HUT59828A - Process for producing oligosaccharid-containing inhibitors of endothelial celle-multiplication and inhibitors of angiogenezis - Google Patents

Process for producing oligosaccharid-containing inhibitors of endothelial celle-multiplication and inhibitors of angiogenezis Download PDF

Info

Publication number
HUT59828A
HUT59828A HU341490A HU341490A HUT59828A HU T59828 A HUT59828 A HU T59828A HU 341490 A HU341490 A HU 341490A HU 341490 A HU341490 A HU 341490A HU T59828 A HUT59828 A HU T59828A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
oligosaccharide
low
fraction
oligosaccharides
heparin
Prior art date
Application number
HU341490A
Other languages
English (en)
Other versions
HU903414D0 (en
Inventor
Karin Helena Louise Bergendahl
Rolf Arne Johansson
Jan Christer Mattsson
Carl Magnus Erik Svahn
Moses Judah Folkman
Judith Sudhalter
Amore Patricia D
Original Assignee
Kabivitrum Ab
Harvard College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kabivitrum Ab, Harvard College filed Critical Kabivitrum Ab
Publication of HU903414D0 publication Critical patent/HU903414D0/hu
Publication of HUT59828A publication Critical patent/HUT59828A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
    • C08B37/0078—Degradation products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H11/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by inorganic acids; Metal salts thereof

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)

