HUT67319A

HUT67319A - Compositions for treating wounds

Info

Publication number: HUT67319A
Application number: HU9400593A
Authority: HU
Inventors: Ella Lindenbaum
Original assignee: Life Medical Sciences Inc
Priority date: 1991-08-30
Filing date: 1992-02-28
Publication date: 1995-03-28
Also published as: EP0650366A1; BR9206433A; FI940932A0; JPH06510453A; DE69230344T2; WO1993004691A1; IL101229A0; HU9400593D0; DE69230344D1; FI940932A; AU670413B2; CA2116549A1; AU2587992A; EP0650366B1; EP0650366A4; US5461030A; ATE186840T1

Description

A találmány új, a bőr és a bőrrel rokon szövetek sebgyógyulását elősegítő készítményekre és e készítmények alkalmazási módszereire vonatkozik. Közelebbről a találmány olyan sebgyógyító készítményekre vonatkozik, amelyek alapja celluláris tápközeg (sejt-tápközeg) és legalább egy, anabolikus fehérje típusú növekedési (szaporodási) hormon vagy növekedési faktor kombinációja.

A bőrseben bármely testszövet olyan, folytonosságában beálló hiányát értik, amelyet a bőr minimális, közvetlen sérülése (károsodása) okoz. Számos esetben a sérült bőr gyors zárása általában konzervatív módszerekkel - például gyógyszerek alkalmazásával - vagy másként, különböző sebészi eljárásokkal például varrással, bőrimplantátum beültetésével vagy tenyészetben növesztett, új bőr beültetésével - valósítható meg.

A sebek bőrsejtekkel elérhető zárását kétféle módszer alkalmazásával végzik: tenyészetben kialakított bőrimplantátummal vagy kivágott bőr beültetésével. E két módszer azonban csak akkor alkalmazható, ha a seben már megfelelő sarjszövet képződött; ennek kialakulása hosszú ideig tarthat vagy szövődménnyel járhat. Általánosabb a kivágott bőrimplantátum alkalmazása, ez azonban olyan készítményeket igényel, amelyek a szerv életképességét fenntartó anyagot tartalmaznak, továbbá megkívánja a sebek kezelését a seb sérülésének gyógyulása céljából.

A bőr legáltalánosabb sérülései az égési sebek. Az égés a felhám (epidermisz) és a mélyebben fekvő bőrszövetek és szubkután szövetek roncsolását okozza, s ezek legtöbbje normális • ·

- 3 gyógyulási válasszal regenerálható, ha az égett terület nem kiterjedt vagy fertőzött. Az égések az Egyesült Államokban évente 2 milliónál is több sérülést idéznek elő, és évente több mint 10000 haláleset súlyos égési sérülések következménye.

S. T. Boyce és munkatársai [Journal of Investigative Dermatology 81. 33S-40S (1983)] szérummentes tenyészetrendszerre alapozott készítményeket ismertetnek, normális emberi felhámszarusejtek tenyésztésére. E készítmények epidermisz-növekedési faktorral, inzulinnal, hidrokortizonnal, etanol-aminnal, foszfo-etanol-aminnal és teljes szarvasmarha-hipofízis-kivonattal (Bovine Pituitary Extráét, rövidítve: wBPE) kiegészített, optimalizált MCDB 153 tápközeget tartalmaznak. Megemlítik, hogy a wBPE indítja meg az elsődleges tenyészetet, és a sejtek öregedése körülbelül 40 sejtoszlással kialakult populációban következik be. Közölték továbbá [J. of Cellular Physiology 110. 219 (1982)], hogy szarvasmarha-magzatszérum-fehérje (Fetal Bovine Serum Protein, rövidítve: FBSP) emberi epidermisz-szarusejtek tenyésztése során a teljes szérumot helyettesítheti, és F12 jelenléte a wBPE szükségletet kiküszöbölheti. Jelenlegi tudásunk szerint a wBPE nem olyan, általánosan használt reagens, amelyet reprodukálható formában könnyű elkészíteni, mivel összetétele nem állandó.

J. J. Wille, Jr. és munkatársai [J. of Cellular Physiology, 121. 31 (1984)] közlik növekedési faktorok, hormonok és kalcium hatásait normális emberi elő-szarusejtek másodlagos tenyészeteinek a szaporodására és differenciálódására. A klonális szaporodást úgy érték el, hogy az MCBD 153-at epidermisz-növekedési • ·

- 4 faktorral vagy wBPE-vel egészítették ki azzal a feltétellel, hogy inzulin volt jelen. Inzulin hiányában mind EGF-re, mind wBPE-re szükség van. Megjegyzik, hogy az optimális klonális szaporodás 10 ng/ml epidermisz-növekedési faktort és 0,3 mM kalciumot tartalmazó közegben következett be.

A 4 673 649 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban készítményeket javasolnak emberi szarusejtek (keratinociták) populációjának klonális szaporítására primer tenyészetben, bőrsérülés gyógyítására; e készítmények jellemző kolóniaképző hatásfoka körülbelül 20 %. A készítmény összetétele: MCDB 153, 1,0 ng/ml - 25 ng/ml koncentrációban vett epidermisz-növekedési faktor és 0,5 Mg/ml - 50 Mg/ml koncentrációjú inzulin. Adott esetben a készítmények teljes szarvasmarha-hipofízis-kivonatot (wBPE) tartalmazhatnak 7 Mg/ml - 700 gg/ml koncentrációban, valamint etanol-amint, hidrokortizont, foszfo-etanol-amint és kalcium-kloridot is tartalmazhatnak. E készítmények különösen alkalmasak beültetés céljára szolgáló bőrsejtek tenyésztésére. A szerzők nem említik a közölt készítmények alkalmazásának lehetőségét sebek kezelésére in vivő körülmények között, vagy tárolt, kivágott bőrimplantátumok életképességének meghosszabbítására vagy fenntartására. Egy teljesen új,

940 666 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (feltalálói az előbbiek; részben folytatása a fentebb idézett szabadalmi leírásnak) igénylik ugyanezeknek a készítménynek az alkalmazását emberi epidermiszsejtek populációjának tenyésztésére. A javasolt készítmények célja bőrsejtek szaporítása, valamint monorétegek vagy egymásra helyeződő rétegek meg valósítása, amelyek a test bőrtől megfosztott területein felhasználhatók. Más szavakkal: ezeket a készítményeket olyan, tenyésztett bőrsejtek kialakítására alkalmazzák, amelyeket beültetésre használnak fel. A fentebb idézett közleményeken kívül további, előzőleg ismert irodalomban valószínűsítik, hogy a sebgyógyulást az epidermisz-növekedési faktor fibroblasztok szaporításával elősegítheti.

Az alábbiakban a találmány tárgyát részletesen ismertetjük. A jelen találmány egyik tárgya olyan új készítmények biztosítása, amelyek a sebgyógyulás meggyorsítására alkalmazhatók.

A találmány további tárgya olyan új készítmények kialakítása, amelyek a sebgyógyulást meggyorsítják, továbbá a bőr és egyéb szövetek életképességét meghosszabbítják.

A jelen találmány tárgya továbbá olyan új készítményekre is vonatkozik, amelyek a sebgyógyulás meggyorsítására alkalmazhatók, s amelyek meghatározott, könnyen felismerhető alkotórészeket tartalmaznak.

A találmány még további tárgya olyan sebgyógyító készítmények kialakítása, amelyek a sebgyógyulást a nedvesség sebfelületen való fenntartásával gyorsítják.

A találmány olyan sebgyógyító készítményekre is vonatkozik, amelyek a nedvességet a seb felületén fenntartják, és a seb gyógyulását hidratált hidrogél polimer kiszerelő rendszerek alkalmazásával elősegítik.

A jelen találmánynak ilyen és további tárgyai könnyen átláthatók a találmány alább következő leírásából.

A találmány készítményekre, valamint a készítményeket alkalmazó, sebkezelő eljárásokra vonatkozik. A találmány szerinti készítmények felhasználhatók sebek kezelésére a sebgyógyulás meggyorsítása útján. A találmány szerinti készítmények celluláris tápközeg, előnyösen szérummentes sejt-tápközeg hatásos mennyiségét legalább egy sejtszaporodást serkentő vegyület - például nemszteroid, előnyösen természetes anabolikus hormon vagy transzformáló szaporodási faktor - hatásos mennyiségének a kombinációját tartalmazzák.

A találmány előnyös megvalósítási formáiban a készítmények növekedési hormont, legelőnyösebben emberi növekedési hormont tartalmaznak legalább egy, a sejtszaporodást serkentő vegyületként. A készítményben a sejtszaporodást serkentő vegyület általában - a készítményre vonatkoztatva - körülbelül legalább 0,05 ng/ml hatásos koncentrációban van jelen, az előnyös koncentrációtartomány körülbelül 0,5 ng/ml-től körülbelül 50 ng/mlig terjed. Olyan készítményekben, amelyeket szilárd vagy koncentrált formában - például gél, krém, elixír vagy por formájában - alkalmazunk, a sejtszaporodást serkentő vegyület hasonló koncentrációkban van jelen, mint az oldatokban: a sebkezelő készítmény tömegére számítva előnyösen körülbelül 0,00000005 - 0,000005 tömeg% mennyiségben.

A sejtszaporodást serkentő vegyület mennyisége és típusa változhat, előnyösen azonban emberi növekedési hormont alkalmazunk, legelőnyösebben inzulinnal és/vagy trijód-tironinnal (T3) kombinálva. Az emberi növekedési hormon alkalmazandó előnyös mennyisége általában a seb típusától és méretétől függ, • ·

- 7 általában azonban, legtöbb esetben a növekedési hormont a készítmény tömegére vonatkoztatva körülbelül 0,5 ng/ml-től körülbelül 50 ng/ml-ig terjedő koncentrációtartományban alkalmazzuk. Olyan készítmények esetében, amelyeket szilárd vagy koncentrált alakban - például gél, krém, elixír, por alakjában - alkalmazunk, az emberi növekedési hormon a sebkezelő készítmény tömegére vonatkoztatva körülbelül 0,5 ng/ml-től körülbelül 50 ng/ml-ig terjedő koncentrációtartományban vagy ennél nagyobb mennyiségben (körülbelül 0,00000005-től körülbelül 0,000005 %-ig terjedő mennyiségben) van jelen.

