HU220879B1 - Dna sequences encoding porcine pancreatic carboxypeptidase b - Google Patents

Dna sequences encoding porcine pancreatic carboxypeptidase b Download PDF

Info

Publication number
HU220879B1
HU220879B1 HU9601302A HU9601302A HU220879B1 HU 220879 B1 HU220879 B1 HU 220879B1 HU 9601302 A HU9601302 A HU 9601302A HU 9601302 A HU9601302 A HU 9601302A HU 220879 B1 HU220879 B1 HU 220879B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
expression vector
plasmid
carboxypeptidase
pichia expression
pichia pastoris
Prior art date
Application number
HU9601302A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9601302D0 (en
HUT76100A (en
Inventor
Jeffrey Tobin Fayerman
David Patrick Greenen
Charles Lee Hershberger
Jeffrey Lynn Larson
Jane Larowe Sterner
Haichao Zhang
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of HU9601302D0 publication Critical patent/HU9601302D0/hu
Publication of HUT76100A publication Critical patent/HUT76100A/hu
Publication of HU220879B1 publication Critical patent/HU220879B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/938—Pichia

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

A leírás terjedelme 22 oldal (ezen belül 13 lap ábra)
HU 220 879 Bl
A karboxipeptidázokként ismert enzimcsalád jól ismert a szakterületen. A jelen találmány tárgyát képezik a sertés karboxipeptidáz B-kódoló cDNS-molekulák, a cDNS-t tartalmazó vektorok, a vektorokkal transzformáit gazdasejtek karboxipeptidáz B-t expresszáló exp- 5 ressziós rendszer előállítása céljából, valamint az expressziós vektorok alkalmazási módszerei karboxipeptidáz B előállítására.
A „karboxipeptidáz B” szakkifejezés általában olyan metallo-exopeptidázokra vonatkozik, amelyek előnyösen bázikus csoportokat hasítanak le a fehérjék C-terminálisáról. A patkány, az ember és a szarvasmarha prokarboxipeptidázok aminosavszekvenciája hasonló [D. L. Eaton: Journal of Biological Chemistry 266. 21833-21838 (1991)].
Számos különböző rekombináns DNS expressziós rendszer alkalmas polipeptid termékek, azaz például a jelen találmány szerinti karboxipeptidáz B és enzimatikusan aktív variánsainak expressziójára. A Pichia pastoris az előnyös expressziós rendszer, de a bakteriális expressziós rendszerek is, azaz például az Escherichia coli, a rovar expressziós rendszerek, azaz például a Baculovirus expressziós rendszerek és számos egyéb expressziós rendszer, beleértve az emlős expressziós rendszereket is, jól ismertek a szakterületen arról, hogy alkalmasak számtalan, számunkra érdekes polipeptid termék expressziójára.
A Pichia pastoris egy élesztőgomba, és így gazdasejtként előnyt jelent a számunkra érdekes génsebészeti termékek előállításában. A baktérium expressziós 30 rendszerek alkalmazása a számunkra érdekes génsebészeti termékek előállítására gyakran azt igényli, hogy a termék granulum formájában legyen kinyerhető a baktériumokból, amit azután oldatba kell vinni, és az ebből felszabaduló anyaggal azután fel kell vetetni a 35 természetes térszerkezetet, hogy egy olyan molekulát állítsunk elő, amelynek a biológiai aktivitáshoz szükséges tercier és kvatemer szerkezete van. A Pichia spp.ben termelt fehérjéket nem kell stabilizálni és kialakítani a természetes térszerkezetüket. A szignálpeptideket 40 génsebészeti úton lehet beépíteni, olyan Pichia expressziós rendszereket készítve, amelyek a kívánt terméket biológiailag aktív formában szekretálják a táptalajba.
A Pichia expressziós rendszerek jól ismertek a szakterületen, és humán szérumalbumin, humán epidermális növekedési faktor, hepatitisz antigének, szarvasmarha lizozim, humán lizozim, humán inzulinszerű növekedési faktor I, aprotin, interleukin 2, sztreptokináz, humán szöveti plazminogén aktiváló faktor, a HÍV gpl20-as antigénje, a SIV gpl20-as antigénje, a per10 tactin, a tetanusz C, a rágcsáló epidermális növekedési faktor és a humán szöveti nekrózis faktor előállítására használták [G. B. Buckholz és M. A. G. Gleeson: Biotechnology 9, 1067-1072 (1991)].
A jelen találmány tárgyát sertés prokarboxipeptidáz 15 B-t, Tyr-His-Met-pro sertés pankreatikus karboxipeptidáz B-t kódoló cDNS-molekulák képezik, valamint a cDNS-eket tartalmazó vektorok, a vektorokkal transzformáit Pichia pastoris sejtek karboxipeptidáz B expressziós rendszerek előállítására, valamint a Pichia 20 pastoris expressziós rendszerek alkalmazása a sertés karboxipeptidáz B és N-terminálisan meghosszabbított ekvivalensei előállítására. A bakteriális, rovar és emlős expressziós rendszerek is alkalmasak a jelen találmány szerinti enzimek előállítására, és a jelen találmány oltal25 mi körébe tartoznak.
A jelen találmány tárgyát képezik rekombináns DNS expressziós vektorok és az ezekkel transzformált gazdasejtek a sertés prokarboxipeptidáz B és sertés Tyr-His-Met-prokarboxipeptidáz B expresszálására.
A jelen találmány szerinti kétszálú cDNS-szekvencia, amely Tyr-His-Met sertés prokarboxipeptidázt kódol, valamint a kódolt aminosavszekvencia az I. képletben látható. Az I. képlet értelmes szálának megfelelő egyszálú DNS-szekvenciát is megadjuk 1. számú szekvenciaként. Az I. képletnek megfelelő aminosavszekvenciát 2. számú szekvenciaként adjuk meg. Az I. képletet azért adjuk meg, hogy kiegészítse a Szekvencialista szekciót, mivel kényelmes referenciát szolgáltat a jelen találmány szerinti vektorok készítésében használt restrikciós endonukleáz hasítási helyekhez, míg ezzel egyidőben megadja a megfelelő kodonok által kódolt aminosavszekvenciát.
