HU220800B1 - Eljárás mikroorganizmusok vagy ezek intracelluláris anyagának kimutatására és/vagy mennyiségi meghatározására - Google Patents

Description

A találmány tárgyát eljárás képezi mikroorganizmusok és/vagy ezek intracelluláris anyagának kimutatására és meghatározására; a találmány tárgyához tartoznak továbbá ezen eljáráshoz alkalmazandó reagensek, valamint ezen reagenseket tartalmazó, fenti vizsgálati eljárás elvégzéséhez használatos készlet, és a találmány szerinti eljáráshoz használható berendezés.

Minden élő szervezet kémiai energiaforrásként adenozin-trifoszfátot (ATP) használ. Ismeretes, hogy ezen vegyület meghatározására az ATP által elindított luciferáz/luciferin reakciót alkalmazzák. Ezen enzimatikus reakció során fénykibocsátásra kerül sor, amit luminométer segítségével mérni lehet, a kibocsátott fény mennyisége arányos a jelenlévő ATP mennyiségével. Már az 1960-as évek közepe óta ismeretes, hogy eredményesen alkalmazható az ATP meghatározása a jelenlévő mikroorganizmusok számának jelzésére [lásd ATP Luminescence Rapid Methods in Mícrobiology (1989), szerkesztő Stanley és munkatársai: Blackwell Scientific Publications, London, 1-10. oldal]; e módszer előnye a gyorsaság és a nagyfokú érzékenység. Ezen vizsgálat segítségével egyszerű minták analízise perceken belül elvégezhető, bonyolultabb minták esetében a vizsgálat fél óráig tart. A meghatározás alsó határát 10~¹² mol/liter ATP-koncentráció képezi. Szükség van azonban egy még érzékenyebb módszerre is, amely a mikroorganizmusok kimutatására vagy meghatározására volna használható, ahol azonban a módszer megtartaná gyorsaságát és könnyű kivitelezhetőségét.

A találmány szerinti megoldásnál azt találtuk, hogy az ATP meghatározáson alapuló módszerek gyorsasága és érzékenysége lényegesen fokozható, ha a vizsgálatnál a meghatározás célpontjaként ATP helyett egy olyan enzimet választunk, amely adenilát-kinázt gerjeszt. Az adenilát-kináz olyan enzim, amelyet minden mikroorganizmus használ az adenozin-difoszfátnak (ADP), adenozin-trifoszfátnak (ATP) és az adenozinmonofoszfátnak (AMP) egymás közötti átalakításánál. Amennyiben a vizsgálati módszernél az ATP helyett ezen enzimet vesszük célba és a kimutatáshoz, továbbá a meghatározáshoz a találmány szerinti reagenst és készletet használjuk, úgy lehetőség nyílik arra, hogy az adenilát-kináz meghatározásánál egészen a 10^-20 mól tartományig lemenjünk.

Ismeretes, hogy a luciferáz/luciferin rendszerrel mód van az adenilát-kináz vizsgálatára [lásd Brolin és munkatársai: Journal of Biochemical and Biophysical Methods 1,163-169 (1979), továbbá Shutenko és munkatársai: Biotekhnologija, 4. szám, 542-547 (1988)] abból a célból, hogy ezen enzim aktivitását meghatározzák; e módszer segítségével bizonyos emlős szöveteket és növényi szöveteket vizsgáltak [lásd például Rodionova és munkatársai: Fiziologija Rastenii 25, 4, 731-734 (1978)]. Ezen vizsgálati módszernek a használata a mikroorganizmusok kimutatására azonban nem volt ismeretes és ezen enzim tanulmányozásával foglalkozó szakember számára nem volt nyilvánvaló, hogy a módszer fokozott érzékenysége milyen előnyöket jelent.

Annak ellenére, hogy az adenilát-kináz kisebb mennyiségekben van jelen, mint az ADP, ennek biológiai jelzőanyagként való alkalmazása mikroorganizmusok esetében a kimutatás érzékenységét mintegy 400 000-szeresére növeli, amennyiben az adenilát-kináz jelenlétét az általa létrehozott ATP segítségével határozzuk meg: ez azt jelenti, hogy 1 mól jelenlévő enzim hatására 400 000 mól ADP alakult át ATP-vé 10 perces inkubáció alatt. Ily módon az enzim meghatározásánál, amikor is a szubsztrátumot vagy az általa katalizált reakciótermékét mérjük, a kimutatás határa a ÍO^-20 mól tartományba csökkenthető le.

A találmány szerinti megoldásnál egy olyan javított módszert dolgoztunk ki, ahol az adenilát-kináz aktivitását a mikroorganizmusok jelzésére használjuk egy mikroorganizmus-befogási vizsgálat során, ahol is mihelyt a mikroorganizmusokat befogtuk és a többi reagenst eltávolítottuk, az így befogott mikroorganizmusok számát oly módon határozhatjuk meg, hogy ezek intracelluláris tartalmát az ADP számára hozzáférhetővé tesszük, majd mérjük a létrehozott ATP mennyiségét, elsősorban mérve a luciferin/luciferáz reakció során képződő fényt, minthogy ez egy gyors mérési módszert biztosít. Az ADP-nek adenilát-kinázzal végbemenő reakciójához a szükséges magnéziumionokat reagens formájában adják az elegyhez, vagy a magnéziumot a jelenlévő baktériumsejtek biztosítják, illetőleg az egyéb reagensekben szennyezésként van jelen. Ezen vizsgálati módszer alkalmazásával a kimutatható sejtek száma mintegy 10 ², megbízhatóbb statisztikus eredményeket kapunk ÍO-³ vagy ennél nagyobb sejtszám esetén, amikor is a lumimetriás mérés eredménye és a sejtszám közötti összefüggés lineárissá válik.