Description

A találmány tárgya endoteliális sejtszaporodás és angiogenezis heparinból vagy heparán-szulfátból származó szacharid elegyekből álló új inhibitorai, különösen olyan szacharid elegyekből álló inhibitorok, amelyek főkomponenseként 6-8 szacharid egységet tartalmazó oligoszacharidot tartalmaznak, és szulfáttartalmuk alacsony. A találmány tárgya továbbá a fenti szacharid elegyek előállítása, és ezek terápiás alkalmazása.
Az angiogenezis, az új kapilláris véredények növekedése fontos szerepet játszik normális folyamatokban, például az embrió kifejlődésében, a sárgatest képződésben, valamint a sebgyógyulásban. Szerepe van patológiás folyamatokban is, például a krónikus gyulladásban, bizonyos immunválaszokban és kóros szövetképződésben. Az angiogenezis a legtöbb szilárd tumornak is jellemzője, és azok szaporodásához szükséges.
Az angiogenezis csökkentése többek között tumorok kezelésében kívánatos, különösen szilárd tumorok esetében, a szem neovaszkuláris megbetegedései esetén, például lencse mögötti rostszövetképződésnél, diabeteszes retinopátiánál és neuvaszkuláris glaukómánál, oszteoporózis kezelésénél, pszoriázis és artritisz esetén, valamint áttétek megakadályozása céljából.
Az új kapilláris véredények növekedése az endoteliális sejtekből indul, amelyek a véredényeket bélelik, és az endoteliális sejtek szaporodásának gátlása az angiogenezis egy modelljeként tekinthető.
Thorton és mtsai. [Science 222. 623-625 (1983)] arra a fel ismerésre jutottak, hogy a heparin in vitro potencírozza savas fibroblaszt növekedési faktor (aFGF) endoteliális sejtekre kifejtett mitogén aktivitását. A közelmúltban ezt a felismerést bővítették Sudhalter és mtsai. [J. Cell. Bioi. 107. 874a (1988)]. Sudhalter és mtsai. sertés vékonybél nyálkahártya heparint depolimerizáltak salétromossawal. Eredményül olyan fragmentek heterogén elegyét nyerték, amelyek diszacharidőktől mintegy 40 szacharid egységből álló poliszacharidokig terjedő szacharidokat tartalmaznak. A heparin fragmentek elegyét ioncserélő kromatográfiás eljárással és gélpermeációs kromatográfiás eljárással tovább frakcionálva különböző szulfatáltsági fokú, méretük szerint homogén oligoszacharidokat nyertek. Ezen szacharidoknak endoteliális sejtek szaporodására, hozzáadott aFGF nélkül, kifejtett hatásának vizsgálata azt mutatta, hogy egy három napos vizsgálat alatt minden vizsgált szacharid képes az endoteliális sejtszaporodás átlagosan 25 %-os gátlására. Az aFGF szuboptimális koncentrációban való jelenléte mellett legalább 10-12 szacharid egység hosszúságú molekula szükséges az aFGF által kiváltott sejtszaporodás potencírozására. A heparinéval azonos stimuláló hatás kiváltására erősen szulfátéit dodekaszacharidot (12 cukor egység) kellett használni. Azt is kimutatták, hogy az erősen szulfátéit hexaszacharid semmiféle hatást nem fejtett ki endoteliális sejtszaporodásra aFGF jelenlétében (lásd a 3. ábrán). Ez a hexaszacharid ugyanolyan gyenge gátló hatást mutat endoteliális sejtszaporodásra aFGF távollétében, mint más heparin eredetű oligoszacharidok, vagy a heparin maga.
A Ο 244 298A számú európai szabadalmi leírásban olyan hexaszacharid készítményt ismertetnek, amelyet aFGF tartalmú Sepharose oszlopon végzett affinitás kromatográfiás eljárással nyertek. Ez a hexaszacharid készítmény erősen szulfátéit [lásd a Lormeau és mtsai., Angiogenesis, Mechanisms and Pathobiology Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory 1987, 43. oldal szakirodalmi helyet is], a -(G-H)n-G- vagy -H-(G-H)n ismétlődő diszacharid szerkezet jellemzi, ahol G jelentése L-iduronsav-2-0-szulfát és H jelentése D-glükózamin-N-szulfát-6-O-szulfát. Ez a hexaszacharid készítmény aFGF jelenlétében köldök vénából származó endoteliális sejtekre gyenge stimuláló hatással bír [lásd a 0 244 298 A számú európai szabadalmi leírásban; és a 14. ábra c mintáján]. Más típusú sejtek, például patkány és borjú aorta simaizom sejtek, és patkány nyaki epiteliális sejtek esetén a heparinból származó hexaszacharidok bírnak némi burjánzásgátló hatása. Azonban ezeken az összes sejteken a szaporodásgátlás olyan erősen szulfátéit hexaszacharidokkal kapcsolatos [Wright és mtsai., J. Bioi. Chem. 264, 1534-1542 (1989)], amelyek kéntartalma jelentősen magasabb 9 tömeg %-nál.
A 0 114 589 számú európai szabadalmi leírásban olyan, emlősök angigenezisének gátlására szolgáló orális vagy szubkután adagolható készítményt ismertetnek, amelynek hatóanyaga lényegében 1 heparinból vagy olyan heparin fragmentből, amely hexaszacharid vagy annál nagyobb molekulájú, és 2) kortizonból vagy hidrokortizonból vagy hidrokortizon 11-a-izomerőéből áll. Az ilyen kétkomponensű elegyek emlősökben az angiogenezist • · • · · * · · ··· · · · « · · • · · · · « ♦ · ··· » · ···
- 5 ~ gátolják, emlősök tumorjainak visszafejlődését okozzák, és az áttétek kialakulását megelőzik [Folkman és mtsai., Science 221, 719-725 (1983)]. Az elegyektől más hatásokat is várnak, például neovaszkularizáció, így szem neuvaszkuláris megbetegedései, pszoriázis és artritisz kezelésére alkalmasnak vélik.
A 0 302 034A számú európai szabadalmi leírásban azt írják le, hogy terápiás célra heparin fragmentek, köztük hexaszacharid fragmentek rézkomplexeit tartalmazó új heparin származékok és valamely angiosztatikus komponens, előnyösen úgynevezett angiosztatikus szteroid komponens együttesét alkalmazzák.
Terápiás célra igen hasznos lenne egy olyan heparin eredetű készítmény, amely az angiogenezist anélkül gátolja, hogy szteroid jelenlétét igényelné. Hasznos lenne továbbá, ha az ilyen készítmény orálisan, valamint helyileg vagy parenterálisan adagolható lenne.
Nem várt módon arra a felismerésre jutottunk, hogy heparinból vagy heparán-szulfátból származó frakciók,- amelyek 6-8 szacharid egységet tartalmaznak, és szulfatáltságuk mértéke alacsony, a megfelelő erősen szulfátéit, az előzőekben leírt hexaszacharid frakciókkal ellentétben jelentősen fokozott gátló hatással bírnak endoteliális sejtek szaporodására, és jelentős antiangiogenikus jellemzőkkel bírnak anélkül, hogy angiosztatikus komponenst, például angiosztatikus szteroidot kellene velük együtt alkalmazni.
A fentieknek megfelelően a találmány tárgyát képezik a heparinból, vagy heparán-szulfátból származó olyan frakciók, amelyek alacsony, 1000 és 2000 közötti molekulatömegű oligo szacharidok, és amelyekre jellemző, hogy az említett alacsony molekulatömegű oligoszacharidok nagyobb része kevéssé szulfátéit, kéntartalma 9 tömeg % alatti, és az említett frakció a kapilláris endoteliális sejtek burjánzását vagy az angiogenezist gátolja, de nincs jelentős antikoaguláns aktivitása.
Jellemzően az említett kevéssé szulfátéit oligoszacharidok molekulatömege 1000 és 1800 közötti, előnyösen 1000 és 1600 közötti. Előnyös, ha az említett kevéssé szulfátéit oligoszacharidok kéntartalma 7 tömeg % alatti, még előnyösebben 4 tömeg % alatti.
Előnyösen a frakció lényegében az említett alacsony molekulatömegű oligoszacharidokból áll, és előnyösen lényegében az említett kevéssé szulfátéit oligoszacharidokat tartalmazza.
Feltételezzük, hogy a kevéssé szulfátéit oligoszacharidok általában egy uronsav maradékot, egy glükózamin maradékot és egy galaktóz maradékot tartalmaznak. Ezek az oligoszacharidok tartalmazhatnak glükoronsav-maradékokat, és lényegében mentesek lehetnek az iduronsav maradékoktól. Az oligoszacharidok tartalmazhatnak xilóz maradékokat is. Közelebbről, úgy véljük, hogy a frakciók rendszerint tartalmaznak egy terminális xilóz maradékot, amely egy galaktóz maradékhoz kapcsolódik, amely egy további galaktóz maradékhoz kötődik. Úgy véljük, hogy a második galaktóz maradék általában egy uronsav maradékhoz kötődik, amely utóbbi egy glükózamin egységen át egy második uronsav egységhez kötődik. Az említett glükózamin-uronsav diszacharid egység ismétlődhet oktaszacharidot alkotva. Előnyösen bármely glükózamin egység N-acilezett, és adott esetben a 6-helyzetben • · · • ·» · · « ··· ··* ·« ···
- 7 egy szulfátcsoportot hordozhat.
Azt is feltételezzük, hogy a kevéssé szulfátéit oligoszacharidok lényegében 6-8 szacharid egységből áló oligoszacharidok.
Előnyösen a frakciók angiogenezis gátlására képesek tyúktojás korioallantoin membránban 1 Mg és 50 Mg közötti dózisban adagolva.
A találmány tárgyát képezik angiogenezis gátlására alkalmas frakciók, ezen frakciók alkalmazása angiogenezis gátlására szolgáló gyógyászati készítmények előállítására, angiogenezis gátlása ezen frakciók alkalmazásával, valamint a fenti frakciókat és gyógyászati szempontból elfogadható hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokat tartalmazó gyógyászati készítmények.