Az 1-6. ábrák az 5-11. példákban leírt kísérletek eredményeit szemléltetik. Ezek a grafikonok mutatják a gélközeggel és hormonokkal kezelt sebek területének változását különböző kontrollokhoz képest. E grafikonokon A_o a seb kezdeti területét, A_b a seb t napján mért területét jelenti.

A találmány leírása során több fogalmat használunk, amelyeket az alábbiakban definiálunk.

A seb megnevezést az egész leírásban olyan bőrsérülések leírására használjuk, amelyeket a jelen találmány szerinti készítményekkel és a jelen találmány szerinti eljárással kezelünk. Ezen belül bőrseben értjük a bőrszövet olyan folytonossági hiányát, amelyet közvetlen bőrsérülés idéz elő. A bőrsebeket általában több csoportra osztjuk, ezek: szúrási, vágási sérülések - beleértve a különböző sebészi beavatkozásokat is -, kimetszések, szakításos sebek, horzsolások és égési sebek, beleértve a nagy kiterjedésű égett felületeket is. A találmány szerinti készítmények különböző mértékben alkalmasak a bőr • ·

- 8 valamennyi sebe gyógyulásának az elősegítésére, beleértve azokat is, amelyek mesh autográf eljárás után következnek be.

A kiszerelő polimer (delivery polymer) kifejezést az egész leírásunkban olyan polimer megjelölésére használjuk, amely egy sejt-tápközeggel (előnyösen szérummentes tápközeggel) és sejtszaporodást serkentő vegyülettel kombinálva olyan gyógyszerformák (készítmények) előállítására használható; amelyek előnyösen alkalmazhatók a jelen találmány értelmében sebek kezelésére helyi (topikus) adagolással. Ilyen kiszerelő polimerek például: számos hidrogén hidratált vagy nemhidratált alakban, így a (hidroxi-etil)-metakrilát (HEMA), gliceril-metakrilát (CMA), poli(vinil-pirrolidon) (PVP), polietilénglikol (PEG), kollagén, zselatin, agaróz (például agarózzal telített gél formájában), valamint a fentiekkel rokon polimerek és keverékeik. A szakmai gyakorlattal rendelkező egyén változtathatja a találmány szerinti készítményekben használt kiszerelő polimer típusát és mennyiségét a topikus adagolásra alkalmas, sebgyógyulást növelő jellemzők megvalósítása céljából. A kiszerelő polimer kifejezést olyan polimerek leírására is használjuk, amelyek a találmány szerinti sebgyógyító készítményeknek késleltetett ütemű vagy lassú felszabadulást biztosító sajátságokat kölcsönöznek.

A szérummentes celluláris tápközeg (sejt-tápközeg) kifejezést az egész leírásban olyan közeg megjelölésére használjuk, amely szérumot nem tartalmaz, és a sejtszaporodást serkentő vegyülettel kombinálva a találmány szerinti sebgyógyító készítményeket eredményezi. A találmány szerinti szérummentes sejt« · • « tápközeg a következő komponenseket tartalmazza: (a) esszenciális aminosavakat; (b) nem-esszenciális aminosavakat; és (c) vitaminként biotint, folátot, lipoátot, niacinamidot, pantotenátot, piridoxint, riboflavint, tiamint és B12 vitamint. Mind az (a), mind a (b) és (c) komponensek a sejtszaporodást serkentő vegyületekkel együtt olyan hatásos koncentrációkban és/vagy mennyiségekben vannak jelen, amelyek hatásosan elősegítik a környező, sérült (károsodott) vagy a sebgyógyulásért felelős sejtek szaporodását. A találmány szerint alkalmazott esszenciális és nem-esszenciális aminosavak előnyös koncentrációtartománya körülbelül 5,0 μΜ (10^-® móltól) körülbelül 50 mmól-ig (10~³ mól-ig) terjed. A találmány szerint alkalmazott vitaminok előnyös koncentrációtartománya körülbelül 1 nanomól (10“⁹ mól) és körülbelül 10 μΜ között van. AZ (a), (b) és (c) komponenseken kívül a találmány szerinti tápközeg adott esetben egy vagy több alábbi komponenst is tartalmazhat: (d) purinokat és pirimidineket; (e) egyéb szerves vegyületeket; (f) nagyobb mennyiségű szervetlen iont; (g) nyomelemeket; (h) pufferanyagokat és indikátorokat, valamint (i) egyéb kiegészítő anyagokat tartalmazhat. Valamennyi - (d), (e), (f), (g), (h) és (i) - komponens a találmány szerinti tápközegben - amennyiben jelen van - a sebgyógyulás folyamataiban részt vevő sejtek szaporodását hatásosan elősegítő mennyiségben van jelen. A (d), (e), (h) és (i) komponensek előnyös koncentrációtartománya körülbelül 1 nanomóltól körülbelül 10 mmól-ig terjed. Az (f) és (h) komponensek előnyös koncentrációi körülbelül 1 μιηόΐ-tól körülbelül 50 μmól-ig terjedő tartományban vannak. A szakmai ···· ·« *· », ·· ·· ·· »· « ./.: :: ··; ··:

- ίο gyakorlattal rendelkező egyén a találmány kitanításának segítségével a sejt-tápközeg komponenseinek típusát és mennyiségét könnyen módosíthatja.

A szérummentes celluláris tápközegen kívül a találmány céljára szérumot tartalmazó sejt-tápközeget is használhatunk, jóllehet szérumtartalmú sejt-tápközeg alkalmazása általában kevésbé előnyös, mint a szérummentes közegé. Ilyen tápközegek például - számos más között - a DMEM, HAM F12 és HAM F10, melyek mindegyike szérumot tartalmaz. A celluláris tápközeg kifejezést használjuk a találmányban alkalmazásra számításba vehető, valamennyi típusú tápközeg megnevezésére, beleértve a szérummentes sejt-tápközeget is.

A találmány szerinti sejt-tápközeg a kereskedelmi forgalomból beszerezhető közegeket oldat formájában vagy liofilizált alakban tartalmazhatja. Az alkalmazott sejt-tápközeg lehet liofilizált formában, amelyet - előnyösen sterilizált - desztillált vízzel oldattá alakítunk (rekonstituálunk), majd kiegészítjük a sejtszaporodást serkentő vegyülettel vagy más adalékanyagokkal. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy a tápközeget a találmány szerinti készítményekben liofilizált formában vagy ehhez hasonló típusú szilárd anyag alakjában alkalmazzuk (inkább, mint oldat formájában), különösen ha a kiszerelés során géleket, krémeket, elixíreket, porokat vagy más kiszerelő vivőanyagokat óhajtunk alkalmazni. Szilárd anyagok alkalmazása során nyilvánvalóan előnyös a találmány szerinti sebgyógyító készítmények kiszerelése hidrogén alakjában vagy más, olyan formában, amelyek a nedvesítéshez elegendő mennyiségű vizet tartalmaznak.

• : :: : ··; ··;

•· ·· ·· ·· ♦ *

- 11 Számos közeg kereskedelmi forgalomból beszerezhető (előnyösen szérummentes közeg) a Collaborative Research Incorporated (Bedford Massachusetts) cégtől vagy a Biological Industries cégtől (Beth HaEmek, Izrael). Ezek a közegek a beszerzett formában vagy a találmány oltalmi körén és gyakorlatán belül eső módosítással használhatók.

A sejtszaporodást serkentő vegyület vagy celluláris szaporodást serkentő vegyület kifejezést teljes leírásunkban olyan vegyületek megnevezésére alkalmazzuk, amelyeket a jelen találmány szerinti készítményekhez adunk, mivel kedvező hatást fejtenek ki sejtek szaporodásának és fejlődésének a serkentésében. A találmányban alkalmazható, sejtszaporodást serkentő vegyületek például az anabolikus fehérje növekedési hormonok, így az emberi növekedési hormon (GH) és az ezzel rokon, állati növekedési hormonok; más nem-szteroid anabolikus hormonok, például a tiroxin (T4), trijód-tironin (T3) és az inzulin - többek között -, valamint szaporodási faktorok, így például az epiteliális szaporodási faktor (EGF), a trombocitákból származó szaporodási faktor (PDGF), transzformáló szaporodási faktor (TGF) és az inzulinszerű növekedési faktor (TGF), valamint további faktorok. A találmány szerinti készítményekben egy vagy több, sejtszaporodást serkentő vegyületet építünk be hatásos mennyiségben azon környező sejtek szaporodásának a serkentésére, amelyek károsodtak vagy a sebgyógyulásért felelősek. A találmányban alkalmazható, sejtszaporodást serkentő vegyületek például a fentebb említett vegyületek vagy azokkal egyenértékű vegyületek természetes eredetű vagy szintetikus úton előállított változa• ·· · *· • »

- 12 tai, továbbá a szükséges esetekben génsebészettel és géntechnológiai eljárásokkal előállított vegyületek is.

A találmány szerinti készítményekben alkalmazott valamennyi komponens mennyisége a seb típusától függ, azonban minden egyes komponenst olyan mennyiségben foglalunk a készítménybe, amely jelentős hatékonysággal előmozdítja egy seb gyógyulását a hagyományos sebgyógyító terápiákhoz képest. A találmány előnyös megvalósítási formáiban a sejtszaporodást serkentő vegyületek általában legalább körülbelül 0,05 ng/ml, előnyösen körülbelül 0,5 ng/ml-től körülbelül 50 ng/ml-ig terjedő vagy nagyobb koncentrációban alkalmazzuk. Inzulint tartalmazó készítmények esetén az inzulin mennyisége gyakran kívül esik ezen a tartományon. Sejtszaporodást serkentő vegyületként előnyösen emberi növekedési hormont és/vagy inzulint alkalmazunk, mivel ismertek ezek előnyei a sejt szaporodásának és fejlődésének elősegítésében, és ismert, hogy általában nem toxikusak.

