HUT66375A

HUT66375A - Pharmaceutical composition comprising purpurogallin useful as an antioxidant and cytoprotective agent

Info

Publication number: HUT66375A
Application number: HU9303246A
Authority: HU
Inventors: Tai-Wing Wu
Original assignee: Wu Tai Wing
Priority date: 1991-05-16
Filing date: 1992-05-15
Publication date: 1994-11-28
Also published as: WO1992020332A1; CA2103040A1; AU1745592A; HU9303246D0; JPH06507610A; EP0584148A1

Description

A jelen találmány általánosságban olyan antioxidánsokia vonatkozik, amelyek biomedikusan alkalmazhatók. Közelebbről, a jelen találmány a púipogallin molekula és glikozidjaínak az oxigén gyökök mennyiségét szabályozó tulajdonságaira vonatkozik.

A szabad oxigén gyökök mint a szuperoxid gyök (Og) és a hidroxil gyök (OH) a véráramban lévő oxigén 5%-ból keletkeznek. Ezek az oxigén gyökök erősen toxikusak, és visszafordíthatatlan oxidativ károsodást okozhatnak a sejtekben és szövetekben. Amikor egy élő szerv vagy szövet szabályos veiáiamlása valamilyen oknál fogva ideiglenesen megszakad, pl. szervátültetés by-pass műtét és hasonlók miatt (ez az ischemíának, véitelenségnek nevezett sebészeti folyamat), az oxigénnek a szövetben való újra megjelenése a szupeioxid keletkezésének nagymértékű növekedéséhez vezet, amelynek következménye a másodlagos hidioxil gyökök megjelenése és a jellegzetes sejtpusztulás kialakulása. A2 ischemiát követően teimelődő nagy mennyiségű szabad gyek elsődleges fonása a xantin-dehidiogenáz enzim. Ez az enzim egyébként eíektionokat szállít a púim bázisoktól az oxidált nikotimamid-adenin dinukleotidokia. Hipoxia alatt ez az enzim gyorsan és ii reverzibilisen xantin-oxidázza alakul, amely azzal, hogy az elektronokat közvetlenül az oxigénhez szállítja, nagy mennyiségű szupeioxidot állít elő.

A szabad oxigén gyökök biológiai szempontból fontos molekulákat támadhatnak meg és károsíthatnak. A sejtmembiánban az OH gyök lipid peioxidációnak nevezett láncreakciót indíthat be. amelynek során a hosszú szénláncu telítetlen zsíisav molekulákból vízben oldódó termékek keletkeznek ami a membiánt természetszerűleg károsítja. A sejtmembránok peroxidációja a sejt pusztulását okozhatja, mivel lizoszómális hidiolázok szabadulhatnak fel és kerülhetnek a citoplazmába. Az oxigén gyökök mutációkat is okozhatnak a DNS.: :

• · · · · · ······ · · ··· · ···♦ ··· · ·♦

-3 -bon, ezenkívül a hialuronsav és a hasonló makromolekulák depolimeiizációjáéit ís felelősek.

A szervezet több olyan védekező mechanizmussal is rendelkezik, amelyek a minimálisra képesek csökkentem a szabad oxigén gyökök által okozott sérüléseket. Az egyik védekező mechanizmus egy, a szuperoxid dizmutáz enzimet is magába foglaló enzimatikus folyamat. Ez az enzim két szabad oxigén gyök és hídiogén hidrogén peroxiddá történő kapcsolódását katalizálja. A hidrogén peroxidot ezekután a peroxídázok, mint például a kataláz eltávolítják a szei vezetből. Egy másik védekező mechanizmust a teimészetes antioxidánsok biztosítanak, mint például a sejtmembrán hidrofób magjában lévő E vitamin (tocopherol), vagy a sejtben vízben oldott formában jelenlévő glutátion és aszkorbinsav. Ezek az antioxidánsok elégségesek akkor, amikor a sejtben noimális köiüimények között keletkező szuperoxidokat kell eltávolítani, nem tudnak viszont megbh kőzni azzal a (okozott szuperoxid teimeléssel, amely akkor lép fel, amikor ischemia után újia oxigén keiül a szövetekbe.

