propanolového pufru s pH 11 a štandardnú krivku pre stanovenia BG.

Súprava naviac obsahuje usporiadanú tabulku, ktorej os X je kalibrovaná na reprezentáciu stúpajúcich hladín IgA a os Y, ktorá je kalibrovaná na reprezentáciu stúpajúcich hladín BG zistených v ludskom GCF, a obsahujúca vyznačené oblasti, pre ktoré príslušné osi IgA a BG určujú body vo vnútri vyznačených oblastí, reprezentujúce riziko vysokej, miernej alebo nízkej kategórie.

Príklad 4

Nasledovný príklad je iný reprezentatívny príklad súpravy podía predmetu vynálezu.

Spektrofotometrická súprava na anlýzu pomerov IgA/elastáza obsahuje:

» Na odber GCF: 20 vopred vystrihnutých páskov filtračného papiera.

» Na anlýzu GCF IgA: 20 mikrocentrifugačných skúmaviek s obsahom PBST (0.01 M fosfátový pufer pH 7.01, solný roztok 0.15 N NaCl a 0.05 % Tween); 50 ml premývacieho roztoku PBST; 4 mikrotitračné platničky; 10 ml ovčieho antiséra proti ludskému IgA riedené 1 : 256 000 v uhličitanovom/hydrogénuhličitanovom pufre pH 9.6; 10 ml peroxidázou označenej ovčej protilátky proti ludskému IgA v riedení 1 : 4 000 v PBST pufre; 10 ml 0.1 M citrátového pufru s 30 mg% orto-fenyléndiamínu s percentami peroxidu vodíka; 10 ml 0.1 M roztoku HCI a štandardnú krivku pre stanovenia IgA.

Na stanovenie elastázy: 2 ml TST pufru (50 ml Tris HCI, pH 7.0, 0.15 N NaCl a 1 % Triton X-100, ako je popísané v Cox II) . dve biele plastické tácky, 40 koliesok o priemere 6 mm z *

papieru Whatman 3MM, ktoré sú impregnované elastázovým substrátom (t. j. 250 μΜ metoxisukcinyl-Ala-Ala-Pro-Val-7-amino4-trifluoro-metylkumarín v 50 mM Tris HCI, pH 9.0 a 350 mM NaCl a 5 % dimetyl f ormamid) a usušený cez noc a 1 ml 1 % p-dimetylaminocinnamaldehydu v 1.0 N HCI.

Chromogenické farebné reakcie pre príslušné vzorky sú potom priradené k jednotlivým roztokom obsahujúcich príslušné farbivá na vytvorenie sady roztokov s rovnakým zafarbením ako testované vzorky IgA a elastázy, výsledkom čoho je sada farebných roztokov, reprezentujúcich rôzne koncentrácie IgA a elastázy. Táto sada roztokov je štandardou intenzity zafarbenia, oproti ktorej možno porovnať výsledky stanovenia chromogenickými farebnými reakciami, urobenými so vzorkami GCF odobranými pacientom, u ktorých sa má hodnotiť riziko.

Pomer IgA/elastáza sa určuje priradením intenzít zafarbenia zo stanovenia IgA a BG v GCF vzorkách podía farebných štandárd na základe usporiadanej tabuľky, ktorej os

Y reprezentuje stúpajúce koncentrácie elastázy zistenej v ludskom GCF a ktorej os X reprezentuje stúpajúce koncentrácie IgA. Bod v usporiadanej tabuľke, určený koordinátami, zapadá do oblasti, pre ktorú je určené vysoké, mierne alebo nízke riziko; oblasť bližšia k osi Y je vyššie riziko.

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob zistenia a vyhodnotenia rizika súčasného alebo neskoršieho vývoja aktívnej parodontitídy vy z n a č u júci sa tým, že obsahuje

   a) odber sulkulárnej tekutiny;

   b) meranie množstva IgA v sulkulárnej tekutine;

   c) meranie množstva markeru polymorfonukleárnych leukocytov v sulkulárnej tekutine;

   d) porovnanie pomeru množstiev z krokov (b) a (c) voči štandarde.
2. 2. Spôsob podlá nároku 1,vyznačujúci sa tým, že IgA je celkový IgA sérového typu a markerom pre polymorfonukleárne leukocyty je β-gluluronidáza.
3. 3. Spôsob podlá nároku 1,vyznačujúci sa tým, že IgA je celkový IgA sérového typu a markerom pre polymorfonukleárne leukocyty je elastáza.
4. 4. Súprava na zaistenie a vyhodnotenie rizika súčasného alebo neskoršieho vývoja aktívnej parodontitídy vyznačujúci sa tým, že obsahuje:

   (a) prostriedok na meranie množstva IgA v jednej alebo viacerých vzorkách sulkulárnej tekutiny; (b) prostriedok na meranie množstva markera polymorfonukleárnych leukocytov v jednej alebo viacerých vzorkách sulkulárnej tekutiny; (c) štandardu, oproti ktorej sa porovnáva pomer množstiev zistených v krokoch (a) a (b).
5. 5. Súprava podlá nároku 1, vyznačujúca sa tým, že prostriedok na meranie množstva markeru polymorfonukleárnych leukocytov je prostriedkom na meranie βglukuronidázy.
6. 6. Súprava podlá nároku 1, vyznačujúca sa tým, že prostriedok na meranie množstva markeru polymorfonukleárnych leukocytov je prostriedkom na meranie elastázy.