HUT67186A - Altered affinity polypeptides of metal chelate binding antibodies - Google Patents

Description

Fémkelátok megkötésére képes, megváltoztatott affinitásu antitest-polipeptidek

Hybritech Incorporated, SAN DIEGO, California,

AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

Feltalálók:

AHRWEILER Patrícia Marié, SCHAUMBURG, Illinois,

MOORE Margaret Dow, SAN DIEGO, California,

AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

A bejelentés napja: 1993. 11. 10.

Elsőbbsége: 1992. 11. 12. (07/975,230),

AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

A találmány leírása során számos publikációra hivatkozunk a zárójelekben idézett irodalmi hivatkozásokon keresztül. A hivatkozások révén ezeket a publikációkat beépítettük a találmány leírásába, mely azt a célt szolgálja, hogy teljesebb képet adjunk a tudomány azon témakörének állásáról, ahová ez a találmány is • · · tartozik.

A találmány betegségek kezelésére és diagnosztizálására szolgáló antitestekkel és antitest fragmentekkel kapcsolatos. Közelebbről a találmány antitestek vagy antitest fragmentek egy olyan családjával kapcsolatos, melyek képesek a fémkelátok kötésére.

A magasabb rendű szervezeteket olyan immunrendszer jellemzi, mely védelmet biztosit a potenciálisan káros anyagokkal vagy mikroorganizmusokkal szemben. Ha egy anyag, melyet nevezzünk antigénnek, bekerül a testbe, és az ezt idegenként észleli, az immunrendszer mind antitest által közvetített, mind sejt által közvetített választ indít ezzel szemben. Az immunrendszer sejtjei, melyeket B limfocitáknak vagy B sejteknek neveznek, olyan antitesteket termelnek, melyek specifikusan felismerik és kötik az idegen anyagokat. Más limfociták, a T limfociták vagy T sejtek, kiváltják és szabályozzák a sejt által közvetített választ, mely végül az antigén eltávolítását eredményezi.

Ismeretes, hogy az antitest specifitását és affinitását a komplementaritást meghatározó régiók (CDR-ek) szekvenciája és szerkezete vagy a könnyű és nehéz variábilis domének hipervariábilis szekvenciái irányítják. Az antitest kötő régiójának szerkezete magába foglalja a könnyű és nehéz láncok valamennyi párjainak variábilis doménjeit. A könnyű és a nehéz láncon található domének azonos általános szerkezettel rendelkeznek és minden

- 3 dómén rendelkezik konzervált szekvenciát tartalmazó 4 régióval, melyeket 3 hipervariábilis vagy komplementaritást meghatározó régió (CDR) köt össze. A négy keret régió túlnyomórészt a β-lemez konformációt veszi fel és a CDR-ek összekötő hurkokat képeznek a β-lemez szerkezet között, néhány esetben annak részét képezik. A CDR-ek szoros közelségben vannak a keret régiók miatt és más doménekből származó CDR-ekkel hozzájárulnak az antigén kötő hely létrej öttéhez.

Egy antigénnel vagy hapténnel komplexet képzett antitestek kristályos szerkezetének analízisét arra használtuk, hogy demonstráljuk azt, hogy az egyes CDR-ekből származó aminosav maradékok kapcsolatba lépnek az antigénnel (lásd pl. Davies et al., J, Bioi. Chem. 263, 1988). A CDR aminosav maradékok és a haptén molekulák közötti kölcsönhatásokat számos antitest-haptán komplex esetében vizsgálták, a komplex kristályos szerkezetét használva, a hely-irányította mutagenezises tanulmányokkal együtt (lásd. pl. Glockshuber et al., Biochemistry 30:3049-3054, 1991, és Strong et al., Biochemistry 30:3739-3748, 1991).

Az antitestek az immunovizsgálatokban való in vitro alkalmazásokban és a betegségek in vivő diagnosztizálásában és kezelésében is fontos szerepet játszanak. Azok az antitestek, melyek egy fémion és egy kelátképző anyag kelát komplexe ellen irányulnak, különösen hasznosak bizonyos betegségek in vivő feltérképezésében és kezelésében, különösen bizonyos karcinómákkal kapcsolatos tumorok esetében, mint pl. a kolorektális és az • · · *

emlő karcinómákéban. ..Ezeket a fém-specifikus antitesteket hasznosító tumor specifikus bifunkcionális antitesteket szintén meg lehet szerkeszteni. A lokalizációhoz a megfelelő kelátképző anyaggal komplexet képzett gyógyászati vagy diagnosztikai radiojelölések ily módon a tumorhoz juttathatók a feltérképezéshez vagy terápiás célokból.

A találmány kielégíti a rák és egyéb betegségek leküzdésében használatos továbbfejlesztett terápiás és diagnosztikai eszközök iránti foplyamatos igényt.

A találmány polipeptidek vagy antitest variánsok egy olyan családját biztosítja, melyekben a CDR-ek aminosav szekvenciáját oly módon változtattuk meg specifikusan, hogy a polipeptidek bizonyos haptén vagy fém keláttal szembeni kötési affinitása azonos vagy eltérő legyen a natív antitest kötési affinitásával.

Részletesebben, olyan polipeptideket vagy antitest fragmenteket biztosítunk, melyek képesek EDTA vagy DOTA fém kelátokat vagy rokon hapténeket kötni, melyekben a polipeptid vagy az antitest fragment kötési affinitása megközelítően azonos vagy eltér a natív antitest vagy antitest fragmentek kötési affinitásától. A fémkomplexek közé tartoznak a fémionok terápiás és feltérképező radionukleotidjai.

Egy megvalósulásban - a CHA255-nek jelölt antitest mutáns polipeptidjei - egy fém komplexeket kötni képes patkány monoklonális antitestet biztosítunk. Ezek a polipeptidek megközelítően azonos, alacsonyabb vagy magasabb kötési konstanssal rendelkeznek a fémkomplexekkel szemben mint a natív CHA255 antitest. A polipeptidek különösen magas kötési affinitással rendelkeznek az EDTA vagy DOTA fémkomplexekkel szemben, legelőnyösebben a ¹¹¹Ιη EDTA vagy ⁹⁰YDOTA komplexekkel szemben. Azt találtuk, hogy a CDR 1 (Hl) és a CDR 3 (H3) nehéz láncainak és a CDR 2 (L2) és a CDR 3 (L3) könnyű láncainak bizonyos aminosav helyettesítései megváltozott affinitásu polipeptideket eredményeznek.

A találmány polipeptidjeit kódoló nukleotid szekvenciákat, valamint ezen nukleotid szekvenciákat tartalmazó vektorokat biztosítunk. Továbbá biztosítunk olyan gazdasejteket, melyek ezeket a vektorokat tartalmazzák.

A következőkben megadjuk az ábrák rövid leírását

1. ábra A CHA255 könnyű láncú variábilis régiójának aminosav (1A) és nukleinsav (1B) szekvenciáit; valamint a CHA255 nehéz láncú variábilis régió aminosav (IC) és nukleinsav (1D) szekvenciáit mutatja.

2. ábra A könnyű és nehézláncu CHA255 CDR-ek Ll-nek, L2-nek, L3-nak és Hl-nek, H2-nek és H3-nak nevezett aminosav szekvenciáit mutatj a.

3. ábra A 3A ábra az L2 és az L3 mutagenezise után kapott pozitív kiónokat, a 3B ábra a Hl és a H3 mutagenezise után kapott pozitív kiónokat mutatja.

4. ábra A CHA255 natív Fab', a fág által expresszált CHA255 natív Fab' és a fág által expresszált megváltozott CHA255 Fab' fragmentek kötési affinitásának (Ka) összehasonlítását mutatja.

Hacsak másként nem jelöltük, az összes technikai és tudományos fogalom jelentése a tudomány e területén általában használt jelentésekkel azonos.

A találmány szerinti használatban a variáns, a mutáns és a a találmány szerinti polipeptidek fogalmak olyan polipeptidre illetve proteinre vonatkoznak, melyek olyan elsődleges aminosav szekvenciával rendelkeznek, mely eltér a nativ polipeptidekétől vagy proteinekétől. A találmány szerint a nativ fogalma az antitest vagy az antitest fragmentjének olyan formájára utal, melyet a természetből izoláltunk, vagy mely mentes szándékos aminosav helyettesítésektől.

A találmány szerint az antitest vagy immunoglobulin fogalom olyan proteinre vonatkozik, mely egy antigénnel vagy egy fémkeláttal történő immunizálásra adott válaszként termelődik és specifikusan lép kapcsolatba az antigénnel vagy a fémkelát hapténnel. Ez poliklonális és monoklonális antitesteket is magába foglal. Az antitestek bármilyen állatból izolálhatok, pl. egérből, nyulból, vagy emberből.

A találmány szerint az antitest magába foglalja az antitestek fragmentjeit is, melyekre a találmányban polipeptidekként utalunk. Az antitest fragment vagy polipeptid megőriz legalább egy kis az antigénjéhez vagy hapténjéhez való szelektív kötődési képességet. A találmány magába foglal olyan rekombináns módon előállított, biokémiai utón szintetizált vagy , kémiailag szintetizált vagy kémiailag módosított polipeptideket, melyek f ♦ ·· » :·*····. · *’*· ., · * «· ··♦ megőrizték a megfelelő natív antitest antigénhez vagy hapténhez való kötődési képességet. Az antigénnel vagy hapténnel való kötődési képességet az antigén-kötődési vizsgálatokkal határozzuk meg, mint pl. az antitest befogó vizsgálatként ismert módszerrel (lásd pl. Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1988). A bizonyos kötési képességet megőrző antitest fragmentek vagy polipeptidek a következőkre való korlátozás nélkül az alábbiakat foglalják magukba:

(1) Fab;

(2) Fab';

(3) (Fab')₂;

(4) Fv, melyet egy olyan genetikailag manipulált fragmentként határozunk meg, mely tartalmazza a két láncként expresszált könnyű lánc és a nehéz lánc variábilis régióit; és (5) SCA, melyet egy olyan genetikailag manipulált molekulaként határozunk meg, mely tartalmazza egy a megfelelő polipeptid kötővel összekapcsolt könnyű lánc variábilis régióját és a nehéz lánc variábilis régióját, egy genetikailag fuzionált egyedüli láncmolekulaként.

A találmány szerint a könnyű lánc variábilis régió és a nehéz lánc variábilis régió fogalma megfelelően a könnyű és nehéz láncok N-terminális végén levő régiókra vagy doménekre vonatkozik, melyek változatos primer aminosav szekvenciával rendelkeznek az egyes natív antitestekkel szemben. A natív antiV · · ι * · · ; ·

- 8 test variábilis régiója tartalmazza a könnyű és a nehéz láncok amino terminális doménjét, ahogy összetekerednek az antigén kötő hely háromdimenziós kötő helyének létrehozásához.

A találmány szerint a monoklonális antitest egy sejt egyedüli kiónjából származó immunoglobulinokra vonatkozik. A klónból származó összes monoklonális antitest kémiailag és szerkezetileg azonos és specifikus egy egyedüli antigenikus determinánsra.

A találmány szerint a haptén fogalma egy antigén olyan részére vonatkozik, mely az immunválasz immuntérmékévei reagál, de mely maga nem képes immunválaszt indukálni egy hordozóval való komplex létrejötte nélkül, mely a teljes antigén létrehozásához szükséges. A találmány által leirt fémkelátok az ilyen haptének specifikus példái.

A találmány szerint a vektor vagy az expressziós vektor fogalma olyan heterológ nukleinsav szekvenciákra vonatkozik, melyek képesek egy szelektált gazdasejtben expresszálódni az expressziójukat elősegíteni képes más szekvenciákhoz - pl. promóter szekvenciához, erősítő szekvenciához - való operációs kapcsolódáson keresztül. A találmány szerint a nukleinsav fogalma egyszálu vagy kétszálu DNS-re, cDNS-re vagy RNS-re vonatkozik. A rekombináns DNS technológiában tipikusan alkalmazott vektorok a következőket foglalják magukba: bakteriális plazmidokat, bakteriális fágokat, állati vírusokat vagy bakulovirust a rovar sejtekben való expresszióhoz.

A találmány szerint a komplementeritást meghatározó régió (CDR) vagy hipervariábilis régió egy antitest könnyű és nehéz láncain levő aminosav szekvenciákra vonatkozik, melyek háromdimenziós hurok szerkezetet hoznak létre, mely hozzájárul az antigén vagy haptén kötő hely kialakításához.

A találmány szerint a CDR-rel átvitt antitest egy olyan antitestre vonatkozik, mely egy olyan aminosav szekvenciával rendelkezik, melyben a könnyű és/vagy a variábilis doménben levő egy vagy több CDR szekvenciák legalább egy részét egy adott hapténnel vagy antigénnel szemben eltérő kötési specifitást mutató antitestből származó CDR szekvenciák analóg részeivel helyettesítettük. Az analóg CDR szekvenciákra azt mondjuk, hogy átvisszük a szubsztrátra vagy a recipiens antitestre (lásd European Patent Publication No. 0 239 400). A donor antitest az az antitest, mely biztosítja a CDR szekvenciát és a helyettesített szekvenciákat megkapó antitest a szubsztrát antitest.

A találmány szerint a kiméra antitest fogalma egy olyan antitestre vonatkozik, melyben az egy fajból származó antitestek variábilis régióit kombináljuk eltérő fajból származó antitestek konstans régióival. A kiméra antitesteket rekombináns DNS technológiával hozzuk létre és a következő müvekben kerültek leírásra: Shaw et al., J. Immun., 138:4534, 1987; Sun, L.K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218. 1987; Neuberger, M.S. et al., Natúré, 314:268. 1985; Boulianne, G.L. et al., Natúré, 312:643-646, 1984; valamint Morrison, S.L. et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 81.:6851-6855, 1984, például.