Fentiekből következik, hogy alkalmazhatunk olyan kolorimetriás módszereket, amelyek alkalmasak a vizsgálati mintában a jelenlévő ATP mennyiségének meghatározására, használhatunk például piruvát-kináz meghatározáson alapuló reakciókat; ezen kolorimetriás vizsgálati módszert az adenilát-kináz-módszerrel összekapcsolva kiváló kimutatási érzékenységet érhetünk el.

A mikroorganizmusokat bármilyen ismert befogási módszerrel befoghatjuk, így például erre a célra használhatunk specifikus antitesteket, amelyeket egy szilárd felszínen, mint például mikrotitrálásra szánt lemezen vagy latexgyöngyökön rögzítünk. Az immunológiai vizsgálathoz bármely egyéb megfelelő felület is figyelembe jöhet, amely a szakember számára rendelkezésre áll. Jelen megoldásnál különösen előnyös, ha az antitesteket egy mágneses gyöngyön kötjük meg (immobilizáljuk), amit követően bármely, az antitesthez kapcsolt mikroorganizmus befogható egy mágneses mezőbe, az ebben lévő adenilát-kináz aktivitása meghatározható, majd ennek eleresztésével újabb minta vizsgálatára kerülhet sor. Ezen módszer igen előnyös az állandó áramlásban lévő minták vizsgálatára, például amikor a minta egy folyamatosan áramló forrásból származik egy ciklonmintavevő esetében a levegőben lévő baktériumok számának meghatározásánál.

Az adenilát-kináz-vizsgálatot alkalmazva, különösen ha adenilát-kinázt és ATP reagenseket használunk, a vizsgálati mintában jelenlévő mikroorganizmusok számát folyamatos módszer segítségével meghatározhat2

HU 220 800 Bl juk, ahol is 200 μΐ térfogatú mintában már néhány 10 sejtet kimutathatunk; a sejtek száma és az ATP-ből származó fény közötti kvantitatív összefüggése alapján mód van arra, hogy mindössze 10 sejtet is kimutassunk vagy akár 10-nél kisebb számú sejt jelenlétét észleljük, amennyiben a reakció térfogatát csökkentjük.

A találmány szerinti megoldás egyik aspektusa szerint olyan módszert dolgoztunk ki, amelynek segítségével kimutatható a mikroorganizmusok és/vagy ezek intracelluláris anyagának jelenléte vagy meghatározható ezek mennyisége a vizsgált mintában; a műveletet oly módon végezzük hogy:

a) a vizsgálati mintát szilárd szubsztrátumon immobilizált specifikus megkötőanyag hatásának tesszük ki, ahol a specifikus megkötőanyag képes a mikroorganizmushoz vagy ennek intracelluláris anyagához kapcsolódni és ily módon azt a szilárd anyaghoz kötni;

b) a szilárd szubsztrátumot olyan szerrel hozzuk érintkezésbe, amely képes az a mikroorganizmusban és/vagy ennek intracelluláris anyagában lévő adenilátkinázt a szubsztrátum kezeléséhez alkalmazott oldat számára hozzáférhetővé tenni;

c) a szubsztrátumot adenozin-difoszfát (ADP) tartalmú oldattal kezeljük;

d) meghatározzuk a keletkezett adenozin-trifoszfát (ATP) mennyiségét és ennek alapján megállapítjuk a jelenlévő mikroorganizmus vagy intracelluláris anyag mennyiségét.

A d) lépést bármely, az ATP meghatározására alkalmas módszer segítségével elvégezhetjük. Előnyösen oly módon járunk el, hogy színképző reakciót végzünk, még előnyösebben a széles körben alkalmazott luciferin/luciferáz lumineszcencia reagenst használjuk és meghatározzuk az ATP-nek ADP-vé való átalakulását a szakember számára jól ismert módon. Az ATP mennyiségének a mikroorganizmusokhoz és/vagy az intracelluláris anyag tartalmához viszonyított aránya könnyen meghatározható olyan kalibrációs görbék segítségével, amely kalibrációs görbéket ismert mennyiségű megcélzott mikroorganizmus vagy ennek intracelluláris anyagával veszszük fel, majd az ismeretlen mennyiségű mikroorganizmust ezen görbékhez viszonyítjuk. Előnyösen olyan kalibrációs görbét készítünk, amelyen feltüntetjük a kibocsátott fénynek a mikroorganizmusok számához való viszonyát, majd egy ismeretlen számú mikroorganizmust tartalmazó minta esetében az időegység alatt észlelt fénykibocsátást ennek alapján értékeljük.

Annak érdekében, hogy az átalakított ATP mennyiségét maximális értékre növeljük és így a szilárd szubsztrátumhoz kapcsolódó adenilát-kináz mennyiségét felerősítsük, az ADP-nek ATP-vé való átalakulását célszerűen magnéziumionok jelenlétében végezzük, ahol is az ionok moláris koncentrációja elegendő ahhoz, hogy az ADP-nek ATP-vé való átalakítását maximálissá tegye. A művelethez szükséges magnézium mennyisége előnyösen olyan, hogy 1 mól ADP-re számítva megközelítőleg 1 mól magnézium legyen jelen, ily módon minden ADP-molekula legalább 1 magnéziumionnal kapcsolódhat. A reakció az alábbiak szerint megy végbe: ADP+Mg²⁺. ADP <+> Mg²⁺. ATP+AMP, az

1:1 mólarány pontos betartása nem okvetlenül szükséges, de hasznos iránymutatás.

A találmány egyik előnyös megoldása szerint a vizsgálati mintát vizes szuszpenzió vagy oldat formájában állítjuk elő, a vizsgálat tárgyát képező mikroorganizmusok vagy intracelluláris anyagok a mintában vannak megkötve, az ezekhez kapcsolódó adenilát-kináz meghatározását oly módon végezzük, hogy a mintához ADP-t és magnéziumionokat adunk olyan körülmények között, hogy a jelenlévő összes adenilát-kináz az ADP-t ATP-vé alakítsa át, amikor is a mintát egy előre meghatározott időtartamig inkubáljuk, az átalakítás biztosítására luciferáz/luciferin tartalmú szert adunk a mintához, a mintából kisugárzott fényt meghatározva ebből a jelenlévő adenilát-kináz mennyiségére következtetünk.

