BG63622B1

BG63622B1 - Супресия на растежа на туморни клетки посредствомсиндекан- 1 ектоучастък

Info

Publication number: BG63622B1
Application number: BG101038A
Authority: BG
Inventors: Markku Jalkanen; Markku Mali
Original assignee: Oy Biotie Therapies Ltd
Priority date: 1994-06-13
Filing date: 1996-12-09
Publication date: 2002-07-31
Also published as: BG101038A; HUT76535A; PL317658A1; WO1995034316A1; AU708963B2; NO965336D0; CA2192593A1; FI964997A; RU2164414C2; NO965336L; HU9603456D0; CZ355496A3; HU220340B; AU2739395A; KR970703782A; EP0765167A1; NZ288237A; MX9606369A; US5851993A; JPH10501258A

Abstract

Изобретението се отнася до метод за редуциране растежа на тумори чрез осигуряване на достатъчни нива на синдекан-1 ектоучастък, както и до фармацевтичен състав, включващ протеин, притежаващ участък на базата на синдекановия ектоучастък.

Description

ОБЛАСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящото изобретение се отнася до областта на биологията на рака и неговото лечение. По- специално изобретението се отнася до метод за забавяне или нормализиране скоростта на растежа на юлетките. в частност малигнени клетки. чрез доставяне на ефикасни количества от синдекан-1 ектоучастък до такива клетки. Методът по изобретението улеснява и води до нормализиране скоростта на растежа и диференциацията на малигнени клетки.

НИВШЗАИЗОБЕЕТЕНИЕШ

Клетъчната диференциация се основава на селективното използване на генетична информация, програмирана от екстрацелуларни стимули, които например могат ga вюйочват клетъчни взаимодействия и свързване на извън клетъчни ефекторни молекули с рецептори от клетъчната повърхност. Така става ясно, че определени протеогликани cm клетъчната повърхност важна роля в регулацията на к.\етъчнотс поведение. Синдеканите са протеогликани от клетъчната повърхност, които участват както в разпознаването на матрикса. така и в свързването на растежния фактор и по този начин взимат участие в клетъчната регулация. Познати са последователности на синдекани от човек, мишка, плъх и хамстер. Наскорс напр авенаша

еканите

Jalkanen, et al..

in Receptors for Extracellular Matrix,

J. MacDonald & R. Mecham,

Editors, Academic Press, San Diego, pp. 1- 37 7.991) and Bemfield, 0., et al., Annu.

Rev. Cell. Biol. 8: 365- 393 (1992).

Синдекан-1 е най- асбое охарактеоизиоаният клетъчно повърхностен'J ·>££*.£ £ поотеогликан (Saunders et al., J. Cell Biol. 198: 1547- 1556 (1989); Mali et al.

т t j·

Biol. Chem. 265: 6884- 6889 (1990)). Международна патентна публикация

90. 12033 описва амино киселинната последователност и съответните установяване на тпенссЬсимиоани клетки чрез откриване на изменения в

- £ £ >- £ £ £ експресията на синдекана в трансформирани клетки е описано 6 патентно описание WO 92/ 13274 u V/O 93/ 05167.

Подсилващият елемент на синдекановия ген, а така също и метод за понижаване растежа на малигнени клетки чрез индуциране експресията на синдекан вътре в малигнени клетки е описано в WO 94/12162

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ЧЕРТЕЖИТЕ

Фигура 1 показва последователността на синдекан-1. Кръгчета:

възможни gag места на присъединяване: подчертаване с плътна линия:

трансмембранен участък; подчертаване с тънка линия: aataa полиаденилационен сигнал.

Фигура 2 показва последователността на миши синдекан-1.

фигура 3 Схематична структура на същинските протеини див тип. на структурите с по- малък опашен дял и екто трансфекционните структури Дивият тип структура съдържа синдекановият повърхностен участък с неговата пълна дължина (Mali, М. etal., J. Biol Chem. 268: 24215 (1993)). Структурата с по- малък опашен дял ( tail- less construct) е получена с помощта на олигонуклеотид- насочена мутагенеза, водеща до делеционен мутант с единичен аргининов участък в цитоплазматичния участък, както е описано в примерите (Miettinen, II. М. et al., J. Cell Sei nog печат (1944)). Екто^:структурата е получена също чрез олигонуклотид- насочена мутагенеза както е описано в примерите. и притежава един стоп кодон в чувствителен на протеаза сайт, точно съседен на клетъчната повърхност. Вертикални линии показват вероятните GAG места на присъединяване, а стрелките бибазичният чувствителен на протеази сайт.

фигура 4 Организация на актинсвия филамент и имунофлуоресцентна локализация на синдекан-1 на клетъчната повърхност.

Фигура 5 Количество на секретираният повърхностен участък на синдекан-1 от кондиционирана среда на кюнове от повърхностни клетки (Екто 15,34.2 и 23). Клетките са култивирани в проължение на два дни в присъствието на 10 пМ тестостерон и се използва ектоучастъка на синдекан-1, който е акумулиран в средата. Ку.лтуралната среда се използва директно. Пробите се нормализират за броя на клетките и еквивалентните количества се оцветяват върху Hybond- N+ мембрана. Участъкът на синдекан- 1 се открива с помощта на хемилуминисцентен метод с 281- 2 > както е описано в примерите (Miettmen, Н. М. et al., J. Cell Sci nog печат (1944)). Определяйте на количествата става с компютърна система за . анализ на изображението (Imaging Research Inc.). Представени са две успоредни проби на Means and SEMs.

фигура 6 Организация на актиновия филамент в Екто клетъчни кюнове . Екто клетките се култивират в присъствието на 10 пМ тестостерон и актиноВшпе филаменти се визуализират с родаминконюгатен фалоидин.

фигура 7 формиране на колония от Екто клетъчни клонове върху мек агар. Клетките се култивират в продъ.икение на 12 дни в 0. 335 мек агар. DMEM + 5% FCS с 10 пМ тестостерон както е описано по- рано (Leppa, S, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. C’SA 89: 932 (1992//.

фигура 8 Повлияване на изолиран с DEAE синдекан-1 повърхностен участък (примери) от кондиционираната среда на Екто 2 клетки при третиране с NMuMG и тестостерон (10 пМ) S115 клетки (S115+ ). 1500 клетки се прехърлят в 96 - кладенчови къмпурални панички и клетките се култивират с DEAE- изолиран ектоучастък на синдекан-1 докато контролните клетки достигнат около 75- 85% сливане (NMuMG клетки четири дни, S115+ три дни). След това юхетките се фиксират с 2%· параформалдехид, оцветяват се с 0. 5% кристал виолет и се промиват с дистилирана вода. Оцветените клетки се суспендират в 10% оцетна киселина и се измерват спектрофотометрично при 595 пт.

Фигура 9 Въздействие на третирането с хепаритиназа от изолиран с DEAE синдекан- 1 повърхностен участък върху инхибиране растежа на S115+ клетки. S115+ клетките се култивират с 1пМ изолиран с DEAE синдекан-1 със същите продукти, предварително третирани е хепаритиназа (Seikagaku

Kogyo Co.) 1 час при 37°С.

фигура 10 Въздействие на имунопречистен синдекан-1 повърхностен синдекан-1 повърхностен участък по- нататък се пречиства с 231- 2 имуноафинитетна колона (примери). S11 г NAiuMG клетки се култивират е пМ имутоафинитетно пречистен синдекан-1 повърхностен участък.

Фигура 11 Изолиран с DEAE синдекан-1 повърхностен участък. н<

нито HS. нито CS GAGs инхибират растежа на S115+ клетките.

Фигура 12 Инхибиране растежа на различни клетъчни линии (СагВ.

NMuMG и НаСаТ) с 1 пМ изолиран с DEAE синдекан-1 повърхностен участък (примери). Клетъчният растеж е анализиран във всички панели, оста). Представени са средствата и SEMs от две успоредни проби.

фигура U Супресия на развитието на тумора в гола мишка с помощта на синдекан-1 повърхностен участък.

QEIIKmiWEREIZHMEIQ

Настоящото изобретение най- напред е насочено към подходящ във фармацевтично отношение състав, съдържащ повърхностен участък на синдекан.

По- нататък изобретението е насочено към метод за понижаване или нормализиране растежа на туморните клетки чрез доставяне в екстрацелуларното пространство на протеин от синдеканов ектоучастък.

Методите от изобретението са приложими както за малигнени. така и за не- малигнени туморни клетки, и по- специално за тумори, характеризиращи се със загуба на синдскан-1. като глис-ми. мисломи. карциноми. саркоми. лимфоми или аденоми.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ?азоиоане на описанието и

J.

патентните претенции нова клетъчният растеж е скоростта на деление ι гкация.

Π о ·? Q πη: ι τ; ζ* ?г (' L—-----клетките.

I/

По- добре диференциран фенотип: Когато се твърди, че клетката има ю- добре диференциран фенстип. се разбира че клетката постига фенотип. който обикновено е постигнат от същинският клетъчен тип..

който е по- добре диференциран от дадената клетка. фенотипът може да бъде дефиниран чрез един аги повече фенотипични характеристики.

Например, формата на епитслиална клетка е по- добре диференциран фенотип от мезенхимоподобната форма: поради това, в този пример. “подобре диференциран фенотип” е епителиа.лната клетъчна морфология, вместо мезенхимоподобната форма. Терминално диференцираната мезенхимна клетка е ~ по- добре диференциран фенотип” в сравнение с кондензираните мезенхимни клетки. Състоянието на актин- съдържащият цитоскелет също може да бъде използвано: дезорганизираните актинови филаменши са индикатори за по- малко диференциран фенотип от организираните филаменши.

Ефективно количество: “Ефективно количество от даден агент е такова количество, което е достатъчно да доведе до желан резултат, и поспециално при прилагането на такъв агент върху човек или животно.

Ефективно количество от синдеканов ектоучастък в състави и методи съгласно изобретението е количеството, достатъчно да редуцира растежа на туморнитс клетки, за предпочитане де нормална за специфичните клетъчни типове скорости.

Прилагане: Терминът “прилагане” означава въвеждане на синдеканов ектоучастък съгласно изобретението в животно ши човек чрез каквото и да е подходящо средство, познато в медицината. включително, но без да се <зграничава до инжекционно, орално. ентерално. транедермално и парентерално (напр. интравенозно) прилагане.

Излагане на синдеканов ектоучастък.

ектоучастък в съставите съгласно изобретението означава, че средата която е външна за клетките,се снабдява с количества от синдеканов сктоучастък. които са ефективни при постигане на желания резу.цпат.

предимно за понижаване скоростта на растежа на туморните клетки.

Подходяща във фармацевтично отношение сол: Терминът “подходяща във фармацевтично отношение сол включва соли на синдекановия ектоучастък съгласно изобретението. Такива соли могат да бъдат формирани от подходящи във фармацевтично отношение киселини, като например, киселини като сярна, солна, азотна, фосфорна и др. или основи като хидроокиси на ажални а\и алкалоземни метали, амониеви хидроокиси, ахкил амониеви хидроокиси и др.

Подходят 8ъ8 фармацевтично отношение състав. Терминът “подходящ във фармацевтично отношение състав’’ се отнася до разтворители, носители, разрешпели и др. подобни, които се използват като добавки или среда за получаване на синдекансвият ектоучастък съгласно изобретението. така че да осигури носител или аджувант за прилагането на такиВа състава на пациенти (хора или животни) когато се нуждаят от такова Подобни добавки могат да предоставят такива функции, като например, да предоставят йонна среда за приложение. да стабилизират синдекансвият ектоучастък по отношение на инактивиране или разграждане, и или да повишат времето на полу- живот на синдекансвият ектоучастък. Подходящият във фармацевтично отношение състав е конкурентен с гостоприемника ,на който се прилага.

Лечение: Терминът '‘лечение“ или лекуване“ обхваща въвеждането на подходящи във фармацевтично отношение състави съгласно изобретението, включващи ефикасни количества от синдеканов ектоучастък съгласно изобретението у пациент за целите, които може да включват профилактика, подобрение, предотвратяване или изцеление на медицински неразположения. Включително подтискане тумор чия растеж.

Кава се че материалът е свободен на природни замърсявания. ако е по същество пречистен от материали, с които е обикновено и природно свързан преди такова пречистване и чиито замърсители. обикновено и природно откривани с веществата in vivo аш in vitro, по същество липсват от крайният продукт на материала. При прилагане на субект, нуждаещ се от лечение, синдекансвият ектоучастък съгласно изобретението е по същество свободен на природни контаминанти. които са свързани със синдекановия ектоучастък както in vivo ( в гостоприемника. от който ектоучастъкът е

изолиран), така и in vitro (като резултат на химичен синтез). Под “ по щи присъстват при такива ниски концентрации,че тяхното присъствие 1) не влияе на Желания терапевтичен ефект на активният агент (тук способността на синдекановият ектоучастък да инхибира растежа на тумора) в подходящ във фармацевтично отношение състав, когато такъв състав се въвежда на нуждаещ се пациент и (2),не уврежда пациента като резултат от прилагането на такъв състав.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ПРЕДПОЧИТАНИТЕ ВАРИАНТИ НА

ИЗПЪЛНЕНИЕ

Изобретението се основава на откритието, че сктоучастъците на синдеканите ооладават определени оиологични функции и че са способни д придават шези функции на клетките. когато са разположени на външната синдеканов ектоучастък. Синдеканите са мембранно свързани протеини.

Изненадващо е установено, че екстрацелуларно осигуреният синдеканов ектоучастък. сам по себе си, е достатъчен да възстанови по- добре диференцирана морфология на туморните клетки и да подтисне растежа на малигнените клетки. Изобретението се пояснява със синдекая-1.

Всички синдекани съдържат цитоплазматичен участък, трансмембранен участък и екстрацелуларен участък. Екстрацелуларният участък е ектоучаешъка. Както се дискутира от Jalkanen et al., (in Receptors for Extracellular Matrix, J. MacDonald & R. Mecham, Editors. Academic Press, San Diego, pp. 1- 37 (1991)), синдеканите показват добре съхранени хомоложни последователности при три отделни области от техните ектоучастъци. Дибазичната последователност е точно съседна на N- края на хидрофобен трансмембранен участък, за който се предполага, че е локализиран съседно на външният слой на плазмената мембрана, и може да служи като място.

чувствително на протсазш позволяващо интактното отцепване на хомоложност между миши и човешки синдскан- 1. Човешкият сидекан- 1 има идентичен размер. товар. плътност и GAG състав с този на мишият колагеновите фибрили тип ί и фибринонектин о не юмерирани съгласно фигура 2 no Mali et al..,/. Biol. Chem. 26у. 6884- 6889 /Л държа следващите 25 аминожиселинни остатъка (ами остатъка (аминовшселини 277- 310).

от ектоучастъка. Макар да са приложими за развиване секретирането на индекан-1. секреционният сигнал не е необходим за супресия на растежа на тумора или диференционните функции на ектоучастъка по изобретението.

Поради това. последователността на ектоучастъка съгласно изобретението вю\ючва онези фрагменти от синдекановите аминокиселинни остатъци 1-251, които обхващат GAG местата на свързване и желаната функция на ектоучастъка. като например, ектоучастъците, притежаващи аминокиселини 1-251 (със секреционен сигнал и разграден при RK сайта), 18251 (без секреционен сигнал, но разграден при RK сайта), 1- 231 (със секреционен сигнал, но разграден при RK. сайта) и 18 - 251 (без секреционен сигнал, но разграден при RK сайта). Може да се използва един ектоучастък, притежаващ карбокси край в място,където и да е между аминожиселинни остатъци 231- 251, или фрагмент на секреционният сигнал с по- малко от 117 аминокиселини, доколкото такива варианти на изпълнение се очаква да обхванат биологичните свойства на ектоучастъка.

Макар човешките и миши ектоучастъци са само 70% идентични на ниво аминокиселини, всички места на присъединяване на гликозаминогликани (GAG) са идентични между мишите и човешките последователности. Петте възможни места на присъединяване на гликозаминогликани от човешкият синдеканов ектоучастък се при позиции 37,45,47,206 и 216. Две от тези места принадлежат на консенсусните последователности SGXG и на три други също (E/D)GSG(E/D). По същия начин,идентичен за мишия и човешки синдекан_?е единичният сайт за N- гликозилация и чувствителният на протеинази дибазичен RK сайт,съседен на екстрацелуларната част на трансмембранният участък. Човешкият синдекан съдържа и втора дибазична RR последователност в размер точно на 18 остатъка освен RK последователността. Протеолишичното разграждане в това място също ще освободи един ектоучастък по изобретението, което съдържа всички интактни (неувредени) GAG места.

Трансмембранните участъци на човешкият и миши синдекан-1 са 96% идентични (единственото изменение в човешкият синдекан е едно изменение на аланин в глицин) и цитоплазматичншпе участъци са 100% идентични в човешкият и миши синдекан.

Синдеканоб ектоучастък, като например човешки синдеканов ектоучастък, може да бъде получен с рекомбинантни техники в който и да е гостоприемник по желание. Предпочита се, но не е задължително, да бъде използван гостоприемник от същия клетъчен тшдкакто тумора, така че да се предостави толкова сходен с клетката в не- туморно състояние GAG състав , колкото е възможно. Много депозирани клетъчни линии, които представляват човешки тъканно специфични или характеристични за различни клетъчни типове са подходящи за целта.

Например, миши синдекан-1 клонове по изобретението са конструирани с помощта на липозомна шрансфекция и генетицин за последващ подбор на стабилно трансфектирани клетъчни клонове. Клонове на S115 клетъчната линия (виж фиг. 3), експресират както дивият тип миши синдекан-1 (див тип), делеционен мутант с единичен аргининов остатък в цитоплазматичната област само (без опашка) така и прост ектоучастък на синдекан-1 (екто). Див тип синдекан-1 и цитоплазматичен делеционен мутант (без опашка) се клонират в EcoRI сайта на pBGS еукариотичен вектор на експресия. Структурата на ектоучастъка се клонира в рМАМпео вектор, с оглед получаване на ефективни нива на екпресия също в присъствието на хормон, докато ММТ LTR промотора е индуциран от същият стероиден хормон,както клетките. Не е задължително използването на този вектор, тъй като са известни много такива вектори на експресия. Експресията на синдекан-1 на повърхността на клетката е установена с помощта на моноклонално антитяло, примерно с помощта на описан по- рано тАЬ 281- 2, който разпознава ектоучастъка от миши синдекан-1 същински протеин, и актиновите филаменти се визуализират с помощта на родамин- конюгатен фалоидин, като индикатор на етапа на диференциация и етапа на растеж на клетката.

Без тестостерон SI 15 клетките показват организирани, актинови филаменти, типични за тези клетки при епителизация. В присъствие на тестостерон акшинът е дезорганизиран и алобуларен, и клетъчно повърхностната експресия на синдекан-1 също се супресира. Дивият тип и клоновете с по- малка опашна част (Tail- less) експресиращи синдекан-1 на клетъчната повърхност възстановяват актин филаментозната организация въпреки третирането с тестостерон. Тъй като трансфекцията на Tail- less мутанта също индуцира сходни изменения като Дивият тип синдекан-1, S115 клетки се шрансфектират с простия ектоучастък и се получават повече от 50 независими клона, секретиращи различни нива на ектоучастъка в културалната среда. Клетъчните повърхности на тези клетки се оцветяват само слабо за синдекан-1, но все още тези клетки изявяват добре организирани актинови филаменти и епителоидна морфология. Тези резултати показват, че ектоучастъкът на синдекан- 1 е достатъчен за възстановяване епителоидната морфология на третираните с тестостерон S115 клетки с този от по- добре диференцираният фенотип и е полезно противораково лекарство.

В не- туморни клетки синдекан сфкспресира в епителни клетки, мезенхимни клетки, пре- В клетки, но не и от В клетки Синдекан също се експресира в тъкани, които съдържат клетки от този тип, включително мозъчна тъкан на човек. Поради това методите по изобретението са особено приложими срещу тумори на епителни, мезенхимни, пре- В и плазмашични клетки По- специално, методите по изобретението са приложими за забавяне растежа на стероид отговорни тумори, по- специално естроген и андроген отговорни тумори (тумори, които растат по- добре в присъствие на стероиди, естрогени или андрогени) включително туморни клетки на гърда и туморни клетки на простатата жлеза

За лечение на хора и животни синдекан-1 ектоучастък се прилага в подходящ във фармацевтично отношение разтвор в нива, достатъчни да възстановят етапа на нормалното развитие на тумора или малигнените клетки, както това е видно от по- ниската скорост на растеж. Съдържащият синдекан фармацевтичен състав може да бъде прилаган под различни форми, така че да въздейства профилактично, палиативно, предотвратяващо или регресивно на развитието на тумора.

Количеството на прилаганите на пациента състави, съдържащи синдекан-1 ектоучастъка съгласно изобретението, може да бъде определено чрез наблюдаване развитието на тумора по време на курса на лечение, и да бъде регулирано съответно на реакцията на пациента. Синдекановият ектоучастък по изобретението за предпочитане се доставя до атакуваните туморни клетки в екстрацелуларни концентрации около 0.7 пМ (виж фигура 11), но може да бъде използвана всяка концентрация, достатъчна да намали развитието на тумора. Ектоучастъкът може да бъде осигурен както локално (както с концентрирано доставяне направо до атакуваният орган), така и системно (например доставяне чрез кръвният поток). За пресмятане дозата синдекан, давана на пациента (независимо човек или животно)_>следва да се има предвид обема (като кръвен обем),в който се въвежда ектоучастъка и типа на тумора, който се атакува Например, ако е необходимо продължително излагане на действието на синдеканов ектоучастък, тогава ще се изискват по- често прилагане спрямо случая, когато е необходимо временно излагане на въздействието на синдеканов ектоучастък. Например, количество 1 пМ синдеканов ектоучастък с аминокиселини 1- 251 съответства на 0.2 mg/1 (200 pg/I), както в кръвта, така и концентриран за външно въздействие. Типични системни дози синдеканов ектоучастък, приложими по метода съгласно изобетението за лечение на хора или животни включват количества, които доставят кряйна концентрация в кръвта от за предпочитане 0.2 mg синдеканов ектоучастък за литър кръв. Обемът на кръвта в хора е 6% от телесното тегло, като 70 килограмов индивид има около 4,2 литра кръв. Независимо от това, тъй като ефектът от синдекановият ектоучастък е предимно локален (напр. действа на специфична клетъчна мембрана), теоретичната минимална доза може да бъде регулирана с оглед достигане желан терапевтичен ефект.

Синдекановият ектоучастък може да бъде прилаган по който и да е начин, така че да бъдат доставени ефикасни нива от лекарството до желаното активно място, например, чрез инжектиране. За парентерално приложение препараши^ъдържащи синдекановият ектоучастък може да бъде осигурен на нуждаещият се от лечение пациент в комбинация с подходящи във фармацевтично отношение стерилни водни или не- водни разтворители, суспенсии и емулсии. Примери за не- водни разтворители са пропилей гликол, полиетилен гликол, растителни мазнини, рибено масло, и инжекционни органични естери. Водни носители са водата, водно- алкохолни разтвори, емулсии или суспенсии, включително солени или буферни медицински парентерални среди включителноразтвор на натриев хлорид, Рингеров разтвор, декстроза плюс разтвор на натриев хлорид, Рингеров разтвор съдържащ лактоза или фиксирани масла. Интравенозните вехикулуми включват течни и хранителни пълнители, електролитни пълнители, като тези, основани на Рингерова декстроза и др. подобни.

Синдекановият ектоучастък, съдържащ медикамент ( подходящ фармацевтичен разтвор, съдържащ терапевтично активен синдекан-1 ектоучастък) може да бъде приложен посредством катетри или помпи, поспециално когато е необходимо доставянето на ектоучастъка до определени висока концентрации. Съдържащият синдекан-1 ектоучастък медикамент може да бъде въведен подкожно или директно в меките тъкани посредством средства за имплантиране, инертни за кръвните течности. Такива съоръжения и системи за имплантиране са известни на специалистите в областта. Описана е керамична система за доставяне на протеини, например в WO 92/ 00109.

Синдекан-1 ектоучастъка, съдържащ медикамент,може да бъде въведен чрез осигуряване на такава молекула като част от химерна молекула (или комплекс) който е създаден за атакуваните специфични органи, например, като част от антитяло, което разпознава детерминанти върху атакуваната тъкан или орган или клетка, в неговото туморно или нетуморно състояние.

Подходящ във фармацевтично отношение разтвор, съдържащ синдекан-1 ектоучастъка,може да бъде прилаган и локално. Макар синдекан1 ектоучастъка да може да бъде прилаган на пациента в режим, който включва и други противоракови лекарства, оптималното приложение на синдекан-1 съдържащите състави от изобретението е особено полезно в този смисъл.

Локалното приложение се осъществява за предпочитане по един или два начина. Първо, терапевтично активният синдеканов ектоучастък може да бъде смесен с подходящи във фармацевтично отношение носители и (незадължително) подсилващи пенетрацията (проникващата способност), което да подпомогне доставянето на активният агент през кожата, за формиране на масла, емулсии, лосиони, разтвори, кремове, гелове или други подобни и полученият продукт сам по себе си може да бъде приложен на определен участък от кожата. Обратно, терапевтично активният синдеканов ектоучастък може да бъде включен в пластир или трансдермална система съгласно известни техники за получаване на такива пластири и системи.

Прилагането на пренасящо- освобождаваща форма е по- удобно за пациента когато е необходимо повтаряне на инжекциите за пролонгирани периоди от време, или при продължително излагане на туморните клетки на действието на желаният ектоучастък. При иншраВенозни форми на приложение съставите от настоящето изобретение са достатъчно силнщза да бъдат използвани за остро въздействие върху развитието на тумора.

Прилагането може да бъде локализирано директно върху клетката, ако тя е свързана с тъкан или телесен орган, или прилагането може да бъде системно, в средата,в която е намерена тази клетка, като кръв или цереброспинална течност. Системното прилагане през тялото на пациента, например, чрез въвеждане в кръвния поток, улеснява лечението на пациенти, при които туморът може да бъде на повече от едно място в тялото.

Предлагането на синдеканов ектоучастък като продукт на експресионна структура, която секрепшра ектоучастък в ефективни количества също се счита за “прилагане”. Например, прилагането чрез кръвната бариера на мозъка може да бъде постигнато с помощта на известни вирусни системи за доставяне на ДНК от синдеканов ектоучастък по начин, който експресира ектоучастъка и го секретира в екстрацелуларното пространство, като напр. в ретровирусни системи, описани във WO 93103743, WO 90109441, Breakfield, X. A. et aL, The New Biologist 3:203-218 (1991) and Huang, Q. et al, Exp. Neurol 115:303-316(1992).

Подходящ във фармацевтично отношение състав по изобретението, съдържащ синдекан-1 ектоучаспгьк_;може да бъде произведен по начин, който е сам по себе си известен, например, чрез обичайно смесване, разтваряне, лиофилизиране или аналогични процеси. Съставите от настоящото изобретение, които предоставят синдекан-1 ектоучастъка,намират приложение в тяхната способност да забавят или предотвратят растежа на тумора или повторното появяване на тумора, и тяхната способност да изменят фенотипа на клетката в такъв в по- добре диференциран етап, както у пациенти хора, така и у животни. Съставите по изобретението използват собствените механизми на тялото за развиване диференцирането на специфичните клетъчни типове в техния максимален потенциал.

Съставите и методите по изобретението не са ограничени до синдекан-1. Известно е, че синдекан-1, синдекан- 2, синдекан- 3 и синдекан- 4 съдържат сходни структури. Известно е, че диференцирането на подобни клетъчни шипове се свързва с със загубата на синдекан-1, но с появата на друг член от синдекановото семейство (Bemfield, O.,et al, Алпи. Rev. CeU Biol. 8:365- 393 (1992)). Например, когато бронхиалният епител формира зародиши, белодробният мезенхим загубва синдекан-1, но изисква синдекан- 2. В тумори от клетъчни типове, които загубват синдекан-1 при диференциацията, но експресират различен синдекан, използването на ектоучастъка от синдекана, който е експресиран в етапа на диференциация би бил показателен.

Изложените по- долу примери служат само за илюстративни цели и не ограничават обхвата на изобретението.

ПРИМЕРИ

Изложените по- долу примери илюстрират, но не ограничават изобретението.

ПРИМЕР 1

Пелеиипнни мутантни с1шде1ганлЯи

С помощта на липозомна трансфекция и последващ подбор на стабилно трансфектирани клетъчни клонове с аенетицин, както е описано от Leppa et aL, Proc. ΝαΛ Acad. Sci. USA 89: 932 (1992), се получават такива клонове на клетъчна линия S115 (виж фиг. 3), които експресират както дивият тип миши синдекан-1 (Див тип), делеционен мутант с единичен аргининоб остатък само в цитоплазматичният участък (Tail- less) или само участъка от синдекан- 1 (Екто 2; виж фиг. 3). Тези три форми и гостоприемниците са конструирани както следва.

Мишата синдекан-1 сДНК с пълна дължина, както е описана от Afa/i et aL, J. Biol Chem. 268:24215- 21222 (1993) се клонира в EcoRI сайта на Bluescript SK+ (Promega).

1) EcoRI инсерта от структурата Bluescript се клонира в EcoRI сайта от вектора pBGS (Mali etaL,J. BioL Chan. 268:24215- 21222 (1993) u ce потвърждава ориентацията. Структурата е означена като “Див тип”.

2) Мутагенен 25- базисен олигонуклеотид притежаващ последователността: 5’ G CTG TAC CGC TAG CAG AAG AAG GAC- 3’ [SEQ ID No. 1], съдържащ стоп кодон u Nhel рестрикционен сайт (подчертан) се използва за превръщане на кодона за втората аминокиселина (метионин) от цитоплазматичният участък, следвайки трансмембранният участък в стоп кодон. Мутацията се потвърждава чрез разграждане с рестрикционни ензими и дидезокси съгласуване. EcoRI инсерта на структурата Bluescript се клонира в EcoRI сайта от един пододящ за амплификация вектор (Maliet aL, J. BioL Chan. 268:24215- 21222 (1993)). Този мутант синдекан-1, съдържащ една аминокиселина (аргинин) в неговият вероятен цитоплазматичен участък, е обозначен като “Tail- less”.

Мутагенен 33- базисен олигонуклеотид

5^?- GACACCTCCCAGTACTCACTTCCrGTCCAAAAG-a^ [SEQ ID No. 2] съдържащ стоп кодон (удебелен) и Seal сайт (подчертан) се използва за превръщане на първият кодон (Е) след дибазичният чувствителен на протеаза сайт от ектоучастъка в стоп кодон. Мутацията се потвържава чрез рестрикционно разграждане и дидезокси съгласуване.Това е Bluescript- екто структурата. EcoRl инсерта от Bluescript-ekmo структурата се клонира в EcoRl сайта от pJC119R вектор (Miettinen et aL, J. Cell Sci 107: in press, (1994)). Hhol разграденият екто инссрт om pJC119Rекто структурата се свързва в Xhol сайта от рМАМпео еукариотичен трансфекционен вектор, предоставен от Clontech, Palo Alto (Leppa et aL, Proc. NatL Acad. Sci USA 89 932 (1992)) и ориентацията се потвърждава чрез рестрикционно разграждане.

ПЕИМЕЕ2

Експресия на мутагенно синдекан-1 нормализиране на малигненият растеж в S115 клетки

Див тип синдекан-1 и цитоплазматичен делеционен мутант (Tail- less) се клонират в EcoRl сайта на pBGS еукариотичен вектор на експресия (Mali etaL,J. BioL Chem. 268:24215- 21222 (1993)), но структурата на ектоучастъка се клонира в рМАМпео вектор, за получаване на ефективни нива на експресия също в присъствие на хормон (лично съобщение, S. Ala- Uoti, Turku Centre for

Biotechnology). pBGS системата не се подтиска от тестостерон. Синдекан-1 експресията на клетъчните повърхности се установява с помощта на тАЬ

281- 2 (Jalkanen et aL, J. CeUBioL 101: 976 (1985),който разпознава ектоучастъка от миши синдекан-1 ядрен протеин, и актинови филаменти се визуализират с помощта на родамин- конюаатен фалоидин.

Клетки (S115+, див шип, tail - less and Ecto 2) се култивират четири дни 8 DMEM- 5% FCS-1 mM Na- пируват с 10 пМ тестостерон, с изключение на S115- клетки, които са култивирани без тестостерон 8 DMEM- 4% DCCFCS (Dextran- Coated- Charcoal) (третиране c покрит c декстран активен въглен) елиминира ендогенните стероиди от серума с 1 mM Na- пируват. Клетките се фиксират с 0.1% Тритон- X- 100р 2% параформалдехид и се инкубира с родамин- конюаатен фалоидин (Здепа). Експресията на клетъчно повърхностният синдекан-1 се визуализира чрез инкубиране на живи клетки в продължение на 1 час върху лед с плъши тАЬ 281- 2 (разпознава миши синдекан-1 ектоучастък); след това те се фиксират с параформалдехид и свързаният тАЬ 281- 2 се визуализира с помощта на FTTC- конюаатен плъши анши- плъши IgG.

Без тестостерон S115 клетките проявяват организирани актинови филаменти, типични за тези клетки^когато са епителоидални. В присъствието на хормон, актинът е дезораанизиран и глобуларен, и експресията на синдекан-1 на клетъчната повърхност също се супресира както е показано от Leppa et aL, Cell Reg. 2,1 (1991), фиг. 4.

Див шип и Tail- less клонове, експресиращи синдекан-1 на клетъчната повърхност, възстановяват организацията на актиновите филаменти вместо лечение с тестостерон, фиг. 4.

ПРИМЕР 3

Въздействие на секретиран синдекан-1 ектоучастък върху култивирани клетки S115

Поради факта, че трансфекцията на Tail- less индуцира изменения, сходни на тези от дивият тип синдекан-1, клетките S115 се трансфектират с ектоучастъка. Продуцират се повече от 50 независими клона, секретиращи различни нива на ектоучастъка в културалната среда (виж фиг. 5,6 и 7). Клетъчната повърхност на тези клетки е оцветени слабо само за синдекан-1, но все още показват добре организирани актинови филаменти и епителоидна морфология (фиг. 4). Това води до предположението, че ектоучастък на синдекан-1 е достатъчен за възстановяване на епителоидната морфология на третирани с тестостерон S115 клетки.

За подробен анализ на Екто клоновете се измерват количества от секретираният синдекан-1 ектоучастък от културалната среда с помощта на хемилуминисцентният метод с участието на АЬ 281- 2 срещу ектоучастък от синдекан-1 ядрен протеин. Два успоредно стабилно трансфектирани клетъчни клона, секретиращи големи количества синдекан1 в културалната среда (Екто 2 и Екто 23),и два клетъчни клона с ниска експресия (Екто 15 и Екто 34) се подбират за по- нататъшен анализ (фиг. 5).

Установена е отчетлива корелация между експресията на синдекан-1 и реорганизацията на актинови филаменти в присъствие на 10 пМ тестостерон: Екто 15 и Екто 34 с ниска синдекан-1 експресия имат дезорганизиран, по- слабо глобуарен актин, но клоновете Екто 2 и Екто 23, експресиращи синдекан-1 ектоучастък, демонстриряепителоидна молфология с организирани актинови филаментни зародиши (фиг. 6). По- рано е показано, че повишената експресия на интактен синдекан-1 подтиска развитието на тумора при третирани с тестостерон S115 клетки (Leppa et al, по- горе) и понастоящем също Екто 2 и Екто 23 клонове с висока експресия на синдекан-1 ектоучастък ограничава тяхното развитие въру мек агар. Слабо експресиращите синдекан-1 ектоучастък клонове Екто 15 и Екто 34, обаче, демонстрират върху мек агар растеж, типичен за S115 клетките (фиг. 7). Експериментът върху мек агар показва, че в допълнение към морфологията, експресията на синдекан-1 ектоучастъка е достатъчна да ограничи туморното разрастване на клетките S115.

ПРИМЕР 4

Изолиране и пречистване на синдеканов ектоучастък от Екто клетъчни култури

Поради факта, че синдекан-1 ектоучастъка изглежда отговорен за супресията на поведението на малигненото разрастване на третирани с андроген клетки S115. ние събрахме кондиционирана среда от Екто клетъчни култури за изолиране на ектоучастък. Кондиционирана клетъчно културална среда се денатурира с 2М уреа и се вари преди да бъде натоварена върху DEAE- сефасел колона, добавят се 50 тМ Na- ацетат (рН= 4.5) и средата се охлажда до +4°С Колоната се промива с 0.2 М NaCl, 2М уреа, 50 тМ Naацетат (рН= 4,5) и свързаният материал се елуира с помощта на 1М NaClq 2 М уреа, 50 мМ Na- ацетат (рН= 4.5). Фракциите, съдържащи синдекан-1

Количество от синдекан-1 ектоучастък на фракции се изпитва чрез оцветяване и последващо изследване с метода на хемилуминисценция с тАЬ

281- 2 (Пример 2 и Miettinen, H.M.etaL,J. CeU Sci. in press (1944)) u ce сравняваш c количествата на известния синдекан-1 стандарт.

Ектоучастъка на синдекан-1 от култивирана среда на Екто клетки биохимично е сходна на синдекан-1 ектоучастъка, изолиран от нормални клетки на миша млечна жлеза (NMuMG). След изолиране синдекан-1 съдържимото на препарата се измерва и препарата се тестува върху третирани с хормон клетки S115. Както е показано на фиг. 8, концентрациите на DEAE- изолиран синдекан-1 ектоучастък са толкова ниски, колкото 1 пМ супресира развитието на третирани с тестостерон S115 клетки (фиг. 8). Същата концентрация само слабо инхибира растежа на NMuMG клетките, които служат като нормални епителни клетки (фиг. 8). Синдекан-1 ектоучастъка също е изолиран от културалната среда на NMuMG клетки, и с този препарат също, 1 пМ концентрация инхибира развитието на третирани с хормон S115 клетки (фиг. 9). Третирането на изолиран с DEAE ектоучастък с хепаришиназа тотално унищожава инхибиращата развитието активност на тези препарати (фиг. 9), което предполагаме същински протеин на синдекан-1 като такъв не е включен.

Изолираният с DEAE синдекан-1 ектоучастък по- нататък се пречиства с помощта на mA 281- 2 имуноафинитетна колона; изолиран с DEAE синдекан-1 ектоучастък в PBS се натоварва на тАЬ 281- 2- Сефарозна Cl- 4В имуноафинитетна колонафакто е описано в Jalkanen etaL,J. Cell Biol. 105:3087 (1987), и свързаният материал се елуира с 50 тМ триетиламин (рН= 11.5). фракциите, съдържащи синдекан-1 ектоучастък се диализират срещу дестилирана вода с последващо лиофилизиране. След това синдекан-1 ектоучастъка се суспендира 8 DMEM (Gibco) и се изпитва количеството, както е описано по- горе. 0ново, при концентрации 1 пМ от този имуноафинитетно пречистен синдекан-1 ектоучастък, се наблюдава инхибицията на развитието на третирани с тестостерон S115 клетки и се вижда само слаб ефект върху NMuMG клетките (фиг. 10). От друга страна, хепарин сулфат (HS) илихондроитин сулфат (CS) гликозаминогликанови вериги самостоятелно не супресират S115 клетъчното развитие,дори ако се използва стократно по- висока концентрация в сравнение със синдекан-1 ектоучастъка (фиг. 11).

ПРИМЕР 5

Въздействие на изолиран синдекан-1 ектоучастък Върху култивирани клетъчни линии

Инхибиторният ефект на изолиран синдекан- 1 ектоучастък е тестуван също и върху няколко други клетъчни линии. Те включват недостатъчно диференцирани карциномни линии от сквамозни клетки (СагВ), туморни клетки от човешка млечна жлеза (MCF- 7; ATCC НТВ 22), S115 клетки с (S115+) и без хормон (S115-), NIH ЗТЗ фибробласти (ATCC CRL 1658), нормални епителни клетки от млечна жлеза (NMuMG; ATCC CRL 1636) и човешки кератоцитни клетки (НаСаТ; фиг. 12).

Клетките се култивират и анализират,както е описано на фиг. 8 в следните среди по време на посочените периоди от време: СагВ клетки (М. Quintanilla, К. Brown, М. Ramsden, A. Baimam, Nature 322, 78 (1991)) се култивират в НАМ- F12-10% FCS за четири дни; MCF- 7 клетки в DMEM5% FCS заместен с 10 пМ есшрадиол (ЕД и 10 pg/ ml инсулин за 4 дни; S115+ и S115- клетки се култивират,както на фиг. 3 за три дни; NIH ЗТЗ клетки в DMEM- 5% FCS за 4 дни, NMuMG и НаСаТ клетки в 10% FCS- DMEM за 4 дни. Тъй като S115- клетките притежават по- слаба скорост на растеж от

S115+, 3000 S115- клетки (други клетъчни линии, 1500 клетки) пропорционално се добавят към кладенчето, така че да осигурят сравними резултати с клеткшпе S115+. поради това, за S115- клетки, 3000 клетки се прехвърлят в паничката противоположно на 1500 клетки за другите проби.

Тези клетъчни линии, които формират тумори (CarB, MCF- 7, S115+), показват силна супресия на растежа,когато са подложени на синдекан-1 ектоучастък при концентрация 1пМ (фиг. 12). В противоположност на това, се наблюдава само умерено или отсъствие на инхибиране с останалите тестувани клетъчни линии (S115-, NH ЗТЗ, NMuMG, НаСаТ; фиг. 12), които всички се отнасят като не- туморогенни. Излагането на въздействие на хормони удвоява скоростта на растеж на S115 клетките (leppa et al., погоре), но ако в културата се включи синдекан-1 ектоучастък, растежът на клетките S115 без андроген е 5.4 пъти по- висок от растежа на същите S115 клетки с тестостсрон (фиг. 12). Това се дължи на инхибирането на “малигненото” поведение на S115+ клетките и ненарушеният растеж на епителоидни S115- клетки.

ПРИМЕР 6

Супресия на тумор in vivo със синдекан-1 ектоучастък

Екто структурата е създадена^както е описано в по- ранни примери с помощта на миша синдекан-1 сДНК в пълната й дължина, клонирана във вектора Bluescript SK+ (10) и мутагенени 33- базисен олигонуклеотид

5’- GACACCTCCCAGTACTCACTTCCTGTCCAAAAG-3’ [SEQ ID No.: 2], съдържащ стоп кодон (удебелен) и Seal сайт (CAGTAC) за превръщане на първата аминокиселина (Е) след дибазичният протеин- сенситивен сайт от ектоучастъка до стоп кодона. Мутацията е подбрана чрез рестрикционно разграждане и потвърдена чрез дидезокси съгласуване. Дивият тип синдекан1 и цитоплазматичният делеционен мутант се клонира в EcoRI сайт от pBGS еукариотичен вектор на експресия (Afafl etal,]. Biot Chem. 268:2421524222 (1993)). Екто мутантът се свързва в Xhol сайта от рМАМпео еукариотичен трансфекционен вектор (LeppaetaL, PNAS (1992) 89, 932- 936), тъй като ние знаем ,че рМАМпео трансфекционната работа за S115 клетки в биореакторна система (лично съобщение, Sari Ala- UotUa, Turku Centre for Biotechnology). SI 15 клетки се трансфектират c помощта на липозомна трансфекция и последващ подбор с Geneticin ,както е описано по- рано (Leppa etal., PNAS (1992) 89, 932- 936).

SI 15 клетките и клетъчните трансфекционни клонове се култивират в DMEM- 5% FBS- 1 тМ Na- пируват с 10 пМ тестостерон, освен за S115клетки, които се култивират без тестостерон в DMEM- 4% DCC- FBS (Dextran- Coated- Charcoal третиран етален телешки серум, елиминира ендогенни стероиди от серума) с 1 тМ Na- пируват.

За туморния растеж на сляти култури се въздейства с трипсин, промиват се с DMEM и се изброяват с брояч (Coulter Electronics). Клетките се ресуспендират в DMEM при плътност от 5 х 10⁷/ ml и се съхраняват върху лед до инжектиране. Мъжки голи мишки без тимусна жлеза (пи/ пи BALB/cABom) от 6 до 8 седмична възраст (Bomholtgard, Rye, Denmark) се инжектират субкутанно с 0.2 ml клетъчна суспенсия. Едновременно се имплантира силасшик тестостеронова капсула. Голите мишки се наблюдават редовно за развитието на тумора и размера на туморите се измерва в интервали от в две перпендикулярни дименсии. Когато животните бъдат умъртвени, белият дроб и черният дроб се изследват за евентуална поява на метастази. Размерите на тумора се измерват на 6- тия, 11 и 15- ти ден след инжектирането и се оцветяват както на фигура 13.

Трансфектираните с ектоучастъ клетки формират само остра възпалителна реакция и не показват развитие на тумор, противно на дивия тип клетки, които формират бързо развиващи се тумори. Този експеримент показва ефикасността на синдекан-1 ектоучастъка като тумор- супресорен агент in vivo.

Всички цитирани тук литературни източници са включени в приложената литературна справка. Сега, след пълното описване на изобретението лесно може да се разбере от специалиста в областта, че обхватът може да бъде очертан в широк и еквивалентен интервал от условия! параметри и др. подобни, без да се наруши духа или обема на изобретението или всеки негов вариант на изпълнение.

СЕКВЕНЦИОНЕН ЛИСТИНГ (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ (i) ЗАЯВИТЕЛ (A) ИМЕ: Jalkanen, Markku (B) УЛИЦА: Rauvolantie (C) ГРАД: PHSPANRISTI (E) ДЪРЖАВА: FINLAND (F) ПОЩЕНСКИ КОД (ZIP): FIN- 20760 (A) ИМЕ: Mali, Markku (B) УЛИЦА: Inkerccntic 176 (C) ГРАД: SALO (E) ДЪРЖАВА: FINLAND (F) ПОЩЕНСКИ КОД (ZIP): FIN- 24280 (ii) ЗАГЛАВИЕ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО: СУПРЕСИЯ HA РАСТЕЖА HA ТУМОРНИ КЛЕТКИ ПОСРЕДСТВОМ СИНДЕКАН-1 ЕКТОУЧАСТЪК (iii) БРОЙ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ: 2 (iv) КОМПЮТЪРНО ЧИТАЕМА ФОРМА:

(A) СРЕДЕН ТИП: флопи диск (B) КОМПЮТЪР: IBM PC compatible (C) ОПЕРАТИВНА СИСТЕМА: PC- DOS/ MS- DOS (D) СОФТУЕР: Patentin Release #L 0, Version #1.25 (EPO) (v) ДАННИ ЗА ЗАЯВИТЕЛЯ:

НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: WO ДА СЕ ПОПЪЛНИ (vi) ДАННИ ЗА ПО- РАННО ЗАЯВЯВАНЕ:

(А) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: US 08/258862 (В) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 13-JUN-1994 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 1:

(ί) СЕКВЕНЦИОННИ ХАРАКТЕРИСТИКИ:

(A) ДЪЛЖИНА: 25 двойки бази (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: и двете (D) ТОПОЛОГИЯ: линеарна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП : ДНК (геномна) (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: няма (iii) БЕЗСМИСЛЕН OCT: няма (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 1:

GCTGTACCGC TAGCAGAAGA AGGAC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 2:

(i) СЕКВЕНЦИОНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ (A) ДЪЛЖИНА: 33 двойки бази (B) ТИП : нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: и двете (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (iii) ХИПОТЕТИЧНОСТ: няма (iii) БЕЗСМИСЛЕНОСТ: няма (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА SEQ ID N0:2:

GACACCTCCC AGTACTCACT TCCTGTCCAA AAG

Claims

1. Метод за забавяване растежа на туморни клетки, който включва осигуряване на достатъчни нива от синдеканов ектоучастък в екстрацелуларното пространство на дадената клетка.

2. Метод съгласно претенция 1, където посочената клетка е подбрана от група, състояща се от епителни клетки, мезенхимни клетки, пре- В клетки и плазмени клетки.

3. Метод съгласно претенция 2, където посочената клетка е подбрана от групата, включваща клетка на млечна жлеза, клетка на ендометриума и клетка от простата жлеза

4. Метод съгласно претенция 3, където посочената клетка е стероидотговорна.

5. Метод съгласно претенция 4, където посоченият стероид е естроген или андроген.

6. Метод съгласно претенция 1, където посочената клетка е клетка на човек.

7. Метод съгласно претенция 6, където синдекановият ектоучастък е човешкия синдекан-1 от фигура 1.

8. Метод съгласно претенция 7, където посоченият ектоучастък включва аминокиселини 18- 231 от фигура 1, но не включва трансмембранен или цшпоплазматичен участък,както е показано в аминокиселини 252- 310 от фигура 1.

9. Метод съгласно претенция 8, където посоченият ектоучастък включва аминокиселини 18- 231 от фигура 1.

10. Метод за лечение на пациенти, нуждаещи се от въздействие за супресия на туморен растеж, който включва придаване върху дадения пациент на състав, включващ ефикасни количества синдеканов ектоучастък в ектрацелуларното пространство на посочената клетка.

11. Метод съгласно претенция 10, където посочената клетка е подбрана от групата, състояща се от епителни клетки, мезенхимни клетки, пре- В клетки и плазмени клетки.

12. Метод съгласно претенция 11, където посочената клетка е подбрана от групата, състояща се от клетки на млечната жлеза, клетки от ендометриума и клетки на простатата жлеза.

13. Метод съгласно претенция 12, където посочената клетка е стероид- отговорна.

14. Метод съгласно претенция 13, където посоченият стероид е естроген или андроген.

15. Метод съгласно претенция 10, където посочената клетка е човешка клетка.

16. Метод съгласно претенция 15, където посоченият синдеканов ектоучастък е човешкият синдекан-1 от фигура 1.

17. Метод съгласно претенция 16, където посоченият ектоучастък включва аминокиселини 18- 231 от фигура 1, но не включва трансмембранен или цитоплазматичен участък, както е показано в аминокиселини 252- 310 от фигура 1.

18. Метод съгласно претенция 17, където посоченият ектоучастък включва аминокиселини 18- 251 от фигура 1.

19. фармацевтичен състав за прилагане на пациент, който включва протеин, притежаващ участък, състоящ се от синдекановият ектоучахлпък.

20. фармацевтичен състав съгласно претенция 19, където посоченият синдекан е човешки и притежава последователността, показана на фигура 1.

21. фармацевтичен състав съгласно претенция 20, където посоченият ектоучастък включва аминокиселини 18- 231 от фигура 1, но не включва трансмембранният или цитоплазматичен участък^както е показано в аминокиселини 252- 310 от фигура 1.

22. фармацевтичен състав съгласно претенция 20, където посоченият ектоучастък включва аминокиселините 18- 251 от фигура 1.