A találmány szerint az oligonukleotid-áital irányított mutagenezis vagy a hely irányított mutagenezis fogalmak egy olyan módszerre vonatkoznak, mellyel megváltozott DNS szekvenciákat nyerünk a fenotipusos szelekció nélkül, T. Kunkel leírásának megfelelően (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, .82:488-492, 1985).

A találmány szerint a kódon alapú mutagenezis fogalma egy aminosavat kódoló három nukleotidból álló kódon in vitro helyettesítésére vonatkozik, mely kódont egy pepiidben mutációt előidéző aminosav szekvenciába helyettesítünk. Ez aminosav változásokat okoz az egyes helyettesítésekkel, az egyszeri nukleotid inzertációkkal, helyettesítésekkel, vagy deléciókkal létrehozott in vivő mutációkkal szemben, melyek nagyobb számú mutációs eseményt igényelnek az aminosav szekvenciában bekövetkező változás eléréséhez.

A találmány szerint a fémkomplex, fémkelát vagy haptén kifejezések fémionok kelátjaira vonatkoznak, pl. az EDTA (etiléndiamin tetraecetsav) vagy az EDTA analógok kelátjaira. Számos fémről ismert, hogy köti az EDTA-t, ezek közé tartoznak az In(III), a Sc(III), a Fe(III), a Ga(III), a Tb(III), a Mn(II), a Co(II), a Co(III), a Cu(II), a Zn(II), és a Zn(II), ahogy az a 4,722,892-es számú US. szabadalomban leírásra került. Az EDTA analógjait, mint pl. a dietiléntriamin pentaecetsav (DTPA), valamint az EDTA és EDTA analógok előállítási módszerét a

4,622,420-as számú US. szabadalomban írták le. Más EDTA analógo• ·

-Ilkát, ideértve a DOTA-t a HETA-t a TRITA-t és a TETA-t a

4,678,667-es számú US. szabadalmomban írták le. Ezek az analógok képesek számos fémionnal komplexet képezni, ideértve a

4,622,420-as számú US. szabadalomban leirt radioaktív ionokat is. A radioaktív fémionokkal komplexet alkotni képes további analógokat a 3. Példában irtuk le.

A találmány szerint a DOTA jelentése 2-p-nitrobenzil1,4,7,10-tetraazaciklododekán-N,Ν',N,N'''-tetraecetsav. Az EOTUBE jelentése 4-[Ν'[2-hidroxietil]-tioureido]benzil EDTA, a p-(aminobenzil)EDTA egy olyan származéka, melyben az egyik etilén belső szén atomjai helyettesítésre kerültek. A DOTA, ha a radioaktív Ittriummal képez komplexet, vagy az EOTUBE, ha a radioaktív ⁴⁴⁴In-nel képez komplexet különböző antitest vizsgálatokban használatos, ahogy azt a későbbiekben leírtuk. Az EOTUBE szintézisét, valamint ennek standard Scatchard Analiziben való használatát infra irtuk le.

Az asszociációs konstans, az affinitási konstans vagy a kötési konstans, a Ka, fogalmak jelentése az antitest-fém kelát komplex koncentrációja és a szabad antitestek és az egyensúlyi fémkelát komplex koncentrációi szorzatának hányadosa, ahogy az egyenlet mutatja: [Ab*H]/[Ab][H]. Ezt például úgy határozzuk meg, hogy az antitestet és a fémkelátokat majdnem egyensúlyi állapotig dializáljuk és meghatározzuk a szabad antitestek vagy fémkelátok mennyiségét (Eisen, Meth. Med. Rés. .10.:106, 1964).

A találmány szerint a fémkelát komplex egy olyan komplexre • ·

Λ · · · · ·

- 12 utal, mely egy a fémionjához kötött fémkeláthoz kötött polipeptidet tartalmaz.

A találmány polipeptidjei egy natív antitest vagy egy antitest fragment variánsainak családjába tartoznak. Az egyes variánsok egy vagy több aminosav helyettesítést tartalmaznak a könnyű lánc egy vagy több CDR szekvenciájában és/vagy egy vagy több aminosav helyettesítést, vagy a natív antitest nehéz láncának egy vagy több CDR szekvenciájában helyettesitéséket. Ezek a polipeptidek kötési affinitással rendelkeznek egy adott fémkeláttal szemben, mely megegyezik vagy eltér a natív antitestétől.

Részletesebben, a találmány polipeptidjei rokon és gyógyászatilag hasznos polipeptidek vagy antitest fragmentek családját jelentik, melyek képesek kötni az EDTA vagy a DOTA vagy ezek analógjainak fémkelátjait. Ezek a polipeptidek hasznosak a rosszindulatú szövetek vagy tumorok in vivő feltérképezésében. Ezek hasznosak a rosszindulatú szövetek vagy tumorok pl. a kolorektális vagy emlő karcinómák kezelésében is. Mindkét módszer magába foglalja a radionuklidek alkalmazását, melyek kötődnek a fémkelátokhoz vagy hapténekhez, melyek specifikusan szállítódnak a célhelyhez célmolekula segítségével. Például a gamma-emissziós radionuklidek komplexeket képezhetnek az EDTA-val vagy az EDTA analógokkal a célzott szövetek feltérképezésére. Az alfa- vagy béta- emissziós radionuklidek a célzott szövetek radioterápiájához alakíthatók komplexekké.

A találmány egy előnyben részesített megvalósulásában a ♦

• · · találmány polipeptidjei a patkány monoklonális antitest CHA255 variánsainak családjába tartoznak. A CHA255-öt D.T. Reardan et al írták le (Natúré, 316:265-268, 1985), valamint a 4,722,892-es számú US. szabadalomban került leírásra. A CHA255 számos az EDTA-val, különösen az L-benzil-EDTA-val komplexet képzett fémionhoz kötődik. Ezek közé tartoznak a Se(III), a Fe(III), a Ga(III), a Tb(III), aYb(III), aMn(II), aCo(II), aCo(III), a Cu(II), a Zn(II) és a Cd(II), (4,722,892-es számú US. szabadalom, I-es Táblázat, 3. oszlop). A CHA255 antitest és a találmány CHA255 variánsainak családja különösen magas kötési affinitással rendelkezik az ¹¹¹In és az L-aminobenzil EDTA kelát komplexekkel szemben, megközelítően 10¾^-^.

A megközelítően azonos fokú funkcionalitással rendelkező közeli rokonságban álló mutáns polipeptidek családjának generációja gyógyászati szempontból hasznos, mivel lehetővé teszi, hogy egy antitestet egy másikkal helyettesítsünk, ha az adott antitest alkalmazása ártalmas anti-idiotipusu reakciót okoz a recipiensben.

Ha a nativ antitest alacsony affinitást mutat hapténjével szemben, ez a módszer hasznos a nativ antitestnél magasabb kötési affinitásu származékok létrehozásában. A megnövekedett affinitás biztosítja, hogy a haptént tartalmazó izotóp elegendő mennyiségei megfelelő ideig tartózkodjanak a célnál. így ezek az antitestek hasznosak lesznek terápiás és feltérképezési alkalmazásokban is.

A hapténekkel szemben a megfelelő nativ antitestnél ala14 csonyabb affinitást mutató mutáns polipeptidek családjának generációja szintén lehet gyógyászati szempontból hasznos, mivel nagyobb a valószínűsége annak, hogy a polipeptid a tumor belsejét célozza meg, igy megnöveli a tumor átjárhatóságát. A magasabb affinitással rendelkező polipeptidek általában erősen kötődnek a célhoz az első elérhető felszínen, általában a tumor felszínén, igy a polipeptid nem jut be könnyen a tumorba.

A találmány polipeptidjeit a következő általános stratégia szerint származtatjuk. Először, egy natív antitest könnyű láncának variábilis régióját és a nehéz lánc variábilis régióját kódoló nukleinsav szekvenciát klónozzuk külön vektorokba. Ezeket a vektorokat ezután emésztésnek vetjük alá, majd egymáshoz anneáljuk őket egy egyedüli expressziós vektor létrehozásához. Az ezen vektorokon belüli nukleinsav szekvenciákat in vitro hely irányított mutagenezissel mutáltatjuk a Kunkel· et al által leírtak szerint (supra). Kunkel et al. módszerében egy először mutagenizált cDNS könyvtár tartalmaz egy sor mutagenizált könnyű láncú variábilis régiót a natív nehéz lánc régióval együtt egy Fab' fragment létrehozásához. Hasonlóképpen, egy második cDNS mutagenizált könyvtárat hozunk létre, mely tartalmaz egy sor nehéz láncú variábilis régiót a natív könnyű variábilis régióval együtt egy Fab' fragment létrehozásához.

Tetszőlegesen, természetesen egy könyvtár létrehozható úgy is, hogy tartalmazza a fent leirt módon mutagenizált könnyű és nehéz lánc régiókat is a szelektálás előtt. Másik lehetőségként • * »

• · szelektálható a legjobb mutagenizált nehéz és a legjobb mutagenizált könnyű variábilis régió, majd ezek kombinálhatok, és a legjobb kombináció szelektálható.

A mutagenezis előnyösen számos in vitro technikával végezhető el, melyek ismertek a tudomány e területén, pl. random kódon kazetták inzertálásával (Lowman et al., Biochemistry. 30:1083210838 , 1991), vagy a hibára hajlamos PCR-rel (Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, .89:3579-3580). A teljes variábilis dómén kitehető mutagenezisnek, a leírtak szerint pl. Jackson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, .88:58-62, 1991. Másik lehetőségként, ha a natív antitest szerkezete megfelelő módon jellemzett, a hipervariábilis régiók bizonyos aminosav szekvenciái szelektíven célozhatok pl. ahogy Glockschuber et al., leírják (Biochemistry, 20:3049-3054, 1991) az McPC603 antitestre. A mutagenezissel létrehozott nagyszámú polipeptid előnyben részesített előállításához és szkrineléséhez való módszer a fág bemutató könyvtárak használata, melyek felületi bemutató könyvtárként is ismertek, ahogy a WO 92/06204 Nemzetközi Publikáció leírja.

Az expressziós termékeket, melyek antitest fragmentként állnak össze, mint pl. a Fab' fragment, melyek egy potenciális funkcionális kötő hellyel rendelkeznek, a tudományban ismert módszerekkel szkrinelünk a kötési affinitásra, pl, ELISA (Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay) módszerrel,a haptént vagy az antigént hasznosítva vagy affinitási oszlopokkal (ahogy pl.

* ·· »··· · ···· * *· » • · · * · · · i · * · · · • · ··· ··· ···

- 16 Skerra és Pluckthun leírják Science, 240:1038-1041, 1988). Ha a polipeptid a natív CHA255 antitestből származik, akkor a polipeptid szkrinelhető az affinitási haptén kötésre ⁴⁴⁴InEOTUBE telep szkrinelő vizsgálattal (a későbbiekben írjuk le) vagy más kívánatos fém haptén komplexszel szkrinelhető. A szelektált kiónok kötési konstansai a lent leirt Scatchard analízissel határozható meg.

A mutagenezis és a kötési affinitásra való szelektálás után a szelektált polipeptideket kódoló nukleinsavakat izoláljuk. Ezek az izolált nukleinsavak vektorokba ligálhatók, és az expresszióhoz megfelelő gazdasejtekbe juttathatók. A nukleinsavak sejteken belüli ligálása és expresszálása jól ismert a tudomány e területén, lásd Maniatis et al. munkáját (Molecular Clonincr: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring

Harbor , NY.).

Számos különböző tipusu vektor szerezhető be és alkalmazható a találmányban való használathoz, pl. plazmid, DNS és RNS virus vektorok, bakulovirus vektorok és az élesztőgombák esetében használt vektorok. Ha a vektor egy plazmid, általában számos alkotórészt tartalmaz ideértve a promótereket, a jelszekvenciákat, fenotipusos szelekciós géneket, a replikációs helyek origóját, és más szükséges alkotórészeket, melyek a tudomány számára ismertek.

A prokarióta vektorokban általában alkalmazott promóterek magukba foglalják a lac Z promóter rendszert, az alkalikus fősz- 17 • 4 ···

9·· 9 ti 99 99 · 9 99

9 99 999999 fatáz pho A promótert, a bakteriofág lambdaPL promótert (ez egy hőérzékeny promóter), a tac promótert (ez egy hibrid trp-lac promóter, melyet a lac represszor szabályoz), a triptofán promótert valamint a bakteriofág T7 promótert.

A találmányban használt előnyben részesített promóterek a lac Z promóter és a pho A promóter. A lac Z promótert a lac represszor lac i proteinje szabályozza és igy a polipeptid transzkripciója szabályozható a lac represszor protein szintjének manipulálásával. Illusztrálásként a lac Z promótert tartalmazó fágmidot egy a lac i represszor gén egy kópiáját és a lac Z promóterhez egy represszort tartalmazó sejt törzsben szaporítjuk. A lac i gént tartalmazó sejt törzsekre példák a JM 101 és az XLl-blue. Másik lehetőségként a gazdasejt kotranszfektálható egy a represszor lac i és a lac Z promótert tartalmazó plazmiddal is. Alkalmanként a két fent leirt technikát szimultán alkalmazzuk, azaz a lac Z promótert tartalmazó fágmid részecskéket egy a lac i gént tartalmazó sejt törzsben szaporítjuk, majd a sejt törzset a lac Z és lac i géneket tartalmazó plazmidokkal kotranszfektáljuk. Normális esetben ha valaki egy gént akar expresszálni a transzfektált fenti gazdában, indukáló szert kell alkalmazni, mint pl. az izopropiltiogalaktozid (IPTG), de ez a lépés elhagyható .

