HUT61323A - And treating htlv-1 peptides and antibodies against them for diagnosting htlv-1 infection and for vaccination against it - Google Patents
And treating htlv-1 peptides and antibodies against them for diagnosting htlv-1 infection and for vaccination against it Download PDFInfo
- Publication number
- HUT61323A HUT61323A HU906639A HU663990A HUT61323A HU T61323 A HUT61323 A HU T61323A HU 906639 A HU906639 A HU 906639A HU 663990 A HU663990 A HU 663990A HU T61323 A HUT61323 A HU T61323A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- ser
- leu
- pro
- htlv
- lys
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 211
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 128
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title abstract description 15
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 title description 3
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 claims abstract description 135
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 45
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 25
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 22
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 16
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 13
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 6
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 5
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 47
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 41
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 6
- 208000027814 HTLV-2 infection Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 40
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 39
- 241000714259 Human T-lymphotropic virus 2 Species 0.000 description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 29
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 29
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 28
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 27
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 26
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 description 21
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 20
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 19
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 19
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 11
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 11
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 11
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 11
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 10
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 9
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 9
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 7
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 6
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 6
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 206010044696 Tropical spastic paresis Diseases 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 208000006961 tropical spastic paraparesis Diseases 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 5
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 5
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 4
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 4
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 4
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N Dimethyl sulfide Chemical compound CSC QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- DMBKPDOAQVGTST-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-3-phenylmethoxypropanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)COCC1=CC=CC=C1 DMBKPDOAQVGTST-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N anisole Chemical compound COC1=CC=CC=C1 RDOXTESZEPMUJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 2
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- VRTXRNJMNFVTOM-ZDUSSCGKSA-N (2r)-3-[(4-methoxyphenyl)methylsulfanyl]-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound COC1=CC=C(CSC[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C=C1 VRTXRNJMNFVTOM-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- ZQEBQGAAWMOMAI-ZETCQYMHSA-N (2s)-1-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O ZQEBQGAAWMOMAI-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- ZYJPUMXJBDHSIF-NSHDSACASA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-3-phenylpropanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZYJPUMXJBDHSIF-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- IMUSLIHRIYOHEV-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-4-methylsulfanylbutanoic acid Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C IMUSLIHRIYOHEV-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- SOHLZANWVLCPHK-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-4-oxo-4-phenylmethoxybutanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(=O)OCC1=CC=CC=C1 SOHLZANWVLCPHK-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- AJDUMMXHVCMISJ-ZDUSSCGKSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-5-oxo-5-phenylmethoxypentanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(=O)OCC1=CC=CC=C1 AJDUMMXHVCMISJ-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- QVHJQCGUWFKTSE-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)OC(C)(C)C QVHJQCGUWFKTSE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- WXYGVKADAIJGHB-ZDUSSCGKSA-N (2s)-3-(1h-indol-2-yl)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2NC(C[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)=CC2=C1 WXYGVKADAIJGHB-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- DCLJSEPKYJSEHW-HNNXBMFYSA-N (2s)-3-[1-(4-methylphenyl)sulfonylimidazol-4-yl]-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N1C=C(C[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)N=C1 DCLJSEPKYJSEHW-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- UYWMYJQSTUVRHR-SFHVURJKSA-N (2s)-3-[4-[(2-bromophenyl)methoxycarbonyloxy]phenyl]-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound C1=CC(C[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)=CC=C1OC(=O)OCC1=CC=CC=C1Br UYWMYJQSTUVRHR-SFHVURJKSA-N 0.000 description 1
- SZXBQTSZISFIAO-ZETCQYMHSA-N (2s)-3-methyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]butanoic acid Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C SZXBQTSZISFIAO-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- WBIIPXYJAMICNU-AWEZNQCLSA-N (2s)-5-[amino-[(4-methylphenyl)sulfonylamino]methylidene]azaniumyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentanoate Chemical compound CC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C=C1 WBIIPXYJAMICNU-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- VVNYDCGZZSTUBC-LURJTMIESA-N (2s)-5-amino-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O VVNYDCGZZSTUBC-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- VRPJIFMKZZEXLR-UHFFFAOYSA-N 2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]acetic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NCC(O)=O VRPJIFMKZZEXLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710174880 Capsid vertex protein Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100024458 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A Human genes 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700010908 HIV-1 proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700010909 HTLV-1 proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282821 Hippopotamus Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 208000030289 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-asparagine Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FYYSQDHBALBGHX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- MDXGYYOJGPFFJL-QMMMGPOBSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C MDXGYYOJGPFFJL-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 241001043922 Pensacola Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 1
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical group C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- VWYLMMNTUOUYCT-UHFFFAOYSA-N benzyl carbonobromidate Chemical compound BrC(=O)OCC1=CC=CC=C1 VWYLMMNTUOUYCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N methoxybenzene Substances CCCCOC=C UZKWTJUDCOPSNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N phosphamidon Chemical compound CCN(CC)C(=O)C(\Cl)=C(/C)OP(=O)(OC)OC RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- WHMDPDGBKYUEMW-UHFFFAOYSA-N pyridine-2-thiol Chemical compound SC1=CC=CC=N1 WHMDPDGBKYUEMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229940126577 synthetic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 125000006253 t-butylcarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(C(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/14011—Deltaretrovirus, e.g. bovine leukeamia virus
- C12N2740/14022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
A találmány HTLV-1 peptidekre és azok elleni antitestekre, és az antitestek HTLV-1 fertőzések diagnosztizálásában, kezelésében és azok elleni vakcinálásban való felhasználására vonatkozik.
Közelebbről a találmány olyan peptidekre vonatkozik, amelyeknek a szekvenciája megfelel a HTLV-1 immunológiailag fontos proteinje antigén területének. Ezek a peptidek diagnosztikai reagensként alkalmazhatók HTLV-1 antitestek jelenlétének kimutatására, továbbá immunogénként HTLV-1 elleni antitestek állatban és emberben való képződésének kiváltására szolgáló kompozíciókban és módszerekben.
A HTLV-l-t (humán T-sejt limfotropikus vírus I. típus) az aduit T-sejt leukémia/limfóma (ATL) kiváltó okaként azonosították [lásd pl. Sarngadharan és munkatársai, Virology 1345-1371. oldal: Humán T-cell Leukémia Viruses, kiadó: B. N. Fields és munkatársai (1985)]. A vírus a Földön leginkább a Japán déli részén levő Kyushu szigeten elterjedt, ahol a lakosságnak mintegy 15 %-a fertőzött. Nemrégiben úgy találták, hogy a trópusi görcsös paraparezisként (TSP) ismert trópusi paralízis szintén összefüggésbe hozható a HTLV-1 fertőzéssel [Rogers-Johnson és munkatársai, HTLV-1 and HTLV-III and Tropical Spastic Paraparesis, Lanclet, II1247 (1985); Vernant és munkatársai, Endemic Tropical Spastic Paraparesis Associated with Humán T-Lymphotropic Virus Type I: A Clinical Seroepidemiological Study of 25 Cases, Ann. Neurol., 21, 123 (1987)]. A trópusokon a TSP hasonlóan elterjedt és hasonló jelentőségű, mint a szkleróz s multiplex a nyugati világban [Marx, Leukémia Virus Linked • · to Nerve Disease, Science, 236, 1059-1061 (1987)].
A HTLV-l és a humán T-sejt limfotropikus vírus II. típus (HTLV-2) antigén szempontból rokonai az onkogén retrovírusok családjának, amelyek a T-limfociták tropizmusát és limfoproliferatív betegségeket okoznak. A HTLV-l és HTLV-2 közötti homológra mértékének következtében a szerológiai vizsgálatok nem voltak képesek különbséget tenni a HTLV-l és HTLV-2 fertőzések között. A HTLV-l és HTLV-2 egyértelmű megkülönböztetéséhez a vírust izolálni kell és/vagy molekuláris azonosításra van szükség. Bár a HTLV-2-t kimondottan nem hozták összefüggésbe humán betegségekkel, olyan intravénás drog-fogyasztók (IVDA), akikről korábban úgy gondolták, hogy HTLV-l-fertőzöttek, most HTLV-2-fertőzötteknek bizonyultak. Feltételezik, hogy a HTLV-2 fertőzés az IVDA-k között egészen átalános [Tedder és munkatársai, Low Prevalence in UK of HTLV-l and HTLV-2 Infection in Subjects with AIDS, with Extended Lymphodenopasthy, and Risk of AIDS”, Lanclet, 2, 125-128; Robert-Gurott és munkatársai, Prevalence of Antibodies to HTLV-l, -II and -III in Intravenous Drug Abusers from AIDS Endemic Region, J.A.M.A., 255, 3133-3137 (1986)]. Tekintettel a HTLV-2 és az AIDS kapcsolatára, a vírus izolálása különösen bonyolult és veszélyes. Ezért nagyon hasznos lenne, ha különbséget tudnánk tenni a HTLV-l és HTLV-2 fertőzés között anélkül, hogy a vírust izolálni és azzal dolgozni kellene. A nem-fertőzött vér biztosítására szintén fontos egy olyan automatikus vérvizsgáló módszer, amely egyszerűen detektálja a HTLV-l-t, és külömbséget tesz a HTLV-l és HTLV-2 között.
• · ·
- 4 A HTLV-1 fertőzés detektálására szolgáló módszerek általában a vér, szérum és a vérből készült termékek HTLV-1 antigén tartalmát jelzik és annak mennyiségét mérik. Az ilyen vizsgálatok az ATL és TSP diagnosztizálására, valamint vér és vér-termékek HTLV-1 fertőzöttségének vizsgálatára, és így a további fertőzések megakadályozására használhatók.
A HTLV-1 fertőzések diagnosztizálására és annak vizsgálatára jelenleg végzett kísérletek, hogy az illető termék ki volt-e téve HTLV-l-nek, az enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálaton (ELISA) alapszanak, amellyel a vizsgált mintában a HTLV-1 immunogén komponensei elleni antitestek jelenlétét mutatják ki. Más módszerek a Western foltképzési eljáráson alapszanak, amellyel a vizsgált mintában a HTLV-1re fajlagos antitesteket mutatják ki. Általában szinte minden ismert immunvizsgálat, beleértve a radioimmunvizsgálatot, agglutinációs tesztet vagy indirekt immunfluoreszcenciát, továbbá az ELISA és a Western foltképzés adaptálható a HTLV-1 és antitestjei kimuntatására fajlagos reagensek felhasználásával.
Az ezen vizsgálatokban használt antigének lehetnek HTLV-l-gyel fertőzött T-sejtekből nyert antigének és rekombináns DNS technikával előállított antigének. Ezen antigének használatának azonban jelentős hátrányai vannak.
A HTLV-1 sejtvonalak segítségével történő előállítását szigorú biztonsági intézkedéseknek (P3 biztonsági kategória) megfelelő laboratóriumban kell végezni, mivel a dolgozók veszélynek vannak kitéve a vírussal végzett munka során. Az is valószínű, hogy a T-sejtekből származó HTLV-1 an • · · · · · ·
- 5 tigén hamis negatív, illetve hamis pozitív eredményt adhat az ELISA tesztben. így például analóg módon, az AIDS vírussal történt fertőzöttség vizsgálatakor hamis negatív, illetve hamis pozitív eredményeket észleltek az ELISA teszttel, amikor sejtvonalakból nyert teljes HIV-1 vírus antigént alkalmaztak [Gurtler és munkatársai, Sensitivity and Specificity of Commercial ELISA Kits fór screening AntiLAV/HTLV-III J. Virol. Met., 15, 11-23(1987)]. A Western foltképzéssel végzett vizsgálat, amelyben teljes vírus antigént használnak, nagyobb fajlagosságot mutat, azonban sokkal munka- és időigényesebb, mint az ELISA módszer. Ezenkívül, mivel a HTLV-1 termelő sejtek humán eredetűek, az ezen sejtvonalakkal előállított vírus antigén preparátumok normál sejt-antigénekkel, például HLA antigénekkel lehetnek szenynyezve - hacsak nincsenek nagyon alaposan tisztítva - , amelyek hamis pozitív reakciót adhatnak az ELISA tesztben.
A sejtvonalakból nyert vírus antigének alapos tisztítása esetleg szintén károsíthatja vagy megsemmisítheti az immunogén szempontból fontos fehérjék immunogenitását vagy egyéb módon inaktiválhatja az antigéneket, és így a kapott reagensek hamis negatív reakciót adnak. Emellett hamis negatív reakciót kaphatunk élő vírusból kapott antigének használatakor is a sztérikus gátlás miatt, amikor az antitestek nem tudnak reagálni fajlagos antigénjükkel, mivel a reakcióelegyben jelen levő más antigének és antitestek blokkolják a rekaciót. Élő vírusból izolált fehérjék szintén alkalmatlanok lehetnek vakcinálás céljára a szennyező teljes vírus, illetve a víruseredetű genetikai anyag által képviselt rizi • · ·
- 6 kő miatt.