Célszerűen a találmány szerinti új frakciókat marhából, sertésből vagy más emlősből származó heparinból vagy heparánszulfátokból, alacsony molekulatömegű heparinokból vagy heparánszulfátokból, heparinok vagy heparán-szulfátok fragmentjeiból, ezen termékek bármelyikéből származó oligoszacharidőkből, 6-8 szacharid egységet tartalmazó méret szerint homogén oligoszacharidőkből és heparin vagy heparán szulfát más frakcióiból, például heparingyártás melléktermékeiből izoláljuk.
Amint azt az előzőekben ismertettük, az új frakciók tartalmazhatnak egy uronsav maradékból és egy glükózamin maradékból álló diszacharid szekvenciákat. Az uronsav maradék vagy glükuronsav vagy iduronsav, adott esetben a 2-helyzetben szulfátcsoporttal helyettesített. A legszokásosabb uronsavegység a szulfát helyettesítő nélküli glükuronsav. Amint azt az • · · r *· • · · ·«· · * « • · · · · • *· ·*« *· ·a·
- 8 előzőekben ismertettük, a glükózamin egység az aminocsoporton előnyösen acetilezett, és adott esetben a 6-helyzetben egy szulfátcsoportot hordozhat. Azonban más megvalósítási mód szerint az oligoszacharid glükózamin egységeinek egyike az aminocsoporton szulfátcsoporttal helyettesített lehet, vagy az aminocsoporton egyáltalán nem helyettesített. A galaktóz egységek egyike adott esetben egy szulfátcsoportot hordozhat, és a xilóz egység adott esetben foszfátcsoportot hordozhat. Adott esetben az oligoszacharidhoz a xilóz egységen át egy oxigénhez kötődő szerin egység kapcsolódhat.
A találmány szerinti új frakciókat heparint és/vagy heparán-szulfátot tartalmazó termékek kémiai vagy enzimes módszerrel történő részleges vagy teljes depolimerizálásával állítjuk elő. A kémiai eljárásokban általában nitrit reagenst, például salétromossavat, előnyösen annak nátriumsóját vagy egy szerves nitritet alkalmazunk vizes oldószerben, vagy egy lúgos reagenst, például nátrium-hidroxidot alkalmazunk vizes oldószerben, vagy kvaterner ammónium-hidroxidot használunk szerves oldószerben.
Ha lúgos reagenst alkalmazunk, a kiindulási anyagul használt heparint/heparán-szulfátot előnyösen a karbonsav-csoportokon észterezzük. A depolimerizáláshoz alkalmazhatunk enzimeket is, például heparinázt, heparitinázt vagy B-glükuronidázokat. A depolimerizálást követően az újonnan képződött végcsoportokat nátrium-bór-hidriddel vagy hidrogéngáz és fémkatalizátor alkalmazásával redukálhatjuk, vagy abban az esetben, ha anhidromannóz képződik, az anhidromannánsav terminális egysé*1 * · »« · • «
- 9 geket oxidálással alakíthatjuk ki. Az így kapott frakciókat ezután ioncserélő kromatográfiás eljárással frakciónáljuk alacsony vagy emelt nyomáson, gyenge vagy erősen bázisos anioncserélő gyantát alkalmazva, és/vagy gélpermeációs kromatográfiával végzünk frakcionálást alacsony vagy emelt nyomáson, hogy kinyerjük a főkomponensként 6-8 szacharid egységet tartalmazó kevéssé szulfátéit oligoszacharidokat tartalmazó frakciókat. A méret szerint homogén és csökkent mennyiségű szulfátcsoportot tartalmazó frakciók kinyerése érdekében további frakcionálást végezhetünk ioncserélő kromatográfiás és/vagy gélpermeációs kromatográfiás eljárással. Anioncserélő gyantaként alkalmazhatunk DE-32 (Whatman) vagy AmberliteR IPA-47, 401, 904, DowexR, lxl, 1x2, DEAE-SepharoseR, Q-SepharoseR és Mono QR (Pharmacia) gyantákat. A szulfatáltság (töltéssűrűség) szerint való elválasztást végrehajthatjuk úgy is, hogy kvaterner ammóniumionnal, például cetil-trimetil-ammóniummal, cetil-piridiniummal, HyaminR-nal, benzalkóniummal vagy más kvaterner ammóniumionokkal komplexet képzünk, majd a legerősebben szulfátéit (erősen töltött) frakciókat szerves oldószerrel, például etanollal, metanollal vagy acetonnal kicsapjuk, és a kevéssé szulfátéit (kevesebb töltéssel bíró) frakciókat az anyalúgból kinyerjük. A kevéssé szulfátéit frakciókban való dúsulást elérhetjük úgy is, hogy a heterogén elegyből a kevéssé szulfátéit részt alkoholos oldószerrel végzett extrahálással (az oldószer 45 %-nál kevesebb vizet tartalmaz) kiextraháljuk, és az oldott, kevéssé szulfátéit oligoszacharidokat az oldószer lepárlásával kinyerjük.
A találmány szerinti új frakciók klinikai gyakorlatban való «·*· «<·· ·« • · ♦ Ί · · ·*· ·«» Λ · « • * · · · ·*· · · * ·« · · ·
- 10 alkalmazása lényegében a heparin és az alacsony molekulatömegű heparin alkalmazásának megfelelő. így alkalmazhatunk helyi adagolást, parenterális, különösen intravénás, intramuszkuláris vagy szubkután injekció formájában való adagolást. Kívánt esetben alkalmazhatunk helyi adagolást, például szembe vagy tumorra. Előnyösen azonban a találmány szerinti frakciókat alacsony molekulatömegük és alacsony szulfáttartalmuk (amely csökkent töltéssel jár) folytán orálisan adagoljuk.
Helyi adagolásra általában 0,1 - 10 mg/nap dózist alkalmazunk. Parenterális adagolásra általában 10 - 1000 mg/nap, orális adagolásra 5 g/nap vagy akár 10 g/nap dózisig terjedő mennyiséget alkalmazunk.
A heparinból és/vagy heparán-szulfátból származó kevéssé szulfátéit oligoszacharid frakciók jellemző vonásai a következők:
(a) fokozott gátló hatással bírnak angiogenezisre (b) a fenti gátló hatás létrejöttéhez nincs szükség további angiosztatikus szteroid alkalmazására;
(c) erősen gátolják a hajszálér endoteliális sejtek szaporodását;
(d) savas fibroblaszt növekedési faktor (aFGF) jelenlétében is erősen gátolják a hajszálér endoteliális sejtek szaporodását; és (e) nem bírnak jelentős antikoaguláns aktivitással (azaz antikoaguláns aktivitásuk nem haladja meg az 5 E/mg értéket) anti-FXa vizsgálat eredménye szerint.
A következőkben a találmány jelenleg előnyösnek tartott megvalósítási módját mutatjuk be nem-korlátozó példákban és ábrákon.
Először az ábrák leírását adjuk.
Az 1. ábrán az LSH-1 jelölésű találmány szerinti, kevéssé szulfátéit oligoszacharid (amely feltételezésünk szerint döntően hexaszacharid) angiogenezist gátló hatását mutatjuk be ahhoz a heparinhoz hasonlítva, amelyből az LSH-1 készült. A vizsgálati eljárást a leírásnak a biológiai vizsgálatokra vonatkozó részében ismertetjük. Minden egyes oszlop 20-50 tyúktojáson mért vizsgálatok átlaga. HC jelentése hidrokortizon.
A 2. ábrán heparinnak aFGF hajszálér endoteliális sejtekre gyakorolt mitogén hatására való hatását mutatjuk be. A sejtburjánzásra vonatkozó vizsgálatokat a későbbiekben a biológiai vizsgálatoknál leírt módon végeztük, a sejtburjánzást különböző dózisokban adott aFGF-val (2,5-40 3T3 egység) váltottuk ki heparin (10 gg/ml) jelenlétében vagy távollétében. Három napos inkubálás után a sejteket tripszinnel kezeltük és elektronikus úton számoltuk.
A 3. ábrán heparinból származó, különböző méretű és különböző szulfatáltsági fokú oligoszacharidok hatását mutatjuk be aFGF hajszálér endoteliális sejtekre kifejtett mitogén hatására. A sejtburjánzási vizsgálatokat az alábbiakban a biológiai vizsgálatoknál leírt módon végeztük. Kontrollként önmagában aFGF jelenlétében (2 E/ml) szaporított sejteket (üres oszlop) és 2 E/ml aFGF és 10 μg/ml teljes heparin jelenlétében (kitöltött oszlop) tenyésztett sejteket alkalmaztunk. Az aFGF-val stimulált sejtburjánzást csak a találmány szerinti alacsony szulfatáltsági ···· ·· · • · * ·· • ·8 »·· · · · • · · » · ··· ·«» «· Μ» fokú oligoszacharid (LSH-1) gátolta.
A 4. ábrán heparinból származó, különböző méretű és különböző szulfatáltsági fokú oligoszacharidok hatását mutatjuk be aFGF hajszálér endoteliális sejtekre gyakorolt mitogén hatására. A sejtburjánzási vizsgálatokat az alábbiakban ismertetésre kerülő biológiai vizsgálatoknál írjuk le. A kontrollok önmagában 2 E/ml aFGF jelenlétében tenyésztett, és 2 ng/ml humán rekombináns aFGF és 10 Mg/ml heparin együttes jelenlétében tenyésztett sejtek. Az alacsony szulfatáltsági fokú LSH-1 oligoszacharidok négy alfrakciója közül három fokozott mértékben gátolta a sejtburjánzást, míg a negyedik alfrakció (HSH-2), amelynek szulfáttartalma magasabb, mint a kiindulási LSH-1 frakcióé, a LSH-1 gátló hatásánál kisebb hatással bírt.
Az 5. ábrán heparinból származó, különböző szulfatáltsági fokú oligoszacharidok hajszálér endoteliális sejtekre gyakorolt hatását mutatjuk be. A sejtburjánzási vizsgálatokat az alábbiakban biológiai vizsgálatoknál leírt módon végezzük. A kontrollok víz jelenlétében (amely a heparin és a szacharidok hordozóanyaga) , illetve heparin önmagában való jelenlétében szaporított sejtekből állnak. Minden találmány szerinti kevéssé szulfátéit oligoszacharid, az LSH-1, LSH-4, LSH-5 és LSH-6 jó inhibitornak bizonyult, míg a magasabb szulfáttartalmú oligoszacharid (HSH-2) gátló hatása kisebb.