I. Képlet N d e
I
TATCATATGCACCACTCCGGGGAGCATTTCGAAGGGGAGAAGGTGTTCCGTGTCAATGTT 1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60
ATAGTATACGTGGTGAGGCCCCTCGTAAAGCTTCCCCTCTTCCACAAGGCACAGTTACAA
TyrHi sMe tHi sHi sSerGlyGIuHi sPheGluGIyGIuLysVa1PheArgVa1AsnVa1 GAAGATGAAAATGACATCAGCTTACTCCATGAGTTGGCCAGCACCAGGCAGATTGACTTC
61---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120
CTTCTACTTTTACTGTAGTCGAATGAGGTACTCAACCGGTCGTGGTCCGTCTAACTGAAG
G1uAs pG1uAs nAs pl 1e S e r Le uLe uH i sGluLe uAlaSerThrAr gGlnlleAspPhe TGGAAACCAGATTCTGTCACACAAATCAAACCTCACAGTACAGTTGACTTCCGTGTGAAA
121---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180
ACCTTTGGTCTAAGACAGTGTGTTTAGTTTGGAGTGTCATGTCAACTGAAGGCACATTT
HU 220 879 Bl
TrpLysProAspSerValThrGlnlleLysProHi sSerThrValAspPheArgVaILys GCAGAAGATATTTTGGCTGTGGAAGACTTTCTGGAGCAGAATGAACTACAATATGAGGTA
CGTCTTCTATAAAACCGACACCTTCTGAAAGACCTCGTCTTACTTGATGTTATACTCCAT AlaGluAs pI1eLeuAlaVa1G1uAs pPheLe uGluG1nAs nGluLeuGlnTyrGluVal
B g X h
o
I I
CTCATAAACAACCTGAGATCTGTGCTCGAGGCTCAGTTTGACAGCAGAGTCCGTACAACT
---------+---------+---------+---------+---------+---------+
GAGTATTTGTTGGACTCTAGACACGAGCTCCGAGTCAAACTGTCGTCTCAGGCATGTTGA LeülieAsnAs nLeuAr gSe rVa1LeuGluAlaGlnPheAspSerAr gValArgThrThr GGACACAGTTATGAGAAGTACAACAACTGGGAAACGATCGAGGCTTGGACTAAGCAAGTC
---------+---------+---------+---------+---------+---------+
CCTGTGTCAATACTCTTCATGTTGTTGACCCTTTGCTAGCTCCGAACCTGATTCGTTCAG GlyHi sSerTyrGluLysTyrAsnAsnTrpGluThrlleGluAlaTrpThrLysGlnVal ACCAGTGAAAATCCAGACCTCATCTCTCGCACAGCCATCGGAACTACATTTTTAGGAAAC
---------+---------+---------+---------+---------+---------+
TGGTCACTTTTAGGTCTGGAGTAGAGAGCGTGTCGGTAGCCTTGATGTAAAAATCCTTTG ThrSerGluAsnProAspLeuIleSerArgThrAlalleGlyThrThrPheLeuGlyAsn AATATATACCTCCTCAAGGTTGGCAAACCTGGACCAAATAAGCCTGCCATTTTCATGGAC
---------+---------+---------+---------+---------+---------+
TTATATATGGAGGAGTTCCAACCGTTTGGACCTGGTTTATTCGGACGGTAAAAGTACCTG AsnlleTyrLeuLeuLysValGlyLysProGlyProAsnLysPr oAlallé PheMe tAs p TGTGGTTTCCATGCCAGAGAATGGATTTCCCATGCATTTTGCCAGTGGTTTGTGAGAGAG
ACACCAAAGGTACGGTCTCTTACCTAAAGGGTACGTAAAACGGTCACCAAACACTCTCTC CysGlyPheHi sAlaArgGluTrpIleSerHi sAlaPheCysGlnTrpPheValArgGlu GCTGTTCTCACCTATGGATATGAGAGTCACATGACAGAATTCCTCAACAAGCTAGACTTT
---------+---------+---------+---------+---------+---------+
CGACAAGAGTGGATACCTATACTCTCAGTGTACTGTCTTAAGGAGTTGTTCGATCTGAAA AlaValLeuThrTyrGlyTyrGluSerHi sMe tThrGluPheLeuAsnLysLeuAspPhe TATGTCTTGCCTGTGCTCAATATTGATGGCTACATCTACACCTGGACCAAGAACCGAATG
---------+---------+---------+---------+---------+---------+
ATACAGAACGGACACGAGTTATAACTACCGATGTAGATGTGGACCTGGTTCTTGGCTTAC TyrValLeuProValLeuAsnIleAspGlyTyrIleTyrThrTrpThrLysAsnAr gMe t TGGAGAAAGACCCGCTCTACCAATGCTGGAACTACCTGCATTGGCACAGACCCCAACAGA
---------+---------+---------+---------+---------+---------+
ACCTCTTTCTGGGCGAGATGGTTACGACCTTGATGGACGTAACCGTGTCTGGGGTTGTCT TrpArgLysThrArgSerTh rAs nAlaGlyThrThrCysI1eGlyThrAspProAsnArg AATTTTGATGCTGGGTGGTGCACAACTGGAGCCTCTACAGACCCCTGCGATGAGACTTAC
---------+---------+---------+---------+---------+---------+
TTAAAACTACGACCCACCACGTGTTGACCTCGGAGATGTCTGGGGACGCTACTCTGAATG AsnPheAs pA1aG1yTr pCy sThrThrGlyAlaSerThrAspPr oCy sAs pG1uTh rTy r
P s
t
I
TGTGGATCTGCTGCAGAGTCTGAAAAAGAGACCAAGGCCCTGGCTGATTTTATACGCAAC
ACACCTAGACGACGTCTCAGACTTTTTCTCTGGTTCCGGGACCGACTAAAATATGCGTTG CysGlySerAlaAlaGluSerGluLysGluThrLysAlaLeuAlaAs pPhe11eAr gAs n AACCTCTCCTCCATCAAAGCATACCTGACGATCCACTCATACTCACAGATGATACTCTAC
---------+---------+---------+---------+---------+---------+
TTGGAGAGGAGGTAGTTTCGTATGGACTGCTAGGTGAGTATGAGTGTCTACTATGAGATG AsnLeuSerSerI1eLy sAlaTyrLeuThr1leHi sSerTyrSerGlnMe tI1eLeuTyr CCTTATTCCTATGATTACAAACTCCCCGAGAACAATGCTGAGTTGAATAACCTGGCTAAG
HU 220 879 Bl
901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 960
GGAATAAGGATACTAATGTTTGAGGGGCTCTTGTTACGACTCAACTTATTGGACCGATTC ProTyrSerTyrAspTyrLysLeuProGluAsnAsnAlaGluLe uAsnAs nLeuAlaLy s GCTGCCGTGAAAGAACTTGCTACACTGTATGGCACCAAGTACACATACGGCCCAGGAGCT
961 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1020
CGACGGCACTTTCTTGAACGATGTGACATACCGTGGTTCATGTGTATGCCGGGTCCTCGA
Al aAl aVaILysGluLeuAlaThrLeuTyrGlyThrLysTyrThrTyrGlyProGlyAla ACAACAATCTATCCTGCTGCTGGGGGCTCTGATGACTGGGCTTATGACCAAGGAATCAAA
1021 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1080
TGTTGTTAGATAGGACGACGACCCCCGAGACTACTGACCCGAATACTGGTTCCTTAGTTT
Th rTh rI1eTyr Pr oAlaAlaGlyGlySerAspAspTr pAlaTyrAs pGlnGlyI1eLy s TATTCCTTCACCTTTGAACTCCGGGATAAAGGCAGATATGGTTTTATCCTCCCTGAATCC
1081---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1140
ATAAGGAAGTGGAAACTTGAGGCCCTATTTCCGTCTATACCAAAATAGGAGGGACTTAGG TyrSerPheThrPheGluLeuArgAs pLysGlyArgTyrGlyPhelleLeuProGluSer CAGATCCAGGCAACCTGTGAGGAAACAATGCTGGCCATCAAATACGTAACCAACTACGTG
1141 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200
GTCTAGGTCCGTTGGACACTCCTTTGTTACGACCGGTAGTTTATGCATTGGTTGATGCAC
G1 η I1eGlnAlaTh rCy sGluGluTh rMe tLeuAlalleLysTyrValThrAsnTyrVal CTGGGCCACCTGTAA
1201--------+------1215
GACCCGGTGGACATT LeuGlyHi sLeuEnd
Az I. képlet szerinti DNS-szekvencia és a megfelelő aminosavszekvencia egy olyan sertés prokarboxipeptidáz B-t kódoló cDNS-szekvenciát mutat be, amely az N-terminálisán Tyr-His-Met extenziót tartalmaz.
A prokarboxipeptidáz B és az N-terminálisán meghosszabbított variánsai könnyen átalakíthatok karboxi- 30 peptidáz B-vé, tripszines kezeléssel, amely az I. képlet szerinti polipeptidet a 98-as és 99-es aminosavak között hasítja el. A sertés karboxipeptidáz kódolószekvenciáját 3. számú szekvencia néven adjuk meg, a megfelelő transzlációs terméket pedig 4. számú szekvencia 35 néven adjuk meg.
A pFJ474 plazmid tartalmazza a Tyr-His-Met-sertés prokarboxipeptidáz B kódolószekvenciáját (I. képlet),
A pFJ474 plazmidot a Northern Régiónál Research Laboratory-nál (NRRL) helyeztük letétbe (Peoria, IL), 40 ahol NRRL B-21032 letéti számon bárki számára hozzáférhető.
A pFJ489 tartalmazza a sertés prokarboxipeptidáz B kódolószekvenciáját (I. képlet, mínusz az első három kodon, amely Y-t, H-t és M-et kódol). A pFJ489 plaz- 45 midot a Northern Régiónál Research Laboratorynál (NRRL, Peoria, IL) helyeztük letétbe, ahol NRRL B-21028 letéti számon bárki számára hozzáférhető.
A jelen találmány szerinti karboxipeptidáz B-k expresszálására előnyös gazdasejtek a Pichia pastoris sej- 50 tek. A bakteriális, rovar és emlős expressziós rendszerek is jól ismertek a szakterületen, ezekkel szintén elő lehet állítani a jelen találmány szerinti enzimeket, és szintén a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.
A Pichia pastoris alkalmazása számunkra lényeges 55 polipeptid termékek expresszálására jól ismert a szakterületen. Az 5,102,789, 5,004,688, 4,882,279 és az 5,032,516 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentések a Pichia pastorishoz számos háttérinformációt tartalmaznak, valamint számos részle- 60 tét tartalmaznak a Pichia pastoris génsebészeti alkalmazásánál használt számos vektorról. Az előzőkben említett szabadalmi bejelentések tartalmát a továbbiakban referenciának tekintjük. Egy különösen előnyös Pichia pastoris törzs a GTS 115. A Pichia pastoris GTS 115 törzset a Northern Régiónál Research Laboratorynál (NRRL, Peoria, IL, 1984. augusztus 31.) helyeztük letétbe. A Pichia pastoris GTS 115 Y15851 letéti számon férhető hozzá az NRRL-nél. A Pichia pastoris GTS115-öt az NRRL Y-11430 nitrozoguanidines mutagenezisével állítjuk elő, és a hisztidinol-dehidrogenáz-aktivitásban tartalmaz egy hibát, amit a HIS4 gén kódol. A Pichia pastoris GTS115 nő komplett táptalajon, azaz például YPD-n, valamint minimál táptalajon, azaz például MMH-n, MDH-n vagy MGYH-n, amelyeket hisztidinnel egészítettünk ki. A HIS4-ben levő hiba kényelmes szelekciós lehetőséget kínál a Pichia pastorishol vagy más élesztőkből származó HIS4 gént tartalmazó vektoroknak. A GTS 115 törzset a szakirodalomban néha GS115 néven is említik.
A Pichia pastoris számos egyéb törzse is hozzáférhető különböző forrásokból, beleértve a Northern Régiónál Research Laboratoryt (NRRL), az American Type Culture Collectiont (ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD). Például az 1990-es „ATCC Catalog of Yeasts” 8 Pichia pastoris törzset sorol fel. Jóllehet a GTS115 Pichia pastoris törzset részesítjük előnyben, a többi Pichia pastoris törzs is kompatibilis a jelen találmány szerinti vektorokkal, és így a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.
A Pichia pastoris génsebészeti úton történő megválasztása számos, a szakirodalomban az élesztőben működőnek ismert szabályozóegységből és szelekciós markerből eredő előnyben részesül. A kitanításban szereplő és az igénypontokkal védett vektorok alkalmaznak néhány, a szakterületen ismert elemet. A vektoro4
HU 220 879 Bl kát úgy helyezték letétbe, mint számos promoter, szignálpeptid, antibiotikumrezisztencia-marker, kódolószekvencia, integrációs funkció és egyéb, a jelen találmány szerinti vektorok készítésében használt egyéb elem kényelmes forrását. A letétbe helyezett anyagokat az I. táblázatban foglaljuk össze.
1. táblázat
Gazdasejt/vektor NRRL leteti szám Szám
E. coli RV308/pFJ469 B-21025 1
E. coli DH5a/pLGD27 B-21027 2
E. coli 294/pFJ489 B-21028 3
E. coli 294/pLGD23 B-21029 4
E. coli 294/pFJ457 B-21030 5
E. coli 294/pLGD36 B-21031 6
E. coli RV308/pFJ474 B-21032 7
E. coli RV308/pFJ471 B-21033 8
E. coli 294/pLGD20 B-21034 9
A jelen találmány szerinti vektorok lehetnek mind autonóm replikációra képes, mind integrálódó vektorok. Az integratív vektorok az 5’ AOX1 és a 3’ AOX1szekvenciákat alkalmazzák a Pichia pastoris kromoszómába való integrációhoz. Az AOX a Pichia pastoris alkohol-oxidáz génjét jelenti, az 5’ és a 3’ jelölések jelentése pedig az, hogy ezek a szekvenciák az alkoholoxidáz gén, azaz az AOX1 előtt vagy után találhatók a Pichia pastoris kromoszómáján. Az AOX2 a Pichia pastoris genom második alkohol-oxidáz génjét jelenti, és nem hivatkozunk rá többet, mivel nem használjuk expresszióra a jelen találmány szerinti illusztratív vektorokban, és a határolórégióit sem használjuk rekombinációra. Az 5,166,329-es amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés tárgyalja a Pichia pastoris alkohol-oxidáz génjeit, valamint azok szabályozó egységeit.
A gyakorlott szakemberek számára nyilvánvaló, hogy az AOX2-t is jól lehetne expresszióra használni, de az AOX1 az előnyös metanollal indukálható promoter a jelen találmány szempontjából. A Pichia pastoris kromoszómába való helyspecifikus inszerciót az előzőkben említett határolószekvencia segítségével a 4,882,279-es számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben ismertetik, amelynek tartalmát a továbbiakban referenciának tekintjük. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy az 5’ és 3’ AOX 1-szekvenciák lehetővé teszik a gazdaszervezet kromoszómájába a helyspecifikus integrációt homológ rekombináció révén. A példákra és az ábrákra való hivatkozás azt mutatja, hogy a rekombinációs esemény számos vektorral előfordulhat két különböző rekombináció révén, az azonban nyilvánvaló, hogy hacsak a HIS4-szekvencia nincs jelen azon a fragmensen, amely rekombinálódik a Pichia pastoris kromoszómájába, a fragmenst nem lehet kimutatni a hisztidindeficiens törzsek, azaz például a GTS115 szelekciójára használt hisztidinoldefíciens táptalajok miatt. Az is nyilvánvaló, hogy ha olyan Pichia pastoris törzseket alkalmazunk, amelyek nem hisztidin auxotrófok, akkor mindkét variáns rekombinánsai előfordulhatnak. A PARS1-szekvenciát, amely jól ismert a szakterületen, használjuk autonóm replikálódó vektorok készítésére. A vektorok integratív formáját részesítjük előnyben.
Számos, a jelen találmány szerinti vektor tartalmaz olyan elemeket, amelyek lehetővé teszik az Escherichia coliban való replikációt és szelekciót. Az Escherichia coliban való szelekcióra ampicillin rezisztencia (AmpR vagy Ap) markert használunk. A kanamicin rezisztencia marker (KanR) is lehetővé teszi az Escherichia coliban való szelekciót.
Számos különböző promoter működhet élesztőkben, azaz például Pichia pastorisban. Az alkohol-oxidáz (pAOX) például metanollal indukálhatok. A pAOXl az LGD20 (NRRL letéti szám: B-21034) komponenseként érhető el. A pLGD20 restrikciós hasítási hely és funkciós térképét a 9. ábrán mutatjuk be. A gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz promotert (pGADH vagy pGAP) az NRRL-nél helyeztük letétbe a pLGD23 komponenseként, ahol mindenki számára hozzáférhető B-21029 letéti számon. A pLGD23 restrikciós hasítási hely és funkciós térképét a 4. ábrán mutatjuk be. A foszfoglicerát-kináz promotert (pPGK) a 4,615,974 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben ismertetik, amit a továbbiakban referenciának tekintünk.
A jelen találmány szerinti előnyös expressziós rendszerek tartalmaznak szignálpeptideket (szignálokat) a kívánt termék szekréciójához (sertés karboxipeptidáz vagy annak N-terminálison hosszabbított ekvivalense). Hitzeman és munkatársai (4,775,622 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés) leírják heterológ fehérjék élesztőkben való expresszióját, processzálását és szekrécióját, és így kiválóan tárgyalják a különböző szignálokat és azok alkalmazhatóságát. Hitzeman és munkatársai (4,775,622 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés) publikációját referenciának tekintjük a továbbiakban. Chang és munkatársai (5,010,003 számú amerikai egyesült államokbeli bejelentés) leírják az élesztő homológ szignálok alkalmazását heterológ fehérjék szekretálására. Az 5,010,003 számú amerikai egyesült államokbeli bejelentést a továbbiakban referenciának tekintjük. Az előnyben részesített szignálpeptid a prepro-a-mating faktor. A pFJ474, NRRL B-21032, 7. ábra, és a pLGD20, NRRL B-21034, 9. ábra, prepro-a-mating faktor szignált tartalmaz. Ezek a vektorok szabadon hozzáférhetők a jelen találmány elfogadása után, és ezáltal az a-mating faktor szignálszekvencia kényelmes forrását jelentik más, a jelen találmány szerinti vektorok készítéséhez. A savas foszfatáz szignálpeptid (PHO1) is jól ismert a szakterületen. A humán szérumalbumin szignálpeptidjét a pLGD23 (NRRL B-21029, 4. ábra) komponenseként helyeztük letétbe, és a jelen találmány elfogadása után mindenki számára hozzáférhető lesz az NRRL-nél. A HPI a példákban és az ábrákon a humán proinzulin szignálpeptidjének rövidítése. A HPI-t a pLGD36 komponenseként helyeztük letétbe. A pLGD36 (NRRL B-21031, 6. ábra) mindenki számára hozzáférhető lesz
HU 220 879 Bl a jelen találmány elfogadása után. A preMFa jelű pre-amating faktor a pFJ489 plazmid komponense, amit az NRRL-nél helyeztünk letétbe B-21028 letéti számon, és a jelen találmány elfogadása után mindenki számára hozzáférhető lesz. A 3. ábrán a pFJ489 restrikciós hasítási hely és funkciós térképét látjuk. A CpB a példákban és az ábrákon használt rövidítés a sertés karboxipeptidáz B szignálpeptidjének rövidítése. A CpB-t kényelmesen izolálhatjuk a pLGD27 plazmidból (NRRL B-21027), amely mindenki számára hozzáférhető lesz a jelen találmány elfogadása után. A pLGD27 restrikciós hasítási hely és funkciós térképét a 2. ábrán adjuk meg. A szarvasmarha tripszinogén szignálpeptid jelölésére a TRPGEN kifejezést használjuk. A TRPGEN-t kényelmesen előállíthatjuk a pFJ469 plazmidból (NRRL B-21025), amely a jelen találmány elfogadása után mindenki számára hozzáférhető lesz. A pFJ489 plazmid restrikciós hasítási hely és funkciós térképét a 3. ábrán adjuk meg. A pFJ471 plazmid a humán glukagon szignálpeptidjét tartalmazza. A pFJ471 plazmidot az NRRL-nél helyeztük letétbe, ahol a jelen találmány elfogadása után mindenki számára hozzáférhető lesz B-21033 letéti számon. A pFJ471 plazmid restrikciós hasítási hely és funkciós térképét a 8. ábrán adjuk meg.