A HTLV-1 fertőzés kimutatására szolgáló ELISA tesztben szítén alkalmazhatók immunológiai szempontból fontos vírusfehérjék, amelyeket a HTLV-1 genom részeinek baktériumokban végzett klónozásával állítottunk elő. A HTLV-1 teljes nukleotid-szekvenciáját Seiki és munkatársai ismertették a Humán Aduit T-cell Leukémia Vírus: Complete Nucleotide Sequence of the Provirus Genome Integrated in Leukémia Cell DNA, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 80, 3618-3622 (1983) irodalmi helyen, úgy tűnik, hogy a vírusburok glikoproteinek és burok fehérjék, amelyeket a HTLV-1 env és qaq génjei kódolnak, azok az antigének, amelyeket a HTLV-1 fertőzött betegek szérumában levő antitestek felismernek.
A vírus burokban jelen levő immunológiailag fontos HTLV-1 antigének előállíthatok a HTLV-1 genom részeinek különböző expressziós vektor rendszerekbe, például baktériumokba, élesztőkbe vagy vakciniákba történő klónozásával. Az ilyen rekombináns antigének alkalmazhatók a dignosztizálás területén és potenciálisan vakcina készítményekben, úgy mint a HIV-1 proteinek. [Lásd pl. Cabradilla és munkatársai, Serodiagnosis of Antibodies to the Humán AIDS Retrovirus with a Bacterial Synthesized env Polypeptide”, Biotechnology 4, 128-133 (1986); Chang és munkatársai, Detection of Antibodies to Humán T-cell Lymphotropic Virus-III (HTLV-III) with an Immunoassay Employing a Recombinant Escherichia coli -Derived Viral Antigenic Peptide, Bio/technology 3., 905-909 (1985); Putney és munkatársai, HTLV-III/LAV-Neutralizing Antibodies to an E. coli-Produced Fragment of the Vírus • · · • · · · ·«·· ····
- 7 Envelope, Science 234, 1392-1395 (1986); Kieny és munkatársai, AIDS Vírus env Protein Expressed from a Recombinant Vaccinai Vírus, Bio/technology 4, 790-795 (1986).] A rekombináns DNS technikával előállított HTLV-1 antigéneket azonban még alaposan tisztítani kell az ELISA tesztben adott hamis pozitív reakciók elkerülse érdekében, amelyek a HTLV-1 antigén készítményben szennyezésként jelen levő, a kifejező rendszer antigénjeivel reaktív bármely antitest jelenléte következtében fordulhatnak elő. A HTLV-1 antigének tisztítás során bekövetkező denaturálódása szintén károsíthatja a fontos antigén aktivitást.
Vakcinák esetén a baktériumokból és élesztőkből kinyert rekombináns fehérjék gyakran baktérium, illetve élesztő eredetű proteinekkel szennyezettek. Az ilyen szennyezéseknek már egészen kis mennyisége is káros reakciókat okozhat.
Bár a rekombináns technikákkal előállított HTLV-1 antigének fejlődést képviselnek a vírussal fertőzött sejttenyészetek segítségével előállított antigénekhez képest, a rekombináns fehérjék azonban még sem eredményezik a lehető legpontosabb diagnosztikai reagenseket. A betegség természete és a pontos eredmények szükségessége miatt olyan reagensek kifejlesztésére van szükség, amelyek a HTLV-1 diagnosztizálásában megközelítik a 100 %-os pontosságot és fajlagosságot.
A fehérjék számos epitopot, illetve antigén determinánst tartalmaznak, amelyek a fehérjének azt a területét képviselik, ahol a fajlagos antitestek kötőhelye található.
• · · ···· ···· ····
- 8 A fehérjék általában 5-10 epitopot tartalmaznak, ezek mindegyike egy 6-8 aminosavat tartalmazó szekvenciából áll. Az epitopok lehetnek folyamatosak, ilyenkor a 6-8 aminosav lineáris szekvenciát alkot, vagy nem-folyamatosak, ilyenkor az epitopot alkotó aminosavak a fehérje három dimenziós összehajtogatódása következtében kerülnek össze. Annak ellenére, hogy az epitopot csak viszonylag kevés aminosav alkotja, az epitop antitesttel szembeni reaktivitását nagy mértékben befolyásolják a fehérjében található, az epitopot körlülvevő aminosavak.
A fehérjék antigén helyeinek és epitopjainak feltérképezésére végzett vizsgálatokat az illető proteinek különböző területeinek megfelelő szintetikus peptidek segítségével folytatták le [lásd pl. Lerner és munkatársai, The Biology of Immunological Disease: A Hospital Practice Boook, The Development of Synthetic Vaccines 331-338 old. (kiadó: Dixon And Fischer, 1983); Lerner, Antibodies of Predetermined Specificity in Biology and Medicine Adv. Immunoi., 36 1, (1984)]. Az epitopok a hidrofób szekvenciákban fordulnak elő, amelyek valszínűleg a fehérje felületén található aminosavmaradékoknak felelnek meg. Néhány a fehérjék összehajtogatódása alapján megjósolt módszert kidolgoztak. Ezek a módszerek azonban csak korlátozottan használhatók, mivel az immunrendszer antigénként megjelenő sejtjei a fehérjéket olyan epitopok termelésére késztetik amelyek nem feltétlenül felelnek meg a fehérje felületén levőknek. Ezek az epitopok azok, amelyekre az immunrendszer válaszképpen antitesteket termel, ezért nem lehet eleve megjósolni, hogy a fehérje • »* • · · ·
- 9 melyik szekvenciája lesz az az epitop, amelyet az immunrendszer felismer. Az ilyen epitopokat képviselő fehérjék különösen hasznosak diagnosztikai célokra.
A mintegy 100 aminosav hosszúságú vagy ennél hosszabb rekombináns peptidek összehajfogatodnak, és olyan tercier szerkezetet vesznek fel, amely hasonlít az eredeti fehérje szerkezetére, és így lehetővé válik a nem-folyamatos epitopok kialakulása. A lineáris belső epitopok azonban a molekulán belül fajlagos antitestjeik számára hozzáférhetetlen módon el lehetnek rejtve.
Az epitopok feltérképezése során mutatott hasznosságuk mellett a szintetikus peptidek - ha egy fehérje nagy antigén determinánsaihoz társul - immunogén kompozíciókban, például vakcinákban vagy diagnosztikai reagensekben is használhatók. A peptidek számos előnnyel rendelkeznek a fajlagos antitest termelésben és reaktivitásban. A peptid pontos szekvenciája kiválasztható a fehérje aminosav-szekvenciájának meghatározása alapján vagy megjósolható a proteint kódoló DNS-szekvencia alapján. A fajlagos szintetikus peptidek használata kiküszöböli azt, hogy a teljes hosszúságú fehérjét kelljen használni a fajlagos antitest termelése vagy annak vizsgálata során. Emellett a Merrifield és munkatársai féle szilárd fázisú peptidszintézis a kérdéses peptid lényegében véve korlátlan mennyiségben végzett kémiai szintézisét teszi lehtővé [lásd pl. Erickson és Merrifield, Solid Phase Peptide Synthesis, The Proteins, 3. kiadás (1976), 2. kötet, Academic Press New York (3. fejezet)]. A módszert tovább könnyítette az automatizált peptid-szintetizátorok hoz• · · ···· · · · · ··*·
- 10 záférhetősége.
Bár számos kritérium használható annak meghatározására, hogy a fehérje mely területei immundeterminánsok, az ilyen területeknek megfelelő peptidek nem mindig használhatók nagy mennyiségű minta átvizsgálására és diagnosztizálásra, mivel az antigenitás eltűnhet, mert a peptid nem a megfelelő térszerkezetű ahhoz, hogy a proteinnel reagáló antitestek felismerjék. Ezenkívül - mint ahogyan a HIV-1 és HIV2 esetén különösen nyilvánvaló - jelentős genetikai változatosság van a két víruscsoporton belül, ami a vírusok számos szerotípusát eredményezi. Ez jelentős bizonytalanságot jelent abból a szempontból, hogy a fehérjének melyik részét válasszuk arra, hogy peptidet képezzünk átvizsgálás! és diagnosztikai célra, valamint vakcina előállításához. A HIV-1 és HIV-2 bizonyos immundomináns részeit azonban viszonylag változatlannak találták.
Nemrégen a két vírus env génje által kódolt, ilyen a HIV-1 gpl20 és gp41 felületi glikoproteinjei és a megfelelő HIV-2 proteinek külömböző immundomináns területének megfelelő immunológiailag reaktív peptideket szintetizáltak, és kimutatták, hogy mintegy 100 % hatékonysággal reagálnak HIV1 és HIV-2 fertőzött betegek szérumával. Antitestek jelenlétére nézve végzett vizsgálatokban ezek a peptidek nem adtak hamis pozitív vagy hamis negatív reakciót.
Feltételezhető, hogy a HTLV-1 dignosztizálásának hasonló megközelítésében a HTLV-1 immunológiailag fontos fehérjéiből levezetett peptidek különösen hasznosak lennének elsősorban a Föld azon területein, ahol a vírus járványsze • · »
- 11 rűen jelenik meg.
Mostanában néhány publikáció olyan adatokat hozott nyilvánosságra, amelyek a HTLV-1 antigén fehérjéinek megfelelő bizonyos szintetikus peptidek immunológiai reaktivitását igazolják. Az egyik vizsgálatban külömböző HTLV-1 qaq peptideket szintetizáltak [Parker és munkatársai, C-terminal Region of Humán T-cell Lymphotropic Vírus Type I (HTLV-1) p Core Protein is Immunogenic in Humans and Contains an HTLV-1 Specific Epitop J. Immunoi. 136. 23932397 (1986)]. Az egyik, az SP-71 jelű qaq peptid, amely a
HTLV-1 pl9 fehérje C-terminálisának felel meg, egy radioimmun vizsgálatban (RIA) 8/9 HTLV-l-beteg szérumával reagált. Az SP-71 aminosav-szekvenciája: Pro-Tyr-Val-GluPro-Thr-Ala-Pro-Gln-Val-Leu. Copeland és munkatársai [Envelope Proteins of Humán T-cell Leukémia Virus Type I: Characterization by Antisera to Synthetic Peptides and Identification of Natural Epitope J. Immunoi. 137. 2945-2951 (1986)] szintetizáltak három további HTLV-1 peptidet, amelyek a HTLV-1 env génje által kódolt fehérje területeinek felelnek meg. Ezek egyikének, a gp46 nagy felületi glikoprotein C-terminálisához közel elhelyezkedő SP-7O-nek antigén aktivitása van, de csak 4/12 HTLV-l-pozitív beteg szérumával reagált. Az SP-70 peptidet a HTLV-1 genom 6066-6098 bázispárjait tartalmazó nukleotidszekvencia kódolja, és aminosav-szekvenciája: Pro-Pro-Phe-Ser-Leu-Ser-Pro-Val-Pro-Thr-Leu-NH2.
A HTLV-1 immunológiailag fontos fehérjéinek, mint pl. a gp46-nak megfelelő peptidek, amelyek közel 100 %-os haté• « · • · · · ···· ···· ·<»· ··
- 12 konysággal reagálnának HTLV-1 fertőzött betegek szérumával, azonnal használhatók lennének diagnosztikai módszerekben és HTLV-1 elleni antitest termelését kiváltó immunogén kompozíciókban.
A mellékelt 1. ábra a találmány szerinti peptidek HTLV pozitív antiszérumokkal szembeni reaktivitásának oszlopdiagramját mutatja. A peptidek relatív helyzetét a gp46 és gp21 glikoproteinek aminosavkszekvenciájához képest, valamint az illető peptidekkel reaktív HTLV-1 minták (N=71) százalékos arányát ábrázoltuk. A potenciális glikozilezési helyeket csillaggal jelöltük.
A 2. ábra a HTLV-1 qaq gén által kódolt fehérjék (gpl5, gpl9 és gp24) epitop feltérképezésének eredményeit mutatja. Az X-tengelyen megadott számok a reprezentatív hexapeptid első (amino-terminális) aminosavának a számát jelölik. Az Y-tengelyen az egyes peptidek esetén két egyesített HTLV-1 pozitív szérummal kapott megfelelő optikai sűrűség-leolvasásokat ábrázoltuk.