A 6. ábrán a találmány szerinti, LSH-1 jelölésű, kevéssé szulfátéit oligoszacharid Ή-NMR spektrumát mutatjuk be.
A 7. ábrán a találmány szerinti, LSH-5 jelölésű, kevéssé szulfátéit oligoszacharid ’H-NMR spektrumát mutatjuk be.
Az NMR spektrumokat D2O-ban JEOL GX-400 berendezésen (400 MHZ Ή) 25 °C hőmérsékleten, referenciaként 4,77 ppm-nél vizet alkalmazva vettük fel.
A 8. ábrán a találmány szerinti, LSH-10 jelölésű, kevéssé szulfátéit oligoszacharid (amely feltételezésünk szerint döntően hexaszacharid) hidrokortizon jelenlétében (+ HC) és hiányában (HC) kifejtett gátló hatását mutatjuk be ahhoz a heparinhoz (hidrokortizon jelenlétében) hasonlítva, amelyből készült. A vizsgálati eljárást az alábbiakban a biológiai vizsgálatoknál ismertetjük. Az egy-egy oszlopban ismertetett eredmények 20-50 tojásból származnak.
A 9. ábrán a találmány szerinti LSH-10 jelölésű, kevéssé szulfátéit oligoszacharid (amely feltételezésünk szerint hexaszacharid) és az LSH-11 jelölésű, kevéssé szulfátéit oligoszacharid (amely feltételezésünk szerint oktaszacharid) dózis-hatás összefüggését mutatjuk be aFGF-nak hajszálér endoteliális sejtekre gyakorolt mitogén hatására. A sejtburjánzási- vizsgálatokat az alábbiakban a biológiai vizsgálatoknál leírt módon végezzük. A kontrollok víz jelenlétében (amely a heparin és a szacharidok hordozóanyaga; ferdén vonalkázott oszlop), 2 ng/ml aFGF önmagában való jelenlétében (üres oszlop) és 2 ng/ml aFGF és 10 gg/ml teljes standard heparin együttes jelenlétében (kitöltött oszlop) szaporított sejtek. Az ábrán világosan látható, hogy a aFGF-vel stimulált sejtburjánzást növekvő LSH-10 és LSH-11 dózisok növekvő mértékben gátolják.
A 10. ábrán depolimerizált heparin gélpermeációs kromatogramját mutatjuk be, a kromatografálást Biogel-P6 oszlo14 ροη (1800 χ 50 mm) végezzük, eluensként 3 cm/óra sebességgel áramló 0,25 mól/l-es nátrium-kloridot alkalmazunk. A detektálást a refrakciós index alapján végezzük, és a kromatogram csúcsainak megfelelő frakciókat összegyűjtjük. Az oszlopra minden egyes futtatásnál 5 g olyan sóelegyet viszünk fel, amely salétromossawal depolimerizált heparinból származó, kevéssé és közepesen szulfátéit oligoszacharidok elegyét tartalmazza.
A 11. ábrán a találmány szerinti, LSH-11 jelölésű, kevéssé szulfátéit oligoszacharid (amely feltételezésünk szerint oktaszacharid) 1H-NMR spektrumát mutatjuk be. Ezt a spektrumot D2Oban, JEOL GX-400 eszközön (400 MHz Ή) 25 °C hőmérsékleten, referenciaként 4,73 ppm-nél vizet alkalmazva vettük fel.
A 12. ábrán depolimerizált heparin gélpermeációs kromatogramját mutatjuk be, a kromatografálást Biogel P6 oszlopon (1800 x 50 mm) végezve, eluensként 3 cm/óra sebességgel áramló nátrium-kloridot alkalmazva. A detektálást a refrakciós index alapján végezzük. 8 g depolimerizált heparint 0,25 mól/1 nátrium-kloridban oldva viszünk fel az oszlopra.
A 13. ábrán depolimerizált heparán-szulfát gélpermeációs kromatogramját mutatjuk be, a kromatografálást Biogel P6 oszlopon végezzük, eluensként 3 cm/óra sebességgel áramló, 0,25 mól/l-es nátrium-kloridot alkalmazunk. Az oszlopra 0,5 g depolimerizált heparán-szulfát 0,25 mól/l-es nátrium-kloridban készült oldatát visszük fel. Az eluálást a refrakciós index detektálásával követjük nyomon.
A 14. ábrán a találmány szerinti LSH-11 és LSH-12 jelölésű, kevéssé szulfátéit oligoszacharidok (feltételezésünk szerint hexaszacharidok) hatását vizsgáljuk a dózis függvényében hajszálér endoteliális sejtek burjánzására aFGF távollétében. A sejtburjánzási vizsgálatokat az alábbiakban a biológiai vizsgálatoknál leírt módon végeztük. A kontrollok víz jelenlétében (amely a heparin és a szacharidok hordozóanyaga; üres oszlop) és 10 μg/ml teljes standard heparin jelenlétében (kitöltött oszlop) tenyésztett sejtek. Az ábrából világosan látható, hogy a sejtburjánzás gátlása az LSH-11 és LSH-12 dózisok növelésével nő.
A 15. ábrán a találmány szerinti, LSH-11 és LSH-12 jelölésű, kevéssé szulfátéit oligoszacharidok hatását vizsgáljuk a dózis függvényében hajszálér endoteliális sejtek burjánzására aFGF jelenlétében. A sejtburjánzási vizsgálatokat az alábbiakban a biológiai vizsgálatok után leírt módon végeztük. A kontrollok víz (amely a heparin és a szacharidok hordozóanyaga; üres oszlop) és 4 ng/ml aFGF és 10 Mg/ml standard heparin (ferdén vonalkázott oszlop) jelenlétében tenyésztett sejtek. Az ábrából világosan látható, hogy az LSH-11 és LSH-12 növekvő dózisaival az aFGF által stimulált sejtburjánzás gátlása növekszik.
1. Példa
A heparin fragmenteket sertés vékonybél nyálkahártyából származó heparinnak salétromossawal végzett dezaminatív hasításával [lényegében Thunberg és mtsai. [FEBS Letter 117. 203-206 (1980) eljárása szerint], majd ezt követően nátrium-bód-hidriddel való redukálással [Horton és Philips, Carbohydr. Rés. 30. 367-374 (1973)] nyerjük. A heparin fragmenteket tartalmazó oldatot DEAE-Sepharose oszlopon • · ·
- 16 ioncserélő kromatografálással választjuk el, eluensként nátrium-klorid-oldatot alkalmazunk. Három frakciót szedünk, egy alacsony szulfáttartalmú frakciót 0,15 mól/1 nátrium-klorid eluenssel, kén/szén atomaránya elemanalízis szerint 0,14; egy közepes szulfáttartalmú frakciót 0,6 mól/1 nátrium-klorid eluens alkalmazásával, kén/szén atomaránya 0,19; és egy magas szulfáttartalmú frakciót 1,5 mól/1 nátrium-klorid eluens alkalmazásával, kén/szén atomaránya 0,21. Nagyteljesítményű gélpermeációs kromatográfiás vizsgálat (HPGC) eredményei szerint ezek a frakciók tetra- vagy hexaszacharidoktól az eredeti heparin szacharid egységeinek méretéig (átlagos Mr = 13 500) terjedő szacharid egységeket tartalmaznak. Mind az alacsony, mind a közepes, mind a magas szulfáttartalmú frakciókat további elválasztáson vittük át, méret szerint homogén, páros számú oligoszacharidokra választottunk gélpermeációs kromatografálással Sephadex G-50 Superfine oszlopon, Lane és mtsai. [Biochem. J. 218. 735 (1984)] eljárása szerint, így az 1. táblázatban bemutatott frakciókat nyertük. Tetraszacharidokat csak az alacsony szulfáttartalmú frakcióból nyertünk. Oligoszacharidokat - amelyeket hexaszacharidoknak vélünk - az alacsony, közepes és magas szulfáttartalmú frakciókból is nyertünk. Mivel a közepes és magas szulfáttartalmú frakciók kén/szén aránya is magas volt, ezeket a frakciókat összegyűjtöttük (az eredményeket az 1. táblázat magas szulfáttartalomra vonatkozó oszlopában mutatjuk be). Minden frakció szén-, nitrogén- és kéntartalmát a Mikro Kérni AB, Uppsala, Svédország elemezte. HPGPC vizsgálatot végeztünk két, egymással sorba kötött TSK G3000SH gélpermeációs oszlopon. Az ··« · ··
- 17 alkalmazott mozgó fázis 0,05 térfogat% ecetsavat és 0,02 tömeg/térfogat% nátrium-azidot tartalmazó 0,2 mól/l-es nátrium-acetát oldat. A mozgó fázis áramlási sebessége 0,5 ml/perc. A mintát az eluensben oldjuk, és markerként kék dextránt és nátrium-azidot adunk hozzá. A detektálást Rí-detektorral végezzük. A papírsebesség 2 mm/perc. A kromatogram csúcsainak meghatározását jellemzően szulfátéit (azaz diszacharid egységenként két szulfátcsoportot tartalmazó) diszacharidokhoz, tetraszacharidőkhöz és hexaszacharidokhoz hasonlítva határozzuk meg, amelyek tömegspektroszkópiásan jellemzettek.
Az a frakció, amely feltételezésünk szerint döntően kevéssé szulfátéit hexaszacharidokból áll (LSH-1) 8,6 % kéntartalmú, az a frakció, amely nézetünk szerint döntően erősen szulfátéit hexaszacharidokból áll (HSH-1) 11,9 % kéntartalmú, míg a kiindulási heparin kéntartalma 10,7 %. Az LSH-1 további jellemzői a 6. ábrán bemutatott Ή-NMR-spektrumból vonhatók le. Tojásonként 25 pg LSH-l-t 50 gg hidrokortizon jelenlétében alkalmazva az LSH-1 az angiogenezis 28 %-os gátlását mutatta, a HSH-1 angiogenezis gátló hatása csak 3 %. Az LSH-1 hidrokortizon távollétében mért aktivitását az 1. ábrán mutatjuk be. Az endoteliális sejtek burjánzásának aFGF jelenlétében bekövetkező jelentős gátlása a 3. ábrán látható.
« * « · · · · · ··· · «I · · ♦ • · · · · ··· ·♦· «· ···
1. Táblázat
Heparin1 salétromsavas depóiimerizálásával, ioncserélő kromatográfiás és gélpermeációs kromatográfiás elválasztással nyert oligoszacharidok jellemzői
A monoszacharidok Alacsony Közepes Magas
száma az oligo- szulfáttartalom
s z achar idokban kén/szén2 3 kén/szén kén/szén