Az előnyös emberi növekedési hormon jól ismert, definiált fehérje, amely könnyen beszerezhető. A hipofízis a vérkeringési rendszerbe választja el. Számos aminosavból áll, amelyek összes molekulatömege körülbelül 193 000. A jelen találmányban alkalmazható emberi növekedési hormon számos forrásból nyerhető, így például génsebészeti eljárásokkal és géntechnológiai műveletekkel.

A találmányban történő alkalmazásra különösen előnyös, sejtszaporodást serkentő vegyület az emberi növekedési hormon hatásos mennyiségének a keveréke - adott esetben hatásos mennyiségű inzulin (transzferrint tartalmazó vagy transzferrinmentes • 9 ««·

- 13 inzulin) jelenlétében - és/vagy trijód-tironin (T3) vagy tiroxin (T4) hatásos mennyiségének keveréke előnyösen szérumentes, celluláris tápközegben. A találmánynak ezen előnyös megvalósítása során minden egyes, sejtszaporodást serkentő vegyületet olyan mennyiségben foglalunk a készítmény-végtermékbe, amely körülbelül 0,05 és körülbelül 50 ng/ml koncentrációtartományban vagy ennél magasabb koncentrációban van jelen, előnyösen a készítmény-végtermékre vonatkoztatott koncentrációja 1 ng/ml-től körülbelül 20 ng/ml-ig terjed, vagy ennél nagyobb. Az inzulint előnyösen körülbelül 50 ng/ml-től körülbelül 100 pg/ml-ig terjedő mennyiségben (körülbelül 0,1 milliegység/ml-től körülbelül 2 E/ml-ig terjedő mennyiségben), előnyösen körülbelül 50 mg/ml és körülbelül 2 pg/ml közötti mennyiségben alkalmazzuk. A szakmai gyakorlattal rendelkező egyén a sejtszaporodást serkentő vegyület mennyiségét a vegyület típusa és hatékonysága alapján megállapított hatástartományban változtatni tudja.

A találmányban alkalmazott celluláris tápközeg bármilyen tápközeg lehet, amely rendelkezik a sérült bőrszövet gyógyulását elősegítő hatással, ha a sejtszaporodást serkentő vegyülettel kombinálva alkalmazzuk. A találmány szerinti előnyös kiviteli formában a sejtszaporodást serkentő vegyület hatásos mennyiségét szérummentes celluláris tápközeggel elegyítjük, s így alakítjuk ki a találmány szerinti készítményeket.

A celluláris tápközeg (sejttápközeg) komponensei az alábbi csoportokba tartoznak: (a) esszenciális aminosavak; (b) nemesszenciális aminosavak; (c) vitaminok; (d) purinok és pirimidinek; (e) egyéb szerves vegyületek; (f) nagyobb mennyiségben ···· 99

- 14 jelenlévő szervetlen ionok; (g) nyomelemek; (h) pufferanyagok és indikátorok; valamint (i) egyéb kiegészítő anyagok. A (d), (e), (f), (g), (h) és (i) csoportokhoz tartozó anyagok jelenléte tetszőleges. Előnyösen alkalmazható a szérummentes celluláris tápközeg. Előnyös szérummentes celluláris tápközeg a módosított MCDB.

Jóllehet elméleti szempontból nem teszünk korlátozást, nézetünk szerint a meggyorsított sebgyógyulás mechanizmusának egy valószínű magyarázata abban áll, hogy a sejtszaporodást serkentő hormon, különösen az emberi növekedési hormon vagy inzulin jelenléte a találmány szerinti készítményekben előmozdítja a sárjszövet in situ, azaz magán a seben belüli szaporodását. Ezzel egyidejűleg az új készítmények a vaszkuláris elemek serkentését is kiválthatják, és elősegíthetik a vérerekkel behálózott sárjszövet szaporodását bőrimplantátum kimetszésére. Az erekkel behálózott sarjszövet szaporodása előmozdítja az epidermisz szaporodását a sejt kerülete felől a vaszkuláris szubsztrátumon át, valamint a bőr mélyebb rétegeiből, s ez a folyamat a bőr mielőbbi záródásához vezet a seb felett. Esetleg feltételezhető olyan mechanizmus, hogy a burjánzási fázisban a sebben az első naptól kezdve új hajszálerek és fibroblasztok jelennek meg, és egy hét eltelte után érik el maximális mennyiségüket. A sárjszövetben lévő új erek bimbószerű formában keletkeznek a szomszédos ereken, behatolnak a sebbe, erezetet képeznek, és a sejtoszlás útján a seb egészében elágaznak.

Úgy gondoljuk továbbá, a tápközeg szerepe abban áll, hogy ···· ·· • fc-

- 15 tápanyagokkal látja el a normális, fáradt és károsult sejteket, amelyek a seb környezetében vagy a seben belül vannak, s amelyeket kezelnünk kell abból a célból, hogy a sebgyógyulásért felelős szaporodásukat és javulásukat meggyorsítsuk. A tápközeg szerepe tehát: fokozni a sejtszaporodást serkentő hormon képességét a seb alakítására, a sejtek szaporodására és a seb gyógyítására. A közegnek egy további szerepe, hogy a seb körüli környezetet nedvesen tartsa.

A találmány megvalósítása során számos cellujláris - előnyösen szérummentes - tápközeget, így kereskedelmi forgalomban lévő közegeket vagy más, a szakterületen jól ismert közegeket alkalmazhatunk. Ilyen közegek például (amelyek szérummentesek, vagy amelyekből a szérumot előzőleg eltávolították): ADC-1, LPM (szarvasmarha-szérumalbumintól mentes) , F10 (HAM) , F12 (HAM) , DCCM1, DCCM2, RPMI 1640, BGJ közeg (Fitton-Jackson szerint módosítva), Eagle-féle alapközeg (BME Earle-sónak megfelelő bázis), Dulbecco-féle, módosított Eagle-közeg (DMEM szérummentesen) , az Eagle közeg Glasgow szerinti módosítása (GMEM), Leibowitz L-15 közeg, McCoy 5A közeg, M199 közeg (M199E Earlesóval, mint alapközeggel), M199 közeg (M199H Hank-féle sóval, mint alapközeggel), Eagle-féle minimális esszenciális közeg (MEM-E Earle-féle sóval mint alapközeggel), Eagle-féle minimális esszenciális közeg (MEM-H Hank-féle sóval, mint alapközeggel), valamint Eagle-féle minimális esszenciális közeg (MEM-NAA nemesszenciális aminosavakkal együtt) és számos más közeg. Mindezek, valamint további szérummentes, a találmányban alkalmazható celluláris tápközeg beszerezhető a Biological Industries

- 16 cégtől (Bet HaEmek, Izrael).

A fentiek mellett a találmány szerinti készítményekben szérumot tartalmazó celluláris tápközegek is alkalmazhatók, a szérumtartalmú közegek használata azonban kevésbé előnyös, mivel fennáll annak a lehetősége, hogy a szérumot mikrobák szennyezik, továbbá a beteg esetleg immunreakciókkal válaszol egyes, a szérumban jelenlévő antigén komponensekre.

Bár a jelen találmány kivitelezéséhez igen számos szérummentes sejt-tápközeg használható, a találmányban alkalmazható, előnyös tápközeg a módosított MCDB 153, mely a legelőnyösebb, szérummentes, celluláris tápközeg.

Emberi, kimetszett implantátumminták életképességének meghosszabbítására irányuló kísérletek azt mutatták, hogy a találmány szerinti, módosított MCDB 153 közeg az életképesség határát 3 hétről 9 hétre terjesztette ki. A kimetszett bőrminták szövettani vizsgálata arra utalt, hogy az epidermisz-réteg az alsóbb bőr-szubsztrátumhoz valamennyi, módosított MCDB 153 közegben 20 °C hőmérsékleten tartott mintában erősen kötődött.

Az alábbiakban feltüntetjük a fenti csoportokhoz tartozó komponenseket és koncentrációikat az MCDB 153 közeg esetére.

(a) csoport Koncentráció

Arginin	1,0	X	10-3
Cisztein	2,4	X	10-4
Glutamin	6,0	X	10-3
Hisztidin	8,0	X	10-5
Izoleucin	1,5	X	10-5

Leucin	5,0	X	10-4
Lizin	1,0	X	10-4
Metionin	3,0	X	10-5
Fenilalanin	3,0	X	10-5
Treonin	1,0	X	10-4
Triptofán	1,5	X	10-5
Tirozin	1,5	X	10-5
Valin	3,0	X	10-4

(b) csoport

Alanin	1,0	X	10-4
Aszparagin	1,0	X	10-4
Aszpartát	3,0	X	10-4
Glutamát	1,0	X	10-4
Glicin	1,0	X	10-4
Prolin	3,0	X	10-4
Szerin	6,0	X	10-4

(c) csoport

Biotin	6,0 x 10-8
Folát	1,8 x 10-6
Lipoát	1,0 x 10-6
Niacinamid	3,0 x 10-7
Pantotenát	1,0 X 10-6
Piridoxin	3,0 x 10-7
Riboflavin	1,0 X 10-7
Tiamin	1,0 X 10-6
Vitamin B12	3,0 X 10-7

• · • · ·

- 18 (d) csoport

Adenin	1/8	X	10-4
Timidin	3,0	X	10-6
(e) csoport
Acetát	3,7	X	10-4
Kolin	1,0	X	10-4
Glükóz	6,0	X	10-3
i-Inozit	1,0	X	10-4
Putreszcin	1,0	X	10-6
Piruvát	5,0	X	10-4
(f) csoport
Magnézium	6,0	X	10-4
Kálium	1,5	X	10-3
Nátrium	1,5	X	10-1
Klorid	1,3	X	10-1
Foszfát	2,0	X	10-3
Szulfát	4,5	X	10-6

(q) csoport

Réz	1,0	X	10-8
Vas	1,5	X	10-6
Cink	3,0	X	10-6

(h) csoport Bikarbónát HEPES	1,4 x 10-2 2,8 x 10-2
(i) csoport
Etanolamin	0,1 mmól
Foszfo-etanol-amin	0,1 mmól
Kalcium	0,1 mmól.