A találmány új szintetikus peptidekre vonatkozik, amelyek a HTLV-1 qaq és HTLV-1 env proteinek epitopjainak felelnek meg. Ezek a peptidek önmagukban vagy kombinálva, nem-kapcsolt vagy más molekulához kapcsolt formában HTLV-1 fertőzések kimutatásában diagnosztikai célra, HTLV-1 fertőzés elleni immunizálás céljára és poliklonális vagy monoklonális antitestek előállítására használhatók.
A találmány szerinti új peptidek HTLV-1 fertőzés, illetve a vírussal történt érintkezés diagnosztizálására és olyan immunogén kompozíciók hatóanyagaként alkalmazhatók, a• · 9 «·· • · · 9 • itt ·«·· ···· ··
- 13 melyek HTLV-1 elleni antitestek termelésének kiváltására alkalmazhatók emberek és állatok esetén. A találmány szerinti peptidek olyan oligomerek, amelyeknek aminosav-szekvenciái olyan szekvenciarészeket tartalmaznak, amelyek a HTLV-1 fajlagos antitestekkel reaktív folyamatos (lineáris) epitopokat alkotják.
Az epitopoknak megfelelő peptidek detektálására harmincöt különböző, 18-26 aminosavmaradékot tartalmazó peptidet szintetizáltunk. A peptidek aminosav-szekvenciáját az 1. táblázatban foglaltuk össze. A peptidek öt vagy több aminosavmaradékkal átfedik egymást, és a teljes env gén transzlációs terméket (huszonegy gp46 peptid és tizennégy gp21 peptid) fedik. Az aminosav-szekvenciákat az előre megjósolt aminosav-szekvenciából kaptuk [Seiki és munkatársai, Humán Aduit T-cell Leukémia Vírus: Complete Nucleotid Sequence of the Provirus Genome Integrated in Leukémia Cell DNS, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3618-3622 (1983)]. A peptidek közül négyet (A-HTLV-1; B-HTLV-1; C-HTLV-1; H-HTLV-1) már korábban előállítottak (lásd WO 89/08664 számon közrebocsátott nemzetközi szabadalmi bejelentés).
• · · · ·
1. táblázat
HTLV-l-ből származtatott peptidek és azok reaktivitása HTLV-1 pozitív szérumokkal
Peptid
Aminosav
Aminosav-szekvencia*
Reaktiviás szám2
| gag-1 | 112-130 | DSDPQIPPPYVEPTAPQVL | 74/81 |
| gag-2 | 131-150 | PVMHPHGAPPNHRPWQMKDL | 0/6 |
| gag-3 | 41-61 | YDFHQLKKFLKIAQFDPTAKD | 0/6 |
| gag-4 | 206-226 | DSLISEAETRGITGYNPLAGP | 0/6 |
| gag-5 | 265-281 | SILQGLEQPYHAFVERL | 1/5 |
| T | 190-212 | LLPHSNLDHILEPSIPWKSKLLT | 84/97 |
| 0 | 89-110 | TKKPNRNGGGYYSASYSDPCS L | 38/91 |
| U | 208-230 | GKLLTLVQLTLQSTNYTCIVCID | 32/67 |
| V | 239-261 | VLYSPNVSVPSSSSTPLLYPSLA | 81/91 |
| X | 291-313 | NSLILPPFSLSPVPTLGSRSRRA | 76/97 |
| BB | 363-385 | KNHKNLLKIAQYAAQNRRGLDLL | 29/91 |
| HH | 190-209 | LLPHSNLDHILEPSIPWKSK | 39/91 |
| AA | 345-367 | SLLHEVDKDISQLTQAIVKNHKN | 30/81 |
| GG | 466-488 | QLRHLPSRVRYPHYSLIKPESSL | 65/911 |
| VH | 163-185 | LLVDAPGYDPIWFLNTEPSQLPP | 0/6 |
| prot 1 | 1-17 | HSTPKLHRGGGLTSPP | 0/6 |
| prot 2 | 40-62 | RRPVIKAQVDTQTSHPKTIEALL | 0/6 |
| prot 3 | 76-99 | FSSNTPLKNTSVLGAGGQTQDHFKLT | 0/6 |
| VA | 368-390 | LLKIAQYAAQNRRGLDLLFWQQG | 0/33 |
| HA | 395-417 | ALQEQCRFPNITNSHVPILQERP | 0/6 |
| VB | 260-282 | LALPAPHLTLPFNWTHCFDPQIQ | 0/33 |
| HB | 286-310 | SSPCHNSLILPPFSLSPVPTLGSRS | 9/33 |
| HC | 234-256 | LSTWHVLYSPNVSVPSSSSTPLL | 8/33 |
| VC | 210-232 | LLT LVQ LT LQSTNYTCIVCIDRA | 6/33 |
| A | 381-404 | GLDLLFWEQGGLCKAIQEQCCFLN | 57/97 |
| B | 273-295 | WTHCYQPRLQAITTDNCNNSIIL | 54/97 |
| C | 223-242 | YTCIVCIDRAS LSTWHLYP | 79/97 |
| D | 116-140 | GCQSWTCPYTGAVSSPYWKFQHDVN | 0/17 |
• · · · · · ·
1. táblázat folytatása
Peptid Aminosav
Aminosav-szekvencia*
Reaktiviás szám2
| E | 35-57 | SYHSKPCNPAQPVCSWTLDLLAL | 0/17 |
| H2 | 176-199 | LNTEPSQLPPTAPPLLSHSNLDHI. | 3/6 |
| T2 | 191-212 | LLSHSNLDHILEPSIPWKSKLLT | 3/6 |
| A2 | 381-404 | GLDLLFWEQGGUZKALQEQCCFLN | 1/6 |
| A3 | 381-404 | GLDLLFWEQGGLCKALQEQCYFLN | 1/6 |
| L | 20-40 | GDYSPSCCTLTIGVSSYHSKP | 2/67 |
| L1 | 20-40 | GDYSFSCCTLTIGVSSYHSKP | 0/6 |
| RÍ | 154-176 | FSKCGFSFSLLVDAPGYDPIWFL | 0/6 |
| VI | 239-261 | VLYSPNVSVPSPSSTPLLYPSLA | 4/6 |
| F | 55-77 | LALSADQALQPPCPNLVSYSSYH | 2/17 |
| G | 103-125 | SYSDPCSLKCPYLGCQSWTCPYT | 0/17 |
| H | 176-199 | LNTEPSQLPPTAPPLLPHSNLDHI | 71/97 |
| I | 352-374 | KDISQLTQAIVKNHKNLLKIAQY | 2/17 |
| J | 362-384 | VKNHKNLLKIAQYAAQNRRGLDL | 1/17 |
| K | 427-449 | WGLNWDLGLSQWAREALQTGITL | 0/17 |
| M | 53-75 | DLLALSADQALQPPCPNLVSYSS | 0/17 |
| N | 71-94 | VSYSSYHATYSLYLFPHWTLLPNR | 0/17 |
| P | 107-129 | PCSLKCPYLGCQSWTCPYTGAVS | 0/17 |
| Q | 136-158 | QHDVNFTQEVSRLNINLHFSKCG | 0/17 |
| R | 154-176 | FSKCGFPFS LLVDAPGYDPIWFL | 0/6 |
| S | 172-194 | PIWFLNTEPSQLPPTAPPLLPHS | 0/17 |
| W | 257-279 | YPSLALPAPHLTLPFNWTHCFDP | 0/6 |
| Y | 309-331 | RSRRAVPVAVWLVSALAMGAGVA | 1/73 |
| z | 327-349 | GAGVAGGITGSMSLASGKSLLHE | 0/6 |
| cc | 400-422 | CRFPNITNSHVPILQERPPLENR | 5/67 |
| DD | 418-440 | PLENRVLTGWGLNWDLGLSQWAR | 0/11 |
| EE | 436-458 | SQWAREALQTGITLVALLLLVIL | 0/6 |
| FF | 454-476 | LLVILAGPCILRQLRHLPSRVRY | 0/11 |
| II | 1-26 | MGKFLATLILFFQFCPLILGDYSPSC | 0/6 |
Megjegyzés:
1 alacsony abszorbancia értékek 2 a szóban forgó protein génjén belüli relatív aminosav-helyzet az aminosavmaradékok egybetűs kódja:
alanin A arginin R aszparagin N aszpartinsav D cisztein C glutaminsav E glutamin Q glicin G hisztidin H izoleucin I leucin L lizin K metionin M fenilalanin F prolin P szerin S treonin T triptofán W tirozin Y valin V
A harmincöt különböző peptidet mikrotitráló lapok üregeihez adszorbeáItattuk, és hat HTLV-1 pozitív beteg szé rumával szembeni reaktivitásra enzimmel kapcsolt immunab szorbens vizsgálattal (EIA) átvizsgáltuk. A tizenegy pepti det, amelyek egy vagy több szérum mintával pozitív reakciót adtak, további 65 HTLV-1 pozitív szérum mintával továbbvizsgáltuk. A peptidek aminosav-szekvenciáját, valamint a pepti dekkel reagáló HTLV-1 pozitív szérumok frakcióját feltüntet tük az 1. táblázatban.
Az eredmények azt mutatják, hogy három nagyon immunogén terület van az env proteinben: az első a 176. és 212. aminosavmaradékok között, amelyet H-HTLV-1 peptidként (176199 aminosavak) és J-HTLV-1 peptidként (190-212 aminosavak) jelöltünk; a második a 223. és 261. aminosavmaradékok között, amelyet C-HTLV-1 peptidként (223-243 aminosavak) és VHTLV-1 peptidként (239-261 aminosavak) jelöltünk; a harmadik a 273. és 313. aminosavmaradékok között, amelyet B-HTLV-1 peptidként (273-295 aminosavak) és X-HTLV-1 peptidként (291313 aminosavak) jelöltünk. A gp46 amino-terminális végéről egy peptid (O-HTLV-1, 89-110 aminosavak) adott pozitív reakciót a HTLV-l pozitív szérumokkal.
Nemrégen beszámoltak arról, hogy a 374-392 aminosavmaradékoknak (gp46/gp21 számozása a folyamatos szekvenciában) megfelelő peptid a HTLV-l pozitív szérumok 18 %-ával reagált [Palker és munkatársai, Mapping of Immunogenic Regions of Humán T-cell Leukémia Vírus Type I (HTLV-l) gp46 and gp21 Envelope Glycoproteins with env-encoded Synthetic Peptides and Monoclonal Antibody to gp46 J. Immunoi. 142, 972-978 (1989)]. Más kutatók viszont nem találtak a gp21-en belüli epitopoknak megfelelő peptideket [Copeland és munkatársai (1986)].
Korábbi vizsgálatokkal ellentétben, amelyek azt mutatták, hogy a gp21 nem immunogén, a találmány szerinti, gp21-ből származtatott peptidek közül négy pozitív reakciót adott HTLV-l pozitív antiszérumokkal. Kutatásaink során kimutattuk, hogy a gp21-ben két olyan terület van, amelyek emberben immunogén epitopot tartalmaznak (lásd 1. ábra). Az egyik terület a gp21 amino-terminális 345-404 aminosavainak megfelelő terület, amelyet három peptid, az AA-HTLV-1 (3813676 aminosavak), a BB-HTLV-1 (362-385 aminosavak) és az AHTLV-1 (381-404 aminosavak) jelöl. A másik, epitopot tártál• · ·
- 18 mazó terület a gp21 karboxi-terminálisa, amelyet a GG-HTLV-1 (466-488 aminosavak) peptid jelöl. Érdekes módon a gp21 egyetlen, a 404-406 aminosavaknál található potenciális N-kapcsolt glikozilezési helyét tartalmazó peptid nem volt reaktív egyetlen vizsgált HTLV-1 pozitív humán szérummal sem.
Az 1. ábrán említett peptideket egy Applied Biosystems 430A jelű peptid-szintetizátorral szintetizáltuk. A peptideket lehasítottuk a szilárd fázisról, és a védő oldalláncokat hidrogén-fluoriddal eltávolítottuk. A peptideket a Pharmacia-módszerrel (Pharmacia, Uppsala, Svédország) SPDP-vel borjú szérumkalbuminhoz (BSA) kapcsoltuk. Az eredeti peptid-szekvenciához a C-terminálison egy ciszteint adtunk az SPDP-vel való kapcsolási rekció megkönnyítésére. A peptid—BSA komplexet azután mikrotitráló lapokra (NUNC, Dánia) töltöttük. A szérumokat a peptidekkel szembeni reaktivitásra nézve 1/50-szeres hígításban indirekt ELISA módszerrel vizsgáltuk. Azokat a szérumokat, amelyeknek az abszorbancia értéke egyenlő vagy nagyobb, mint öt negatív kontroll átlagértéke + 6SD, úgy tekintettük, hogy pozitív reakciót adott a peptidekkel. A peptidek relatív helyzete a glikoproteinek aminosav-szekvenciája mentén, valamint az illető peptiddel reagáló HTLV-1 szérumok (n=71) százalékos aránya meg van adva. Csak az a hét gp46 peptid és négy reaktív gp21 peptid van megadva, amelyek a HTLV-1 pozitív szérumokban az antitestekhez kapcsolódtak. A lehetséges glikozilezési helyek meg vannak jelölje (*). A Copeland és munkatársai (1986) és Palker és munkatársai (1989) által leírt env peptidek elhelyezkedését szintén megadtuk.
Szintetizáltunk egy másik sorozat peptidet a HTLV-1 qaq gén terméke epitopjainak meghatározására. A fentitől eltérő átvizsgálás! stratégiát követtünk. Egymást öt aminosavmaradékkal átfedő és a teljes qaq gén terméket fedő hexamer peptideket szintetizáltunk polietilén rudakon, ahogyan Geysen és munkatársai a Use of Peptide Synthesis to Probe Viral Antigens fór Epitops to a Resolution of a Single Amino Acid, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3998-4002 (1984) irodalmi helyen ismertették, a peptid szintézis keretét minden új peptid esetén egy aminosawal elmozdítottuk a C-terminális irányába (minden egyes 1. peptid esetén készítettünk egy másolatot). A védőcsoportok eltávolítása után, azonban még a rúdhoz kötött peptidekkel EIA mérést végeztünk. A peptideket két adagba összegyűjtött olyan szérummal vizsgáltuk, amelyek erősen reagáltak mind a három, qaq által kódolt proteinnel. A szérumok végső hígítása 1/100 volt. A kapott eredményeket a 2. ábra szemlélteti. Ezen eredmények alapján öt peptidet (tizenhét - huszonegy aminosav hosszúságú) szintetizáltunk, és a fenti módon mikrotitráló lapra vittük fel. Amikor a peptideket a HTLV-1 pozitív szérumokkal vizsgáltuk, egy peptid erősen reagált (Gag-1-HTLV-1). Az X-tengelyen megadott számok az illető hexapeptid első (N-terminális) aminosava aminosav-koordinátáját jelöli. Az Y-tengely az egyes peptidek esetén a HTLV-1 pozitív szérumokkal adott abszorbancia értéket mutatja.
A találmány tehát HTLV-1 env génje által kódolt burok glikoproteinek területeinek megfelelő, immunológiailag reak tív peptidekre és azok olyan funkcionálisan ekvivalens változataira vonatkozik, ahol a változás a peptidek antigén tulajdonságait nem befolyásolja szignifikánsan.
A peptideket ismert módon, szilárd fázisú peptidszintetizáló módszerrel állítottuk elő [lásd pl. Merrifield és Bárány, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology 1. kötet, kiadó: Gross and Meinenhoffér, Academic Press, New York (1980), 1. fejezet]. A szintézis azt is lehetővé teszi, hogy a peptid amino- vagy karboxi-terminálisához egy vagy két olyan aminosavat adjunk, amelyek az eredeti protein szekvenciájában nem fordulnak elő. Az ilyen extra aminosavak használhatók a peptidek egymáshoz, más peptidekhez, nagy hordozó fehérjékhez vagy szilárd hordozóhoz történő kapcsolására. Ilyen célra előnyös aminosavak a tirozin, lizin, glutaminsav, aszpartinsav, cisztein és ezek származékai. A peptidek más fehérjéhez vagy peptidhez vagy hordozóhoz való kapcsolására más fehérje-módosító módszert is használhatunk, pélául NH2-acilezést vagy karboxi-terminális amidálást.
A találmány tárgykörébe tartoznak a peptidek analógjai és homológjai is. Analógok az olyan peptidek, amelyek a kérdéses peptiddel funkcionálisan ekvivalensek, de természetben elő nem forduló aminosavakat tartalmaznak. Homológok az olyan peptidek, amelyek hagyományos módon helyettesített aminosavakat tartalmaznak, vagy amelyek olyan peptideknek felelnek meg, amelyeket bármely más HTLV-1 izolátum genomja kódol. Hagyományos aminosavhelyettesítések például a következők: glicin, alanin; valin, izoleucin, leucin; aszparagin, glutamin; aszpartinsav, glutaminsav; szerin, treonin; lizin, arginin; valamint fenilalanin, tirozin. A találmány szerinti peptidek olyan aminosav-szekvenciákat tartalmaznak, amelyek mindegyike legalább egy folytonos (lineáris), HTLV-1 antitesttel reaktív epitopot tartalmaznak. így az olyan peptidszármazékok, amelyek az alábbi teljes aminosav-szekvenciánál kevesebb aminosavat tartalmaznak, szintén a találmány tárgykörébe tartoznak, feltételezve, hogy legalább egy olyan lineáris epitopot tartalmaznak, amelyet a HTLV-l-re fajlagos antitestek felismernek. A peptidek kifejezés tehát magában foglalja az adott aminosav-szekvenciákat, azok analógjait, homológjait és az azokból levezethető epitopokat.
Az alábbiakban megadjuk a HTLV-1 proteineknek megfelelő új peptideket. Az aminosavak számozását Seiki és munkatársai ismertették a Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3618- 3622 (1983) irodalmi helyen. Az aminosavak rövidítése a következő:
| Alá: | alanin; |
| Arg: | arginin; |
| Asn: | aszparagin; |
| Asp: | aszparaginsav; |
| Cys: | cisztein; |
| Gin: | glutamin; |
| Glu: | glutaminsav; |
| Gly: | glicin; |
| His: | hisztidin; |
| He: | izoleucin; |
| Leu: | leucin; |
| Lys: | lizin; |
• ·
| Met: | metionin; |
| Phe: | fenilalanin; |
| Pro: | prolin; |
| Ser: | szerin; |
| Thr: | treonin; |
| Trp: | triptofán; |
| Tyr: | tirozin; |
| Val: | valin. |
I-HTLV-1 peptid
X-Lys-Asp-Ile-Ser-Gln-Leu-Thr-Gln-Ala-Ile-Val-Lys-Asn-His-Lys-Asn-Leu-Leu-Lys-Ile-Ala-Gln-Tyr-Y-Z, ennek analógjai és homológjai, ahol X jelentése a peptid amino-terminális Nőcsoportjának hidrogénatomja vagy egy a peptid amino-terminális Nő-csoportjához kapcsolódó további aminosav, amelyet úgy választunk meg, hogy megkönnyítse a peptid más peptidhez, fehérjéhez vagy más hordozóhoz való kapcsolását; Y jelentése kémiai kötés vagy ciszteinmaradék; Z jelentése hidroxil- vagy aminocsoport.
Az I-HTLV-1 peptidet a HTLV-1 env proteinből származtattuk. Az olyan I-HTLV-1 peptid, ahol X jelentése hidrogénatom, Y jelentése ciszteinmaradék és Z jelentése hidroxilcsoport, különösen előnyös.
AA-HTLV-1 peptid X-Ser-Leu-Leu-His-Glu-Val-Asp-Lys-Asp-Ile-Ser-Gln-Leu-Thr-Gln-Ala-Ile-Val-Lys-Asn-His-Lys-Asn-Y-Z, ennek analógjai és homológjai, ahol X, Y és Z jelentése a fenti.
Az AA-HTLV-1 peptidet a HTLV-1 env proteinből származtattuk. Az olyan AA-HTLV-1 peptid, ahol X jelentése hidrogénatom, Y jelentése ciszteinmaradék és Z jelentése hidroxilcsoport, különösen előnyös.
BB-HTLV-1 peptide X-Lys-Asn-His-Lys-Asn-Leu-Leu-Lys-Ile-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Gln-Asn-Arg-Arg-Gly-Leu-Asp-Leu-Leu-Y-Z, ennek analógjai és homológjai, ahol X, Y és Z jelentése a fenti.
A BB-HTLV-1 peptidet a HTLV-1 env proteinből származtattuk. Az olyan BB-HTLV-1 peptid, ahol X jelentése hidrogénatom, Y jelentése ciszteinmaradék és Z jelentése hidroxilcsoport, különösen előnyös.
GG-HTLV-1 peptid X-Gln-Leu-Arg-His-Leu-Pro-Ser-Arg-Val-Arg-Tyr-Pro-His-Tyr-Ser-Leu-Ile-Lys-Pro-Glu-Ser-Ser-Leu-Y-Z, ennek analógjai és homológjai, ahol X, Y és Z jelentése a fenti.
A GG-HTLV-1 peptidet a HTLV-1 env proteinből származtattuk. Az olyan GG-HTLV-1 peptid, ahol X jelentése hidrogénatom, Y jelentése ciszteinmaradék és Z jelentése hidroxilcsoport, különösen előnyös.
O-HTLV-1 peptid X-Thr-Lys-Lys-Pro-Asn-Arg-Asn-Gly-Gly-Gly-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Ser-Tyr-Ser-Asp-Pro-Cys-Ser-Leu-Y-Z, ennek analógjai és homológjai, ahol X, Y és Z jelentése a fenti.
Az O-HTLV-1 peptidet a HTLV-1 env proteinből szár utaztattuk. Az olyan O-HTLV-1 peptid, ahol X jelentése hidrogénatom, Y jelentése ciszteinmaradék és Z jelentése hidroxilcsoport, különösen előnyös.
T-HTLV-1 peptid X-Leu-Leu-Pro-His-Ser-Asn-Leu-Asp-His-Ile-Leu-Glu-Pro-Ser-Ile-Pro-Trp-Lys-Ser-Lys-Leu-Leu-Thr-Y-Z, ennek analógjai és homológjai, ahol X, Y és Z jelentése a fenti.
A T-HTLV-1 peptidet a HTLV-1 env proteinből származtattuk. Az olyan T-HTLV-1 peptid, ahol X jelentése hidrogénatom, Y jelentése ciszteinmaradék és Z jelentése hidroxilcsoport, különösen előnyös.
V-HTLV-1 peptid X-Val-Leu-Tyr-Sér-Pro-Asn-Val-Ser-Val-Pro-Ser-Ser-Ser-Ser-Thr-Pro-Leu-Leu-Tyr-Pro-Ser-Leu-Ala-Y-Z, ennek analógjai és homológjai, ahol X, Y és Z jelentése a fenti.
A V-HTLV-1 peptidet a HTLV-1 env proteinből származtattuk. Az olyan V-HTLV-1 peptid, ahol X jelentése hidrogénatom, Y jelentése ciszteinmaradék és Z jelentése hidroxilcsoport, különösen előnyös.
X-HTLV-1 peptid X-Asn-Ser-Leu-Ile-Leu-Pro-Pro-Phe-Ser-Leu-Ser-Pro-Val-Pro-Thr-Leu-Gly-Ser-Arg-Ser-Arg-Arg-Ala-Y-Z, ennek analógjai és homológjai, ahol X, Y és Z jelentése a fenti.
Az X-HTLV-1 peptidet a HTLV-1 env proteinből szár maztattuk. Az olyan X-HTLV-1 peptid, ahol X jelentése hidrogénatom, Y jelentése ciszteinmaradék és Z jelentése hidroxilesöpört, különösen előnyös.
GAG-l-HTLV-1 peptid X-Asp-Ser-Asp-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro-Pro-Tyr-Val-Glu-Pro-Thr-Ala-Pro-Gln-Val-Leu-Y-Z, ennek analógjai és homológjai, ahol X, Y és Z jelentése a fenti.
A GAG-l-HTLV-1 peptidet a HTLV-1 qaq proteinből származtattuk. Az olyan GAG-l-HTLV-1 peptid, ahol X jelentése hidrogénatom, Y jelentése ciszteinmaradék és Z jelentése hidroxilesöpört, különösen előnyös.
A peptidek alkalmazhatók önmagukban vagy kombinációban HTLV-1 elleni antitestek vagy HTLV-l-gyel kapcsolatos antigének detektálására. Antitestek találhatók biológiai mintákban, például szérumokban, más testfolyadékokban, szövetmintákban vagy más mintákban, amelyek HTLV-1 elleni antitesteket tartalmazhatnak. A HTLV-1 fertőzés HTLV-2 fertőzéstől való megkülönböztetésére különösen a H-HTLV-1, O-HTLV-1 és a T-HTLV-1 alklamzható. A találmány szerinti peptidek vér és vértermékek megbízhatóság és fajlagosság szempontjából magasszintű átvizsgálására alkalmazhatók. A peptidek alkalmazhatók továbbá jövőbeli HTLV-1 fertőzések elleni védelemre. A találmány kiterjed a monoklonális és poliklonális antitestekre is, amnelyek fajlagosan felismerik a peptideket.