A Pichia pastorisnak vannak endogén enzimei, amelyek lehasítják a szignálpeptideket. A Kex2 a bázikus dipeptid egységeket tartalmazó szekvenciában levő második bázikus egység után hasít. Tehát a megfelelően exponált dipeptideket, amelyek arginin és/vagy lizin bármely kombinációját tartalmazzák, a Kex2 enzim elhasítja. A jelen találmány szerinti vektorok olyan polipeptideket kódolnak, amelyeket a Kex2 rendszer elhasít. Az ArgArg-HAS szignált és a LysArg-MFa-t használó konstrukciókat állítunk elő, és ezzel a példával mutatjuk be a Kex2 mint processzáló enzim használatát. A Kex2 rekombináns DNS-technikával nagyobb mennyiségben való előállítását a 4,929,553 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben ismertetik, amely bejelentést a továbbiakban referenciának tekintünk.
A SEC11 gén által kódolt szignálpeptidáz jól ismert a szakterületen. A SEC11 termék az Ala-X-Ala szekvenciát hasítja, ahol X jelentése bármely aminosav, és így jól használható a „pre” régió eltávolítására a preMFA szignált tartalmazó konstrukciókból.
A példákat megelőzi egy szekció, amely a számos példában alkalmazott protokollokat tartalmazza. A protokollok tartalmazzák a tudományos és technikai irodalomra való megfelelő hivatkozást, hogy a szakterületen jártas szakember számára megkönnyítsük a jelen találmány végrehajtását.
Protokollok
l. Protokoll: Pichia pastoris transzformálása elektroporációval
100 ml YPD táptalajt oltunk be egy kacsnyival a kívánt Pichia pastoris törzsből, amelyet agarlemezen szaporítottunk. Az YPD táptalajt úgy állítjuk elő, hogy 10 g Bacto élesztőkivonatot, 20 g peptont oldunk 900 ml vízben (tartalmaz még 20 g Bacto agart az YPD ferdékhez vagy lemezekhez), majd 20 percig autoklávozzuk, utána 100 ml steril 20%-os (tömeg/térfogat) D-glükóz-oldatot adunk hozzá. Az YPD táptalajt, amelyet a megfelelő Pichia pastoris törzzsel oltottunk be, 30 °C-on inkubáljuk egy rázó vízfürdőben 48 óra hosszat. A Pichia pastorist azután átoltjuk, a fermentléből 10 μΐ-t, 30 pl-t vagy 100 μΐ-t oltva 100 ml YPD-be, majd 30 °C-os rázó vízfürdőben inkubáljuk éjszakán át. Az az éjszakán át tenyésztett tenyészet a jó, amelynek az optikai sűrűsége 0,8 és 1,5 között van (600 nm, üres táptalajjal szemben mérve). A megfelelő optikai sűrűséggel rendelkező tenyészetet azután centrifugáljuk, a sejtek kiülepítésére. A felülúszót elöntjük, majd 20 ml hideg steril vizet adunk minden egyes csőhöz. A sejteket centrifugálással ülepítjük. Az üledéket azután újból mossuk 20 ml hideg steril vízzel, és a sejtek kinyeréséhez centrifugáljuk. A centrifugálás után 20 ml hideg, 1 mol/1 Sorbitol™-t adunk az üledékhez. Az üledéket felszuszpendáljuk, óvatosan megütögetve a csöveket, és egy pipettába felszíva szétoszlatjuk az üledéket.
Körülbelül 10 μΐ lineáris vektort (koncentrációja 1 pg/μΙ) adunk ezután 50 μΐ, az előzőkben előállított Pichia pastoris befogadó törzshöz. A DNS/Pichia pastoris keveréket 25 percig jégen inkubáljuk, majd hideg, 0,2 cm-es elektroporációs küvettába visszük át (BioRad). Az elektroporációs keveréken azután egy 2,0 kV, 25 pF, 200 Ω impulzust bocsátunk át, egy BioRad Gene Pulsar System elektroporációs berendezéssel. 500 μΐ YPD táptalajt adunk az elektroporációs mintához, majd a teljes keveréket egy 5 ml-es centrifugacsőbe visszük át és jégen tartjuk, ameddig az összes mintán nem bocsátottuk át az eiektroporáció céljából a megfelelő impulzust. Az elektroporációs mintákat azután 30 °C-os vízfürdőbe tesszük, és 30 percig ott tartjuk. Az elektroporációs mintákból maximum 100 μΐ-t szélesztünk MD lemezekre. Az MD agarlemezeket úgy állítjuk elő, hogy 100 ml 10X YNB-t (6,7 g élesztő nitrogénbázis aminosavak nélkül, 100 ml vízben, szűréssel sterilezve), 2 ml 500 X biotin (20 mg biotin 100 ml vízben oldva, szűréssel sterilezve) és 100 ml 10 X Dglükóz 800 ml autoklávozott vízzel (az agarlemezekhez 15 g Bacto agart is tartalmaz). A lemezeket azután négy napig 30 °C-on tartjuk.
A HIS+ transzformánsokat azután MD és YPD lemezekre oltjuk át. Az MD és YPD lemezeket azután 30 °C-on inkubáljuk 48 óra hosszat, amikor ezek a telepek könnyen észrevehetők szabad szemmel.
2. Protokoll: Pichia pastoris szokványos transzformációja
Az 5,166,329 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés 9. és 10. oldalán a Pichia pastoris szferoplaszt képzését és szokványos transzformációs protokollját írják le. Az előzőkben említett kitanításokat a továbbiakban referenciának tekintjük.
3. Protokoll: Fehérje metanollal indukált expressziója Pichia pastorisban
Az alkohol-oxidáz promoterrel meghajtott transzkripció metanolos indukcióját az 5,135,868 számú ame6
HU 220 879 Bl rikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben írják le, amelynek a tartalmát a továbbiakban referenciának tekintjük.
