HUT63343A - Process for producing immunereactive compounds - Google Patents

Process for producing immunereactive compounds Download PDF

Info

Publication number
HUT63343A
HUT63343A HU9204170A HU417091A HUT63343A HU T63343 A HUT63343 A HU T63343A HU 9204170 A HU9204170 A HU 9204170A HU 417091 A HU417091 A HU 417091A HU T63343 A HUT63343 A HU T63343A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
igm
iga
antigen
fragment
polypeptide
Prior art date
Application number
HU9204170A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9204170D0 (en
Inventor
Ebo Sybren Bos
Petrus Johannes Boon
Original Assignee
Akzo Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Akzo Nv filed Critical Akzo Nv
Publication of HU9204170D0 publication Critical patent/HU9204170D0/hu
Publication of HUT63343A publication Critical patent/HUT63343A/hu

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Kivonat
A jelen találmányban olyan újszerű immunreaktív vegyületeket hozunk nyilvánosságra, melyek IgM vagy IgA egy vagy több antigénkötő fragmentumát tartalmazzák egy hordozó molekulához, pl.HSAhoz, egy enzimhez vagy kis antigenitású szintetikus polipeptidhez kapcsolva. Ezen fragmentumok hordozóhoz való kötésével a viszonylag kis antigén affinitásuk a natív IgM vagy IgA affinitás szintjével összemérhető szinten tartható.
(I
! KÖZZÉTÉTELI
PÉLDÁNY
Képviselő:
«4
DANUBIA SZABADALMI ÉS VÉDJEGY IRODA KFT
6334 3' ’
Budapest
v./a ,
AOK '’T'M ,
Eljárás immunreaktív vegyületek előállítására
AKZO N.V., Arnhem, Hollandia
Feltalálók:
BŐS Ebo Sybren, Oss, Hollandia
BOON Petrus Johannes, Oss, Hollandia
A bejelentés napja: 1991. 06. 28.
Elsőbbsége: 1990. 07. 03. (90 201 781.3)
Európa
A nemzetközi bejelentés száma: PCT/EP91/01223
A nemzetközi közzététel száma: WO 92/00763
76414-760C TF/SM
I
- 2 A jelen találmány immunreaktív vegyületekkel és ezeket tartalmazó gyógyászati készítményekkel kapcsolatos.
Egy ilyen immunreaktív vegyület főként immunterápiában és diagnosztikában használható fel.
Az immunterápia az egyik Ígéretes lehetőség számos betegség elleni küzdelemben. Maga az immunterápia alapelve régóta ismert, mely szerint egy olyan célpont ellen irányuló anyagot alkalmaznak, ami az aktív hatóanyagot a célpont közvetlen közelébe szállítja.
így felhasználható arra, hogy bizonyos, a célpont ellen irányuló anyag számára hozzáférhető résszel rendelkező sejtcsoportot elpusztítsunk vagy esetleg aktiváljunk velük. Az ilyen rendszerek kialakításához a ligandum receptor kölcsönhatásokat vagy az antigénantitest kölcsönhatásokat alkalmazhatjuk, de természetesen e tudományterületen jártas szakemberek más hasonló rendszereket is kidolgozhatnak.
Az immunterápia egy másik, feltehetőleg még elegánsabb megoldása az un. előcélpont stratégiák. Ez például egyebek között lehet gyógyszer előanyag aktiváció, amikor is egy enzimet kapcsolunk a célpont ellen irányuló anyaghoz, és egy gyógyszer előanyaggal együtt vagy azt megelőzően juttatjuk be. A hatóanyag előanyaga magánál a hatóanyagnál kevésbé toxikus és az enzim a célpont helyén alakítja át az előanyagot hatóanyaggá.
Tumorellenes terápiához és tumor lokalizációjához ill. rák diagnózishoz általában jelzett antitesteket alkalmaznak. Tumorellenes terápiában ilyen jelzés lehet pl. valamilyen toxikus anyag mint pl. adriamicin, verrukarin, kalikeamicin, mitomicin, ricin A vagy más alkalmas toxikus vegyület, izotóp, vagy mint azt fent említettük, egy enzim.