4 0,16
6 0,14 0,20
8 0,13 0,18 0,20
10 0,11 0,19 0,21
12 0,11 0,17 0,21
14 0,11 0,19 0,22
16 0,11 0,17 0,22
18 3) 0,22
18-20 0,17
20 0,21
224 0,17 0,20
1) Sertés vékonybél nyálkahártyából nyert heparin, melynek kén/szén aránya 11 különböző heparin mintából meghatározva 0,18 ± 0,01.
2) A kén/szén atomarányt elemanalízissel határoztuk meg.
3) Poliszacharidok elegye, amely 18 monoszacharid egységből álló szacharidoktól az eredeti heparin átlagos méretéig terjedő elemekből áll, az elegy kén/szén arányát nem határoztuk meg.
4) Poliszacharidok elegye, amely 22 monoszacharid egységből álló poliszacharidok, és az eredeti heparin mérete közötti egységekből áll.
2. Példa
Heparin fragmentet nyerünk kimerítő salétromossavas depolimerizálással és ezt követően DEAE-Sepharose oszlopon való kromatografálással. Sephadex G-10-en való tisztítás után olyan oligoszacharidőkből álló frakciót nyertünk, amely feltételezésünk szerint döntően hexaszacharidokból áll. Elemanalízis alapján a frakció nitrogéntartalma 1,5 %, kéntartalma 3,2 %. LSH-2 25 gg mennyiségben, hidrokortizon jelenlétében, az angiogenezist 50 %-ban gátolja. Hidrokortizon jelenléte nélkül a gátlás magasabb.
3. Példa
Az 1. példa szerinti LSH-1 jelölésű alacsony szulfáttartalmú oligoszacharidot ioncserélő kromatográfiás eljárással, erős anionos ioncserélő gyantán, Mono Q 5/5 HR oszlopon (Pharmacia) tovább frakciónáljuk, eluensként nátrium-klorid gradienst alkalmazunk. A gradienst két LKB 2152 szivattyúval hozzuk létre, amelyet egy LKB 2152 egység irányít. Az eluenst 218 nm-nél ultraibolya detektorral (LKB 2151) mérjük.
mg LSH-l-t 1 ml vízben oldunk. Az oldatból 100 μΐ-t Rheodyne injektorral az oszlopra viszünk. Az elválasztást izokratikus eluálással végezzük, 1,0 ml/perc áramlási sebességgel 10 percig 60 mmól/l-es nátrium-kloridot, majd 1,0 ml/perc áramlási sebességgel, 55 percig lineárisan növekvő gradienssel 1,2 mól/1 nátrium-klorid koncentrációt érünk el. Végül a gradiens felső koncentrációján elért 1,2 mól/l-es nátrium-kloridot áramoltatjuk át 1,00 ml/perc sebességgel 15 percig. 1 ml-es frakciókat szedünk, és ezeket az alábbiak szerint gyűjtjük:
1. fraXció 1-10 ml
2. frakció 11-26 ml
3. frakció 27-40 ml
4. frakció 41-75 ml
A megfelelő frakciókat vákuumban bepároljuk, és P2 oszlopra (78 x 26 mm) visszük, majd vízzel, 11,3 cm/óra sebességgel eluáljuk. Az eluens refrakciós indexét detektáljuk, és 15 perces frakciókat szedünk. A szénhidrátot tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, majd liofilizáljuk. így három alacsony szulfáttartalmú oligoszacharid frakciót nyerünk, amelyek feltételezésünk szerint döntően hexaszacharidokból állnak (LSH-4, LSH-5 és LSH-6), továbbá nyerünk egy viszonylag magas szulfáttartalmú frakciót (HSH-2). Az endoteliális sejtek burjánázására kifejtett jelentős gátló hatást a 4. és 5. ábrán mutatjuk be.
LSH-4 1,5 mg (az 1. frakcióból) S < 3 %
LSH-5 4,8 mg (a 2. frakcióból) S < 3 % Ή-NMR spektrum
(7. ábra)
LSH-6 7,1 mg (a 3. frakcióból) S = 6,0 %
HSH-2 29,5 mg (a 4. frakcióból) S = 10,5 % N = 1,5 %
A 7. ábrából világosan látható, hogy az LSH-5-ben igen kevés N-szulfát-csoport van jelen, és nincs jelen szulfátéit iduronsav.
4. Példa
Sertés vékonybél nyálkahártyából származó heparint a heparin-metil-észter lúgos B-eliminálásával depóiimerizálunk a 0 302 034A számú európai szabadalmi leírásban ismertetett módon.
A terméket Sephadex G-50 oszlopra visszük, és 0,2 mól/l-es nátrium-kloriddal eluáljuk. A gyűjtött frakciók egyikének Sephadex G-10 oszlopon való sótalanítása után a molekulatömege 2000 (gélszűrés szerint) és anti-Xa aktivitása 5 E/mg alatti (A23i 19). Ebből a termékből 25 mg-ot Mono Q 10/10 (Pharmacia) erős ioncserélő gyantára viszünk. A frakciókat 0,03 mól/l-es, pH = 7,5-es trisz—HCl-pufferben lévő 0 és 1,5 mól/1 között növekvő nátrium-klórid gradienssel eluáljuk. Lineáris gradienst alkalmazunk 156 percen át. Az áramlási sebesség 4 ml/perc.
Sephadex G-10 és Sephadex G-15 oszlopon való sótalanítás után az
oligoszacharidokat három frakcióban gyűjtjük:
LSH-7 10 mg s = 8,9
LSH-8 3,8 mg
HSH-3 9 mg s = 12,6.
5. Példa
Sertés vékonybél nyálkahártyából származó heparint az 1. példában leírt módon depolimerizálunk. 8 g depóiimerizált heparint 0,25 mól/l-es nátrium-kloridban oldunk, és Biogel P-6 oszlopon (1800 x 50 mm) gélpermeációs kromatográfiás eljárásnak tesszük ki, eluensként 3 cm/óra sebességgel áramló 0,25 mól/l-es nátrium-klorid-oldatot alkalmazunk. A kromatografálás lefolyását a refrakciós index detektálásával követjük nyomon, a frakciókat a 12. ábrán látható csúcsok szerint gyűjtjük. A frakciókat Bio-gel P6DG víz alkalmazásával sómentesítjük, a detektálást refrakciós index alapján végezzük, ezután a frakciót liofilizáljuk. A 4-7 frakciókat a találmány szerinti alacsony szulfáttartalmú oligoszacharidok tekintetében tovább vizsgáljuk.
g 5. frakciót QAE A-25 klorid formájú ioncserélő gyantával töltött oszlopra (450 x 50 mm) viszünk, és 0,01 és 2,0 mól/1 nátrium-klorid között növekvő gradienst! oldattal eluáljuk, a detektálást 214 nm-nél UV detektorral végezzük. A 0,01 - 0,6 mől/1 nátrium-kloriddal eluálódó alacsony szulfáttartalmú oligoszacharidokat összegyűjtjük, és a fentiek szerint sómentesítjük. A kapott szacharidokból 200 mg-ot nagyteljesítményű ioncserélő kromatográfiás eljárással tovább tisztítunk, az eljárást Mono Q (10/10 HR) erős anioncserélő gyantával töltött oszlopon végezzük, eluensként nátrium-kloridot alkalmazunk. Először izokratikus eluálást végzünk 1,0 ml/perc áramlási sebességgel 10 percig 10 mmől/l-es nátrium-klorid alkalmazásával, majd 10 mmól/1 és 2,0 mól/1 közötti nátrium-klorid gradienst alkalmazunk. Az eluenst 218 nm-nél UV-ben detektáljuk. 1 ml-es frakciókat szedünk, és azokat az alábbiak szerint gyűjtjük össze:
1. frakció: 1-10 ml
2. frakció: 11-30 ml
3. frakció: 31-70 ml
Az 1. frakcióból bepárlás és az előzőekben leírt sómentesítés, majd liofilizálás után 9 mg LSH-10-t nyerünk. Cukoranalízissel az alábbi monoszacharidok jelenlétét állapítottuk meg: 3,0 % xilóz, 12,1 % galaktóz, 1,9 % fukóz és 14,8 % glükózamin. Nem találtunk galaktózamint, mannózamint és mannózt. Kis mennyiségű, 0,41 % anhidromannit és 0,08 mól szerin/mól glükózamin jelenlétét mutattuk ki. Elemanalízis szerint a foszfortartalom 1,0 %, a kéntartalom 0,5 %.
NMR-spektrummal N-acetil-glükózamin és glükuronsav jelenlétét észleltük, nem észleltük nem-szulfatált és szulfátéit iduronsav jelenlétét. Negatív módon futtatott FAB tömegspektrumban legmagasabb csúcsként az M/Z 1194 és 1176-csúcsokat találtuk. A hajszálér endoteliális sejtek burjánzásának gátlását a 9. ábrán, az angiogenezis gátlását a 8. ábrán mutatjuk be.
6. Példa
Heparint salétromossawal az 1. példában leírt módon depolimerizálunk. 40 g depóiimerizált heparint 150 ml vízben oldunk, és QAE Sephadex oszlopon (A-25 (750 x 50 mm) ioncserélő kromatográfiás eljárással tisztítjuk. Az eluálást vízzel végezzük, egy alacsony és egy közepes szulfáttartalmú oligoszacharid frakciót nyerünk, amelynek oligoszacharid egységei tetraszacharid és eikozaszacharid közöttiek (1. frakció), és 2 mól/1 nátrium-kloriddal végzett eluálással magas szulfáttartalmú, hasonló méretű oligoszacharidokból álló frakciót nyerünk (2. frakció). Az eluenst 214 nm-nél UV-detektálással ellenőrizzük. A vízzel eluált frakciót (1. frakció) bepároljuk, és a szilárd maradékból 5 g-ot vízben oldunk, és Biogel P-6 oszlopon (1800 x 50 mm) gélpermeációs kromatográfiás eljárással kezelünk, eluensként 3 cm/őra sebességgel áramló 0,25 mól/l-es nátriumkloridot alkalmazunk. A kromatografálást a refrakciós index detektálásával követjük nyomon, a frakciókat a kromatogram csúcsainak megfelelő módon gyűjtjük (lásd a 10. ábrán). A megfelelő frakciókat bepároljuk, és kromatográfiás eljárással Biogel P-6DG gél oszlopon (220 x 50 mm) sőmentesítjük, eluensként 3 cm/óra sebességgel áramló vizet alkalmazunk. A szénhidráttar talmú anyag detektálását refrakciós index alapján végezzük. A 37. frakciókat (lásd a 10. ábrán) a találmány szerinti alacsony szulfáttartalmú oligoszacharidok szempontjából tovább vizsgáljuk.
200 mg 5. frakciót QAE 25 oszlopra (750 x 50 mm) viszünk, eluensként 0,01 és 2,0 mól/liter között növekvő nátrium-klorid gradienst alkalmazunk. A kromatogram három csúcsának megfelelő három frakciót (5A-C) összegyűjtjük és sómentesítjük. Az első frakciót (5A) preparatív nagyteljesítményű ioncserélő kromatográfiás eljárással kezeljük Mono Q erős anioncserélő gyantával töltött 16/10 HR oszlopon, eluensként nátrium-klorid-gradienst alkalmazunk. Izokratikus eluálást végzünk 4,0 ml/perc áramlási sebességgel 23 percig 10 mmól/l-es nátrium-kloriddal, majd 10 mmól/1 és 2,0 mól/1 közötti gradiensű nátrium-kloridot alkalmazunk. Az eluátumot 218 nm-nél ultrabiolya detektorral vizsgáljuk. A legnagyobb csúcsot, az LSH-ll-t, amely mintegy 25 percnél eluálódik, bepároljuk, és az előzőek szerint sómentesítjük. így 7 mg LSH-ll-t nyerünk, amelyből cukoranalízist végzünk hidrolízissel, származékképzéssel és GLC-MS eljárással, ezek alapján 14,4 % glükózamin, 3,2 % xilóz és 11,8 % galaktóz jelenléte mutatható ki. Nem mutatható ki fukóz, mannóz, mannózamin, galaktőzamin és anhidromanit. Elemanalízis szerint a frakció foszfortartalma 0,2 %, kéntartalma 0,2 %. NMR spektrum N-acetil-glükózamin és glükuronsav jelenlétét, valamint iduronsav és 2-0-szulfatált iduronsav hiányát jelzi (lásd a 11. ábrán). Negatív módon futtatott FAB tömegspektrum esetén a legmagasabb csúcs M/Z 1553-nál, egy alap csúcs M/Z 1429-nél található.
Észlelhetők csúcsok M/Z 1451, 1473, 1487, 1509 és 1531-nél is, ezek oligoszacharidok jelenlétét jelzik. LSH-ll-nek savas FGF jelenlétében hajszálér endoteliális sejtek burjánzására gyakorolt erős gátló hatását a 9. ábrán mutatjuk be. A hajszálér endoteliális sejtek burjánzására aFGF hiányában gyakorolt gátló hatás is igen magas, ez a 14. ábrán látható.
mg 3. számú frakciót Mono Q (16/10 HR) oszlopon preparatív nagyteljesítményű ioncserélő kromatográfiás eljárással kezelünk, az oszlopot nátrium-klorid-gradienssel eluáljuk. Az elválasztást először 3 ml/perc áramlási sebesség mellett 30 percig, 10 mmól/l-es nátrium-kloriddal végzett izokratikus eluálással, majd 10 mmól/1 és 2,0 mól/1 között növekvő gradiensű nátrium-kloriddal végezzük. Az eluátumot 218 nm-nél UV-detektorral vizsgáljuk. A 17. perc körül eluálódó csúcs oldatát bepároljuk, és az előzőek szerint sómentesítjük, így 15 mg LSH-12-t nyerünk. Elemanalízis szerint a frakció foszfortartalma 0,4 %, kéntartalma 0,2 %. Hidrolízist, származékképzést és GLC-MS-t magában foglaló cukorelemzés szerint a frakció 10,5 % glükózamin-hidrogén-kloridot, 11,1 % galaktózt és 2,0 % xilózt tartalmaz. Fukóz, mannózamin, galaktózamin és anhidromannit nem volt kimutatható. NMR spektrum N-acetil-glükózamin és glükuronsav jelenlétét, iduronsav és 2-O-szulfatált iduronsav hiányát mutatta. Negatív módon futtatott FAB tömegspektrum legmagasabb csúcsa M/Z 1198 és 1176, alapcsúcsa M/Z 1074, ami hexaszacharid jelenlétét mutatja. Az endoteliális sejtek burjánzásának gátlása mind aFGF jelenlétében, mind ennek hiányában igen erős. Az aFGF hiányában gyakorolt gátló hatást a 14. ábrán, az aFGF jelenlété• 9
- 26 ben kifejtett gátló hatást a 15. ábrán mutatjuk be.
7. Példa
Marha tüdő heparin gyártásának melléktermékéből Dowex 1-X2 ioncserélő kromatográfia alkalmazásával heparán-szulfátot készítünk. A heparán-szulfátot 1,5 mól/l-es nátrium-kloriddal eluáljuk. A kapott heparán-szulfát összetétele elemzési eredmények szerint: C = 25,3 %, H= 3,7 %, N = 2,2 %, és S = 6,4 %. Az SO3 2-/CO2“ arány konduktometriás titrálás alapján 1,5. Az optikai forgatóképesség [α]ϋ23 = 83,8° (c = 2, víz). Az anti-FXa 6 NE/mg. Aminocukrok analízisével galaktózamin jelenlétét nem tudtuk kimutatni. Ezt a heparán-szulfátot az 1. példában heparinra leírt módon depolimerizáljuk. 0,5 g depolimerizált heparán-szulfátot 0,25 mól/l-es nátrium-kloridban oldunk, és Biogel P-6 oszlopra (1800 x 50 mm) visszük. Az oszlopot 0,25 mól/l-es nátrium-kloriddal eluáljuk. A 13. ábrán bemutatott kromatogram csúcsainak megfelelő frakciókat összegyűjtjük, Biogel P-6DG-on sómentesítjük, majd liofilezzük. A 13. ábrán bemutatott kromatogram 2., 3. és 4. frakcióit MonoQ (5/5) oszlopon nagyteljesítményű ioncserélő kromatográfiás eljárással elemezzük, eluensként a 6. példában leírt nátrium-klorid-gradienst alkalmazzuk. Ezen frakciók kromatogramjai a heparinból származó megfelelő találmány szerinti alacsony szulfáttartalmú oligoszacharidokéval azonos elúciós pozíciójú frakciókat adnak.
Biológiai vizsgálatok
Korioallantoin membrán (CAM) angiogén válaszát vizsgáltuk • · • · « megtermékenyített tyújktojásokon az új, alacsony szulfáttartalmú oligoszacharidot tartalmazó frakciókra. Nem-inkubált (O-napos) megtermékenyített tojásokat [eredete: Linköpings
Kontrollhönseri, Linköping, Svédország] alacsony, 13 - 17 °C hőmérsékletű inkubátorban tárolunk addig, míg a tojás-inkubátorban Andersson & Bonde TYP 40) 37 °C hőmérsékleten való inkubálást meg nem kezdjük. A 37 °C hőmérsékleten inkubált tojásokat az inkubálás 3. napján (3-nap) feltörjük, és teljes tartalmukat Petri-csészébe öntjük. A további inkubáláshoz csak a sértetlen sárgájával bíró tojásokat használjuk, az inkubálást 37 °C hőmérsékleten, 3 % szén-dioxidot tartalmazó, emelt nedvességtartalmú szén-dioxid szövettenyésztő inkubátorban végezzük. Szén-dioxid atmoszférában végzett 3 napos inkubálás (6-nap) után a tojásokba az alábbiakban leírt módon elkészített cellulóz lemezt ültetünk. Háromszor desztillált vízbe 0,5 % koncentrációban metil-cellulózt adunk, majd ezt 138 kPa nyomáson 120 °C hőmérsékleten autoklávban sterilezzük. Az elegy gélesedett metil-cellulóz golyót tartalmaz. Ezt követően 2-3 napig 5 °C hőmérsékleten végzett lassú keveréssel biztosítjuk a teljes oldódást. Az oldatot felhasználásig hűtőszekrényben tároljuk. A vizsgálandó anyagot a metil-cellulózban szobahőmérsékleten 1-50 Mg/10 ml végkoncentrációig szuszpendáljuk. 10 pl metil-cellulóz tartalmú vizsgálati minták alikvot részeit 3 mm átmérőjű TeflonR bot végére helyezzük. Ha a metil-cellulóz vizsgálati anyag lemez már száraz (30-40 perc elteltével), három finom csipesszel leemeljük a teflon botról, és a 6-napos CAM külső részére helyezzük, hogy elkerüljük a szaporodás nélküli • ·
- 28 csészéket. A 8. napon 26-szoros és 40-szeres közötti nagyítású boncoló mikroszkóp alatt megvizsgáljuk azokat a csészéket, amelyek az átlátszó lemez alatt és körül szaporodást mutatnak. Az egyes csészékben való szaporodás gátlását gátló hatásként vagy gátló hatás hiányaként értékeljük. Minden vegyületet legalább 15 tojáson vizsgálunk meg, és az értékelést két technikus végzi, akik a vizsgálati anyag természetéről és koncentrációjáról nem bírnak információval. Az eredményeket a gátlást mutató tojások százalékos értékeként adjuk meg.
Szövettenyészet
Marha vesekéregből hajszálér endoteliális sejteket (EC) izolálunk, és ezeket tenyésztjük Folkman és mtsai. [Proc. Natl. Acad. Sci. 76, 5217-5221 (1979)] eljárása szerint. A sejteket 10 % borjúszérummal és 5 μΐ/ml nyers retina extrakttal kiegészített Dulbecco-féle módosított Eagle tápközegen (DMEM) [Gitlin J.D. és D'Amore, Microvas. Rés. 26, 74-80 (1983)] zselatinnal bevont szövettenyésztő lemezeken tenyésztjük. A sejtek endoteliális természetét von Willebrand-faktor elleni antiszérummal való színeződés, és a sejteknek fluoreszceinezett, acetilezett, kis sűrűségű lipoprotein felvételére való képessége alapján határozzuk meg.
Burjánzás! vizsgálatok
A különböző heparin-eredetű oligoszacharidoknak azt a képességét, hogy endoteliális sejteknek tisztított aFGF jelenlétében vagy hiányában való szaporodását befolyásolják, egy hajszálér endoteliális sejt burjánzási vizsgálatban határozzuk meg. A hajszálér endoteliális sejteket 10 000 sejt/lyuk sejt• » » • · w * · · • · · ··· 9 · · • · · * · ·«· ··· ·· ···
- 29 számmal zselatinnal bevont többlyukú (2,1 cm2/lyuk) lemezekre szélesztjük 5 % borjúszérumot tartalmazó DMEM-re, és éjszakán át hagyjuk megtapadni. A következő napon a tápközeget kiszívjuk, és friss, 5 % borjúszérumot tartalmazó dMEM tápközeggel helyettesítjük. Potencírozási vizsgálat céljára a telítettnél kisebb dózisban alkalmazunk aFGF-t (1-5 3T3 egység/ml), ami 0,2-1 ng/ml aFGF-nek felel meg, ezt a vizsgálandó heparin fragment 10 ^g/ml koncentrációjával együtt adagoljuk; a gátlás vizsgálatára a heparinból származó oligoszacharidokat önmagukban alkalmazzuk. Az aFGF-t marha agyból Lobb R.R. és Felt J.W. eljárásával [Biochemistry 1984, 23., 6925-6929 (1984)] tisztítjuk. Külön tenyészetekhez intakt heparint és aFGF-t adunk, ezek kontrollként szolgálnak. A sejteket az adalékok jelenlétében 3 napig tenyésztjük, majd tripszinezzük, és Coulter számlálóval számláljuk.
A vizsgálatot nagyobb mennyiségű (2 ng/ml és 6 ng/ml) rekombináns DNS eljárással előállított humán aFGF jelenlétében is elvégezzük. A nagyobb mennyiség (6 ng/ml) az aFGF telítési dózisa.

Claims (27)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Heparinból vagy heparán-szulfátból származó frakció, amely alacsony, 1000 - 2000 molekulatömegű oligoszacharidokat tartalmaz, azzal jellemezve, hogy az alacsony molekulatömegű oligoszacharidok többsége kevéssé szulfátéit, kéntartalma legfeljebb 9 tömeg %, és ez a frakció a hajszálér endoteliális sejtek burjánzását vagy az angiogenezist gátolja, anélkül, hogy jelentős antikoaguláns aktivitással bírna.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti frakció, azzal jellemezve, hogy lényegében kevéssé szulfátéit oligoszacharidokból áll.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti frakció, azzal jellemezve, hogy a kevéssé szulfátéit oligoszacharidok molekulatömege 1000 és 1800 közötti.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti frakció, azzal jellemezve, hogy a kevéssé szulfátéit oligoszacharidok molekulatömege 1000 és 1600 közötti.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti frakció, azzal jellemezve, hogy a kevéssé szulfátéit oligoszacharidok kéntartalma 7 tömeg % alatti.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti frakció, azzal jellemezve, hogy a kevéssé szulfátéit oligoszacharidok kéntartalma 4 tömeg % alatti.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti frakció, azzal jellemezve, hogy a kevéssé szulfátéit oligoszacharidok 6-8 szacharid egységből állnak.
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti frakció, azzal jellemezve, hogy • ·4« »··· • · 4 4·· ·«· · ·4 « · * • · » · · ··· ·«« *· ···
    - 31 a kevéssé szulfátéit oligoszacharidok egy uronsav maradékot és glükózamin maradékot tartalmaznak.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti frakció, azzal jellemezve, hogy a kevéssé szulfátéit oligoszacharidok még egy további galaktóz maradékot is tartalmaznak.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti frakció, azzal jellemezve, hogy a kevéssé szulfátéit oligoszacharidok még egy xilóz maradékot is tartalmaznak.
  11. 11. Az 1. igénypont szerinti frakció, azzal jellemezve, hogy korioallantoin membránban 1 Mg és 50 Mg közötti mennyiségben adagolva gátolja az angiogenezist.
  12. 12. Az 1. igénypont szerinti frakció angiogenezis gátlására.
  13. 13. Az 1. igénypont szerinti frakció alkalmazása angiogenezis gátlására szolgáló gyógyászati készítmény előállítására.
  14. 14. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti frakciót és gyógyászati szempontból elfogadható hordozó- vagy hígítóanyagot tartalmaz.
  15. 15. Lényegében tiszta, alacsony, 1000 és 2000 közötti molekulatömegű oligoszacharid, amely heparinból vagy heparánszulfátból nyerhető, azzal jellemezve, hogy az oligoszacharid kéntartalma 9 tömeg % alatti, gátolja a hajszálér endoteliális sejtek burjánzását vagy az angiogenezist, és nem bír jelentős antikoaguláns aktivitással.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti oligoszacharid, azzal jellemezve, hogy molekulatömege 1000 és 1800 közötti.
  17. 17. A 16. igénypont szerinti oligoszacharid, azzal jellemezve, hogy molekulatömege 1000 és 1600 közötti.
  18. 18. A 15. igénypont szerinti oligoszacharid, azzal jellemezve, hogy kéntartalma 7 tömeg % alatti.
  19. 19. A 18. igénypont szerinti oligoszacharid, azzal jellemezve, hogy kéntartalma 4 tömeg % alatti.
  20. 20. A 15. igénypont szerinti oligoszacharid, azzal jellemezve, hogy 6-8 szacharid egységet tartalmaz.
  21. 21. A 15. igénypont szerinti oligoszacharid, azzal jellemezve, hogy egy uronsav maradékot és egy glükózamin maradékot tartalmaz.
  22. 22. A 21. igénypont szerinti oligoszacharid, azzal jellemezve, hogy egy további galaktóz maradékot tartalmaz.
  23. 23. A 22. igénypont szerinti oligoszacharid, azzal jellemezve, hogy egy további xilóz maradékot is tartalmaz.
  24. 24. A 15. igénypont szerinti oligoszacharid, azzal jellemezve, hogy korioallantoin membrán angiogenezisét 1 /zg és 50 μg közötti mennyiségben adagolva gátolja.
  25. 25. A 15. igénypont szerinti oligoszacharid angiogenezis gátlására.
  26. 26. A 15. igénypont szerinti oligoszacharid alkalmazása angiogenezis gátlására szolgáló gyógyászati készítmény előállítására.
  27. 27. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy a 15.
    igénypont szerinti oligoszacharidot és gyógyászati szempontból elfogadható hordozó- vagy hígítóanyagot tartalmaz.
HU341490A 1989-04-24 1990-04-24 Process for producing oligosaccharid-containing inhibitors of endothelial celle-multiplication and inhibitors of angiogenezis HUT59828A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34206589A 1989-04-24 1989-04-24

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU903414D0 HU903414D0 (en) 1992-01-28
HUT59828A true HUT59828A (en) 1992-07-28

Family

ID=23340174

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU341490A HUT59828A (en) 1989-04-24 1990-04-24 Process for producing oligosaccharid-containing inhibitors of endothelial celle-multiplication and inhibitors of angiogenezis

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP0394971A1 (hu)
AU (1) AU5445290A (hu)
CA (1) CA2053883A1 (hu)
FI (1) FI915003A0 (hu)
HU (1) HUT59828A (hu)
PT (1) PT93847A (hu)
WO (1) WO1990012580A1 (hu)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5629287A (en) * 1991-01-18 1997-05-13 University College London Depot formulations
US5610148A (en) * 1991-01-18 1997-03-11 University College London Macroscopically oriented cell adhesion protein for wound treatment
NO921495L (no) * 1991-04-16 1992-10-19 Seikagaku Kogyo Co Ltd Oligosakkarid og fremgangsmaate for dets fremstilling
CZ232593A3 (en) * 1991-05-02 1994-07-13 Yeda Res & Dev Pharmaceutical preparation for preventing and/or therapy of pathological states
GB9206291D0 (en) * 1992-03-23 1992-05-06 Cancer Res Campaign Tech Oligosaccharides having growth factor binding affinity
US6750207B1 (en) 1992-05-01 2004-06-15 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions for the regulation of cytokine activity
US5861382A (en) * 1992-05-01 1999-01-19 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods for regulation of active TNF-α
US5296471A (en) * 1992-12-22 1994-03-22 Glycomed Incorporated Method for controlling o-desulfation of heparin and compositions produced thereby
WO1994020520A1 (en) * 1993-03-10 1994-09-15 Magainin Pharmaceuticals Inc. Steroid derivatives, pharmaceutical compositions containing them, and their use as antibiotics or disinfectants
CA2176934A1 (en) * 1993-11-17 1995-05-26 Ramnath Sasisekharan Method for inhibiting angiogenesis using heparinase
WO1996001278A1 (fr) 1994-07-01 1996-01-18 Seikagaku Corporation Procede pour produire un polysaccharide desulfate et une heparine desulfatee
US5840740A (en) * 1995-06-07 1998-11-24 Magainin Pharmaceuticals Inc. Aminosterol compounds and a method of treating infection using the aminosterol compounds
US5856535A (en) * 1994-08-18 1999-01-05 Magainin Pharmaceuticals, Inc. Aminosterol ester compounds
US6143738A (en) * 1995-06-07 2000-11-07 Magainin Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic uses for an aminosterol compound
US5763430A (en) * 1995-06-07 1998-06-09 Magainin Pharmaceuticals Inc. Method of treating a viral infection by administering a steroid compound
US5792635A (en) * 1995-06-07 1998-08-11 Magainin Pharmaceuticals, Inc. Method of inhibiting the sodium/proton exchanger NHE3 and method of inhibiting growth by administering squalamine
US5847172A (en) * 1995-06-07 1998-12-08 Magainin Pharmaceuticals Inc. Certain aminosterol compounds and pharmaceutical compositions including these compounds
US5840936A (en) * 1995-06-07 1998-11-24 Magainin Pharmaceuticals Inc. Aminosterol compounds useful as inhibitors of the sodium/proton exchanger (NHE)
US5994336A (en) * 1995-06-07 1999-11-30 Magainin Pharmaceuticals Inc. Method of inhibiting proliferation of cells by administering an aminosterol compound
US5795885A (en) * 1995-06-07 1998-08-18 Magainin Pharmaceuticals Inc. Method of inhibiting profileration of cells by administering an aminosterol compound
US5874597A (en) * 1995-06-07 1999-02-23 Magainin Pharmaceuticals, Inc. Certain aminosterol compounds and pharmaceutical compositions including these compounds
DE69722793T2 (de) * 1996-04-26 2004-05-19 Genaera Corp. Squalamin in kombination mit anderen antikrebs-mittelen zur behandlung von tumoren
US6596712B2 (en) 1996-04-26 2003-07-22 Genaera Corporation Treatment of carcinomas using squalamine in combination with other anti-cancer agents or modalities
US5801012A (en) 1996-09-17 1998-09-01 Northwestern University Methods and compositions for generating angiostatin
US6262283B1 (en) 1996-12-06 2001-07-17 Magainin Pharmaceuticals Inc. Stereoselective synthesis of 24-hydroxylated compounds useful for the preparation of aminosterols, vitamin D analogs, and other compounds
WO1999004801A1 (en) * 1997-07-28 1999-02-04 Rijks Universiteit Leiden Use of sulfated glycosaminoglycans for treating of retinopathy
DE19747195A1 (de) * 1997-10-24 1999-04-29 Knoll Ag Verwendung von Glykosaminoglykanen zur Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen zur Behandlung von mit Diabetes assoziierten Augenkrankheiten
US7056504B1 (en) 1998-08-27 2006-06-06 Massachusetts Institute Of Technology Rationally designed heparinases derived from heparinase I and II
AU4351201A (en) * 2000-03-08 2001-09-17 Massachusetts Inst Technology Heparinase iii and uses thereof
AU2001253427B2 (en) 2000-04-12 2007-02-08 Genaera Corporation A process for the preparation of 7.alpha.-hydroxy 3-aminosubstituted sterols using intermediates with an unprotected 7.alpha.-hydroxy group
DE10028204A1 (de) 2000-06-09 2002-01-03 Aventis Pharma Gmbh Verfahren zur Auffindung von medizinisch wertvollen Wirkstoffen
ES2324701T3 (es) 2000-09-12 2009-08-13 Massachusetts Institute Of Technology Metodos y productos relacionados con heparina de peso molecular bajo.
WO2002032406A2 (en) 2000-10-18 2002-04-25 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to pulmonary delivery of polysaccharides
PT2343077E (pt) 2001-09-12 2013-08-29 Sigma Tau Res Switzerland Sa Derivados de glicosaminoglicanos totalmente n-dessulfatados como inibidores da heparanase, capazes de atividade antiangiogénica e desprovidos de efeito anticoagulante
US7285536B2 (en) 2001-12-05 2007-10-23 Yeda Research And Development Co., Ltd. Anti-cancer therapeutic compounds
ITMI20021372A1 (it) 2002-06-21 2003-12-22 Derivati Organici Lab Processo per la depolimerizzazione fisica dei glicosamminogliacani e prodotti da esso ottenuti
FR2866650B1 (fr) * 2004-02-24 2006-04-28 Aventis Pharma Sa Oligosaccharides, procede de preparation, utilisation et compositions pharmaceutiques les renfermant
US20070020243A1 (en) * 2005-01-12 2007-01-25 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions related to modulating the extracellular stem cell environment
EP1792621B1 (en) 2005-11-30 2012-04-04 Istituto di Ricerche Chimiche e Biochimiche "G. Ronzoni" Orally administrable heparin derivatives
WO2009014715A2 (en) * 2007-07-23 2009-01-29 The University Of North Carolina At Chapel Hill Enzymatic synthesis of sulfated polysaccharides without iduronic acid residues
US11203772B2 (en) 2010-12-23 2021-12-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chemoenzymatic synthesis of structurally homogeneous ultra-low molecular weight heparins
WO2014204929A2 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The University Of North Carolina At Chapel Hill Reversible heparin molecules and methods of making and using the same
US11718609B2 (en) 2016-12-13 2023-08-08 Beta Therapeutics Pty Ltd Heparanase inhibitors and use thereof
US11787783B2 (en) 2016-12-13 2023-10-17 Beta Therapeutics Pty Ltd Heparanase inhibitors and use thereof
WO2018165656A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Short-acting heparin-based anticoagulant compounds and methods
US11993627B2 (en) 2017-07-03 2024-05-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Enzymatic synthesis of homogeneous chondroitin sulfate oligosaccharides
CN111601603A (zh) 2017-11-03 2020-08-28 北卡罗来纳大学查珀尔希尔分校 具有抗炎活性的硫酸化寡糖
CN112437667B (zh) 2018-06-20 2024-05-28 北卡罗来纳大学查珀尔希尔分校 细胞保护方法和组合物

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2548672A1 (fr) * 1983-07-04 1985-01-11 Pharmuka Lab Oligosaccharides sulfates et leur utilisation comme medicaments
FR2597484B1 (fr) * 1986-04-17 1988-12-23 Sanofi Sa Glycosaminoglycanes de type heparine ou heparane-sulfate dotes d'une activite sur la division et la differentiation cellulaires, leur preparation et leurs applications therapeutiques.

Also Published As

Publication number Publication date
AU5445290A (en) 1990-11-16
CA2053883A1 (en) 1990-10-25
FI915003A0 (fi) 1991-10-23
PT93847A (pt) 1990-11-20
HU903414D0 (en) 1992-01-28
WO1990012580A1 (en) 1990-11-01
EP0394971A1 (en) 1990-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT59828A (en) Process for producing oligosaccharid-containing inhibitors of endothelial celle-multiplication and inhibitors of angiogenezis
US5039529A (en) Novel heparin derivatives
JP5371167B2 (ja) 抗脈管形成活性を有し、かつ、抗凝固作用がない、部分脱硫酸グリコサミノグリカンの誘導体
US5280016A (en) Non-anticoagulant heparin derivatives
US5008253A (en) Sulfoamino derivatives of chondroitin sulfates of dermatan sulfate and of hyaluronic acid and their pharmacological properties
WO1994014849A1 (en) Sulfated polysaccharides as inhibitors of smooth muscle cell proliferation
JP4575595B2 (ja) 新規グリコサミノグリカン及び該物質を有効成分とする医薬組成物
AU1669592A (en) New non-anticoagulant heparin derivatives
AU3763293A (en) Oligosaccharides having growth factor binding affinity
JPH0273801A (ja) 選択的にｏ―アシル化されたグリコサミノグリカン
DE69535565T2 (de) Verwendung von desulfatiertem Heparin
EP3398971A1 (en) Sulfated heparin oligosaccharide and preparation method and application thereof
WO1992018546A1 (en) Sulfated polysaccharides as inhibitors of smooth muscle cell proliferation
JP2004059506A (ja) セレクチン及びケモカインに作用する過硫酸化オリゴ糖
US20200254003A1 (en) Oligosaccharide compound for inhibiting intrinsic coagulation factor x-enzyme complex, and preparation method therefor and uses thereof
WO2020114418A1 (zh) 抗凝血的五糖类化合物、组合物及其制备方法和医药用途

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary prot. cancelled due to non-payment of fee