7. példa
A pLGD43 készítése
A DPG59 (5. számú szekvencia) és a DPG60 (6. számú szekvencia) oligonukleotidokat megszintetizáljuk, egymáshoz illesztjük, majd foszforilezzük. A száraz oligonukleotid üledéket vízben szuszpendáljuk (0,5 pg/'pl), majd 15 percig 70 °C-on tartjuk. A DPG59/60 komplementer oligonukleotidokból 20 pl-t kombinálunk, 15 percig 70 °C-on tartjuk, majd 1 óra hosszat lehűtjük 55 °C-ról szobahőmérsékletre (25 °C). 30 percig 37 °Con 8,75 pg komplementer oligonukleotid linker DNS-t foszforilezünk 25 μΐ rekacióelegyben, amely 1 mmol/1 ATP-t (pH=8), 2,5 egység polinukleotid kinázt (New England Biolabs) és ligáz puffért (Boehringer Mannheim) tartalmaz. A kinázt 10 percig 70 °C-on inkubálva inaktiváljuk.
pg pLGD23 plazmidot (NRRL B21029) emésztünk 50 egység Nsil restrikciós enzimmel H pufferben (BM). A reakcióelegyet 1 óra hosszat 37 °C-on tartjuk. Az 5’-terminális foszfátokat 1 egység boqúbél alkalikus foszfatáz (CIAP) hozzáadásával eltávolítjuk, majd 30 percig inkubáljuk 37 °C-on. Az enzimeket hővel inaktiváljuk, a reakcióelegyet 10 percig 70 °C-on tartva.
0,35 pg DPG59/60 DNS-t kombinálunk 0,1 pg Nsil-vel emésztett és defoszforilezett pLGD23 plazmiddal. 1 egység T4 DNS-ligázt, ligáz puffért (Boehringer Mannheim) és TE puffért adunk hozzá 15 pl végtérfogatban. A ligáló reakcióelegyet 16 óra hosszat 15 °Con inkubáljuk, majd ezt használjuk Escherichia coli K12 MM294 sejtek transzformálására. A transzformánsokat 50 pg/ml ampicillint tartalmazó L-agaron szelektáljuk. A kívánt pINTl vektor szekvenciaazonosságát nukleotidszekvenálással igazoljuk.
pg pFJ474 plazmidot (NRRL letéti szám B-21032, 7. ábra) 100 egység Ncol és Nrul restrikciós endonukleázzal emésztünk 1 óra hosszat 37 °C-on, B pufferben. Az 1,5 kilobázis méretű fragmenst gélen tisztítjuk, 1%-os TBE agarózgélt és DEAE papírt alkalmazva.
pg pINTl plazmidot emésztünk 100 egység Spel és Xbal restrikciós endonukleázzal 1 óra hosszat 37 °Con H pufferben (BM). Az 5,6 kilobázis méretű DNSfragmenst, amely tartalmazza a pPCpB gént, gélen tisztítjuk, 1%-os agarózgélt, TRIS-borát puffért (TBE) és DEAE papírt alkalmazva [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)].
Tíz mikrogramm pINTl plazmidot emésztünk 50 egység Ncol és Nrul restrikciós endonukleázzal B pufferben (BM). A reakcióelegyet 1 óra hosszat 37 °Con inkubáljuk. A DNS-t 0,1 térfogat 3 mol/1 koncentrációjú nátrium-acetát és 2,5 térfogat 100%-os EtOH hozzáadásával csapjuk ki. A liofilezett DNS-t 100 pl reakciótérfogatban szuszpendáljuk, amely 50 egység Spal és Xbal restrikciós enzimet tartalmaz H pufferben (BM) és TE pufferben [1,0 mmol/1 etilén-diamin-tetraecetsav 0,01 mol/1 (pH=7,4) TRIS pufferben], majd egy óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk. Az 5’ terminális foszfátcsoportokat eltávolítjuk, 1 egység borjúbél alkalikus foszfatáz (CIAP) hozzáadásával, majd 30 percig 37 °C-on inkubáljuk. Az enzimeket hővel inaktiváljuk (10 perc 70 °C).
Körülbelül 0,5 pg gélen tisztított pINTl plazmidot és 0,5 pg gélen tisztított pFJ474 DNS-t kombinálunk 0,1 mg Spel-, Xbal-, Nrul és Ncol restrikciós enzimekkel emésztett pINTl plazmid DNS-sel, majd az előzőkben ismertetett módon defoszforilezzük. 1 egység T4 DNS-ligázt, ligázpuffert (BM) és TE puffért adunk az elegyhez 15 pl végtérfogatban. A ligáló reakcióelegyet 16 óra hosszat 15 °C-on inkubáljuk, majd Escherichia coli KI 2 DH5a sejtek transzformálására használjuk. A transzformánsokat 50 pg/ml ampicillint tartalmazó L-agaron szelektáljuk. A kívánt pLGD43 konstrukciót tartalmazó ampicillinrezisztens transzformánsokat átvizsgáljuk, és restrikciós enzimes elemzéssel azonosítjuk.
1. számú szekvencia: A sertés Tyr-His-Met prokarboxipeptidáz B szekvenciája: 10. ábra
2. számú szekvencia: Preprokarboxipeptidáz B:
11. ábra
3. számú szekvencia: Sertés karboxipeptidáz B szekvenciája: 12. ábra
4. számú szekvencia: Sertés karboxipeptidáz B szekvenciája: 13. ábra
5. számú szekvencia: (hossz: 11 bázis) (DPG59): 13. ábra
TACTAGTTGC A
6. számú szekvencia: (hossz: 11 bázis) (DPG60): 13. ábra
ACYAGTATGC A
Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.
Az 1. ábrán a pFJ469 plazmid restrikciós hasítási hely és funkciós térképe látható.
A 2. ábrán a pLGD27 plazmid restrikciós hasítási hely és funkciós térképe látható. A pLGD27 körülbelül 9492 bázispárt tartalmaz.
A 3. ábrán a pFJ489 plazmid restrikciós hasítási hely és funkciós térképe látható. A pFJ489 körülbelül 10769 bázispárt tartalmaz.
A 4. ábrán a pLGD23 plazmid restrikciós hasítási hely és funkciós térképe látható. A pLGD23 körülbelül 11257 bázispárt tartalmaz.
Az 5. ábrán a pFJ457 plazmid restrikciós hasítási hely és funkciós térképe látható. A pFJ457 körülbelül 9803 bázispárt tartalmaz.
A 6. ábrán a pLGD36 plazmid restrikciós hasítási hely és funkciós térképe látható.
A 7. ábrán a pFJ474 plazmid restrikciós hasítási hely és funkciós térképe látható. A pFJ474 körülbelül 9721 bázispárt tartalmaz.
A 8. ábrán a pFJ471 plazmid restrikciós hasítási hely és funkciós térképe látható.
A 9. ábrán a pLGD20 plazmid restrikciós hasítási hely és funkciós térképe látható. A pLGD20 plazmid körülbelül 9710 bázispárt tartalmaz.

Claims (13)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK.
    1. DNS-vegyület, amely sertés karboxipeptidáz B-t kódol, szekvenciája megegyezik a 3. számú szekvenciával.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti DNS-vegyület, amely említett DNS-vegyület tartalmazza még a sertés karboxipeptidáz B propeptid részét is, és szekvenciája megegyezik az 1. számú szekvenciával.
  3. 3. Rekombináns DNS-vektor, amely az 1. igénypont szerinti DNS-vegyületet tartalmazza.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti vektor, amely egy Pichia expressziós vektor.
  5. 5. A 3. igénypont szerinti expressziós vektor, amely egy bakteriális expressziós vektor.
  6. 6. A 4. igénypont szerinti Pichia expressziós vektor, amely tartalmazza még a humán szérumalbumin szignálpeptidjét is.
  7. 7. Pichia expressziós vektor, amely tartalmazza a 6. igénypont szerinti humán szérumalbumin szignálpeptidet, azaz a pLGD23 plazmid, amely NRRL B-21029 letéti számon érhető el.
  8. 8. A 4. igénypont szerinti Pichia expressziós vektor, amely tartalmazza a pre-mating faktor α szignálpeptidjét is.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti Pichia expressziós vek tor, azaz a pFJ489 plazmid, amely NRRL B-21028 letéti számon érhető el.
  10. 10. A 4. igénypont szerinti Pichia expressziós vektor, azaz a pFJ474 plazmid, amely NRRL B-21032 letéti számon érhető el.
  11. 11. A 4. igénypont szerinti Pichia expressziós vektor, amely tartalmazza a sertés prokarboxipeptidáz B szignálpeptidet.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti Pichia expressziós vektor, azaz a pLGD27 plazmid, amely NRRL B-21027 szá mon érhető el.
  13. 13. Eljárás sertés karboxipeptidáz B, vagy N-terminálisán meghosszabbított sertés karboxipeptidáz előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket alkalmazzuk :
    (a) egy, a 4. igénypont szerinti Pichia expressziós vektort tenyésztünk;
    (b) kinyerjük a karboxipeptidázt a táptalajból, majd szükség esetén tripszinnel lehasítjuk az N-terminális meghosszabbítást.
HU9601302A 1993-11-16 1994-11-16 Dna sequences encoding porcine pancreatic carboxypeptidase b HU220879B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15325893A 1993-11-16 1993-11-16
PCT/US1994/013142 WO1995014096A1 (en) 1993-11-16 1994-11-16 Dna sequences encoding porcine pancreatic carboxypeptidase b

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9601302D0 HU9601302D0 (en) 1996-07-29
HUT76100A HUT76100A (en) 1997-06-30
HU220879B1 true HU220879B1 (en) 2002-06-29

Family

ID=22546426

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9601302A HU220879B1 (en) 1993-11-16 1994-11-16 Dna sequences encoding porcine pancreatic carboxypeptidase b

Country Status (10)

Country Link
US (1) US5672496A (hu)
EP (1) EP0776369A4 (hu)
JP (1) JPH09505998A (hu)
KR (1) KR960705936A (hu)
AU (1) AU1178495A (hu)
BR (1) BR9408061A (hu)
CA (1) CA2175834A1 (hu)
FI (1) FI962044A (hu)
HU (1) HU220879B1 (hu)
WO (1) WO1995014096A1 (hu)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL116696A (en) * 1995-01-25 1999-08-17 Bio Technology General Corp Production of enzymatically active recombinant carboxypeptidase b
DE19915938A1 (de) * 1999-04-09 2000-10-19 Aventis Pharma Gmbh Herstellung von pankreatischer Procarboxypeptidase B, Isoformen und Muteinen davon und ihre Verwendung
AU2001229253A1 (en) * 2000-01-12 2001-07-24 Eli Lilly And Company Carboxypeptidase b free of animal products and contaminating enyzme activity
US7291587B2 (en) * 2001-11-09 2007-11-06 Novo Nordisk Healthcare A/G Pharmaceutical composition comprising factor VII polypeptides and TAFI polypeptides
DE602004025192D1 (de) * 2003-12-05 2010-03-11 Roche Diagnostics Gmbh Rekombinante Carboxypeptidase B und ihre Aufreinigung
PL1794294T3 (pl) * 2004-09-27 2011-12-30 Sanofi Aventis Deutschland Rekombinowana karboksypeptydaza b
EP2943581B1 (en) * 2013-01-10 2019-08-07 Biocon Limited Process for expression of recombinant proteins in pichia pastoris using a fed batch model

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5166329A (en) * 1985-10-25 1992-11-24 Phillips Petroleum Company DNA encoding the alcohol oxidase 2 gene of yeast of the genus Pichia
US5102789A (en) * 1989-03-15 1992-04-07 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of epideramal growth factor in pichia pastoris yeast cells
US5206161A (en) * 1991-02-01 1993-04-27 Genentech, Inc. Human plasma carboxypeptidase B
US5330901A (en) * 1991-04-26 1994-07-19 Research Corporation Technologies, Inc. Expression of human serum albumin in Pichia pastoris

Also Published As

Publication number Publication date
BR9408061A (pt) 1996-12-24
FI962044A0 (fi) 1996-05-14
EP0776369A4 (en) 2000-11-22
AU1178495A (en) 1995-06-06
CA2175834A1 (en) 1995-05-26
KR960705936A (ko) 1996-11-08
JPH09505998A (ja) 1997-06-17
HU9601302D0 (en) 1996-07-29
WO1995014096A1 (en) 1995-05-26
EP0776369A1 (en) 1997-06-04
US5672496A (en) 1997-09-30
HUT76100A (en) 1997-06-30
FI962044A (fi) 1996-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0561137B1 (en) Hybrid DNA Synthesis of Mature Insulin-like Growth Factors
US5270181A (en) Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules
US5292646A (en) Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules
EP0035384B1 (en) Deoxynucleotide linkers to be attached to a cloned dna coding sequence
SK62593A3 (en) Method of constructing synthetic leader sequences
JPH0513630B2 (hu)
JP2000135092A (ja) オリゴペプチド反復単位を有する大ポリペプチド
RU2118365C1 (ru) Производное гирудина, действующее как ингибитор тромбина, рекомбинантная днк, кодирующая производное гирудина, и способ его получения
EP0196864A2 (en) Alkaline phosphatase-mediated processing and secretion of recombinant proteins, DNA sequences for use therein and cells transformed using such sequences
JPH0438394B2 (hu)
US5024943A (en) Regulatory region cloning and analysis plasmid for bacillus
EP0129073B1 (en) Hybrid dna synthesis of mature growth hormone releasing factor
HU220879B1 (en) Dna sequences encoding porcine pancreatic carboxypeptidase b
JPH07170984A (ja) 新規アミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコード するｄｎａを保有する発現ベクターを 組み込んだバチルス・ブレビスを用いる 有用物質の製造法
WO1990003438A1 (en) Improved bacterial strains for heterologous gene expression
US5629205A (en) Promoters for gene expression
US5015574A (en) DNA sequence involved in gene expression and protein secretion, expression-secretion vector including the DNA sequence and the method of producing proteins by using the expression-secretion vector
US5334531A (en) Plasmid vector for expression in bacillus and used for cloning the structural gene which codes for the human growth hormone and a method of producing the hormone
KR950010817B1 (ko) 사카로미세스 세레비시아에에서 재조합 인간 psti의 제법
KR100393297B1 (ko) 돌연변이체aox2프로모터,이를보유한벡터,형질전환체및이종단백질의제조방법
CN100359001C (zh) 宿主细胞中重组多肽的区室化
SU1707078A1 (ru) Рекомбинантна плазмидна ДНК рТНУЗ14, кодирующа полипептид со свойствами тимозина @ человека, рекомбинантна плазмидна ДНК рТНУ12 - промежуточный продукт дл ее конструировани и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент полипептида со свойствами тимозина @ человека
CA2285232A1 (en) Gene encoding recombinant trehalose phosphorylase, vector containing the gene, transformant transformed by the gene, and method for producing recombinant trehalose phosphorylase with the use of the transformant
JPH0638741A (ja) ヒラメ成長ホルモンの製造法
JP3164181B2 (ja) 新規発現ベクタ−、該発現ベクタ−を保有する微生物、該微生物を用いる有用物質の製造法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees