BR112015016683B1

BR112015016683B1 - Processo para expressão de proteínas recombinantes em pichia pastoris com o uso de um modelo de alimentação em batelada

Info

Publication number: BR112015016683B1
Application number: BR112015016683-0A
Authority: BR
Inventors: Sanjay Tiwari; Gourav Awasthi; Gokul Jothiraman; Arun Chandavarkar
Original assignee: Biocon Limited
Priority date: 2013-01-10
Filing date: 2014-01-10
Publication date: 2021-11-23
Also published as: EP2943581A4; EP2943581A1; KR102133789B1; WO2014108856A1; BR112015016683A2; US20150353620A1; US10047134B2; KR20150105644A; EP2943581B1

Abstract

processo para expressão de proteínas recombinantes em pichia pastoris com o uso de um modelo de alimentação em batelada. a presente revelação se refere a um modelo abrangente para expressão de peptídeos recombinantes por pichia pastoris. o modelo usa uma variável facilmente controlável chamada de ?razão de nutriente crítica? para obter um equilíbrio certo entre síntese de produto e sua degradação durante o processo de fermentação. a concentração extracelular de precursor pode ser aumentada em cerca de 10 vezes e as constantes de degradação podem ser reduzidas em cerca de 10 a 20 vezes para casos intracelulares e extracelulares, respectivamente, controlando-se razão de nutriente crítica e adição de hidrolisado de farinha de soja e edta.

Description

CAMPO DA TÉCNICA

[001] A presente revelação refere-se a um modelo abrangente para expressão de peptídeos recombinantes por Pichia pastoris. O modelo é estruturado em linhagens de taxa de síntese intracelular, taxa de degradação intracelular, acumulação intracelular, secreção, taxa de degradação extracelular e taxa de acumulação extracelular. O modelo usa uma variável facilmente controlável chamada de 'razão de nutriente crítica' para obter um equilíbrio certo entre síntese de produto e sua degradação durante o processo de fermentação. A concentração extracelular de precursor pode ser aumentada em cerca de 10 vezes e as constantes de degradação podem ser reduzidas em cerca de 10 a 20 vezes para casos intracelulares e extracelulares, respectivamente, controlando-se a razão de nutriente crítica e a adição de hidrolisado de farinha de soja e EDTA.

ANTECEDENTES E TÉCNICA ANTERIOR DA REVELAÇÃO

[002] Pichia pastoris, um microrganismo de crescimento rápido, embora facilmente cultivável até altas densidades celulares, tem um obstáculo grande de produtividade específica relativamente inferior (Porro et al., 2011). As desvantagens associadas à produtividade baixa da técnica anterior foram remediadas na revelação instantânea.

[003] A robustez no processo microbiano projetado foi introduzida usando-se a razão de nutriente crítica (CNR) de dois nutrientes importantes (Tiwari et al., 2012) como uma variável de controle para variáveis metabólicas chave como atividade de uma enzima regulatória centralmente importante -fosfofrutoquinase, taxa de consumo de oxigênio bem como produtividade específica. Como CNR é um parâmetro geral, é provável que influencie síntese de enzimas de degradação e enzimas de transporte, tão logo o mesmo afete a produtividade do produto principal.

[004] Modelar e medir fluxos intracelulares de proteína recombinante secretadas em Pichia pastoris com uma marcação inovadora 34S por Martin Pfeffer et al. caracteriza formação de proteína intracelular, degradação e secreção mediante uma condição de estado estacionário. Para além da limitação de modo de quimiostato de fermentação, seu estudo também é limitado ao uso de metanol de substrato limitante em vez de usar razão de nutriente crítica (CNR). Adicionalmente, seu estudo não considera as perdas devido à degradação extracelular e, consequentemente, ignora um aspecto vital de dinâmicas de proteína durante a expressão.

[005] Consequentemente, existe uma necessidade na técnica de incluir parâmetros mais relevantes no espaço de projeto de processo para fabricação de peptídeos recombinantes. Na presente revelação foi revelado o uso de CNR para síntese regular, degradação extracelular e intracelular, secreção de peptídeo recombinante expresso em modo de alimentação em batelada.