A vektorok másik hasznos összetevője, melyet a találmányban alkalmazni lehet, egy jelszekvencia. Ez a szekvencia tipikusan közvetlenül a polipeptidet kódoló gén 5' végénél helyezkedik el, « · • 4 ·4 ·

4·· * · · · ··· • · · · · ·· »·· ··« ··· és igy a fúziós protein amino terminusán íródik át. Azonban bizonyos esetekben, kimutatták, hogy a jelszekvencia nem a szekretálandó proteint kódoló gén 5' irányában helyezkedik el. Ez a szekvencia azt a proteint célozza meg, melyhez a bakteriális sejt belső membránján keresztül kötődik. A jelszekvenciát kódoló DNS restrikciós endonukleáz fragmentként nyerhető ki bármelyik génből, mely egy jelszekvenciával rendelkező proteint kódol. A megfelelő prokarióta jelszekvenciák pl. a LamB vagy OmpF-et (Wong et al., Gene, .68:193, 1983), a MalE-t, a PhoA-t, az OmpA-t kódoló, és más génekből nyerhetők ki. A találmány alkalmazásához az előnyben részesített prokarióta jelszekvencia az E. coli hőstabil enterotoxin II (STII) jelszekvencia, ahogy Chang et al., leírták (Gene, .55.:189, 1987).

A találmányban használt vektorok másik hasznos alkotórésze a fenotipusos szelekciós gén. A tipikus fenotipusos szelekciós gének azok, melyek olyan proteineket kódolnak, melyek antibiotikum rezisztenciát biztosítanak a gazdasejtnek. Illusztrálásként, az ampicillin rezisztencia gént (amp), és a tetraciklin rezisztencia gént (tét) szívesen alkalmazzák ebből a célból.

A fent említett alkotórészeket tartalmazó megfelelő vektorok megszerkesztéséhez, valamint a kívánt polipeptidet kódoló gén megszerkesztéséhez standard rekombináns DNS eljárásokat használunk. A vektor létrehozására összeállítandó izolált DNS fragmenteket hasítjuk, átalakítjuk és specifikus sorrendben és orientációban ligáijuk egymáshoz a kívánt vektor létrehozása céljából.

• · Μ*· « · · ·· * «·4 •Φ· φ 4 φ *··· • · · ·Φ •· ··« φ Φ φ ·4·

A DNS-t megfelelő pufferben levő megfelelő restrikciós enzimmel vagy enzimekkel hasítjuk. Általában 0.2 - 1 Mg plazmidot vagy DNS fragmentet használunk 1-2 egység 20 μΐ puffer oldatban levő megfelelő restrikciós enzimmel. A megfelelő puffereket, a DNS koncentrációkat, az inkubációs időket és hőmérsékleteket a restrikciós enzim gyártója megadja. Általában az inkubációs idő 1 vagy 2 óra és a megfelelő hőmérséklet 37 °C, bár számos enzim magasabb hőmérsékletet igényel. Inkubáció után az enzimeket és az egyéb szennyező anyagokat az emésztésnek alávetett oldatból fenol és kloroform elegyével végzett extrakcióval eltávolítjuk és a DNS-t a vizes fázisból etanolos kicsapatással nyerjük ki.

A DNS fragmentek funkcionális vektorrá való ligálásához a DNS fragmentek végei egymással kompatibilisek kell legyenek. Néhány esetben a végek közvetlenül kompatibilisek az endonukleázzal végzett emésztés után. Azonban szükség lehet arra, hogy először az endonukleázos emésztéssel általában ragadós végűvé lett végeket tompa végűvé tegyük, hogy a ligáláshoz kompatibilisek legyenek. A végek tompavégüvé tételéhez a DNS-t egy megfelelő pufferben kezeljük legalább 15 percig 15 °C hőmérsékleten 10 egység DNS polimeráz I Klenow fragmentjével (Klenow) a négy dezoxinukleotid trifoszfát jelenlétében. A DNS-t ezután fenol-kloroformos extrakcióval tisztítjuk és etanollal kicsapatjuk.

A hasított DNS fragmenteket méret szerint szeparáljuk és DNS gélelektroforézist használva szelektáljuk. A DNS elektroforézisét • * « «

- 20 vagy agaróz vagy poliakrilamid mátrixon végezzük. A mátrix kiválasztása a szeparálandó DNS fragmentek méretétől függ. Az elektroforézis után elektroelucióval extraháljuk a DNS-t a mátrixból vagy ha alacsony olvadáspontu agarózt használunk mátrixként, az agarózt megolvasztjuk és a DNS-t kivonjuk .

Az egymáshoz ligálandó DNS fragmenteket (melyeket korábban a megfelelő restrikciós enzimekkel úgy emésztettük, hogy az egyes fragmentek végei a ligáláshoz kompatibilisek) kb. equimoláris mennyiségekben visszük, oldatba. Az oldat tartalmaz ATP-t ligáz puffért és ligázt is, pl. a T4 DNS ligázt kb. 10 egység/0.5 μς DNS mennyiségben. Ha a DNS fragmentet egy vektorba akarjuk ligálni, a vektort először linearizáljuk megfelelő restrikciós endonukleázokkal való hasítással. A linearizált vektor ezután kezelhető alkalikus foszfatázzal vagy borjú intesztinális foszfátázzál. A foszfatázzal való kezelés kivédi a vektor önligálódását a ligációs lépés alatt .

Ligálás után az idegen génnel most már inzertált vektort egy megfelelő gazdasejtbe transzformáljuk. A megfelelő prokarióta gazdasejtek közé a következők tartoznak: E. coli JM101-es törzs, E. coli K12 294-es törzs, (ATCC N°31,446), E. coli W3110-es törzs (ATCC N° 27,325), E. coli X1776 (ATCC N° 31,537), E, coli XLlBlue (Stratagene), és E. coli B; azonban az E. coli más törzsei is mint pl. a HB101, NM522, NM538, NM539 és a prokarióták számos más faja és nemzetsége használható. Az E. coli törzsek fenti listáján túl bacillusok, mint pl. Bacillus subtilis, más enteroJ*·’ .

• « · · · « •· ··♦ «·« ··« ««· bakteriáceae mint pl. a Salmonella typhimurium vagy a Serratia marcescens és számos Pseudomonas faj használható gazdaként.

A prokarióta sejtek transzformációja könnyen elvégezhető kalcium-kloridos vagy más ismert módszerrel, melyek ismertek a tudomány e területén képzett szakember számára. Elektroporáció is használható ezen sejtek transzformálásához (Neumann et al., EMBO J. 1:841, 1982) . A transzformált sejteket egy antibiotikumon általában tetraciklinen (tét) vagy ampicillinen (amp) való szaporodással szelektáljuk, mellyel szemben rezisztenciát mutatnak a vektoron levő tét és/vagy amp rezisztencia géneknek köszönhetően.

A transzformált sejtek szelektálása után ezeket a sejteket tenyészetben szaporítjuk majd a plazmid DNS-t (vagy más az idegen génnel inzertált vektort) izoláljuk. A plazmid DNS-ek ismert módszerekkel izolálhatok. Ezt a tisztított plazmid DNS-t ezután restrikciós térképezéssel és/vagy DNS szekvenálással analizáljuk.

A fent leirt eljárások után emlős sejtvonalak mint pl. a mieloma (P3-653), hibridóma (SP2/0, Kínai hörcsög Ovárium (CHO) Zöld majom vese (COS1) és patkány fibroblasztok (L492) a megfelelő gazdasejtek a polipeptidek expressziójához. Ezek az emlős vektorok magukba foglalhatnak promotert, erősítőt, poliadenilációs jeleket, jelszekvenciákat és szelektálható markereket kódoló géneket, mint pl. a geneticin (neomicin rezisztencia), mikofenolos sav (Xantin, -guanin foszforibozil transzferáz) vagy hisztidinol (hisztidinol dehidrogenáz).

Az emlős gazdasejtekben használható megfelelő promóterek a következőket foglalják magukba az ezekre való korlátozás nélkül: lg Kappa, lg Gamma, Citomegalovirus (CMV) azonnali korai, Rous Sarcoma Vírus (RSV), majom vírus 40 (SV40) korai, egér emlő tumor (MMTV) vírus és metallotionein. A megfelelő erősítők magukba foglalják, az ezekre való korlátozás nélkül a következőket: lg Kappa, lg Nehéz, CMV korai és SV40. A megfelelő poliadenilációs szekvenciák magukba foglalják az lg Kappá-t, az lg Gammá-t vagy az SV40 nagy T antigént. A megfelelő jelszekvenciák közé az lg Kappa, az lg nehéz és humán növekedési hormon (HGH) tartoznak.

Ha a vektor bakulovirus, a megfelelő promóterek és erősítő szekvenciák közé az ezekre való korlátozás nélkül a következők tartoznak: AcMNPV polihedrin, AcMNPV ETL és AcMNPV plO szekvenciák. Egy különösen megfelelő poliadenilációs jel a polihedrin AcMNPV. Az lg Kappa, az lg Nehéz és AcMNPV a megfelelő jelszekvenciákra példák. Ezek a vektorok a következő rovar sejtvonalakban való alkalmazáshoz hasznosak többek között:SF9, SF21 és a High5.

Másik lehetőségként a polipeptid olyan élesztőgomba törzsben is expresszálható, mint a PS23-6A, W301-18A, LL20, D234-3, INVSC1,INVSC2 és YJJ337. Promóter és erősítő szekvenciák, mint a gal 1 és a pEFT-1 szintén hasznosak. A Vra-4 szintén megfelelő erősítő szekvenciát biztosit. A funkcionális replikációs origóként szóbajöhető szekvenciák magukba foglalják az arsl és a 2μ cirkuláris plazmidokat.

·** ν·· λχ··· ··· »·· *··· ’ · ♦ · «· ·· ··· ·«· ···

- 23 Az előnyben részesített, a fém komplexekkel szemben kötési affinitással rendelkező patkány CHA255 származású polipeptidek a későbbiekben leirt előnyben részesített stratégia szerint állíthatók elő. Ezen mutáns polipeptidek származtatásának specifikus protokolljait az 1. Példában mutatjuk be.

PoliA+ mRNS-t izoláltunk a CHA255-öt expresszáló hibridóma sejtekből. A nehéz és könnyű lánc variábilis régiók cDNS szintézisét és PCR amplifikációját a lent leirtak szerint végeztük el. A könnyű és nehéz lánc variábilis régiókat egy megfelelő vektorba a lent leirtak szerint klónoztuk. A klónozott CHA variábilis könnyű és nehéz lánc gének szekvenálását az egyszálu templátokhoz való standard eljárásokkal végeztük Sanger et al. (Maniatis, supra) szerint. A kapott cDNS szekvencia adatokból a DNS szekvenciák által kódolt polipeptidek aminosav szekvenciáját a MAPSEQ számitógépes software alapján vezettük le, mely a kereskedelemben kapható a DNAStar-tól (Madison, Wiskonsin). Ezek a szekvenciák az 1. ábrán szerepelnek.

A CHA255 antitest könnyű lánc variábilis légió elsődleges aminosav szekvenciáját a .. számú szekvenciában mutatjuk be. A CHA255 könnyű lánc variábilis régiót kódoló nukleotid szekvenciát a .. számú szekvenciában mutatjuk be. A CHA255 antitest nehéz lánc variábilis régió elsődleges aminosav szekvenciáját a .. számú szekvenciában mutatjuk be. A nehéz lánc variábilis régiót kódoló nukleotid szekvenciát a .. számú szekvenciában mutatjuk be. A könnyű és nehéz lánc variábilis régiók három hipervariábi.·· j··· ι··· ··· ··· · ··· ♦ * · · · ·· ··· ··· ·<· lis vagy komplementaritást meghatározó régiójának aminosav szekvenciáját meghatároztuk. A CDR régiók meghatározásának eszközei jól ismertek. Például, a CDR lokációi levezethetők Wu és Kábát (J. Exp. Med.,132:211-250, 1970) módszerének megfelelően.

A hipervariábilis régiók szekvenciáit a 2. ábra tartalmazza. Az L1 a .. számú szekvenciaként, az L2 a .. számú szekvenciaként, az L3 a .. számú szekvenciaként, a Hl a .. számú szekvenciaként, a H2 a .. számú szekvenciaként, és a H3 a .. számú szekvenciaként került felsorolásra. Mutagenezisnek azokat a bizonyos aminosav maradékokat vetettük alá, melyekről úgy vélik, hogy közvetlenebbül vesznek részt a fémkelát kötésben. Például, az L2 és L3 régiók maradékait és a Hl és H3 régiók maradékait, melyeket a 2. Ábrában aláhúzással jelöltük, vetjük alá mutagenezisnek.

A fémkomplex kötő polipeptidek mutagenezisének és szkrinelésének előnyben részesített módszere a könnyű és nehéz lánc variábilis régiók Fab'-M13 fág bemutató könyvtárba való klónozása a WO 92/06204-es számú Nemzetközi Alkalmazási Publikációban leírtak szerint történik. Sacifikusabban, a könnyű lánc variábilis régiót az 1X33 (IXSYS, San Diego, CA) vektorba ligáljuk, és a nehéz lánc variábilis régiót az 1X12 (IXSYS, San Diego, CA) vektorba. Ezután ezeket a vektorokat egy expressziós vektorrá alakítjuk restrikciós exonukleázos emésztéssel és anneálással. Ez a klónozási eljárás lehetőséget biztosit arra, hogy szelektíven mutagenizáljuk a könnyű lánc variábilis régió CDR-eket, mig megtartjuk a natív nehéz lánc variábilis régiót és hogy .·· :··· *·ν «·· * · 4 • · ···

Ϊ···· • ··» • · ··· ··· szelektíven mutagenizáljuk a nehéz lánc variábilis régiót, mig fenntartjuk a könnyű lánc variábilis régió natív szekvenciáját, valamint lehetővé teszi egy intakt Fab' fragment fág burkon való expresszálását a szkrineléshez.