A HTLV-l-re fajlagos antitestek mintákban való jelenlétének kimutatására szolgáló eljárás során a mintát legalább egy találmány szerinti peptiddel hozzuk érintkezésbe • ·' .· · ···· ···· ··»· ·· »··
- 26 olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik, hogy a peptid és a mintában esetleg jelen levő, HTLV-1 elleni antitest között immunológiai komplex jöjjön létre. A HTLV-1 elleni antitest mintában való jelenlétére utaló immunológiai komplex képződését azután detektáljuk, és alkalmas módon mérjük.
Ilyen detektálási módszer például a homogén és heterogén kötési immunvizsgálat, például radioimmunvizsgálat (RIA), ELISA és a Western foltképzési vizsgálat. A találmány szerinti peptidek alkalmazásán alapuló vizsálatok során kompetitív és nem-kompetitív kötési vizsgálatokat végzünk. Az átvizsgálási módszerek gyorsak, hatékonyak és számos minta párhuzamos átvizsgálását teszik lehetővé.
A peptidek lehetnek jelzettek (jelképzők) vagy nem-jelzettek a vizsgálat fajtájától függően. A peptidekhez kapcsolható jelzőanyagok jól ismertek, ilyenek például az enzimek, radionuklidok, fluorogén és kromogén anyagok, kofaktorok, biotin/avidin, kolloid arany és mágneses részecskék.
A peptidek bármely ismert módszerrel kapcsolhatók más peptidekhez, szilárd vivőanyagokhoz vagy hordozóproteinekhez. Ilyen szilárd vivőanyagok például a polisztirol vagy polivinil mikrotitráló lapok, üvegcsövek vagy üveggyöngyök, kromatográfiás vivőanyagok, például papír, cellulóz és cellulózszármazékok, továbbá szilícium-dioxid. Hordozóproteinek lehetnek például a szarvasmarha szérumalbumin (BSA) és a kürtőscsiga hemocianin (KLH).
Előnyös átvizsgálási módszer, különösen betegek szé • ··♦ ··♦ ·
- 27 ruménak, vérnek és vérkészítményeknek nagy mennyiségben klinikai körülmények között végzett átvizsgálására az ELISA, agglutinációs és a Western foltképzési módszer. Az ELISA módszer különösen előnyös gyorsasága miatt és azért, mert számos minta párhuzamos vizsgálatát teszi lehetővé, és könnyen automatizálható.
A találmány szerinti peptideket alkalmazó ELISA módszer más vírusok kimutatására jelenleg használt ELISA módszeren alapszik. A vizsgálatban reagensként való alkalmazáshoz a találmány szerinti peptideket szokásos módszerrel mikrotitráló lap üregeinek belső felületére kötjük. A peptidek köthetők közvetlenül hidrofób kölcsönhatással a mikrotitráló lap üregeihez, vagy kapcsolhatók kovalensen ismert hordozóporein, például BSA segítségével, ahol a kapott konjugátummal vonjuk be az üregeket. A peptideket általában mintegy 1-100 μ/ml koncentrációban, esetenként 500 μ/ml-ig terjedő koncentrációban alkalmazzuk. A peptideket bevonáshoz általában 10-100 μ/ml koncentrációban alkalmazzuk.
A mintát, például testfolyadékot és szövetmintát azután a peptiddel bevont üregbe adjuk, ahol immunológiai komplex képződik, ha a mintában HTLV-1 elleni antitest van jelen. A komplex képződésének detektálására egy jelképző anyag adagolható. Detektálható jel képződik, ha a mintában HTLV-1re fajlagos antitestek vannak jelen. Az agglutinációs vizsgálatot szokásosan használják Japánban. Ebben a módszerben latex vagy eritrociták használhatók. Az agglutinációs vizsgálatokban alkalmazott módszerek jól simertek a vér átvizsgálása terén.
**· ···· · · · · · ·· ·
- 28 A találmány szerinti peptidek immunogénként alkalmazható készítmények formájában is elkészíthetők. Ezek az immunogének alkalmazhatók HTLV-1 antitestként vagy antitestek termelésének kiváltására állatok vagy ember esetén. A termelt antitestek lehetnek poliklonálisak vagy monoklonálisak. Az ilyen készítményeket úgy készítjük, hogy legalább egy peptid immunológiailag hatékony mennyiségét fiziológiailag elfogadható, állat és ember számára adagolható hordozóanyaggal keverjük. A peptidek egymáshoz, más peptidekhez, hordozóproteinhez vagy más vivőanyaghoz kapcsolhatók kovalensen, liposzómákba vagy más vezikulumokba foglalhatók vagy adjuvánssal vagy adszorbenssel komplex képezhető belőlük, a vakcinagyártásban ismert módszerekkel. Eljárhatunk úgy is, hogy a peptidekből nem képezünk komplexet, csak egyszerűen összekeverjük fiziológiailag elfogadható olyan hordozóanyaggal, például nátrium-klorid-oldattal vagy pufferrel, amely alkalmas állatnak vagy embernek történő adagoláshoz. A vakcinák és antitestek készítése, tisztítása és jellemzőinek meghatározása jól isemert, itt nem ismertetjük.
Amint minden, antitest képzését kiváltó immunogén készítmény esetén, a találmány szerinti peptidek immunogén szempontból hatékony mennyiségét empirikusan kell megállapítani. Figyelembe veendő faktorok a natív peptid immunogenitása, az a szempont, hogy a peptidből adjuvánssal, hordozóproteinnel vagy más vivőanyaggal képzünk-e komplexet vagy kovalensen kapcsoljuk-e ezekhez, továbbá a készítmény adagolási módja (azaz intravénás, intrmuszkuláris, szubkután stb.) és az adagolandó immunizáló dózisok száma. Ezek a fák• · · ··· • · » · ···· ··»· ···· ·· « ·-»
- 29 torok a vakcinakészítés terén jól ismertek, immunológusok számára a dózis meghatározása rutin feladat.
A találmány kiterjed a peptideket felismerő, a peptidekre adott válaszképpen képződő antitesekre is. Az ilyen antitestek lehetnek poliklonálisak vagy monoklonálisak. Az antitestek előállítása jól ismert.
A találmány szerinti megoldást a következő példákkal szemléltetjük.
1. példa
A peptidek előállításához egy Applied Biosystems 430A modelszámú peptidszintetizáló berendezést használtunk. A szintézisekben p-metil-benzil-hidril-amin hordozógyanta (Peptides International, Louisville, KY) szilárd fázist használtunk. A szintéziseket a Users Manual fór Peptide Synthesizer Model 430A, Applied Biosystems, 1986 előírásai szerint végeztük.
A szintézishez alkalmazott aminosavak (Novabiochem AG, Svájc gyártmány) a-NÜ2 csoportja terc-butil-karbonil(t-Boc) -védőcsoportot tartalmazott. Az oldalláncban reaktív csoportot tartalmazó aminosavak további védőcsoportokat tartalmaztak a nemkívánt oldallánc-reakciók megakadályozására. A szintézisekben alkalmazott, védőcsoportokat tartalmazó aminosavakat a 2. táblázatban soroljuk fel.
Az egyes szintézisek befejezése után a védőcsoportokat eltávolítottuk a szintetizált peptidről, és a peptidet lehasítottuk a hordozógyantáról 0 °C-os vízmentes hidrogén-fluorid (HF) segítségével, 10 % anizol és 10 % dimetil-szulfid mint megkötőszer alkalmazása mellett. Lehasítás • ♦ · ♦·· • · « · ···· ·♦»· »··♦
- 30 után a HF-t nitrogénárammal kihajtottuk a mintából. A HFnyomok eltávolítására a mintát 0 °C-on vákuum alá helyeztük. A peptideket trifluor-ecetsavas (TFA) kezeléssel extraháltuk a gyantáról, amelyet azután szobahőmérsékleten végzett bepárlássál távolítottunk el. A TFA eltávolítása után a peptideket kicsaptuk, és vízmentes éterrel mostuk.
Az egyes vizsgálatokban történő felhasználás előtt a peptidek kívánt esetben reverz fázisú nagysebességű folyadékkromatográfiával (HPLC) tovább tisztíthatok. Az ilyen tisztítás céljára különösen alkalmas a reverz fázisú VydakR C-18 oszlop, amelyről a peptidek víz (TFA) - acetonitril (TFA) gradienssel eluálhatók.
• « «· *♦· · • · · · ···* ···» ·*·· *· ·<··
2. táblázat
A peptidek szintéziséhez használt aminosavak
Boc-Ala-OH
Boc-Arg(Tos)-OH
Boc-Asn-OH
Boc-Asp(OBzl)OH
Boc-Cys(pMeOBzl)-OH
Boc-Glu(OBzl)-OH
Boc-Gln-OH
Boc-Gly-OH
Boc-His(Tos)-OH
Boc-Ile-0H«^H20
Boc-Leu-OH·H2O
Boc-Lys(2-C1-Z)-OH (krist.)
Boc-Met-OH
Boc-Phe-OH
Boc-Pro-OH
Boc-Ser(Bzl)-OH DOHA
Boc-Ser(Bzl)-OH
Boc-Trp(formil)-OH
Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH
Boc-Val-OH ahol: Tos=tozil- vagy p-toluolszulfonsav,
OBzl=benzil-oxi-csoport, pMeOBzl=p-metil-benzil-oxi-csoport, 2-Cl-Z=karbobenzoxi-klorid 2-Br-Z=karbobenzoxi-bromid ···
2. példa
Mikrotitrálő lapok készítése ELISA vizsgálathoz
A következő kísérleteket végeztük peptidek alkalmazásával, amelyeket szarvasmarha szérum-albuminhoz (BSA) konjugáltunk a mikrotitrálő lapok üregei bevonásának megkönnyítése érdekében.
200 peptiddel bevont mikrotitrálő lap készítését a következőképpen végeztük:
0,15 g BSA-t (Boerhinger Mannheim, V. frakció) tartalmazó alikvotokat oldottunk 3 ml kapcsoló pufferben (0,2 mol/1 nátrium-foszfát, pH=8,5). Ezt a BSA-oldatot három egyenlő térfogatrészre osztva 1,5 ml kapcsoló puffer kíséretében PD-10 oszlopokra (Pharmacia AB, Uppsala, Svédország) vittük fel, és 2,0 ml kapcsoló pufferrel eluáltuk. Az összegyűjtött eluátum minták BSA-koncetrációját az oldat 280 nmnél mért abszorbanciája alapján számoltuk, ahol A280 ( 0,1 % BSA) = 0,67 ml/mg. A kitermelés általában 80-90 % volt.
Ezután etanollal 5-40 mmol/l-es N-szukcinil-3-(2-piridil-ditio)-propionát (SPDP, Pharmacia) oldatot készítettünk. Az SPDP koncentrációját a Pharmacia Fine Chemicals spDP-brossúrája szerint, a reaktív észter mérése alapján határoztuk meg. A fenti módon készített BSA-ba 2-piridil-diszulfid-maradékokat vittünk be úgy, hogy minden BSA-ekvivalenshez 10 SPDP-ekvivalenst adtunk. Az SPDP-oldatot keverés közben adtuk a BSA-oldathoz. Az oldatot 15-30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk.
A fölösleges, el nem reagált SPDP eltávolítására a piridil-diszulfid-BSA elegyet 6 egyenlő térfogatra osztot··· ···
- 33 tűk, és PD-10 oszlopokra vittük fel. Az oszlopok ki voltak egyensúlyozva, és a terméket 10 térfogat% ecetsavat tartalmazó vízzel eluáltuk. A helyettesítés mértékét a Pharmacia Fine Chemicals SPDP brossúra alapján mértük. A BSA kitermelése általában 90-120 mg, a helyettesítés mértéke mintegy 7, azaz 6-tól 8-ig terjed.
A peptidoldatot úgy készítettük, hogy 25 mg peptidet olyan mennyiségű piridil-diszulfid-BSA-oldattal kevertünk össze, hogy hét ekvivalens peptidre egy BSA-ekvivalens jusson. Az elegyet 18-48 óra hosszat szobahőmérsékleten inkubáltuk. A felszabadult 2-tiopiridont úgy távolítottuk el, hogy a reakcióelegyet egy 2,0 cm2 felületű, 80-100 ml-es 10 térfogat% ecetsavat tartalmazó vízzel kiegyensúlyozott Sephadex G-25 oszlopon (Pharmacia-LKB) futtattuk. A terméket 10 térfogat% ecetsavat tartalmazó vízzel eluáltuk. Az A280= 0,5 értéknél kisebb értékeket mutató frakciókat gyűjtöttük, és egyesítettük. Az egyesített térfogat mintegy 30-40 ml volt. Az összegyűjtött frakciók A280 értékét mértük, és számítottuk a BSA koncentrációt. Az egyesített frakciókat 4 °Con tárolva stabilnak találtuk.
A peptid-BSA konjugátumot bevonó pufferrel (50 mmol/1 NaC03, 0,15 mol/1 NaCl, pH=9,5) 60 mg/ml koncentrációra hígítottuk. Az oldat pH-ját ellenőriztük, és 1-5 mol/l-es NaOH-val 9,5 értékre állítottuk.
100 pl bevonó pufférés peptid-BSA elegyet helyeztünk egy mikrotitráló lap (Nunc, High Binding, katalógusszám 486667) minden üregébe. A lapokat szobahőmérsékleten 15 percig inkubáltuk. Inkubálás után a folyadékot leszivattuk az • · · · • · ·
- 34 üregekből, és 200 μΐ steril (0,22 μιπ-es szűrlet) 3 % BSA-t tartalmazó foszfáttal pufferolt sóoldatot (PBS, 10 mmol/1 NaPŰ4, 0,15 mol/1 NaCl, pH=7,2) mértünk be minden üregbe. A lapokat letakartuk, és tizenhat óra hosszat 37 ’C-on inkubáltuk.
Inkubálás után a folyadékot leszivattuk az üregekből, és a mikrotitráló lapokat biztonságos helyen mintegy három óra hosszat levegőn szárítottuk.
A lapok zárt tárolóeszközben, például leforrasztott alumínium tasakban hosszú ideig tárolhatók +4 °C és -20 °C közötti hőmérsékleten. Szárítószer, például szilikagél jelenléte hozzájárul a lapok eltarthatóságához.
3. példa
ELISA módszerek
A peptidek immunológiai reaktivitását ELISA módszerrel mértük. A peptideket párhuzamos ELISA tesztekben vizsgáltuk HTLV-2 elleni antitestekre nézve pozitív szérum mintákkal, HTLV-1 elleni antitestekre nézve pozitív szérum mintákkal, valamint HTLV-l/HTLV-2-re negatív 10 véradó szérumával szemben. A szérumokat a WO 89/08664 számon közzétett nemzeközi bejelentésben ismertetett HTLV-1 peptidekkel szemben is vizsgáltuk.
A mikrotitráló lapokat a 2. példa szerinti módon készítettük. Ha korábban készített lapokat használtunk fel, akkor azokat először szobahőmérsékletre melegítettük, majd tíz percig mosó-pufferrel (0,05 % Tween 20 PBS-ben) áztattuk. Az áztató oldatot azután használat előtt leszivattuk az üregekből.
A szérum mintákat 1:50 arányban szérumhígító oldattal (1 % BSA mosó-pufferben) hígítottuk. 100 μΐ hígított szérumot bemértünk minden üregbe, és a lapokat 90 percig 37 ’C-on nedvesített kamrában inkubáltuk. Inkubálás után a lapokat háromszor mostuk mosó-pufferrel.
Anti-humán immunglobulin G (IgG) konjugátumot (Jackson, Labassco, 10.4999999 cikkszám, 109-056-003, alkálikus foszfatáz) feloldottunk 0,5 ml vízben, és alikvotokra osztva megfagyasztottuk. A fagyasztott alikvotokat felengedtettük, és 1:5000 arányban szérumhígító pufferrel hígítottuk. 100 μΐ alikvotot hozzáadtunk minden üreghez. A lapokat 90 percig 37 °C-on nedvesített kamrában inkubáltuk. Inkubálás után a lapokat háromszor mostuk mosó-pufferrel.
Alkálikus foszfatáz szubsztrátot (Sigma, tabletták) 1 mg/ml koncentrációra oldottunk szubsztráthígító pufferben (50 mmol/1 Na2CO3, 1 mmol/1 MgCl2). Ebből 200 μΐ alikvotot adtunk hozzá minden üreghez. A lapokat mintegy 35 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten. Kívánt esetben a reakció üregenként 100 μΐ 3 mol/l-es NaOH-val leállítható.
A peptidekhez kötött antitest mennyiségének meghatározására a lapokon az abszorbanciát 405 nm-nél olvastuk le. Minél nagyobb az abszorbancia, annál nagyobb a megkötött antitest mennyisége.
4. példa
A kiindulási pentidek ELISA vizsgálata HTLV-2 és HTLV-1 pozitív szérumokkal
HTLV-2-ből levezetett, az A-HTLV-l-gyel, AA-HTLV-1gyel, B-HTLV-l-gyel, C-HTLV-l-gyel, HH-HTLV-l-gyel, V-HTLV36
1-gyel és X-HTLV-l-gyel homológ peptideket készítettünk az 1. példa szerinti módon. A HTLV-2 peptideket a 07/434 239 számú, 1989. november 13-án benyújtott amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés ismerteti. A HTLV-2 aminosav-szekvencia a Shimitohno által ismertetett nukleotid-szekvenciából vezettük le [Complete Nucleotide Sequence of an Infectious Clone of Humán T cell Leukémia Virus Type II: An Open Reading Frame fór the Protease, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 3101-3115 (1985)]. Ezeket a peptideket és homológ peptideket a 2. és 3. példában ismertetett módon betegek szérumával vizsgáltuk arra a képességükre nézve, hogy detektálják-e az olyan antitesteket, amelyek felismerik a HTLV-2-t, különbséget tesznek-e a HTLV-2 és HTLV-1 között és kersztreaktívak-e.
A vizsgálatban használt szérum minták HTLV-2 pozitivitását PCR analízissel ellenőriztük. A HT-201 - HT220 jelű szérumokat a Serologicals Inc., Pensacola, Fia intézettől szereztük be. Korábban a kutatók nem tudtak kükönbséget tenni a HTLV-1, illetve HTLV-2 fajlagos antitestek között ezekben a szérumokban Western folt elemzéssel, ELISA módszerrel vagy immunfluoreszcens vizsgálattal.
A 3. táblázatban összefoglaltuk az ELISA teszttel kapott eredményeket. Negatív kontrollként olyan szérumokat alkalmaztunk, amelyek mind HTLV-l-re, mind HTLV-2-re negatívak voltak, jelük NC-1 és NC-2, a HTLV-1 pozitív szérum jele HTLV-1. A HT-201 - HT-220 betegek szérumának jele 201-220. Az eredmények a 405 nm-nél leolvasott abszorbancia-értékek.
:
- 37 A 3. táblázatban található eredményekből látható, hogy a H-HTLV-2, O-HTLV-2, T-HTLV-2 és a Gag-HTLV-2 erősen reagált a HTLV-2-vel fertőzött betegek szérumában jelen levő antitestekkel. A peptidek gyengén reagáltak a HT-218 és HT219 jelű szérumokkal. Ezeket a szérumokat előzetes ELISA tesztben csak gyengén pozitívnek találtuk, ami arra utal, hogy a HTLV-2 fajlagos antitestek szintje ezekben a szérumokban alalcsony volt. Meglepő, hogy a HTLV-2 peptidek jól reagáltak HTLV-2-vei fertőzött betegek szérumával, és gyengén a HTLV-l-gyel fertőzött betegek szérumában levő antitestekkel. A Gag-l-HTLV-2 peptid nem olyan fajlagos, mint a többi három peptid.
Meglepő, hogy a többi peptid a legtöbb beteg szérumában nem detektálta a HTLV-2 elleni antitestet. Ezek a peptidek a HTLV-l epitopokat magában foglaló szekvenciáknak feleltek meg, és jól kellet volna reagálniuk a HTLV-l antitestekkel.
5. példa
A peptidek faj lapossága
A HTLV-l peptidek fajlagosságának jobb meghatározására ELISA tesztet végeztünk a 3. példa szerinti módon. A HHTLV-1, O-HTLV-1 és a T-HTLV-1 peptideket hasonlítottuk össze a H-HTLV-2, O-HTLV-2 és a T-HTLV-2 peptidekkel mind HTLV-l pozitív, mind HTLV-2 pozitív szérumokkal szemben vizsgálva.
A kapott eredményeket a 4. táblázat tartalmazza. A 2a, 2b, 2c, 2d, 2e és 2f jelű szérum öt különböző betegtől származott, és polimeráz lánc reakciós (PCR) vizsgálattal meghatározva HTLV-2 pozitív volt, továbbá humán immunhiányos betegség vírus (HÍV) pozitív volt. Az la, lb, le, ld, le és lf jelű szérum öt különböző betegtől származott, és polimeráz lánc reakciós (PCR) vizsgálattal meghatározva HTLV-l pozitív volt. Az la, lb és le beteg aduit T-sejt leukémiában, az ld, le és lf beteg HIV-ben szenvedett. A HIV-1 jelű szérum olyan betegtől származott, aki nem volt sem HTLV-l pozitív, sem HTLV-2 pozitív, de HÍV pozitív volt. Az NL->1 és NL2 jelű szérumok negatív kontroll minták olyan betegektől, akik nem voltak fertőzve sem HTLV-l-gyel, sem HTLV-2-vel.
A 4. táblázatban megadott eredmények két kísérlet átlagából adódtak, és a 405 nm-nél történt abszorbancia-leolvasást jelentik.
Az eredmények azt mutatják, hogy a peptidek fajlagossága nagy.
A fenti eredményekből nyilvánvaló, hogy az új szintetikus peptidek, amelyek a HTLV-l env és gag génjei által kódolt fehérjéknek felenek meg, a HTLV-l elleni antitestek jelenlétének kimutatására egyedülálló érzékeny reagenst jelentenek. Ezenkívül a H-HTLV-2 peptidek világosan különbséget tesznek az olyan antitestek között, amelyek a HTLV-l-t, illetve HTLV-2-t ismerik fel.
Bizonyos esetekben előnyös lehet legalább két peptidet alkalmazni a vizsgálatokban, mivel két peptid nagyobb gyakorisággal ad szeropozitív és érzékeny reakciót, mint egy. Ez azt is jelenti, hogy a hamis negatív reakciók gyakorisága csökken.
• · · • ·
| 04 | σ | 04 | cn | LÓ | η | π-> | 04 | 1— | m | Γ | 00 | rd | ο | σ | 04 | σ | οι | χτ | . rd | θ' | ||
| ΟΙ | σ> | m | ο | rd | ο | Ο | m | xr | ο | σ\ | σ\ | ο | ο | ο | η | σ | σι | 00 | ο | m | ||
| rd. | ο | rd | ι—1 | f—1 | r-d | Γ—1 | ’ Γ—1 | «—Η | ·—< | rd | ο | rd | ο | rd | γ—1 | rd | 04 | ο | ο | ο | rd | ·—I |
| ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ό | α | ο | ο | ο | ο | ο | ο | rd | ο | ο | ο | ο |
| σ | ο» | cn | ο | οι | οι | οι | οη | σ | 04 | 0 | m | ιη | οι | σ | m | σ | ΟΙ | οι | rd | ο | οι | αο |
| m | ο | 0 | rd | 04 | ο | οι | rd | rd | ο | rd | σ | οι | CD | ο | <D | Γ** | ο | ο | σ> | ο | rd | |
| rd | rd | rd | rd | rd | rd | ο | rd | rd | rd | rd | rd | Ο | rd | ο | rd | Ο | rd | rd | rd | ο | rd | rd |
| ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο |
| σ | m | 0 | ο | 0 | ιη | οη | οι | C0 | cn | ο | rd | ιη | m | ιη | σ | ιη | 04 | ιη | 10 | ιη | ||
| 04 | rd | m | 00 | ο | ιη | rd | ο | rd | ιη | ’Τ | Γ** | ο· | 10 | ΟΙ | αο | σ> | ο | σ\ | cn | Ο | ||
| ι—1 | rd | rd | ο | θ' | ^r | r< | οι | ΟΙ | rd | ο- | m | rd | CO | ιη | m | 04 | ο | m | rd | rd | ο | |
| ο | ο | ο | rd | ο | ο | ο | ΓΊ | 04 | ο | rd | rd | ο | <Ώ | rd | ο | rd | οη | rd | rd | ο | ο | rd |
| ο | ο | ο | ο | 00 | Γ** | rd | Γ | 00 | ιο | σ | Ο | 00 | *3* | ιη | 0 | 10 | ο | 00 | 00 | |||
| cn | rd | ο- | ΓΌ | ο | CD | ο | rd | 10 | ο | οι | σ\ | 0 | \0 | ο | οι | οι | ΟΙ | σ | ο | ’Τ | ||
| ι—1 | rd | rd | οη | rd | ο | ιη | m | rd | rd | ο | Ό | ο | rd | ιη | ιη | rd | ο | rd | ο | |||
| ο | ο | ο | rd | rd | ο | ο | rd | ο | ο | ο | ο | ο | οη | rd | ο | οη | cn | rd | ο | ο | ο | ο |
| Γ-1 | 10 | rd | rd | Γ** | ιη | 00 | ο | ΙΟ | ο | ο | οη | m | ιη | 00 | οι | CD | CD | ίο | 00 | cn | ||
| οι | ο | ο | ο | ο | ο | rd | ο- | cn | rd | rd | ο | οι | rd | ο | οι | ιη | Γ | σ | σι | 00 | ο | rd |
| r-1 | rd | οι | rd | rd | rd | rd | ο | rd | rd | rd | rd | rd | rd | rd | 10 | rd | cn | ο | ο | θ | rd | rd |
| ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | οι | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | rd | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο |
| ιη | rd | σ | 04 | cn | 04 | ιη | σ\ | ο | ιη | 10 | Γ- | rd | <0 | ο | ο* | Γ*· | cd | οι | r- | σι | ||
| σ | σ\ | 00 | 04 | 0 | αο | rd | m | οι | 00 | ο | 10 | ο | ΓΟ | rd | 00 | rd | οι | rd | ||||
| ο | ο | rd | sr | 0 | σ> | 0 | ο | οι | ιη | 0 | 00 | σ | Γ- | ιη | ο- | ο | Μ· | rd | rd | η | ||
| ο | ο | ο | cn | rd | Ο | ο | οη | οη | ο | rd | m | ο | cn | rd | ο | ΟΙ | cn | rd | rd | ο | ο | rd |
| 04 | 00 | σ | in | 00 | Ο | θ' | Γ* | rd | ο | ο | ο | ο | ο | οη | 10 | Γ | οι | rd | ιη | Γ' | ||
| m | ο | ο | o | in | Γ* | Ο | 00 | σ | 00 | <d | 00 | rd | αο | ιη | cn | 00 | Γ— | cn | οι | rd | Γ' | |
| rd | rd | 00 | cn | m | ιη | ιη | ιη | rd | m | οι | ο | οι | rd | 04 | οι | rd | rd | rd | ||||
| ο | ο | 04 | o | ο | ο | ο | rd | ο | ο | ο | ο | ο | οι | rd | ο | Ο | οι | ο | ο | ο | ο | ο |
| Γ·* | •’Τ | ο | in | ιη | 00 | 04 | CD | οη | αο | Ο | 10 | 00 | rd | m | ιη | ιη | σι | 10 | Γ*· | rd | ||
| ο | rd | 00 | o | cd | 00 | (D | ο | •—4 | σ> | CD | 00 | οι | σ | 00 | 04 | οι | η | σ | 00 | Γ' | 00 | ο |
| rd | rd | rd | rd | ο | ο | ο | rd | rd | ο | ο | ο | rd | ο | ο | rd | ιη | τ | ο | ο | ο | ο | rd |
| ο | Ο | Ο | O | ο | ο | ο | ο | Ο | ο | ο | ο | Ο | Ο | ο | Ο | Ο | Ο | Ο | ο | ο | ο | ο |
| m | \0 | 10 | o | ο | ο | οι | ο | ιη | οι | ο- | rd | m | ιη | Γ- | rd | \0 | ιη | 1—1 | 00 | <d | οι | |
| rd | ο | OS | ο | ο | σ> | ο | οι | οι | σ | σ | ο | CD | σ | ο | ο | σ | CD | 00 | σ | cn | ||
| rd | rd | rd | o | rd | rd | ο | rd | rd | rd | ο | ο | rd | ο | ο | rd | rd | rd | ο | ο | ο | ο | rd |
| Ο | ο | Ο | o | Ο | Ο | ο | Ο | ο | Ο | Ο | ο | Ο | ο | Ο | Ο | Ο | Ο | ο | ο | ο | ο | Ο |
| rd | 10 | cd | 00 | ιη | οι | ΠΊ | 10 | οι | ιη | m | 00 | m | θ' | ΟΙ | 04 | ο | ο | <0 | ||||
| Ή | 00 | 04 | Γ' | 00 | cd | cn | σ | σ | σ\ | 00 | 00 | 00 | 00 | 00 | ο | σ | οι | 00 | 00 | θ' | 00 | σ |
| rd | Ο | rd | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | rd | ο | rd | ο | ο | ο | ο | ο |
| ο | ο | Ο | ο | ο | ο | Ο | Ο | Ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | Ο | Ο | Ο | ο | ο | ο | ο | Ο |
| *3· | σ> | σ> | 04 | 00 | rd | ΙΟ | 00 | Γ* | . η | ο | rd | m | m | η | Γ* | 00 | 04 | |||||
| m | rd | ιη | ο | rd | rd | οι | ο | η | ο | οι | οι | ο | οι | rd | ιη | ο | cn | rd | rd | σ | ο | 10 |
| rd | rd | Γ* | rd | rd | rd | οι | οη | rd | rd | rd | rd | rd | 00 | rd | rd | rd | οι | rd | rd | ο | rd | rd |
| ο | ο | rd | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | Ο | ο | ο | rd | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο | ο |
| r—1 1 | οι 1 | > | rd | σι | οη | •*r | ιη | 10 | Γ- | οο | CD | Ο | rd | σι | cn | ^5* | in | 0 | r- | 00 | CD |
| υ | υ | Ε-ι | Ο | ο | ο | ο | ο | ο | Ο | ο | Ο | rd | rd | rd | rd | rd | rd | rd | rd | f-d | rd |
| ζ | ζ | X | 04 | 04 | σι | οι | 04 | 04 | σι | 04 | 04 | 04 | 04 | 04 | 04 | 04 | 04 | 04 | 04 | σι | 04 |
220
-Λ0cm i >
X I
O
| cn | o: | k0 | 00 | co | (Ή | CM | in | 00 | ® · | r- | CM | CN | co | |||
| m | o | m | in | r- | γ-h | σι | σ> | CM | co | CM | r—i | m | CM | 00 | ||
| ΓΗ | o | 00 | m | 10 | r* | o | o | o | o | <—4 | o | »—1 | <—1 | e—4 | r—1 | o |
| t—1 | rH | o | r—4 | o | o | o | o | o | o | o | o | o | o | o | o | o |
HTLV-1 és HTLV-2 megfelelő területeiből származtatott peptidek ELISA mérésének eredményei
Peptid
I
| > | m | m | o | σχ | σχ | o | CM | m | 00 | co | KO | o | o | cn | kD | σχ | |
| m | 'T | κο | KO | k£> | o | 10 | in | o | »-1 | CM | |||||||
| e< | o | o | o | o | o | o | r- | σ | ao | in | ΓΗ | r-4 | f—1 | r—< | i-4 | o | |
| X | • | ||||||||||||||||
| 1 O | o | o | o | o | o | o | f—4 | rH | r—1 | r—1 | f-4 | r-4 | o | o | o | o | o |
CN
I >
Eh
X
I
| 00 | ao | kŰ | σ | CM | o | o | σ | cn | <x> | O | o | tn | CH | in | ||
| o | CM | C | Γ· | CM | ’T | r* | o | m | o | Γη | m | f—1 | o | o | σ | |
| σχ | CM | r* | Γη | kD | o | r—1 | f—4 | i—4 | o | o | i—4 | i—1 | i—1 | »—1 | o | |
| o | f—1 | r—1 | o | í-4 | c-4 | o | o | o | o | o | O | o | o | o | o | o |
(
| > | KO | oo | 00 | cn | 00 | m | cn | 00 | o | σχ | CM | m | KO | ao | CM | CM | |
| i-J | CN | i£> | Γη | in | xr | co | ΓΗ | m | m | σ | r-4 | in | σ | σ | σ | in | |
| Eh | o | o | O | o | o | o | r* | r* | 00 | CO | r* | σχ | o | o | o | o | o |
| X | • | ||||||||||||||||
| 1 Eh | o | o | O | o | o | o | r-4 | «-4 | r-4 | r-| | r-4 | »—1 | o | o | o | o | o |
CN
I > X Eh X
X
| CM | i—4 | m | in | r-1 | 00 | f-4 | r* | CM | in | σχ | CM | »—4 | 00 | CN | ||
| kD | o | CM | r~ | ao | σ | CM | KO | ’T | 00 | m | o | r* | co | |||
| ·—1 | co | σχ | m | r* | o | o | o | o | o | o | o | o | ♦—1 | o | o | |
| r-1 | f-4 | r-4 | o | i—4 | r—1 | o | o | o | o | o | o | o | o | o | O | o |
i
| > | ID | r4 | r-4 | 00 | cn | cn | σι | n | in | 00 | m | CM | σ | rH | m | ao | o |
| J | »—4 | M· | m | CM | m | CM | ao | kD | kO | m | CM | r* | r* | 10 | m | CM | CM |
| Eh | o | o | o | o | o | o | ao | σχ | ao | σχ | σχ | 00 | o | o | o | o | O |
| X | • | ||||||||||||||||
| 1 | o | o | o | o | o | o | i—4 | r-4 | r—4 | í—í | r-4 | í-4 | o | o | o | o | o |
| X |
Φ P 0)
| 1 > | r-4 | ||||||||||||||
| 1 > | r-4 1 | CM 1 | |||||||||||||
| 05 | Λ | o | Φ | IM | (ΰ | Λ | υ | Ό | Φ | U-4 | Μ | n | J | iJ | |
| CM | CM | CM | CM | CM | CM | »—4 | Ή | <—4 | «—4 | r-4 | r-4 | X | Z | z |
Szérum
Claims (8)
- Szabadalmi igénypontok1. Antigén peptidek, amelyek a következő aminosavszekvenciákkal rendelkeznek, ezek analógjai és homológjai:- Val-Leu-Tyr-Ser-Pro-Asn-Val-Ser-Val-Pro-Ser-Ser-Ser-Ser-Thr-Pro-Leu-Leu-Tyr-Pro-Ser-Leu-Ala-OH,- Thr-Lys-Lys-Pro-Asn-Arg-Asn-Gly-Gly-Gly-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Ser-Tyr-Ser-Asp-Pro-Cys-Ser-Leu-OH,- Leu-Leu-Pro-His-Ser-Asn-Leu-Asp-His-Ile-Leu-Glu--Pro-Ser-Ile-Pro-Trp-Lys-Ser-Lys-Leu-Leu-Thr-OH,- Asn-Ser-Leu-Ile-Leu-Pro-Pro-Phe-Ser-Leu-Ser-Pro-Val-Pro-Thr-Leu-Gly-Ser-Arg-Ser-Arg-Arg-Ala-OH,- Ser-Leu-Leu-His-Glu-Val-Asp-Lys-Asp-Ile-Ser-Gln-Leu-Thr-Gln-Ala-Ile-Val-Lys-Asn-His-Lys-Asn-OH,- Gln-Leu-Arg-His-Leu-Pro-Ser-Arg-Val-Arg-Tyr-Pro-His-Tyr-Ser-Leu-Ile-Lys-Pro-Glu-Ser-Ser-Leu-OH.
- 2. Az 1 igénypont szerinti peptidek, azzal jellemezve, hogy olyan amino-terminálist tartalmaznak, amely egy a peptid hordozóhoz való kapcsolását megkönnyítő további aminosavat tartalmaz, a karboxi-termiálison aminocsoportot, hidroxilcsoportot, és azt követő ciszteinmaradékot, egy ciszteinmaradékot aminocsoportot vagy hidroxilcsoportot tartalmaz.
- 3. Eljárás HTLV-1 elleni antitestek detektálására biológiai mintákban, azzal jellemezve, hogy a mintát legalább egy olyan peptiddel érintkeztetjük, amely legalább egy a HTLV-l-re fajlagos antitestek által felismert epitopot tartalmaz, amely epitop a következő aminosav-szekvenciákon, • · · • · · · • * · · ···· ·«·» ··- 42 azok homológjain vagy analógjain belül helyezkednek el:- Val-Leu-Tyr-Ser-Pro-Asn-Val-Ser-Val-Pro-Ser-Ser-Ser-Ser-Thr-Pro-Leu-Leu-Tyr-Pro-Ser-Leu-Ala-OH,- Thr-Lys-Lys-Pro-Asn-Arg-Asn-Gly-Gly-Gly-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Ser-Tyr-Ser-Asp-Pro-Cys-Ser-Leu-OH,- Leu-Leu-Pro-His-Ser-Asn-Leu-Asp-His-Ile-Leu-Glu-Pro-Ser-Ile-Pro-Trp-Lys-Ser-Lys-Leu-Leu-Thr-OH,- Asn-Ser-Leu-Ile-Leu-Pro-Pro-Phe-Ser-Leu-Ser-Pro-Val-Pro-Thr-Leu-Gly-Ser-Arg-Ser-Arg-Arg-Ala-OH,- Ser-Leu-Leu-His-Glu-Val-Asp-Lys-Asp-Ile-Ser-Gln-Leu-Thr-Gln-Ala-Ile-Val-Lys-Asn-His-Lys-Asn-OH,- Gln-Leu-Arg-His-Leu-Pro-Ser-Arg-Val-Arg-Tyr-Pro-His-Tyr-Ser-Leu-Ile-Lys-Pro-Glu-Ser-Ser-Leu-OH, az érintkeztetést a peptid és a HTLV-1 elleni antitest közötti immunológiai koplex képződését biztosító körülmények között végezzük, és az immunológiai komplex képződését észleljük.