DEMONSTRAÇÃO DA REVELAÇÃO

[006] Em conformidade, a presente revelação se refere a um processo de aprimorar a expressão de insulina análoga usando-se CNR de carbono residual para nutrientes de nitrogênio residual na cultura como uma ferramenta eficaz para controlar dinâmicas microbianas para a biossíntese de peptídeo geral durante a fermentação e aprimora explicitamente os níveis de expressão insatisfatórios de precursor de Insulina análoga em processo de alimentação em batelada P.pastoris. A presente revelação demonstra o controle de razão de nutriente crítica (C/N), uso de inibidores de protease como hidrolisado de farinha de soja, ureia e inibidores de metalo de protease para produtividade aprimorada de peptídeos heterólogos e proteínas como Carboxipeptidase B, Insulina e sua análoga com o uso de sistema de expressão induzível por metanol em Pichia Pastoris incorporando-se modelo matemático para acumulação de produto intra e extracelular, degradação e síntese.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS ANEXAS

[007] Os recursos da presente revelação se tornarão mais completamente evidentes a partir da descrição a seguir tomada em conjunto com as Figuras anexas. Mediante o entendimento de que as Figuras retratam apenas diversas modalidades de acordo com a revelação e, portanto, não devem ser consideradas como limitantes de seu escopo, a revelação será descrita com especificidade adicional e detalhes através do uso das Figuras anexas:

[008] A Figura 1: mostra perfil atual (marcadores) e de modelo ajustado (linha sólida) de concentração de biomassa durante três execuções de alimentação descontínua de controle de precursor de peptídeo de Insulina, peptídeo de precursor de Lispro, peptídeo de precursor de Glargina e precursor de Carboxipeptídeo B.

[009] A Figura 2: mostra perfil atual (marcadores) de razão de nutriente crítica (metanol a amônia) durante três execuções de alimentação descontínua de controle de precursor de peptídeo de Insulina, peptídeo de precursor de Lispro, peptídeo de precursor de Glargina e precursor de Carboxipeptídeo B.

[010] A Figura 3: mostra perfil atual (marcadores) e de modelo ajustado (linha sólida) de concentração de produto extracelular durante três execuções de alimentação descontínua de controle de precursor de peptídeo de Insulina, peptídeo de precursor de Lispro, peptídeo de precursor de Glargina e precursor de Carboxipeptídeo B, precursor de peptídeo de Insulina e precursor de Carboxipeptidase B são considerados 100% em caso de controle enquanto o peptídeo de precursor de Glargina e o peptídeo de precursor de Lispro são considerados como porcentagem com referência de precursor de peptídeo de Insulina.

[011] A Figura 4: mostra perfil atual (marcadores) e de modelo ajustado (linha sólida) de concentração de produto extracelular durante três execuções de processo de alimentação em batelada de precursor de peptídeo de Insulina, peptídeo de precursor de Lispro, peptídeo de precursor de Glargina e precursor de Carboxipeptídeo B com razão de nutriente crítica otimizada, precursor de peptídeo de Insulina peptídeo de precursor de Glargina e peptídeo de precursor de Lispro são comparados a 100% no caso de controle de precursor de peptídeo de Insulina enquanto Carboxipeptidase B é comparado com seu caso de expressão extracelular de controle.

[012] A Figura 5: mostra batelada de controle (linha pontilhada); batelada com taxa de nutriente Crítica ideal (linha sólida) para Insulina.

[013] A Figura 6: mostra batelada de controle (linha pontilhada); batelada com taxa de nutriente Crítica ideal (linha sólida) para Lispro.

[014] A Figura 7: mostra batelada de controle (linha pontilhada); batelada com taxa de nutriente Crítica ideal (linha sólida) para Glargina.

[015] A Figura 8: mostra batelada de controle (linha pontilhada); batelada com taxa de nutriente Crítica ideal (linha sólida) para Carboxipeptidase B.

[016] A Figura 9: mostra aprimoramentos em acumulação extracelular de peptídeo precursor de insulina, linha sólida simulada e marcador para valores medidos.

[017] A Figura 10: mostra aprimoramentos em acumulação extracelular de peptídeo de precursor de Lispro, linha sólida simulada e marcador para valores medidos.

[018] A Figura 11: mostra aprimoramentos em acumulação extracelular de peptídeo de precursor de Glargina, linha sólida simulada e marcador para valores medidos.

[019] A Figura 12: mostra aprimoramentos em acumulação extracelular de Carboxipeptidase B protease, linha sólida simulada e marcador para valores medidos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA REVELAÇÃO

[020] Cepas de P.pastoris são usadas para produção do respectivo peptídeo de cadeia única para peptídeo de insulina, peptídeo de insulina Lispro, peptídeo de insulina Glargina e enzima de Carboxipeptidase B. Os peptídeos projetados de análogos de Insulina são similares exceto para a inversão no posicionamento de prolina e lisina nas posições B28 e B29, respectivamente, para peptídeo de Lispro e a Carboxipeptidase B de porcino é clonada em Pichia pastoris. A expressão envolveu o uso de um promotor de enzima álcool oxidase rigorosamente regulada (AOX) que é integrado ao genoma hospedeiro com o uso de vetor pPIC9K. Os clones selecionados a partir de placa de ágar de base de nitrogênio de levedura (YNB) de Sigma têm resistência a 2 mg ml-1 de G418. A cultura propagada em meio de YNB é usada para preparar frascos de glicerol que foram eventualmente mantidos a - 70 °C no freezer para armazenamento a longo prazo. Para inocular um recipiente de semente, conteúdos de 1 ml frasco de glicerol foram descongelados e transferidos para 50 ml de cultura de MGY (10 g l-1 de glicerol e 0,004 g l-1 de biotina e YNB em 1,5 % volume/volume-1) em recipiente cônico de 250 ml e agitados a 230 rpm e 30 °C durante 24 horas. De modo subsequente, cultura bem crescida (OD600nm > 15) é usada em aproximadamente 10% volume/volume-1 para inocular recipientes de inóculo 2.000 ml que contêm cerca de 500 ml de meio de MGY. Os recipientes de inóculo são agitados a 230 rpm e 30 °C durante 24 horas. A cultura do recipiente de inóculo é transferida para 10 l de meio de produção pré-esterelizado em um fermentador de 50 l. O processo padrão ou de controle é adaptado a partir de protocolos descritos para processo de alimentação em batelada de Pichia. (http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/pichiafermj3rot.pdf).

[021] O meio de produção é esterilizado a pH baixo de cerca de 2,0 unidades aquecendo-se a 121 °C durante 1 hora. Após a esterilização, a fonte de nitrogênio é fornecida ajustando-se o pH para 5,0 com o uso de sulfato de amônio esterilizado em filtro na faixa de concentração de cerca de 1 g/l a cerca de 5 g/l. O final de fase de batelada é indicado por um aumento visível em DO (Oxigênio Dissolvido) de < 25% para tão alto quanto 100%. De modo subsequente; a indução é iniciada iniciando-se alimentação de metanol em uma taxa de 1 g l-1 h-1. A taxa de alimentação de metanol é aumentada gradualmente até cerca de 10 g l-1 h-1. O metanol é usado, não apenas como indutor, mas também como fonte de energia e carbono e é mantido todo o tempo na concentração de menos que ou igual a cerca de 5g/l, preferencialmente em menos que cerca de 0.5 g l-1. Durante toda a fase de processo de alimentação em batelada de metanol, uma solução-mãe concentrada pré-esterelizada de YEP (5 % w v-1 de extrato de levedura, 10 % w v-1 de peptona de soja) é alimentada em uma taxa fixa de 1 g l-1 h-1. O controle de espuma é gerenciado com a adição de structol antiespuma J673. Todo o processo de alimentação em batelada é executado com o auxílio de método de pico DO, isto é, o tempo levado para observar um aumento exorbitante em DO imediatamente após interrupção de alimentação de metanol, indiretamente representou a acumulação de metanol na cultura. O tempo de acumulação é estritamente controlado em menos que 1 minuto e as temporizações de acumulação são correlacionadas ao conteúdo de metanol na cultura. As amostras, retiradas a cada 24 horas após o início de indução são analisadas para peso de célula úmida % (WCW), pH, conteúdo de peptídeo (%), degradação taxa para produto intra e extracelular. O conteúdo de metanol, ureia e amônia em sobrenadante é medido a cada 4 a 8 horas durante toda a batelada.

[022] A presente revelação ocorre em relação a um processo de aprimoramento em expressão de peptídeos recombinantes com o uso de modelo de processo de alimentação em batelada estruturado de modo dinâmico com síntese de peptídeos, secreção e degradação.

[023] O processo aprimorado é atingido executando-se as bateladas em modo de controle, exceto controle de razão de nutriente crítica conforme sugerido por modelagem e controlando-se o mesmo mediante a alimentação de sulfato de Amônio (70% peso/volume), metanol (94 % v/v_) e Ureia (50% peso/peso) enquanto

[024] O hidrolisado de farinha de soja (16% peso/volume) e EDTA (16% peso/volume) para controlar degradação de proteína conforme exigido a partir de perfil de degradação dos produtos.

[025] Em uma modalidade da presente revelação, CNR é definido pela taxa de carbono: nitrogênio, um valor fracionário/decimal o qual está na faixa de cerca de 0,01 a 0,15. Adicionalmente, a concentração de metanol empregada na presente invenção é menos que ou igual a cerca de 5 g/l e a concentração de hidróxido de amônio empregada está na faixa de cerca de 1 g/l a cerca de 5 g/l.

[026] Em outra modalidade da presente revelação, a concentração extracelular de precursor aumentada em cerca de 10 vezes e as constantes de degradação reduzidas em cerca de 10 a 20 vezes para casos intracelulares e extracelulares respectivamente.

[027] Em ainda outra modalidade da presente revelação, a diferença entre o processo de controle e o processo da presente invenção está no perfil de alimentação de metanol e adição de sulfato de amônio. No processo aprimorado da presente invenção, o perfil de alimentação de metanol é calculado a partir do modelo (processo de controle) e sulfato de Amônio é usado para CNR de controle.MODELO DINÂMICO DE PROCESSO DE ALIMENTAÇÃO EM BATELADA Equilíbrio de massa de precursor na biomassa total como um limite do sistema Taxa de formação- Taxa de degradação - Taxa de secreção = Taxa de acumulação

Em que a taxa de crescimento específico é definida como

[028] pi é a concentração intracelular de precursor em gramas por quilograma de biomassa; X é a biomassa total em Kg; rf, rid e rs representam a taxa de formação de peptídeo específica, degradação taxa e secreção taxa respectivamente em g kg-lh-1.

[029] O equilíbrio de massa de precursor em sobrenadante isento de célula como um limite de sistema:

[030] Em que, vermelho representa a taxa de degradação extracelular em g h-1; Pe representa produto extracelular total em gramas. Os diversos termos na equação cima são subsequentemente expandidos:

[031] Taxa de síntese (rf) e taxas de degradação (rid & red)

[032] Como o gene de produto é colocado próximo ao promotor de AOX, assume- se que as enzimas de atividade de síntese seriam proporcionais à atividade de AOX induzido. A atividade de AOX, por sua vez, depende do metanol como seu substrato. Adicionalmente, conforme a retenção de metanol é revelada como afetada de modo adverso pela concentração de outro nutriente-chave na fermentação - amônia, uma correção é introduzida em termos de CNR de metanol para amônia. Desse modo, a taxa de síntese de peptídeos é modelada como o uso de cinética de saturação a seguir:

[033] Em que kf é uma constante de síntese em gramas de peptídeo sintetizado por unidade de AOX sintetizado por h; EAOX representa AOX em unidades por grama de biomassa; CNR é calculado de modo dinâmico como a taxa de concentração de metanol para aquela de concentração de amônia na cultura; kMf é a constante de afinidade. Como AOX é um promotor forte (Zhang et al., 2000), o termo 'kf* EAOX' é substituído por um valor de estado estacionário rfmax. Conforme relatado (Bibila & Flickinger, 1991; Whitely et al., 1997; Belle et al., 2006), os dados de degradação atuais mostrados primeiro na cinética de ordem e, consequentemente, forma modelados conforme mostrado a seguir:

[034] Em que Kid, Ked são as constantes de taxa de primeira ordem dependente de tempo em h-1; V é o volume de cultura em litros; x e pe são a concentração de biomassa e a concentração de produto extracelular em g l-1.

[035] Constantes de degradação (Kid & Ked)

[036] Para explicar as variações observadas nas constantes de degradação ao longo da batelada, o comportamento dinâmico em termos de protease produtividade e liberação de protease das células é modelado na presente invenção. Sendo um parâmetro geral, espera-se que CNR afete a produtividade de protease da mesma forma que existe a hipótese de que afeta a síntese de peptídeo. O impacto cumulativo de CNR, um quelante de íon de metal (I1) e um hidrolisato vegetal (I2) na protease atividade é incorporado da seguinte maneira:

[037] Em que kpid e kped são as constantes de degradação específicas de molécula em gramas de peptídeo degradado por atividade unitária por hora; kI1 e kI2 são as respectivas constantes de inibição conforme determinado a partir do estudo de inibição realizado em amostras de cultura. A produtividade de Ei, da protease intracelular líquida em unidades por grama de biomassa, é modelada conforme descrito na equação (7):

[038] Em que ridmax denota a produtividade de protease máxima em unidades por grama de biomassa por hora; kMid é a constante de afinidade; Ee é a concentração de protease extracelular em unidades por grama de sobrenadante. A liberação de protease dinâmica de biomassa é modelada da seguinte maneira:

[039] Em que kes é a taxa de liberação de protease contínua de células em unidades por grama de biomassa por hora; x é a concentração de biomassa em g l- 1, v denota viabilidade fracionária real das células.

[040] Taxa de crescimento específica (μ) e taxa secreção intracelular (rs)

[041] Visto que a atividade de enzimas reguladoras como fosfofrutoquinase (Voet & Voet, 2004) é afetada não apenas por substrato (Tiwari et al., 2012; Habison et al., 1983; Buckwitz et al., 1990), foi necessário corrigir a quantidade de nutriente de carbono que se ligaria à enzima na presença de nutriente de nitrogênio. Isso é alcançado usando-se CNR no tipo Monod de modelo visto que isso confinaria a quantidade de nutriente de carbono que poderia se ligar à enzima centralmente importante e, consequentemente, afetar a taxa de crescimento específica da seguinte maneira:

[042] A taxa de secreção de peptídeos (rs), sendo um processo ligado à enzima(Kjeldsen, 2000) também é modelada da seguinte maneira:

[043] Em que Et representa enzimas de transporte em unidades por grama de biomassa; kcat é a constante para conversão de complexo de Et - pi em pθ, em gramas de peptídeo por atividade unitária por hora. A produtividade de Et foi modelada conforme descrito na equação (14):

[044] Em que rtmax denota a produtividade máxima de Et; kMt é a constante de afinidade. Além disso, as equações de equilíbrio de massa a seguir são usadas para o fermentador como um sistema:

[045] Em que F denota a taxa de alimentação em litros por hora; Vo é o volume inicial em litros.

TRABALHAR COM O MODELO

[046] Os dados de três testes de fermentação de controle de cada peptídeo são usados para obter valores de várias constantes no modelo mediante a minimização do erro entre os resultados de modelo em relação aos dados experimentais. As constantes KI1 e KI2 são determinadas a partir de estudos de degradação in vitro reais com o uso de I1 e 12 separadamente em amostras de sobrenadante de testes de fermentação de controle. O modelo obtido dessa forma mostrou pe como uma função de variáveis facilmente mensuráveis e controladas: CNR, I1 e 12. Embora o aumento de concentrações de I1 e 12 até o respectivo máximo, as concentrações são determinadas a partir de estudos experimentais reais com devidas considerações em relação à absorção de substrato e crescimento. O perfil ideal de CNR como uma variável de controle é determinado mediante a maximização da função objetivo de taxa de mudança em pe toda hora a partir do início da indução até o término da fermentação.

[047] São impostas várias restrições para chegar a uma solução. São dados abaixo alguns exemplos:

[048] Uma restrição é imposta pela taxa de transferência de oxigênio e calor máxima experimentalmente determinada no biorreator, implícita na quantidade máxima de biomassa formada por hora (< 100 g h-1). Essa restrição é um objetivo para a determinação de CNR ideal para taxa de crescimento específica, a taxa máxima possível de formação de peptídeo conforme derivado da equação

[049] A restrição adicional em CNR é imposta a fim de reduzir a taxa de degradação intracelular, em particular, para o peptídeo Lipsro instável e 'difícil de expressar', equacionando o Kid alvo à taxa de constante de degradação intracelular de peptídeo de insulina relativamente estável conforme determinado por teste de processo de controle. Adicionalmente, outro processo restrição é implantado na taxa de secreção máxima, com base no acúmulo de peptídeo extracelular mais alto relatado (Werten et al., 1999) de cerca de 15 g l-1, que é mais alto que os níveis de expressão de peptídeo de insulina bem como peptídeo de lispro. Consequentemente, presume-se que a secreção não é um gargalo até 15 g l-1 de peptídeo extracelular. O perfil obtido dessa forma de CNR é verificado para impacto em pe testando-se realmente três bateladas de peptídeo de insulina e peptídeo de lispro, peptídeo de Glargina e carboxipeptidase B, cada um com perfil de CNR ideal.

[050] Um entendimento mais profundo pode ser obtido por referência aos exemplos específicos, que são fornecidos para propósitos de ilustração apenas e se destinam a limita o escopo da revelação.

EXEMPLO 1

[051] O teste de processos de controle processes com o uso de protocolos mencionados acima adaptados das diretrizes de processo de fermentação Invitrogen, proporcionam diferentes resultados de expressão para o peptídeo de insulina, peptídeo de lispro, peptídeo de Glargina e proteína Carboxipeptidase B. O perfil de biomassa, a razão de nutriente bem como o acúmulo extracelular dos respectivos peptídeos é mostrado nas Figuras 1 a 3:

[052] A expressão extracelular geral de peptídeo precursor lispro e peptídeo de precursor de Glargina é de apenas cerca de 2 % e 25,5 % daquela encontrada para peptídeo de insulina conforme mostrado na Figura 3. O peptídeo de insulina tem expressão mais elevada que é considerada 100% mostrada na Figura 3. Visto que o precursor de Carboxipeptídeo B é diferente da Insulina, a atividade máxima de precursor de Carbóxi peptidae B é considerada 100% em bateladas de controle e seu perfil é mostrado na Figura 3. Os estudos de controle são usados para estudar as diferenças não apenas em acúmulo extracelular desses peptídeos, mas também determinam restrições relevantes usadas no modelo. Subsequentemente, usa-se o modelo para prever o perfil ideal de razão de nutriente crítica. O perfil previsto de razão de nutriente é, então, verificado por testes experimentais reais para todos os peptídeos.

EXEMPLO 2

[053] A fim de maximizar o acúmulo extracelular geral de peptídeo de insulina relativamente estável, peptídeo de Glargina e Carboxipeptidase B, o modelo planejou um aumento geral na razão de nutriente crítica representada nas Figuras 5(A), 7(A) e 8(A). Conforme mostrado na Figura 4° acúmulo extracelular geral de peptídeo de precursor de insulina aumentou de 100% para 175%, para o peptídeo de precursor de Glargina, o acúmulo extracelular aumentou de 25,5% para 61,5% e para Carboxipeptidase B, a expressão extracelular aumentou de 100% para 180%. O sumário do aumento do acúmulo extracelular de Insulina Precursor peptídeo, peptídeo de Precursor de Glargina e protease de Precursor de Carboxipeptidase é mostrado nas Figuras 9, 11 e 12.

EXEMPLO 3

[054] A fim de maximizar o acúmulo extracelular geral de peptídeo de Lispro relativamente instável, o modelo planejou uma diminuição geral na razão de nutriente crítica conforme mostrado na Figura 6(A). Conforme mostrado na Figura 10, o acúmulo extracelular geral de peptídeo de Lispro aumentou em cerca de 9 vezes de 2% para 20%.

EXEMPLO 4

[055] O impacto de usar a razão de nutriente ideal em síntese de peptídeos bem como a degradação é avaliado e é mostrado nas Figuras 5 a 8. Conforme mostrado na Figura, a abordagem de otimização aumentou a CNR para peptídeo de insulina, peptídeo de Glargina e Carboxipeptidase B, mas reduziu a CNR para peptídeo de Lispro. Dessa maneira, concluiu-se que a taxa de síntese de peptídeo de insulina, peptídeo de Glargina e carboxipeptidase B aumenta enquanto a mesma para o peptídeo de Lispro diminui. Adicionalmente, concluiu-se que as constantes de degradação caem para todos os peptídeos e a proteína. As Figuras 5 a 8 mostram o impacto das alterações acima na dinâmica de peptídeo na expressão extracelular geral para o peptídeo precursor de insulina, peptídeo de Lispro, peptídeo de Glargina e Carboxipeptidase B. Embora o acúmulo extracelular de peptídeo de insulina, peptídeo de Glargina e Carboxipeptidase B poderia ser aumentado em cerca de 38%, 140% e 180%), os aprimoramentos correspondentes para peptídeo de Lispro são cerca de 10 vezes do desempenho geral da insulina e os análogos são resumidos na Figura 9 a 11. Isso verifica o potencial regulatório de CNR para afetar de modo favorável a dinâmica de peptídeo durante as execuções de fermentação de processo de alimentação em batelada. Para o peptídeo de Lispro, a constante de degradação é adicionalmente controlada adicionando-se EDTA e hidrolisado de farinha de soja na faixa de 15 a 20 g/l e 5 a 6% peso/volume. Uma vez que o Lispro é um análogo instável em comparação com outros produtos de proteína ou peptídeo da presente invenção, o hidrolisado de farinha de soja e EDTA são exclusivamente adicionados durante o processo para a produção de Lispro, enquanto no caso de outros produtos estáveis, extrato de Levedura e peptona de soja, serem adicionados (alimentação YEP).

EXEMPLO 5

[056] A fim de compreender a eficiência geral do maquinário de expressão, um cálculo teórico de vários parâmetros relacionados à expressão para o controle bem como o processo aprimorado é feito com o uso dos respectivos parâmetros medidos/ preditos. A Tabela I mostra 67,9% e 2,5% do precursor de insulina (IP) e precursor de Lispro (LP) sintetizado respectivamente acumulado extracelular nos respectivos processos de controle. De modo semelhante, 79,6% e 17,4% do precursor de Insulina (IP) e do precursor de Lispro sintetizados respectivamente separados no processo de controle. As diferenças significativas entre IP e LP, são atribuídas à degradação extracelular e intracelular maior de LP em 80,6 % do LP sintetizado e 85,7 % de LP separado como contra 21,6% do IP sintetizado e 14,7% de IP separado. Além disso, a síntese geral de LP também é menor em 51,8% daquela do IP. A abordagem reduziu a degradação intracelular de LP para 21,9%) do peptídeo sintetizado no processo aprimorado, o nível aceitável se baseia nos resultados de IP estável no processo de controle ou aprimorado. No entanto, uma queda na degradação extracelular de AP de 85,7% para 50,8% no processo aprimorado sugere o escopo para a redução adicional e pode exigir estudos de otimização adicionais na CNR bem como aditivos adicionais. O LP acumulado extracelular como uma porcentagem de total sintetizado pode ser aumentado de 2,5% para 35,7%.TABELA I. SALDO DE MASSA GERAL NO PEPTÍDEO INSULINA E LISPRO NA RESPECTIVA FERMENTAÇÃO DE PROCESSO DE ALIMENTAÇÃO EM BATELADA

a: cálculo em % em relação ao peptídeo de insulina total sintetizado no caso de controle;b: cálculo em % com base no peptídeo extracelular medido bem como a degradação extracelular;c: cálculo em % em relação ao peptídeo total sintetizado no respectivo caso

EXEMPLO 6

[057] A fim de compreender a eficiência geral do maquinário de expressão, um cálculo teórico de vários parâmetros relacionados à expressão para o controle bem como o processo aprimorado é feito com o uso dos respectivos parâmetros medidos/ preditos. A Tabela II mostra 67,9% e 17,3% do precursor de insulina (IP) e precursor de Glargina (GP) sintetizado respectivamente acumulado extracelular nos respectivos processos de controle. De modo semelhante, 79,6% e 48% do precursor de Insulina (IP) e do precursor de Glargina sintetizados respectivamente separados no processo de controle. As diferenças significativas entre IP e GP, são atribuídas à degradação extracelular e intracelular maior de GP em 47% do GP sintetizado e 48 % de GP separado como contra 21,6% do IP sintetizado e 14,7% de IP separado. Além disso, a síntese geral de GP é equivalente a 95% daquela do IP. A abordagem reduziu a degradação intracelular de GP para 36,4% do peptídeo sintetizado no processo aprimorado, o nível aceitável se baseia nos resultados de IP estável no processo de controle ou aprimorado. No entanto, uma queda na degradação extracelular de GP de 32,3,7% para 23,3% no processo aprimorado sugere o escopo para a redução adicional e pode exigir estudos de otimização adicionais na CNR bem como aditivos adicionais. O GP acumulado extracelular como uma porcentagem de total sintetizado pode ser aumentado de 18,2% para 37,9%.TABELA II. SALDO DE MASSA GERAL NO PEPTÍDEO INSULINA E GLARGINA NAS RESPECTIVAS FERMENTAÇÕES DE PROCESSO DE ALIMENTAÇÃO EM BATELADA

a: cálculo em % em relação ao peptídeo de insulina total sintetizado no caso de controle; b: cálculo em % com base no peptídeo extracelular medido bem como a degradação extracelular;c: cálculo em % em relação ao peptídeo total sintetizado no respectivo caso

[058] Semelhante a esses, a atividade de Carboxipeptidase B extracelular total em linha é aumentada de 25% para 40,9%, conforme mostrado na Tabela III.TABELA III

[059] Saldo de massa geral em proteína de Carboxipeptidase B nas respectivas fermentações de processo de alimentação em batelada

a: cálculo em % em relação ao peptídeo de Carboxipepitdase B total sintetizado no caso de controle;b: cálculo em % com base no peptídeo extracelular medido bem como a degradação extracelular;c: cálculo em % em relação ao peptídeo total sintetizado no respectivo caso

Claims

1. Processo para aperfeiçoar a expressão de peptídeo recombinante em Pichia pastoris caracterizado por controlar a razão de nutriente crítica (CNR) de nutrientes de carbono residual para nitrogênio residual na cultura, em que a CNR é dinamicamente calculada como a razão da concentração de metanol para a concentração de amônia na cultura, em que a CNR está sendo controlada por um modelo matemático compreensivo, e em que a CNR está sendo controlada pela introdução de sulfato de amônio (70% peso/volume), metanol (94% volume/volume) e ureia (50% peso/peso), e em que um valor fracional/decimal da CNR cai na faixa de 0,01 a 0,15, em que metanol é empregado em uma concentração inferior ou igual a 5 g/l, e sulfato de amônio ou hidróxido de amônio é empregado em uma concentração na faixa de 1 g/l a 5 g/l, e em que o hidrolisado de farinha de soja (16% peso/volume) e EDTA (16% peso/volume) são usados para controlar a degradação proteica como exigido pelo perfil de degradação do produto,em que o modelo matemático compreensivo é um modelo de alimentação em batelada, em que o impacto cumulativo da CNR, EDTA (I1) e hidrolisado de farinha de soja (I2) na atividade de protease é incorporado como segue:

em que kpid e kped são as constantes de degradação extracelular e intracelular específicas de molécula em gramas de peptídeo degradado por atividade unitária por hora; kI1 e kI2 são as respectivas constantes de inibição conforme determinado a partir do estudo de inibição realizado em amostras de cultura,em que Ee é a concentração de protease extracelular em unidade por grama de supernatante, e Ei é a concentração de protease intracelular líquida em unidade por grama de biomassa, eem que a produtividade de Ei é modelada como:

em que X é a biomassa total em kg, μ é a taxa de crescimento específica, ridmax denota a produtividade máxima de proteases intracelulares em unidade por grama de biomassa por hora, kMid é a constante de afinidade da afinidade das proteases intracelulares ao peptídeo recombinante, e a liberação dinâmica de proteases a partir de biomassa é modelada como

em que kes é a taxa de liberação contínua de proteases das células em unidades por grama de biomassa por hora, x é a concentração de biomassa em g L-1, e v denota a viabilidade fracional real das células.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o modelo abrangente é um modelo de alimentação em batelada que é estruturado de modo dinâmico com degradação, secreção e síntese de peptídeos.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado adicionalmente por compreender o uso de um inibidor de protease, ureia e um inibidor de metaloprotease para aperfeiçoar a produção do peptídeo recombinante.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a CNR controla atividade de protease intra e extracelular controlando a taxa de síntese de protease e a liberação em meio extracelular.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o precursor de proteína recombinante é insulina análoga.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o peptídeo recombinante é lispro, glargina ou carboxipeptidase.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a concentração extracelular de precursor de lispro pode ser aumentada em cerca de 10 vezes e a constante de degradação pode ser reduzida em cerca de 10 a 20 vezes.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a concentração extracelular de precursor de insulina pode ser aumentada em cerca de 1,5 vezes enquanto a constante de degradação pode ser reduzida em 1,4 vezes.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a concentração extracelular de precursor de glargina pode ser aumentada em cerca de aproximadamente 2,4 vezes enquanto a constante de degradação pode ser reduzida em 3 vezes.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a concentração extracelular de carboxipeptidase pode ser aumentada em cerca de 1,8 vezes enquanto a constante de degradação pode ser reduzida em aproximadamente 1,9 vezes.