KR20240052334A - 치주질환 진단용 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 치주조직에서 수득한 치은열구액(GCF)을 검체로 이용하여 직접 면역반응을 통해 도출된 데이터를 기반으로 치주염 등과 같은 치주질환을 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 치주질환 진단용 키트를 제공한다.
Description
본 발명은 치주질환 진단용 키트에 관한 것으로, 더 상세하게는 치주조직에서 수득한 치은열구액(GCF) 검체의 표적 단백질을 이용하여 치주질환을 진단하는 키트에 관한 것이다.
치주질환(periodontal disease)은 연령이 증가할수록 발병이 증가하는데 잇몸에만 치주질환이 국한된 경우 치은염이라고 하며, 이러한 염증이 잇몸과 잇몸뼈 주변까지 진행된 경우 치주염이라고 한다. 치주염이 진행되면 치주인대, 더 나아가 치조골까지 손상시킨다. 치조골 손상의 한 예로 치조골형성장애(alveolar bone osteodystrophy)가 있는데, 더욱 세분하면 치조골다공증(alveolar bone osteoporosis), 치조골연화증(alveolar bone osteomalacia), 치조골감소증(alveolar bone osteopenia) 등을 포함하며 치조골이 손상되면 결국 치아가 손실된다. 건강보험심사평가원과 국민건강보험공단이 발표한 국민구강건강실태조사에 따르면, 2021년 기준 치은염 및 치주질환(질병코드 K05)이 외래 다빈도 질환 1위로 조사되었고 임플란트 식립 환자가 매년 증가하고 있어 식립 후 엄격한 치주 관리가 요구되고 있다. 현재의 치주질환 진단은 치주낭 깊이 탐침, 치아-치은부착 정도 확인, 방사선 촬영 판독과 같은 치과의사의 소견에 전적으로 의존되고 있으므로, 진단 민감도 및 정확성이 반영된 진단마커를 이용한 치주질환 진단 도구 도입이 필요한 실정이다. 이와 관련하여 대한민국 등록특허 제10-2134516호는 치주 질환 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 진단키트를 개시하고 있다.
그러나 상기 선행기술은 타액이나 치주 주변 세포를 이용한 치주염 진단마커에 관한 것으로, 진단 정확도가 높지 않거나 세포 파쇄 과정 등이 필요하여 간편 진단이 어려운 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 치은열구액(GCF)을 검체로 활용하여 직접 면역반응을 통해 도출된 데이터를 기반으로 치주염 등과 같은 치주질환을 간편한 방법으로 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 치주질환 진단용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 개체의 치주조직으로부터 수득한 시료 내 존재하는 Galectin-10 및 Defensin-1α 단백질 마커 검출용 시약을 유효성분으로 포함하는, 치주질환 진단용 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 개체의 치주조직으로부터 수득한 시료로부터 Galectin-10 및 Defensin-1α 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 치주질환 진단을 위한 정보 제공방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 치주질환 진단용 키트는 치주염이 발생되는 부위의 주변 환경을 적절히 반영하고 있는 치은열구액(GCF)을 검체로 치주염 진단마커인 Galectin-10 또는 Defensin-1α를 대상으로 치주질환을 정확하게 진단하므로 치주염의 간편 진단 및 정기적 치주 건강관리에 도움이 된다. 또한 비침습적으로 치은열구액(GCF) 채취만으로 치주염을 진단하므로, 일상 또는 치과 병원 현장에서 치주염을 간편하게 진단하는데 활용할 수 있어 상용화 가능성이 높다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 치주질환 진단용 키트를 이용하여 치주염을 진단하는 과정을 개략적으로 나타내는 개요도이다.
도 2는 치은열구액 시료를 채취 후 원심분리를 통해 진단키트에 적용하기 전까지의 샘플링 공정을 나타내는 사진이다.
도 3은 치주염 진단마커를 발굴하기 위해 바이오마커인 Galectin-10 및 Defensin-1 alpha(DEFA) 단백질 수준을 정량 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 치은열구액 시료를 채취 후 원심분리를 통해 진단키트에 적용하기 전까지의 샘플링 공정을 나타내는 사진이다.
도 3은 치주염 진단마커를 발굴하기 위해 바이오마커인 Galectin-10 및 Defensin-1 alpha(DEFA) 단백질 수준을 정량 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "치주질환(periodontal disease)"은 흔히 풍치라고도 하는데, 병의 정도에 따라 치은염(gingivitis)과 치주염(periodontitis)으로 나뉜다. 비교적 가볍고 회복이 빠른 형태의 치주질환으로 잇몸 즉, 연조직에만 국한된 형태를 치은염이라고 하고, 이러한 염증이 잇몸과 잇몸 뼈 주변까지 진행된 경우를 치주염이라고 한다. 치주염이 진행되면 치주인대, 더 나아가 치조골까지 손상시킨다. 치조골 손상의 한 예로 치조골형성장애(alveolar bone osteodystrophy)가 있는데, 더욱 세분하면 치조골다공증(alveolar bone osteoporosis), 치조골연화증(alveolar bone osteomalacia), 치조골감소증(alveolar bone osteopenia) 등을 포함한다. 치조골이 손상되면 결국 치아가 손실된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "치주조직(Periodontium)"은 치아를 둘러싸고 있는 4종류의 조직으로 치은(잇몸)(gingiva), 백악질(cementum), 치주인대(Periodontal ligament, PDL) 및 치조골(alveolar bone)을 의미한다. 치아를 물리적으로 지지하고, 치아의 움직임을 감지하며, 치아에 필요한 혈류 등을 공급하는 역할을 한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "치은열구액(gingival crevicular fluid, GCF)"은 치아에 붙어있지 않고 분리되어 있는 치은이라 이곳에 기구조작으로 치아로 부터 분리시킬 수 있으며, 그 분리되는 V 자 형태의 공간 즉 치실이 들어가는 공간을 치은열구라고 하며 치은열구에는 얇은 열구상피를 통해서 치은 결합조직으로부터 스며나온 유체 성분인 치은열구액이 존재하는데 치은열구액에는 과립구, 대식세포, B세포 등 강력한 면역세포들이 있어서 치은열구의 세균들을 제거하여 잇몸조직을 건강하게 유지한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "임플란트 주위염"은 임플란트 시술 부위에 염증이 생기는 부작용으로 임플란트 시술 후 잇몸이 붓고 시술 부위에 통증이 유발되는 질환을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Galectin-10"은 인간에서 CLC 유전자에 의해 암호화되는 효소로 상기 유전자에 의해 암호화된 단백질은 호산구와 호염기구에서 발현되는 리소포스포리파제로 생물학적 막에 작용하여 다기능 리소인지질을 조절하는 효소이다. 상기 단백질은 탄수화물 또는 IgE 결합 활성을 가질 수 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Defensin-1 alpha(DEFA)"은 3쌍의 분자내 이황화 결합을 포함하는 2-6kDa의 양이온성 살균 펩타이드로 알파 서브패밀리의 포유동물 디펜신 펩티드 패밀리로 포유류에서는 크립딘이라고도 하며 소장에서 생성된다. 많은 그람 음성 및 그람 양성 박테리아, 진균 및 외피 바이러스에 대해 활성을 나타내고 특히 호중구, 특정 대식세포 개체군 및 소장의 Paneth 세포에 풍부하다.
본 문서에서 사용되는 용어 "항체유사체(antibody mimetic)"는 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄가 이종사합체의 4차구조를 형성하여 기능을 발휘하는 통상의 전장 항체와 달리, nanobody, monobody, 가변 림프구 수용체(VLR) 등 비항체 유래의 단백질 스캐폴드로부터 제조되는 항체와 유사한 기능을 담당하는 단백질을 의미한다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 일 관점에 따르면, 개체의 치주조직으로부터 수득한 시료 내 존재하는 Galectin-10 및 Defensin-1α 단백질 마커 검출용 시약을 유효성분으로 포함하는, 치주질환 진단용 키트가 제공된다.
상기 키트에 있어서, 상기 시료는 타액, 치주 주변 세포 및 치은열구액(GCF)으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있고 바람직하게는 치주낭의 치은열구액일 수 있다.
상기 치주질환은 치은염(gingivitis), 치주염(periodontal inflammation), 치은출혈(gingival bleeding), 치은퇴축(gingival retraction), 치주낭(periodontal pocket), 치조골 파손(alveolar bone breakage), 치조골형성장애(alveolar bone osteodystrophy) 및 임플란트 주위염으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으며 상기 치조골형성장애는 치조골다공증(alveolar bone osteoporosis), 치조골연화증(alveolar bone osteomalacia) 및 치조골감소증(alveolar bone osteopenia)으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
이때 상기 치은염은 잇몸 조직의 염증, 잇몸 출혈, 위포켓(pseudopockets)과 같은 증상을 나타낸다. 치은염은 플라크 연관 치은염, 만성 치은염, 급성 치은염, 괴사궤양 치은염, 전신 질환 또는 약물 관련성 치은염(예를 들면 호르몬으로 인한 잇몸 염증, 약물로 인한 치은염, 잇몸 홍반 등), 감염성 치은염 등으로 세분화될 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 검출용 시약은 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체의 기능성 단편, 항체 유사체, 앱타머, 화합물 또는 질량분석용 시약일 수 있고 상기 항체의 기능성 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv, di-scFv, sdAb, VHH 또는 VNAR일 수 있으며 상기 항체 유사체는 애필린(Affilin), 애피바디(Affibody), 애피머(Affimer), 애피틴(Affitin), 알파바디(Alphabody), 앤티클린(Anticlin), 아비머(Avimer), 다르핀(DARpin), 피노머(Fynomoer), 쿠니츠 도메인 펩타이드(Kunitz domain peptide), 모노바디(monobody), 가변 림프구 수용체(VLR), Minibody, Diabody, Tetrabody, Triabody, 또는 Peptabody일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 효소결합면역흡착측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 또는 측면유동면역분석법(Lateral-flow immunoassay, LFA)의 형태를 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 개체의 치주조직으로부터 수득한 시료로부터 Galectin-10 및 Defensin-1α 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 치주질환 진단을 위한 정보 제공방법이 제공된다.
상기 제공방법에 있어서, 정상 개체과 비교하여 상기 Galectin-10 및 Defensin-1α 단백질의 농도가 유의하게 높은 개체를 치주질환에 걸린 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
치주질환(periodontal disease)은 만성질환으로 간주하여 장기간 관리되어야 하므로, 치과병의원을 내원해 전문가의 진찰을 받는 것뿐만 아니라, 환자 개인이 필요시마다 모니터링 하는 것이 치료 예후 개선에 도움이 될 수 있다. 특허 치주염은 치주원인균에 의해 치주조직이 파괴되는 만성질환으로, 새로운 치주조직이 재생되기 위해서는 치근 표면에 새로운 결합조직의 부착이 선행되어야 한다. 따라서 이와 같은 치주질환을 신속하고 간편하게 진단할 수 있는 바이오마커의 개발이 시급한 실정이다. 기존에는 타액이나 구강세포(치주 주변 세포)를 이용하여 치주염 진단마커를 개발하였으나, 타액은 진단 정확도가 높지 않거나 구강세포는 세포 파쇄 과정 등 전처리 과정이 필요하여 신속 진단이 어려운 문제점이 있었다. 구체적으로 이와 관련하여 종래기술 1은 치은열구액 단백질 분석을 통한 치주염 진단 기법 개발(출원번호 제10-2010-0023917호)에 관한 것으로 치은열구액에서 Azurocidin(AZU1)을 검출하여 치주염을 진단하는데 치은열구액 내 Azurocidin 농도가 매우 낮은 수준이다. 종래기술 2는 Odam의 치주질환 바이오마커로서의 용도(출원번호 제10-2016-0104806호)에 관한 것으로 치은열구액에서 진단마커로서 Odam을 측정해 치주염이나 임플란트 주위염 진단에 활용하나 이 또한 치은열구액 내 Odam 농도가 매우 낮은 수준이다. 종래기술 3은 치주질환 진단용 바이오마커(출원번호 제10-2017-0100362호)로 사람 구강섬유세포의 RNA를 분리, 전사체를 분석, 차등 발현된 유전자를 도출하는데 진단마커를 진단키트에 적용하기 위해서는 치주주변 조직의 분리 및 세포 파쇄 등의 과정이 선행되어야 하므로, 현장성 및 간편성이 반영된 진단키트 개발은 한계가 있다. 아울러 종래기술 4는 치주 질환 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 진단키트(출원번호 제10-2018-01214567호)로 정상인과 치주질환자의 타액 내 존재하는 대사물질 수준의 차이를 관찰, 이를 치주질환 진단마커로 제시하나 타액을 검체로 대사산물의 농도를 측정하므로, 측정 시의 구강 위생 상태나 구내 세척 정도, 음식 잔사량, 공복 상태, 내분비계 질환(당뇨병, 갑상선 질환, 부신계 질환 등)에 따라 진단 정확도 바이어스가 클 것으로 예상된다. 결론적으로 종래기술에서 검체로 사용되는 타액은 치주염 환경 변화를 적절히 반영하기에는 한계가 있어 낮은 진단 정확도가 예상되고 일례로 타액을 이용한 혈당기기도 개발은 되었으나 낮은 신뢰도 때문에 거의 사용이 되지 않고 있고 구강세포를 이용한 진단은 복잡한 전처리 과정이 필요하여 현장진단 구현이 불가하며 진단마커로 제시된 Azurocidin과 Odam 등의 치은열구액 내 농도가 매우 낮아 현장진단용 키트 개발에 제한점이 있다.
이에 본 발명자들은 치은열구액을 검체로 직접 면역반응을 통해 도출된 데이터를 기반으로 하여, 치주염에 특이적인 표적 단백질인 Galectin-10(Gal-10) 및 Defensin-1 alpha(DEFA)를 발굴하였고 이를 활용하여 치주질환 진단용 키트를 개발하였다. 상기 치은열구액에서 Galectin-10 및/또는 Defensin-1 alpha(DEFA)의 농도가 정상인에 비해 치주염 환자에게서 유의미하게 증가하는 결과를 도출하였다(도 1 내지 3). 정상인의 치은열구액 대비 치주염 환자의 치은열구액 내 표적 마커인 Galectin-10 또는 Defensin-1α의 농도 증가 폭이 커서 진단 정확도를 높일 수 있다. 따라서 본 발명의 치주질환 진단용 키트는 치주염이 발생되는 부위의 주변 환경을 적절히 반영하고 있는 치은열구액(GCF)을 검체로 사용하므로 비침습적 방법으로 검체를 수집할 수 있고 진단키트를 통해 간편하고 신속한 진단이 가능하므로 치주염 간편 진단 및 정기적 치주 관리에 도움이 되며 치과 병원 현장에서 치주염을 간편 진단할 수 있는 기술적 특징이 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예1: 치은열구액(GCF) 시료 수집
본 발명자들은 환자들 대상으로 치주 부위에서 치은열구액 시료를 수집하였다. 먼저, 시료 수집이 진행될 치은 부위의 타액과 오염원을 제거 후 건조시키고 페이퍼 포인트(Absorbent paper point, Meta Biomed, Chung-Ju, Korea)를 치주 부위에 삽입 후 30초간 시료를 흡습시켰다. 이어서, 인산완충 생리식염수 (phosphate-buffered saline, PBS, pH 7.2)에 상기 시료를 흡습한 페이퍼 포인트를 넣고 5분간 교반하였고 3,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 페이퍼 포인트와 이물질은 제거한 후 시료로 실험에 사용하였다(도 2).
실시예 2: 치주염 진단마커 발굴
본 발명자들은 상기 치은열구액 시료를 이용하여 치주염 진단 마커인 Galectin-10 및 Defensin-1a를 발굴하였다. 구체적으로 Human Galectin-10 ELISA kit(colorimetric, Novus biologicals) 및 Human α-defensin 1 ELISA kit (colorimetric, R&D systems)을 이용하여 정상 GCF(Normal) 및 치주염 GCF (Periodontitis) 시료를 점적한 후 Galectin-10 및 defensin-1α 단백질 농도 수준을 정량분석하였다. 그 결과, 대조군(정상)과 비교하여 치주염 치은열구액에서 Galectin-10과 defensin-1α의 농도가 현저하게 증가하였음 확인하였다(도 3). Galectin-10의 경우, 정상은 GCF 0.07 ~ 0.18 ng/ml였고 치주염 실험군은 GCF 0.41 ~ 0.95 ng/ml로 나타났고 defensin-1α(DEFA)의 경우 정상은 GCF ~ 65.78 ng/ml였고 치주염 실험군은 GCF 757.7 ~ 2328.2 ng/ml로 나타났다. 상기 결과는 본 발명의 일 실시예에 따라 발굴한 Galectin-10 및 Defensin-1a가 치주염 질환을 신속하고 정확하게 진단하기 위한 바이오마커로 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
Claims (10)
- 개체의 치주조직으로부터 수득한 시료 내 존재하는 Galectin-10 및 Defensin-1α 단백질 마커 검출용 시약을 유효성분으로 포함하는, 치주질환 진단용 키트.
- 제1항에 있어서,
상기 시료는 타액, 치주 주변 세포 및 치은열구액(GCF)으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 키트. - 제1항에 있어서,
상기 치주질환은 치은염(gingivitis), 치주염(periodontal inflammation), 치은출혈(gingival bleeding), 치은퇴축(gingival retraction), 치주낭(periodontal pocket), 치조골 파손(alveolar bone breakage), 치조골형성장애(alveolar bone osteodystrophy) 및 임플란트 주위염으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 키트. - 제3항에 있어서,
상기 치조골형성장애는 치조골다공증(alveolar bone osteoporosis), 치조골연화증(alveolar bone osteomalacia) 및 치조골감소증(alveolar bone osteopenia)으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 키트. - 제1항에 있어서,
상기 검출용 시약은 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체의 기능성 단편, 항체 유사체, 앱타머, 화합물 또는 질량분석용 시약인, 키트. - 제5항에 있어서,
상기 항체의 기능성 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv, di-scFv, sdAb, VHH 또는 VNAR인, 키트. - 제5항에 있어서,
상기 항체 유사체는 애필린(Affilin), 애피바디(Affibody), 애피머(Affimer), 애피틴(Affitin), 알파바디(Alphabody), 앤티클린(Anticlin), 아비머(Avimer), 다르핀(DARpin), 피노머(Fynomoer), 쿠니츠 도메인 펩타이드(Kunitz domain peptide), 모노바디(monobody), 가변 림프구 수용체(VLR), Minibody, Diabody, Tetrabody, Triabody, 또는 Peptabody인, 키트. - 제1항에 있어서,
효소결합면역흡착측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay), 또는 측면유동면역분석법(Lateral-flow immunoassay)의 형태를 특징으로 하는, 키트. - 개체의 치주조직으로부터 수득한 시료로부터 Galectin-10 및 Defensin-1α 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 치주질환 진단을 위한 정보 제공방법.
- 제9항에 있어서,
정상 개체과 비교하여 상기 Galectin-10 및 Defensin-1α 단백질의 농도가 유의하게 높은 개체를 치주질환에 걸린 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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