A klónozott könnyű és nehéz lánc variábilis cDNS mutagenezise a Kunkel et al (supra) féle hely irányított mutagenezissel végezhető el. Az előnyben részesített mutagenzis típus a randomkódon helyettesítés 50 %-os telítettségi szintnél, ahogy a WO 92/06176-os számú Nemzetközi Alkalmazási Publikációban leírásra került. Ez a megközelítés CDR mutációk nagy könyvtárát hozza létre a CHA255-ben, melyet ezután szkrinelésnek vetünk alá, replika filter lift vizsgálatot alkalmazva, a nativokéval megegyező vagy annál nagyobb affinitással rendelkező mutánsok azonosítása céljából.

A célzott CDR szekvenciákhoz szintetizált specifikus oligonukleotidok az 1. Példában szerepelnek. A WO 92/06176-os számú Nemzetközi Alkalmazási Publikáció leírja ezen randomizált kódonok szintézisének eljárását.

A mutagenizált Fab' fragmenteket nitrocellulóz szűrő plakk lift vizsgálatával expresszáltuk és szkrineltük, ahogy a WO 92/06204-es számú Nemzetközi Alkalmazási Publikációban leírtuk, és a lenti 1. Példában leirt telep szkrinelési vizsgálattal azonosítottuk. A pozitív kiónok aminosav szekvenciáit a ¹¹¹InEOTUBE szkrinelési vizsgálatban határoztuk meg és a 3A ábrában (könnyű lánc CDR 2 és 3 ) és a 3B ábrában (nehéz lánc CDR 1 és 3) mutatjuk be. A pozitív kiónok közül a 3.1.1, a 4.2.1, az 1.1.1, a 3.2.1, és a 3.7.1.kiónok InEOTUBE-bal (a 3B ábrából) szembeni konstansát a 2. Példában leirt Scatchard analizises eljárással határoztuk meg. A 4. ábra a Scatchard analízis eredményét mutatja, melyben a natív CHA255 Fab' fragmentet hasonlítottuk össze (szintetizált, és tággal expresszált). Látható, hogy az egyes vizsgált kiónok kötési affinitása megközelítően azonos, egy kiónt kivéve - 3.2.1 -, mely megközelítően egy nagyságrenddel kisebb, mint a natív tággal expresszált Fab'.

* A 4. ábrát nézve, megfigyelhető, hogy a Scatchard analízishez kiválasztott szelektált kiónok között nem figyelhető meg aminosav helyuettesités a Hlben vagy az öt H3 aminosav első háromjában. A H3 utolsó két aminosavmaradékát csupán három tipusu maradék helyettesíti: arginin (pozitív töltésű), szerin vagy treonin (kicsit poláros) vagy glicin vagy valin (kicsit semleges). Azonban azt várjuk, hogy a mutagenezis után, ami magas kötési affinitás polipeptideket eredményez , a specifikus aminosav változások a CDR-ekben a kezdetben használt natív antitesttel együtt fognak változni.

A találmány polipeptidjei felhasználhatók egy megfelelő haptén kötésére, mely egy feltérképezéshez használható anyagot tartalmaz. Az ilyen megfelelő anyagok jól ismertek a tudomány e területén képzett szakember számára, de nem korlátozódnak a fémionokra. A CHA255 származású polipeptidekhez való előnyben részesített radioaktív fémionok azok, melyek komplexet képeznek az EDTA-val vagy az EDTA analógokkal, mint pl. a ⁴⁴⁴In, melyek gamma sugárzást bocsátanak ki és igy különösen jól használhatók a rádió-feltérképezésben. Ha egy antitesthez, egy antitest fragmenthez, vagy egy tumorral kapcsolatos antigénre specifikus polipeptidhez kapcsolódik, a kapott molekula (kétfunkciós antitest) úgy viselkedik, mint egy spcifikus szállító rendszer,a feltérképezéshez használható anyag célzott helyhez való szállításával. A célzott komplexeket Planáris Radiotérképezést Pozitron Emissziós Tomográfiát (PÉT), a magnetikus rezonanciához való feltérképezésre szolgáló NMR-t vagy Egyszerű Foton Emissziós Kiszámított Tomográfiá-t (SPECT) használva irtuk le.

Továbbá, a polipeptidek köthetnek egy megfelelő haptént is, mely tartalmazza a terápiás anyagot. Az ilyen előnyben részesített polipeptidek csoportja az a csoport, mely DOTÁ-hoz, vagy DOTA analógokhoz kötődik, melyek alfa vagy béta részecskéket sugározó izotópokat tartalmaznak. Ha a polipeptid egy második tumorral kapcsolatos antigénre specifikus antitesthez kötődik, a molekula (bifunkcionális antitest) úgy viselkedik mint egy szövetspecifikus szállító rendszer, mely a terápiás anyagot a célhelyhez szállítja.

Még spécifikusabban a találmány polipeptidjei fémkelát kötési affinitással rendelkezik. Az előnyben részesített polipeptidek igy azok, melyek specifikusak a keltátképző anyagokkal szemben, melyek könnyen kötnek olyan radioizotópokat vagy más fémionokat, melyek hasznosak diagnosztikai vagy terápiás szem28 pontból. Ezek az anyagok olyan kelátképző anyagokat foglalnak magukba, melyek kelátokat képeznek radioaktív fémionokkal

(195mPt,57Ni, 57Co,	105Ag,	67Mn,	52Fe,	inm,	113mIn,	99mTc,
68Ga,	67Ga, 169Yb,	57Co, 167Tm,	166Tm,	146Gd,	157Dy,	95mNbf
103Ru,	97Ru, 99Rh,	101mRh>	2 0 irji ~|	és 90	Y). A leginkább	előnyben

részesített polipeptidek azok, melyek olyan kelátképző anyagokkal szemben rendelkeznek affinitással, melyek komplexet képeznek az indium-111-gyel (¹⁴¹In), Technécium-99m-mel (^99mTc) , a réz-67-tel (⁶⁷Cu), a gallium-67-tel (⁸⁷Ga), és az ittrium-90-nel (⁹⁸Y). A ¹⁴¹indium(III) radioaktív fémiont és más gamma sugárzókat részesítünk általában előnyben a diagnosztikai alkalmazásoknál, mig a ittrium(III)-at és más alfa vagy báta sugárzókat általában a terápiás alkalmazásoknál részesítünk előnyben. Például, az EDTA és a benzil EDTA származékok könnyen képeznek komplexet a ¹¹¹In (III)-mai a kívánt diagnosztikai alkalmazásokhoz. A benzil EDTA és ennek analógjai, valamint ezek előállítási módszerei a 4,622,420-as számú US. Szabadalomban kerültek leírásra.

Továbbá, a találmány polipeptidjei intact antitestként vagy antitest fragmentként is biztosíthatók. Az antitest vagy antitest fragment megszerkeszthető a nativ antitesttel való kombinációkból, vagy más eltérő specifitásokkal rendelkező antitestekkel való kombinációkból. Például, a találmány polipeptidjei CDR-rel átültetett antitestként építhetők be, ahogy azt a későbbiekben leírjuk.

Azonkívül, a találmány polipeptidjei kiméra antitestek

megszerkesztéséhez is használatosak. Előnyösen a CHA255 mutált variábilis könnyű láncot (magába foglalja a Ll, L2, vagy L3-ban levő mutagenizált régiókat) egy humán antitest constans régióival kombináljuk; vagy a CHA255 mutált variábilis nehéz láncot (magába foglalja a Hl, a H2 vagy a H3-ban levő mutagenizált régiókat) kombináljuk egy humán antitest constans régióival. Egy XCHA-351.23-nak elnevezett hibridóma sejtvonalat, mely egy kiméra anti-indium antitestet hoz létre, az American Tyoe Culture Collection törzsgyüjteménynél (ATCC) deponáltuk 1992/11. 11-én a 11188-as katalógusszámon. Az ilyen kiméra antitestek kétfunkciósak lehetnek, ahogy azt az alábbiakban leírtuk.

Ahogy fent megjegyeztük, a találmány polipeptidjei kettős specifitásu kétfunkciós antitestek vagy antitest fragmentek megszerkesztésében használhatók fel. A bifunkciós antitest második specifitása rosszindulatú sejtek populációjával, egy tumorral, egy fertőző organizmussal vagy egy másik betegség állapottal kapcsolatos antigén ellen irányul. Lásd a 4,678,667 számú US Szabadalmat. A tumorral kapcsolatos antigénekre a következők a példák: a karcinoembrionális antigének (CEA), prosztata specifikus foszfatáz (PAP), prosztata specifikus antigén (PSA), ferritin, bombesin, melanómával kapcsolatos antigének p97, és gp40 és a hasonlók. Ezt a második specifitást egy az ezen találmány polipeptidjéhez kapcsolódó egység biztosítja. A kétfunkciós antitestek létrehozásának módszerei általában ismertek a tudomány e területén, például a következőkben kerültek leírásra:

- 30 4,678,667 számú US Szabadalom, Parham, J. Immunology 131, 2895 (1983); Lamoyi et al., J, Immunological Methods, 56, 235 (1983); Parham, id. , .53,133, (1982) és Matthew et al., id. , 50 239 (1982). Antitest félmolekulák szintén használhatók a második specifitás biztosítására. Lásd pl.az 1984 április 24-én közzétett 4,479,895 számú és a 4,444,878 számú US Szabadalmakat. A bifunkcionális antitesteket rekombináns módon is elő lehet állítani, pl a 4,474,893 számú US Szabadalom leirása szerint.

A binfunkcionális specifitás elérhető úgy is, hogy egy olyan hapténhez használunk egy antitestet , melynek egynél több kelát specifikus részlete van. Például a DB-I - DB-X és a DDB-I - DDBIII jelölésű haptének különösen előnyben részesített vegyületek, melyek egynél több kelát-specifikus részlettel rendelkeznek. A DB-I - DB-X és a DDB-I - DDB-III előállítására szolgáló módszerek részletesen az 1989 augusztus 8-án közzétett 0 327 365 számú Európai Szabadalmi Alkalmazásban kerültek leírásra. Ezek az előnyben részesített vegyületek egyedülálló súlyzó alakúak a (kelátképző) haptén egy második a származtatott haptén kelátképző részletéhez való csatlakozásának köszönhetően. Például a DB vegyület komplexálható a haptén (EDTA) végen egy hideg (nertiradioaktiv) indium (III) ionnal a megfelelő haptén biztosítása céljából az ezen találmányban használt anti-benzil EDTA-indium antitestek részére, ezt követően a származtatott hapténen levő második kelátképző egységet (pl DTPA, DOTA) terhelhető egy radiofeltérképezési (pl m

In(III)) fémnukliddel vagy egy rádió31 terápiás (pl. ^θΥ(ΙΙΙ)) fémnukliddel. Ugyanaz a haptén használható radiofeltérképezéses anyagként a tumor célbavevésére majd a feltérképezett tumor radioterápiás dózisaként. A találmány polipeptidjét tartalmazó bispeciíikus antitest az alkalmazás előtt terhelhető egy hapténnel vagy alkalmazható a haptén nélkül is az prelokalizáció biztosítása céljából, mely a jelölt haptén alkalmazása után egy bizonyos idővel elteltével következik be.

A találmányban való használathoz szelektált haptének általában egy fémion és egy kelátképző anyag kelát komplexeiből állnak. A találmány kelátképző anyaga az igénypontokban leirt etiléndiamintetraecetsav (EDTA) vegyületek haptén részleteiként szolgálnak. Az EDTA, az analógok előállításának módszerei és a találmány vegyületeinek kiindulási anyagai a 4,622,420as számú, 1986 november 11-én közzétett US Szabadalomban kerültek leírásra.

Továbbá, a származtatott haptének tartalmazhatnak más kelátképző anyagokat is, mint pl. a dietiléntriaminpentaecetsavat (DTPA), DOTÁ-t, HETÁ-t, TRITÁ-t, TETÁ-t és ezek analógjait. A DTPA és analógjainak előállítási módszerei a '420-as szabadalomban kerültek leírásra. A DOTA, HETA, TRITA, TETA és a találmányban hasznos megfelelő kiindulási anyagok előállításának módszereit részletesen a 4,678,667-es számú US Szabadalomban (1987 julius 7-én tették közzé) és a Moi et al., J. Am. Chem. Soc.

110:6266, 1988, írták le. A 4,622,420-as számú US Szabadalomban leirt EDTA és DTPA analógok képesek fiziológiásán stabil kelátoI

- 32 kát képezni egy sor fémionnal. Hasonlóképpen, a DOTA, HETA, TRITA és TETA analógok (a 4,678,667-es számú US Szabadalomban és Moi et al munkájában kerültek részletes leírásra) képesek fiziológiailag stabil kelátokat képezni egy sor fémionnal.

Továbbá, a találmány polipeptidjei CDR szekvenciák donoraiként vagy recipienseiként szolgálhatnak a megváltozott antitestekhez, ahogy azt a 0 239 400 (1987) számú Európai Szabadalom leírja. A peptidek pl. átültethetők az immunoglobulinok szupercsaládjának tagjaival. Ezek közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül a T-sejt receptorok, a CD4 és a CD8. Előnyösen a 3. ábrán felsorolt szelektált CDR szekvenciák donorszekvenciák, melyeket egy megfelelő humán antitestbe ültettünk át terápiás célokból, ahogy azt Winter supra leírja. Az ilyen antitestek szintén bifunkciójuvá tehetők, ahogy fent leírtuk.

A találmány továbbá biztosit egy olyan gyógyszerészeti összetételt, mely tartalmazza a fent leirt polipeptidek bármelyikét, egyedül vagy egymással kombinálva, valamint egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozót. A találmány szerinti használatban a gyógyszerészetileg elfogadható hordozó a standard gyógyszerészeti hordozók bármelyikét magába foglalja, pl egy foszfát puffereit sóoldatot, vizet, emulziókat, mint pl. egy olajos/vizes vagy vizes/olajos emulziót és számos nedvesítő anyagot. Ezek a gyógyszerészeti összetételek diagnosztikai vagy terápiás célokra használatosak. A polipeptid a gyógyszerészeti összetételben hatásos mennyiségben van jelen. A hatásos meny9 99 ,·· r’* .

«·· ··« • · ·

- 33 nyiségek megállapításának módszerei ismertek a tudomány e területén jártas szakember számára. Ezeket a gyógyszerészeti készítményeket az alanynak pl egy embernek a feltérképezéshez illetve a terápiához a kívánt hatást biztosító mennyiségben adjuk. Az ilyen dózisokat a tudomány e területén képzett szakember könnyen meghatározza. Az alkalmazás magába foglalja az erre való korlátozás nélkül az orális alkalmazást, az intravénás vagy a parenterális alkalmazást. Az adagolás megvalósítható folyamatosan vagy szakaszosan oly módon, hogy a terápiás anyag vagy a feltérképező anyag a betegben a tumorsejtek szaporodását hatékonyan meggátolja vagy lokalizálja a tumort.

A fent leirt polipeptideket kódoló nukleinsav szekvenciákat biztosítja ez a találmány. Ezeket a nukleotid szekvenciákat a tudomány e területén ismert módszerekkel határozzuk meg, ahogy azt az 1. Pédában leírjuk. Néhány megvalósulás nukleotid és aminosav szekvenciáját a 3A és 3B ábrában mutatjuk be a ... számú szekvenciákon túl.

A találmány magába foglal nukleinsavakat tartalmazó vektorokat is. A vektorokat egy megfelelő gazdasejt transzformálására használjuk. Azok a technikák, melyekkel ilyen vektorok előállithatók és melyekkel a megfelelő gazdasejtek transzformálhatok ismertek a tudomány e területén, lásd pl. Maniatis et al supra.

A találmány polipeptidjeinek előállítására használt megfele lő gazdasejtek a prokarióta mint pl. a bakteriális sejtvonalak, • · · « · ·« ·«· ···«··

- 34 vagy az eukarióta, mint pl az élesztőgomba vagy rovar vagy emlős sejtvonalak, előnyösen az emlős sejtvonalak.

A találmány biztosit egy rekombináns eljárást is a polipeptidek előállítására. Ez a módszer feltételezi a gazdasejt szaporítását, a fent leirt módon, olyan megfelelő körülmények között, melyek lehetővé teszik a polipeptid expresszálását és az előállított polipeptid izolálását, lásd Maniatis supra. Az ezen módszerrel előállított polipeptidek szintén a találmány részét képezik.

A következőkben leirt példák a találmány illusztrálását és nem korlátozását célozzák.

1. Példa

A CHA255 mutáns Fab' fragmentek megszerkesztése

1. A CHA255 variábilis régiók M13 könyvtár vektorba való klónozása

A könnyű és nehéz CHA255 natív variábilis régiókat először M13 könyvtár vektorokba klónozzuk a következők szerint. PoliA⁺ mRNS-t izolálunk a feltehetően CHA255-öt termelő hibridóma sejtekből MicroFast Track mRNS Izolációs Kit-et használva (Invitrogene Corporation, San Diego, CA). CHA255 első szál cDNS szintézist és PCR amplifikációt végezünk a gyártók leírásának megfelelően a következő primereket használva (A zárójelben levő restrikciós helyeket aláhúztuk a szekvenciában): lambda V_L egyenes (Ncol):

·· »

- 35 5'-GCCCAACCAGCCATGGCCCAGGCTGTTGTGACTCAGGA-3' (..számú szekvencia) lambda V_L reverz (Xbal):

5'-CCGCTTAACTCTAGACTAGGAACAGTCAGCACGGGAC-3' (..számú szekvencia) nehéz lánc V_L egyenes (Xhol):

5'-GAAGTGACGCTGCTCGAGTCTGGGGGAGACT-3' (.. számú szekvencia) nehéz V_L reverz (Spel):

5¹-TGTGTGAGTACTAGTACAACCACAATCCCTGGG-3 * (.. számú szekvencia)

A PCR amplifikáció után a CHA255 nehéz és könnyű láncú szekvenciákat nehéz és könnyű láncú vektorokhoz sorrendben az M13IX12-höz és az M13IX33-hoz ligáljuk (IXSYS, Inc., San Diego.CA) majd egy restrikciós vektoron restrikciós endonukleázzal, exonukleázzal való emésztéssel és a Huse, W.D. eljárásnak megfelelően (Combinatorial Antibody Expression Libraries in Filamentous Phage, Antibody Enqineerinq: A Practical Guide, C.A.K. Borrsbaeck, Ed., Wm. Freeman and Company, New York (1991), pp. 103-120) anneálással állítjuk össze. Röviden a vektor, melybe a nehéz láncot ligáljuk, tartalmaz egy M13 köpeny fehérje szekvenciát. A nehéz lánc transzlációja egy gVIII-variábilis nehéz láncú fúziós fehérjét eredményez. A nehéz és könnyű láncú vektor populációkat randomszerüen kombináljuk oly módon, hogy a könnyű és a nehéz láncú variábilis szekvenciákat tartalmazó vektor részek egy cirkuláris vektorrá kapcsolódnak össze, ahogy azt a Huse-féle WO 92/06204 számú Nemzetközi Közzététel leírja. A kombinált vektor irányítja a könnyű és nehéz lánc variábilis • J- .

·· · ··« · ♦·· • · · · · • · ··· ··· ···

- 36 szekvenciák koexpresszióját a polipeptidek M13 fág felszínen való összegyűjtése céljából. A magas titerü fág populáció haptén-kötő aktivitásra való válogatása kiszelektálja a kérdéses antitestet kódoló cDNS-akat. (Huse, Antibodv Engineerinq, supra, p.107-109). Ebben az esetben a CHA255 antitest funkcionális ¹¹¹InEOTUBE kötő kiónjait nitrocellulóz szűrő lift módszerrel azonosítjuk. A pozitív kiónból a CHA255 natív nehéz és könnyű láncú variábilis régió szekvenciákat egyszálu templáton 2-es tipusu Sequenase™mel különítjük el (United States Biochemical Co., Cleveland, OH) a gyártók leírásának megfelelően.

2. A mutagenizált könyvtárak előállítása

A CHA255 könnyű lánc három CDR régiójának aminosav szekvenciáját és a nehéz láncok három CDR szekvenciáját az 1. ábra mutatja. A nehéz láncok CDRl-ét és 3-át és a könnyű láncok CDR 2-jét és 3-át mutagenezisnek vetjük alá, melyet CHA255 Fab'haptén komplex Röntgen-sugárzásos kristályos szerkezetéből nyert információra alapozzuk. A CHA255 CDR 1 és 3 nehéz lánc 5 maradékát, a könnyű lánc CDR 2 5 vagy 7 maradékát és a CDR 3 könnyű lánc 6 vagy 9 maradékát speciálisan kódon alapú mutagenezisnek vetjük alá (lásd a 2. ábra aláhúzott maradékait). A mutagenizált könyvtár szkrinelésének elősegítése céljából a célzott CDR szekvenciákat először stop kódonnal és Miül (nehéz) vagy Hind III (könnyű) restrikciós hellyel helyettesítjük. Ezt a templátot ··*

- 37 használjuk ezután a kódon mutagenezishez a vad-tipusu nem mutagenizált CHA255 Fab' háttér kiküszöbölésére a nitrocellulóz szűrő lift vizsgálatban. Ez azért van, mert a Fab' részecskék a fág felszínén termelődnek, melyek Sup E E. coli szupresszor törzsekben szaporodnak. A CHA nehéz lánc CDR 1 és 3 és a CHA könnyű lánc CDR 2 és 3 templát előállításhoz használt oligonukleotidok a következők (a szekvenciák komplementerek a proteint kódoló régiókkal):

Nehéz lánc CDR 1 és 3 (stop/MluI hely aláhúzva)

5'-CTGGCGAACCCAACGCGTTTAACTTAAAGTGAA-3' (CDR 1) (.. számú szekvencia)

5'-CCCGTGGCCCCAACGCGTTTAACTTGCACAGAA-3' (CDR 3) (.. számú szekvencia) .

Könnyű lánc CDR 2 és 3 (stop/Hind III hely aláhúzva)

5'-AGGAACACCTGGAAGCTTTTAACCACCTATTAG-3' (CDR 2) (.. számú szekvencia)

5'-TCCACCGAATACAAGCTTTTATAGAGCACAGAA-3' (CDR 3) (.. számú szekvencia) .

Az összes oligo-irányitotta mutagenezises reakciót Kunkel, T.A. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, .82:488, 1985) módszerének megfelelően végezzük. A célzott CDR kódonokat először eltávolítjuk és egy Hind III hellyel és stop kódonnal helyettesítjük, az oligonukleotid irányította mutagenezissel Kunkel (lásd fent) leírásának megfelelően. A CDR-ek helyett stop/restrikciós hely szekvenciákkal rendelekző nehéz és könnyű lánc kiónokat egyszálu

Λ templát szekvenálásával azonosítjuk a 2-es verziójú Sequenase ™ (United States Biochemical Co., Cleveland, OH) segítségével, a gyártó leírásának megfelelően és templátként használva a kódon mutagenezishez. A kódon mutagenezis részletesen a WO 92/06204 számú Nemzetközi Közzétételben került leírásra.

A randomizált kódonokat tartalmazó mutagenikus oligonukleotidokat B-cianoetil foszforamidit kémiával szintetizáljuk a tudomány által ismert módon Milligen Cyclone Plus DNS szintetizálót (Milligen, Burlington, MA) használva egy kétoszlopos szintézises megközelítést alkalmazva. A kétoszlopos oligonukleotid szintézis a Huse-féle WO 92/06176 számú Nemzetközi Szabadalmi Közzétételben került leírásra. A kétoszlopos szintézises módszer a randomizált aminosavakat kódoló oligonukleotidek keverékét hozza létre, a cél régión belül, míg fenntart egy 50 %-os hajlamot a bármelyik pozícióban levő szülői szekvencia felé. A kapott mutagenikus könyvtár kiónokat szkrineljük a nehéz és könnyű lánc hozamra és az ¹¹¹ΙηΕΟΤυΒΕ kötésre.

3. Mutáns szekvcencia analízis

A mutagenizált CHA255 hipervariábilis régióinak DNS szekvencia meghatározását egy egyszálu templáton végezzük a 2-es verziójú Sequenase ™ (United States Biochemical, Cleveland, OH) és a Genesis 2000 szekvenáló reagens kit (DuPont Instruments, Wilmington, DE) segítségével a gyártók leírásának megfelelően,

Η» t·’· .

• · · • · · ·

- 39 majd Genesis 2000 Automata Szekvenálóval (DuPont Instruments, Wilmington, DE) analizáljuk.

4. A CHA255 Fab' expresszió szkrinelése

A nehéz és könnyű láncok expresszióját nitrocellulóz szűrők plakk lift vizsgálatával bizonyítjuk (pl. a WO 92/06204 Nemzetközi Szabadalmi Közzététel írja le). Röviden, a nitrocellulóz szűrőket 10 mM IPTG-vel megnedvesitjük és szárazra itatjuk. A szűrőket 50-300 plakkot tartalmazó lemezekre helyezzük és szobahőmőrsékleten 4 órán át inkubáljuk az antitest expressziójának indukálása céljából. A szűrőt óvatosan leemeljük a lemezekről blokkoló oldatban áztatjuk (29 mg/ml BSA, 3 Mg/ml sztreptavidin, 0.1 M NaHCC^, pH=8.6-0.02% NaN^) két órán keresztül és kecske anti-patkány lambda alkalikus foszfatáz konjugátummal hibridizáljuk (Fisher Scientific Co., Pittsburg, PA) a könnyű lánc detektálásához vagy anti dekapeptid alkalikus foszfatáz konjugátummal a nehéz lánc detektálásához.

A funkcionális haptén-kötő CHA255 kiónokat a H^1nEOTUBE telep szkrinelő vizsgálat adaptálásával azonosítjuk, ahogy azt a 3. példában leírjuk. Röviden, a jelölt kelátot úgy állítjuk elő, hogy 0.075 mM-os EOTUBE (Ν'-(2-hidroxietil)-p-tioureidobenzil EDTA) 10 μΐ mennyiségét inkubáljuk 50 μθί puffereit ¹¹¹Indium kloriddal fémmentes mikrocentrifuga csőben. A blokkolt szűrőket ^11:1InEOTUBE-bal (10 μΰί/ΞζύΓ0) inkubáljuk blokkoló oldatban 30 percig szobahőmorsékleten. A szűrőket háromszor mossuk 5 percig PBS-sel, majd megszáritjuk és egy éjszakán át Kodak X-omat AR autoradiográfiás filmet exponálunk vele -80 °C hőmérsékleten intenzifikáló képernyővel.

5. A CHA255 Fab' mutánsok ELISA vizsgálata

Antigént (50 μΐ 10 mM-os NaPO4-ben feloldott 500 ng BSAizotiocianátbenzil EDTA-indium antigén/üreg, (Phelps et al., J. Immunoi.145:1200-1204, 1990)) adszorbeálunk standard 96 üregű Fisher Titertec lemezekhez 37 °C hőmérsékleten egy éjszakán keresztül. Az üregeket egyszer H₂O-val, egyszer PBS-sel 0.1 % TWEEN-nel mossuk, majd a fág-fertőzött tenyészetek felüluszójának mintáival inkubáljuk vagy periplazmás készítménnyel 1-2 órán keresztül szobahőmorsékleten. A CHA255 Fab' könnyű láncot kecske anti-egér lambda alkalikus foszfatáz konjugátummal detektáljuk (Fisher Scientific Co., Pittsburg, PA), melyet 1/250 arányban hígítunk egyszeres PBS-sel, 3 %-os BSA-val 3 % kecske szérummal egy órán keresztül szobahőmorsékleten. Szinreagenst adunk hozzá a detektálás céljából megközelítően 15 perc elteltével, a szint leolvassuk Biotek EL310 Microplate Autoreader-rel (Biotek Instruments, Winooski, VT) 409 nm hullámhosszon.

6. A polipeptidek Scatchard analízise

Szabad Fab'-t expresszálunk és izolálunk a nem-szupresszor ,«* :··· λ ;··· ··« ··♦ * *·* *,.· ·♦·* ··· ·*·

- 41 ΜΚ30-3 törzs periplazmás üregéből a korábban leírtaknak megfelelően (WO 92/06204 számú Nemzetközi Szabadalmi Közzététel). A periplazmás készítmény antitest koncentrációját úgy határozzuk meg, hogy a mutáns telepek periplazmás mennyiségei által generált ELISA jeleket összehasonlítjuk egy standard görbével tisztított CHA255 Fab'-t használva. A Scatchard illesztéshez az adat pontokat úgy állítjuk elő, hogy a nyers periplazmás frakcióként egyszeres PBS-ben és 1 %-os BSA-ban hígított (100 μΐ, megközelítően 10 nM) antitestet egyszeres PBS-ben és jelzőként ^{4 4} 'InEOTUBE-bal jelölt 1 %-os BSA hapténben levő InEOTUBE hideg hígításaival (2.43 nM - 0.082 nM) inkubáljuk 2 órán keresztül. Ezt a vizsgálatot részletesebben a lentebbi 3. példában írjuk le. A mintát 6.000 rpm fordulatszámon 10 percig centrifugáljuk Amicon Centrifree™ mikrokoncentrátorban (Amicon, Grace Co. , Danvers, MA), 10.000 MW megszakításokkal a hapténhoz kötött Fab'-tői való szabad haptének szeparálása céljából. A teljes és a szabad számokat meghatározzuk és a kötött haptén szabad hapténhez viszonyított aránya pontjainak görbéjét a kötött haptén koncentrációjával szembeállítva kiszámítjuk az affinitás konstanst (Ka) .

A mutagenizált nehéz lánc CDR1 és CDR3 könyvtárakban a detektált ⁴⁴⁴InEOTUBE kötő kiónok gyakorisága megközelítően 12/1000 plakk/szkrinelt lemez. A mutagenizált könnyű lánc CDR2 és 3 könyvtárban a detektált ¹¹ 'InEOTUBE kötő kiónok gyakorisága megközelítően 25/2000 szkrinelt plakk/lemez.

«·«* • V 9 Λ 9 «· «·* *·· ··«

- 42 A könnyen azonosítható jelekkel rendelkező pozitív plakkokat izoláljuk és tisztítjuk egy második szkrinelés során majd a szekvencia adatokat megerősítjük a második sorozatból származó legalább két klón szekvenálásával.

2. Példa

A CYI001 Mutáns CDR átültetett Fab' fragmentek megszerkesztése

1. A CYI001 variábilis régiók pBluescript vektorokba való klónozása

A CYI001 antitestet termelő hibridóma sejtvonalat a Budapesti Szerződés Szabadalmi Eljárások Céljára Szolgáló Nemzetközi Mikroorganizmus Letétre vonatkozó előírásainak megfelelően deponáltuk 1992 november 11-én a 11187 katalógusszámon az American Type Culture Collection törzsgyüjteménynél, 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland U.S.A. 20852. A könnyű és nehéz CYI001 natív variábilis régiókat először a következők szerint pBluescript vektorokba klónozzuk. A PoliA⁺ mRNS-t izoláljuk a CYIOOl-et expresszáló hibridóma sejtekből egy MicroFast Track mRNS Izolálása Kitet használva (Invitrogene Corporation, San Diego, CA) a gyártók útmutatásának megfelelően. A CYI001 nehéz és könnyű lánc variábilis régiók első szál cDNS szintézisét és a PCR amplifikációt a korábban leírtak szerint végezzük el, a következő primer « ··»· ·· · * ···

4« «·*/·

szekvenciákat használva (a zárójelben levő restrikciós helyeket a szekvenciákban aláhúzással jelöltük):

nehéz lánc V_L egyenes (Hind III):

5'-GCCCAACCAGAAGCTTGATGTGCATCTTCAGGAGTCGGGACCT-3' (.. számú szekvencia) nehéz lánc V_L reverz (Bam Hl):

5¹-CCGCTTAACGGATCCTGGATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC-3' (.. számú szekvencia) lambda V_L egyenes (Hind III):

5'-GAAGTGACGCTGAAGCTTCAGGCTGTTGTGACTCAG-3' (.. számú szekvencia) lambda-A V_L reverz (Bam Hl):

TG

5'-TGTGTGAGTGGATCCGAC ( )TTGGTACT ( ) CCGAA -3'

CA

(.. számú szekvencia) lambda-B reverz (BamHI):

TG

5'-TGTGTGAGTGGATCCCAG ( )TTGGTTCC ( )CCGAA-3'

CA

(.. számú szekvencia)

A PCR reakcióban mindkét lambda V_L reverz primer azonos mennyiségét arra használjuk, hogy biztosítsuk a kérdéses lambda V régió amplifikációját.

A PCR amplifikáció után a nehéz és könnyű láncú szekvenciákat pBluescript KS(-) vektorokba (Stratagene, San Diego, CA) « ·

- 44 ligáljuk. Az IM-9 klónozott nehéz és könnyű láncú szekvenciák DNS szekvencia meghatározását a plazmidokon végezzük 2-es verziójú Sequenaset (United States Biochemical, Cleveland, OH) és Genesis 2000 szekvenáló reagens kitet (DuPont Instruments, Wilmington, DE) használva a gyártók leírásának megfelelően, majd Genesis 2000 Automated Sequencert (DuPont Instruments, Wilmington, DE) használunk az analizáláshoz.

2. A Humán IM-9 könnyű láncú gén (V_KC_K) és a nehéz láncú gén fragment (V_HC_T1) M13 könyvtár vektorokba való klónozása

A könnyű IM-9 natív gén és a nehéz IM-9 natív gén fragmentet (V_HC_T1) valamint az összekötő régió első 7 aminosavát először a következők szerint az M13 könyvtár vektorokba klónozzuk. A PoliA⁺ mRNS-t az IM-9 limfoblasztoid sejteket használva izoláljuk MicroFast Track mRNS Izolációs Kitet használva (Invitrogene Corporation, San Diego, CA) a gyártók útmutatásának megfelelően. Az IM-9 nehéz és könnyű láncú gén régiók első szál cDNS szintézisét és PCR amplifikációját a korábbiakban leírtak szerint végezzük el a következő primereket használva (a zárójelben levő restrikciós helyeket a szekvenciában aláhúzással jelöltük): Kappa egyenes (Ncol):

5¹-GCCCAACCAGCCATGGATGGACATGAGGGTCCCC-3' (.. számú szekvencia)

Kappa reverz (Xbal):

5'-CCGCTTAACTCTAGACTAAGACTCTGGCCTGTT-3' (.. számú szekvencia) nehéz lánc egyenes (Xhol):

5'-GAAGTGACGCTGCTCGAGATGGAGTTGGGACTGAGC-3' (.. számú szekvencia) nehéz lánc reverz (Spel):

5'-TGTGTGAGTACTAGTTTAGTCACAAGATTTGGGCTC-3' (.. számú szekvencia).

A PCR amplifikáció után az IN-9 nehéz és könnyű láncú szekvenciákat sorrendben a nehéz és könnyű láncú vektorokba, az M13IX12-be és az M13IX33-ba ligáljuk (IXSYS, Inc. San Diego, CA) majd anneálással egy expressziós vektoron kombináljuk őket Huse W.D. eljárásának megfelelően (Combinatorial Antibody Expression Libraries in Filamentous Phage, Antibody Enqineerinq: A Practical Guide, C.A.K.Borrsbaek, Ed., Wm. Freeman and Company, New York, 1991, pp.103-120). Röviden, az a vektor, melybe a nehéz láncot ligáltuk, tartalmaz egy Ml3 köpeny fehérje szekvenciát. A nehéz lánc transzlációja gVIII-variábilis nehéz láncú fúziós fehérjéket hoz létre. Ezután a nehéz és a könnyű láncú vektor populációkat randomszerüen kombináljuk oly módon, hogy a vektor nehéz és könnyű láncú szekvenciáit tartalmazó részei egy egyszerű cirkuláris vektorrá kapcsolódjanak össze, ahogy az a WO 92/06204 számú Nemzetközi Közzétételben leírásra kerül. A kombinált vektor irányítja a könnyű és nehéz láncú szekvenciák koexpresszióját a polipeptidek összegyűjtése céljából az M13 fág felszínén. A pozitív klónokból származó IM-9 natív nehéz és könnyű láncú szekvenciákat egy egyszálu templáton vizsgáljuk 2-es verziójú Sequenase-zal (United States Biochemical Co., Cleveland, OH) a gyártók leírásának megfelelően.

3. A CYI001/IM-9 hibrid expressziós vektorok CDR átültetése

A bizonyítottan IM-9 könnyű és nehéz láncú protein szekvenciákat és a CYI001 könnyű és nehéz láncokat felhasználva a komplementaritást meghatározó régiókat (CDR-ek) a Kábát et al. által (1987, Seq. of Proteins of Immunoi. Interest, NIH, Bethesda, MD) és a Wu és Kábát által (J.Exp.Med.132:211-250. 1970) leirt módszerrel határozzuk meg. Az IM-9 V régiókban levő CDR-eket a CYI001 megfelelő régióival helyettesítjük. A szekvencia egyszerű helyettesítése során a meghatározott CDR-ek nem tűnnek megfelelőnek a specifitás és az affinitás megtartásához. Az antitest Röntgen sugárzásos kristályos szerkezetének analízise azt mutatja, hogy a szekvencia-meghatározott CDR-ek nem szükségeszerüen felelnek meg az antigén kötő helyeknek. Következésképpen, a szekvencia-meghatározott CDR-ek csupán egy régiója helyettesíthető és néhány szekvencia meghatározott keret maradék vihető át (Verhoeven, M et al., Scinece, 239:1534-1536. 1988; Jones et al., Natúré 321:522-524. 1986; Riechmamm et al., Natúré 332:323-327. 1988; Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-33, 1989) .

A modellezés során nyert protein szekvenciát használva egy nukleinsav szekvenciát származtatunk egy számitógépes software programot, a MAPSEQ-et, használva, mely beszerezhető a kereskedelemben a DNAStar-tól (Madison, WI). Ezt a nukleotid szekvenciát átfedő oligonukleotid szekvenciákra osztjuk fel, melyeket ezután szintetizáljuk és templátként használjuk a polimeráz lánc reakcióhoz az IM-9 kereteket és a CYI001 CDR régiókat tartalmazó hibrid V régiók szintetizálásához. A V régiókat ezután az IM-9 expressziós vektorokba inzertáljuk egy kettős átfedésü PCR-t használva (5,023,171 számú US Szabadalom).

4. A mutagenizált könyvtárak előállítása

A CYI001 könnyű láncú 3 CDR régiójának és a nehéz láncok 3 CDR régiójának aminosav szekvenciáját a fentiek szerint határozzuk meg. A krisztallográfiás adatok hiányában a CDR régiókat a Kábát által meghatározott szekvenciákkal analóg módon határozzuk meg a fentiek szerint. Az egyes láncok 3 CDR-jét egyesével irtuk le, ahogy az a későbbiekben látható. A CDR-ek 5 maradékát kódon mutagenezisnek vetjük alá.

A mutagenizált könyvtár szkrinelésének elősegítésére a célzott CDR szekvenciákat először stop kódonnal és Mlu I (Nehéz) vagy Hind III-mal (könnyű) restrikciós helyekkel helyettesítjük. Ezt a templátot használjuk fel ezután a kódon mutagenezishez a vad tipusu nem mutagenizált CDR átültetett CYI001/IM-9 Fab' háttér eltávolítására a nitrocellulóz szűrő lift vizsgálatban. Ez azért szükséges, mert a Fab' részecskék olyan fág felszínén termelődnek, mely Sup Ε E. coli szuppresszor törzsekben szaporodik. A CYI001/IM-9 nehéz és könnyű láncok CDR templátjaihoz használt oligonukleotidok előállítása analóg a CHA esetében leírtakkal.

Az összes oligo irányította mutagenezises reakciót Kunkel

T.A. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488, 1985) szerint végezzük el. A célzott CDR kódonokat először eltávolítjuk és egy Hind III hellyel és stop kódonnal helyettesítjük oligonukleotid irányította mutagenezissel, Kunkel (lásd fent) leírásának megfelelően. A stop/restrikciós hely szekvenciákkal helyettesített CDR-ekkel rendelkező nehéz és könnyű láncú kiónokat egyszálu templát szekvenálással azonosítjuk 2-es verziójú Sequenase-t (United States Biochemical Co., Cleveland, OH) használva a gyártók leírásának megfelelően, majd a kódon mutagenezishez templáként használjuk ezeket. A kódon mutagenezis részletesen a WO 92/06204 számú Nemzetközi Szabadalmi Közzétételben került leírásra.

A randomizált kódonokkal rendelkező mutagenikus oligonukleotidokat B-cianoetil foszforamidit kémiával szintetizáljuk a tudomány számára ismert módon, Milligen Cyclone Plus DNS szintetizálót (Milligen, Burlington, MA) használva , kétoszlopos szintézises megközelítéssel. A kétoszlopos oligonukleotid szintézis a Huse féle WO 92/06176 számú Nemzetközi Szabadalmi közzétételben került leírásra. A kétoszlopos szintézises módszer randomizált aminosavakat kódoló oligonukleotidok keverékét hozza létre a célzott régión belül, mialatt megtartja bármelyik pozíciójában a szülői szekvenciák iránti 50 %-os hajlamot.

A kapott mutagenikus könyvtár kiónokat szkrineljük a nehéz és a könnyű lánc termelésre és az ⁹θΥ-ΝΒϋΟΤΑ kötésre.

5. A CDR átültetett CYI/IM-9 Fab' expresszió szkrinelése

A nehéz és a könnyű láncok expresszióját nitrocellulóz szűrők plakk lift vizsgálatával (pl. a WO 92/06204-es számú Nemzetközi Szabadalmi Közzététel írja le részletese) erősítjük meg. Röviden, a nitrocellulóz szűrőket 10 mM IPTG-vel nedvesítjük meg, majd szárazra itatjuk. Ezután a szűrőket 50-300 plakkot tartalmazó lemezekre helyezzük és 4 órán keresztül szobahőmőrsékleten inkubáljuk az antitest expresszálásának indukálása céljából. A szűrőket óvatosan leemeljük a lemezekről két órán keresztül blokkoló oldatban áztatjuk majd kecske anti-patkány lambda alkalikus foszfatáz konjugátummal (Fisher Scientific Co., Pittsburg, PA) hibridizáltatjuk a könnyű láncok detektálása céljából vagy anti dekapeptid alkalikus foszfatáz konjugátummal a nehéz láncok detektálása céljából.

A funkcionális haptén kötő CDR átültetésü CYI001/IM-9 kiónokat az ⁴⁴⁴InEOTUBE telep szkrinelő módszer egy adaptációjával azonosítjuk, ahogy azt a 3. példában leírtuk. Röviden, a jelölt kelátot úgy állítjuk elő, hogy a 0.5 μΜ NBDOTA 10 μΐ mennyiségét 0.01 N HCl-ban levő θθΥ klorid 5 0 μ<2± mennyiségével inkubáljuk fémmentes centrifuga csőben. A blokkolt szűrőket ezután 5 %-os BLOTTO-ban (Sambrook et al írják le) levő ^®Y NBDOTA-val (3 μCi/ szűrő) inkubáljuk 30 percen keresztül szobahőmőrsékleten. A szűrőket ezután háromszor mossuk 5 percig PBS-sel majd megszáritjuk és két órára Kodak X-omat AR autoradiográfiás filmre helyezzük -80 °C hőmérsékleten intenzifikáló szűrőt alkalmazva. A könnyen azonosítható jelekkel rendelkező pozitív plakkokat

- 50 izoláljuk, és másodlagos szkrineléssel tisztítjuk, a szekvencia adatokat a második sorozatból származó legalább két klón szekvenálásával erősítjük meg.

6. Mutáns szekvencia analízis

A mutagenizált CYI001/IM-9 CDR átültetett hipervariábilis régióinak DNS szekvencia meghatározását egy egyszálu templáton végezzük a 2-es verziójú Sequenase ™ (United States Biochemical, Cleveland, OH) és a Genesis 2000 szekvenáló reagens kit (DuPont Instruments, Wilmington, DE) segítségével a gyártók leírásának megfelelően, majd Genesis 2000 Automata Szekvenálóval (DuPont Instruments, Wilmington, DE) analizáljuk.

7. A CYI001/IM-9 Fab' mutánsok ELISA vizsgálata

Üregenként 50 μΐ 10 mM-os NaPO4-ben feloldott antigént (500 ng BSA-izotiocianobenzil DOTA-Yttrium) adszorbeálunk standard 96 üregü Fisher Titertek lemezekhez 37 °C hőmérsékleten egy éjszakán keresztül. Az üregeket egyszer H2Ű-val, egyszer PBS-sel 0.1 % TWEEN-nel mossuk, majd a fág-fertőzött tenyészetek felüluszójának mintáival vagy periplazmás készítménnyel inkubáljuk 1-2 órán keresztül szobahőmőrsékleten. A CDR átültetett CYI001/IM-9 Fab' könnyű láncot kecske anti-egér lambda alkalikus foszfatáz konjugátummal detektáljuk (Fisher Scientific Co., Pittsburg, PA),

- 51 melyet 1/250 arányban hígítunk egyszeres PBS-sel, 3 %-os BSA-val 3 %-os kecske szérummal egy órán keresztül szobahőmorsékleten. Szinreagenst adunk hozzá a detektálás céljából megközelítően 15 perc elteltével, a szint leolvassuk Biotek EL310 Microplate Autoreader-rel (Biotek Instruments, Winooski, VT) 409 nm hullámhosszon .

8. A polipeptidek Scatchard analízise

Szabad Fab'-t expresszálunk és izolálunk a nem-szupresszor

MK30-3 törzs periplazmás üregéből a korábban leírtaknak megfelelően (WO 92/06204 számú Nemzetközi Szabadalmi Közzététel). A periplazmás készítmény antitest koncentrációját úgy határozzuk meg, hogy a mutáns telepek periplazmájának azonos mennyiségei által generált ELISA jeleket összehasonlítjuk egy standard görbével tisztított CDR átültetett CYI/IM-9 Fab'-t használva. A Scatchard illesztéshez az adat pontokat úgy állítjuk elő, hogy a nyers periplazmás frakcióként egyszeres PBS-ben és 1 %-os BSA-ban hígított (100 μΐ, megközelítően 10 nM) antitestet egyszeres PBS-ben és jelzőként ^θΥ (2.43 nM - 4.85 μΜ) NBDOTA-val jelölt 1 %-os BSA hapténben levő Y Nitrobenzil DOTA hideg higitásaival inkubáljuk 2 órán keresztül. Ezt a vizsgálatot részletesebben a lentebbi 3. példában írjuk le. A mintát 6.000 rpm fordulatszámon 10 percig centrifugáljuk Amicon Centrifree™ mikrokoncentrátorban (Amicon, Grace Co., Danvers, MA), 10.000 MW megszakítással a • · ·

- 52 hapténhoz kötött Fab'-tői való szabad haptének szeparálása céljából. A teljes és a szabad számokat meghatározzuk és a kötött haptén szabad hapténhez viszonyított aránya pontjainak görbéjét a kötött haptén koncentrációjával szembeállítva kiszámítottuk az affinitás konstanst (Ka).

3. Példa

Az EOTUBE szintézise és az EOTUBE vizsgálatokban való alkalmazása

Az EOTUBE indium (III) komplexét az itt leirt mennyiségi és minőségi vizsgálatokban alkalmazzuk. Az EOTUBE a p-(aminobenzil) EDTA egy származéka. Az EOTUBE szintézise és a standard Scatchard analízisben való alkalmazása az alábbiakban kerül leírásra.

Részletesen, az EOTUBE egy olyan EDTA, melyet az egyik belső etilén szén atomjában (S stereokémia a helyettesített szén atomnál) a benzil szénatomon keresztül egy N-(2-hidroxietil)-Ν'(p-benzil) tio-urea egységgel helyettesítjük. Az EOTUBE szintézisét alapjában véve fémionok kizárásával végezzük el. (Például az összes üvegárut 6 M-os HCl-lel mossuk és csupán ionmentes vizet használunk.) (S)-p-nitrobenzil EDTA-t állítunk elő, majd (S)-4-izotiocianatobenzil EDTA-vá alakítjuk (a továbbiakban ITCBE-ként rövidítjük) ahogy az a 4,622,420 számú US Szabadalomban, Meares, C.F., Anal. Biochem. 142:68-75.(1984) munkájában leírásra került.

A liofilezett ITCBE-t reszuszpendáljuk 0.3 M HCl-ben (Ultrex, J.T. Baker, Phillipsburg, N.J.) megközelítően 50 mM végkoncentráció eléréséig. Ezt az oldatot -70 °C hőmérsékleten tároljuk. Hacsak másként nem jelezzük, az összes reakciót vizes oldatban végezzük 40 °C hőmérsékleten.

mM-os ITCBE 2.5 ml mennyiségét adjuk 200 mM etanolamin 1.35 ml mennyiségéhez, majd a pH értéket 11.0 állítjuk 10 N-os NaOH-val. A térfogatot 5 ml mennyiségre igazítjuk vízzel majd a reakciót 15 percig hagyjuk végbe menni, mely idő alatt HPLC analízist végzünk. Az összes ITCBE-t átalakítjuk EOTUBE-á, a retenciós idő 3.6 perc a HPLC-n (C18-as oszlop, 50 mM trietilammonium acetát vizes pufferének lineáris grádiensével eluáljuk tiszta metanolig Hewlett-Packard 1090 készülék).

A terméket anioncserés kromatográfiával tisztítjuk egy 11 ml-es DEAE Sephadex Α-25-os oszlopot használva, melyet 0.1 - 1 M ammonium formát 110 ml grádiensével eluálunk . A pH érték 6.0. (Az oszlopot 280 nm hullámhosszon vizsgáljuk.) A terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és liofilezzük. A termék abszorpciós maximuma 246 nm hullámhossz értéknél van, az extinkciós koefficiens 18000.

A szerkezetet szén 13 NM spektroszkópiával tisztítjuk. (Variant Instrumants Model X-300 Mhz készüléket használunk. A mintát deutériummal dúsított vizben futtatjuk.) Az ITCBE-ben levő izotiocianát egység szén atomjának megfelelő csúcs 139 ppm-nél van és ezt az EOTUBE esetében a 182 ppm-nél levő csúcs helyette4 · · * · · • · ···« ♦ * 4 • ··· · · · · • · »·· · · · · 4 «

- 54 siti. Ez a csúcs a tiourea kötésben levő szén atomnak felel meg. Az ITCBE spektrumának aromás régiója (128-138 ppm) 4 csúcsot mutat, mig az EOTUBE hármat. Az alifás régióban az ITCBE-ben és az EOTUBE-ban közös 5 csúcs van, és van még két további csúcs a 64 és 49 ppm-nél az EOTUBE spektrumban. Ezen utóbbi csúcsok megfelelnek sorrendben a hidroxil és tio-urea egységekkel szomszédos szén atomoknak.

1. Az EOTUBE radiojelölése

9.9540xl0^-7 mmol EOTUBE-ot jelölünk 600 μθί ¹⁴¹In-nel. A következőket adjuk a fémmentes csőhöz bármilyen más fém hozzáadása nélkül:

a. 63 μΐ 0.0158 mM fémmentes EOTUBE

b. 63 μΐ 0.26M fémmentes ammóniumcitrát, pH=6.0 és

c. 600 μθί ⁴¹¹In (1.30xl0^-9 mmol).

Az elegyet egy éjszakán át inkubáljuk szobahőmőrsékleten. Ezután elegendő hideg indiumot adunk hozzá, hogy az indium (mind ⁴⁴⁴In és alap állapotú Indium) EOTUBE moláris aránya 1.05 legyen. Ehhez a csőhöz 0.012 mM alapállapotu InCl₃ (1.044x10^_8 mmol) 10.2 μΐ mennyiségét adjuk. Ezt 4 órán keresztül inkubáljuk szobahőmőrsékleten. Vékonyréteg Kromatográfiás analízist végzünk (TLC) az indium beépülésének tesztelésére. A jelölt minta 0.5 μΐ mennyiségeit helyeztük kettős sorokban 1 cm-re a 10.5 inch hosszúságú szilikagél lemezek aljától, mely 0.25 inch sávokra osztott a futtatás útvonalában.

A minták, foltjait hagyjuk megszáradni. A lemezt egy TLC tartályba helyezzük, melyben 10 %-os ammónium acetát:metanol (1:1) oldat rendszer van és a 9 cm-es jelölésig hagyjuk futni. Ezután a lemezt kivesszük az oldatból és megszáritjuk. A futási vonalak mindegyikét 3 szekcióra vágjuk:

1) az eredeti szekció a lemez aljától a 2 cm-es jelölésig tart

2) a 2 - 3.5 cm-ig tartó középső szekció

3) a 3.5 cm-es jelöléstől a tetejéig tart a farok rész

Az egyes szekciókat mindkét sáv esetében megszámoltuk.

Az egyes sávok farokrészeinek százaléka megegyezett a kelátokhoz épült indium százalékával. Ha az indium 90 %-nál nagyobb arányban épült be az EOTUBE-ot 4.40 pg/μΐ koncentrációra hígítjuk PBS-ben (pH=7.5) a vizsgálatban való alkalmazáshoz.

2. A hideg kompetitorok előkészítése

5.530xl0^-4 mmol EOTUBE-ot terheltünk 1.02x InCl₃ moláris arányával az EOTUBE-hoz viszonyítva. Bármilyen szennyező fém hozzáadása nélkül a következőket adjuk a fémmentes csőhöz:

a. 70 μΐ 7.9 mM fémmentes EOTUBE-ot (5.530xl0^-4 mmol)

b. 70 μΐ 0.26 M fémmentes ammónium citrátot, pH=6.0 és

c. 55.3 μΐ 10.2 mM alap állapotú InCl₃-at (5.641X10^-4 mmol) • · · • .ι ;·· « · ·· • · · » · · · · ·

- 56 A keveréket 4 órán keresztül inkubáljuk szobahőmőrsékleten. Ezután a keveréket 1 ml 0.40 ng/μΐ és 0.36 ng/μΐ koncentrációra hígítjuk PBS-sel (pH=7.5) az antitest szenzitivitási görbéhez való felhasználáshoz.

3. Antitest szenzitivitási görbe

A következőket adjuk egy 96 üregü mikrotiter lemezhez három ismétlésben:

a. 25 μΐ EOTUBE--^L11In-alapállapotu 4.4 pg/Ml-ben

b. 25 μΐ antitest hígítás (CHA255 vagy származéka)- vagy 20 Mg/ml, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.623, 0.313, 0.156, 0.080, 0.040, 0.020, vagy 0 Mg/ml

c. 50 μΐ RPMI 10 % lószérummal

d. 20 μΐ szefaróz gyöngyökhöz kapcsolódó birka anti-egér IgG (March.S.C., Parikh, I. és Cuatrecacas, P. Analvt.

Biochem. 60:149, 1974) olyan koncentrációra hígítva, hogy 20 μΐ kötődjön 0.5 Mg Ab-hez.

A lemezeket rázógépen inkubáljuk egy éjszakán át szobahőmérsékleten. Az üregek tartalmát üvegszálas szűrőpapírra párologtatjuk el, kivágjuk és megszámoljuk. Az antitest higitási számot a frakció kötéssel szembe állítjuk és grafikont készítünk annak megállapítása céljából, hogy a hígítás hol azonos a maximális kötés 90 %-ával. Ezt az értéket használjuk a Scatchard vizsgálathoz.

*

4. A Scatchard vizsgálat

A következőket adjuk egy 96 üregü mikrotiter lemezhez három ismétlésben:

a. 25 μΐ EOTUBE-min-alapállapotban 4.40 pg/μΐ

b. 25 μΐ 0.40 ng/μΐ és 0.36 ng/μΐ sorozatos hígításban levő alapállapotu EOTUBE-ot. 11 hígítás plus egy nulla 24 pontot ad a 10 ng/üreg - 4.40 pg/üreg intervallumban plus egy nulla. 10 % lószérumot tartalmazó RPMI-vel hígítjuk.

c. 25 μΐ 10 % lószérumot tartalmazó RPMI

d. 25 μΐ a kérdéses antitestből

e. 20 μΐ birka anti-egér IgG-t, mely szepharóz gyöngyökhöz kapcsolódik (ugyanaz, mint amit a szenzitivitási vizsgálatban használunk).

A lemezt egy éjszakán át rázógépen inkubáljuk. Az üregek tartalmát üvegszálas szűrőpapírra párologtatjuk, kivágjuk és megszámoljuk. A moláris kötéseket versus kötés/szabad grafikonon ábrázoljuk. A görbe azon részének lineáris regresszióját ahol a görbe egyenes vonal meghatározzuk. A Ka a meredekség negatív értéke.

4. Példa

A bifunkcionális ECHO37.2 antitest előállítása • « *

A bifunkcionális ECHO37.2 antitestet úgy állítjuk elő, hogy a CHA255 monoklonális antitestet expresszáló hibridóma sejtvonal (lásd a 0 327 365-ös számú 1989 aug. 9-én közzétett Európai Szabadalmi Publikációt) és egy CEM231.6.7 jelölésű, a karcinoembrionális antigénnel (CEA) szemben specifitást mutató antitesttel rendelkező hibridóma sejtvonal biológiai fúziójával egy tetradomát hozunk létre. A CEM 231.6.7 hibridóma sejtvonalat az American Type Culture Collection törzsgyüjteménynél deponálták a Budapesti Szerződésnek megfelelően (1988 január 7 az ATCC katalógusszám HB 9620). így a létrehozott bifunkcionális antitest rendelkezik mind az indium benzil EDTA és a CEA elleni specifitással. Az ECHO37.2 jelölésű bifunkcionális antitestet expresszáló tetradomát a CHA255 és a CEM231.6.7 hibridóma sejtvonalak biológiai fúziójával hozzuk létre Burnett, K.G. et al. leírásának megfelelően ( Biotechnology:Applications and Research, pp.401-409, eds. Cheremisinoff and Ouellette, Technomic Publishing Company, Pennsylvania, 1985). Az ECHO37.2-öt a tenyészfolyadékból egy kétlépéses folyamattal tisztítjuk. Az IgG molekulákat először a tenyész tápközeg más alkotórészeiből izoláljuk DEAEcellulózon való kromatográfiáfiával, Parham et al leírásának megfelelően (Parham et al., J. Immunoi. Meth. 53:133, 1982), melyet egy HPLC-vel való tisztítás követ hidroxilapatiton (BioRad Laboratories, Richmond, Ca). Az ECHO37.2 bifunkcionális antitestet egy 10 mM - 160 mM nátrium foszfát grádienssel eluáljuk (pH=6.8). Mindkét puffer tartalmaz 10 mM Ca²⁺-ot az oszlop ♦· 9·*· ί·♦♦· • I ··· _ »*««««> **' • · · · ·· «« 4 ·4 ···· * ·

- 59 degradációjának kivédése céljából. Az ECHO37.2 bifunkciós antitestet, valamint az antitest azon képességét, hogy képes-e kötni mind az indiumbenzil-EDTA kelátokat és a CEA-t protein sávok mintája alapján határozzuk meg, melyeket 7.5 %-os akrilamid gélen (SDS) való elektroforézissel hozunk létre.

1. Haptén kapacitás vizsgálat

Annak meghatározása céljából, hogy az antitest képes-e kötni az indiumbenzil-EDTA-t, az antitestet és az (S)-4-p-nitrobenzil EDTA In(III) kelátját összevegyitjük 1.5 mg/ml normál szérum albumint tartalmazó PBS-ben (10 mM nátrium foszfát, 150 mM NaCl, pH=7.5). Az antitest koncentráció 0.15 mg/ml és az Indium (S)-4-p-nitrobenzil EDTA koncentráció 3 μΜ. A kelátot ¹¹¹Indiummal radiojelölj ük (0.5 - 3.0 MCi/nmol specifikus aktivitás). Öt percig szobahőmőrsékleten való inkubálás után a keverék 400 μΐ mennyiségeinek duplikátjait szeparáló Centrifree™ ultraszürő készülékbe helyezzük, (NMW megszakitás=30.000, az Amicon, Danvers, MA szerezhető be). Ezeket 1500 g-n centrifugáltuk 10 percig. Az 50 μΐ duplikát Centrifree mintákat megszámoljuk és átlagoljuk. Ezt az éréket hívjuk TC értéknek. Az 50 μΐ duplikát Centrifree filtrátumokat megszámoljuk és átlagoljuk. Ezt az értéket hívjuk F értéknek. Az elméleti kapacitás százalékát a következő egyenletből számítjuk ki:

(1 - F/TC) x M az M értékét 150, 100, 200 vagy 300 határoztuk meg sorrendben az intakt antitest (CHA255), a Fab' fragment, a F(ab)'₂ bifunkcionális antitest és az intakt bifunkcionális antitest (ECHO37.2) esetében.

Az antitest azon képességének vizsgálatához, hogy képes-e kötni a CEA-t egy immunoreaktivitási vizsgálatot tervezünk, a CEA-t kötő radiojelölt anti-CEA antitest készítmény arányának meghatározásához. Ezt az értéket egy kéttős immunovizsgálattal határozzuk meg, melyben először polisztirén gyöngyökhöz kötődő szilárd fázisú CEA-t, majd a CEA-val reaktív második antitestet alkalmazunk, ahogy az a 4,376,110 számú US szabadalomban leírásra került. Az antigén pozitív és negatív gyöngyöket úgy állítjuk elő, hogy a CEA gyöngyöket (a kereskedelemben beszerezhető TANDEM-R CEA teszt kitből (Hybridtech Incorporated, San Diego, CA)) magas CEA és nulla kalibrátorral inkubáljuk. Ezután a nem kötött CEA antigént kimossuk a gyöngyökből és megközelítően 1 ng 10 MCi/pg specifikus aktivitású 125j-d_ai radiojelölt antitestet adunk hozzá. A százalékos immunoreaktivitást úgy számítjuk ki, hogy megállapítjuk az antigén jelenlétében a gyöngyökhöz kötődő számok százalékát. A nem-specifikus kötési kontrolt a CEA antigén nélküli gyöngyökhöz kötött számok százalékának meghatározásával állapítjuk meg.

2. A CHA255 antitest kötési vizsgálat

Ahogy jelöltük, a CHA255 monoklonális antitest specifikus az r·· λ :··· • Η « Η· • · · · · ·· ·*♦ ··· ···

In(III)-benzil EDTA komplexszel szemben. Az affinitást és a jellemzést már korábban leírták (Reardon et al, Natúré,316:265, 1985) . A kötési vizsgálatot a DB-I - DB-X és DDB-I - DDB-III jelölésű haptének azonosságának vizsgálata céljából végezzük el.

A vizsgálati körülmények között sem a ⁹⁰Yttrium(III), sem az -¹-¹¹Indium(III) DTPA magában nem kötődik a CHA255-höz. Különösen a ⁹⁽^Yttrium(III) haptén keláthoz a CHA255 kötés esetében szükség van az Indiumbenzil-EDTA egység jelenlétére, ahogy azt a találmány vegyületei biztosítják. A jelölt DB és DDB haptén kelátokat összekeverjük 44 ^g/ml humán szérum albumint és 0.05 % Triton-X-100 detergenst tartalmazó PBS-ben (10 mM nátrium foszfát, 150 mM nátrium klorid, pH=7.4) levő CHA255 antitesttel.

A rádiójeléit haptén kelátképző anyag és az antitest koncentrációja sorrendben 5 nM és 133 nM. Az elegyet összekeverjük és szobahőmorsékleten 15 percig állni hagyjuk, ezután egy Amicon Centrifree szerkezetbe helyezzük, az NMW limit 30000, és a keláthoz kötött antitest szabad haptén kelátoktól való szeparálása céljából centrifugáljuk. Az antitesthez kötődő fajtákat visszatartjuk a membránnal és a szabad kelátot átfolyatjuk a membránon a szürletbe. Az antitest-haptén kelát kötés mértékét ezután határozzuk meg.

Bár a találmányt az előnyben részesített megvalósulásokra való hivatkozással irtuk le, természetesen számos módosítás alkalmazható a találmány körétől való eltávozás nélkül. Ennek megfelelően a találmány csupán a szabadalmi igénypontok korlá tozzák .

.- 4 :··· ··· ··« * ·«» • · · · * ·* ·· ··· »··

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (24)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Egy polipeptid azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy aminosav helyettesítést magába foglaló natív antitest komplementaritást meghatározó régió (CDR) szekvenciát magába foglaló aminosavat. A polipeptid az EDTA , egy EDTA analóg, vagy DOTA vagy egy DOTA analóg fémkelátjaival szemben a natív antitest kötési affinitásával megegyező vagy azétól eltérő kötési affinitást mutat.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy a fémkelát egy L-aminobenzil EDTA fém haptén komplexet j elent.
3. 3. A 2. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy a haptén az L- vagy D- (para) aminobenzil EDTA '¹¹inidium kelátját jelenti.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy a natív antitestet egy monoklonális antitest képviseli.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy a natív antitestet egy patkány antitest képviseli.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy a natív antitestet CHA255-nek nevezzük.
7. 7. A 6. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy az aminosav helyettesítés a nehéz lánc CDR 1-ben (Hl) •· ··«· · «··♦ • i ··· ··· ··· ···* • · ♦ ·^ · ·· »4· «·· ··· található.
8. 8. A 6. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy az aminosav helyettesítés a nehéz lánc CDR 3-ban (H3) található.
9. 9. A 6. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy az aminsav helyettesítés a könnyű léánc CDR 2-ben (L2) található.
10. 10. A 6. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy az aminosav helyettesítés a könnyű lánc CDR 3-ban (L3) található.
11. 11. Az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy a polipeptid kötési affinitása a natív antitest kötési affinitásánál magasabb értéket mutat.
12. 12. Az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy a polipeptid kötési affinitása a natív antitest kötési affinitásánál kisebb értéket mutat.
13. 13. Egy nukleotid szekvencia azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti polipeptidet kódolja.
14. 14. Egy vektor azzal jellemezve, hogy a 13. igénypont szerinti nukleinsav szekvenciát tartalmazza.
15. 15. Egy gazdasejt azzal jellemezve, hogy a 14. igénypont szerinti vektort tartalmazza.
16. 16. Az 1. igénypont szerinti polipeptid előállítására szolgáló módszer azzal jellemezve, hogy a 15. igénypont szerinti • 4 ···* ·····

    4» · ··· ··· ·«· ···· * · « · · ·· ·4ν ··· ··· gazdasejtet a polipeptid termelését lehetővé tevő körülmények között szaporítjuk, majd a kapott polipeptidet kinyerjük.
17. 17. A polipeptid azzal jellemzve, hogy a 16. igénypont szerinti módszerrel előállítjuk.
18. 18. Az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy egy feltérképezéshez használható anyaghoz kötjük.
19. 19. Az 1. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy egy gyógyászati anyaghoz kötjük.
20. 20. Egy gyógyszerészeti összetétel azzal jellemezve, hogy az 1., 18., vagy a 19. igénypontok szerinti polipeptidet és egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozót tartalmaz.
21. 21. Egy terápiás anyag sejthez való szállításának módszere azzal jellemezve, hogy a sejtet a 19. igénypont szerinti gyógyszerészeti összetétellel kapcsolatba hozzuk.
22. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kapcsolatba hozást in vitro végezzük.
23. 23. A 21. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kapcsolatba hozást in vivő végezzük.
24. 24. Egy célsejt alanyban való feltérképezésének módszere azzal jellemezve, hogy az alanynak a 18. igénypont szerinti összetétel hatékony mennyiségét adjuk majd az alanyban a célsej tet feltérképezzük.