Az antitest általában egy bizonyos tumorantigén ellen irányul. E célra alkalmazott antitestek a legtöbb esetben egér eredetű monoklonális antitestek. Egér monoklonális antitesteket ismert eljárásokkal könnyen nyerhetünk szinte bármilyen antigénnel szemben.
Az ilyen antitesteknek azonban számos hátrányuk van. Ha tumoros sejteket egérbe juttatunk be, szinte bármelyik antigénnel szemben, beleértve ezen sejtek normális antigénjeit is, antitestek képződnek. Ezen az úton nehéz kizárólag a tumoros sejtekre specifikus antitesteket nyerni. így az egér eredetű antitestek olyan epitópok (antigén determinánsok) ellen is irányulhatnak, melyek a humán immunrendszerben nem tumorspecifikusak. Továbbá, az egér eredetű antitestek felhasználását gátolja az, hogy az emberben immunogének. Olyan antitest fragmentumok alkalmazásában kerestek megoldást ezekre a problémákra, melyek főleg az egér eredetű antitest antigénkötő szakaszát tartalmazzák, ami a második problémára megoldás lehet, de az elsőre biztosan nem.
Még ideálisabb megoldás a humán anti-tumor antitestek alkalmazásában rejlik. Humán tumorellenes antitesteket kaphatunk az EP 0151030 számú európai szabadalmi leírásban közölt eljárás szerint. A probléma azonban az, hogy ezzel az eljárással főleg IgM és/vagy IgA izotípusú immunglobulinokat nyerhetünk. Ezek pentamer illetve dimer szerkezetűek, azaz 5 vagy 2 diszulfid (S-S hidakkal) hidakkal összekötött monomerből állnak, ahol mindegyik IgM/IgA monomer két nehéz- és két könnyű láncot tartalmaz, és két antigénkötő helyet hordoznak. Ezen monomerek mindegyike durván egy IgG molekula méretével egyezik meg. így egy teljes IgM molekula ötször nagyobb méretű az IgG molekulánál. A legtöbb IgM antigén affinitása alacsony, az IgG affinitási tartomány alsó végére helyezhető.
Az IgM molekula viszonylag nagy mérete miatt kevésbé alkalmas in vivő immunterápiás és tumortérképezési célokra; viszonylag hosszú időt vesz igénybe a célpont helyének elérése, és a nem kötődött IgM kiürülése legalább ötször hosszabb ideig tart, mint IgG esetén. Hasonló, bár az IgM-től eltérő nagyságrendű megfigyelések érvényesek az IgA-ra.
Célravezető megoldásnak tűnik az IgM pentamer vagy az IgA dimer monomerekké történő fragmentálása. Arról számoltak be azonban, hogy az IgM/IgA monomerek antigén affinitása drámaian lecsökken a teljes IgM/IgA molekuláéhoz képest; a különbség legalább kb.100-1000-szeres. Ez az alacsony affinitás alkalmatlanná teszi az IgM/IgA monomerek terápiás vagy diagnosztikai célokra történő felhasználását. Hasonló affinitás csökkenést figyeltek meg az IgM és IgA enzimatikus úton nyert fragmentumai esetén is.
A jelen találmány az IgM fragmentumok antigén affinitásának megtartásával kapcsolatos. A jelen találmány szerint az IgM vagy IgA fragmentumok antigénkötő aktivitása megtartható, ha ezeket legalább egy polipeptidhez kapcsoljuk.
Ilyen polipeptid lehet előnyösen egy humán fehérje pl.humán szérum albumin vagy egy humán enzim, vagy lehet egy kevésbé immunogén szintetikus polipeptid pl.poli-L-glutaminsav vagy poliL-lizin. Az IgM vagy IgA fragmentum lehet IgM vagy IgA monomer, amit a monomerek közötti S-S hidak redukálásával nyerhetünk, vagy lehet egy antigénkötő fragmentum, amit IgM vagy IgA enzimatikus hasításával pl. pepszinnel vagy papainnal kaphatunk meg. A pepszinnel való emésztés F(ab')2-vel jelzett antitest fragmentumokat eredményez, melyek két S-S hidakkal összekapcsolt antigénkötő részből állnak. Az S-S hidak redukciójával két F(ab') fragmentumot nyerünk.