- 4. A 3. igénypont szerinti elljárás, azzal jellemezve, hogy olyan peptideket alkalmazunk, amelyek olyan amino-terminálist tartalmaznak, amely egy a peptid hordozóhoz való kapcsolását megkönnyítő további aminosavat tartalmaz, a karboxi-termiálison aminocsoportot, hidroxilcsoportot, ciszteinmaradékot, egy ciszteinmaradékot és azt követő aminocsoportot vagy hidroxilcsoportot tartalmaz.
- 5. Eljárás HTLV-1 elleni antitestek detektálására mintákban, azzal jellemezve, hogy a mintát legalább két olyan peptiddel érintkeztetjük, amelyek mindegyike legalább egy olyan epitopot tartalmaz, amelyet HTLV-1 antitestek fel• · * • *« · ♦ ·· * «··· ismernek, és amely az 1. vagy 2. igénypont szerinti szekvencián belül helyezkedik el, az érintkeztetést a peptid és a HTLV-1 elleni antitest közötti immunológiai koplex képződését biztosító körülmények között végezzük, és az immunológiai komplex képződését észleljük.
- 6. Kompozíció, azzal jellemezve, hogy legalább egy a következő aminosav-szekvenciák valamelyikével rendelkező peptidet vagy azok analógjai és homológjai közül egyet tartalmaz fiziológiailag elfogadható hordozó mellett:- Val-Leu-Tyr-Ser-Pro-Asn-Val-Ser-Val-Pro-Ser-Ser-Ser-Ser-Thr-Pro-Leu-Leu-Tyr-Pro-Ser-Leu-Ala-OH,- Thr-Lys-Lys-Pro-Asn-Arg-Asn-Gly-Gly-Gly-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Ser-Tyr-Ser-Asp-Pro-Cys-Ser-Leu-OH,- Leu-Leu-Pro-His-Ser-Asn-Leu-Asp-His-Ile-Leu-Glu-Pro-Ser-Ile-Pro-Trp-Lys-Ser-Lys-Leu-Leu-Thr-OH,- Asn-Ser-Leu-Ile-Leu-Pro-Pro-Phe-Ser-Leu-Ser-Pro--Val-Pro-Thr-Leu-Gly-Ser-Arg-Ser-Arg-Arg-Ala-OH,- Ser-Leu-Leu-His-Glu-Val-Asp-Lys-Asp-Ile-Ser-Gln--Leu-Thr-Gln-Ala-Ile-Val-Lys-Asn-His-Lys-Asn-OH,- Gln-Leu-Arg-His-Leu-Pro-Ser-Arg-Val-Arg-Tyr-Pro-His-Tyr-Ser-Leu-Ile-Lys-Pro-Glu-Ser-Ser-Leu-OH.
- 7. A 6. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy olyan peptideket tartalmaz, amelyek olyan amino-terminálist tartalmaznak, amely egy a peptid hordozóhoz való kapcsolását megkönnyítő további aminosavat tartalmaz, a karboxi-termiálison aminocsoportot, hidroxilcsoportot, ciszteinmaradékot, egy ciszteinmaradékot és azt követő aminocsoportot vagy hidroxilcsoportot tartalmaz.• 4 ·
- 8. Kompozíció, azzal jellemezve, hogy legalább két olyan peptidet tartalmaz fiziológiailag elfogadható hordozó mellett, amelyek mindegyike legalább egy olyan epitopot tartalmaz, amelyet HTLV-l-re fajlagos antitestek felismernek, és amely epitop a 6. vagy 7. igénypont szerinti aminosav-szekvencián belül helyezkedik el.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8902148A SE467542B (sv) | 1989-06-13 | 1989-06-13 | Syntetiska peptidantigener, immuniserande komposition och immunanalys foer htlv-1 antikroppar |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU906639D0 HU906639D0 (en) | 1992-02-28 |
| HUT61323A true HUT61323A (en) | 1992-12-28 |
Family
ID=20376281
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU906639A HUT61323A (en) | 1989-06-13 | 1990-06-12 | And treating htlv-1 peptides and antibodies against them for diagnosting htlv-1 infection and for vaccination against it |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0477301A1 (hu) |
| JP (1) | JP2650217B2 (hu) |
| KR (1) | KR0151860B1 (hu) |
| AU (2) | AU638727B2 (hu) |
| CA (1) | CA2062713A1 (hu) |
| FI (1) | FI915702A0 (hu) |
| HU (1) | HUT61323A (hu) |
| NZ (1) | NZ234049A (hu) |
| SE (1) | SE467542B (hu) |
| WO (1) | WO1990015820A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA904565B (hu) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5643714A (en) * | 1986-12-31 | 1997-07-01 | Genelabs Technologies, Inc. | Method and assay for HTLV |
| JP2807287B2 (ja) * | 1989-10-13 | 1998-10-08 | 株式会社医学生物学研究所 | ペプチドおよびその用途 |
| FI910245A (fi) * | 1990-01-24 | 1991-07-25 | United Biomedical Inc | Syntetiska peptidkompositioner med immunoreaktivitet mot htlv-antikroppar. |
| JPH07502483A (ja) * | 1990-08-29 | 1995-03-16 | アメリカ合衆国 | 新規ペプチド抗原およびそれを用いるイムノアッセイ、試験キットおよびワクチン |
| US5912338A (en) * | 1990-10-12 | 1999-06-15 | Benjamin Rovinski | Nucleic acids encoding self-assembled, non-infectious, non-replicating, immunogenic retrovirus-like particles comprising modified HIV genomes and chimeric envelope glycoproteins |
| US5773211A (en) * | 1991-07-10 | 1998-06-30 | Abbott Laboratories | Differentiation of HTLV-I and HTLV-II using synthetic peptides |
| JP3421336B2 (ja) * | 1991-07-10 | 2003-06-30 | アボツト・ラボラトリーズ | 合成ペプチドを用いてのｈｔｌｖ−▲ｉ▼とｈｔｌｖ−▲ｉｉ▼との区別 |
| CA2117378C (en) * | 1992-02-24 | 2003-04-15 | Steven K. H. Foung | Htlv-i/htlv-ii assay and method |
| US6406841B1 (en) | 1993-07-01 | 2002-06-18 | Abbott Laboratories | Methods for the detection of HTLV-II antibodies employing novel HTLV-II NRA envelope peptides |
| AU1443695A (en) * | 1993-12-20 | 1995-07-10 | Abbott Laboratories | Differentiation of htlv-i and htlv-ii using synthetic peptides |
| FR2844514B1 (fr) * | 2002-09-16 | 2007-10-19 | Neovacs | Produit immunogene stable comprenant des heterocomplexes antigeniques, compositions les contenant et procede de preparation |
| JP2015215244A (ja) * | 2014-05-12 | 2015-12-03 | 富士レビオ株式会社 | 免疫測定における抗ｈｔｌｖ抗体の検出感度を向上させる方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1249395A (en) * | 1982-09-30 | 1989-01-24 | Tetsuya Tachikawa | Human leukemia virus-related peptides, a process for production thereof, antibodies of the peptides and a process for production of the antibodies |
| CA1262014A (en) * | 1983-01-07 | 1989-09-26 | Mitsuaki Yoshida | Human leukemia virus-related peptides, antibodies of the peptides and a process for production of the antibodies |
| JPS6028993A (ja) * | 1983-07-22 | 1985-02-14 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | ヒト白血病ウイルス関連ペプチド |
| US4689398A (en) * | 1984-06-20 | 1987-08-25 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | HTLV test using synthetic peptides |
| US4833071A (en) * | 1987-01-09 | 1989-05-23 | United Biomedical, Inc. | Peptide composition as anitgen for detection of antibodies to HTLV-I, as a vaccine for ATL and methods therefor |
| AU613350B2 (en) * | 1988-01-12 | 1991-08-01 | Genelabs Technologies, Inc. | Htlv-i peptide antigen and assay |
| JPH02209889A (ja) * | 1988-02-08 | 1990-08-21 | Univ Duke | 合成親水性ペプチド |
| US5017687A (en) * | 1988-03-10 | 1991-05-21 | Virovahl, S.A. | Peptides for the detection of HTLV-1 infection |
| JPH0628993A (ja) * | 1992-07-10 | 1994-02-04 | Fujitsu Ltd | 電子ビーム装置 |
-
1989
- 1989-06-13 SE SE8902148A patent/SE467542B/sv not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-06-12 WO PCT/SE1990/000407 patent/WO1990015820A1/en not_active Application Discontinuation
- 1990-06-12 CA CA002062713A patent/CA2062713A1/en not_active Abandoned
- 1990-06-12 EP EP90917762A patent/EP0477301A1/en not_active Withdrawn
- 1990-06-12 JP JP2509469A patent/JP2650217B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-12 AU AU59453/90A patent/AU638727B2/en not_active Ceased
- 1990-06-12 HU HU906639A patent/HUT61323A/hu unknown
- 1990-06-12 KR KR1019910701844A patent/KR0151860B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-06-12 EP EP97103408A patent/EP0814090A1/en not_active Withdrawn
- 1990-06-13 ZA ZA904565A patent/ZA904565B/xx unknown
- 1990-06-13 NZ NZ234049A patent/NZ234049A/xx unknown
-
1991
- 1991-12-03 FI FI915702A patent/FI915702A0/fi not_active Application Discontinuation
-
1993
- 1993-10-08 AU AU48906/93A patent/AU654240B2/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0477301A1 (en) | 1992-04-01 |
| AU638727B2 (en) | 1993-07-08 |
| KR920702688A (ko) | 1992-10-06 |
| ZA904565B (en) | 1991-03-27 |
| JP2650217B2 (ja) | 1997-09-03 |
| FI915702A0 (fi) | 1991-12-03 |
| CA2062713A1 (en) | 1990-12-14 |
| SE467542B (sv) | 1992-08-03 |
| AU4890693A (en) | 1993-12-16 |
| EP0814090A1 (en) | 1997-12-29 |
| WO1990015820A1 (en) | 1990-12-27 |
| AU654240B2 (en) | 1994-10-27 |
| SE8902148D0 (sv) | 1989-06-13 |
| HU906639D0 (en) | 1992-02-28 |
| SE8902148L (sv) | 1990-12-14 |
| JPH04506077A (ja) | 1992-10-22 |
| NZ234049A (en) | 1993-02-25 |
| AU5945390A (en) | 1991-01-08 |
| KR0151860B1 (ko) | 1998-10-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0292454B1 (en) | Synthetic peptide antigen for the detection of hiv-2 infection | |
| CA1336529C (en) | Synthetic peptide antigens for the detection of htlv-1 infection | |
| CA1336473C (en) | Synthetic peptide antigens for the detection of hiv-1 infection | |
| HUT61323A (en) | And treating htlv-1 peptides and antibodies against them for diagnosting htlv-1 infection and for vaccination against it | |
| EP0317804B1 (en) | HIV peptides and methods for detection of HIV | |
| EP0538283B2 (en) | Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting hiv antibodies | |
| EP0326490B1 (en) | Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies | |
| EP0539405B1 (en) | Peptides and analogues and mixtures thereof for detecting antibodies to htlv-i and htlv-ii viruses | |
| US5283320A (en) | Peptides for HTLV-2 infection diagnosis of, therapy for, vaccination against, for distinguishing between HTLV-1 and HTLV-2 infections and antibodies derived therefrom | |
| US7053175B1 (en) | Synthetic peptides useful in biological assays for detecting infections caused by group O HIV-1 viruses | |
| EP0693938A1 (en) | Peptides for use in vaccination and induction of neutralizing antibodies against human immunodeficiency virus | |
| US6218102B1 (en) | Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies | |
| US6214537B1 (en) | Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies | |
| US6210874B1 (en) | Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies | |
| CA1338028C (en) | Synthetic peptide antigens for the detection of hiv-1 infection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |