HUE030279T2 - Savas lizofoszfolipázok klónozása, expressziója és felhasználása - Google Patents

Claims (7)

1. $mm ^pr^s?es<S|s és felhasználása Sas#ad al m l Igény pontok

   1, DNS-szekvehcia, amely lizofoszfoiipáz aktivitással rendelkező polipeptidet kódol, gzznl jellemezve, hogy aPNS-szckvepcia az alábbiak közül ke#i klylÍMZtásra; # az L azonosítási számé szekvencia (SEQ ID NO: 1) szerinti nukíeotid szekvenciái tartalmazd DNS-sz.ekvenciák, b) az L azonosítási számú szekvencia (SEQ ID NO: l) szerinti kódold szekvenciát tartalmazó DNS-szekvenciák. e) az K azonosítási számú szekvencia (SEQ ID NÖ:I) szerinti íehérjeszekveneiát kódoló DNS* szekvenciák, d) a 4. ábra szerinti restrikciós térképpel jellemzett és DSM í 8370 számon letétbe helyezett BőSmadS piazmid által kódolt DNS-szekvenciák, e) a genetikai kód: degeneráltsága folytait az ή)* h), c) vagy d) szerinti DNS-Szekvenelákkal isszefúggö DNS-szekvettniák és !) az a) - e) szerinti szekvenciákkal komplementer szálak, ahol a DNS-szekvencía előnyösm á^w0ím és gíétiyösébbm Â^rg$$w$ffî}ig0m·. -fíldat# ős ahol a lizofoszfoíipiz aktivitással rendelkező polipeptki legalább 4 órán át megőrzi az aktivitásának legalább 80 %-àt a bázakeményítö részleges hidroíizátumáhan 65 °C hőmérsékleten és pH~5 értéken,
2. 2, Nukleinsav szekvencia, amely az I. Igénypont szerinti szekvéneMk egyikének analógját tartalmazza, azzal jellemezve, hogy á szekvencia lizofoszfoiipáz aktivitással rendelkező poiipeptklet kódol és: a) legalább S9 %#an azonos az említett szekvenciák egyikével, vagy h) az említett szekvenciák egyikével hibrldizái szigorú körülmények között, vagy c) az a) vagy b) szerinti szekvenciákkal komplementer szál, alpi m 1. azonosítási számú szekvencia (SEQ IP NO:l) szerinti DNS-székvencia egy vagy több nttkicinsayjának szubszttSáéiéjával, déiéélójával, inszemiójáyalü addíeicpvál vagy mútációjéval állítható elő a szekvencia, és ahol a iizoföszfoiípáz aktivitással rendelkezö polipept i d legalább 4 órán ál ^gdri^ÂalètiVlï^àn#ilêgajiph 8Ö %-áí a hózakeTnényitő részleges hidroiizáiómlban 65 °C hőtnérséhietén és pH~$ értéken,
3. 3. Expressziós szerkezet, amely az !, vagy 2, igénypont szerinti szekvenciát tartalmazza tniködőkepes kápé&amp;oláíban egy vagy több szekvenciával a HzoíÖi^féiilpáz. aktivitással iipbdéifcőzö poiipeptid alkalmas gazdasejtbe« történő expressziójának szabályozására, ahol a poiipeptid expresszióját: szabályozó szekvencia előnyösen egy olyan promoter, amely az dvpergillw nemzetség gíukő-amiMz pontotora vagy a-amiíáz promotora, a Wickodemm nemzetség eellullz tceiloblo-hidrölázj pmniotora, a glikolitikus anyagcserében részvevő valamelyik enzim, így a ibSZÍö-gliföifltékináz vagy glieerm-aidehkl-BdoszíóPdehídrogenáz promotora, a xiianáz promoter vagy az enoláz promotor közöl kerül kiválasztásra, és amely adott esetben szekretorlktss vezér szekvenciát tartalmaz;
4. 4. Rekombináns gazdasejt*, azzal jellemezve, bogy a "I, igénypont szerinti expresszié« szerkezettel lett transzformálva*. 5. A 4. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy az Pspergulus, MMsüpus, ;$ci$&amp;decw®:>. AfewrtApnrOj: Ä vagy Pénicillium nemzetségbe tartozó gomba segítő! ered vagy a Múywmmyeéé, ßpechmmmyrns, Sehízús&amp;mhűromycepf ^mh&amp;sp&amp;rm, Schwumiiamyce^ Hansenula vagy Pichia nemzetségbe tartozó élesztő sejttől ered.
5. 6. A BőSma35 plazmái amelyet a 4, ábra szerinti restrikciós térképjel lemez es DSM 18311 számon lelt letétbe helyezve, ?. Rólipépíidg amely lizofószíőlipáz aktivitással rendelkezik és az alábbiak közűi kerül lei vála sztásra? # m I, vagy 2, igénypont szerinti DNS-szekvencia kódoló része ÉM kódolt pőipeptid, b) olyan szekvenciával rendelkező poiipeptid, amely legalább 89 %~ban azonos a 2. azonosítási számó szekvencia (SEQ ID NO; 2) 16,-611, aminosavjávaJ, #pîi 3 iizofoszfolipáz aktivitással rendelkező poiipeptid legalább 4 órán át megőrzi az aktivitásának legalább 80 %~ât a bózakéményítő részleges hidrolizátumában 65 fíC hőmérsékleten és pH;:::5 értéken, 8, A 7, igénypont szerinti, iizoíbszfblipáz aktivitással rendelkező poi ipepttd, azzal jellemezve, hogy - molekulasúlya a 64-78 kDa tartönuinyban yan, ~ képes hidrolizálni a üzoleeitinböl származó zsírsavat, - a feszfolipázaktivitásím viszonyítva nagy a jlzojbszfoiipáz - elkölönítbető az nemzetségbe tartozó valanreiyik örgánizmnsből, * knm unó légi a í lag renk tív a 2. a zppestiisi számú szekvenciával (SHQ ID NO: 2) szembeni antitesttel, 9, À 8» igénypont szerinti pölipeptid, azzal jellemezve, hegy âz Âspergillm-Jum^m^M elkülöníthető. 10, A 8. vagy &amp; igénypont szerinti pölipeptid, azzal jellemezve, hogy a 2. azonosítási számú szekvenciát (SEQ !D NO: 2) tartalmazza.
6. 11, Lizófoszfolipáz készítmény, azzal jellemezve, hogy a 7,-10, igénypont egyike szerinti valátnélyik pölipeptMét tarta!m®izá adalékanyagokkal együtt, és adöü esëtPén élelmiszerben vagy állati tápbpt Oasználatps egy vagy több enzimet is tartalmaz, m. A 7,-1(¾ igénypont egyiké szerinti polipepid vagy a 11, igénypont szerinti lizófbsztbllpáz készítmény lelhasználása szirup, előnyösen a glukóz szirup és malióz szirup közüí kiválasztott ^ztup-áizősrésénekíájnvításárá.·. 13 . A 7,” 10, igénypont egyike szerinti poíipeptíá vagy a 1 í, tgányponí szerinti íizofoszíolipáz készitmény Mhaszuálasa lizelecitihek átészíerezésére,
7. 14. Eljárás á 7.-10. igénypont egyike szerinti, lizÄszfbHpaz aktivitássá! rendelkező polipepíid előlilMsára, azzal jellemezve, hogy a 4. vagy 3. igénypont szerinti gazdasejtet olyan körülmények között tenyészt}dk, amelyek elősegítik a pölipeptid expresszíóját, majd a poiípeptidet kinyerjük.