HUT71776A - Antibody conjugates with improved properties - Google Patents
Antibody conjugates with improved properties Download PDFInfo
- Publication number
- HUT71776A HUT71776A HU9500586A HU9500586A HUT71776A HU T71776 A HUT71776 A HU T71776A HU 9500586 A HU9500586 A HU 9500586A HU 9500586 A HU9500586 A HU 9500586A HU T71776 A HUT71776 A HU T71776A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- antibody
- conjugate
- carrier protein
- conjugates
- idiotype
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Egy monoklonális anti-idiotipus antitest egy olyan antitest, amely reaktív egy antitest felismerő szakasz (variábilis régió) epitoppal (idiotóppal). Ezért egy anti-idiotipus antitestet gyakran Ab 2-ként (2. antitestként) jelölünk, míg az Ab 2 termelésére felhasznált immunizáló antitestet Ab 1-nek (1. antitestnek) nevezzük. Mivel egy antitestnek (Ab 1) több idiotopja van, melyek közül egyesek az antigénkötó helyével asszociálódnak (paratópok) és mások a variábilis régió dómén szerkezeti determinánsaihoz asszociálódnak, ezért arra a komplementer antitest válasz funkcionálisan és struktúrálisan heterogén, és három fő kategóriába osztható [H.C.J. Érti és C.A. Bona, Vaccine 6., 80-84 (1988)] . E kategóriák egyike az Ab 2-be sorolható, amely Ab 2S-ként felismer egy paratóp-asszociált idiotopot. Az e kategóriába tartozó antitest az Ab 1-nek megfelelő antigén belső képmását hordozza, ezért rendszerint belső képmás típusú (anti-idiotipus) antitestnek nevezzük. Azon kritériumok, amelyek alapján egy belső képmás típusú anti-idiotipus antitestet megkülönböztetünk egy normál, azaz nem belső képmás típusú anti-idiotipus antitesttől, egyrészt immunkémiai kritériumok, úgymint az Ab 2-nek az Ab 1-hez való kapcsolódásának antigén általi gátlása, másrészt funkcionális kritériumok, például antigénspecifikus immunválasz előidézése olyan emlősben, amely korábban sohasem került kapcsolatba az antigénnel (H.C.J. Érti és C.A. Bona előbb idézett közleménye). Antigént utánzó képessége alapján egy belső képmás típusú antitest alkalmas arra, hogy számos rendszerben antigénspecifikus antitesteket hozzon létre, amelyeket anti-anti-idiotipus antitesteknek vagy Ab 3-nak (3. antitestnek) is nevezünk. Azok a rendszerek, amelyekben Ab 3 válasz hozható létre, például emberek vagy állati teszt rendszerek, úgymint egerek és kecskék.
Az anti-idiotipuson alapuló megközelítés magában foglalja egy idiotipus felhasználását T-sejt leukémiák vagy B-sejt limfómák passzív immunterápiájára [S. Müller, H. Köhler, D. Anderson, in: Recombinant DNA vaccines: Rationale and Strategy, R.E. Isaacson (ed.), Marcel Dekker, New York, 1992. pp. 345-346], valamint egy anti-idiotipus monoklonális antitest alkalmazását, például oltóanyagként vírus, parazita vagy baktérium patogén szervezetekkel szembeni immunitás kialakítására, továbbá rák elleni immunterápiás szerként, és terápis szerként immunregulációs rendellenességek esetén, végül agonistaként/antagonistaként antigén-antitest kötődés vizsgálatokban [például J.R. Schreiber, Current Drugs Ltd., pp. 1641-1648 (1993); H.C.J. Érti és C.A.Bona előbb idézett közleménye]. Egy belső képmás anti-idiotipus antitestet használhatunk például antigén pótló anyagként, ezért igen ígéretes anyag olyan antigénnel szembeni vakcinációban, amely antigénnel szemben rendelkezésre áll egy megfelelően reaktív antitest, de az antigén vagy rosszul van definiálva vagy nem tisztítható. Egy belső képmás antitest alkalmazása továbbá megfelelő lehet olyan esetekben, amelyekben az antigén maga nem képes alkalmas immunválasz létrehozására, például bizonyos szénhidrát antigének esetén, amelyek nem idéznek elő memória válaszokat. Egy belső képmás antitest alkalmas lehet arra is, hogy letörjön egy saját antigénnel szembeni toleranciát, ezért alkalmas immunológiai megközelítésnek tekinthető tumor terápiában, például melanoma terápiában.
Az ilyen antitest oltóanyagok hatékony immunogenicitása követelmény, és ez szükségessé tehet például hordozófehérjével kia·· · · · 4···
4*4 ··
4 444« ··4» lakított formulálást annak érdekében, hogy T-sejt függő (memória) választ idézzünk elő. A technika jelenlegi állása szerint az antitesteknek hordozófehérjével képezett aggregált és/vagy vízben rosszul oldódó vagy vízoldhatatlan konjugátumait, úgymint a keyhole limpet hemocianinnal (KLH, molekulatömeg 1000 000 Danái nagyobb) alkotott konjugátumait használják fel anti-idiotipus (Ab 2) vagy anti-anti-idiotipus (Ab 3) immunválasz előidézésére [lásd például M. Kusama et al., J. Immunology 143, 3844-3852 (1989); V.K. Lee et al., Biochim. Biophys. Acta 865, 127-139 (1986); A. Mittelman et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 466-470 (1992); M. McNamara et al., Science 226, 1325-1326)]. A hagyományos nézetek szerint a fehérjék aggregátumai erősebb immunválaszt váltanak ki mint az oldódó fehérjék [például Harlow és Lane (szerk.), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, pp. 100-101]. Fehérje aggregációval járó random konjugációt tipikus esetben homobifunkcionális crosslinkerekkel (keresztkötéseket létrehozó vegyületekkel) hozhatunk létre, úgymint glutáraldehiddel vagy diszukcinimidil-szuberáttal.
A klinikai felhasználás szempontjából azonban az aggregált és/vagy oldhatatlan antitest-fehérje konjugátumok hátrányosak például azért, mert meglehetősen heterogén, nehezen standardizálható preparátumok. Felmerült ezért az igény olyan antitest-alapú preparátumok iránt, amelyek javított tulajdonságokkal rendelkeznek, így például olyan egységesebb preparátumok iránt, amelyek lehetővé teszik a kereskedelmi termék standardizálását.
A találmány céljra ezen igény kielégítése olyan antitest-hordozófehérje konjugátumok előállításával, amelyek oldhatóak és nincsenek aggregálva, valamint javított tulajdonságokkal rendel•· · ··« ··· • · · · ·· *··· ·« keznek a klinikai felhasználás szempontjából.
Meglepő módon azt találtuk, hogy az ilyen oldódó, nemaggregált konjugátumok hatékony antigenicitással rendelkeznek, ami in vivő adagolás esetén az eredeti antigénnel szembeni megfelelő anti-idiotipus (Ab 2) vagy anti-anti-idiotipus (Ab 3) antitest választ eredményez. A találmány szerinti oldható konjugátumok in vivő tesztelése során a specifikus anti-idiotop humorális immunválasz legalább öszemérhető azzal, amelyet a szokásosan alkalmazott aggregátumok idéznek elő. A találmány szerinti oldható konjugátumok - amelyek egy meghatározott antitestet, például egy anti-idiotipus antitestet tartalmaznak - immunogenicitása előnyös módon felülmúlja a rosszul oldódó vagy (vizes oldatokban) oldhatatlan aggregátumok immunogenicitását, amely aggregátumok ugyanazt az antitestet tartalmazzák. Ez a jobb antigenicitás nagyobb antigén-specifikus antitest (Ab 2 vagy Ab 3) titert eredményez.
A találmány további tárgya eljárás az ilyen konjugátumok előállítására, valamint az ilyen konjugátumokat tartalmazó gyógyszerkészítmények, és terápiás eljárás, azzal jellemezve, hogy e konjugátumokat emlősöknek adjuk be.
A találmány tárgyát közelebbről olyan meghatározott, oldható konjugátumok képezik, amelyekben egy monoklonális antitest molekula, előnyösen egy anti-idiotipus antitest molekula kovalensen kötődik legalább egy hordozófehérje molekulához. A találmány szerinti konjugátumok képesek arra, hogy antitest választ (Ab 2 vagy Ab 3 választ) idézzenek elő emlősökben. A komponensek konjugálását úgy célozzuk meg, hogy a hordozófehérje kapcsolódása az antitest konstans régió részére korlátozódik. E célból a kapcsolási módszert úgy választjuk meg, hogy az csak a konstans /
• · · · • · 4 • ♦ « · · *··· * · régióban lévő olyan alkalmas csoportok részvételével menjen végbe, amelyek nem fordulnak elő vagy nem hozzáférhetőek a felismerő szakaszokban (variábilis régiókban). Az antitesthez való ilyen irányítottan hely-szelektív konjugációt elérhetünk például úgy, hogy a hordozófehérjét megfelelően aktiváljuk, például heterobifunkciós crosslinkerrel, például olyan crosslinkerrel, amely N-hidroxi-szukcinimid (NHS) véget tartalmaz, majd ezt követően az aktivált hordozófehérjét reagáltatjuk az antitesttel. Az antitestet a hordozófehérjéhez úgy kell kapcsolnunk, hogy a konjugáció nem érintheti az antitest variábilis régióinak a konformációját és/vagy hozzáférhetőségét.
A találmány szerinti konjugátumokat az jellemzi továbbá, hogy
- csak egy antitest molekulát tartalmaznak, amelyhez korlátozott számú hordozófehérje molekula van kovalensen kapcsolva;
- a végtermék konjugátum maga nincs aggregálva.
A leírásban az oldható jelző azt jelenti, hogy a találmány szerinti konjugátum oldódik vízben vagy vizes oldatban, úgymint alkalmas pufferban, például olyan pufferban, amelyben a konjugátum komponensei külön-külön szintén oldódnak.
A találmány szerinti konjugátumokban az antitest komponens származtatható olyan antitestből, amely sejthez kötött formájában egyedülálló tumor-specifikus antigénként szolgál, ilyen például egy B-sejt limfómával asszociált antitest. Az antitest komponens előnyösen anti-idiotipus antitest, különösen monoklonális belső képmás típusú antitest (Ab 2β), vagyis az antitest komponens reaktív az immunizáló antitestben (Ab 1) lévő antigénkötő struktúrákkal, amelyek az antigénre nézve komplementerek. Egy ilyen r
- 7 antitest az antigén konformációs tükör-képmását képviseli és antigénpótlóként (antigénhelyettesítőként) használható. Ennélfogva a találmány szerinti konjugátumok, amelyek belső képmás anti-idiotipus antitestet tartalmaznak, in vitro gátolják az immunizáló antitestnek a célsejtekhez való kötődését, és képesek anti-anti-idiotipus antitestek (Ab 3) in vivő létrehozására, amely Ab 3 antitestek az antigén ellen irányulnak és ugyanolyan reaktivitási sémájúak mint az Ab 1 antitestek. Az anti-idiotopok emlős, például egér (murine) eredetűek lehetnek.
A találmány szerinti célra alkalmas anti-idiotop például egy olyan antitest, amely vírus, gomba, parazita, baktérium vagy emlős, különösen humán eredetű antigént utánoz. A monoklonális anti-idiotipusnak mint vírus vakcinának az előnyei közé tartozik, hogy kiküszöböljük a potenciálisan patogén víruseredetű antigéneket, valamint kiküszöböljük a legyengítetten életben lévő vírusokból származó genomikus anyagot, amely visszaalakulhat vad típussá vagy transzformálhatja a gazdasejteket. Alkalmas virális patogének közé tartozik például a sendai vírus, a herpesz vírus, úgymint a citomegalovírus (CMV), a humán immunhiány vírus (HÍV), a gyermekbénulás, influenza A, SV 40 vírus, retrovírus és víruseredetű antigének, úgymint a hepatitisz B felületi antigén (HBsAg). Kimutatták, hogy az anti-idiotipus antitestek utánozni tudnak esszenciális baktérium vagy parazita eredetű antigéneket, és rezisztenciát fejleszthetnek ki emlősökben súlyos vagy halálos baktérium- vagy parazita-fertőzésekkel szemben, így például a Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, meningococcus, trypanosoma vagy Schistosoma mansoni által okozott fertőzésekkel szemben.
Előnyösek a találmány szerinti azon konjugátumok, amelyek alkalmasak vakcinaként, így például egy olyan konjugátum, amely anti-idiotipus komponenst tartalmaz, amely komponens humán limfocita antigénen lévő epitópot utánoz (HLA; például az EP-A-0 498 767 számú európai szabadalmi bejelentés); előnyösen tumor vakcinaként, például egy olyan konjugátum, amely carcinoembryonikus antigénen lévő (CEA) epitopot vagy tumor-asszociált antigént (tumor asszociated antigén, TAA), különösen melanoma-asszociált antigént utánoz (lásd például S. Müller, H. Köhler, D. Anderson fent idézett közleményének 343-351. oldalán). Melanomával együttjáró (melanoma-asszociált) antigén például a p97 [például M. Kahn et al. , Cancer Rés. 49, 3157-3162 (1989)] és a nagy molekulatömegű-melanoma-asszociált antigén (high molecular weight-melanoma associated antigén, HMW-MAA) (lásd például az EP-A-0 428 484 számú európai szabadalmi bejelentést és a WO 89/11296 számú PCT-bejelentést). A találmány különösen előnyös kivitelében a konjugátum antitest komponense egy monoklonális antitest, például az MAb 763.74 jelű monoklonális antitest [P. Giacomini et al., J. Immunoi. 135, 696 (1985)] által HMW-MAA-n felismert determánsok belső képmása. Példák az ilyen különösen előnyös konjugátumokra az olyan molekulák, amelyek antitest komponensként MK2-23 egér (murine) anti-idiotipus monoklonális antitestet (lásd az EP-A-0 428 485 számú európai szabadalmi bejelentést, amely e bejelentés tekintetében referenciaként szerepel) tartalmaznak vagy abból származtatható antitestet, például annak izotípus switch (átkapcsolás!) variánsát, vagy egy kimérés antitestet, például az MK2-CHjfl-et (lásd a WO 93/19180 számú PCT-be j elentést, amely e bejelentés tekintetében referenciaként szerepel) . Az MK2-CH/jl
r
- 9 antitest tartalmaz Kappa (K) könnyűláncú humán konstans régiókat, gamma (-j) nehéz láncú humán konstans régiókat és MK2-23 egér anti-idiotipus monoklonális antitestből származtatható variábilis régiókat. Az MK2-CH'^í antitest nehézláncú és könnyűláncú variábilis doménjeinek aminosav szekvenciáit a SEQ ID 1, illetve 3 azonosítási jelű szekvenciák mutatják be. Az MK2-CH^l-et az MK-CH^ 1-6 hibridóma sejtvonallal állítjuk elő, amelyet az Állati Sejtkultúrák Európai Gyűjteményében [(European Collection of Animál Cell Cultures, ECACC), Proton Down, Salisbury, Wilts SP40JG, Egyesült Királyság] 1992. március 6-án deponáltak 92030462 leltári számon.
A találmány szerinti előnyös konjugátum antitest komponense tartalmaz egy olyan nehézláncú variábilis domént, amely egy SEQ ID. No 1. azonosítási számmal jelzett aminosav szekvenciájú polipeptidből vagy egy SEQ ID No 2. azonosítási számmal jelzett aminosav szekvenciájú polipeptidből áll.
A leírásból a szakember számára nyilvánvaló, hogy emlős, például egér eredetű monoklonális antitest helyett vagy egy olyan kimérás monoklonális antitest helyett, amelyben a variábilis és a konstans domének különböző fajoktól származnak, egy ilyen antitest fragmensét, például egy F(ab') fragmenst, vagy ha alkalmas, egy átalakított (humanizált) antitestet alkalmazhatunk a találmány szerinti konjugátum előállítására.
Az antitest bármely immunglobulin osztályú/alosztályú lehet, előnyösen IgG osztályú.
Hordozófehérje komponensként a találmány szerinti konjugátumok bármely, az emberi szervétben alkalmazható hordozóierhérjét tartalmazhatnak, például nemtoxikus, nempirogén, vízoldható,
- 10 gyógyszerészetileg elfogadható hordozófehérjét, polipeptidet vagy oligopeptidet, előnyösen olyan fehérjeszerű molekulát, amelynek kiemelkedő aminocsoportjai vannak, például toxin aktivitástól mentes mutáns diftéria toxint [Uchida et al., J. Bioi. Chem. 218, 3838-3844 (1973)] . Alkalmas bármely olyan fehérjeszerű molekula, amely nagymértékben immunogén vegyes T-sejt epitópokat tartalmaz, amelyek I osztályú és II osztályú polimorf HLA géntermékek széles skálájához kötődnek, így például valamilyen mikrobiális, különösen bakteriális fehérje, polipeptid vagy oligopeptid.
Különösen előnyös valamely baktériumtoxinból nyerhető hordozófehérje komponens - e toxin például tetanusz toxin (lásd például B. Bizzini in: Bacterial Vaccines, Academic Press, 1984: Tetanus, pp. 38-68) vagy diftéria toxin amely fehérjekomponens toxin aktivitástól mentes, de megőrzi a toxin sajátos antigén tulajdonságait, például hatékony immunogenicitását. Ilyen nemtoxikus hordozófehérje komponenst nyerhetünk például a toxin méregtelenítésével például tetanusz toxin esetén, vagy mutációval, például diftéria toxin esetén.
A méregtelenítést elvégezhetjük kémiai úton, ismert módszerekkel, például úgy, hogy formaldehiddel (formaiinnal) kezeljük a nyers vagy tisztított toxint olyan körülmények között, amelyek toxoid előállítására ismertek. A toxint például toxoiddá alakíthatjuk át úgy, hogy formaldehidet adunk a toxinoldathoz, majd körülbelül 35°C-37°C-on körülbelül egy hónapon át inkubáljuk. A toxoidnak meg kell felelnie mindazon követelményeknek, amelyeket a World Health Organization a humán felhasználásra szánt toxoidokkal szemben támaszt. A találmány szerinti konjugátumok előállítása céljára előnyös hordozófehérje a tetanusz toxoid.
- 11 Diftéria toxint Corynebacterium diphteriae PW8 tenyészet felülúszóiból nyerhetünk R.K. Holmes, Infect. Immun. 12 , 1392 (1975) közleménye szerint. A találmány szerinti konjugátumok előállítására előnyös hordozófehérje valamely atoxikus mutáns diftéria toxin, különösen a CRM197 mutáns diftéria toxin. A CRM197 egy atoxikus fehérje, amely immunológiailag keresztreakcióba lép a diftéria toxinnal, és a C. diphteriae C7 tenyészet felülúszókból nyerhető (lásd R.K. Holmes előbb idézett közleményét, valamint a 4 925 792 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást, e közlemények e bejelentés tekintetében referenciaként szerepelnek). A CRM197 fehérje molekulatömege megegyezik a diftéria toxinéval, és egy B fragmensből - amely funkcióját és szerkezetét tekintve azonos a toxinéval továbbá egy A fragmensből - amely nemtoxikus és az eredeti fragmenstől egy aminosavban tér el - épül fel.
A találmány szerinti konjugátumokban legalább egy, előnyösen körülbelül egy-öt, vagyis kb. egy, kb. kettő, kb. három, kb. négy vagy kb. öt hordozómolekula van egy antitesthez kovalensen kapcsolva. Előnyösek azok a hordozófehérje-antitest konjugátumok, amelyekben a mólarány körülbelül három az egyhez. Az előbbi, az antitestre számított hordozófehérje arányokat, melyek értéke körülbelül 1-5 hordozófehérje antitestenként, átlagos arányoknak kell érteni.
Az egy antitest molekulához kapcsolt hordozófehérje molekulák átlagos számát ismert eljárásokkal határozhatjuk meg, például úgy, hogy meghatározzuk a konjugátum molekulatömegét. A konjugátum molekulatömegéből a hordozófehérje molekulák átlagos számát a következőképpen számíthatjuk ki: meghatározzuk a konjugátum
- 12 molekulatömegét például gélszűréssel vagy szabad áramlásos (free flow) frakcionálással, majd a konjugátum molekulatömegének és az antitest komponens például körülbelül 150kDa (IgG esetén) molekulatömegének a különbségét elosztjuk a hordozófehérje pl. CRM197 esetén körülbelül 50kDa-os molekulatömegével, és így megkapjuk a hordozó fehérjemolekulák átlagos számát.
A találmány szerinti azon konjugátumok esetén, amelyek IgG-ből és CRM197-ből épülnek fel, az előnyös molekulatömeg kb. 200kDa - kb. 400kDa- különösen kb. 300kDa.
A hordozófehérje kovalensen kapcsolódik az antitesthez, olyan kötéssel, amelyben az antitest megválasztott funkciós csoportjai vesznek részt. Tipikus esetben az antitest aminocsoportján keresztül létrejött kötést nem tekintjük alkalmasnak a találmány célja szempontjából. A hordozófehérje molekula előnyös módon kovalensen kötődhet egy antitest molekulához olyan kötéssel, amely például az antitest egy ritka szénhidrogén szerkezetének részvételével alakul ki, a C-terminális aminosav funkciós csoportjával, különösen a karboxicsoporttal létrejött kötéssel, diszulfid kötéssel és legelőnyösebben tioéter kötéssel.
Előnyös módon az antitestet tisztított formában reagálhatjuk. Az antitestet ismert módon tisztíthatjuk, például olyan eljárással, amely egy vagy több kromatográfiás lépést foglal magában, úgymint affinitás kromatográfiával, különösen Protein A vagy Protein G affinitás közegen végzett kromatográfiával, ioncserélő kromatográfiával, hidrofób kölcsönhatás kromatográfiával vagy gélszűréssel vagy lecsapási lépésből álló eljárással, úgymint ammónium-szulfáttal végzett lecsapással.
Ha az alkalmas, például tisztítás céljából, egy adott antitesttel izotipus switchet (átkapcsolást) végezhetünk. Egy bizonyos antitest ilyen izotipus switch variánsát szokásos eljárásokkal állíthatjuk elő, például szerkezetileg azonos variábilis régiókat de különböző nehézláncú konstans régiókat tartalmazó lg illesztett sorozatait nyerhetjük a hibridóma lg nehézláncú osztály switch variánsainak az izolálásával, amely variánsok spontán módon fordulnak elő körülbelül 10~4 és körülbelül 10~10 frekvenciáknál szaporodó tenyészetekben. Például MK2-23 egér (murine) antitest használata helyett (amely G1 típusú immunglobulin) előnyös lehet G2a vagy G2b típusú switch variáns alkalmazása, mert az IgGl antitesttel ellentétben ezt a variánst affinitás útján tisztíthatjuk Protein A vagy Protein G affinitás közegen. Az MK2-23 hibridóma ilyen IgGl-IgG2a vagy IgGl-IgG2b nehézláncú izotipus switch variánsának az izolálására szekvenciális szubliningot alkalmazhatunk IgG2a- vagy IgG2b-specifikus ELISA-val kombinációban.
Egy szempontból a találmány anti-idiotipus antitestre, például egér (murine) IgG2b anti-idiotipus antitestre vonatkozik, amely a HMW-MAA egy epitópjának belső képmását hordozza, és amely egy mutációval átalakított nemtoxikus diftéria toxinhoz, például CRM 197-hez vagy tetanusz toxoidhoz van konjugálva.
A találmány egy előnyös kivitele szerint a konjugátum CRM 197-et vagy tetanusz toxoidot tartalmaz hordozófehérjeként és egy antitest komponenst, amely az MK2-CH/3'1 jelű antitest vagy az MK2-23 jelű antitest könnyűláncú és/vagy nehézláncú variábilis régióit tartalmazza.
A legelőnyösebb konjugátumok hordozófehérjeként CRM 197-et vagy tetanusz toxoidot tartalmaznak és egy IgG 2-típusú antitest komponenst, amely a SEQ ID No. 2 szerinti aminosav szekvenciájú nehézláncú variábilis domént és a SEQ ID No 3. szerinti aminosav szekvenciájú könnyűláncú variábilis domént tartalmazza.
Különösen előnyös az a konjugátum, amely anti-idiotipus anti-HMW-MAA egér Ig2b: kappa monoklonális antitestet - melyet a SEQ ID No. 2 szerinti aminosav szekvenciájú nehézláncú variábilis domének és a SEQ ID No. 3. szerinti aminosav szekvenciájú könnyűláncú variábilis domének jellemeznek -, valamint a CRM 197 mutált diftéria toxint tartalmazza.
A kapcsolási reakciót a szakember számára ismert eljárásokkal végezzük olymódon, hogy elkerüljük az aggregációt, az antitestet ne denaturáljuk, és az antitestben jelenlévő nemkovalens kötéseket lényegében fenntartsuk. A kémiai eljárásokat úgy kell megválasztanunk, hogy a nemkívánatos melléktermékek (például homokonjugátumok) keletkezését minimális értéken tartsuk, míg a funkcionálisan aktív konjugátumok maximális hozamát érjük el. Ezen felül a konjugátumnak stabilnak és jól definiáltnak kell lennie az aktuális kapcsolási funkció tekintetében. Előnyösek azok az eljárások, amelyekben heterobifunkciós kapcsolószert alkalmazunk. Minthogy a heterobifunkciós crosslinkereknek (keresztkötést létrehozó kapcsolószereknek) két olyan szelektíven reaktív csoportjuk van, amelyek fehérjék kapcsolására lépésenként! és specifikus módon használhatók, a nemkívánatos mellékreakciók, úgymint a homoproteinek keletkezése, a kívánt módon elkerülhető. Az egy-egy antitest molekulához kapcsolódó hordozófehérje molekulák számát a reakciópartnerek moláris adagolási arányának változtatásával szabályozatjuk. A hordozófehérje kapcsolódása az antitest H és L lánca konstans régióin keresztül jöhet létre.
Az antitest szénhidrátszerkezetét magában foglaló kötést ismert eljárásokkal hozhatunk létre [lásd például D.J. O'Shannessy, R.H. Quarles, J. Immunological Methods 99 , 153-161 (1987)], például a szénhidrátcsoportok enyhe oxidációjával és ezt követő módosításával. A találmány szerinti ilyen konjugátumot előállíthatunk például hidrazincsoportot tartalmazó kapcsolószer alkalmazásával .
Az antitest C-terminális karboxicsoportját magában foglaló kötést szokásos eljárásokkal hozhatunk létre, például az 5 234 820 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett eljárással.
A hordozófehérjének az antitesthez való kapcsolása együtt járhat a hordozófehérje, például a tetanusz toxoid vagy a CRM 197 aktiviálásával olymódon, hogy reagáltatjuk azt alkalmas heterobifunkciós kapcsolószerrel. Egy alkalmas heterobifunkciós kapcsolószernek két különböző reaktív csoportja van, melyek egyike reakcióba tud lépni a hordozófehérje funkciós csoportjával, különösen a hordozófehérje aminocsoportjával. A kapcsolószerben ez a reaktív csoport előnyösen N-hidroxi-szukcinimid-észter-csoport.
Egy hordozófehérje molekulának egy antitest molekulához diszulfid vagy tioéter kötésen keresztül való kapcsolódása legalább egy hozzáférhető tiol (szulfhidrái) csoport jelenlétét teszi szükségessé az antitestben. Az antitesthez való irányított helyszelektív konjugációt az aktivált hordozónak az antitest kapocs (hinge) és láncközötti (interchain) ciszteincsoportjaival végbe···· menő reakciója révén hozzuk létre, kihasználva a láncközötti diszulfid kötések redukciója révén felszabadult tiolcsoportokat. Ilyen redukciót enyhe körülmények között végzünk - például olyan körülmények között, amelyek nem okozzák a fehérje nagymértékű kibomlását - megfelelő redukálószer alkalmazásával. Alkalmas redukálószer például egy olyan szer, amely (az antitestre számítva) elegendő moláris feleslegben alkalmazva kedvez a diszulfid átalakulás teljessé válásának, ilyen például egy ditiol, úgymint a ditiotreitol (DTT). A diszulfid átalakulással (interchange) szembeni érzékenységük szerint az antitestekben lévő diszulfid kötéseket három kategóriába oszthatjuk: árnyékolt kötések (rendszerint láncon belüli), segített (assisted) kötések és nemsegített kötések (mindkettő rendszerint láncközötti) (lásd G.T. Stevenson et al. in: Protein Engineering of Antibody Molecules fór Prophylactic and Therapeutic Applications in Mán, ed. M. Clark, Academic Titles, Bramcote, Nottingham, U.K. 1993, 127-141). A találmány szerinti konjugátumok előállítása céljára az utóbbi típus redukciója a legalkalmasabb. A találmány szerinti olyan konjugátumok előállítására, amelyek egy vagy több diszulfid vagy tioéter kötést tartalmaznak, az szükséges, hogy az antitestben legalább egy diszulfid kötést redukáljunk.
A hordozófehérjének az antitesthez való kapcsolására használhatunk például heterobifunkciós lizin/cisztein keresztkötést létrehozó szert, úgymint szulfoszukcinimidil-4 -(p-maleimid-fenil)-butirátot (szulfo-SMPB-t). A hordozófehérjét reagáltatjuk egy ilyen keresztkötést létrehozó szerrel olyan hozzáférhető aminosavcsoportjai révén, amelyeknek reaktív primer aminocsoportjuk van, úgymint a felületen szabadon lévő lizincsoportjai révén, és ·· ···««·· • · · · · ·· ···· ·· ·· így olyan aktivált hordozófehérjét állítunk elő, amely képes arra, hogy reaktív tiolokhoz kapcsolódjon. Ezt az aktivált hordozófehérjét, amelynek a felületén szabadon lévő cisztein reaktív csoportjai vannak, ezután reagáltatjuk olyan antitesttel, amelyet parciálisán redukálhatunk például ditiotreitollal. A perciális redukció körülményei szabaddá tesznek néhány, de nem valamennyi diszulfid kötést, amelyek az antitest kapocs régiójában vannak. A konjugátumokat ezután ismert módon tisztíthatjuk és analizálhatjuk .
Az alkalmas heterobifunkciós kapcsolószerek kaphatók a kereskedelemben vagy ismert módon előállíthatok. Ezek közé tartoznak például az olyan keresztkötést létrehozó kapcsolószerek, amelyek amin reaktív csoportot tartalmaznak, például az N-hidroxi-szukcinimid-észterek, és amelyek szulfhidril reaktív csoportot tartalmaznak, például halogén-acetil-funkciós csoportot, maleimid funkciós csoportot vagy reaktív diszulfidcsoportot tartalmazó szerek, úgymint az N-[3 -(2'-piridil-ditio)-propion-oxi]-szukcinimid (SPDP), a diszulfidkötéseken keresztül létrehozott kapcsolásra. Az antitest tiolcsoportok alkilezésére alkalmas szerek közé - amely alkilezés tioéter kötést eredményez tartozik az N-szukcinimidil-brómacetát vagy ide tartoznak a maleimid-N-(hidroxi-szukcinimid)-észter típusú crosslinkerek. A maleimid-N-(hidroxi-szukcinimid)-észter típusú crosslinkerek (keresztkötést létrehozó szerek) lehetnek aromásak, úgymint a m-maleimido-benzoil-N-hidroxi-szukcinimid-észter (MBS), a szulfoszukcinimidil-4-(p-maleimido-fenil)-butirát (S-SMPB vagy szulfo-SMPB) és a m-maleimido-benzoil-szulfoszukcinimid-észter (S-MBS), vagy lehetnek alifásak, úgymint az N-maleimido-butiril-oxi-szuk18 cinímid-észter (GMBS) [lásd D.E. Myers et al., J. Immunological Methods 121, 129-141 (1989)]. Ha a hordozófehérjét egy ilyen kapcsolószerrel reagáltatjuk, akkor aktivált hordozófehérjét kapunk, amely képes arra, hogy reagáljon az antitest molekulával olyan reaktív csoport bevitele következtében, amely lényegében nem reagált a hordozófehérjével. Mielőtt az aktivált fehérjét reagáltatjuk az antitesttel, a kapcsolószer feleslegét el kell távolítanunk például gélszűréssel vagy dialízissel.
A legelőnyösebben a konjugátum komponensek tioéter csoportokon keresztül kapcsolódnak.
A találmány szerinti előnyös konjugátumok belső képmástípusú anti-idiotipus monoklonális antitestek, különösen olyan anti-idiotipus antitestek oldódó, nemaggregált, CRM 197 proteinnel vagy tetanusz toxoiddal alkotott konjugátumai, amely antiidiotipus antitestek azon determinánsok belső képmásai, amelyeket monoklonális antitest HMW-MAA-n feliser, amely konjugátumot az jellemez, hogy egy antitest molekula átlagosan 1-5, előnyösen átlagosan három hordozófehérje molekulát hordoz, amely hordozófehérje molekulák hely-szelektíven és kovalensen, tioéter kötéssel kapcsolódnak az antitest konstans régió részéhez. Különösen előnyösek azon konjugátumok, amelyeket szulfo-SMPB heterobifunkciós kapcsolószer alkalmazásával állítunk elő.
Azon immunválasz (Ab 3 válasz), például egy anti-HMW-MAA immunválasz kiváltását, amely a találmány szerinti anti-idiotipus konjugátummal végzett vakcinációt követ, ismert módszerekkel analizálhatjuk, például úgy, hogy anti-melanomasejt antitest titereket határozunk meg például ELISA, különösen élősejt ELISA eljárás alkalmazásával. Celluláris szubsztrátumokként HMW-MAA pozitív • ·
humán melanoma sejtvonalat, úgymint A 375 met-et és HMW-MAA negatív melanoma sejtvonalat, úgymint S-7-et használhatunk fel.
A sejteket teszt szérumok (Ab 3) vagy pozitív és negatív (nem-HMW-MAA-reaktív) kontroll monoklonális antitestek higítási sorozatával hozzuk érintkezésbe. A sejthez kötött Ab 3 antitesteket alkalmas, enzimhez kötött antitest konjugátummal például anti-IgG peroxidáz konjugátummal határozhatjuk meg.
A találmány további tárgya eljárás a találmány szerint konjugátumok előállítására, amely eljárást az jellemez, hogy antitestet hordozófehérjével olyan körülmények között reagáltatunk, amely körülmények között hely-szelektív, kovalens kötéssel átlagosan kb. 1- kb. 5 hordozófehérje molekula kapcsolódik antitest molekulánként, majd a találmány szerinti konjugátumot izoláljuk.
Ha az megfelelő, a hordozófehérjét aktiváljuk az antitesttel végzett reakciót megelőzően. A kapott termékeket tisztíthatjuk, és így különböző antitest/hordozófehérje arányú konjugátumokat kapunk. Kívánt esetben a találmány szerinti konjugátumokat tovább analizálhatjuk, például minőségellenőrzés céljából. Az ilyen analízis részét képezheti a nemkonjugált antitesttel végzett összehasonlítás, például általánosan ismert módszerekkel, úgymint immunmeghatározásokkal, például immuncitokémián vagy áramlásos (flow) citometrián alapuló vizsgálatokkal, olyan módszerekkel, amelyek célja a kötési kinetika meghatározása, például az asszociációs vagy disszociációs sebességek meghatározására szolgáló eljárásokkal, úgymint biospecifikus kölcsönhatás analízissel [lásd U. Jönsson et al., Bio Techniques 11, 620-627 (1991)] és hasonlókkal. Előnyösek az olyan eljárások, amelyek a találmány szerinti előnyös konjugátumokat eredményezik.
·· »· *4·· 44
Közelebbről, a találmány szerinti olyan konjugátumok előállítására, amelyekben a hordozófehérje, például CRM 197, tioéter kötéssel kapcsolódik az antitesthez, a reakciót kétlépéses eljárással végezzük. A hordozófehérjét, amely nem tartalmaz szabad ciszteint, először egy maleinimid-N-hidroxi-szukcinimid-észter típusú crosslinkerrel reagáltatjuk. Ez cisztein-reaktív maleinimid csoportoknak a hordozófehérje felszínére való addícióját eredményezi, és nem jár a fehérjemolekulák közötti keresztkötések kialakulásával. A feleslegben lévő crosslinkert eltávolítjuk például gélszűréssel vagy dialízissel, ezután az aktivált fehérjét együtt inkubáljuk az antitesttel, például egy olyan antitesttel, amely az MK-CH^l vagy MK2-23 antitest lg variábilis régióit tartalmazza, amely antitestet előzetesen parciálisán redukáltunk például ditiotreitollal, és így szabad, reaktív tiolcsoportokat alakítottunk ki anélkül, hogy a teljes fehérjeszerkezetet megbontottuk volna. Az antitest redukált formáját elválasztjuk az el nem reagált redukálószertől. A kapcsolási reakció kovalens kötéseket hoz létre az aktivált hordozófehérje és a redukált antitest között, így hordozófehérje - antitest konjugátumokat kapunk. A kapcsolási reakcióban a hordozófehérje moláris feleslegét úgy választjuk meg, hogy a kívánt számú hordozófehérje molekula kapcsolódjék egy-egy antitest molekulához. Ha például olyan konjugátumot kívánunk nyerni, amelyben körülbelül három CRM197 molekula kötődik egy egér (murine) IgG molekulához, például MK2-23-hoz, az aktivált CRM197-et ötszörös molfeleslegben reagáltatjuk. A találmány szerinti konjugátumokat előnyös módon kromatográfiás eljárással tisztítjuk és kívánt esetben sterilizáljuk például aszeptikus körülmények közötti szűréssel.
I
- 21 ···· «· ·· · ·*· ··· • * » « « • ·* ·*♦· ·« ·«
A találmány szerinti konjugátumokat agonista/antagonistaként használhatjuk fel antigén-antitest kötés tanulmányozásában, például diagnosztikai célokra, például az adott antigénnel szembeni antitestek (Ab 1 vagy Ab 3) in vitro (ex vivő) vagy in vivő minőségi és mennyiségi meghatározására, ahol a találmány szerinti konjugátum anti-idiotipus antitest komponense utánzó tulajdonságú, vagy terápiás célokra, például oltóanyagként vírus, parazita vagy baktérium patogénekkel szembeni immunitás előidézésére, vagy tumor, például melanoma megszűntetésére, megelőzésére, (adjuváns) kezelésére és kimutatására.
A találmány további tárgya a találmány szerinti konjugátumok felhasználása oltóanyagként, továbbá eljárás emlősök, különösen ember vakcinációjára, melyet az jellemez, hogy a találmány szerinti konjugátumot a szervezetbe beadjuk. Az ilyen eljárás magában foglalja antitumor válasz létrehozásának eljárását emlősök esetén, amely eljárást az jellemez, hogy a találmány szerinti olyan konjugátumot adunk be, amely megfelelő antitestet tartalmaz .
A találmány szerinti konjugátumok számos terápiás és diagnosztikai célra használhatók fel. Ha olyan konjugátumokat alkalmazunk, amelyek antitest komponensként olyan anti-idiotipus monoklonális antitestet tartalmaznak, amely a HMW-MAA-n monoklonális antitest által felismert determinánsok belső képmása maga a HMW-MAA helyett, a következő előnyökkel járhat például:
- a konjugátum nagyobb immunogenicitása;
- a konjugátum stimulálja a B-sejt kiónokat, amelyek normálisan nem reagálnak HMW-MAA-ra;
- anti-HMW-MAA T-sejt válaszok lehetséges előidézése;
·· · · · · · • ·· · ··· »·· • · « · «4 ··» ·· ···« ·· «·
- azon mellékhatások kiküszöbölése, amelyek HMW-MAA alkalmazásával járhatnak együtt;
- a konjugátum nagy mennyiségben, könnyen előállítható.
Az idiotipus-anti-idiotipus reakcióhálóban betöltött immunregulátor funkciójuk következtében a találmány szerinti konjugátumokat felhasználhatjuk például tumorral asszociált antigénnel, úgymint HMW-MAA-val szembeni immunválasz modulálására. A modulálás specifikus, és irányíthatjuk például az anti-idiotipus antitestek termelésére felhasznált monoklonális antitest megválasztásával, vagyis az immunizáló Mab (Abl) specifikusságával és az anti-idiotipus MAb-k izotípusával, minthogy az anti-idiotipus antitestek különböző izotípusainak különböző immunregulátor hatása lehet. A találmány szerinti konjugátumok rendelkezhetnek immunregulátor funkciókkal, úgymint stimulálhatják a humorális és celluláris immunitást.
Ennek következtében a találmány szerinti konjugátumok hasznos szerek például tumorok, például melanóma megszűntetésére, kezelésére vagy adjuváns kezelésére, vagyis sikeresen alkalmazhatók például tumorok visszafejlesztésére és/vagy tumorok kiújúlásának megelőzésére. A találmány szerinti konjugátumokban lévő anti-idiotipus monoklonális antitestek testreszabottak lehetnek, hogy utánozzák a TAA specifikus determinánsait, ha az immunizáló antitestet megfelelően választjuk meg. A találmány szerinti anti-idiotipus antitest-konjugátumok hasznosak tumor megelőzésében is azáltal, hogy immunitást idéznek elő a TAA-nak az immunizáló monoklonális antitest által felismert determinánsaival szemben.
• ν· ·· ···« ν· ·· · 9 9 ¥ <
• ·· « ··· ··· • · · · · · ··· ·· ···« ·« ··
A találmány szerinti anti-idiotipus antitest alapú konjugátumok oltóanyagokként használhatók fel rákos megbetegedések kiegészítő kezelésére. Például a találmány szerinti azon konjugátumok, amelyek HMW-MAA-val reaktív Ab3 antitesteket indukálnak, vakcinaként használhatók fel rosszindulatú melanóma aktív immunterápiájára, például rosszindulatú melanóma kiegészítő kezelésére korai stádiumú melanomában szenvedő páciensek esetén, akiknél fennmaradt a metasztatikus betegségek veszélye a primer lézió műtéti kezelése után.
A találmány vonatkozik a találmány szerinti konjugátumokat tartalmazó gyógyszerkészítményekre is. A gyógyszerkészítmények tartalmaznak például egy, a találmány szerinti konjugátumot terápiásán hatékony mennyiségben, gyógyszerészetileg elfogadható, szervetlen vagy szerves, szilárd vagy folyékony hordozóanyagokkal együtt vagy azokkal keverékben. Előnyösek az olyan gyógyszerkészítmények, amelyek tartalmaznak még adjuvánst is, vagyis olyan szert, amely tovább növeli az immunválaszt. Adjuváns lehet a Freund-féle teljes adjuváns (ásványolaj emulzió, víz és mikobaktérium extraktumok), a Freund-féle nemteljes adjuváns (csak vizet és olajat tartalmazó emulzió) továbbá ásványi gélek például aluminium-hidroxi gélek, felületaktív anyagok, úgymint lizolecitin, polianionok, peptidek BCG (Bacillus Calmette-Guerin), stb. Különösen előnyösek azok a gyógyszerkészítmények, amelyek tartalmaznak egy, a találmány szerinti konjugátumot és adjuvánsként MF59-et (lásd a WO 90/14837 számú PCT szabadalmi bejelentést), valamint adott esetben N-(acetil-muramil)-L-alanil-D-izoglutamil-L-alanin-2[1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3 -(hidroxi-foszforil-oxi)-etil-amidot (MTP-PE-t; lásd a WO 90/14837 számú PCT szabadalmi • ·
- 24 bejelentést).
Előnyösek a parenterális adagolási! gyógyszerkészítmények. Az intramuszkuláris, szubkután vagy intravénás adagolásra szánt készítmények például izotóniás vizes oldatok vagy szuszpenziók, amelyeket adott esetben röviddel a felhasználás előtt készítünk liofilizált vagy koncentrált készítményekből. A gyógyszerkészítmények lehetnek sterilek, és tartalmazhatnak adjuvánsokat például az alkotórészek tartósítására, stabilizálására, nedvesítésére, emulgeálására vagy oldására, sókat az ozmózisnyomás szabályozására, puffért és/vagy viszkozitást szabályozó vegyületeket, például nátrium-karboxicellulózt, dextránt, poli(vinil-pirrolidon)-t vagy zselatint. A készítényeket ismert módon állítjuk elő, például szokásos elegyítéssel, oldással vagy liofilezéssel, és azok körülbelül 0,01% - körülbelül 50% hatóanyagot tartalmaznak. Az injekciós készítményeket előállítjuk, ampullákba vagy üvegekbe töltjük, és ismert módon, aszeptikus körülmények között lezárjuk. A vizes oldatokban való oldhatóság következtében a találmány szerinti konjugátumokat két ampullás rendszerben is kiszerelhetjük egy fenti adjuvánssal, például MF59-0-val.
Előnyösek az olyan gyógyszerkészítmények, amelyek a találmány szerinti konjugátumokat intramuszkuláris adagolásra depó formában adjuvánssal együtt tartalmazzák.
Ugyancsak előnyösek a találmány szerinti konjugátumokat tartalmazó gyógyszerkészítmények, amelyek nyálkahártyán át történő (mukozális) adagolásra alkalmasak [lásd H.F. Staats et al., Current Opinion in Immunology 6., 572-583 (1994)], vagy az olyan stabilizált gyógyszerkészítmények, amelyek lenyelhetők orális immunizálásra.
- 25 - ...........
Az adagolási módot és a dózist a kezelőorvos választja meg a beteg körülményei, a kezelendő betegség stádiuma és típusa és hasonlók figyelembevételével. A tarápiás dózis emlősök esetén körülbelül 0,1 jiig és körülbelül 100 ptg közötti, előnyösen körülbelül 0,1 /zg és körülbelül 10 μg közötti érték testtömeg kg-onként a beteg állapotától és az adagolási módtól függően. Emlősök esetén a legelőnyösebb dózis körülbelül 0,1 /xg és körülbelül 1 μg között van testtömeg kg-onként.
A találmány szerinti konjugátumokat felhasználhatjuk patogénekkel, például a fentiekben említett patogénekkel vagy TAA-val, úgymint HMV-MAA-val szembeni antitestek minőségi és mennyiségi meghatározására is. Ez különösen hasznos arra a célra, hogy kövessük a találmány szerinti konjugátumokkal végzett kezelés sikerét.
A találmány szerinti konjugátumokat felhasználhatjuk például olyan meghatározásokban, amelyek egy bizonyos Abl vagy Ab3 idiotop és a találmány szerinti konjugátum részét képező megfelelő anti-idotipus monoklonális antitest (Ab 2) közötti kötési kölcsönhatáson alapulnak. Ilyen meghatározás például a rádió-, az immunlecsapási, a latex agglutinációs és a hemagglutinációs immunoassay.
A találmány további tárgyát képezik az olyan reagenskészletek, amelyek az adott antigénnel szembeni antitestek (Ab 1 vagy Ab 3) minőségi és mennyiségi meghatározására szolgálnak, ahol az antigént a találmány szerinti konjugátum antitest komponense utánozza, amely reagenskészletek a találmány szerinti egy-egy konjugátumot és adott esetben más poliklonális vagy monoklonális antitesteket és/vagy segédanyagokat tartalmaznak.
« ·
A találmány különösen a példákban ismertetett kivitelekre, például konjugátumokra, azok előállítási eljárásaira, valamint az e konjugátumokat tartalmazó készítményekre vonatkozik.
A következő példák a találmány bemutatását szolgálják, az oltalmi kör korlátozása nélkül.
1. példa: CRM197 konjugálása ΜΚ2-0Η^1 antitesthez
1.1. CRM197 aktiválására szulfoszukcinimidil-4-(p-maleimido-
-fenil-bútiráttal (S-SMPB-vel)
CRM197 52 mg/ml koncentrációjú oldatát készítjük el PBS-sel (25 mM nátrium-foszfát puffer pH = 8,2, 150 mM NaCl), és 245 μΐ oldatot hozzáadunk 450 μΐ PBS/EDTA elegyhez (25 mM nátrium-foszfát puffer pH = 8,2, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA). Friss oldatot készítünk S-SMPB-ből úgy, hogy 9 mg S-SMPB-t hozzáadunk 1 ml DMSOhoz (dimetil-szulfoxidhoz). Ezután ennek az oldatnak a 200 μΐ-ét cseppenként hozzáadjuk a CRM197-t tartalmazó elegyhez. A reakcióelegyet jégen 2 órán át inkubáljuk.
1.2. Az aktivált CRM197 elválasztása a nemreagált S-SMPB-től
HR 10/10 gyors sómentesítő oszlopot (Pharmacia) kiegyenlítünk, és szobahőmésékleten PBS/EDTA-ban 7,2 pH-értéken 3 ml/min áramlási sebességgel működtetünk. Az aktivált CRM197 oldatot ezután az oszlopra tápláljuk. A fehérje elúciót 280 nm-en mért ultraibolya abszorpcióval követjük. Összegyűjtjük az első lejövő csúcsot, amely a kiegyenlítő pufferban lévő aktivált CRM197-et tartalmazza (kb. 2,2 ml). Az oldatot jégbe helyezzük.
1.3. az MK2-CH<flT antitestben lévő diszulfidkötések redukciója reaktív tiolcsoportok előállítása céljából ml mennyiségű, 12 mg/ml koncentrációjú MK2-CHjfí oldat (lásd a WO 89/11296 számú PCT szabadalmi bejelentést) - melyet
- 27 PBS-sel készítünk - pH-ját 8,0 értékre állítjuk be 20 μ.1 2M Trizma bázissal (Sigma). Ehhez 50 μΐ friss 1 molos vizes DTT (ditiotreitol) oldatot adunk (50 mM a végső koncentráció). Az elegyet ezután 37°C-on vízfürdőn, 30 percig inkubáljuk.
1.4. A redukált ΜΚ2-όΗ^1 elválasztása a nemreagált DTT-tői
HR 10/10 gyors sómentesítő oszlopot kiegyenlítünk, és szobahőmérsékleten, PBS/EDTA-ban 7,2 pH-értéken 3 ml/min áramlási sebességgel működtetünk. A redukált antitest oldatot ezután az oszlopra tápláljuk. A fehérje elúciót 280 nm-en mért ultraibolya abszorpcióval követjük. Összegyűjtjük az első lejövő csúcsot, amely a kiegyenlítő pufferban lévő redukált antitestet tartalmazza (kb. 2,2 ml). Az oldatot jégbe helyezzük.
1.5. Az aktivált CRM197 kapcsolása a redukált antitesthez
A redukált antitest oldatát folyamatosan keverjük szobahőmérsékleten, amíg cseppenként hozzáadjuk az aktivált CRM197-et. A reakcióelegyet ezután visszahelyezzük a jégbe, és a reakciót egy éjjelen át hagyjuk végbemenni. A végső oldat kis mennyiségű csapadékot tartalmaz, melyet úgy távolítunk el, hogy az oldatot centrifugáljuk, és egy 0,22 μιη-es membránszűrőn át szűrjük.
2. példa: A CRM197 és az antitest kon~iugátum végtermékének az analízise
2.1. Gélszűrés
A konjugátumot Superose 6 (Pharmacia) gélszűréses kromatográfiával analizáljuk, ekkor egy 300 kDa átlagos molekulatömegnek megfelelő csúcsot kapunk (I. csúcs), ezt követi a nem reagált CRM197 csúcsa. A 300 kD molekulatömegnek megfelelő csúcs annak felel meg, hogy három CRM197 [Mr (molekulatömeg) 47 kDa] kapcsolódik minden antitesthez.
2.2. SDS-PAGE
Denaturált gélelektroforézis redukáló szer (DTT) jelenlétében vagy távollétében egy 150 kDa-nál nagyobb Mr-ű nagy komplexet mutat ki. Az analízis nem mutat ki nemreagált antitestet, de megfigyelhető kis mennyiségű CRM197 jelenléte.
2.3. Szabad áramlásos (free flow) frakcionálás
Ez az eljárás diffúziós koefficiensük alapján választja szét a molekulákat és a gélszűrés ideális kiegészítése, minthogy megerősítheti az Mr-t, valamint kimutathat nagy aggregátumokat. Ha a
2.1. pont szerint nyert I. csúcs eluátumot analizáljuk, az eljárással kimutatjuk, hogy nincsenek jelen nagy aggregátumok és 300 kDa-os átlagos Mr-t igazolunk.
2.4. ELISA assay
Ha a konjugátum kötési aktivitását ELISA assay-vel vizsgáljuk, kimutatjuk, hogy a komplex képes olyan antitesthez kötődni, amelyet specifikusan a nemkonjugált MK2-CH-^1 antitest ismer fel.
Összefoglalva megállapítható, hogy a konjugációs reakcióban átlagosan három CRM197 kapcsolódik minden MEG-CH^l molekulához. A kapcsolódásnak az antitest H és L láncain keresztül kell megtörténnie, minthogy a komplexet nem tudja széttörni a redukáló SDS-PAGE.
3. példa: CRM197 konjugációja MK2-23 antitesthez
A CRM197-et az 1. példában leírt eljárással analóg módon konjugáljuk MK2-23 egér (murine) antitesthez (lásd az EP-A-0 428 485 számú európai szabadalmi bejelentést). A kapott konjugátumban három CRM197 molekula kapcsolódik egy-egy antitest molekulához.
4. példa: Eperek kísérleti vakcinációja az 1, és 3. példa szerinti konjupátumokkal
A konjugátumokat pirogénmentes sóoldattal hígítjuk úgy, hogy 600 /ig antitest/ml koncentrációjú oldatot kapjunk. Egyenlő térfogatú konjugátum oldatokat elegyítünk vagy Freund-féle teljes adjuvánssal (Freund's Complete Adjuvant, FCA), Freund-féle nemteljes adjuvánssal (Frenun's Incomplete Adjuvant, IFA) vagy MF59 adjuvánssal (Biocinnal), amely vagy tartalmaz 100 μg MTP-PE-t (MF-100) vagy nem (MF59-0). 15 μg antitestnek megfelelő konjugátumot injektálunk intramuszkulárisan Balb/c egerekbe a 0, 14-ik és 28-ik napokon. Az egerekből vérmintákat veszünk az első injekciót követő 0, 28-ik, 56-ik és 72-ik napokon. A nagy molekulatömegű-melanoma-asszociált antigént ELISA-eljárással határozzuk meg, amelyben kötött (adherent) A375 sejteket (American Type Culture Collection ATCC CRL 1619) használunk, amelyek antigénforrásként HMW-MAA-t fejeznek ki. Az antitest titereket az Abl (MAb 763.74) standard görbéje alapján kapjuk meg, amely Abl az eredeti antitest, amelyet az egér anti-idiotípus, és következésképpen kimérás antitest termelésére használtunk fel.
A kimérás antitest: CRM197 specifikus konjugátum (1:3, az 1. példa szerint) beadása kielégítő HWM-MAA specifikus antitest titert eredményez. Az MK2-23 egér (murine) antitestnek CRM197-tel végzett reakciójával (lásd 3. példa) előállított konjugátum szintén erős anti-HMW-MAA antitest választ vált ki egerekben. Annak érdekében, hogy valóban demonstráljuk azt a meglepő felismerést, hogy a konjugátumok kiemelkedő immunogenicitása oldható molekulához kötődik, szemben egy kis mennyiségű antigénként potens
- 30 - ...........
aggregtáummal, a kimérás antitest: CRM197 (1:3) konjugátumot tovább tisztítjuk Superose 6 kromatográfiával, hogy eltávolítsuk a nagy molekulatömegű (>6 millió) komponenseket, valamint, hogy feldúsítsuk az előrejelzett 300 kDa molekulatömegű fehérjére nézve. Azt találtuk, hogy az immunogén tulajdonság a nemaggregált 300 kDa frakcióhoz kötődik, amely az 1:3 arányú antitest: CRM197 konjugátumot képviseli.
5. példa: Gyógyszerkészítmény parenterális adagolásra mg konjugátumot, amely MK-CH'jjl kimérás antiidiotipus monoklonális antitestet (lásd 1. példa) vagy MK2-23 egér (murine) monoklonális antitestet (lásd 2. példa) tartalmaz, feloldunk 50 ml PBS-ben. Az oldatot átengedjük egy bakteriológiai szűrőn, a szúrletet 10 egyenlő részre osztjuk, és aszeptikus körülmények között ampullákba töltjük. Az ampullákat előnyösen hidegen, például 4°C-on tároljuk. Ezek a gyógyszerkészítmények alkalmasak injekciós célra, és felhasználhatók önmagukban vagy olyan gyógyszerkészítményekkel kombinációban, amelyek MF59-et (Biocint) és adott esetben MTP-PE muramii-peptidet tartalmaznak.
6. példa: Tetanusz toxoid (TT) konjugációja IgG2b-antitesthez
Az IgG2b-antitestnek elnevezett antitest egy IgG2b switch variáns, amelyet az MK2-23-termelő hibridóma antitestből szekvenciális szublining eljárással állítunk elő. Az IgG2b antitest tartalmaz egy nehézláncú variábilis domént, melynek aminosav szekvenciája a SEQ ID No. 2. azonosítási jelű szekvenciának felel meg, és egy könnyűláncú variábilis domént, amelynek az aminosavszekvenciája a SEQ ID No. 3. azonosítási jelű szekvenciának felel meg.
6.1. A TT aktiválása szulfoszukcinimidil-4-(p-maleimido-
-fenil)-butiráttal (S-SMPB-vel)
Friss S-SMPB oldatot készítünk úgy, hogy 11,3 mg S-SMPB-t adunk 1 ml DMSO-hoz (dimetil-szulfoxidhoz). Ezután ebből az oldatból 33,8 μΐ-t cseppenként hozzáadunk 4,4 ml TT oldathoz (koncentrációja 5,5 mg/ml), amely TT oldatot PBS-sel (25 mM nátrium-foszfát puffer, pH = 8,2, 150 mM NaCl) készítünk. Ezután a reakcióelegyet jégbe helyezve 2 órán át inkubáljuk.
6.2. Az aktivált TT elválasztása a nemreagált S-SMPB-től
HR 10/10 gyors sómentesítő oszlopot (Pharmacia) kiegyenlítünk, és szobahőmérsékleten PBS/EDTA-ban (25 mM nátrium-foszfát puffer, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) pH = 7,2 értéken 2 ml/min áramlási sebességgel működtetünk. Ezután az aktivált TT oldat alikvot részeit felvisszük az oszlopra. A fehérje elúciót 280 nm hullámhosszon mért ultraibolya abszorpcióval követjük. Az első lejövő csúcsot, amely az aktivált TT-t tartalmazza a kiegyenlítő pufferban, összegyűjtjük (körülbelül 2,2 ml). Ezt az oldatot jégbe helyezzük.
6.3. Az IgG2b antitestben lévő diszulfidok redukciója reaktív tiolok előállítása céljából
0,75 mg IgG2b oldatot - koncentrációja 6,6 mg/ml, oldószere PBS - reagáltatunk 15 μΐ friss, 0,5M vizes DTT-vel (ditiotreitollal), amely 50 mM EDTA-t tartalmaz. A reakcióelegyet ezután 37°C-on vízfürdőben 15 percen át inkubáljuk.
6.4. A redukált IgG2b antitest elválasztása a nemreagált
DTT-től
HR 10/10 gyors sómentesítő oszlopot kiegyenlítünk, és szobahőmérsékleten PBS/EDTA-ban pH = 7,2 értéken 2 ml/min áramlási sebességgel működtetünk. Ezután a redukált antitest oldatot betápláljuk az oszlopra. A fehérje elúciót 280 nm-en mért ultraibolya abszorpcióval követjük. Az első lejövő csúcsot, amely a kiegyenlítő pufferban lévő redukált antitestet tartalmazza, öszszegyűjtjük (körülbelül 2,2 ml). Ezt az oldatot jégbe helyezzük.
6.5. Az aktivált TT kapcsolása a redukált antitesthez.
Az aktivált TT oldatát (9 ml) folyamatosan keverjük szobahőmérsékleten, miközben a redukált antitestet (2,5 ml) cseppenként hozzáadjuk. A reakcióelegyet ezután visszahelyezzük a jégre, és a reakciót egy éjjelen át hagyjuk végbemenni. A végső oldatot 72 órán át dializáljuk PBS-sel szemben, pH =7,2 értéken, és átszűrjük egy 0,22 /im-es membránszúrőn.
6.6. SBS-PAGE
Redukálószer (β-merkapto-etanol) jelenlétében végzett denaturáló gélelektroforézis egy nagy komplexet mutat ki, Mr éréke több mint 150 kDa. Nem mutatható ki nemreagált antitest, de megfigyelhető visszamaradt TT.
Deponálási adatok:
Az MK2-CH-^1 antitestet termelő ΜΚ2-ΟΗ·^1-6 hibridóma sejtvonalat az Állati Sejtkultúrák Európai Gyűjteményében (European Collection of Animál Cell Cultures, ECAAC), Porton Down, Salsibury, Wilts SP40JG, United Kingdom, 1992. március 6-án helyezték letétbe a 92030642 leltári számon.
A leírásban megadott aminosavszekvenciákat a következőkben ismertetjük.
Szekvencia lista
4(1) Általános információ:
(i) Bejelentő:
(A) Név: Ciba-Geigy AG (B) Utca: Klybecstr. 141 (C) Város: Bázel (E) Ország: Svájc (F) Postai irányítószám: 4002 (G) Telefon: +41 61 69 11 11 (H) Telefax: +41 61 696 79 76 (I) Telex: 962 991 (ii) A találmány címe: Javított tulajdonságú antitest konjugátumok (iii) Szekvenciák száma: 3 (iv) Computer olvasható forma (A) Középméret: Floppy disk (B) Computer: IBM PC compatibilis (C) Működtető rendszer: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (2) SEQ ID NO: 1:
| (i) Szekvencia | j ellemzők: | |
| (A) | Hossz: | 117 aminosav |
| (B) | Típus: | aminosav |
| (C) | Szál : | egy szál |
| (D) | Topológia: ismereti |
(ii) Molekulatípus: fehérje ·· · (xl) Szekvencia leírás: SEQ ID NO: 1.
| Leu GLn Glu 1 | Ser | Gly Gly Gly Leu Val 5 | Gin 10 | Pro | Gly | Gly | Ser | Arg 15 | Lys | ||||||
| Leu | Ser | Cys | Alá | Alá | Ser | Gly | Phe | Thr | Phe | Ser | Ser | Phe | Gly | Met | His |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Trp | Val | Arg | Gin | Alá | Pro | Glu | Lys | Gly | Leu | Glu | Trp | Val | Alá | Tyr | Ile |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Ser | Ser | ASp | Ser | Ser | Asn | Ile | Tyr | Tyr | Alá | Asp | Thr | Val | Lys | Gly | Arg |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Phe | Thr | Ile | Ser | Arg | Asp | Asn | Pro | Lys | Asn | Thr | Leu | Phe | Leu | Gin | Met |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Thr | Ser | Leu | Arg | Ser | Glu | Asp | Thr | Alá | Met | Tyr | Tyr | Cys | Alá | Arg | Ser |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Asn | Tyr | Val | Gly | Tyr | His | Val | Arg | Trp | Tyr | Phe | Asp | Val | Trp | Gly | Gin |
| 100 | 105 | 110 |
Gly Thr Thr Val Thr
115
V « *··· • ♦ <
- 35 (2) SEQ ID NO: 2 :
| (i) Szekvencia | j ellemzők: | |
| (A) | HOSSZ: | 120 aminosav |
| (B) | Típus: | aminosav |
| (C) | Szál : | egy szál |
| (D) | Topológia: ismereti |
(ii) Molekulatípus: fehérje (xi) Szekvencia leírás: SEQ ID NO: 2:
| Asp 1 | Val | Val | Leu Val 5 | Glu Ser Gly | Gly | Gly Leu 10 | Val | Gin | Pro Gly 15 | Gly | |||||
| Ser | Arg | Lys | Leu | Ser | Cys | Alá | Alá | Ser | Gly | Phe | Thr | Phe | Ser | Ser | Phe |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Gly | Met | His | Trp | Val | Arg | Gin | Alá | Pro | Glu | Lys | Gly | Leu | Glu | Trp | Val |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Alá | Tyr | He | Ser | Ser | Asp | Ser | Ser | Asn | He | Tyr | Tyr | Alá | Asp | Thr | Val |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Lys | Gly | Arg | Phe | Thr | He | Ser | Arg | Asp | Asn | Pro | Lys | Asn | Thr | Leu | Phe |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Leu | Gin | Met | Thr | Ser | Leu | Arg | Ser | Glu | Asp | Thr | Alá | Met | Tyr | Tyr | Cys |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Alá | Arg | Ser | Asn | Tyr | Val | Gly | Tyr | His | Val | Arg | Trp | Tyr | Phe | Asp | Val |
| 100 | 105 | 110 |
Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr
115 120 * * # ·
| SEQ | ID NO | : 3 : | |
| (i) | Szekvencia | j ellemzők: | |
| (A) | HOSSZ: | 108 aminosav | |
| (B) | Típus: | aminosav | |
| (C) | Szál : | egy szál | |
| (D) | Topológia: ismereti |
(ii) Molekulatípus: fehérje (xi) Szekvencia leírás: SEQ ID NO: 3:
| Gin 1 | Leu Thr Gin | Ser 5 | Pro Alá | Ser | Leu Alá 10 | Val | Ser | Leu Gly | Gin 15 | Arg | |||||
| Val | Thr | He | Ser | Cys | Arg | Alá | Ser | Glu | Ser | Val | Glu | Tyr | Tyr | Gly | Ser |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Ser | Leu | Met | Gin | Trp | Tyr | Gin | Gin | Lys | Pro | Gly | Gin | Pro | Pro | Lys | Leu |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Leu | He | Tyr | Alá | Alá | Ser | Asn | Val | Glu | Ser | Gly | Val | Pro | Alá | Arg | Phe |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Ser | Gly | Ser | Gly | Ser | Gly | Thr | Asp | Phe | Ser | Leu | Asn | He | His | Pro | Val |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Glu | Glu | Asp | Asp | He | Alá | Met | Tyr | Phe | Cys | Gin | Gin | Ser | Arg | Lys | He |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Pro | Tyr | Thr | Phe | Gly | Gly | Gly | Thr | Lys | Leu | Glu | He | ||||
| 100 | 105 |
» >
Claims (16)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Oldható, nemaggregált hordozófehérje-antitest konjugátum, amely immunválaszt vált ki in vivő, amelyben egy vagy több hordozófehérje molekula van hely-szelektíven és kovalensen egy antitest molekula konstans régió részéhez kapcsolva.
- 2. Az 1. igénypont szerinti olyan konjugátum, amelyben a hordozófehérje baktériumtoxinból származtatható.
- 3. A 2. igénypont szerinti olyan konjugátum, amelyben a hordozófehérje CRM197 vagy tetanusz toxoid.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti olyan konjugátum, amelyben a hordozófehérje és az antitest komponens közötti kapcsolást tioéter kötés hozza létre.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti olyan konjugátum, amelyben az antitest anti-idiotipus antitest, különösen olyan anti-idiotipus antitest, amely nagy molekulatömegű-melanoma-asszociált antigénen (HMW-MAA) monoklonális antitest által felismert determinánsok belső képmása.
- 6. Az 5. igénypont szerinti olyan konjugátum, amelyben az antitest SEQ ID No. 3 azonosítási számú aminosavszekvenciájú könnyűláncú variábilis domént vagy nehézláncú variábilis domént - amely a SEQ ID No. 1 azonosítási jelű aminosavszekvenciájú polipeptidből vagy a SEQ ID No. 2 azonosítási jelű aminosavszekvenciájú polipeptidből áll - tartalmaz.
- 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum felhasználása az emberi vagy állati testen végzett diagnosztikai vagy terápiás eljárásban.• «
- 8. A 7. igénypont szerinti felhasználás aktív immunterápiában végzett vakcinációként.
- 9. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum felhasználása gyógyszerkészítmények előállítására.
- 10. Gyógyszerkészítmény, amely az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti konjugátumot, gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagot és adott esetben adjuvánst tartalmaz.
- 11. Eljárás az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum előállítására, azzal jellemezve, hogy az antitestet a hordozófehérjével olyan körülmények között reagáltatjuk, amelyek között egy antitest molekulához egy vagy több hordozófehérje molekula kapcsolódik kovalens kötéssel, majd a kívánt konjugátumot izoláljuk.
- 12. Eljárás immunválasz kiváltására emlősben, különösen emberben, azzal jellemezve, hogy olyan oldható, nemaggregált hordozófehérje - antitest konjugátumot adagolunk, amelyben egy vagy több hordozófehérje molekula hely-szelektíven és kovalensen kapcsolódik egy antitest molekula konstans régió részéhez.
- 13. Eljárás emlősök, különösen ember aktív immunterápiájára, azzal jellemezve, hogy az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti konjugátumot adjuk be.
- 14. Eljárás antitumor válasz kiváltására emlősökben, különösen emberben, ennek szükségessége esetén, azzal jellemezve, hogy az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti konjugátumot adjuk be.
- 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, amelyben az antitumor válasz tumor-asszociált antigén (TAA) ellen irányul.
- 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, amelyben az antitumor válasz nagy molekulatömegű-melanoma-asszociált antigén ellen irányul.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP94810173 | 1994-03-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9500586D0 HU9500586D0 (en) | 1995-04-28 |
| HUT71776A true HUT71776A (en) | 1996-01-29 |
Family
ID=8218230
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9500586A HUT71776A (en) | 1994-03-21 | 1995-02-24 | Antibody conjugates with improved properties |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0820545A (hu) |
| KR (1) | KR950031111A (hu) |
| AU (1) | AU1481795A (hu) |
| CA (1) | CA2144936A1 (hu) |
| FI (1) | FI951276A (hu) |
| HU (1) | HUT71776A (hu) |
| IL (1) | IL113022A (hu) |
| NO (1) | NO951061L (hu) |
| NZ (1) | NZ270734A (hu) |
| RU (1) | RU95104325A (hu) |
| ZA (1) | ZA952269B (hu) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2865737B1 (fr) * | 2004-02-03 | 2006-03-31 | Anteis Sa | Gel reticule biocompatible |
-
1995
- 1995-02-24 HU HU9500586A patent/HUT71776A/hu unknown
- 1995-03-14 AU AU14817/95A patent/AU1481795A/en not_active Abandoned
- 1995-03-17 JP JP7059022A patent/JPH0820545A/ja active Pending
- 1995-03-17 RU RU95104325/14A patent/RU95104325A/ru unknown
- 1995-03-17 CA CA002144936A patent/CA2144936A1/en not_active Abandoned
- 1995-03-17 FI FI951276A patent/FI951276A/fi unknown
- 1995-03-17 NZ NZ270734A patent/NZ270734A/en unknown
- 1995-03-17 IL IL11302295A patent/IL113022A/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-03-20 KR KR1019950005739A patent/KR950031111A/ko not_active Application Discontinuation
- 1995-03-20 NO NO951061A patent/NO951061L/no unknown
- 1995-03-20 ZA ZA952269A patent/ZA952269B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA952269B (en) | 1995-09-21 |
| IL113022A0 (en) | 1995-06-29 |
| HU9500586D0 (en) | 1995-04-28 |
| CA2144936A1 (en) | 1995-09-22 |
| AU1481795A (en) | 1995-09-28 |
| JPH0820545A (ja) | 1996-01-23 |
| NO951061D0 (no) | 1995-03-20 |
| FI951276A (fi) | 1995-09-22 |
| KR950031111A (ko) | 1995-12-18 |
| NO951061L (no) | 1995-09-22 |
| IL113022A (en) | 2000-02-29 |
| NZ270734A (en) | 1997-05-26 |
| FI951276A0 (fi) | 1995-03-17 |
| RU95104325A (ru) | 1996-12-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4400376A (en) | Immunological preparations | |
| FI104539B (fi) | Menetelmä muunnellun Neisseria meningitidis ryhmä B polysakkaridin tai muunnellun E. coli K1 kotelomaisen polysakkaridin valmistamiseksi | |
| JP6335102B2 (ja) | Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染に対する多糖類ワクチン | |
| CA1340958C (en) | Synthetic peptides representing a t-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines | |
| US6756361B1 (en) | Enterococcus antigens and vaccines | |
| US4950480A (en) | Enhancement of antigen immunogenicity | |
| US6350449B1 (en) | Antibodies to meningococcal polysaccharide conjugate vaccines | |
| WO1996040731A1 (en) | Pegylated modified proteins | |
| US5601826A (en) | Peptide which produces protective immunity against tetanus | |
| JPS60155133A (ja) | アンチ−イデイオタイプのモノクロナル抗体を採用したアンチ−イデイオタイプワクチン | |
| CS131891A3 (en) | Vaccine | |
| HUT71776A (en) | Antibody conjugates with improved properties | |
| Brumeanu et al. | Immunopotency of a viral peptide assembled on the carbohydrate moieties of self immunoglobulins | |
| Olson et al. | Identification of functional epitopes of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A using synthetic peptides and subclone products | |
| NZ286599A (en) | use of protein antibody conjugate for stimulating an immune response | |
| AU3798699A (en) | Antibody conjugates with improved properties | |
| EP0674907A2 (en) | Conjugabes of a antibody and a carrier protein, useful for active immunotherapy | |
| JP2004532261A (ja) | ポリクローナル免疫グロブリンの使用 | |
| WO1994000487A1 (en) | Peptide which produces protective immunity against tetanus | |
| Sivolapenko et al. | Enhanced in vivo immunogenicity induced by an antibody to the IL‐4 receptor‐associated gp200‐MR6 molecule | |
| GB2045256A (en) | Immunological preparations |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DGB9 | Succession in title of applicant |
Owner name: NOVARTIS AG, CH |
|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |