HU220340B - Tumorsejt növekedésének gátlása szindecán-1-ektodoménnel - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás sejtnövekedés – különösen malignus sejteknövekedése – sebességének lassítására vagy normalizálására, aszindekán-1-ektodomén valamely részlete hatásos mennyiségénekalkalmazásával. A találmány tárgyát képezik szindekán-ektodoméntmagukba foglaló proteineket tartalmazó gyógyászati készítmények is. Atalálmány szerinti eljárások és készítmények elősegítik malignussejtek növekedési sebességének és differen- ciáltsági állapotánaknormalizálódását. ŕ

Description

A találmány tárgya a sejtbiológia és a gyógyászat területére esik. Pontosabban meghatározva, a találmány tárgya eljárás sejtnövekedés - különösen malignus sejtek növekedése - sebességének lassítására vagy normalizálására, a szindekán-l-ektodomén valamely részlete hatásos mennyiségének alkalmazásával. A találmány tárgyát képezik szindekán-ekdomént magukba foglaló proteineket tartalmazó gyógyászati készítmények is.

A találmány szerinti eljárások és készítmények elősegítik malignus sejtek növekedési sebességének és differenciáltsági állapotának normalizálódását.

A sejtdifferenciálódás a genetikai információ szelektív felhasználásán alapul, amelyet az extracelluláris hatások programoznak. Ezek például lehetnek sejtek közötti kölcsönhatások, és extracelluláris effektormolekulák kötődése sejtfelszíni receptorokhoz. Egyre nyilvánvalóbb, hogy a sejtfelszín proteoglikánjai fontos szerepet töltenek be a sejt viselkedésének szabályozásában. A szindekánok sejtfelszíni proteoglikánok, amelyeknek részvételét kimutatták mind a mátrix felismerésében mind a növekedési faktorok kötésében, így fontos szerepük van a sejt szabályozásában. Az emberi, egér-, patkány- és hörcsögeredetű szindekánok szekvenciája ismert. A szindekánokról nemrégiben készültek összefoglaló munkák [Jalkanen és munkatársai: „Receptora fór Extracellular Mátrix”, szerkesztő: J. MacDonald & R. Mecham, Academic Press, San Diego, 1-37. oldal (1991), Bemfield, O. és munkatársai: Annu. Rév. Cell. Bioi. 8, 365-393 (1992)].

A szindekán-1 a legjobban jellemzett sejtfelszíni proteoglikán [Saunders és munkatársai: J. Cell. Bioi. 108, 1547-1556 (1989); Mali és munkatársai: J. Bioi. Chem. 265, 6884-6889 (1990)]. A W090/12033 számú nemzetközi közzétételi irat közli az egér-szindekán-1molekula aminosavszekvenciáját és a megfelelő cDNSszekvenciáját. A WO92/13274 és a WO93/05167 számú nemzetközi közzétételi iratok tárgya egy diagnosztikai eljárás transzformált sejtek detektálására úgy, hogy a szindekánexpresszió változását detektálja a transzformáit sejtekben.

A PCT/FI93/00514 nemzetközi közzétételi iratban ismertetik a szindekángén enhanszer részét, és egy eljárást a malignus sejtnövekedés csökkentésére a szindekánexpresszió indukálásával a malignus sejtekben.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.

Az 1. ábrán az emberi szindekán-1 szekvenciája látható. Bekarikázva: a lehetséges GAG kapcsolódási helyek; a vastagon aláhúzott rész: a transzmembrán dómén; a vékonyan aláhúzott: aataa poliadenilálási szignál.

A 2. ábrán az egéreredetű szindekán-1 szekvenciája látható.

A 3. ábrán a vad típusú, a farok nélküli és az ektotranszfekciós konstrukció „core”-proteinjének vázlatos szerkezete látható. A vad típusú szerkezet az egér színdekán-1-ektodoménjét teljes egészében tartalmazza [Mali, M. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 268, 24215 (1993)]. A farok nélküli szerkezetet oligonukleotiddal irányított mutagenezissel készítettük a példák szerint, amely egy deléciós mutánst eredményezett, melynek citoplazmatikus doménje egyetlen arginin aminosavból állt [Miettinen, Η. M. és munkatársai: J. Cell. Sci., nyomtatás alatt (1994)]. Az ectokonstrukció szintén oligonukleotid irányította mutagenezissel készült a példák szerint, és tartalmaz egy stopkodont a - közvetlenül a sejt felszíne mellett található - proteáz-szenzitív helyében. A függőleges vonalak a feltételezett GAG kapcsolódási helyeket mutatják, és a nyilak pedig a dibázisos proteáz-szenzitív helyet.

A 4. ábra az aktinfilamentumok organizációját és a szindekán-1 immunofluoreszcenciás lokalizációját mutatja a sejtfelszínen.

Az 5. ábrán a szindekán-1 ektodoménjének szekretált mennyiségét láthatjuk Ecto-sejtklónok kondicionált táptalajából (Ecto-15, -34, -2 és -23). A sejteket két napig tenyésztettük 10 nM tesztoszteron jelenlétében és a táptalajban felhalmozódott szindekán-1 ektodoménjét használtuk a továbbiakban. Magát a tenyészetet használtuk fel közvetlenül. A minták sejtszám alapján voltak normalizálva és ekvivalens mennyiségeket „slotblot -oltunk Hybond-N+-membránra. A szindekán-1 ektodoménjét erősített kemilumineszcenciás eljárással detektáltuk mAb-281 - 2-t használva, ahogyan a példákban olvasható [Miettinen, Η. M. és munkatársai: J. Cell. Sci. nyomtatás alatt (1994)]. A mennyiségi meghatározást „computer image znalysis ” eljárással végeztük (Imaging Research Inc.). Az átlagot és két parallel minta szórását (SEM) mutatjuk be.

A 6. ábra az Ecto-sejtklónok aktinfilamentum-organizációját mutatja be. Az Ecto-sejtek 10 nM tesztoszteron jelenlétében voltak tenyésztve és az aktinfilamentum-struktúrát rodaminnal konjugált falloidinnel tettük láthatóvá.

A 7. ábra az Ecto-sejtklónok kolóniáit mutatja lágy agaron. A sejteket 12 napig tenyésztettük 0,33%-os lágy agaron, DMEM +5% FCS 10 nM tesztoszteronnal, ahogyan korábban ezt már leírták [Leppá, S. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 932 (1992)].

A 8. ábrán az Ecto-2-sejtek kondicionált médiumából DEAE-val izolált szindekán-l-ektodomén hatását mutatjuk be az NMuMG-vel és a tesztoszteronnal (10 nM) kezelt SÍ 15 (SÍ 15+) sejtekre. 1500 sejtet tettünk 96 lyukú tenyésztő tálcákba, a tenyészetekhez DEAE-val izolált szindekán-1-ektodomént adagoltunk és addig tenyésztettük, ameddig a kontrollsejtek (szindekán-l-ektodomén nélkül) 75-85%-osan konfluensek lettek (NMuMG-sejtek négy napig, S115+-sejtek három napig). Ezután a sejteket 2% paraformaldehidben fixáltuk, 0,5% kristályibolyával („crystal violet”) festettük és desztillált vízzel mostuk. A megfestett sejteket 10%-os ecetsavban felszuszpendáltuk és spektrofotometriásán mértük 595 nm-en.

A 9. ábra a DEAE-val izolált szindekán-1-ektodomén heparitináz kezelésének hatása S115+-sejtek növekedésének gátlására. S115+-sejteket tenyésztettünk 1 nM DEAE-val izolált szindekán-1-gyei, amely az Ecto-2-sejtek és a NMuMG-sejtek tenyészetéből származott, vagy ugyanezeket a preparátumokat előkezeltük heparitinázzal 1 óráig 37°C-on (Seikagaku Kogyo Co.).

HU 220 340 Β

A 10. ábrán láthatjuk az immunológiailag tisztított szindekán-l-ektodomén hatását S115+- és NMuMGsejtekre. A DEAE-val izolált szindekán-l-ektodomént tovább tisztítottuk mAb-281-2-immunoaffinitásoszlopon (lásd példák). S115+- és NMuMG-sejteket tenyésztettünk 1 nM immunoaffinitással tisztított szindekán-1 -ektodomén j elenlétében.

All. ábrán azt láthatjuk, hogy a DEAE-val izolált szindekán-l-ektodomén gátolja a SÍ 15+-sejtek növekedését, viszont a HS és a CS-GAGs nem.

A 12. ábrán különféle sejtvonalak (CarB, MCF-7, S115+ 10 nM tesztoszteron jelenlétében, S115+ tesztoszteron nélkül, NIH-3T3, NMuMG és HaCaT) gátlását láthatjuk 1 nM DEAE-val izolált szindekán-1-ektodoménnal (példák). A sejtnövekedés minden esetben az (A) panelhez hasonlóan volt analizálva és a kezelés nélküli sejtekhez volt hasonlítva (a kontroll%-a, y tengely). Az átlagot és két parallel minta szórását (SEM) mutatjuk be.

A 13. ábrán egy meztelen egér tumomövekedésének szuppresszálását mutatjuk be szindekán-1-ektodoménnal.

A jelen találmány tárgya elsődlegesen egy gyógyászatiig elfogadható készítmény, amely a szindekánektodoménjét tartalmazza.

A találmány tárgya továbbá egy eljárás tumorsejtek növekedésének gátlására és normalizálására úgy, hogy az említett szindekán-ektodoménproteint a tumorsejthez juttatjuk, a sejt extracelluláris környezetébe.

A találmány szerinti eljárások alkalmasak mind malignus mind nem malignus tumorsejtek növekedésének gátlására, és különösen alkalmasak olyan tumorok esetén, amelyekre jellemző a szindekán-1 hiánya, ilyenek lehetnek például a gliómák, mielómák, karcinómák, szarkómák, limfómák és adenómák.

A szabadalmi igénypontok és a leírás világosabb és pontosabb érthetősége céljából az alábbiakban néhány szakkifejezés jelentését egyértelműen meghatározzuk.

Sejtnövekedés. A „sejtnövekedés” sejtreplikációt jelent, vagy a sejtosztódás sebességét, mind a kontrolláltat, mind a nem kontrolláltat. Tehát a sejtnövekedés az osztódás és a replikáció sebessége.

Malignus. A „malignus” kifejezés kontrollálatlan sejtnövekedést jelent.

Differenciáltabb fenotipus. A leírás szerinti értelemben a „differenciáltabb fenotipus” azt jelenti, hogy egy sejt olyan fenotípussal rendelkezik, amellyel rendszerint egy bizonyos, differenciáltabb sejttípus rendelkezik, mint a szóban forgó sejt. Egy fenotípust definiálhat egy vagy több fenotipizáló ismertetőjel. Például egy epiteliális sejtforma differenciáltabb fenotípusa a mesenchimalis formának; tehát ebben a példában a „differenciáltabb fenotipus” az epiteliális sejtmorfológia, inkább, mint a mesenchimalis forma. Egy terminálisán differenciált mesenchimalis sejt „differenciáltabb fenotípus”, mint a kondenzált mesenchimalis sejt. Az „aktintartalmú citoszkeleton” kifejezés is szerepelhet a leírásban; az organizálatlan aktinfilamentumok utalnak inkább a kevésbé differenciált fenotípusra, mint a rendezett filamentumok.

Hatásos mennyiség. Egy hatóanyag „hatásos mennyisége” az a mennyiség ebből az anyagból, amennyi elegendő egy kívánt eredmény eléréséhez úgy, hogy többnyire ezt az anyagot egy állatnak vagy embernek beadják. A szindekán-l-ektodomén hatásos mennyisége a készítményekben és a találmány szerinti eljárás alkalmazásakor az a mennyiség, amely elegendő a tumorsejt növekedésének gátlásához, elsősorban egy bizonyos sejttípus normál növekedési sebességének eléréséhez.

Beadás. A „beadás” kifejezés a szindekán-ektodomén találmány szerinti bejuttatását jelenti állatba vagy emberbe az orvostudomány által elfogadott bármilyen alkalmas módon, beleértve, de nem kizárólagosan: az injektálást, orális, enterális, transzdermális vagy parenterális (például intravénás) adagolást.

Szindekán-ektodomén hatásának kitéve. Azon a kijelentésen, hogy egy sejt a szindekán-ektodoménjét tartalmazó találmány szerinti készítmények hatásának ki van téve, azt értjük, hogy a sejt külső környezetében akkora mennyiségű szindekán-ektodomén található, amennyi elegendő a kívánt hatás elősegítésére, általában tumorsejtek növekedési sebességének csökkentésére.

Gyógyászatilag elfogadható só. A „gyógyászatilag elfogadható só” kifejezésen értjük a találmány szerinti szindekán-ektodomén sóit. Ezek a sók készülhetnek gyógyászatilag elfogadható savakból vagy bázisokból, úgy mint például kénsavból, sósavból, salétromsavból, foszforsavból mint savakból, alkáli- vagy alkáliföldfém-hidroxidokból, ammónium-hidroxidokból, alkilammónium-hidroxidokból stb. mint bázisokból.

Gyógyászatilag elfogadható készítmény. A „gyógyászatilag elfogadható készítmény” kifejezésen értünk oldószereket, hordozókat, hígítókat és ehhez hasonlókat, amelyeket mint adalékot vagy kísérő anyagot használunk a szindekán-ektodomén találmány szerinti preparátumaihoz úgy, hogy ezzel biztosítjuk a hordozót vagy adjuvánst az ilyen anyagok beadásakor a betegeknek (ember vagy állat) az azonosság érdekében. Ezek az adalékok bizonyos funkciókat lámák el, mint például biztosítják a megfelelő ionos környezetet az adagoláskor, stabilizálják a szindekán-ektodoménjét az inaktiválódással vagy a degradálódással szemben, és/vagy megnövelik a szindekán-ektodomén félélet-idejét. A gyógyászatilag elfogadható készítmény orvosilag kompatibilis a gazdaszervezettel, amelynek beadjuk.

Kezelés. A „kezelés” szó a leírásban használt értelemben a találmány szerinti gyógyászatilag elfogadható készítmény beadását jelenti, mely készítmény tartalmazza a szindekán-ektodomén találmány szerinti hatásos mennyiségét. A készítményt betegségek megelőzése és gyógyítása céljából adjuk be a pácienseknek, akiknek profilaktikusan vagy amelioráció céljából, beleértve a tumomövekedés gátlását is.

Lényegében mentes természetes szennyezőktől. Egy anyagról akkor állítjuk, hogy „lényegében mentes természetes szennyezőktől”, ha az lényegében meg van tisztítva azoktól az anyagoktól, amelyek normálisan és természetesen benne voltak a tisztítás előtt, és az anyag végső preparátuma lényegében mentes ezektől a normálisan és természetesen in vivő vagy in vitro jelen lévő

HU 220 340 B szennyezőktől. Amikor egy kezelés szükségessége miatt beadjuk egy egyénnek, a találmány szerinti szindekán-ektodomén lényegében mentes azoktól a természetes szennyezőktől, amelyek vagy in vivő (abban a szervezetben találhatók, amelyből az ektodomént izolálták), vagy in vitro (a kémiai szintézis eredménye miatt) kísérik. A „lényegében mentes” azt jelenti, hogy az ilyen szennyezők vagy egyáltalán nincsenek jelen, vagy olyan alacsony koncentrációban vannak jelen, hogy jelenlétük (1) nem interferál az aktív hatóanyag kívánt terápiás hatásával (mostantól fogva ez a szindekán-ektodomén tumomövekedést gátló hatása) a terápiásán elfogadható készítményben, amikor ezt a készítményt egy olyan páciensnek beadják, akinek arra szüksége van, és (2) nem károsítja a pácienst az ilyen készítmény adagolásának eredménye.

A találmány azon a felismerésen alapul, hogy a szindekánok ektodoménjei bizonyos biológiai funkcióval rendelkeznek és képesek biztosítani ezt a funkciót sejteknek, ha azt olyan sejtek külső felszínéhez juttatjuk, amelyek nem ugyanolyan sejtek, mint amelyek szintetizálták ezt a szindekán-ektodomént. A szindekánok membránkötött fehérjék. Meglepő volt az a felismerés, hogy az extracellulárisan adagolt szindekán-ektodomén már önmagában is elegendő, hogy helyreállítson egy differenciáltabb morfológiájú sejtet egészen a tumorsejtig és szuppresszálja a malignus sejt növekedését. A találmány mostantól fogva a szindekán-l-gyel lesz szemléltetve.

Minden szindekán tartalmaz egy citoplazmatikus domént, egy transzmembrán domént és egy extracelluláris domént. Az extracelluláris dómén az ektodomén. Ahogyan Jalkanen és munkatársai kifejtik [„Receptors fór Extracellular Mátrix”, szerkesztő: J. MacDonald & R. Mecham, Academic Press, San Diego, 1-37. oldal (1991)], a szindekánoknak nagymértékben konzervatív homológ szekvenciája van az ektodomén három jól elkülönített régiójában. Egy dibázisos szekvenciarészlet rögtön a hidrofób transzmembrán dómén N-terminális vége mellett található, ami arra utal, hogy az közvetlenül a plazmamembrán külső részénél található, és valószínűleg egy proteázérzékeny csoport, amely képessé teszi az ektodomént, hogy egészben hasadjon le a sejtfelszínről.

A humán szindekán-1 „core”-proteinje 310 aminosavból áll. Nagyfokú szerkezeti és funkcionális homológia van az egéreredetű és a humán szindekán-1 között. A humán szindekán-1 ugyanolyan méretű, töltésű, „buoyant”-sűrűségű és GAG-összetételű, mint az egérszindekán-1. A humán szindekán-1, az egéreredetűhöz hasonlóan, köti az I. típusú kollagénrostokat és a fibronektint, de nem köti a laminint vagy virtronektint.

A humán szindekán-1 szekvenciája ismert és már megklónozták [Mali és munkatársai: J. Bioi. Chem. 265, 6884-6889 (1990)]. A 2. ábra számozása szerint [Mali és munkatársai: J. Bioi. Chem. 265, 6884-6889 (1990)], az 1-251. aminosav a humán szindekán-1ektodomén része (a szekréciós szignállal együtt), a hidrofób transzmembrán dómén tartalmazza a következő 25 aminosavat (252-276. aminosavak), és a citoplazmatikus dómén tartalmazza az utolsó 34 aminosavat (277-310. aminosavak).

A szignál-peptidszekvencia az ektodomén első 17 aminosava. Bár hasznos a szindekán-1 sejtből való szekrécióját elősegíteni egy ugyanilyen fehérje szintetizálásával, a szekréciós szignál nem szükséges a találmány szerinti ektodomén tumomövekedést szuppreszszáló vagy differenciáló hatásához.

Tehát a találmány szerinti ektodomén szekvenciája tartalmazza a szindekán 1-251. aminosavjának olyan fragmentumait, amely megőrizte a GAG kapcsolódási helyeket és az ektodomén kívánt funkcióját, ilyenek például a következő szekvenciájú ektodoménfragmensek: az 1-251. (szekréciós szignállal és RK-helynél hasítva), a 18-251. (szekréciós szignál nélkül, de RK-helynél hasítva), az 1-231. (szekréciós szignállal, de RRhelynél hasítva) és a 18-251. aminosavakat tartalmazók (szekréciós szignál nélkül de az RR-helynél hasítva). Az az ektodomén, amelynek egy karboxilcsoportja van bárhol a 231-251. aminosavak között, vagy amelynek a szekréciós szignálffagmense kevesebb, mint az 1-17. aminosavak, szintén használható, mivel az előnyös megvalósítási eljárásnál várható, hogy az ektodomén megtartja biológiai tulajdonságait.

Bár a humán és az egérektodomének csak 70%-ban azonosak aminosavszinten, minden feltételezett glükózaminoglikán (GAG) kötőhely azonos az egér- és a humán szekvenciában. Az öt lehetséges glükózaminoglikán kötőhely a humán szindekán-ektodoménban a 37., 45., 47., 206. és 216. pozícióban van. Kettő ezek közül a SGXG konszenzus szekvenciához tartozik és a három másik az (E/D) GSG (E/D)-hez. Szintén azonos az egér- és a humán szindekán szerkezetében az egyetlen N-glikozilálásra alkalmas csoport és a proteáz-szenzitív dibázisos RK-csoport közvetlenül a transzmembrán dómén extracelluláris oldala mellett. A humán szindekán egy másik két bázikus csoportból álló RR-szekvenciát is tartalmaz 18 csoportra az RK-szekvenciától. Proteolitikus hasítás ennél a csoportnál is a találmány szerinti ektodomént szabadít fel, amely az összes intakt GAG kötőhelyet tartalmazza.

A humán és az egér-szindekán-1 transzmembrán doménja 96%-ban azonos (az egyetlen különbség a humán szindekánban az, hogy egy alanin van egy glicin helyett) és a citoplazmatikus dómén 100%-ban azonos az egér- és a humán szindekánban.

A szindekán-ektodomén, úgy mint a humán szindekán-ektodomén, rekombináns technikával tetszés szerinti gazdaszervezetben előállítható. Mégis preferálandó, de nem szükséges, hogy olyan gazdaszervezetet használjunk fel, amelynek hasonló a sejttípusa, mint a tumor, így hasonló GAG-összetételt lehet biztosítani, mint amilyen a sejt nem tumoros állapotában van. Sok olyan letétbe helyezett sejtvonal áll a rendelkezésre, amely humán szövetre specifikus vagy különböző más sejttípusokra jellemző.

Például a találmány szerinti egér-szindekán-1-kiónokat liposzómatranszfekcióval és geneticinnel készítettük fokozatosan szelektálva a stabil transzfektált sejtklónok felé. S115-sejtvonal kiónjai (lásd 3. ábra) fejezik ki

HU 220 340 B vagy a vad típusú egér-szindekán-l-et (vad típus), egy deléciós mutánst a citoplazmatikus dómén csak egyetlen arginincsoportjában (farok nélküli) vagy a teljes szindekán-l-ektodomént (ecto). A vad típusú szindekán-l-et és a citoplazmatikus deléciós mutánst (farok nélküli) pBGS eukarióta expressziós vektor EcoRI-hasítóhelyébe klónoztuk. Az ektodomén-konstrukciót pMAMneovektorba klónoztuk azért, hogy megfelelő expressziós szintet éljünk el hormon jelenlétében is, ugyanis az MMT-LTR-promoter ugyanazzal a szteroid hormonnal indukálható, amivel a sejtek. Nem szükséges ugyanezt a vektort használni, sok ilyen expressziós vektort ismer a tudomány. A szindekán-1 expresszióját a sejt felszínén monoklonális ellenanyaggal detektáltuk, példaként a már korábban leírt mAb-281-2-t hozzuk fel, amely az egér-szindekán-1 „core”-protein ektodoménjét ismeri fel, és az aktinfilamentumokat rodaminkonjugált falloidinnel tettük láthatóvá, ami a sejt differenciáltsági állapotát és növekedési állapotát mutatta.

Tesztoszteron nélkül az SÍ 15-sejtek rendezett aktinfilamentumokat mutatnak, amelyek jellemzők ezekre a sejtekre, ha azok epiteliális sejtek. Tesztoszteron jelenlétében az aktin rendezetlen és globuláris volt, és a szindekán-1 sejtfelszíni expressziója is szuppresszálva volt. A vad típusú és a farok nélküli kiónok expresszálták a szindekán-l-et a sejt felszínére és helyreállították az aktinfílamentumok organizációját a tesztoszteron kezelés ellenére. Mivel a farok nélküli mutáns transzfekciója is hasonló változásokat indukált, mint a vad típusú szindekán-1, az SÍ 15-sejtek transzfekcióját teljes ektodoménnel végeztük el és több, mint 50 független kiónt állítottunk elő, amelyek különböző szinten szekretáltak ektodomént a táptalajba. Ezen sejtek felszíne csak gyengén festődött szindekán-1-re, de ezek a sejtek jól organizált aktinfilamentumokat mutattak és epiteliális morfológiát. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a szindekán-1 ektodoménje elegendő ahhoz, hogy a tesztoszteronnal kezelt SÍ 15-sejtek epiteliális morfológiáját helyreállítsa, differenciáltabb fenotípust létrehozva, és hasznos rákellenes gyógyszer.

Nem rákos sejtekben a szindekán epiteliális, mesenchimalis, pre-B- és plazmasejtekben expresszálódik, de B-sejtekben nem. A szindekán azokban a szövetekben is kifejeződik, amelyek az ilyen típusú sejtekből állnak, beleértve az emberi agyi szöveteket is. Tehát a találmány szerinti eljárások különösen alkalmasak epiteliális, mesenchimalis, pre-B- és plazmasejtek tumorjai ellen. A találmány szerinti eljárások a leginkább a szteroid-reszponzív tumorok növekedésének lassítására alkalmasak, főleg az ösztrogén- és androgén-reszponzív tumorokra (azok a tumorok, amelyek szteroidok, ösztrogének vagy androgének - a jelölésnek megfelelően - jelenlétében jobban növekednek) beleértve a mellsejttumorokat, endometriumsejt-tumorokat és a prosztatasejt-tumorokat.

Emberek és állatok kezelésére a szindekán-l-ektodomént gyógyászatilag elfogadható oldat formájában adjuk be olyan mennyiségben, amennyi elegendő a tumor, malignus sejt normál növekedési állapotának helyreállításához, ami a lassabb növekedési sebességgel válik nyilvánvalóvá. A szindekántartalmú gyógyászatilag elfogadható oldat bármilyen formában beadható, ami profilaktikus, palliatív, preventív vagy regresszív hatást fejt ki a tumor növekedésére.

A találmány szerinti, pácienseknek beadott szindekán-1-ektodomén készítmények mennyisége és az adagolás időtartama meghatározható a tumor növekedésének követésével a páciensben az adagolási kúra ideje alatt, és beállítható a páciens által adott válasznak megfelelően. A találmány szerinti szindekán-ektodomén preferált extracelluláris adagolási koncentrációja a megcélzott tumorsejthez 0,7 nM-1 nM (lásd 11. ábrát), de bármilyen koncentráció használható, ami elegendő a tumor növekedésének csökkentéséhez. Az ektodomén adagolható vagy lokálisan (közvetlenül a célszervhez juttatva koncentráltan) vagy szisztematikusan (a véráramon keresztül juttatva). A páciensnek (akár humán vagy állati) adott szindekán dózisánál tehát figyelembe vettük azt a térfogatot, amibe az ektodomént beadtuk (úgy, mint a vér térfogatát), és a tumor típusát, amit kezeltünk. Például, ha a szindekán-ektodomén folyamatos adagolása szükséges, gyakoribb dózisok szükségesek, mintha a tumornak csak a szindekán-ektodomén tranziens hatására lenne szüksége. Például 1 nM mennyiségű szindekán-ektodomén, amely az 1-251. aminosavakat tartalmazza, megfelel 0,2 mg/L-nek (200 pg/L), vagy a vérben vagy lokálisan koncentrálva a hatás helyén. A találmány szerinti eljárásokban használatos tipikus szisztematikus szindekán-ektodoméndózis az a mennyiség, ami leginkább 0,2 mg szindekánektodomén per liter vér végső vérkoncentrációt biztosít. A vér térfogata emberekben 6%-a a testsúlynak, ennélfogva egy 70 kg-os személynek körülbelül 4,2 liter vére van. Mégis, mivel a szindekán-ektodomén hatásai feltételezhetően helyiek (például hatás egy specifikus sejtmembránon), elkülönítettek és kinetikailag meghatározottak, az elméletileg számított minimumdózis módosítható fölfelé, hogy a kívánt terápiás hatást elérje.

A szindekán-ektodomén beadható bármilyen módon, ami a gyógyszer hatásos mennyiségét a kívánt aktív helyre juttatja, például injekcióval. Parenterális adagolás céljából a szindekán-ektodomént tartalmazó preparátumokat ilyen kezelés szükségessége esetén gyógyászatilag elfogadható steril vizes vagy nem vizes oldószerekkel, szuszpenziókkal vagy emulziókkal adják be. Nemvizes oldószerek például a propilénglikol, polietilénglikol, növényi olaj, hal olaj és injektálható szerves észterek. A vizes hordozók magukban foglalják a vizet, víz-alkohol oldószereket, emulziókat vagy szuszpenziókat, beleértve a sós és puffereit orvosi parenterális hordozókat, nátrium-klorid-oldatot, Ringer-féle dextrózoldatot, dextróz plusz nátrium-klorid-oldatot, laktóztartalmú Ringer-féle oldatot vagy fixált olajokat. Az intravénás hordozók tartalmaznak folyadékot és tápanyag-utánpótlást, elektrolit-utánpótlást, úgymint a Ringer-féle dextrózalapúak és a hasonlók.

A szindekán-ektodomént tartalmazó gyógyszerek (a gyógyászatilag elfogadható oldat tartalmazva a terápiásán aktív szindekán-1-ektodomént) beadhatók katéter vagy pumpa segítségével, különösen ha az ekto5

HU 220 340 Β domént lokálisan magas koncentrációban kell bejuttatni. A szindekán-l-ektodomén-tartalmú gyógyszerek beadhatók szubkután vagy direkt a lágy szövetbe olyan beültetőeszközzel, ami inért a testfolyadékokkal szemben. Ilyen eszközök és beültetőrendszerek ismertek a szakmában. Egy kerámiarendszert fehérjék célba juttatására például a W092/00109 számú közzétételi iratban ismertetnek.

A szindekán-l-ektodomént tartalmazó gyógyszerek beadhatók úgy, hogy az ilyen molekula egy kiméramolekula (vagy komplex) része, amely a specifikus célszervhez van tervezve, például egy ellenanyag része, amely a célszöveten -szerven vagy sejten - ismer fel determinánsokat, tumoros vagy nem tumoros állapotban.

A szindekán-l-ektodomént tartalmazó gyógyászatilag elfogadható oldatot be lehet adni például helyileg. Bár a szindekán-l-ektodomén a páciensnek beadható egy olyan kezelési előirat szerint, amely más rákellenes gyógyszer beadását is előírja, a találmány szerinti szindekántartalmú készítmények optimális beadása különösen hasznos ebben a tekintetben.

A helyi bejuttatás két eljárás valamelyikével történhet. Az egyiknél a terápiásán aktív szindekán-ektodomén összekeverhető megfelelő gyógyászatilag elfogadható hordozóval és (adott esetben) a penetrációt fokozó anyagokkal, hogy segítse az aktív hatóanyagot átjuttatni a bőrön, így kenőcsöket, emulziókat, borogatóvizeket, oldatokat, krémeket és ehhez hasonlókat készíthetünk, és magát a preparátumot a bőr egy bizonyos területére helyezzük. A másik lehetőség, hogy a terápiásán aktív szindekán-ektodomént beépítjük egy tapaszba vagy egy ismert technológia szerinti transzdermális továbbítórendszerbe, ilyen tapaszok vagy továbbítórendszerek előállításának céljából.

A beadás ilyen retard, lassan felszabaduló formája a páciensnek kényelmesebb, mintha hosszabb időperiódusban ismételt injekciókra lenne szükség, vagy ha a tumorsejtnek az ektodomén folyamatos hatása lenne kívánatos. A találmány szerinti készítmény intravénás adagolási formájában elegendően gyors kezdeti hatást vált ki, ami hasznos a tumor növekedésének akut kezelésében.

A beadás irányulhat direkt a sejthez, ha a sejt egy szövethez vagy testszervhez kapcsolódik, vagy az adagolás lehet szisztematikus, azaz abba a közegbe, amiben a sejt található, úgy mint a vér vagy a gerincvelői folyadék. Az olyan szisztematikus adagolás, ami kiterjed a páciens testének minden részére, például a véráramba való bejuttatás, elősegíti azoknak a pácienseknek a kezelését, akiknek tumorsejtek testük több pontján is találhatók.

A szindekán-ektodoménnek, az ektodomént hatásos mennyiségben szekretáló expressziós konstrukció termékeként történő adagolása szintén „beadásnak” tekinthető. Például a véragygáton való keresztüljuttatás elérhető ismert vírusvektorrendszer felhasználásával úgy, hogy a szindekán-ektodomén DNS-ét juttatjuk be úgy, hogy az kifejeződik és szekretálódik az extracelluláris környezetbe, mint ahogyan például azt retrovírusos rendszerben leírják: WO93/03743, W090/09441,

Breakefield, X. A. és munkatársai: The New Biologist 3, 203-218 (1991) és Huang, Q. és munkatársai: Exp. Neurol. 115, 303-316 (1992).

A találmány szerinti gyógyászatilag elfogadható készítmény, amely a szindekán-1 ektodoménjét tartalmazza, előállítható olyan, önmagukban ismert eljárásokkal, mint például a hagyományos keverés, feloldás, liofilizálás vagy hasonló eljárásokkal. A találmány szerinti szindekán-l-ektodomént tartalmazó készítmények hasznossága abban a képességükben rejlik, hogy lassítják vagy megakadályozzák a tumor növekedését vagy a tumor újramegjelenését, valamint abban a képességükben, hogy megváltoztatják a sejt fenotípusát egy differenciáltabb állapotba mind humán, mind állati páciensek esetén. A találmány szerinti szindekán-1-ektodomén-készítmények a szervezet saját mechanizmusát használják fel egy speciális sejttípus differenciálódásának elősegítésére úgy, hogy az elérje maximális lehetőségeit.

A találmány szerinti készítmények és eljárások nem korlátozhatók a szindekán-l-re. A szindekán-1, szindekán-2, szindekán-3 és a szindekán-4 szintén hasonló doménstruktúrával rendelkezik. Ismert, hogy bizonyos sejttípusok differenciálódása együtt jár a szindekán-1 elvesztésével, de a szindekáncsalád egy másik tagjának megjelenésével [Bemfield, O. és munkatársai: Annu. Rév. Cell. Bioi. 8, 365-393 (1992)]. Bronchiális epitéliabimbók formálódása esetén például a tüdómesenchimela elveszti a szindekán-l-et, de megjelenik benne a szindekán-2. Az olyan sejttípusok tumorjában, amelyek elvesztik a szindekán-l-et a differenciálódás során, de egy másfajta szindekánt expresszálnak, az olyan szindekán-ektodomén felhasználása figyelhető meg, amely a differenciált állapotban expresszálódott.

Az alábbi példákkal a találmány szerinti megoldást kívánjuk tovább szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.

1. példa

Deléciós mutáns szindekánkonstrukciók

Liposzóma-transzfekcióval és a stabilan transzfektált sejtklónok azt követő geneticines szelektálásával Leppá és munkatársai leírása szerint [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 932 (1992)] olyan S115-sejtvonal-klónokat (lásd 3. ábra) állítottunk elő, melyek vagy a vad típusú egér-szindekán-l-et expresszálták (vad típusú), vagy egy deléciós mutánst, amely a citoplazmatikus doménben egy arginincsoportot tartalmazott (farok nélküli), vagy csak a szindekán-1 ektodoménjét (Ekto-2; lásd a

3. ábrát). Ezt a három formát és a gazdaszervezetet a következőképpen állítottuk elő.

Az egér-szindekán-1 teljes hosszúságú cDNS-ét Mali és munkatársai leírása szerint [J. Bioi. Chem. 268, 24215-24222 (1993), BluescriptSK+ (Promega)] EcoRI-helyébe klónoztuk.

1. A Bluescript-konstrukció EcoRI-inszertjét a pBGS-vektor EcoRI-helyébe klónoztuk [Mali és munkatársai: J. Bioi. Chem. 268, 24215-24222 (1993)] és az orientációt igazoltuk. Ezt a konstrukciót „vad típusú”-nak neveztük.

HU 220 340 Β

2. Egy 25 tagú mutagén oligonukleotidot - melynek szekvenciája: 5-G CTG TAC CGC TAG CAG AAG AAG GAC-3’ (szekvenciaazonosító szám: 1) volt, és tartalmazott egy stopkodont és egy Nhel restrikciós hasítóhelyet (aláhúzva) - használtunk fel arra a célra, hogy a citoplazmatikus dómén transzmembrán domént követő második aminosavának (metionin) kodonját stopkodonná alakítsuk át. A mutációt restrikciós emésztéssel és didezoxi-szekvenálással igazoltuk. A Bluescript-konstrukció EcoRI-inszertjét egy amplifikálható pBGS-vektor EcoRI-helyébe klónoztuk [Mali és munkatársai: J. Bioi. Chem. 268, 24215-24222 (1993)]. Ez a mutáns szindekán-1, amely a feltételezett citoplazmatikus doménjében összesen egy aminosavat tartalmazott (arginin), „farok nélküli”-nek hívtuk.

Egy 33 tagú mutagén oligonukleotidot 5’-GACACCTCCCAGTACTCACTTCCTGTCCAAAAG-3 ’ (szekvenciaazonosító szám: 2), amely egy stopkodont (vastag betűk) és egy Seal hasítási helyet (aláhúzva) tartalmazott - használtunk arra a célra, hogy az ektodomén dibázisos proteáz-szenzitív helye utáni első kodont (E) stopkodonná alakítsuk. A mutációt restrikciós emésztéssel és didezoxi-szekvenálással igazoltuk. Ez volt a Bluscript-ecto-konstrukció. A Bluescript-ecto-konstrukció EcoRI-inszertjét a pJC119R-vektor EcoRI-hasítóhelyébe klónoztuk [Miettinen és munkatársai: J. Cell. Sci. 107 nyomtatás alatt, (1994)]. A pJCllR-ecto-konstrukcióból származó ekto-inszertet Xhol-gyel emésztettük és ligáltuk egy pMAMneo eukarióta transzfekciós vektor Xhol-hasítóhelyébe, amely vektor a Clontechtől (Palo Alto) származott, [Leppá és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 932 (1992)], és az orientációt restrikciós emésztéssel igazoltuk.

2. példa

A mutáns szindekán-1 expressziója normalizálja a malignus növekedést Siló-sejtekben

A vad típusú szindekán-1-et és a citoplazmatikus deléciós mutánst (farok nélküli) a pBGS eukarióta expressziós vektor EcoRl-hasitóhelyébe klónoztuk [Mali és munkatársai: J. Bioi. Chem. 268, 24215 (1993)], de az ektodomén-konstrukciót pMAMneo-vektorba klónoztuk azért, hogy jobb expressziós szintet kapjunk hormon jelenlétében is (személyes közlés, S, Ala-Uoti, Turku Centre fór Biotechnology). A pBGS-rendszert nem represszálta a tesztoszteron. A szindekán-1-expressziét a sejtfelszínen mAB-281-2-vel detektáltuk [Jalkanen és munkatársai: J. Cell. Bioi. 101, 976 (1985)], ami felismeri az egér-szindekán-1-ektodomén „core”-proteinjét, és az aktinfilamentumokat rodaminkonjugált falloidinnel tettük láthatóvá.

A sejteket (S115 + , vad típusú, farok nélküli és Ecto-2) négy napig tenyésztettük felületi tenyészeten DMEM - 5% FCS -1 mM nátrium-piruvátban 10 mM tesztoszteronnal, kivéve az S115-sejteket, amelyeket tesztoszteron nélkül tenyésztettük DMEM - 4% DCC - FCS-ben (DCC=„Dextran-Coated-Charcoal”, azaz dextránnal borított faszén, ez a kezelés eliminálja a szérumból származó endogén szteroidokat) 1 mM nátrium-piruvát hozzáadásával. A sejteket 0,1% Triton-X100-zal és 2% paraformaldehiddel fixáltuk és rodaminkonjugált falloidinnel (Sigma) inkubáltuk. A sejtfelszíni szindekán-1-expressziót úgy tettük láthatóvá, hogy az élő sejteket 1 óráig jégben inkubáltuk a patkánymAb-281-2-vel (amely felismeri az egér-szindekán-1 ektodoménjét); azután 2% paraformaldehidben fixáltuk és a kötött mAB-281-2-t FITC-konjugált antipatkány nyúl-IgG-vel tettük láthatóvá.

Az S115-sejtek tesztoszteron nélkül organizált aktinfilamentumokat mutattak, ami ezekre a sejtekre akkor jellemző, ha azok epiteloidálisak. A hormon jelenlétében az aktin dezorganizált és globuláris volt, és a szindekán-1 sejtfelszíni expressziója szintén szuppreszszálva volt, ahogyan korábban Leppá és munkatársai vizsgálatai mutatták, [Cell. Reg. 2,1 (1991)], 4. ábra.

A vad típusú és a farok nélküli, szindekán-1-et sejtfelszínre expresszáló kiónok visszaállították az aktinfilamentumok organizációját a tesztoszteron kezelés ellenére, 4. ábra.

3. példa

Szekretált szindekán-1-ektodomén hatása tenyésztett Siló-sejtekre

Mivel a „farok nélküli” mutáns transzfekciójával indukált változások hasonlók a vad típusú szindekán-1 gyel indukált változásokhoz, az S115-sejtek transzfekcióját az ektodoménnel végeztük el. Több mint 50 független kiónt állítottunk elő (lásd 5, 6 és 7. ábra), amelyek különböző szinten szekretáltak ektodomént a táptalajba. Ezen sejtek felszíne csak gyengén festődött szindekán-1-re, de ezek a sejtek jól organizált aktinfilamentumokat és epiteliális morfológiát mutattak (4. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a szindekán1 ektodoménje elegendő ahhoz, hogy a tesztoszteronkezelt S115-sejtek epiteliális morfológiáját helyreállítsa.

Az Ecto-klónok részletes analízise céljából a szekretált szindekán-1-ektodomén mennyiségét erősített kemilumineszcenciás eljárással mértük mAb-281-2-t használva, amely a szindekán-l-ektodomén „core”-proteinjét ismeri fel. Két különböző stabilan transzfektált sejtklónt, amelyek nagy mennyiségben szekretáltak szindekán-1-et a tenyészet táptalajába (Ecto-2 és Ecto23) és két sejtklónt, amelyekben alacsony volt az expresszió (Ecto-15 és Ecto-34) választottunk ki a további analízishez (5. ábra).

Világos összefüggést találtunk a szindekán-l-ektodomén expressziója és az aktinfilamentumok reorganizációja között 10 nM tesztoszteron jelenlétében: az Ecto-15 és Ecto-34, melyek alacsony szindekán-expressziót mutattak, dezorganizált, főleg globuláris aktinnal rendelkeztek, de az Ecto-2 és az Ecto-23-klónok, amelyek a szindekán-1-ektodomént szekretálták, epiteliális morfológiát mutattak rendezett aktinfilamentumkötegekkel (6. ábra). Az intakt szindekán-1 megnövelt expressziója - ahogyan azt korábban bemutattuk szuppresszálja a tesztoszteronkezelt S115-sejtek tumornövekedését (Leppá és munkatársai: lásd fent), és most szintén az Ecto-2- és Ecto-23-klónok, amelyeknek magas a szindekán-1-ektodomén-expressziója, lágy agáron korlátozzák azoknak a növekedését. A szindekán7

HU 220 340 B

1-ektodomént alacsony szinten expresszáló Ecto-15- és Ecto-34-klónok lágy agaron mutatott növekedése a parentális S115-sejtekre jellemző (7. ábra). A lágy agaros kísérletek azt mutatták, hogy a morfológián túl, a szindekán-l-ektodomén-expresszió még S115-sejtek tumoros növekedésének restrikciójához is elegendő.

4. példa

A szindekán-ektodomén izolálása és tisztítása Ecto-sejtek tenyészetéből

Mivel úgy látszik, hogy a szindekán-l-ektodomén a felelős az androgénkezelt SÍ 15-sejtek malignus növekedésének szuppresszálásáért, Ecto-sejtkultúrákból kondicionált táptalajt gyűjtöttünk az ektodomén izolálásához. A kondicionált sejtkultúra táptalaját 2 M ureával denaturáltuk és főztük, mielőtt DEAE-Sephacel-oszlopra vittük volna, 50 mM nátrium-acetátot (pH=4,5) adtunk hozzá és lehűtöttük +4 °C-ra. Az oszlopot 0,2 M NaCl, 2 M urea, 50 mM Na-acetáttal mostuk és a kötött anyagot 1 m NaCl, 2 M urea, 50 mM Na-acetáttal (pH=4,5) eluáltuk. A szindekán-1-ektodomént tartalmazó frakciókat foszfáttal puffereit sóval (PBS) szemben dializáltuk 4 °C-on. A szindekán-l-ektodomén mennyiségét a frakciókban „slot-blot”-ta\, majd utána erősített kemilumineszcenciás eljárással becsültük meg, mAb-281-2-t használva [2. példa és Miettinen, Η. M. és munkatársai: J. Cell. Sci. 107nyomtatás alatt, (1994)] és azt ismert mennyiségű szindekán-1-standardhoz hasonlítottuk.

Az Ecto-sejtek tenyésztési táptalajából származó szindekán-l-ektodomén biokémiailag hasonló volt a normál egéreredetű epitélsejtekből (NMuMG) izolálthoz. Az izolálás után a preparátum szindekán-1-tartalmát megmértük és a preparátumot teszteltük hormonkezelt S115-sejteken. Amint a 8. ábrán láthatjuk, a DEAE-val izolált szindekán-l-ektodomén koncentrációi már 1 nMnál is szuppresszálták a tesztoszteronkezelt SÍ 15-sejtek növekedését (8. ábra). Ugyanez a koncentráció csak alig gátolta az olyan NMuMG-sejtek növekedését, amelyek normál epiteliális sejtek voltak (8. ábra). A szindekán-1ektodomént NMuMG-sejttenyészetek táptalajából is izoláltuk, és ez a preparátum is 1 nM koncentrációban gátolta a hormonkezelt SÍ 15-sejtek növekedését (9. ábra). A DEAE-izolált ektodomén heparitinázkezelése teljesen eltünteti ezeknek a preparátumoknak a növekedést gátló hatását (9. ábra), ami arra utal, hogy a szindekán1 „core”-proteinjének nem volt szerepe.

A DEAE-izolált szindekán-1-ektodomént tovább tisztítottuk mAb-281-2-immunoaffinitásoszlopon: a DEAE-izolált szindekán-l-ektodomén PBS-ben volt injektálva a mAb-281-2-Sepharose-CL-4B-immunoaffinitásoszlopra Jalkanen és munkatársai leírása szerint [J. Cell. Bioi. 105, 3087 (1987)], és a megkötődött anyagot 50 mM trietil-aminnal (pH=ll,5) eluáltuk. A szindekán-1-ektodomént tartalmazó frakciókat dializáltuk desztillált vízzel szemben és utána liofilizáltuk. Ezután a szindekán-1-ektodomént DMEM-ben (Gibco) szuszpendáltuk föl és a mennyiségét megbecsültük a fentiek szerint. Ezt az immunaffinitással tisztított szindekán-1ektodomént 1 nM koncentrációban alkalmazva, ismételten a tesztoszteronnal kezelt SÍ 15-sejtek növekedésének inhibíciój át figyeltük meg, és csak egy nagyon enyhe hatás vált nyilvánvalóvá NMuMG-sejtek esetén (10. ábra). Másrészt heparin-szulfát (HS) vagy kondroitin-szulfát (CS) glükózaminoglikán-láncok egymagukban nem szuppresszálták az SÍ 15-sejtek növekedését, még akkor sem, amikor ezerszer nagyobb koncentrációban alkalmaztuk, mint a szindekán-1-ektodomént (11. ábra).

5. példa

Az izolált szindekán-l-ektodomén hatása tenyésztett sejtvonalakra

Az izolált szindekán-l-ektodomén inhibitor hatását néhány más sejtvonalon is teszteltük. Ezek alig differenciált pikkelyes karcinómasejtek (CarB), humán eredetű tumorsejtek (MCF-7, ATCC-HTB-22), SÍ 15-sejtek hormonnal (S115+) és hormon nélkül (S115-), NIH-3T3fibroblasztok (ATCC-CRL-1658), normál egéreredetű epitélsejtek (NMuMG; ATCC-CRL-1636), és humán keratinocitasejtek (HaCaT; 12. ábra) voltak.

A sejteket a 8. ábra leírása szerint tenyésztettük és analizáltuk a következő táptalajokban a megjelölt ideig: CarB-sejteket [M. Quintanilla, K. Brown, M. Ramsden, A. Balmain, Natúré 322, 78 (1991)] HAM-F12-10% FCS-ben tenyésztettük négy napig; MCF-7-sejteket DMEM-5% FCS kiegészítve 10 nM ösztradiollal (E2) és 10 pg/ml inzulinnal 4 napig; SÍ 15+ és S115-sejteket a 3. ábra szerint három napig tenyésztettük; NIH-3T3sejteket DMEM-5% FCS-ben 4 napig; NMuMG- és HaCaT-sejteket 10% FCS-DMEM-ben 4 napig. Mivel az SÍ 15-sejtek sokkal lassabban növekednek, mint az S115 + -sejtek, 3000 S115-sejtet (másik sejtvonal 1500 sejt) adtunk arányosan a tálcába, így az S115+sejtekhez megfelelően hasonlítható eredményt kaptunk. Tehát az SÍ 15-sejtek esetében 3000 sejtet tettünk a tenyésztő tálcába, a többi mintából ezzel szemben 1500 sejtet.

A tumorból származó sejtek (CarB, MCF-7, SÍ 15+) erős növekedési szuppressziót mutattak, amikor 1 nM koncentrációjú szindekán-l-ektodomén hatása alatt álltak (12. ábra). Ezzel ellentétben csak gyenge vagy semmilyen inhibíciót sem figyeltünk meg a maradék tesztelt sejtvonalon (SÍ 15-, NIH-3T3, NMuMG, HaCaT; 12. ábra), amelyeket nem tumorosnak tekintettünk. Hormon hatása megduplázza az SÍ 15-sejtek növekedési sebességét (Leppá és munkatársai: lásd fent), de ha a tenyészet tartalmazta a szindekán-1 ektodoménjét, az SÍ 15-sejtek növekedése androgén nélkül 5,4-szer nagyobb volt, mint ugyanezen SÍ 15-sejtek növekedése tesztoszteronnal (12. ábra). Ez volt az oka a „malignus”-ként viselkedő S115+-sejtek inhibíciójának és az epiteliális SÍ 15-sejtek zavartalan növekedésének.

6. példa

A tumor in vivő növekedésének szuppressziója szindekán-1 -ektodoménnel

Az Ecto-konstrukciót, amit a korábbi példákban leírtak szerint készítettünk úgy, hogy a teljes hosszúságú

HU 220 340 Β egér-szindekán-l-cDNS-t BluescriptSK+-vektorba klónoztuk, és egy 33 tagú mutagén oligonukleotidot - 5’GACACCTCCCAGTACTCACTTCCTGTCCAAAAG-3’ (szekvenciaazonosító szám: 2), amely tartalmazott egy stopkodont (vastag betű) és egy Seal hasító helyet (CAGTAC) - használtunk fel arra a célra, hogy az ektodomén dibázisos proteáz-szenzitív helye utáni első aminosav (E) kodonját átalakítsuk stopkodonná. A mutációra restrikciós emésztéssel szelektáltunk és didezoxi-szekvenálással igazoltuk annak létrejöttét. A vad típusú szindekán-l-et és a citoplazmatikus deléciós mutánst pBGS eukarióta expressziós vektor EcoRI-hasítóhelyébe klónoztuk [Mali és munkatársai: J. Bioi. Chem. 268, 24215 (1993)]. Az Ecto-mutánst pMAMneo eukarióta transzfekciós vektor Xhol-hasítóhelyébe ligáitok [Leppá és munkatársai: PNAS. 89, 932-936 (1992)], mivel tudtuk, hogy a pMAMneo-val transzfektált S115-sejtek jól működnek egy bioreaktorrendszerben (személyes közlemény, Sári Ala-Uotila, Turku Centre fór Biotechnology). Az SÍ 15-sejtek transzfekcióját liposzóma-transzfekcióval végeztük el, és azt követően geneticinnel szelektáltunk, ahogyan már korábban ezt leírták [Leppá és munkatársai: PNAS. 89, 932-936 (1992)].

Az S115-sejteket és a transzfekciós sejtklónokat DMEM-5% FBS - 1 mM Na-piruvátban tenyésztettünk 10 mM tesztoszteronnal, kivéve azokat az SÍ 15-sejteket, amiket tesztoszteron nélkül tenyésztettünk DMEM-4% DCC-FBS-ben (Dextran-Coated-Charcoal, azaz dextránnal borított faszénnel kezelt marhaszérum, eliminálja az endogén szteroidokat a szérumból) 1 mM Na-piruváttal.

Tumor növesztéséhez szubkonfluens kultúrákat választottunk le tripszinnel, mostunk DMEM-el és „Coulter Counter’’-κΊ (Coulter Electronics) számoltuk. A sejteket DMEM-ben szuszpendáltuk fel 5x10 /ml sűrűségűre és jégen tartottuk az injektálásig. Hím tímusztalanított meztelen egereket (nu/nuBALB/cABom), 6-8 heteseket (Bomholtgárd, Rye, Dánia) oltottunk be szubkután 0,2 ml sejtszuszpenzióval. Egy szilasztikus tesztoszteron kapszulát ültettünk be szimultán. A meztelen egereken rendszeresen figyeltük a tumor kifejlődését és hellyel-közzel megmértük a tumorok méretét két függőleges dimenzióban. Amikor az állatokat leöltük, megállapítottuk, hogy a tüdőben és a májban volt lehetséges a metasztázis megjelenése. A tumor méretét az oltás utáni 6, 11 és 15 napon mértük és öt különböző tumor átlagát ábrázoltuk a 13. ábrán. Az ektodoménnal transzfektált sejtek csak akut gyulladásos reakciót mutattak és nem volt látható tumomövekedés, ellentétben a vad típusú sejtekkel, amelyek gyorsan növekvő tumorrá alakultak. Ez a kísérlet mutatja a szindekán-1-ektodomén hatékonyságát mint in vivő tumorszuppresszív anyag.

Az idézett publikációkat teljes terjedelmükben a kitanítás részeként kell tekinteni. Miután a találmányt teljes részletességgel ismertettük, szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti megoldás kivitelezésekor a különböző feltételeket, paramétereket és hasonlókat igen széles tartományon változtathatjuk anélkül, hogy az így előállított műszaki megoldás a találmányi gondolattól eltérő elven alapulna, vagy az igényelt oltalmi körön kívül esne.

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 25 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: mindkettő

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCTGTACCGC TAGCAGAAGA AGGAC

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 33 bázispár

TÍPUSA: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: mindkettő

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUS: genomiDNS

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GACACCTCCC AGTACTCACT TCCTGTCCAA AAG

Claims (22)

1. Szindekán-ektodomén alkalmazása tumorsejt növekedésének gátlására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.

2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás epiteliális, mesenchimalis, pre-B- vagy plazmasejt növekedésének gátlására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.

3. A 2. igénypont szerinti alkalmazás mellsejt, endometriás sejt vagy prosztatasejt növekedésének gátlására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.

4. A 3. igénypont szerinti alkalmazás szteroid-reszponzív sejt növekedésének gátlására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.

5. A 4. igénypont szerinti alkalmazás ösztrogénvagy androgén-reszponzív sejt növekedésének gátlására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.

6. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás humán sejt növekedésének gátlására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.

7. Az 1. ábra szerinti humán szindekán-1-ektodomén, tumorsejt növekedésének gátlásában történő alkalmazásra.

8. Az 1. ábra szerinti 18-231. aminosavakat magában foglaló, de az 1. ábra szerinti a 252-310. aminosavakból álló transzmembrán vagy citoplazmatikus do9

HU 220 340 B mént nem tartalmazó szindekán-ektodomén, tumorsejt növekedésének gátlásában történő alkalmazásra.

9. Az 1. ábra szerinti 18-251. aminosavakat magában foglaló szindekán-ektodomén, tumorsejt növekedésének gátlásában történő alkalmazásra.

10. Szindekán-ektodomén alkalmazása tumor redukálására vagy szuppresszálására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.

11. A 10. igénypont szerinti alkalmazás, epiteliális, mesenchimalis, pre-B- vagy plazmatumorsejtek extracelluláris környezetébe juttatható gyógyászati készítmény előállítására.

12. A 11. igénypont szerinti alkalmazás, mell-, endometriás vagy prosztatatumorsejtek extracelluláris környezetébe juttatható gyógyászati készítmény előállítására.

13. A 12. igénypont szerinti alkalmazás, szteroidreszponzív tumorsejtek extracelluláris környezetébe juttatható gyógyászati készítmény előállítására.

14. A 13. igénypont szerinti alkalmazás, ösztrogénvagy androgén-reszponzív tumorsejtek extracelluláris környezetébe juttatható gyógyászati készítmény előállítására.

15. A 10. igénypont szerinti alkalmazás, humán tumorsejtek extracelluláris környezetébe juttatható gyógyászati készítmény előállítására.

16. Az 1. ábra szerinti humán szindekán-1-ektodomén, gyógyászati készítmény hatóanyagaként történő alkalmazásra.

17. Az 1. ábra szerinti 18-231. aminosavakat magába foglaló, de 1. ábra szerinti 252-310. aminosavakat tartalmazó transzmembrán vagy citoplazmatikus domént nem tartalmazó szindekán-ektodomén, gyógyászati készítmény hatóanyagaként történő alkalmazásra.

18. Az 1. ábra szerinti 18-251. aminosavakat magában foglaló ektodomén, gyógyászati készítmény hatóanyagaként történő alkalmazásra.

19. Gyógyászatilag elfogadható készítmény humán alkalmazásra, amely készítmény tartalmaz egy olyan proteint, amelynek egy doménje a szindekán ektodoménje.

20. A 19. igénypont szerinti készítmény, amely 1. ábrán bemutatott szekvenciája, emberi eredetű szindekánektodomént magában foglaló proteint tartalmaz.

21. A 20. igénypont szerinti készítmény, amely az 1. ábra szerinti 18-231. aminosavakat tartalmazó, de az 1. ábra szerint a 252-310. aminosavakat nem tartalmazó transzmembrán vagy citoplazmatikus domént nem tartalmazó szindekán-ektodomént magában foglaló proteint tartalmaz.

22. A 20. igénypont szerinti készítmény, amely az 1. ábra szerinti 18-251. aminosavakat tartalmazó szindekán-ektodomént magában foglaló proteint tartalmaz.