Valamennyi fenti komponens tömegét a közegben a fentebb megadott koncentrációhatárokon belül változtathatjuk, s így a találmány leírása szerint kialakítható gyógyszerkészítményeket kapunk.

A módosított MCDB 153 közegbe foglalt, sejtszaporodást serkentő vegyület előnyösen emberi növekedési hormon, legalább körülbelül 0,05 ng/ml hatásos mennyiségben. Legelőnyösebb, ha a sejtszaporodást serkentő vegyület emberi növekedési hormon, transzferrint tartalmazó vagy transzferrinmentes inzulin és/vagy trijód-tironin (T3) és tiroxin (T4) keveréke, amelyek mindegyike legalább körülbelül 0,05 ng/ml, előnyösen legalább körülbelül 0,5 ng/ml, még előnyösebben legalább körülbelül 1 ng/ml vagy ennél nagyobb koncentrációban van jelen. Az inzulin esetében a hatásos mennyiség tartománya általában körülbelül 5 ng/ml-től körülbelül 100 Mg/ml-ig terjedő tartományban, ezen belül még előnyösebben körülbelül 50 ng/ml és körülbelül 2 Mg/ml között van.

A sejtszaporodást serkentő hormon és a sejt-tápközeg • ·

- 20 hatásos mennyiségein kívül a találmány szerinti készítmények hidrokortizont is tartalmazhatnak, amely egyes esetekben előnyös összhatást fejt ki a sebgyógyulás meggyorsításában.

Azt találtuk, hogy a hidrokortizon a fibroblasztok klónozási hatásfokát javítja, és elősegíti az epidermisz szarusejtjeinek megtartását. A hidrokortizon előnyösen alkalmazható mennyisége általában körülbelül 0,2 μιηό 1-tól körülbelül 50 μιηόΐig terjedő tartományban van.

A transzferrint tartalmazó inzulin a sejtszaporodást serkentő vegyület tetszőleges, kívánatos alkotórésze, amely a szaporodó tenyészet érését serkenti. Az inzulin előnyös mennyisége körülbelül 5 ng/mól-tól körülbelül 100 gg/ml-ig terjedő (körülbelül 0,1 mEgység/ml-től körülbelül 2E/ml-ig terjedő) tartományban van, előnyösen körülbelül 50 ng/ml és körülbelül 2 μg/ml közötti érték. AZ inzulint a találmány szerinti sebkezelő készítményekbe előnyösen legalább egy, másik, a sejtszaporodást serkentő vegyülettel együtt foglaljuk. Az inzulin kereskedelmi forgalomból beszerezhető; általában mE nagyságrendű mennyiségekben (körülbelül 41 ng inzulin) alkalmazzuk. Az inzulin nemzetközi egysége [a System International (Sí) mértékrendszer szerint] 0,04167 mg (41,67 Mg) 4. Nemzetközi Standard Készítmény (1958) aktivitása. A standard készítmény 52 % szarvasmarha- és 48 % sertés-hasnyálmirigyből extrahált, tisztított kristályos cink-inzulin mennyiségét jelenti (lásd Martindale Pharmacopoeia,

26. kiadás).

A találmány szerinti készítmények továbbá hatásos mennyiségű antimikrobiális szert, például antibiotikumokat és gomba9 · • · · · · · · ellenes szereket, így grizeofulvint, nisztatint, valamint antivirális hatóanyagokat tartalmazhatnak. Az antimikrobiális hatóanyagot fertőzés kezelése céljából vagy fertőzést megelőző hatás céljából adjuk a készítményhez. Ha az antimikrobiális szereket a találmány szerinti felhasználásra számításba vesszük, akkor azokat fertőzés kezelésére vagy fertőzést megelőző kezelésre hatásos mennyiségekben alkalmazzuk. Az alkalmazott antimikrobiális szer mennyisége megegyezik az annak topikus alkalmazása során adagolt mennyiségekkel. A szakmai gyakorlattal rendelkező egyén könnyen meghatározhatja a találmány szerinti készítményekben alkalmazásra szánt antimikrobiális szer típusát és mennyiségét. Az antimikrobiális hatóanyag mennyisége általában széles határok között változtatható a hatóanyag hatásosságának, valamint a fertőzés profilaktikus kezelésének vagy a fertőzés súlyosságának megfelelően; általában azonban a jelen találmány kivitelében az antimikrobiális hatóanyagot körülbelül 0,05 Mg/ml-től körülbelül 250 mg/ml-ig terjedő tartományban, előnyösen körülbelül 50-200 Mg/ml mennyiségben alkalmazzuk. Ezek a határok természetesen a kezelendő fertőzés állapotától, valamint az alkalmazott antimikrobiális hatóanyag erősségétől függően változnak. így például gombás fertőzések kezelése során az amfotericint általában körülbelül 0,1 Mg/mltől körülbelül 100 Mg/ml-ig terjedő koncentrációban, előnyösen körülbelül 0,25 Mg/ml koncentrációban használjuk. Antibiotikumok, különösen penicillin, sztreptomicin és gentamicin esetében az általában alkalmazott koncentrációtartomány körülbelül 0,05 Mg/ml-től körülbelül 250 mg/ml-ig, előnyösen körül• « · · · · ··· • · · · ·

- 22 belül 25 jug/ml-től körülbelül 250 ^g/ml-ig terjed.

Az antiobiotikumok közül bármely változatosságban választhatunk, ilyenek: az amino-glükozidok, szulfa hatóanyagok, penicillinek és a klóramfenikol; előnyösen azonban széles spektrumú antibiotikumokat, például valamilyen cefalosporint vagy tetraciklint használunk fel profilaktikus mennyiségben, vagy más esetekben a baktériumfertőzés kezelésére hatásos mennyiségben. Az antibiotikumok alkalmazása során a szakterületen jártas egyén felismeri annak szükségességét, hogy minimálissá tegye vagy elkerülje olyan antibiotikumok használatát, amelyek a kezelt betegeken allergiás reakciókat válthatnak ki.

A találmány egyes megvalósítási formáit jelentik azok a készítmények, amelyeket - az alábbi leírás szerint - hidrogélekkel vagy ezekkel rokon kiszerelő polimerekkel alakítunk ki a készítmények sebhez juttatása céljából. E kiviteli formákban a sejtszaporodást serkentő hormon és szérummentes sejt-tápközeg hatásos mennyiségét önmagában vagy egyéb komponensek hozzáadása után egy kiszerelő (szállító) polimerrel keverjük. Ilyenek például a hidrogélek, így a HEMA [(hidroxi-etil)-metakrilát] vagy az N-vinil-pirrolidon (NVP), polietilén-glikolok (PEG), zselatin, agaróz, mezil-cellulóz és az ezekkel rokon hidrofil cellulóz-polimerek, valamint a kollagén, amelyeket a sebgyógyulás elősegítésére alkalmazunk. Azon túlmenően, hogy a találmány szerinti készítmények felvitelével elért sebgyógyulást gyorsítják, a szállító polimerekkel kialakított készítmények azt a további előnyt biztosítják, hogy megelőzik vagy lassítják a •·· · · ·

• « seb varasodását. Jóllehet nem korlátozódunk elméleti magyarázatra, nézetünk szerint a képződött sebszövet, amely száraz és varszerű helyett lágy és nedves marad, kedvező, kozmetikai szempontból tetszetős sebet eredményez, és a sebgyógyulás sebességét fokozza.

Az oldat, gél, vagy hidrogél gyógyszerformán kívül a találmány szerinti készítmények például krémek, elixírek, porok alakjában is kiszerelhetők.

A találmány szerinti sebkezelő eljárások egyike szerint a fentebb leírt készítményeket cseppfolyós vagy gél formában helyileg (topikusan) visszük fel a sebszövetre naponta 1-6 vagy még több alkalommal. Kiszerelő polimert tartalmazó készítmények esetében az adagolást kevesebb alkalommal is végezhetjük, mint folyadékformában alkalmazott készítmények esetében. A szakterületen jártas egyén a találmány szerinti készítmények adagolásra szánt mennyiségét és az adagolás gyakoriságát könnyen meghatározhatja. A sebre kezelés céljából juttatott anyag mennyisége a szakmai gyakorlattal rendelkező egyén számára könnyen átlátható. Oldat vagy gélforma esetén a seb területének 1 cm²-ére számítva 1 ml készítményt viszünk fel. A kezelésre szoruló seb mélységétől függően a sebfelület 1 cm²-ére vonatkoztatva 1 ml készítménynél nagyobb vagy kisebb mennyiség is alkalmazható. Sok esetben a készítményt legalább körülbelül 2 mm rétegvastagságban kell a sebre felvinni.

Előzetes, patkányon, tengerimalacon és kiválasztott klinikai esetekben a sebgyógyulás gyorsulásának meghatározására végzett biológiai mérések azt mutatták, hogy a találmány sze• · ·

- 24 rinti készítmények a hagyományos terápiás eljárásokhoz viszonyítva jelentősen kedvezőbb eredményt biztosítottak.

Az alábbiakban a találmányt példákkal írjuk le; ezek a példák egyes, találmány szerinti készítményekkel a sebeken végzett teszteket ismertetnek. Nyilvánvaló azonban, hogy a példák nem korlátozó jellegűek, csupán a találmány jobb megértését szolgálják.