A befogási lépést előnyösen immobilizált antitestek segítségével végezzük el, e lépéshez olyan antitesteket használunk, amelyek specifikusak egy adott mikroorganizmus fajtára vagy osztályra nézve, vagy használhatunk bizonyos anyagokra specifikus szereket, amelyek a különféle mikroorganizmusok sejtfalán kötődnek, mint például a lecitin. A befogáshoz alkalmas szerként előnyösen antitestek szerepelnek, ezeket a szilárd szubsztrátumhoz kötjük szokásos megkötési módszerek segítségével, így például kovalens kapcsolást vagy sztreptavidin/biotin megkötést végzünk. így például egy specifikus antitestet biotinilezésnek alávetve az antitestet oly módon alakítjuk át, hogy az a sztreptavidinnel bevont felszínre kötődjön.

Egy előnyös megoldás szerint mágneses szilárd anyagot, így például mágneses gyöngyöket alkalmazunk, amelyek például a Dynal UK Ltd. Station House, Grove Street 26, New Ferry, Wirral, Merseyside cégtől szerezhetők be. A specifikus antitesteknek ezen gyöngyökhöz való kötési módszere a szakember számára a szakirodalomból jól ismert.

Ezen gyöngyök alkalmazásával a vizsgálat tárgyát képező mikroorganizmusokat a gyönggyel immobilizált antitestekhez köthetjük egy oldatban, egy csövet ebbe lebocsátunk mint a folyamatos mintavevő készülék használata esetén, majd a kivett mintákat egy vizsgálati helyen összegyűjtjük, ezeket mágneses térrel kezeljük, az adenilát-kinázt hozzáférhetővé tesszük, miközben az ADP és ATP meghatározására szükséges reagenseket beadagoljuk. Előnyösen ADP-magnéziumot és luciferáz/luciferin reagenst adunk a mintákhoz, miközben a gyöngyök immobilizálva vannak, majd mérjük a kibocsátott fényt egy fénydetektor segítségével; erre a feladatra előnyösen a minták mellett elhelyezett luminométer használható. A luciferáz/luciferin reagenst ADP-vel és magnéziummal egyidejűleg vagy ezeket követően adjuk a mintákhoz.

A találmány szerinti megoldást végezhetjük egyetlen lombikban mágneses gyöngyöket adva az edényhez, ahol az antitestek a gyöngyökön immobilizálva vannak; a vizsgálandó mintát oldat vagy szuszpenzió formájában keverés közben adagoljuk be, a gyöngyökön befogott mikroorganizmusokat és/vagy intercelluláris anyagot mágneses teret létesítve immobilizáljuk, ezután a maradék oldatot vagy szuszpenziót eltávolít3

HU 220 800 Bl juk; a gyöngyökhöz ADP-szubsztrátumot és extrakciós oldatot vagy oldatokat adunk, ily módon az adenilátkinázt az ADP-oldat számára hozzáférhetővé tesszük, ezután a mágneses teret megszüntetjük, a gyöngyöket a szubsztrátumoldatban keverjük, a mágneses tér újralétesítésével a gyöngyöket immobilizáljuk; ezután az ADP-tartalmú oldatot, az extrakcióhoz használt szert és a képződött ATP-t eltávolítjuk és az ATP-tartalmat meghatározzuk. Az ATP meghatározást végezhetjük kolorimetriás módszerrel vagy még előnyösebben luminometriával.

Egy további előnyös megoldás szerint a megkötés céljára egy oszlopot használunk, amelyben egy megkötőszer, mint például antitest van, ami egy szilárd szubsztrátumon, mint például gyöngyön van immobilizálva, majd a mintát és a különböző reagenseket egymást követően az oszlopon átengedjük, így ATP-t szintetizálunk, majd ennek a megkötött antitesttel arányos mennyiségét meghatározzuk.

Minden esetben olyan mennyiségű ADP-vel elegyítjük a mintát, amely előnyösen elegendő ahhoz, hogy az ADP-koncentrációja az elegyben legalább 0,005 mmol vagy ennél több legyen, előnyösen ez az érték több mint 0,01 mmol, még előnyösebben ez az érték több mint 0,08 mmol. Különösen előnyös, ha a konverziós lépésben az elegyben az ADP-mennyiség mintegy 0,1 mmol. Ez függ az ADP tisztaságától is: nagyobb mennyiségű ATP-szennyezés esetében nem célszerű magas koncentrációkat képezni. Az az ADP-koncentrációtartomány tekinthető különösen előnyösnek, amely mintegy 10 mmol és mintegy 0,1 pmol között van. Az előnyös ADP-koncentráció beállításánál célszerű, ha az ADP-nek ATP-vé való konverziója alkalmával a szuszpenzió vagy oldat magnéziumkoncentrációja 1 mmol vagy ennél több, előnyösen 5 mmol vagy e fölötti érték, még előnyösebben 10 mmol vagy e fölötti érték. A magnéziumionokat magnéziumsók formájában visszük be az oldatba, előnyösen magnézium-acetátot használunk. A Mg²⁺ koncentráció tartománya előnyösen mintegy 0,1 mmol és mintegy 25 mmol között van. Az Mg²⁺ jelenlévő mennyisége függ egyebek között az ADP-koncentrációtól és a jelenlévő kelátképzőszer mennyiségétől (így például EDTA-tói).

A találmány egy előnyös megoldása szerint a luciferin/luciferáz luminometriás reagenst az inkubációs időszak kezdete előtt adjuk a mintához, előnyösen egyetlen reagens formájában az ADP és magnéziumion-forrás beadásával egyidejűleg. E művelethez nagy tisztaságú luciferáz reagenst használunk, ahol a reagens előállítása során az adenilát-kináz teljes mértékben el lett távolítva. A találmány ezen megoldása szerint az összes reagenst az ADP-nek ATP-vé való átalakítása előtt adjuk az elegyhez és/vagy a luminometriás számlálást a luciferin/luciferáz hozzáadását követően is folytatjuk, ahol e reagens hozzáadása egy külön lépésben történik, vagy a magnéziumot a luciferin/luciferáz reagenssel egyidejűleg is beadhatjuk. Tekintettel azonban arra, hogy a magnéziumionokat a luciferáz és EDTA megköti, szükséges, hogy a magnézium szükséges mennyiségét a vizsgálat előtt kísérleti úton vagy számítással határozzuk meg. A szakember számára világos, hogy egy adott ADP-tartalmú minta és luciferin/luciferáz elegy esetében a magnéziumsó optimális mennyiségét rutinkísérlettel határozzuk meg ismert mennyiségű baktériumot, így például E. colit tartalmazó minta segítségével, ahol maximális jeleket kapunk.

A magnéziumionok az ADP instabilitását okozhatják (azon értelemben, hogy a szennyezésként jelenlévő adenilát-kináz idő előtti ATP-vé való átalakulását indítja el). Ezért célszerű a magnéziumionokat a felhasználás előtt nem a többi komponenssel együtt oldatban tartani, hanem előnyös a komponenseket közvetlenül a felhasználás előtt elegyíteni, vagy az ADP konverziólépésében hozzáadni. Minthogy a magnéziumionokra szükség van az adenilát-kináz aktivitásának biztosítására, célszerű e komponenseket a mintával az ADP hozzáadását megelőzően elegyíteni. Abban az esetben, ha a reagenseket együttesen tároljuk, úgy célszerű ezeket fagyasztva szárítva tárolni, így mindennemű destabilizáló hatás elkerülhető.

Mint a fentiekben említettük az adenozin-trifoszfátot (ATP) előnyösen úgy mutathatjuk ki, hogy luciferin/luciferáz rendszert használunk, amikor is fotometriásan jól észlelhető jelet kapunk, ahol a kapott jel a mintában lévő ATP mennyiségével arányos. A luciferin/luciferáz készítmények és ezek alkalmazása az ATP meghatározásánál a szakember számára jól ismert, ezen reagensek a kereskedelemben beszerezhetők (lásd például Brolin és munkatársai fentiekben említett közleményét). Egy szokásos készítmény például 0,1-10 mg/1 luciferázt, 15-1000 pmol/l, előnyösen 15-100 pmol/l (így például mintegy 36 pmol/l) D-luciferint, továbbá olyan komponenseket, mint MgCl₂-t (2,5-25 mmol), EDTA-t, BSA-t tartalmaz, az oldat pH-ja 7, ami pufferrel van beállítva (lásd például a 054676 számú európai szabadalmi leírást), a pH célszerűen 7,8.

Amennyiben az adenilát-kináz vizsgálati módszerhez egyetlen reagenst használunk a fentiekben leírtak szerint, célszerű, ha a pH-t a két enzim szempontjából optimális értékre állítjuk, vagyis egy kompromisszumos értéket állítunk be annak érdekében, hogy a számlálást folyamatosan végezhessük, miközben az ADPnek ATP-vé való konverziója folyik. Ezt rutinkísérlettel határozhatjuk meg ismert számú baktériumot tartalmazó mintát használva.

A mintát, ADP-t és a magnéziumion-forrást bármely olyan pufferral elegyíthetjük, amely az adenilátkináz reakcióhoz szükséges pH-t biztosítja, nincs szükség reagensekre. így bármely puffer használható, amely képes 5,5 és 8,5 közé a pH-t beállítani, az optimális pH 6 és 7 között van, előnyösen ez az érték 6,5. A megfelelő pufferek közül példaként említjük meg a trisz- és a foszfátpuffereket. Legelőnyösebb a minta elkészítéséhez és/vagy hígításához azt a puffért használni, amelyet a vizsgálati módszer végzésénél is alkalmazunk.

Mint minden folerősítő vizsgálat esetében a találmány szerinti adenilát-kináz-vizsgálat érzékenysége az alkalmazott reagensek tisztaságától függ. Jelen esetben a legszámottevőbb szennyezést az ATP képezi az ADPszubsztrátumban, valamint az adenilát-kináz a luciferáz

HU 220 800 Β1 készítményben. Minthogy mikroorganizmusok vonatkozásában érzékeny vizsgálati módszert kívánunk nyújtani, különösen az esetben, ahol káros hatású mikroorganizmusokról van szó és alacsony számban kívánjuk ezeket kimutatni, szükséges, hogy minden egyes reagens a lehető legtisztább legyen figyelembe véve elsősorban azt az anyagot, amivel a vizsgálat során a mintát reagáltatni fogjuk.

Előnyösen Econopaq Q erős anioncserélő géltöltetet (BioRad) használunk, amit 20 mmol/1 koncentrációjú kálium-foszfát-oldattal (pH: 4,6) egyensúlyozunk ki és eluálunk, ahol a kálium-foszfát koncentrációja egészen 400 mmol-ig mehet. Azt találtuk, hogy az ADP mint koherens csúcs eluálódik, majd ezt követi az ATP eluálódása. Ily módon olyan ADP-t kapunk, ahol az ATP mol% felső határa 2 χ 10⁸. Ismereteink szerint az irodalomból ismert legtisztább ADP 0,001%-os (lásd Shutenko és munkatársai közleményét fentiek szerint) a találmány szerinti megoldásnál viszont olyan ADP-t alkalmazunk, amely 0,001 mol% ATP-nél kisebb mennyiséget tartalmaz, előnyösen ez az érték 2 χ 10^-8 mol% vagy ez alatti érték.

Egy további problémát képez az adenilát-kináz, ami lényegében egy mindenütt jelenlévő enzim, gyakorlatilag minden mikroorganizmusban megtalálható és általában a luciferáz készítményekben is előfordul. Lehet, hogy az adenilát-kináz csak kis mértékű szennyezést képez, de minthogy a találmány szerinti megoldásnál igen csekély adenilát-kináz-szintet kívánunk a mintákban kimutatni, ezen enzimnek a luciferáz készítményben való jelenléte egy korlátozó faktort képez.

A luciferáz és adenilát-kináz móltömege lényegesen eltér egymástól, az egyik 61 kD, a másik 21 kD. A luciferáz ezenkívül membránhoz kötődő protein, így viszonylag hidrofób, ezzel szemben az adenilát-kináz oldható enzimként fordul elő. így mód van arra, hogy a luciferáz készítményekből az adenilát-kinázt eltávolítsuk, például méretkizáró kromatográfia, reverz fázisú kromatográfia vagy mindkettő segítségével. Másik lehetőségként vagy az előbbi megoldásokkal kombinálva a luciferáz készítmény adenilát-kináz szennyeződésének problémáját oly módon küszöbölhetjük ki, hogy a biolumineszcenciás reagenst (luciferáz és luciferin) közvetlenül a meghatározás előtt vagy annak során adjuk a vizsgálandó mintához, így az esetleg jelenlévő szennyező adenilát-kináznak nincs arra ideje, hogy számottevő hatást idézzen elő.

A luciferáz tisztítására alkalmas módszerként végezhetünk oszlopkromatográfiás frakcionálási, amihez alacsony porozitású gélt, így például Sephadex G-25-öt használhatunk [lásd Nielsen és Rasmussen, Acta Chemica Scandinavica 22, 1757-1762 (1968)]; alkalmazhatók a Sephadex és Sepharose oszlopok (például Blue Sepharose) egymás után kötve, végezhető SDS elektroforézis [lásd Devine és munkatársai: Biochimica et Biophysica Acta 1172,121-132. oldal (1993)], vagy bizonyos ideig szobahőmérsékletnél magasabb hőmérsékleten tartjuk a vizsgálati anyagot.

Adenilát-kináztól mentes BSA-t, ami a kereskedelemben beszerezhető luciferáz/luciferin készítmény egy komponense, a Sigma és BDH cégtől szerezhetünk be, ez a készítmény kémiailag kezelt acetilezett BSA. A szakember számára nyilvánvaló, hogy egyéb, kémiailag kezelt BSA reagens is alkalmazható.

Annak érdekében, hogy a vizsgálat tárgyát képező mikroorganizmushoz kapcsolódó összes adenilátkinázt az ADP, magnéziumionok és luciferin/luciferáz tartalmú találmány szerinti vizsgálati reagensek számára hozzáférhetővé tegyük, szükséges, hogy a mikroorganizmusokat olyan mértékben felszakítsuk, hogy a sejten belüli anyag felszabaduljon, vagy más módon váljon a reagens számára hozzáférhetővé. Ezen felszakítást végezhetjük mechanikus úton, így például ultrahang-generátort alkalmazunk, vagy ozmotikus sokkot fejtünk ki, előnyösen egyidejűleg hideg sokkot is végzünk vagy olyan szereket használunk, mint lizozim vagy még egyszerűbben, például felületaktív anyagokat használunk. Ezen felületaktív anyagok a kereskedelemben beszerezhetők, ezekre általában mint extraktánsokra hivatkozunk. Általában extraktánsként szerepelhet valamely kationos detergens, mint például a CTAB (cetil-trimetil-ammónium-bromid) vagy a védett megnevezésű enzimatikus hatású ATP-t felszabadító szer, a Biotrace XM extraktáns (előállító: Biotrace Bridgend UK), a Celsis UK kationos extraktáns, valamint a Lumac NRM (nukleotidot felszabadító szer, előállító: Lumac BV, Hollandia) nevű szer. Abban az esetben, ha CTAB-t alkalmazunk, egy megfelelő készítmény 0,01-1 tömeg% CTAB-t tartalmaz vizes oldatban, így például 0,2 tömeg%-ot, de más koncentrációértékek is jól ismertek a szakember számára.

így mielőtt ADP-t és luciferáz/luciferin reagenst adnánk ahhoz a mintához, amelynél mikroorganizmus jelenlétére gyanakszunk, célszerűen a mikroorganizmust felszakítjuk annak érdekében, hogy a luminometriás reagensek a sejten belüli anyaghoz hozzá tudjanak férni, ebből a célból mikroorganizmus sejteket felszakító szert használunk. Abban az esetben, ha különbséget akarunk tenni a kimutatandó sejtek és az egyéb sejtek között, mint például a gombaspórák között, eljárhatunk úgy is, hogy két egymástól független vizsgálatot végzünk, az egyik esetben a mintát olyan nemionos detergenssel kezeljük, amely csak a spórákat és a többsejtű szomatikus állati sejteket szakítja fel (így például mint a Triton-X-100, előállító: Sigma cég), a másik vizsgálathoz kationos felületaktív anyagot, úgynevezett extraktánst használunk, amely képes az összes sejt felszakítására. Lehetőség van arra is, hogy ezen vizsgálatokat ugyanazon a mintán végezzük el, amennyiben egy ATP-ázt, mint apirázt, majd ezt követően egy proteázt adunk a vizsgálati mintához a detergens/luciferáz/mérés ciklusok között; az egyik ciklusban nemionos, a másik ciklusban kationos felületaktív anyagot használunk a ciklus első lépésében.

Az extraktánsnak a luciferáz/luciferin rendszerre kifejtett hatása ismert módon igen jelentős [lásd például Simpson és munkatársai: J. Biolumin Chemilumin 6(2) 97-106. oldal (1991)], ismeretes, hogy a kationos felületaktív anyagok potencírozzák a reakciót, de ugyanakkor a luciferázt fokozatosan inaktiválják, ismert az is, ί

HU 220 800 Bl hogy az anionos felületaktív anyagok inhibitálják a reakciót, ezzel szemben a nemionos és az ikerionos felületaktív anyagok széles tartományban potencírozó hatást fejtenek ki. 0,15 tömeg%-os kationos felületaktív anyagnak 0,25 tömeg% tercier-diamin típusú felületaktív anyaggal készített elegye (előállító: Celsis, Cambridge, UK) megfelel a találmány szerinti megoldás céljaira, de a szakember számára nem fog nehézséget jelenteni, hogy olyan egyéb extraktánsokat válasszon, amelyek az adenilát-kináz és luciferáz optimális hatását biztosítják, amikor egy oldatban egyidejűleg vannak jelen. Általában a felületaktív anyag koncentrációja mintegy 0,05 és 1,0 tömeg% között lehet.

A lényeges lépések befejezése után a leadott fényt (vagyis amikor az ADP-nek ATP-vé való átalakulása megtörténik és ezt követően a luciferáz a luciferinre kifejti hatását) oly módon mérhetjük meg, hogy a vizsgálati mintát egy luminométer mérőedényébe visszük, fénydetektorral mérjük a kisugárzó fényt közvetlenül a luciferáz/luciferin reagens vagy egyéb szerek hozzáadása után vagy azzal egyidejűleg.

A találmány egy második aspektusát képezi az a vizsgálati készlet, amely tartalmazza a találmány szerinti vizsgálati módszerhez szükséges összes lényeges reagenseket, így például az immobilizált befogószert, adenozin-difoszfátot és célszerűen magnéziumion-forrást, továbbá előnyösen luciferázt és luciferint. Előnyösen a vizsgálati készlet tartalmazza mindezen reagenseket; a luciferázt és luciferint reagens oldat formájában, a felületaktív reagenssel együtt, ahol ez utóbbi a vizsgálandó mikroorganizmus sejtjének felszakítására szolgál. Általában a mikroorganizmusok vizsgálatához elegendő a kationos felületaktív anyagok alkalmazása, ezzel szemben a gombás spórák és a szomatikus sejtek vizsgálatára célszerűen egy további nemionos felületaktív reagenst is használhatunk ezen sejtek számának meghatározására. A vizsgálati készlet előnyösen tartalmaz egy útmutatást is arra vonatkozóan, hogyan kell a találmány szerinti vizsgálatot elvégezni, a reagensek tartóedényben vannak elhelyezve, koncentrációjuk olyan, hogy a reagenseket közvetlenül vagy hígítást követően használhatjuk fel.

A találmány szerinti vizsgálati készlet előnyös kivitelezése szerint a készlet immobilizált (rögzített) antitesteket tartalmaz szabadon mozgó gyöngyök formájában, ezenkívül tartalmazhat gyöngyökkel töltött oszlopot vagy bevont mikrotiter lapot. Tartalmaz továbbá ADP reagenst, amelynek tisztasága 99,999%-nál nagyobb, továbbá luciferáz/luciferin reagenst, valamint olyan BSA-t, amely lényegében adenilát-kináz-hatástól mentes. Ezen túlmenően a luciferáz/luciferin arány (mint az a készletben lévő instrukciókból kitűnik) és ezek koncentrációja olyan, hogy a luciferáz képes legyen a luciferin szubsztrátumon hatását gyorsan kifejteni, így a luciferázhoz kötődő adenilát-kináz csak az első emiszszió befejeződését követően hoz létre ATP-t, így a mikroorganizmusokból származó adenilát-kinázt egy erős fényfelvillanással járó kinetikai reakció jelzi, ezzel szemben a szennyezésként jelenlévő ATP-re csak parázsló fény utal.

A találmány tárgyához tartozik a találmány szerinti vizsgálati módszer véghezvitelére szolgáló berendezés is, amely egy reakciós kamrából áll, amelyben a rögzített befogószer reagál a vizsgálati mintával, a reakciós kamrán egy bevezető és kivezető nyílás van a reagensek egymást követő beadagolására, így a megkötés elvégzésére, az extraktáns és ADP hozzáadást lépések elvégzésére, ezenkívül egy luciferáz/luciferin forrásként szolgáló reagenssel egy luminométer cellával van összekapcsolva úgy, hogy fenti lépések befejezése után a keletkezett ATP-t közvetlenül mérni lehessen az emittált fényt alapján. A találmány szerinti berendezésben a reakciós kamra előnyösen következő részekből áll:

a) egy reakció végbevitelére alkalmas edényből, amely elektromosan működtetett mágnes hatásterében van, ahol az edényben felfüggesztett mágneses gyöngyök a folyékony reakcióelegyben immobilizálhatók, miáltal a reagensek cserélhetők, így például egy szivattyú segítségével; vagy

b) reaktoroszlopból, amely ismert befogószert tartalmaz hordozóanyagon, így például befogószerrel bevont latexgyöngyöket.

A találmány szerinti eljárást, berendezést, reagenseket és vizsgálati készletet az alábbi példák és ábrák szemléltetik, a korlátozás szándéka nélkül. A szakember számára ezek alapján további megoldások is elvégezhetővé válnak.

Ábrák leírása

Az 1. ábra a találmány szerinti vizsgálati módszer kivitelezéséhez alkalmas berendezés diagramját tünteti fel, amely egy automatikus áramló rendszert mutat be, ahol a befogószer mágneses gyöngyökön van rögzítve, és ahol a gyöngyök a kívánság szerint bekapcsolható mágneses tér segítségével elkülöníthetők.

A 2. ábra a találmány szerinti vizsgálati módszer kivitelezésére alkalmas berendezés diagramját szemlélteti, amely egy automatikus áramló rendszert mutat be, ahol a befogószer rögzítése egy reaktoroszlopon történik.

A 3. ábra az igen kis számú E. coli sejtek vizsgálatára használt adenilát-kináz-módszer grafikus szemléltetésére szolgál.

A 4. ábra az E. coli sejtek specifikus vizsgálatát szemlélteti oszlopdiagram segítségével, ahol a befogásra mágneses gyöngyöket és a kimutatáshoz adenilát-kinázt használunk.

1. példa

Az E. coli sejtek kimutatása az 1. ábra szerinti berendezés alkalmazásával

E. coli sejteket tartalmazó folyékony mintát vezetünk egy 1 mintaforrásból egy 2 ötelágazású szelepen és 3 perisztaltikus csövön keresztül egy 4 reverzibilis szivattyú segítségével egy 5 reakciós kamrába, amely kamra E. colira specifikus antitesteket tartalmaz Dynal-féle mágneses gyöngyökön, szokásos kovalens kapcsolási módszerrel rögzítve. A gyöngyöket és a mintát a befogáshoz szükséges ideig keveqük, így például 1-30 per6

HU 220 800 Bl cig, a művelethez 6 keverőt használunk, egy 7 mágnes bekapcsolásával a gyöngyöket immobilizáljuk, majd a folyékony mintát 4 reverzibilis szivattyú és 2 szelep segítségével a 8 elöntésre szánt hulladékhoz vezetjük. A gyöngyöket 9 tartályból származó mosópufferral átmossuk, a 7 mágnest kikapcsoljuk, a 6 keverőt megindítjuk, a 7 mágnest bekapcsoljuk, majd a mosópuffert elöntjük.

ADP-szubsztrátumot (amelynek tisztasága az ATP vonatkozásában 99,999%-nál nagyobb), magnéziumacetátot és extraktáns reagenst (0,15% kationos felületaktív anyagot és 0,25% tercier-diamint tartalmazó reagens a végtérfogatra számítva) a reakciós edénybe adunk egy 10 tartályból (forrásból) elegendő mennyiségben ahhoz, hogy a reakciós kamrában 0,1 mmol ADP és 10 mmol/liter magnéziumion koncentráció alakuljon ki, a mágnest kikapcsoljuk, a keverőt megindítjuk, hagyjuk, hogy az extrakció/ADP konverzió mintegy 1-5 perces időtartam alatt végbemenjen, ezután a keverőt leállítjuk, a mágnest bekapcsoljuk, majd a folyadékot 11 luminométerhez tartozó átfolyócellába vezetjük, ehhez a művelethez 3 perisztaltikus csövet és 4, valamint 12 reverzibilis szivattyúkat használjuk, miközben egyidejűleg a vizsgálati folyadékhoz csökkent adenilát-kináz-tartalmú, hatásos térfogatú luciferáz/luciferin reagenst elegyítünk, ahol a reagenst 13 tartályból szivattyúzzuk be. Abban az esetben, ha adenilát-kinázzal módosított Celsis LDR reagenst használunk, amelyben egyébként a szükséges komponensek standard mennyisége van jelen, a reagens térfogatát úgy választjuk meg, hogy az a vizsgálati minta térfogatának felét tegye ki. A cellából emittált fény arányos a befogott E. coli sejtek számával, a meghatározáshoz standard görbéket használunk, amelyeket ismert számú sejtet tartalmazó vizsgálati mintákkal veszünk fel.

A reakciós edényben (kamrában) lévő mágneses gyöngyök regenerálását oly módon végezzük, hogy az elhasznált gyöngyöket az elöntésre szánt folyadékhoz vezetjük és egy 14 tartályból újabb gyöngyöket vezetünk be; vagy pedig olyan reagenst vagy oldatot vezetünk a gyöngyökhöz, amelynek segítségével a gyöngyökről a rátapadt mintarészek eltávolíthatók és a gyöngyök regenerálhatok; így például, ha a gyöngyöket antitestektől kívánjuk megszabadítani, úgy mintegy 0,1 mol/liter koncentrációjú sósavoldatot használunk.

2. példa

E. coli meghatározása 2. ábra szerinti berendezés alkalmazásával

A vizsgálatot az 1. példában leírtak szerint végezzük, azzal az eltéréssel, hogy az 5 tartályt, 6 mágnest és 7 keverőt egy luminométer átfolyócellájával összekötött reaktoroszloppal helyettesítjük, az oszlopot a fentiekben említett tartályokból származó reagensekkel töltjük meg. A berendezésben két 2 kétirányú szelepet használunk az 1. példánál alkalmazott öt irányban záró egyetlen szelep helyett; a 2. ábrán szereplő berendezéshez használt szivattyúk nem reverzibilisek. A minta forrását közvetlenül egy hidrociklon képezi, amilyet a WO 95/25811 számú nagy-britanniai szabadalmi bejelentés ismertet.

Meg kívánjuk jegyezni, hogy az 1. példában alkalmazott öt irányban nyíló szelep is alkalmazható a 2. példa szerinti reaktoroszlop beiktatásával végzett módszernél; hasonlóképpen a három darab, egymás után között két irányba nyíló szelep szintén használható a 2. példa szerinti megoldásnál; hasonlóképpen a vizsgálat egyes lépései a mágnes kézi működtetésével is elvégezhetők, hasonlóképpen a reagensek kézi adagolása is megvalósítható.

Claims (26)

1. Eljárás mikroorganizmusok és/vagy ezek intracelluláris anyagának kimutatására és/vagy mennyiségének meghatározására mintában, amely eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza:

a) a mintát olyan reagenssel érintkeztetjük, amely képes a mikroorganizmusban vagy annak intracelluláris anyagában lévő adenilát-kinázt hozzáférhetővé tenni a szubsztrátum kezeléséhez alkalmazott oldat számára;

b) a mintát adenozin-difoszfátot (ADP-t) tartalmazó oldattal kezeljük;

c) meghatározzuk a keletkezett adenozin-trifoszfát (ATP) mennyiségét, és ezt arányba állítjuk mikroorganizmus vagy intracelluláris anyag jelenlétével és/vagy mennyiségével;

azzal jellemezve, hogy előkészítő lépést hajtunk végre, amely során a mintát érintkeztetjük szilárd szubsztrátumra immobilizált befogószerrel, amely befogószer képes a mikroorganizmust vagy annak intracelluláris anyagát megkötni, miáltal azt a szilárd szubsztrátumhoz kapcsoljuk, és az a) lépésben a reagenst a szubsztrátumhoz adjuk, és a b) lépésben az ADP-oldatot a szubsztrátumhoz adjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépés szerinti meghatározást színreakció segítségével végezzük.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépés szerinti meghatározást luciferáz/luciferin reagenssel végezzük, ahol az emittált fény arányos a képződő ATP mennyiségével, és ahol az emittált fény mérésére luminométert alkalmazunk.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben magnéziumionokat adunk a reakcióhoz.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) és b) lépésekben a mintához extraktánst, ADP-t és magnéziumionokat adunk és az elegyet inkubáljuk.

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előkészítő lépésben befogószerként mikroorganizmusok nemzetségére, fajára vagy osztályára specifikus immobilizált antitesteket, vagy különféle típusú mikroorganizmusok sejtfalán lévő sajátos anyagokra specifikus kötóreagenst alkalmazunk.

7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy befogószerként szilárd szubsztrátumhoz kovalens kötéssel vagy sztreptavidin/biotin kölcsönhatással kapcsolódó antitestet használunk.

HU 220 800 Bl

8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mágneses térben rögzíthető szilárd szubsztrátumot alkalmazunk.

9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az előkészítő lépést úgy végezzük, hogy antitesteket immobilizálva hordozó mágneses gyöngyöket egy edénybe helyezünk, a vizsgálati mintát oldat vagy szuszpenzió formájában keverés közben a gyöngyökhöz adjuk; a mikroorganizmusokat és/vagy anyagaikat befogott gyöngyöket mágneses térben immobilizáljuk; a felesleges oldatot vagy szuszpenziót eltávolítjuk; ADP-szubsztrátot és extrahálószer-oldatot, vagy az adenilát-kinázt ADP-oldat számára hozzáférhetővé tévő oldatokat adunk a gyöngyökhöz; a mágneses teret megszüntetjük és a gyöngyöket a szubsztrátoldatban kevertetjük; a gyöngyöket a mágneses tér újbóli bekapcsolásával immobilizáljuk; az ADP-t, extrahálószert és képződött ATP-t tartalmazó oldatot eltávolítjuk és ennek ATP-tartalmát meghatározzuk.

10. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a befogószert egy oszlopra visszük fel.

11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a befogószert az oszlopban lévő gyöngyökre visszük fel.

12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizsgálati mintát és a vizsgálathoz alkalmazott reagenseket az oszlopon egymást követően átengedjük, a keletkezett kimenő ATP mennyiségét meghatározzuk, és azt arányba állítjuk a befogószer által célba vett anyag jelenlétével.

13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a megkötött minta kezelésére nagyobb mint 0,005 mM végkoncentrációjú ADP-t alkalmazunk.

14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mintegy 0,1 mmol/liter végkoncentrációjú ADP-t alkalmazunk.

15. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a megkötött minta kezelésére legalább 1 mmol/liter koncentrációjú magnéziumiont alkalmazunk.

16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább 10 mmol/liter koncentrációjú magnéziumiont alkalmazunk.

17. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépést kationos detergenst tartalmazó reagens hozzáadásával hajtjuk végre.

18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kationos detergensként tercier-diamin-tartalmú reagenst alkalmazunk.

19. Vizsgálati készlet 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás végrehajtására, amely mikroorganizmust vagy intracelluláris anyagát megkötni képes immobilizált befogószert és adenozin-difoszfát-reagenst tartalmaz.

20. A19. igénypont szerinti vizsgálati készlet, amely magnéziumion-forrást és/vagy luciferázt és luciferint is tartalmaz.

21. A 20. igénypont szerinti vizsgálati készlet, amely különálló gyöngyök, gyöngyökkel töltött oszlop vagy mikrotiter lemez formájában szilárd szubsztrátumon immobilizált antitestet; 99,999%-nál nagyobb tisztaságú ADP-reagenst; továbbá lényegében adenilát-kináz-aktivitástól mentes BSA-t tartalmazó luciferáz/luciferin reagenst tartalmaz.

22. A 19-21. igénypontok bármelyike szerinti vizsgálati készlet, amelyben a befogószer mikroorganizmusok nemzetségére, fajára vagy osztályára specifikus antitest, vagy különféle típusú mikroorganizmusok sejtfalán lévő sajátos anyagokra specifikus reagens.

23. A 3-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás kivitelezésére szolgáló berendezés, azzal jellemezve, hogy immobilizált befogószer és vizsgálati minta reagáltatására szolgáló reakciókamrát (5); a reakciókamrát (5) az előkészítő lépéshez, majd az a) és b) lépéshez szükséges reagensekkel egymást követő módon ellátó eszközt; a reakciókamrához (5) kapcsolódó luminométer átfolyócellát (11); és ahhoz kapcsolódó luciferáz/luciferin forrást (13) tartalmaz, ahol a b) lépés elvégzése nyomán keletkezett ATP-t közvetlenül meghatározzuk a kisugárzott fény mennyisége alapján.

24. A 23. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy elektromosan működtethető mágnest (7) oly módon elhelyezve, hogy az képes a reakciókamrában (5) felszuszpendált mágneses gyöngyöket immobilizálni.

25. A 23. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy a reakciókamra (5) reakciós oszlopot tartalmaz.

26. A 25. igénypont szerinti berendezés, azzal jellemezve, hogy az oszlop mikroorganizmust vagy annak intracelluláris anyagát megkötni képes befogószerrel bevont hordozóanyagot tartalmaz.