Ily módon felmei ült az igény olyan terápiásán alkalmazható, hatékony antioxidánsok kifejlesztésére, amelyek megakadályozzák vagy legalábbis csökkentik a bizonyos sebészeti beavatkozások (főként a szív, máj, vese és a hasonló szervek ischemiájával járó műtétek) után keletkező szabad oxigén gyökök okozta károsodást.

A korábbiakban mái javasoltak bizonyos vegyületeket, amelyek alkalmasak atra, hogy a szabad oxigén gyökök eltávolításával csökkentsék az ischemia és az azt kővető reperfüzió okozta károsodást. Ezek a vegyületek az allopuiinol, az aszkorbinsav, a di-tocopherol, az E vitamin és a 6-hidiOxi-2,5,7,8tetrametil-kroman-2-kaiboxil sav (Trolox). A Tioloxnak, mint az étel és zsír tartósításban szerepet játszó antioxidánsnak az eredeti leírása az US 4, 877, :

-4810 számon bejegyzett szabadalomban található (Scott és társai, J.Am.Oil.Chem. Soc. 51:200-203(1974)).

A szabad oxigén gyököknek bizonyos betegségek, így az ai tritisz, gyulladások, és a rák bizonyos típusainak kialakulásában valamint az öregedésben játszott szerepe szintén régóta ismert, (ld. például C-ross és társai. Ann.lnt. Med. 107:526-545.) Az E vitamint általában a legjobban ismert teimészetes antíoxídánsnak tekintik. Mindazonáltal terápiás célokra nem különösebben alkalmas, főként sürgős esetekben nem, mivel igen esősen lipofil és csak nagyon.lassan jut be a sejtekbe.

A purpuiogailin egy régóta ismert vegyület, a Meick Index 11. kiadásában a 7963 szám alatt szerepel. Kémiai szempontból a puipurogailin 2,3,4.6tetrahidroxi-5H-benzociklohepten-5-on, szerkezetét a mellékelt képlettel adjuk meg.

A molekula a piiogallol oxidációjával állítható elő. Általában ehető vagy ehetetlen zsírok vagy olajok, szénhidiogén tüzelő vagy kenőanyagok adalékaként használják, minthogy csökkenti az oxidációt vagy a fémszennyeződést.

Az US 4 181 545 számú szabadalmi leílásban (Andersen) ismertetik, hogy a púi purogallin és más hidroxi-szubsztítuált aromás vegyületek adalékanyagként használhatók fel a gumi alapú szilárd üzemanyagok polimerizált kötőanyagainak vulkanizálásakor. A szabadalom szerint ezek a vegyületek gyorsítják a vulkanizálás folyamatát és komplexet alkotnak azokkal a ···

-5 fémionokkal, amelyek különben mind a polimerizált, mint a polimei izálatlan rendszerek bomlását okoznák.

A jelen találmány tárgya egy az eddigieknél hatékonyabb, biomedikus szempontból elfogadható antioxidáns kidolgozása, amely többek között a reperfúzió során is alkalmazható.

A jelen találmány azon a megfigyelésen alapszik, hogy a púi purogallin és glükozidjai antioxidánsként és citoprotektív ágensként előre nem sejtett módon hasznosnak és hatékonynak bizonyultak a biomedikai felhasználás során. A púi purogallin ezekben az esetekben még az eddig használt antioxidánsoknál, a Troloxnál és az aszkorbinsavnál is hatékonyabbnak bizonyult. A purpurogallin különösen hasznos akkor, amikor a beteg vérét kezeljük ischemia után abból a célból, hogy csökkentsük az ischemia után adott'vér repeifúzió következtében keletkező szabad oxigén gyökök okozta szövet és szerv károsodást. A púipurogallin nem toxikus és nem bomlékony. a véráramban természetes körülmények között több hét múlva is kimutatható.

Jelen találmány a purpuiogallin és glükozidjainak citoprotektív, antioxidáns anyagokként történő felhasználását javasolja elsősorban.

Másodsorban - mivel adott egy, az emlősökben hatékonyan felhasználható antioxidáns és citoprotektív vegyület - a jelen találmány vonatkozik egy olyan gyógyszel készítményre is, amely a púi pur ogallint vagy annak glükozidjait gyógyászatilag hatásos mennyiségben tartalmazza egy fiziológiai szempontból megfelelő adjuváns tál saságában.

A jelen találmány további táigyát képezi egy módszer is, amelynek segítségével az emlősök vérének szabad oxigén gyök koncentrációja csökkenthető. E módszer szerint a fenti hatás akkor érhető el, ha az emlős vélt in vivő megfelelő mennyiségű purpurogallinnal vagy annak glükozidjaival kezeljük.

·» ♦ .··. .: : :

• * · · ♦ · ·*···» Λ · *»* « ··«· ··· « ο·

-6 A mellékelt ábrák szövege:

Az 1. ábra a később ismertetésre kerülő 1. példa eredményeinek grafikus formában történő bemutatása.

A 2. ábra a később ismertetésre kerülő 2. példa eredményeinek grafikus formában történő bemutatása.

A jelen találmány legfontosabb része annak a folyamatnak a leírása, amelynek során a purpuiogallint antioxidánsként alkalmazzuk abból a célból., hogy csökkentsük a szervek ischemia és r eperfúzió okozta károsodását. Ebből a célból a puipurogallin vegyület már hatásos mennyiségét a megfelelő fiziológiai szempontból alkalmas hordozóval együtt folyadék fői májában a beteg véiáiamába juttatjuk közvetlenül az ischémiát szenvedett szerv iepeifiiziója előtt, az illető szerv közelében. Minél közelebb van a gyógyszer injektálási helye az ischemiás szervhez, annál kevesebb puipogallin szükséges. Szintén jó eiedményeket élhetünk el, ha a púipogailint egy kényelmesen megközelíthető helyen juttatjuk a véiáiamba, de ez pazailás, meit ekkor nagy mennyiségű purpogailin injektálása szükséges. Néha azonban, például séiült beteg esetében, kétségtelen, hogy az injektálást nem a séiüit szerv közelében, hanem más, alkalmas helyen kell végrehajtani. Megfelelő hoidozó alkalmazásával még a szájon át tőiténő bevitel is elképzelhető.

A jelen szabadalmi leit ás szerint a purpurogallin bevitelére alkalmas fiziológiai szempontból megfelelő hordozók lehetnek a víz és sóoldatok, előnyösen izotóniás sóoldatok, vagy báimely általánosan használt kaidioplegíkus oldat, amely a vén ei kompatibilis és ezért hozzákevei helő. De a púi púi ogaííin oldat legmegfelelőbb hordozója a beteg saját véie, vagy más vele azonos véicsoportú vér. Ez sebészeti osztályokon, ahol az ischemia pioblémájával

-7 találkozhatunk, általában hozzáfélhető, és ez az, ami a beteg szempontjából a legmegfelelőbb hordozó.

Az alkalmazott purpurogallin mennyisége a beteg testsúlyának és vél kapacitásának függvénye. Általában az a legmegfelelőbb, ha testsúlykilogrammonként 0,3 - 15 mg, előnyösen 0,5 -10 mg puipijiogailint adunk. Noimál testsúlyú és vét kapacitású felnőtt embernek 3-100 mg purpurogallin elegendő. Ha gyermeknek vagy állatnak adjuk a gyógyszert, ezeket a mennyiségeket a páciens testsúlyának megfelelően arányosan kell változtatnunk.

A kezelés során alkalmazott oldat púi purogailin koncentrációja nem kritikus, effelől a felhasználó szabadon dönthet. Általában a híg oldatok a megfelelőbbek, mivel a purpurogallin oldatot előnyős lassan, pl. 10 - 20 perc alatt adagolni, és ilyen körülmények között híg oldatokkal könnyebb dolgozni. Általában a 0.1 - 10 mmol/1, előnyösen a 0.2 - 5 mmol/l koncentráció a megfelelő. A kezelés folyamán figyelemmel keil kísér ni a beteg általános állapotát és életjeieit, és szükség esetén változtatni kell az adagolás ütemén.

A jelen találmányt a továbbiakban példákon keresztül ismertetjük, de ezzel nem akarjuk behatárolni az alkalmazás körét. Hacsak külön nem jelezzük, a felhasznált vegyszeiek reagens tisztaságűak és a Sigma cégtől szál maznak (Sigma Chemical Co., St, Louis, Mo., USA). A purpurogallínt és a Troloxot az Aldiich cégtől vásároltuk (Aldrich Chemical Co.), az AAPH-t (2.2 -azo-bis-(2-amidinö-piopán)-HCÍ) a Polysciences Inc. szállította.

1. példa

Ebben a példában a kíséi leteket humán vörösvél testekkel végeztük, amelyeket purpurogallin és Trolox nélkül, ill. ezek különböző koncentrációjú

-8 oldatainak jelenlétében AAPH-dal történő teimális aktiváció következtében keletkező szabad gyökök hatásának tettünk ki azért, hogy az adott körülmények között meghatározzuk a purpurogallin citoprotektív kapacitását,

A frissen preparált humán vöiösvértesteket (wt) legalább háromszor mostuk sóoldatban 1500 g x 10 min centi ifugálással. Ezt követően foszfát pufferben (pH= 7.4) 20 %-os wt szuszpenziót állítottunk elő (Miki és társai. Aich. Biochem. Biophys. 258:373-380, 1937),

A szabad gyököket azo-iniciátor 2,2 -azo-bis (2-amidino-propáni-HCI (AAPH) teimális aktivációjával állítottuk elő. A 0,5 ml össztérfogatú reakcióelegy 10% wt szuszpenzió volt, végkoncentrációban 100 mmol/l AAPH-t valamint különböző mennyiségű purpurogailint tartalmazott 10 mmol/l koncentrációjú foszfáttal puff ereit sóoldatban, A fenti elegyet gyengén rázva 37 ^öC-on 180 peicig inkubáltuk. Ezt követően egy 35 ui-es aliquotot kivettünk a leakcióelegyből. feloldottuk 1,5 ml sóoldatban és lecentrifugáltuk (1500 g, 10 perc). A felülúszó abszoipcióját 525 nm-nél PBA vak mintával szemben olvastuk le A reakcióelegy másik aliquotjat hasonlóan 1,5 ml desztillált vízzel kezeltük, majd a teljes hemolízist 2 peices szonikálással éltük el. A hemolízis százalékát az idézett cikkben leírtaknak megfelelően számítottuk ki (Miki és társai).

Mindezeket az eiedményeket grafikusan az 1. ábra mutatja. Az ábiáiól leolvasható, hogy az antioxidánsok (a puipuiogallin és a Tiolox) koncentiációjának növekedésével emelkedett a hemolízis gátlás százaléka. Egy citopiotektív anyag antioxidáns hatékonyságát jellemző legfontosabb index az a koncentiácíóéiték, amely a sejtek 50 %-ának lízisét megakadályozza (IC50). A puipuiogaílin esetében az IC50 0,12 mmol/l, a Tioloxnál 0,74 mmol/l. Ebből látható, hogy a Tioloxnál hatszoi kevesebb puipurogallin megakadályozza a

- 9 sejtek 50 %-ának lízisét, így kijelenthetjük, hogy a purpurogallin hatszor hatékonyabb, mint a Trolox.

2. óéiba

Ebben a példában a kísérleteket patkány hepatocitákkal végeztük úgy, hogy szabad gyökök hatásának tettük ki Őket purpurogallin nélkül valamint különböző koncentrációjú púi purogallin oldatok jelenlétében.

A hepatocitákat hím Sprague-Dawley patkányokból (400 - 450 g) prepái álluk a Princen által megadott módszer szerint (Princen és társai, J.CIin Invest 78:1064-1071, 1986), azzal a módosítással, hogy a máj perfúzióját elősző! 250 ml 0.5 mmol/l EGTA-val és 142 mmol/1 NaCI-ot valamint 6 7 mmol/1 KCI-ot tartalmazó 10 mmol/l-os HEPES pufferrel (pH=7,4) végeztük 20 ml/peic sebességgel csőpögtetve, majd ezt követően a májat 5mmoi/l CaCIg-ot és 0,05% küllagenázt tartalmazó 100 ml magnézium mentes Hank's Balanced Salt Solution pufferrel mostuk át. A továbbiakban az előzőekben ismertetettek szerint jártunk el (Wu éstáisai, Biochem.Cell.Biol. 68: 1189-1194, 1990).

A szabad gyökökkel kapcsolatos kíséi leteket ügy hajtottuk végre, hogy a sejteket a médium eltávolítása után 3 ml 0,05 mol/l nátrium-foszfáttal pufféi élt sóoldatban (PBS) (pH=7.4) vettük fel, amely oxigén gyökök fejlesztéséi e alkalmas 66.7 nemzetközi egység/1 xantimoxidázt (XOD) és 2mmol/l hypoxantint tartalmazott, A különböző koncentrációjú puipurogallin oldatok hatásának összehasonlításához azt az időtartamot vettük alapul, amely alatt 10⁵ azonos generációjú sejt 95%-a elpusztul. Amikor az antioxidáns jelen volt, azt a XOD-zal és a hypoxantinnal együtt adagoltuk, és hatását vakon teszteltük az eluátor által véletlenszerűen kiválasztott tiiplikátumokban, A púipuiogallint különböző koncentrációkban PBS-ben oldottuk, és legalább 30 percig gázmentesítettük.

- 10 ·· · · · * ··♦· ··· 4 «·

Mivel a purpurogallin részben vízoldékony, az oldatok 4 mmol/l koncentrációig rövid szonikálással készültek. A pH-t a sziláid puipuiogallin majdnem teljes feloldása után 7,40 ± 0,05 értékre állítottuk be. A kontrollok vagy csak PBS-ben felvett sejteket tartalmaztak, vagy PBS-t és sejtekkel inkubált XOD-t vagy hypoxantint.

A kísérletek eredményét a 2. ábra mutatja. A grafikon függőleges tengelyén a 100 000 hepatocita nekrózisához szükséges időt tüntettük fel peicekben, vízszintes tengelyén pedig a kísértetek során használt purpurogaílin koncentrációját mmol/1-ben. Az ábra számos kísérlet átlagértékét mutatja, a hasznait statisztikai analízisként a Student t-ριóbát használtuk. Az adatokat átlagolva ± SD (standard deviáció) adtuk meg. A kísérleti eredmények és a kontroll szignifikáns különbségét a p < 0.05 érték jelzi.

A 2. ábra azt mutatja, hogy hogyan függ a purpurogallin koncentrációjától a puipuiogallínnak a patkány hepatocitákra gyakorolt hatása. A nagyobb koncentrációban adagolt purpur ogaliin megnövelte azt az időtartamot (perc), amely alatt 100 000, oxigéngyökök hatásának kitett patkány hepatocita elpusztult. A purpuiogallin citoprotektív hatását a legjobban a 3mmoí/l koncentrációértéknél fejtette ki, amikor a hepatociták élettartamát akár 30 perccel is meghosszabbította. A kontroll kísérteiben (ahol a hepatocitákat minden adalékanyag nélkül tettük ki a hypoxantin és a XOD hatásának) a 100 000 hepatocita kb. 6 perc alatt többségében elpusztult.

További kísérleteink során patkány hepatocitákat tenyésztettünk, és az oxigén gyökök okozta károsodást vizsgáltuk puipurogaílin valamint Trolox jelenlétében. Ezeket a kísérleteket Wu fentebb már idézett cikke és a Clin. Chem. 36:1172-1173 (kivonat) alapján végeztük. A kísérletek eredményét az 1. táblázat foglalja össze.

.: : :

• · • · ··· · ··

I. TÁBLÁZAT

koncentráció (mmol/l)	oxigén gyökök hatásának kitett 10⁵ patkán' hepatocita átlagos túlélési ideje (perc)
	Púi puiogallin	Tiolox
0.5	13	12
1,0	20	13
2,0	31	16

A. kontroll kiséi leiben, amikor semmiféle adalékanyagot nem alkalmaztunk az oxigén gyökök hatásának kitett sejtek kb. 6,5 percig éltek, A táblázatban közölt adatok mutatják, hogy a púipuiogallin egyél telmúen jobb hatékonysággal védi meg a patkány hepatocitákat, mint a Tiolox, amely E vitamin száimazék lévén maga is hatékony antioxidáns,

3. példa

Humán ventiikuláiis myocitákat izoláltunk, és a már leíit és idézett módszei szerint (Wu és táisai) azt vizsgáltuk, hogy mennyiben képes a púi puiogallin ill. a Tiolox kivédeni az oxigén gyökök hatásai a bekövetkező sejtpusztulást Eredményeinket a II. táblázatban foglaltuk össze.

oxigén gyökök hatásának kitett 10^

- 12 II TÁBLÁZAT koncentráció (mmol/l) myocita átlagos túlélési ideje (perc)

	Purpurogallin	Trolox
0,5	14	3.5
1,0	>60	4,5
1.5	> 60	4,8
3.0	>60	5,3

A kontroll kísérletben, ahol nem használtunk semmilyen adalékanyagot, az oxigén gyökök hatásának kitett sejtek 2 percig éltek.

A II. táblázat adatai 5-7 közel azonos eredménnyel végződő kísértet átlagát mutatják. Az eredményekből kiolvasható, hogy ebben a kísérleti elrendezésben a pmpurogallin legalább egy nagyságrenddel hatékonyabb, mint a Tiolox, különösen 0,5 mmol/l-t meghaladó koncentr ációéi tekéknél.

4. példa

Patkány vese mesangiális sejteket izoláltunk, és a már fentebb leíit és idézett módszer szerint (Wu és társai) azt vizsgáltuk, hogy mennyiben ellensúlyozza az azonos koncentrációban adagolt pur purogallin és Trolox a szabad oxigén gyökök sejtkárosító hatását. Az eredményekből világosan kiolvasható, hogy a purpurogallin minden alkalmazott koncentrációértékben hatékonyabb a Troloxnál. Ezeket az eredményeket a III. táblázatban foglaltuk össze.

- 13 Ili, TÁBLÁZAT

Purpurogallin koncentráció (mmol/l)	XOD (66,7 IU/I) és Hypoxantin (0,5 mmol/1) hatásának kitett sejtek átlagos túlélési ideje (perc)
	Purpurogallin	Troíox
0 (kontroll)	5,7	5.7
0,13	11.5	6,4
0,25	13,4	6,6
0,50	16,0	7,4
1,00	19,4	7,8

5. példa

A púi puiogaílin citoprotektivilásának meghálál ozására részleges máj íschernia és repeifúzió után patkány májon in vivő kísérleteket végeztünk.

Kíséreteinkben a Wu által leírt modellt használtuk (Wu és társai. Hepatology. 13:575-580, 1591). Röviden összefoglalva, ebben a modellben a patkány máj bal latéiális, középső és Spigel lebenyeit ellátó véredényeket elzárják, olyan módon, hogy elcsipeszelik a bal portális vénát, a bal máj artériát és a bal epevezetéket. A. jobboldali portális vénát, máj artériát és epevezetéket belső sönt gyanánt épen hagyják. A vér edények mesterséges elzárását 0,3 - 0,4 kg tömegű, előzőleg egy éjszakán át éheztetett Sprague-Dawley patkányokon végeztük. Az ischemia feloldása előtt kb. 45 másodperccel 3 ml sóoldatot (kontroll kísérlet), vagy a sóoldatban a később megadott koncentrációban oldott

- 14 púi púiogallínt vagy Troloxot adagoltunk az állatoknak a pénisz vénán keresztül infúzióban 3 perc időtartam alatt. Mindezt 24 órás repeifúzió követte. A kísér let végén a nekiotizált részek kiterjedését a máj nedves tömegének arányában a jól ismert hisztokémiai módszerrel (Fredericks és táisai, Exptl.Mol.Path. 41:119125,1934) határoztuk meg.

A IV. táblázatban bemutatott eredményekből kiolvasható, hogy a púi pufogailin 4,4-től 18 pmol/testsúlykilograrnmíg növekvő mennyisége jelentős méifékben csökkenti a máj nekrotizált területeinek kiterjedését. Ez jól tükröződik a sz&ív a növekvő purpurogallin dózissal együtt növekvő épen maradt iészének nagyságában. Érdemes megjegyezni egyrészt, hogy a szerv épen maradt részének nagysága minden szinten szignifikánsan különbözik a kontroll éltektől, másieszt. hogy az antioxidánsok már hatékony dózisa testsúly kilóg lammonk ént csak umolokia tehető.

IV. táblázat

A PURPUROGALLIN HATÁSA A RÉSZLEGES ISCHEMIÁN ÉS REPERFÚZIÓN

KERESZTÜLESETT PATKÁNYOKRA

Kontroll Puipurogallin

infúzió dózis	csak sóoldat (antioxidáns nélkül)	4,4 (μηχ	6,3 jl/testsúl)	18 / kg)
átlag nekrózis (tömeg%)	30,3	17,7	7,3	4,4
± SD	11,9	4.6	4,9	1,1
épen maradt máj (%)	0 '	42	76	86
patkányok száma	6	6	6	6
p érték a kontrollal szemben	---	0,05	0,005	0,001

A p érték < 0,05 statisztikai szempontból szignifikáns.

6. példa

Ebben a példában a purpurogallin citoprotektív hatását in vivő körülmények között, nyúl szív ischémia - repeifúzíó után vizsgáltuk.

3,0 - 3,5 kg tömegű, fehér New-Zealarrd nyulakat intiamuszkuláiisan adott Ketamin (35 mg/kg), Atiavet (0,4 mg/kg) valamint intravénásán bejuttatott atropin alkalmazásával (0,1 mg/kg) elaltattunk.

Az állat elülső részének megbotol válása után az anesztéziát trachetómiával tartottuk fel olyan módon, hogy az állatot Harvaid típusú kisállat lélegeztetővel, 2,5% elránt (vagy enfluránt) tartalmazó oxigén alapú gázeleggyel ·· ·

- 16 pozitív nyomású respirációval lélegeztettük. A szegycsont eltávolítása (szternotómia) után a szívburkot felnyitottuk, és a szivet feltártuk. A bal cirkumflex koronaőrnek is nevezett anterior ventrikuláris korona artéria fő ágát, amely nyulak esetében a bal kamra nagy részét és a szívcsúcsot látja el vérrel, ideiglenesen elzártuk oly módon, hogy egy 5-0 selyemszállal 1 órára elkötöítük a csúcs és az atrioventrikulái is árok közötti részen 1/3 - 2/3 távolságban. Az elzáiás feloldása előtt kb. 1 pesccel az 1 mmol/l koncentrációjú tesztfolyadékból egy 30 mí-es mennyiséget injektáltunk a jobb külső juguláris vénába. A kontioíl állatok a tesztfolyadék helyett 30 ml normái sóoldatot kaptak. Az injektálást minden esetben 3 órás reperfúzió követte. Ezt követően a sziveket összegyűjtöttük, az enzimaktivitást kimutató tetiazóliiím festékkel megfestettük, és a nekrotizált területek nagyságát planimetriával meghatároztuk.

A veszélynek leginkább kitett teiületek meghatáiozásáia a szívre eredetileg feltett ligatúiát megszorítottuk, az aortában egy 22 G vastagságú katétert helyeztünk fel, amelyen keresztül 30 ml-nyi Evans-Blue oldatot injektáltunk a szívbe. A szívből ezután 2 mm vastag keresztirányú metszeteket készítettünk és 1.25%-os nitro-tetrazólium vörös festékkel 30 percig festettük. A negatív nitro-tetrazólium vöiös festést minden egyes lemezen tianszparens acetát lapon követtük, és a nekiotizált terület nagyságát komputeiizált planimetriával állapítottuk meg.

Eredményeinket az V. táblázat mutatja.

V táblázat
Infúzió dózis	Kontroll sooldat (adalékanyag nélkül)	Púi ρυι ogaiíin (o.o· íO u.113Ovtestsij-y kq)

Sz ei vnekrozis a veszélyeztetett területen (%) iSíiöC! á oU)

A néni nekiotizáit szerv (%)

-r r· ! □ (átlag)

Myiiíak szama p éilek a kontrollal szemben < 0 00 I

75% - os nem nekiotizáll szervmennyiség statisztikai és klinikai szempontból egya·árit eiósen sz«gntíikáns. Tudomásunk sz.es int ez a legalacsonyabb lywzat u ia tis nekiozis éltén, amit egyetlen vegyület íeinasznajasavei ene^ el az λ példa

A púipuiogalim egy diglűkozídját (C23H28O13) használtuk a jelen szabadalmi leírásban fentebb ismét teteti módszereknek és folyamatoknak megfelelően etítiociták hepatociták és myocilák. valamint a máj és a szív módéi! (elhasználásával szervek nekiózisának kivédéséle. Ez a vegyület ugyanolyan hatásosnak bizonyult, mint maga a púipurogallin. Ezenkívül nagy nyomású

- 18 folyadékkromatográfiával egy másik (valószínűleg mono-) glükozidot is előállítottunk, és ennek a hatását is megvizsgáltuk. Ez a vegyület úgyszintén a purpurogallinhoz hasonló módon viselkedett. Mindezen eredményeinkre támaszkodva kijelenthetjük hogy a ptupurogallin, valamint mono- és diglűkozidjai egyaránt igen hatékony citoprotektánsok mind sejttenyészetben, mind pedig in vivő körülmények között.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Gyógyászati készítmény, amely emlősökben antioxidáns és citoprotektiv hatású, azzaf jellemezve, hogy a készítmény hatékony mennyiségű' purpurogallint vagy annak valamely glükozidját tartalmazza egy fiziológiai szempontból elfogadható adjuváns kíséretében.
2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a készítmény aktív alkotórésze purpurogallin.
3. A 2. igénypont szerint készítmény, azzal jellemezve, hogy az adjuváns vizes oldat.
4. A 3. igénypont szerint készítmény, azzal jellemezve, hogy az adjuváns víz, fiziológiás sóold’at vágy vér.
5. Eljárás az emlősök vérében megjelenő, oxidáló hatású szabad gyökök koncentrációjának csökkentésér e, azzal jellemezve, hogy az emlős vér t in vivő az 1. igénypontban leírt készítmény hatásos mennyiségével kezeljük.
6. Eljárás az emlősök vér ében megjelenő, oxidáló hatású szabad gyökök koncentrációjának csökkentésére, azzal jellemezve, hogy az emlős vért a 4. igénypontban leíit készítmény hatásos mennyiségével in vivő kezeljük.
7. Eljárás az emlősök különböző szelveiben a nevezett szerv iscnemiáját, majd vérrel történő repei fűz lóját követő szöveti károsodás csökkentésére, azzal jellemezve, hogy a vérhez az 1. igénypontban leírt készítmény hatásos mennyiségét ín vívó adagoljuk. ^: ’ *’z.·
8. Eijáiás az emlősök különböző szerveiben a nevezett szerv ischemiáját, majd vénei történő repeifúzióját követő szöveti károsodás csökkentésére, azzal jellemezve, hogy a veihez a 4. igénypontban leírt készítmény hatásos mennyiségét in vivő adagoljuk.
9. Az 5-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy testsúlykilogrammonként kb. 0,3 - 15 mg purpurogallint alkalmazunk.
10. Az 5-8. igénypontok bál melyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy testsúlykilogrammonként 0,5 -10 mg púi purogailint alkalmazunk.
11. A purpurogallin vagy valamely glükozidjának az emlős vérben lévő, oxidáló hatású szabad gyökök koncentrációjának csökkentése céljából történő alkalmazása, azzal jellemezve, hogy a vért in vivő körülmények között a purpurogallinból vagy valamely glűkczidjából előállított, fiziológiai szempontból megfelelő készítmény hatásos mennyiségével kezeljük.
12. A purpurogallin egy olyan fiziológiai szempontból megfelelő készítményben történő alkalmazása, amely egy az emlősök vérében keletkező, oxidáló hatású szabad gyökök koncentrációjának in vivő csökkentésére alkalmas.

hay? néíkuí

1994 -06- 2 4 . .