Az IgM vagy IgA monomerek és az F(ab’) fragmentumok a kénatomjaikon keresztül ideálisan polipeptid(ek)hez köthetők. Az IgM polipeptidhez való kötése azonban más, alkalmas kötés révén is megvalósítható feltéve, ha az antigénkötési tulajdonságait nem gátolja. E tekintetben kényelmes megoldás a glikozil csoportokon keresztül történő kötés, ha ilyenek az IgM vagy IgA fragmentumok konstans szakaszán jelen vannak.
Az IgM/IgA fragmentum és a polipeptid közötti kötés lehet direkt vagy egy kapcsoló és/vagy távtartó csoport segítségével indirekt.
Az IgM/IgA fragmentum és a polipeptid közötti kötést megteremthetjük úgy, hogy mindkét komponensen egy kötésre alkalmas csoportot teszünk hozzáférhetővé, az egyik vagy mindkettő kötőcsoportot egy kapcsoló és/vagy távtartó csoporttal reagáltatjuk, majd a komponeneseket egymással hozzuk reakcióba a kívánt immunreaktív vegyület kialakítása végett.
A polipeptidet esetleg jelölhetjük egy vagy több, terápiás vagy diagnosztikai szempontból alkalmas csoporttal az IgM/IgA fragmentumhoz való kapcsolást megelőzően vagy az után. Terápiás célokra alkalmas csoportok lehetnek pl.citotoxikus hatóanyagok, (esetleg kelát formában lévő) radioaktív atomok, vagy olyan enzimek, amelyek a gyógyszer előanyagokat aktív hatóanyaggá képesek alakítani.
További előny azonban, ha a polipeptid maga egy olyan enzim, mely képes az előanyagot a célpont helyén aktív hatóanyaggá átalakítani, mivel az immunreaktív vegyűletek mérete fontos szerepet játszik az alkalmazhatóságukban. Diagnosztikai célokra alkalmas csoportok lehetnek pl. radioaktív atomok (esetleg kelát formában). Az IgM/IgA fragmentumot előnyösen humán IgM-ből vagy IgA-ból nyerjük. Ezen IgM/IgA egy olyan tumorantigénre specifikus vagy tumorból származik, ami tumoros sejtekben vagy azokon kívül található.
1.PÉLDA
A. Immunreaktív IgM monomerek előállítása
A 16-88 jelű humán monoklonális antitestet, mely vastagbél rákban található tumorepitópok ellen irányul, ciszteinnel való redukcióval monomerré alakítjuk.
Az IgM-et (3-5 mg/ml) 10 mM/Ι ciszteinnel inkubáljuk PBS-ben (6,7 mM/Ι K/Na-foszfát puffer, pH = 6,5 és 0,13 M/l NaCl) 3 óráig 37°C-on. A puffereket nitrogénnel telítjük és a reakcióedényt légmentesen lezárjuk. Inkubálás után a reakciókeveréket előzőleg 1 mM/Ι PBS-ben oldott ciszteinnel egyensúlyba hozott Sephadex G25 oszlopon választjuk el. A monomereket 50% telítettségű (NH4)2SO4 oldattal csapjuk ki és nagyon kis térfogatú cisztein oldatban (PBS-ben oldva pH= 7,5) oldjuk fel. A monomer oldatot 1 mM/1 cisztein PBS-ben készített oldatával, pH= 7,5 egyensúlyba hozott Fractogel TSK HW 55 (S) oszlopra visszük. Az oszlop ágytérfogata a minta térfogatának 45-szöröse és az alkalmazott elúciós sebesség 0,06 ágytérfogat/óra. A monomerek általában Kav= 0,550,6-nál eluálódnak, ami A280-nál egy domináns fehérjecsúcs formájában jelentkezik. A monomereket 50% telítettségű (NH4)2SO4 oldattal csapjuk ki. A csapadék 0,1 M/l nátrium-foszfát, 0,1 M/l NaCl, 5 mM/Ι EDTA és 1 mM/Ι cisztein tartalmú pufferben, pH= 7,5 történő feloldása után a feleslegben maradó ammónium-szulfátot a fenti EDTA-t tartalmazó pufferrel egyensúlyba hozott Sephadex G25 oszlopon való gélszűréssel távolítjuk el.