Példák

1. példa

Sebgyógyító készítmény

100 g liofilizált MCBD 153 port desztillált, sterilizált vízzel oldottunk (rekonstituáltunk), és a szokásos keverés közben körülbelül 0,56 - 2 ng/ml végkoncentrációig emberi növekedési hormonnal egészítettük ki. Egyes készítményekben inzulin-transzferrint adtunk hozzá körülbelül 5 mEgység/ml (körülbelül 200 ng/ml) végkoncentráció eléréséig. Az így kapott oldatot az alábbi példákban bemutatott módon használtuk sebek kezelésére. Egyes esetekben körülbelül 1 tömeg% (t%) zselatint vagy kollagént adtunk hozzá, és így a sebekre juttatásra alkalmas gélterméket kaptunk.

2. példa

A sarkon felfekvés és nyomás hatására keletkezett sebek kezelése

Egy heveny, toxikus epidemolysis necrosis-ban szenvedő nőbetegen - szulfa gyógyszerekkel végzett kezelés következtében fellépő túlérzékenység hatására - ovális alakú, nyomásos seb

- 25 keletkezett a jobb sarkán, 10x5x2 cm méretben. A hagyományos kezelés nem vezetett eredményhez.

Az első kezelsé során a találmány szerinti, 1,0 ng/ml emberi növekedési hormont tartalmazó készítményt folyékony alakban vittük a sebre, és kötéssel fedtük.

A kötést, amelyen izzadmány szivárgott át, eltávolítottuk. A seb medrében sárjszövet szaporodását figyeltük meg. A seb kezdeti ovális alakú határvonala kulcslyukalakűvá vált, a seb mérete 2x3x1 cm-re csökkent. Ugyanazzal a készítménnyel hasonló kezelést ismételtünk a seben.

Három nap eltelte után azt találtuk, hogy a kötés száraz. A kötést eltávolítottuk. A seb igen jelentős mértékben beszűkült, mérte 5 x 1,5 x 0,5 cm-re csökkent. A sebben lévő sárjszövet erekkel erősen behálózódott. Ugyanezzel a készítménnyel azonos kezelést végeztünk. Három nap múlva a száraz kötést eltávolítottuk, és azt találtuk, hogy a seb teljesen zárult.

3. példa

Régi, krónikus lábszárseb kezelése

Egy 16 hónapos, krónikus, kúpos-ovális alakú lábszárfekély (mérete 7 x 3,5 x 2 cm) helyezkedett el a sípcsont felső harmadában, a láb elülső felén. A szokásos, bár ismételten alkalmazott kezelés sikertelen volt.

A sebre az 1. példa szerinti, 0,5 ng/ml emberi növekedési hormont tartalmazó kollagén gélkészítményt vittünk fel, és kötéssel fedtük.

Három nappal később az izzadmánnyal átitatott kötést eltávolítottuk. A seb medrében világosan megfigyelhettük a sarj• · · · • ·

szövetet és annak ereződését. A seb méretét 5,5 x 2,5 x 1 cm-nek találtuk, határvonala kerek, ovális volt. Ugyanezzel a kollagén készítménnyel végeztünk második kezelést, azonban a gélkészítményt módosított MCDB 153-val együtt vittük fel.

Négy nappal később eltávolítottuk a kötést; a seb medrében erősen ereződött sarjszövetet figyeltünk meg. A seb ovális alakú volt, mérete 4 x 2 x 0,5 cm. Három nappal később ismét levettük a kötést, ekkor a seb orsóalakú volt, mérete 3 x 1 x 0,25 cm. A fentivel azonos kollagén géllel ismételtük a kezelést, 4 nap múlva a kötést eltávolítottuk, és a seb méretét 2,5 x 1 x 0 cm-nek találtuk.

Néhány nap múlva a beteg közlése szerint a seb teljesen zárult.

4. példa

Kiújuló lábszárfekély okozta seb kezelése

A 10 x 7,1 x 1,5 cm méretű fekélyes seb egyetlen szokásos kezelésre sem reagált.

Első kezelésünk során 2 ng/ml emberi növekedést hormont és 5 mE/ml (körülbelül 2000 ng/ml) inzulint tartalmazó, 1. példa szerint készült oldatot alkalmaztunk.

Egy hét után a rostos váladékkal átitatott kötést eltávolítottuk. Tekintélyes mennyiségű sárjszövet szaporodását figyeltük meg, mely a seb medrét megemelte. A seb méretét 8x5 x 0,5 cm-nek találtuk. A sebet 3 térf.%-os hidrogén-peroxid-oldattal mostuk, és az első kezelés során alkalmazott oldatot ismét felvittük.

Négy nappal később a kötést eltávolítottuk, és azt tapasz-

taltuk, hogy a tiszta seb üregének legnagyobb részét sajrszövet töltötte ki.

A továbbiakban kimetszéssel nyert bőrimplantátumot alkalmaztunk.

5-11. példák

Az alábbi 5-11. példákban a módosított, szérummentes tenyésztőközeget nemszteroid anabolikus hormonokkal egészítettük ki, és sebgyógyító hatásukat több kontrolihoz viszonyítva vizsgáltuk. A közeget tisztított, 1 %-os alginát-gél matrix-szal és 4 % zselatinnal készítettük, amelyhez fiziológiás koncentrációkban adtuk a növekedési hormont, tiroxint és az inzulin-transzfert.

Ketaminnal altatott Hartley származású tengerimalacok hátából 2 x 3 cm méretű, teljes vastagságú bőrdarabokat metszettünk ki sebészi eljárással. A gélt mintegy 1 ml/cm² mennyiségben vittük fel a sebekre, majd a sebeket Omiderm-mal - egy poliuretán-alapú szintetikus sebtisztító készítménnyel (Omikron, Izrael) - tisztítottuk, és gézzel, valamint rugalmasan tapadó kötései láttuk el. A kötést és a gélekkel végzett kezelést 48 óránként végeztük mindig altatással, és ebben az időpontban egy állatcsoportban a sebeket ESDC fertőtlenítő szerrel (beszerzési helye: Symbollon Corp., Mass., USA), meleg konyhasóoldattal mostuk, mértük és lefényképeztük. A fényképek segítségével számítógépes-morfometriás (alakmérő) méréseket végeztünk, így a regenerálódási folyamat dinamikáját kvantitatíve követtük és elemeztük. Az alábbiakban e kísérletek eredményeit bemutatjuk és részletesen leírjuk.

4·· 4 · · * 9 9 ·· ·« 4 4 ·« · · · • · ·· 4 4 · · 444

4 4 4 * 4 · ·

- 28 Anyagok és módszerek

1. A gélközegek előállítása

AZ eljárást teljes egészében steril körülmények között végeztük.

a. ) Felviteli (kiszerelő) rendszer g 1—A típusú Low EEO agarózt (Sigma Chemical Co.) 10 ml kétszer desztillált vízzel oldottunk, és az oldatot autoklávoztuk. Valamennyi gélkészítményünket úgy állítottuk elő, hogy abban az agaróz vagy zselatin 1 % végkoncentrációban volt jelen.

b. ) Közegek

Az előnyös közegek esszenciális és nem-esszenciális aminosavakat, vitaminokat, egyéb szerves komponenseket, nagyobb mennyiségű szervetlen sókat, nyomelemeket és puf fér anyagokat tartalmaztak, amelyeket kalcium-kloriddal, L-glutaminnal, valamint nemszteroid anabolikus hormonokkal, inzulinnal, tiroxinnal és növekedési hormonnal egészítettünk ki az alább megadott koncentrációkban.

Komponensek Aminosavak (L-enantiomer formában)	Koncentráció :
Alanin	1,0 x 10-4
Arginin hidroklorid	1,0 X 10-3
Aszparagin	1,0 x 10-4
Aszparaginsav	3,0 x 10^-5
Cisztein hidroklorid	2,4 X 10-4
Glutaminsav	1,0 X 10-4
Glutamin	6,0 X 10-3

• · ♦ · 4 · ·· ·* ·«

Glicin	1,0	X	10-4
Hisztidin hidroklorid	6,0	X	10-5
Izoleucin	1,5	X	10-5
Leucin	5,0	X	10-4
Lizin hidroklorid	1,0	X	10-4
Metionin	3,0	X	10-5
Fenil-alanin	3,0	X	10-5
Prolin	3,0	X	10-4
Szerin	6,0	X	10-4
Treonin	1,0	X	10-4
Triptofán	1,5	X	10-5
Tirozin	1,5	X	10-5
Valin	3,0	X	10-4

Vitaminok

d-Biotin	6,0 X 10-8
Fólsav	1,8 X 10-6
DL-α-1iponsav	1,0 X 10-6
Niacinamid	3,0 X 10-7
D-pantotenát 1/20-a	1,0 X 10-6
Piridin hidroklorid	3,0 X 10-7
Riboflavin	1,0 x 10-7
Tiamin hidroklorid	1,0 x 10-6
Βχ2 vitamin	3,0 X 10-7

« ···

Egyéb szerves komponensek

Acetát	3,7	X	10-3
Adenin	1,8	X	10-4
Kolin-klorid	1,0	X	10-4
D-glükóz	6,0	X	10-4
i-Inozit	1,0	X	10-4
Putreszcin dihidroklorid	1,0	X	10-6
Nátrium-piruvát	5,0	X	10-4
Timidin	3,0	X	10-6

Nagyobb mennyiségű szervetlen sók

Kalcium-klorid	4,0	X	10-5
Kálium-klorid	1,5	X	10-3
Magnéz ium-klorid	6,0	X	10-4
Nátrium-klorid	1,2	X	10-1
Dinátrium-hidrogén-foszfát	2,0	X	10-3

Nyomelemek

Réz(II)-szulfát	1,1	X	10-8
Vas(II)-szulfát	5,0	X	10-6
Szelénessav (H₂SeC>3)	3,0	X	10-8
Mangán(II)-szulfát	1,0	X	10-9
Nátrium-metaszilikát (Na₂SiO3)	5,0	X	10-7
(NH4) ₆Μθ7<3₂4	1,0	X	10-9
NH₄VO₃	5,0	X	10-9
Nikkel(II)-klorid	5,0	X	10-10
Ón(II)-klorid	5,0	X	10-10
Cink-szulfát	5,0	X	10-7

·« ·* ·· • · 9 · · • · · » · *1« 999

9 9 * 9 * * *

Puf féranyagok

HEPES	2,8 x 10-2
Nátrium-hidrogén-karbonát	1,4 x 10-2

Nemszteroid anabolikus hormonok

Emberi növekedési hormon	2 ng/ml
Inzulin-transzferrin és nátrium-szelenit	5 mE/ml (körülbelül 200 ng/ml)
Trijód-tironin (T3)	2,0 x 10-9 (1,3 ng/ml)

Vehikulum

Agaróz (Sigma - A 0169)

EEO (Elektro-endozmózis 0,10-0,15)

Gélesedési pont

Olvadáspont

Gélerősség

PH %

°C °C > 825 g/cm² % koncentrációra

- 8,5

c. A sebgyógyító készítmény előállítása ml fentiekben megadott közeget vízfürdőben 40 °C-ra melegítettünk, az elegyet autoklávoztuk, majd 10 ml 1 %-os agaróz-gél-oldatot 40 °C-ra hagytunk lehűlni, és ezt az oldatot a közeghez adva homogén elegyet kaptunk. Az így kapott elegyet 10, illetve 20 ml-es fecskendőkbe szívattuk, és 4 ’C hőmérsékletre hűtve tároltuk.

··<· ·« • · · · · » · • · · · · ♦·· ··· ···»·· · ·

2. A vizsgálatokhoz használt állatkísérleti modell

Hartley származású, 300-400 g testtömegű Albino tengerimalacokat alkalmaztunk. Az állatokat egyenként helyeztük ketrecekbe, szabályszerűen tengerimalac-eledellel tápláltuk, és C vitaminnal dúsított vizet szabadon ihattak. Az összes sebészi eljárásokat Katamin hidrokloriddal [kémiailag [d]-2-(o-klór-fenil)-2-(metil-amino)-ciklohexanon hidroklorid, beszerezhető a Parke-Davis cégtől] altatott állatokon végeztük (az altatószert 150 mg/kg mennyiségben intramuszkulárisan adagoltuk). A szövettani metszeteket hematoxilinnel és eozinnal festettük, kollagén esetében a Mason-féle trikróm-eljárást alkalmaztuk.

Altatás után az állatok hátáról mindkét oldalon négy, egyenként 2 x 3 cm területű bőrszegmentumot metszettünk ki szimmetrikusan a bőr teljes vastagságában: két szegmentumot a lapocka felőli, két szegmentumot az ágyéki területen. A sebeket meleg konyhasóoldattal mostuk, majd körülbelül 1 ml/cm² koncentrációban a géllel kezeltük, poliuretán-alapú szintetikus membránnal (Omiderm, az Omikron cég készítménye, Izrael) fedtük, gézzel, rugalmas tapasszal és Retelast hálóval (a Medinet cég készítménye, Olaszország) rögzítettük. A kötéseket 48-óránként altatott állapotban cseréltük; ebben az időpontban a sebeket meleg konyhasóoldattal mostuk a sebtörmelék és a sebben maradt gél eltávolítására, majd a sebet mértük, fényképeztük, friss gélt vittünk fel, és a sebeket a fentebb leírtak szerint kezeltük. Egy kísérletünkben ESDC fertőtlenítő készítményt (Symbollon cég készítménye) vittünk a sebre a kötés kicserélése során mintegy 10 percig, és ez előtt, majd ez után a sebet meleg konyhasóoldattal öblítettük. Az állatokat a 4., 6., 8.., 10., illetve 12. napon leöltük, a sebeket a környező szövetekkel együtt kimetszettük, és előkészítettük a szövettani vizsgálatra.

Az újonnan képződött epitélium-réteg valamint az alatta elhelyezkedő sarjszövet vastagságát fénymikroszkóppal (Zeiss) 100szoros nagyítás mellett mértük.

A sebekről készült makrofotográfiákat ImageMeasure (Phoenix Corp., Seattle, Washington) számítógépes morfometriás programm segítségével elemeztük, és a kísérleti eredményeket grafikusan ábrázoltuk: ez megmutatta a gélközegekkel és hormonokkal kezelt sebek területi hányadának változását (azaz a sebzáródás mértékét) a különböző kontrollokhoz képest. A sebzáródás mértékét táblázatokba foglaltuk, és meghatároztuk a sebzáródás csúcsértékének napját (sebzáródási %) .

A sebzáródás mértékét (sebességét) a sebgyógyító hatékonyság mértékének tekintettük. A záródási sebesség csúcsértéke az ^Ao A_t á;

tört időszerinti függvénye differenciálhányadosának a maximuma. A záródási sebesség csúcsértéke a kezelés megkezdése óta eltelt azon időpontot jelenti, ahol a szöveti gyógyulás, illetve a szövet szaporodási mértéke maximumát eléri (maximális mérték); azaz azt az esetet, amikor a kezelés optimális.

···· «· • · · · · ··· ····*« · · ·· ·· (»· 9· *·

- 34 5-11. példák

Nyolc kísérleti csoportot alakítottunk ki különböző gyógyszerkombinációk, mint kontrollok alkalmazásával (zárójelben a csoport állatszáma):

1. kísérlet: zselatin konyhasóoldatban (n = 12) összehasonlítva konyhasóoldatos agarózzal (n = 12);

2. kísérlet: kontroliokkal végzett teszt: skarlátvörös (n=19) és konyhasóoldatos agaróz (n=12), mint pozitív, illetve negatív kontroll összehasonlítva olyan agarózzal, amelyet inzulin-transzferrinnel (5 mE/ml, körülbelül 200 ng/ml), tiroxinnal (körülbelül 1,302 ng/ml) és emberi növekedési hormonnal (körülbelül 2 ng/ml) kiegészített közegben alkalmaztunk;

3. kísérlet: agaróz hormonnal kiegészített közegben (n=12) összehasonlítva hormon-kiegészítés nélküli közegben alkalmazott agarózzal (n=12);

4. kísérlet: agaróz kiegészítve inzulin-transzferrinnel (n=33, 5 mE/ml, körülbelül 200 ng/ml), tiroxinnal (n=28, 1,302 ng/ml) vagy növekedési hormonnal (n=27, 2 ng/ml) konyhasóoldattal (közeg nélkül) összehasonlítva agarózzal, amely a fenti három hormont azonos koncentrációban közeggel együtt tartalmazta (n=12):

5. kísérlet: agaróz a fenti három komponenssel kiegészített közegben (n=12), összehasonlítva olyan agarózzal, amelyet vagy inzulinnal (n=8), vagy tiroxinnal (n=8), vagy növekedési hormonnal (n=8) kiegészített közegben alkalmaztunk;

6. kísérlet: agaróz a fenti három hormonnal kiegészített konyha- sóoldatban (n=12) a fentebb megadott koncentrációkban, összehasonlítva olyan agarózzal, amelyet a három hormonnal kiegészített közegben alkalmaztunk (n=12);

7. kísérlet: agaróz a három hormonnal kiegészített közegben a fentiek szerint (n=12) fertőtlenítő borogatás nélkül, összehasonlítva ugyanezzel a kezeléssel, amelyet kiegészítettünk ESDC fertőtlenítőszerrel végzett 10 perces borogatással, amelyet a kötések során végeztünk (n=15).

5. példa

A készítmény kiszerelő vehikulumának vizsgálata

Két gélt készítettünk: konyhasóoldatban zselatinnal, illetve agarózzal, és e két gélt kísérletesen előidézett sebek kezelésére alkalmaztuk. Az agarózzal kezelt sebek zárulási sebessége nagyobb volt, mint a zselatinnal kezelt sebeké (lásd az 1. ábrát).

A seb záródási sebességének összehasonlítása azt mutatja, hogy az 50 %-os zárulás 31 %-kal gyorsabban következik be konyhasóoldatos agarózzal, mint konyhasóoldatos zselatinnal végzett kezelés során. A sebzárulás csúcsértéke 33 %-kal előbb állt be a konyhasóoldatos agarózzal végzett kezelés következtében (lásd a későbbiekben bemutatott 1. táblázatot).

• ♦

6. példa

A pozitív és negatív kontrollok vizsgálata

A skarlátvörössel (azofestéket tartalmazó készítmény, amelyet kórházakban rutinszerűen alkalmaznak a hámosodás fokozására) végzett kezelést alkalmaztuk pozitív kontrollként, és konyhasóoldatos agarózt alkalmaztunk negatív kontrollként. A sebzárulás sebességét - a készítmények esetében - grafikusan ábrázoltuk a hormonokat tartalmazó közegekkel kezelt sebekkel összehasonlítva (n=15). A sebzárulás sebességének összehasonlítása azt mutatja, hogy az 50 %-os záródás 50 %-kal gyorsabban következett be a közegekkel és hormonnal, mint a kontroliokkal végzett kezelés során (lásd a 2. ábrát). A sebzárulás csúcsértéke a konyhasóoldattal, illetve skarlátvörös-kezeléssel 50 %kai, illetve 40 %-kal később állt be, mint a közegekkel és hormonokkal végzett kezelés esetén.

7. példa

A közegekkel, hormonokkal és agarózzal végzett kezelés összehasonlítása a csupán közeggel és agarózzal végzett kezeléssel

A három hormont tartalmazó közeggel végzett kezelés a seb gyógyulását meggyorsította a hormonos kiegészítés nélkül agarózzal és közeggel végzett kezeléshez képest (lásd a 3. ábrát). A csupán közeg alkalmazásával végzett kezelés által elért sebzárulás sebessége hasonló volt a konyhasóoldatos agarózzal kezelt sebek zárulási sebeségéhez.

Mivel a közegek önmagukban nem fejtettek ki serkentő hatást a sebzárulásra, úgy látszik, hogy legalább egy hormon, előnyösen • ·

- 37 három hormon jelenléte esszenciális e közegeknek sejtekben végbemenő hasznosításához.

A sebzárulás sebességének összehasonlítása azt mutatja, hogy az 50 %-os zárulás 60 %-kal lassabban következett be önmagában közeggel végzett kezelés során, mint a közegekkel és három hormonnal végzett kezelés következtében (lásd az 1. táblázatot) . A sebzárulás sebességének csúcsértéke 50 %-kal gyorsabban állt be közegekkel és három hormonnal kezelt sebek esetében, mint csupán közegekkel végzett kezelés során.

8. példa

Inzulinnal vagy tiroxinnal vagy növekedési hormonnal kiegészített (közeget nem tartalmazó) konyhasóoldatban lévő agarózzal végzett kezelés összehasonlítása három hormonnal kiegészített konyhasóoldatban lévő agarózzal végzett kezeléssel

A három hormon együttvéve a sejtszaporodás sebességét hasonlóan befolyásolta, mint a hormonokkal külön-külön végzett kezelés. Ennek alapján a három hormon együttes jelenléte konyhasóoldatos agarózzal elegyítve nem mutatott szinergetikus hatást (lásd a 4. ábrát).

Az inzulinnal, tiroxinnal és növekedési hormonnal külön-külön végzett kezelés azonos sebzárulási sebességet idézett elő. A sebzárulás sebességének összehasonlítása azt mutatta, hogy az 50 %-os sebzárulás 15 %-kal gyorsabban következett be inzulinnal és tiroxinnal; és azonos volt a növekedési hormon és konyhasóoldat, valamint együttesen három hormon hatásával (lásd az 1. táblázatot).

• · · · • ·

V ·

- 38 A sebzárulás sebességének csúcsértéke azonos volt egyrészt inzulin, tiroxin és növekedési hormon, másrészt a három hormont tartalmazó konyhasóoldat esetében.

9. példa

Három hormonnal kiegészített közegben lévő agaróz összehasonlítása inzulinnal vagy tiroxinnal vagy növekedési hormonnal kiegészített közegekben lévő agarózzal

A három hormont tartalmazó közegekkel végzett kezelés jelentősen gyorsabb sebzárulást eredményezett (lásd az 5. ábrát) , mint a három hormon egyikével kiegészített közegben lévő agaróz.

Az önmagában inzulinnal, tiroxinnal, illetve növekedési hormonnal kiegészített közegekkel kezelt sebek zárulási sebessége azonos volt. Ezzel szemben a három hormon a közegekkel együtt szinergetikus hatást fejtett ki. A sebzárulási sebesség összehasonlítása azt mutatta, hogy az 50 %-os zárulás sebessége (mértéke) 75 %-kal lassabban következik be az inzulinnal, illetve tiroxinnal, illetve növekedési hormonnal, mint a három hormon kombinációjának hatására. A sebzárulás sebességének csúcsértéke inzulin, tiroxin és növekedési hormon esetében azonos volt, és 33 %-kal később állt be, mint a közegekkel és mindhárom hormonnal együtt végzett kezelés során.

10. példa

Három hormont tartalmazó konyhasóoldatos agaróz összehasonlítása három hormont tartalmazó közegben lévő agarózzal Az első két napon a két csoport sebzárulását lényegében azonosnak találtuk. A második nap után azonban a közeg nélküli, • ·

- 39 három hormont tartalmazó konyhasóoldattal kezelt seb zárulása jelentősen lassúbb volt, mint a hormonokkal kiegészített, közegekkel kezelt sebeké (lásd a 6. ábrát).

A közegek jelenléte a három hormonnal kiegészített, de közeg nélkül végzett kezeléssel összehasonlítva a sebzárulást meggyorsította. A sebzárulás sebességének összehasonlítása azt mutatta, hogy az 50 %-os zárulás 86 %-kal vagy még lassabban következett be a hormonokat tartalmazó konyhasóoldatos kezeléssel, mint a hormonokkal kiegészített közegekkel végzett kezelés során. Ehhez járult, hogy a sebzárulás sebességének csúcsértéke 57 %-kal korábban állt be a három hónappal kiegészített közeggel végzett kezelések során, mint a három hormonnal kiegészített konyhasóoldatos kezelések következtében.

11. példa

Közegekben jelenlévő, három hormonnal kiegészített agaróz összehasonlítása ESDC fertőtlenítő borogatással és borogatás nélkül végzett kezelés során

A közegekkel és fertőtlenítőszerrel végzett kezelés sebzárulási sebessége kezdetben nagyobb volt, mint a csupán közegekkel kezelt sebeké. A második napon azonban a hormonokkal kiegészített közegekkel kezelt sebek zárulása meggyorsult, és nagyobb volt, mint a fertőtlenítő borogazás nélkül kezelt sebek zárulási sebessége. Kezdeti időszak után a fertőtlenítőszer halmozódó (kumulatív) citotoxikus hatást fejtett ki, amely a gyógyulási folyamatot lassította (lásd a 7. ábrát).

A sebzárulás sebességének összehasonlítása azt mutatta, hogy az 50 %-os zárulás a fertőtlenítőszerrel végzett kezelés során • · • · a

- 40 45 %-kal később következett be.

A sebzárulás sebességének csúcsértéke 100 %-kal később állt be a fertőtlenítőszerrel végzett kezeléskor, mint a fertőtlenítőszer nélkül, közeggel és három hormonnal végzett kezelés során.

1. táblázat

A sebzáródás mértékeinek összehasonlítása %-os zárulás A zárulás csúcsértéke (napokban)napokban (a zárulás %-a)

Közegek + hormonok	3,5	3,0	(30	%)
Konyhasóoldatos agaróz	6,0	6,0	(50	%)
Konyhasóoldatos zselatin	8,5	9,0	(50	%)
Skarlátvörös	6,0	5,0	(35	%)
Közeg + fertőtlenítőszer	5,0	6,0	(60	%)
Inzulin	5,0	3,0	(30	%)
Tiroxin	5,0	3,0	(30	%)
Növekedési hormon	6,0	6,0	(50	%)
Közegek önmagukban	7,0	6,0	(40	%)
Konyhasóoldat + hormonok	7,0	7,0	(50	%)

Következtetések

A fentebb leírt kísérletek eredményeiből az alábbi következtetések vonhatók.

A hatóanyag vivőrendszere

Az alkalmazott készítményekben agaróz használata zselatinnal összehasonlítva a sebzárulás sebességét növelte. Köze• · • · ·· · ·»· ··♦ ······ · ·

- 41 lebbről a konyhasóoldatos zselatinnal kezelt sebek zárulása mintegy 33 %-kal lassúbb ütemű volt, mint a konyhasóoldatos agarózzal kezelt sebek zárulása.

Kontrollok: skarlátvörös és konyhasóoldat

A skarlátvörössel, mint pozitív kontrollal, illetve konyhasóoldattal, mint negatív kontrollal végzett kezelés a közeggel és hormonnal végzett kezeléssel összehasonlítva azonos vagy lassúbb sebzárulást eredményezett.

Közegek és hormon

Legalább egy, sejtszaporodást serkentő vegyület jelenléte nemszteroid anabolikus hormon, előnyösebben három anabolikus hormon jelenlétében, közeg jelenlétében a sebgyógyulás szempontjából jelentős előnnyel jár (a sebgyógyulás sebessége jelentősen nagyobb). Gélközeggel (agaróz jelenlétében), hormonos kiegészítés nélkül végzett kezelés 60 %-kal kisebb sebességet erdményezett, mint a közeget és hormont (három anabolikus hormont) tartalmazó gél, és hasonló sebzárulási sebességet eredményezett, mint a konyhasóoldatos agarózzal végzett kezelés.

Nem kvantifitálható megfigyelések

Hormont tartalmazó közegek alkalmazása agarózban olyan varosodást idézett elő, amelynek szövedéke lágy és felülete egyenletes (váratlan eredmény). E kezelés esztétikusabb és természetesebb kinézetű sebfelületet eredményezett, mint a skarlátvörössel vagy konyhasóoldattal végzett kezelés. Duzzanatok vagy horpadások a legtöbb esetben nem léptek fel, és a hegszövet felülete egyenletes volt a környező, nem sérült bőrrel együtt. A heg szövedéke is hasonlított a környező, nem sérült • · • · ·· · ·«· ··· ····»« · ·

- 42 szövedékéhez, és az alkalmilag jelentkező elszíneződés megszűnt.

Érdeklődésünk középpontjában állt elsősorban a sebzárulás, és állatkísérleti modelljeink alkalmazásával kapott eredményeink, amelyek hangsúlyosan mutatják a találmány szerinti, sejtszaporodást serkentő vegyületekkel kiegészített közegek hatásosságát, tekintet nélkül arra, hogy a sebzárulás sebessége a seb összehúzódásának vagy hámosodásának vagy ezek kombinációjának a következménye. E két mechanizmus tekintetbe vételével a seb területének exponenciális csökkenése hormonokkal kiegészített közegek alkalmazása során jelentősen gyorsabb volt. E vizsgálatunkban alkalmazott különböző kontrollok arra utalnak, hogy önmagában közeggel és önmagukban hormonokkal, külön-külön vagy együttesen nem érhetők el ugyanazok a zárulási sebességek, mint mindkét komponenssel együttesen. Ezenfelül a negatív (skarlátvörössel végzett) és pozitív (konyhasóval végzett) kontrollkísér letek azonos vagy lassúbb sebzárulást eredményeztek.

Mivel nyommennyiségű növekedési faktorok a seb izzadmányának alkotórészét képezik [R. I. Freshney: Állati sejtek tenyésztése (angolul); Alán R. Liss, Inc., N.Y. 239-241. old.,

2. kiadás (1988); valamint Hayward és Robson: A seb összehúzódásának állatkísérleti modelljei a következő helyen: Clinical and Experimental Approaches to Dermal and Epidermal Repair; Normál and Clinical Wounds, 301-312. old. (1991), Wiley-Liss, Inc.] egyiket sem adták a gélközeges készítményekhez. Jóllehet elméleti szempontból nem teszünk korlátozást, feltételezzük, hogy a gélközegnek a sebfelületre történő felvitele komplex, biológiailag hatásos szubsztrátumot alakított ki, amely az utólag növekedési faktorokkal együttesen fejtette ki hatását, és erősítette a gél biológiai aktivitását. A gélközeg a biológiailag hatásos anyag tulajdonságait és jellemzőit egyesíti, és ezenfelül a sejtszaporodáshoz szükséges összes tápanyagokat tartalmazza. A gél hatásosságára vonatkozó eredményeink megegyezni látszanak régebbi megfigyelésekkel, amelyek szerint a korai fázisban jelentkező sebizzadmány kiváltja a sejtszaporodást [G. D. Mulder: Ha a sebek beszélni tudnának (angolul) az előbb idézett munkában,55-66. old. (1991), Wiley-Liss, Inc.].

A fentiekben leírt állatkísérleti modellek bizonyos korlátozásokat kívánnak: a sebeknek tisztáknak, sebészi eljárással kialakítottnak, szennyezéssel nem komplikáltaknak kell lennie. Ez a szempont lényeges, mivel a gélközeg a baktériumok számára kedvező szaporodási szubsztrátumot jelent. Véleményünk szerint szennyezett sebek esetében indokolt lehet bakteriogramm felvétele, majd ezt követő egyidejű kezelés specifikus antibiotikumokkal vagy fertőtlenítőszerekkel, a gélközeges kezeléssel kombináltan.

Találmányunkat a fenteb részletesen kifejtett konkrét megvalósítási formákban írtuk le, ezt azonban úgy kell érteni, hogy ezek a példák csak illusztratív jellegűek, és a találmány szükségszerűen nem korlátozódik e kiviteli formákra. A leírásból nyilvánvalóvá válnak a módosítások és változtatások; ezek nem haladják meg a találmány szellemét a szakmai gyakorlattal rendelkező egyén számára. Ennek megfelelően ezeket a variációkat és módosításokat úgy tekintjük, hogy a találmány és az alább következő igénypontok oltalmi körén belül esnek.

Claims

szabadalmi igénypontok

1. Sebkezelő készítmény, azzal jellemezve, hogy sejt-tápközegben legalább körülbelül 0,05 ng/ml koncentrációban sejtszaporodást serkentő vegyület hatásos mennyiségét tartalmazza.
2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy szérummentes sejt-tápközeget tartalmaz.
3. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jel1 eme z ve, hogy oldatként kiszerelt alakban van.
4. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy gélként vagy krémként kiszerelt alakban van.
5. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a gél zselatin- vagy agaróz-eredetű.
6. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy liofilizált alakban van.
7. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy sejtszaporodást serkentő vegyületként növekedési hormonokat, tiroxint, trijód-tironint, inzulint, epiteliális szaporodási faktort, transzformáló szaporodási faktort, trombocitából eredő szaporodási faktort, inzulinszerű növekedési faktort vagy ezek keverékét tartalmazza.
8. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy sejtszaporodást serkentő vegyületként körülbelül 0,5 ng/ml-től 50 ng/ml-ig terjedő koncentrációtartományban emberi növekedési hormont tartalmaz.
9. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jel• · * ··· ···

-451 e m e ζ v e, hogy a közeg körülbelül 0,1 gmól-től körülbelül

50 μιηόΐ-ig terjedő mennyiségben hidrokortizont is tartalmaz.
10. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal j e 1 lemezve, hogy sejtszaporodást serkentő vegyületként inzulint és legalább egy további, sejtszaporodást serkentő vegyületet tartalmaz.
11. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal j e 1 lemezve, hogy sejtszaporodást serkentő vegyületként körülbelül 5 ng/ml-től körülbelül 100 μg/ml-ig terjedő mennyiségben inzulint tartalmaz.
12. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy kiszerelő (vivő) polimer hatásos mennyiségét is tartalmazza.
13. A 12. igénypont szerinti készítmény, azzal j e 1 lemezve, hogy kiszerelő (vivő) polimerként (hidroxi-etil)-metakrilátot, poli (vinil-pirrolidon)-t, polietilén-glikolt, zselatint, agarózt, kollagént, hidrofil cellulóz-polimert vagy ezek keverékét tartalmazza.
14. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal j e 1 lemezve, hogy mint tápközeget, szérummentes tápközegként ADC-l-t, albuminmentes LPM-t, F10, F12, DCCM1, DCCM2, BGJ közeget (Fitton-Jackson szerint módosítva) , Eagle-féle alapközeget (BME Earle-só alapanyaggal kiegészítve) , Dulbecco-féle módosított Eagle-közeget (szérummentesen), Glasgow szerint módosított Eagle-közeget (GMEM), Leibovitz-féle L-15 közeget, McMoyféle 5A közeget, MDCB 153 közeget, M199 közeget (M199E kiegészítve Hank-féle sóalapanyaggal) , minimális esszenciális • · ·· · ·«· ··· ·····* * ·

Eagle-közeget (MEM-E kiegészítve Eagle-só alapanyaggal), Eagleféle minimális esszenciális közeget (MEM-H kiegészítve Hank-féle só alapanyaggal) vagy (nem esszenciális aminosavakkal kiegészített) minimális esszenciális Eagle-közeget tartalmaz.
15. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy tápközegként MDCB 153-at tartalmaz.
16. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy antimikrobiális hatású szer hatásos mennyiségét is tartalmazza.
17. A 16. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy antimikrobiális hatású anyagként valamilyen antibiotikumot tartalmaz.
18. A 17. igénypont szerinti készítmény, azzal j el lemezve, hogy antibiotikumként valamilyen cefalosporint vagy tetraciklint tartalmaz.
19. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal j el lemezve, hogy sejtszaporodást serkentő vegyületként mint nemszteroid anabolikus hormont emberi növekedési hormont, inzulint, trijód-tironint, tiroxint vagy ezek keverékét tartalmazza.
20. Eljárás sebek kezelésére, azzal jellemezv e, hogy a sebre olyan készítményt viszünk fel, amely szérummentes sejt-tápközegben legalább egy sejtnövekedést serkentő vegyületet legalább körülbelül 0,05 ng/ml koncentrációban tartalmaz .
21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtszaporodást serkentő vegyület növeke• · · · · · ·«· «·· dési hormon, tiroxin, trijód-tironin,inzulin, epiteliális szaporodási faktor, transzformáló szaporodási faktor, trombocitaeredetű szaporodási faktor, inzulinszerű növekedési faktor vagy ezek keveréke.
22. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtszaporodást serkentő vegyület körülbelül 0,5 ng/ml-től 50 ng/ml-ig terjedő koncentrációban jelenlévő emberi növekedési hormon.

23. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jel- 1 e m e ζ v e, hogy a közeg hidrokortizont is tartalmaz. 24. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jel- 1 e m e ζ v e, hogy a hidrokortizon körülbelül 0,1 μιηόΐ-tól

körülbelül 50 μιηόΐ-ig terjedő mennyiségben van jelen.
25. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtszaporodást serkentő vegyület inzulin és legalább egy további, a sejtszaporodást serkentő vegyület.
26. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jel lemezve, hogy a sejtszaporodást serkentő vegyület körül belül 5 ng/ml-től körülbelül 100 Mg/ml-ig terjedő koncentrá cióban jelenlévő inzulin.
27. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jel- m e ζ v e, hogy a készítmény oldat alakjában van.
28. A 20.

igénypont szerinti eljárás, a z m e ζ v e, hogy a készítmény gél vagy krém alakjában van.
29. A 20.

igénypont szerinti eljárás, a m e ζ v e, hogy a készítmény liofilizált alakban van.
30. A 20.

igénypont szerinti eljárás, a ζ z a 1 j e 1 • ·· · ·· w · • · · »w> ·· * • · · · · rv· <·4 ···«** · «

-48 —

1 e m e z v e, hogy a készítmény egy kiszerelő (vivő) polimer hatásos mennyiségét is tartalmazza.
31. A 30.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiszerelő (vivő) polimer (hidroxi-etil)-metakrilát, poli(vinil-pirrolidon), polietilén-glikol, zselatin, kollagén, agaróz, hidrofil cellulóz-polimer vagy ezek keveréke.
32. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jel- lemezve, hogy a szérummentes tápközeg ADC-1, albuminmentes LPM, F10, F12, DCCM1, DCCM2, BGJ közeg (Fitton-Jackson szerint módosítva), Eagle-féle alapközeg (BME Earle-só alapanyaggal kiegészítve) , Dulbecco-féle módosított Eagle-közeg (szérummentesen) , Glasgow szerint módosított Eagle-közeg (GMEM), Leibovitzféle L-15 közeg, McMoy-féle 5A közeg, MDCB 153 közeg, M199 közeg (M199E Hank-féle sóalapanyaggal), M199 közeg (M199H Hank-féle sóalapanyaggal), Eagle-féle minimális esszenciális táptalaj (MEM-H Hank-só alapanyaggal) vagy Eagle-féle minimális esszenciális táptalaj (nem-esszenciális aminosavakkal kiegészítve).
33. A 32. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tápközeg MDCB 153.
34. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a készítmény egy antimikrobiális hatású anyag hatásos mennyiségét is tartalmazza.
35. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antimikrobiális hatású anyag valamilyen antibiotikum.
36. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jel ···· 99

1 eme z ve, hogy az antibiotikum valamilyen cefalosporin vagy tetraciklin.
37. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jel-

1 eme z ve, hogy a sejtszaporodást serkentő vegyületként a nemszteroid anabolikus hormon az emberi növekedési hormon, inzulin, trijód-tironin, tiroxin vagy ezek keveréke.