A sómentesített monomert tartalmazó frakcióhoz szilárd ditionitro-benzoesavat (DTNB, Ellman-reagens) adunk 20 mM/1 végkoncentrációban és óvatos rázás után a reakciókeveréket 3 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk.
A reagens feleslegét és a kis molekulatömegű reakciótermékeket Sephadex G25 oszlopon való, 0,1 M/l nátrium-foszfát, 0,1 M/l NaCl, 5 mM/Ι EDTA tartalmú pufferben, pH= 7,5 gélszűréssel távolítjuk el (A oldat).
B. HSA(-DTPA) redukciója
A HSA(-DTPA)-t 5-10 mg/ml koncentrációban 0,1 M/l nátriumfoszfát, 0,1 M/l NaCl, 5 mM/Ι EDTA tartalmú pufferben, pH= 7,5 oldjuk fel. Ehhez az oldathoz ditio-treitolt (DTT) adunk 20 mM/1 végkoncentrációban és 30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. A reakciókeveréket a fent ismertetett EDTA/PBS pufferrel, pH= 7,5 egyensúlyba hozott Sephadex G25 oszlopon kromatografáljuk a redukálószer és a kis molekulatömegű reakciótermékek eltávolítása végett (B oldat).
C. IgM-HSA(-DTPA) immunkonjugátumok előállítása
A HSA(-DTPA) redukálása után azonnal az A oldatot (aktivált monomereket tartalmaz) és a B oldatot (redukált HSA-t tartalmaz) összekeverjük úgy, hogy a monomer/HSA(-DTPA) tömegaránya kb. 0,5 legyen. Szobahőmérsékleten egy éjszakán át inkubáljuk.
A konjugáció befejeződése után a nem konjugálódott (szabad)
HSA( —DTPA)-t 50% telítettségű (NH4)2SO4 oldattal csapjuk ki addig, amíg HSA(-DTPA) marad az oldatban. A csapadékot néhányszor 50% telítettségű (NH4)2SO4 oldattal mossuk és nagyon kis térfogatú 0,1 M/l nátrium-foszfát, 5 mM/Ι EDTA tartalmú pufferben, pH= 7,5 oldjuk fel. Az oldatot EDTA-foszfát pufferrel (A puffer, nem tartalmaz NaCl-ot!!) egyensúlyba hozott Sephadex G25 oszlopon kromatografáljuk. A fehérjetartalmú frakciót egy A pufferrel egyensúlyba hozott Q-Sepharose (Fást Flow) oszlopra visszük a nem konjugálódott monomereket az immunkonjugátumtól anioncserélő kromatográfiával történő elválasztása céljából. A mintafelvitel után a Q-Sepharose oszlopot az A pufferrel addig mossuk, míg az A280 alapszintre vissza nem jut. Az oszlopon maradt fehérjéket a NaCl koncentrációnak 0-0,6 M/l tartományban való lépcsőzetes növelésével eluáljuk.
A nem konjugálódott monomerek nagy része a kizárási térfogatban eluálódnak, míg az immunkonjugátumok a HSA(-DTPA) savas jellege miatt visszamaradnak és 0,3-0.4 M/l NaCl-ot tartalmazó A pufferrel eluálódnak. Az immunkonjugátumok Sephadex G25 oszlopon való sómentesítése után a végterméket 0,2 μτη membránon történő szűréssel sterilizáljuk és kis részletekben felhasználásig 4°C-on tároljuk.
2.PÉLDA
IgM Fab'-HSA(-DTPA) konjugátumok készítése
Az IgM-et pepszinnel emésztjük Putnam eljárása szerint.
Röviden összefoglalva: 2-5 mg/ml koncentrációjú teljes IgM 0,1 M/l nátrium-acetát pufferben, pH= 4,0 lévő oldatát pepszinnel (0,08-0,2 mg/ml) inkubáljuk 8 órán át 4°C-on. A reakciókeveréket • 9
- 9 az A pufferrel egyensúlyba hozott Fractogel HW 55S oszlopon kromatografáljuk az F(ab')2 fragmentumoknak az emésztetlen IgMtől és a kis molekulatömegű fragmentumoktól való tisztítása céljából. Ezzel az eljárással kromatográfiásan tiszta F(ab')2 fragmentumot 40-60 %-os termeléssel állítunk elő. Az F(ab')2 fragmentumot DTT-vel redukáljuk és HSA(-DTPA)-hoz kapcsoljuk a monomereknél ismertetett módon.
Az F(ab’)2-HSA(-DTPA) tisztítását Q-Sepharose oszlopon való anioncserélő kromatográfiával és Fractogel oszlopon történő gélszűréssel végezzük a fent ismertetett módon. A végterméket szűréssel sterilizáljuk és 4°C-on tároljuk.
3.PÉLDA
IgM, IgM monomerek, IgM F(ab')2 fragmentumok, igM monomerHSA(-DTPA) és IgM Fab'-HSA(-DTPA) immunkonjugátumok immunreaktivitása
Az immunreaktivitást antigén kötődési vizsgálattal vagy kompetíciós EIA vizsgálattal végezzük.
Az antigén kötődési vizsgálat (pont-blot EIA) során a vizsgálandó minta különböző hígításait Immobilon membránra visszük egy Biorad Trans blottoló készülék felhasználásával. A fehérjekötő helyek feleslegét 5 % sovány tejjel blokkoljuk, majd ezután a membránt peroxidázzal jelzett antigénnel inkubáljuk PBS pufferben 2 óráig szobahőmérsékleten. Az antigént tartalmazó oldatot leöntjük és a membránt háromszor PBS-Tween pufferrel mossuk és borinol enzimet, 2 mM/Ι hidrogén-peroxidot, 0,6 mg/ml diamino-benzidint és hidrogéndonorként 0,6 mg/ml CoC12-ot tartalmazó szubsztrát oldat segítségével mérjük. Lila színű pontok válnak láthatóvá 5 perc inkubálás után. A szín erősségét
Biorad Gél Scanner segítségével mérjük.
A kompetíciós EIA során a vizsgálandó minta különböző hígításait egy adott mennyiségű peroxidázzal jelzett teljes IgMmel inkubáljuk 3 óráig szobahőmérsékleten 0,1 μ9/ιη1 koncentrációjú antigénoldattal fedett mikrotitráló lemezen. Inkubálás után a lemez lyukainak tartalmát kiöntjük és a lemezt háromszor PBS-Tween pufferrel mossuk. Az enzim aktivitását hidrogéndonorként tetrametil-benzidin tartalmazó szubsztrátoldat segítségével mérjük. Az enzimreakciót 2 M/l H2SO4 hozzáadásával állítjuk le és a minták abszorbanciáját 450 nm-en leolvassuk.
Mindkét vizsgálat összehasonlítható eredményt ad az IgM, az IgM fragmentumok és az immunkonjugátumok immunreaktivitását tekintve.
A tisztított monomerek specifikus immunreaktivitása (=IR/tömeg) 0,001-0,05-szöröse a kezeletlen, teljes IgM-nél tapasztalt értéknél, míg az F(ab')2 fragmentumok nem reagálnak az alkalmazott vizsgálatokban. A monomerek tisztított HSA(-DTPA) konjugátumai azonban az IgM-mel azonos immunreaktivitást mutatnak és az F(ab')-HSA(-DTPA) konjugátumok a tisztított monomerekkel hasonló IR-t adnak.
Összefoglalva tehát az IgM kovalens kötése pl. diszulfidvagy tioészter-hidakon keresztül egy (hordozó) fehérjéhez képes megtartani az IgM monomerek vagy fragmentumai IR-ét a monomerekhez képest számottevő mértékben vagy akár teljes mértékben.
4.PÉLDA
Enzim-konjugátum előállítása
Enzim-konjugátumokat kétféleképpen állíthatunk elő:
A: SPDP-aktivált enzimekkel való direkt konjugációval,
B: A monomer DTNB-vel történő aktiválásával, majd egy szabad SH csoporttal rendelkező enzimmel való reakcióval.
4.1. A eljárás
Az enzimhez (10 mg/ml 0,1 M/l Na2HPO4/NaH2PO4 pH= 7,5; 0,1 M/l NaCl tartalmú pufferben) 1/10 térfogatnyi 40 mM/Ι SPDP-t (abszolút etanolban oldva) adunk és 30 percig szobahőmérsékleten sötétben inkubáljuk. A reakciókeveréket a pufferrel egyensúlyba hozott Sephadex G25 (M) oszlopon kromatografáljuk a nem reagált SPDP eltávolítása céljából. Az SPDP-vel aktivált enzimet az IgM monomerhez adjuk 1:1 (t/t) arányban (amit szintén a fenti pufferrel egyensúlyba hozott Sephadex G25 (M) oszlopon kromatografálunk az enzim hozzáadása előtt).
A reakciókeveréket 16 órán át szobahőmérsékleten sötétben inkubáljuk. A konjugátumot azonos térfogatú 100 %-os telítettségű ammónium-szulfáttal mossuk mielőtt a megfelelő pufferben feloldjuk.
Megjegyzés: Ez utóbbi lépéseket HRP enzim esetén alkalmazzuk, más enzim esetén egyéb tisztítási eljárások lehetnek szükségesek.
4.2. nB eljárás
Az enzim aktiválása: Először az enzimet SPDP-vel aktiváljuk az A eljárásban ismertett módon. Az aktivált enzimet 0,1 M/l nátrium-acetát pH= 4,5 + 0,1 M/l NaCl pufferrel egyensúlyba hozott Sephadex G25 (M) oszlopon kromatografáljuk. Az enzimet tartalmazó frakcióhoz 1/20 térfogatnyi 1 M/l DTT-t adunk és legalább 30 percig sötétben szobahőmérsékleten inkubáljuk.
A kapcsolás előtt ezt a keveréket Sephadex G25 (M) oszlopon kromatografáljuk az IgM monomer- enzim konjugátum előállításánál
ismertetett módon.
4.3. Monomerizálás (Humán) IgM-et 37°C-on 3 órán át a következő nitrogéngázzal telített oldatban monomerizáljuk:
mM/Ι Na2HPO4/NaH2PO4, pH= 6,5 mM/Ι NaCl,
0,1 g/1 NaN3, mM/Ι cisztein,
0,5 U papain/g IgM és
1-10 g/1 IgM.
Az inkubálás után azonos térfogatú 100 %-os telítettségű ammónium-szulfátot adunk a reakciókeverékhez.
Legalább 2 óra 4°C-on való állás után a csapadékot centrifugálással nyerjük ki és az alábbi oldatban oldjuk fel:
mM/Ι Tris-HCl pH= 8,
140 mM/Ι NaCl és mM/Ι cisztein.
Az oldatban maradó ammónium-szulfát eltávolítása céljából a kapott oldatot a fenti pufferben Sephadex G25 (M) oszlopon kromatogra fáljuk.
4.4. Az IgM monomer tisztítása
A fenti oldatot Fractogel HW 55 (S) oszlopon kromatografáljuk, amit ugyanazzal a pufferrel hozunk egyensúlyba. A monomert tartalmazó frakciókat (általában a második fehérjecsúcs) összegyűjtjük és azonos térfogatú, az 1 mM/Ι cisztein oldatban 100 %-os telítettségű ammónium-szulfát hozzáadásával koncentráljuk. A csapadékot összegyűjtjük és konjugáláshoz használjuk fel.
4.5. A monomer IgM aktiválása
A monomer IgM-et Sephadex G25 (M) oszlopon kromatografáljuk:
mM/1 Tris-HCl pH= 8,0
140 mM/1 NaCl és mM/1 cisztein.
Ehhez az oldathoz milliliterenként 15 mg DTNB-t adunk (szilárd állapotban) és hagyjuk feloldódni. A reakciókeveréket 16 órán át szobahőmérsékleten sötétben inkubáljuk. A szabad DTNB-t előzőleg 0,1 M/l Na2HPO4/NaH2PO4, pH= 7,5 + 0,1 M/l NaCl pufferrel egyensúlyba hozott Sephadex G25 (M) oszlopon való kromatográfiával távolítjuk el.
A monomerek DTNB-vel való aktivációjának mértékét a következő módon határozhatjuk meg:
E280 a monomer koncentrációja= --------------------------- M(=A)
1,45 x molekulatömeg (=180000)
E330
DTNB koncentrációja=-------------Μ (= B)
9217
DTN B monomer A
Konjugálás: Az aktivált HRP-t és az aktivált monomer IgM-et
- 14 egymáshoz adjuk 1:1 (t/t) arányban. Szobahőmérsékleten sötétben 16 órán át inkubáljuk. Ezután a konjugátumot az A eljárásban ismertetett módon tisztítjuk.
4.6.
Az enzim-konjugátum immunreaktivitását úgy határozzuk meg, hogy a konjugátumot a 16.88 és a 81AV78 jelű monoklonális antitestek (lásd l.ábra) által felismert antigéneket expresszáló tumor sejtvonal tisztítatlan antigénkeverékével fedett mikrotitráló lemezhez adjuk és inkubáljuk. A 16.88 jelű monoklonális antitest specifikusan egy, citokeratmokon levő tumor-asszociált epitópot ismer fel, míg a 81AV78 jelű monoklonális antitest egy, a sejtek felszínén lévő tumorasszociált antigénnel reagál.
Egy mielóma IgM indifferens antitesttel hasonlóan készített konjugátum nem rendelkezik reaktivitással tumor sejtek vagy sejtvonalak irányában és nem kötődik a tisztítatlan antigén preparátumhoz.
A mielóma egy olyan antitest (IgM), amely olyan antigént ismer fel, ami nincs jelen a fenti antigénkeverékben.

Claims (11)

  1. - 15 SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Immunreaktív vegyület, azzal jellemezve, hogy abban az IgM vagy IgA antigénkötő fragmentumát legalább egy polipeptidhez kapcsoljuk.
  2. 2. Az 1.igénypont szerinti immunreaktív vegyület, azzal jellemezve, hogy abban az IgM vagy IgA fragmentum humán eredetű.
  3. 3. Az 1-2.igénypont szerinti immunreaktív vegyület, azzal jellemezve, hogy abban az IgM vagy IgA egy tumorasszociált antigén ellen irányul.
  4. 4. Az 1-3.igénypont szerinti immunreaktív vegyület, azzal j ellemezve , hogy a polipeptid humán eredetű fehérje.
  5. 5. Az 1-4.igénypont szerinti immunreaktív vegyület, azzal jellemezve, hogy a polipeptid humán szérum albumin vagy annak egy fragmentuma.
  6. 6. Az 1-4.igénypont szerinti immunreaktív vegyület, azzal jellemezve, hogy a polipeptid egy enzim.
  7. 7. Az 1-6.igénypont szerinti immunreaktív vegyület, azzal jellemezve , hogy a polipeptidhez egy vagy több jelzés van kapcsolva.
  8. 8. Az 1-7.igénypont szerinti immunreaktív vegyület, azzal jellemezve, hogy a fragmentum egy IgM vagy IgA monomer.
  9. 9. Az 1-8.igénypont szerinti immunreaktív vegyület, azzal jellemezve, hogy a fragmentum IgM vagy IgA F(ab')2 fragmentuma.
  10. 10. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy az 1-8. igénypont szerinti immunreaktív vegyületet tartalmazza, melyhez legalább egy tumorölő képességgel rendelkező vegyületet kapcsolunk.
  11. 11. Készítmény rákos betegségek diagnózisára, azzal j e
    1 lemezve, hogy az 1-9. igénypont szerinti immunreaktív vegyületet tartalmazza, melyhez legalább egy diagnosztikailag hasznos csoportot kapcsolunk.
    A meghatalmazott:
    danubia ésVédtej 28. í ( K.
    KÖZZÉTÉTELI
    PÉLDÁNY x • · ·
    I'
    633 4 3
HU9204170A 1990-07-03 1991-06-28 Process for producing immunereactive compounds HUT63343A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP90201781 1990-07-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9204170D0 HU9204170D0 (en) 1993-04-28
HUT63343A true HUT63343A (en) 1993-08-30

Family

ID=8205056

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9204170A HUT63343A (en) 1990-07-03 1991-06-28 Process for producing immunereactive compounds

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP0537222A1 (hu)
JP (1) JPH05507924A (hu)
KR (1) KR930701201A (hu)
CA (1) CA2086531A1 (hu)
FI (1) FI925804A0 (hu)
HU (1) HUT63343A (hu)
WO (1) WO1992000763A1 (hu)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9824632D0 (en) * 1998-11-10 1999-01-06 Celltech Therapeutics Ltd Biological compounds

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU556548B2 (en) * 1980-03-03 1986-11-06 Milton David Goldenberg Tumor localization and therapy with labeled antibodies and antibody fragments specific to tumor-associated markers
CA1168150A (en) * 1981-12-18 1984-05-29 The Governors Of The University Of Alberta Targeting conjugates of albumin and therapeutic agents
NZ210867A (en) * 1984-01-31 1989-01-06 Litton Bionetics Inc Tumour-specific monoclonal antibodies, production thereof and use
EP0293524A1 (en) * 1987-06-02 1988-12-07 Vasocor Atherosclerotic plaque immunoassay
EP0295719A3 (en) * 1987-06-19 1989-12-20 The Agouron Institute The sm-d antigen, the cloning of the sm-d antigen and the detection of systemic lupus erythematosus by using the sm-d antigen
ATE82136T1 (de) * 1987-08-10 1992-11-15 Miles Inc Gereinigtes igm.
US4937183A (en) * 1988-02-03 1990-06-26 Cytogen Corporation Method for the preparation of antibody-fragment conjugates
EP0398872A1 (en) * 1988-02-12 1990-11-28 HighTech Receptor AB Immunoglobulin binding substance, subfragments, a process for preparing thereof, reagent kit and immunoglobulin binding organisms
US4983529A (en) * 1988-06-10 1991-01-08 Abbott Laboratories Immunoassay for HIV-I antigens using F(AB')2 fragments as probe
KR900005995A (ko) * 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
WO1990011091A1 (en) * 1989-03-27 1990-10-04 Centocor, Inc. FORMULATIONS FOR STABILIZING OF IgM ANTIBODIES

Also Published As

Publication number Publication date
HU9204170D0 (en) 1993-04-28
WO1992000763A1 (en) 1992-01-23
JPH05507924A (ja) 1993-11-11
KR930701201A (ko) 1993-06-11
FI925804A (fi) 1992-12-21
EP0537222A1 (en) 1993-04-21
CA2086531A1 (en) 1992-01-04
FI925804A0 (fi) 1992-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU622415B2 (en) Immunoconjugates joined by thioether bonds having reduced toxicity and improved selectivity
US4698420A (en) Antibody hybrid molecules and process for their preparation
JP2942356B2 (ja) 毒素および薬剤を含む治療用複合体
AU636872B2 (en) Cross-linked antibodies and processes for their preparation
JPS61500789A (ja) モノクロ−ナル抗−ヒト乳癌抗体
JPS58208238A (ja) 共有結合によつて酵素と抗体を結合させる新しい共役物とこの共役物を用いた医薬会合
WO1983000810A1 (en) Selective carcinostatic agent
Haenseler et al. Activation of methotrexate-. alpha.-alanine by carboxypeptidase A monoclonal antibody conjugate
US5354554A (en) Crosslinked antibodies and processes for their preparation
CA1340612C (en) Cell specific cytotoxic agents derived from diphtheria toxin
CA2319688A1 (en) Specific antibodies against mammary tumor-associated mucin, method for production and use
HUT56288A (en) Crosslinked antibodies and process for their production
JPH01294638A (ja) 開裂性免疫接合体
AU770069B2 (en) Boron neutron capture therapy using pre-targeting methods
AU8158787A (en) Methods for improved targeting of antibody, antibody fragments, hormones and other targeting agents, and conjugates thereof
Esswein et al. Construction and chemotherapeutic potential of carboxypeptidase-A/monoclonal antibody conjugate
HUT63343A (en) Process for producing immunereactive compounds
JPS63215638A (ja) 接合体
AU8063591A (en) Immunoreactive compound
PT100568A (pt) Anticorpos monoclonais e antigeneos para o melanoma humano
EP0650735A2 (en) Kit and method for pretargeting
Sheldon et al. Targeting of [111In] biocytin to cultured ovarian adenocarcinoma cells using covalent monoclonal antibody—Streptavidin conjugates
AU678474B2 (en) Kit and method for pretargeting
WO1996000087A2 (en) Kit for pretargeting and novel pretargeting conjugates
JPH06157346A (ja) 選択性制癌剤

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary prot. cancelled due to non-payment of fee