HU216631B

HU216631B - Trombózisellenes gyógyszerkészítmény és eljárás előállítására

Info

Publication number: HU216631B
Application number: HU9800503A
Authority: HU
Inventors: Jan-Erik Löfroth; Anna-Lena Ungell
Original assignee: Astra Aktiebolag
Priority date: 1994-12-02
Filing date: 1995-11-29
Publication date: 1999-07-28
Also published as: EP0799052A1; CN1168635A; AU689994B2; FI972332A; IS4483A; NO972475D0; CZ147097A3; ATE208628T1; FI972332A0; DE69523943D1; WO1996016671A1; DE69523943T2; IL116153A0; NZ297118A; CA2206459A1; IL116153A; EE03338B1; EP0799052B1; AU4191596A; AR002254A1

Abstract

A találmány tárgyát a HOOC–CH2–(R)Cgl–Aze–Pab képletű újtrőmbininhibitőrt és egy vagy több felszívódást főkőzó segédanyagőt,példáűl felületaktív anyagőt, így alkil-glikőzidőt, cűkőr-zsí sav-észtert, tővábbá zsírsavat, peptid-zsírsav-származékőt, kelátképzőszert, etilénglikől- vagy pőliakrilát-pőlimert, valamint adőtt esetbenpűffert tartalmazó gyógyszerkészítmények és az előállítás kra szőlgálóeljárás képezi. ŕ

Description

A találmány tárgyát a HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab képletű, új trombininhibitort egy vagy több, a felszívódást elősegítő segédanyaggal kombinált formában tartalmazó új gyógyszerkészítmény és ennek és a hatóanyagnak az előállítására szolgáló eljárás képezi.

A véralvadás kulcsfontosságú folyamat mind a hemosztázisban (azaz a megsérült véredények következtében fellépő vérvesztés megakadályozásában), mind a trombózis (egy ér vérrög okozta kóros elzáródása) kialakulásában. A véralvadás egymással összefüggő enzimreakciók sorozatának eredményeképpen jön létre, ennek a bonyolult eseményláncolatnak egyik utolsó lépése a proenzim, azaz a protrombin átalakulása aktív enzimmé, vagyis trombinná.

A trombin kétségtelenül központi szerepet játszik a véralvadásban, ugyanis ez az enzim aktiválja a vérlemezkéket, a fibrinogént fibrinmonomerré alakítja, amely azután spontán folyamatban rostokká polimerizálódik, azonfelül aktiválja a XIII. faktort, amely viszont a fibrinrostok térhálósításával oldhatatlan fibrinné alakítja át a polimert. A trombin továbbá pozitív visszacsatolás révén aktiválja az V. és VIII. faktort. A trombin inhibitorai ezért a vérlemezkék aktiválásának, valamint a fibrin képződésének és stabilizációjának gátlása folytán hatékony antikoagulánsok. A pozitív visszacsatolási mechanizmus gátlásával ezek az inhibitorok a koagulációhoz és trombózishoz vezető eseményláncolat korai fázisában képesek kifejteni hatásukat.

A peptidszerkezetű vagy peptidszerű trombininhibitorok, hasonlóan sok más pepiidhez vagy ilyen típusú vegyülethez, az élő szervezetbe juttatva csak korlátozott mértékben vagy jelentős ingadozást mutatva szívódnak fel. Ez annak tulajdonítható, hogy különféle fizikai és metabolikus tényezők, például az enzimatikus bomlás, a komplexképződésre való hajlam a készítmény vagy a biológiai környezet komponenseivel, a korlátozott transzportlehetőség és még folytathatnánk a sort, mind befolyásolják valamilyen módon, rendszerint gátként állják útját az ilyen anyagok felszívódásának. A találmány szerinti gyógyszerkészítményekkel kapcsolatos egyik célunk tehát, hogy átsegítsük a hatóanyagot ezeken a gátakon, és így javítsuk, illetve reprodukálhatóvá tegyük a felszívódást. A készítménynek azokat a komponenseit, amelyek ilyen módon befolyásolják, vagyis elősegítik a hatóanyag felszívódását, felszívódást fokozó vagy hatásfokozó szereknek nevezzük.

A felszívódást fokozó szerek gyógyszerkészítményekben való alkalmazásáról a szakirodalomban jó néhány cikket és összefoglalót találunk. A legkülönbözőbb típusú vegyületekről, például felületaktív anyagokról, lipidekről, kelátképző anyagokról és polimerekről írták le, hogy a felszívódást javító tulajdonságúak. Széles körű áttekintést nyújtanak ebben a témában E. J. van Hoogdalem és munkatársai [Pharmac. Theor., 44, 407-443 (1989)]; S. Muranishi [Crit. Rév. Ther. Drug Carrier Syst., 7, 1-33 (1990)]; valamint E. S. Swenson és W. J. Curatolo [Adv. Drug Deliv. Rév., 8, 39-92 (1992) és „Drug Absorption Enhancement” (Harwood Academic Publishers, 1994, szerkesztő: A. B. G. de Boer)].

Azt találtuk, hogy a terápiásán hasznosítható, HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab képletű, új trombininhibitor-hatóanyag felszívódását kedvezően megváltoztathatjuk, ha olyan készítmény formájában alkalmazzuk, amely a hatóanyagon kívül a felszívódást fokozó szert is tartalmaz.

A fentiek alapján a találmány tárgyát képezik tehát a HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab képletű, új trombininhibitort a felszívódást fokozó egy vagy több segédanyaggal és adott esetben egy gyógyszerészetileg elfogadható vivőanyaggal kombinált formában tartalmazó gyógyszerkészítmények, valamint azok az eljárások, amelyekkel ilyen készítmények előállíthatok.

A javított tulajdonságú készítmények előállításának különféle, a felszívódást fokozó segédanyagok - anélkül, hogy ezekre korlátoznánk, például felületaktív anyagok, lipidek, egyéb hatóanyagok és polimerek alkalmazása képezi az alapját. Ilyen segédanyagok felhasználásával a készítmény tulajdonságait illetően pozitív változást érhetünk el, például jobb vagy egyenletesebb lesz a hatóanyag felszívódása különféle alkalmazási módok, így orális, rektális, bukkális, nazális, pulmonális, inhalációs vagy egyéb alkalmazás esetén, illetve ilyen szerek kombinációja pozitív szinergetikus hatást eredményezhet, ami még fokozottabb felszívódásban nyilvánulhat meg.

A találmányunkban alkalmazott jobb felszívódást eredményező hatást egy vagy több felszívódást fokozó segédanyagnak a készítményben történő felhasználásával érhetjük el. Ilyen segédanyagok, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk, a következők: nemszteroid típusú gyulladásgátlók és származékaik, így nátrium-szalicilát, nátrium-(5-metoxi-szalicilát), indometacin és diklofenak; felületaktív anyagok, így a nemionos felületaktív anyagok közül például szorbitán-észterek (Span-sorozat), poliszorbátok (Tween-sorozat), polioxietilezett glikolmonoéterek (hasonló, mint a Brij-sorozat), polioxilezett alkil-éterek (Myrj-sorozat), polioxietilezett alkil-fenolok (a Triton-sorozathoz hasonló), a cukor-glikozidokhoz hasonló alkil-glikozidok, például dodecil-maltozid, cukor-zsírsav-észterek, például szacharóz-laurát, szacharóz-monosztearát és hasonlók, valamint szaponinek; amfolitikus felületaktív anyagok, például betainek; anionos felületaktív anyagok, például szulfátéit zsíralkoholok, szulfátéit polioxietilezett alkoholok vagy más hasonlók, így dioktil-(szulfo-szukcinát); kationos felületaktív anyagok, például ammóniumvegyületek; epesavak, például dihidroxi-epesavak, így nátrium-dezoxikolát, trihidroxi-epesavak, így nátrium-glikokolát, és fuzidátok, például nátrium-dihidrofuzidát; szappanok és zsírsavak, valamint sóik, például oktánsav, dekánsav és nátrium-dekanoát; lipidek, például gliceridek, így gliceril-monooktanoát és glicerin-monooleát; foszfolipidek, például DPPC és DMPC; növényi olajok, például szójaolaj és napraforgóolaj; enaminok, például DLfenilalanin és etil-aceto-acetát-enamin; kelátképző anyagok, például EDTA, EGTA és citromsav; fenotiazinok, például klórpromazin; kamitin és peptidek zsírsavszármazékai, például palmitoil-DL-kamitin és N-mirisztoilL-prolil-L-propil-glicinát; egyéb anyagok, például azon

HU 216 631 Β (lauro-kaprám), konkanavalin A; foszfát- és foszfonátszármazékok, így DL-a-glicerofoszfát, 3-amino-lhidroxi-propilidén-l,l-difoszfonát, dietil-maleát és dietil-[(etoxi-metil)-malonát]; Maillard-reakcióból származó termékek, például glükóz-lizin reakciótermékek; polimerek, például poliakrilsavak, így Carbopol® (polikarbofd); kitozán és kitozánszármazékok; blokk-kopolimerek, például poloxamerek, poloxaminok és meroxapolok.

A hatásfokozó szerek megfelelő, tervezett kombinációira a korlátozás szándéka nélkül példaként a következőket adhatjuk meg: lipidek és epesavak, például glicerin-monooleát és nátrium-taurokolát; lipidek és foszfolipidek, például közepes lánchosszúságú gliceridek és lecitinek; felületaktív anyagok és olajok, például szacharóz-zsírsav-észterek és szójaolaj; és polimerek és lipidek, például polikarbofil és glicerin-monooleát.

Gyógyszerforma szerint a készítmény lehet a jól ismert gyógyszertechnológiai eljárásokkal előállított szilárd, félig szilárd vagy folyékony készítmények valamelyike. A hatóanyag a parenterális beadásra szánt készítmény tömegének általában a 0,1 és 99%, de többnyire 0,1 és 50% közötti mennyiségét teszi ki, míg ugyanez az arány az orálisan adható készítmények esetében 0,2-90 tömeg%.

A terápiás hatóanyag testtömegre számított napi dózisa, gyógykezelés céljából orálisan alkalmazva, embernél hozzávetőleg a 0,001 és 100 mg/kg közötti tartományba esik, parenterális beadás esetén pedig 0,001-50 mg/kg.

A hatásfokozó szer vagy a hatásfokozó szerekből összeállított adalékanyag-keverék aránya a készítményben rendszerint 0,1 és 99 tömeg% közötti értéknek felel meg. Az így kapott készítmény különböző mechanizmusok eredményeként megnöveli a felszívódó hatóanyag mennyiségét és/vagy minimálisra csökkenti a felszívódásban korábban tapasztalt ingadozásokat.

A találmány szerinti, a HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab képletű dipeptidet és különféle, a felszívódást fokozó segédanyagokat tartalmazó gyógyszerkészítmény szándékunk szerint mind az artériás, mind a vénás trombus-embólia megelőzésére és kezelésére alkalmas lehet.

A találmány tárgya továbbá eljárás a fent tárgyalt gyógyszerkészítmény előállítására, ami abból áll, hogy a hatóanyag, azaz a HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab képletű vegyület oldatához a felszívódást fokozó segédanyagokat adunk, adott esetben az oldat pH-ját puffer hatású anyaggal gyógyszerészetileg elfogadható értékre, például 5 és 9, előnyösen 7 és 8 közötti értékre, mondjuk 7,4-re állítjuk, majd a komponenseket alaposan összekeverjük. A puffer hatású anyag például foszfátpuffer, így dikálium-hidrogén-foszfát vagy dinátrium-hidrogén-foszfát lehet. Más, a gyógyszergyártásban hagyományosan alkalmazott, a képzett szakemberek által jól ismert összetevőket, így vivőanyagokat, valamint az izotóniás oldatok készítéséhez használatos anyagokat, így nátrium-kloridot szintén használhatunk a találmány szerinti gyógyszerkészítmények előállításához.

Az 1. ábrán bemutatjuk, hogy milyen mértékben változik meg az intesztinális membránnak a HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab képletű vegyületre vonatkozó átbocsátóképessége két különböző, a felszívódást fokozó szer hatására.

Az itt következő kísérleti részben szemléltetés céljából ismertetjük a mérési módszereket, a HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab képletű, új vegyület, valamint a kiindulási vegyületek előállítását, majd példákat adunk meg a találmány szerinti gyógyszerkészítményekre.

A tömegspektrumokat Finnigan MÁT TSQ 700, elektrospray egységgel felszerelt háromlépcsős kvadrupol-tömegspektrométeren vettük fel.

Az Ή-NMR- és ¹³C-NMR-spektrumok felvételéhez BRUKER AC-P 300 és BRUKER AM 500 spektrométerek álltak rendelkezésünkre. Az elsőként említett készülék 500,14 MHz (Ή) és 125,76 MHz (^l3C) frekvencián dolgozott, míg az utóbbi készülék esetében ezek a frekvenciaértékek: 300,13 MHz és 75,46 MHz.

A hozzávetőleg 10-50 mg tömegű mintákat 0,6 ml oldószerben oldottuk fel, oldószerként a következők valamelyikét használtuk: deuterokloroform (CDC1₃, izotóptisztaság: >99,8%), deuterometanol (CD₃OD, izotóptisztaság: >99,95%) és nehézvíz (D₂O, izotóptisztaság: >99,98%). Az oldószereket a Dr. Glaser AG, Basel cégtől vásároltuk.

Az Ή- és ^l3C-jelek kémiai eltolódásának értékeit deuterokloroformban és deuterometanolban tetrametilszilán külső standardra vonatkoztatva adjuk meg. Nehézvízben az Ή-jelek kémiai eltolódását 3-(trimetil-szilil)d₄-propionsav nátriumsójára vonatkoztattuk, míg a ^l3Cjelek kémiai eltolódása esetében a vonatkoztatási alap 1,4-dioxán (67,3 ppm), mindkettőt külső standardként használtuk. Külső standarddal végzett kalibrálásnál némely esetben a belső standardhoz viszonyítva jelentéktelen eltérés volt tapasztalható a kémiai eltolódásokban, ennek mértékét azonban az Ή-jelek esetében 0,02 ppm, a ^l3C-jelek esetében 0,1 ppm alattinak találtuk.

A prolint vagy prolinhoz hasonló aminosavat tartalmazó peptidszekvenciák esetében gyakran az 'H-NMRspektrumok a rezonanciajelek két sorozatát tartalmazzák. Ez megfelel annak a ténynek, hogy ahol a prolin a peptidkötés nitrogénatom felőli részéhez tartozik, ott a savamidkötés körüli rotációból adódóan két konformer létezhet, ezeket a konformereket cisz és transz előtagokkal jelöljük. Azoknál a vegyületeknél, amelyek képletében az (R)Cha-Aze- és (R)Cha-Pic-szekvenciák előfordulnak, ezek a szekvenciák rendszerint olyan cisztransz egyensúlyt hoznak létre, amelyben az egyik konformer a többségi (>90%) konformer. A hasonló szerkezetű (R)Cgl-Aze-szekvenciát tartalmazó vegyületeknél csak a többségi rotamerhez tartozó kémiai eltolódásokat adjuk meg az Ή-NMR-spektrumban. A kisebbségi rotamerhez tartozó jelek csak akkor szerepelnek az NMR-spektrumokban, ha azok jól megkülönböztethetően elkülönülnek. Ugyanez vonatkozik a deuterokloroformban felvett spektrumok esetében az NH-jelekre, vagyis csak az élesen elkülönült jeleket tüntetjük fel az NMR-spektrumokban. Ebből következik, hogy

HU 216 631 Β némelyik köztiterméknél a spektrumból kiolvasható protonok száma kisebb a képletből számítottnál.

A flash-kromatográfiához 40-63 pm (230-400 mesh) szemcseméretű, Merck Silica gél 60 adszorbenst használtunk, a nyomást levegővel biztosítottuk.

A liofilizálást egy Leybold-Heraeus (model Lyovac GT 2) készülékkel végeztük.

A képletekben használt rövidítések jelentései: Hze=(S)-2-azetidinkarbonsav; Cg/=(S)-ciklohexilglicin; Paó=4-(amino-metil)-benzamidin; Pgl=(S)fenil-glicin.

1. példa

A kiindulási vegyületek előállítása

a) 4-(Amino-metil)-N-[(benzil-oxi)-karbonil]benzamidin [H-Pab(Z)]

i) 4-(Azido-metil)-benzonitril

20,23 g (0,31 mól) nátrium-azidot feloldunk 50 ml vízben, azután szobahőmérsékleten hozzáadjuk 49,15 g (251 mmol) 4-ciano-benzil-bromid 200 ml N,Ndimetil-formamiddal készült oldatához. Exoterm reakció játszódik le, majd utána, 1,5 óra elteltével a reakcióelegyet 200 ml toluollal (vigyázat! potenciálisan robbanásveszélyes anyagok kiválásának az elkerülése végett a toluolt a víz hozzáadását megelőzően adjuk a reakcióelegyhez) és 500 ml vízzel meghígítjuk. A vizes fázist még kétszer 50 ml toluollal extraháljuk, azután az egyesített szerves oldószeres extraktumot kétszer 50 ml vízzel és telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, végül szűrjük. Ezt az oldatot használjuk fel a következő lépéshez. H-NMR-spektrum (300 MHz, CDC1₃, δ): 4,4 (s, 2H), 7,4 (d, 2H), 7,7 (d, 2H).

ii) 4-(Azido-metil)-benzamidin

A fenti i) lépésben kapott, mintegy 200 ml oldat és 250 ml vízmentes etanol -5 °C-os elegyén addig buborékoltatunk át hidrogén-kloridot, amíg az telítődik. Az elegyet ezután 24 óra hosszáig 8 °C-on állni hagyjuk, utána az oldószer nagyobb részét elpárologtatjuk, majd vízmentes dietil-étert adunk a maradékhoz. A levált fehér kristályokat kiszűijük, azután feloldjuk 1800 ml etanolos ammóniaoldatban. 48 óra múlva a reakcióelegyet csaknem szárazra pároljuk, majd a párlási maradékhoz 200 ml 3,75 M nátrium-hidroxid-oldatot adunk, és a színtelen kristályok formájában kivált 4-(azido-metil)-benzamidint szűrőre gyűjtjük. Az így kapott 4-(azido-metil)-benzamidin tömege 22,5 g, az összesített kitermelés 51%. Etil-[4-(azido-metil)-benzimidát]-hidroklorid: H-NMR-spektrum (500 MHz, CD₃OD, δ): 1,6 (t, 3H), 4,5 (s, 2H), 4,65 (q, 2H), 4,8 (széles s, 2H), 7,6 (d, 2H), 8,1 (d, 2H).

4-(Azido-metil)-benzamidin:

H-NMR-spektrum (500 MHz, CD₃OD, δ): 4,3 (s, 2H), 5,7 (széles s, 3H), 7,3 (d, 2H), 7,6 (d, 2H) ¹³C-NMR-spektrum (125 MHz, CDC1₃, δ): 165,5 (amidin szénatom) iii) 4-(Azido-metil)-N-[(benzil-oxi)-karbonil]benzamidin

A fenti ii) pontban leírtak szerint kapott kristályos terméket feloldjuk 500 ml metilén-dikloridban, az oldatot kálium-karbonáton szárítjuk és szüljük, majd hozzáadunk 27 ml (194 mmol) trietil-amint. Ezt követően jeges fürdőbe helyezzük a reakcióelegyet, azután keverés közben, lassú ütemben beadagolunk 25 ml benzil-(klórformiát)-ot. 30 perc elteltével további 2 ml benzil-(klórformiát)-ot adunk az elegyhez, még 30 percig folytatjuk a kevertetést, majd víz hozzáadása után a vizes fázis pH-ját 2 M sósavval 7-re állítjuk. A szerves fázist vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, vákuumban bepároljuk, végül a 4-(azido-metil)-N-[(benzil-oxi)-karbonil]-benzamidint dietil-éter, metilén-diklorid és hexán elegyéből kikristályosítjuk.

‘H-NMR-spektrum (500 MHz, CDC1₃, δ): 4,4 (s, 2H),

5.3 (s, 2H), 6,3-7,0 (széles s, 1H), 7,3-7,4 (m, 5H), 7,5 (d, 2H), 7,9 (d, 2H), 9,3-9,6 (széles s, 1H). ¹³C-NMR-spektrum (125 MHz, CDC1₃, δ): 167,5 (amidin szénatom) iv) 4-(Amino-metil)-N-[(benzil-oxi)-karbonil]benzamidin [H-Pab(Z)]

A fenti iii) pontban leírtak szerint előállított 4-(azidometil)-N- [(benzil-oxi)-karbonil]-benzamidint feloldjuk 160 ml tetrahidrofuránban, majd az oldathoz szobahőmérsékleten 26,3 g (100 mmol) trifenil-foszfint adunk. 16 óra elteltével további 6,6 g (25 mmol) trifenil-foszfint adunk a reakcióelegyhez, az oldatot még 4 óra hosszat állni hagyjuk, majd az oldószert vákuumban elpárologtatjuk. A párlási maradékot feloldjuk metiléndikloridban, 2 M sósavval extraháljuk a terméket, és a vizes extraktumot metilén-dikloriddal mossuk, majd 3,75 M nátrium-hidroxid-oldattal meglúgosítjuk. A lúgos elegyet most metilén-dikloriddal extraháljuk, azután az oldószeres extraktumot kálium-karbonáton szárítjuk és vákuumban bepároljuk. Ily módon 20 g sárga olajat kapunk, amely állás közben megszilárdul, a kitermelés a kiindulási ciano-benzil-bromidra számítva 28%. H-NMR-spektrum (500 MHz, CDC1₃, δ): 1,2-2,2 (széles s, 2H), 3,8 (s, 2H), 5,2 (s, 2H), 7,2-7,35 (m, 5H),

7.4 (d, 2H), 7,8 (d, 2H), 9,1-9,6 (széles s, 1H). ¹³C-NMR-spektrum (125 MHz, CDC1₃, δ): 164,6 és 168,17 (amidin szénatom és karbonil szénatom).

b) H-Aze-OMe-hidroklorid

A címben megnevezett vegyületet a D. Seebach és munkatársai által leírt eljárással (Liebigs Ann. Chem., 1990, 687) állítottuk elő.

c) Boc-(R)Cgl-OH

32,6 g (0,13 mmol) Boc-(R)Pgl-OH 300 ml metanollal készített oldatához 5 g, alumínium-oxidra lecsapott ródiumkatalizátort adunk, majd az oldatot 5,2 és 2,8 MPa közötti nyomáson 3 napon át hidrogénezzük. A reakcióidő leteltével az elegyet megszűrjük, és a szűrletet bepároljuk. Mivel a párlási maradék NMRspektruma azt mutatja, hogy a címben megnevezett vegyület mintegy 25%-nak megfelelő arányban metil-észter formájában van jelen, a nyersterméket feloldjuk 500 ml tetrahidrofuránban, és az oldathoz 20 g lítium-hidroxidot adunk. Ezután az elegyet éjszakán át kevertetjük, másnap a tetrahidrofuránt elpárologtatjuk, majd a visszamaradó vizes fázist kálium-hidrogén-szulfáttal megsavanyítjuk, és egymás után háromszor etil-acetáttal extraháljuk. Az egyesített szerves oldószeres extrak4

HU 216 631 Β tumot vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, végül bepároljuk. Ilyen módon 28,3 g, a címben megnevezett vegyületet kapunk, a kitermelés 83%. 'H-NMR-spektrum (300 MHz, CDC1₃, δ): 0,9-1,7 (m, 20H), 4,0-4,2 (m, 1H), 5,2 (d, 1H).

d) Boc-(R)Cgl-Aze-OH

i) Boc-(R)Cgl-Aze-OMe

3,86 g (15 mmol) Boc-(R)Cgl-OH, 2,77 g (15 mmol) H-Aze-OMe-hidroklorid, 2,75 g (22,5 mmol) 4-(dimetil-amino)-piridin (DMAP) és 40 ml acetonitril elegyéhez 5 °C-on, keverés közben 3,16 g (16,5 mmol) l-[3(dimetil-amino)-propil]-3-etil-karbodiimid-hidrokloridot (EDC) adunk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten keveijük 48 órán át, utána bepároljuk, és a párlási maradékot 150 ml etil-acetát és 20 ml víz keverékében újból feloldjuk. A szerves fázist elválasztjuk, kétszer 20 ml 0,5 M kálium-hidrogén-szulfát-oldattal, kétszer 10 ml telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, 10 ml vízzel és 10 ml telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, végül az oldószert elpárologtatjuk. Az így kapott 4,91 g termék a címben megnevezett vegyület, a kitermelés 92%. Ezt az anyagot minden további tisztítás nélkül felhasználjuk a következő reakciólépéshez.

'H-NMR-spektrum (500 MHz, CDC1₃, 0,1 g/ml): (többségi rotamer) 1,35 (m, 5H), 1,38 (s, 9H), 1,47-1,84 (m, 6H), 2,18-2,27 (m, 1H), 2,50-2,62 (m, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,94-4,06 (m, 1H), 4,07-4,15 (m, 1H), 4,39-4,47 (m, 1H), 4,68 (dd, J=9,l és 5,1 Hz, 1H), 5,09 (d, J=9,2 Hz, 1H).

Elkülönült jelek a kisebbségi rotamer spektrumában: 2,27-2,35 (m, 1H), 3,77 (s, 3H), 3,80-3,87 (m, 1H), 3,88-3,95 (m, 1H), 4,92 (d, J=9,2 Hz, 1H), 5,21 (dd, J=9,1 Hz és ~5 Hz, 1H).

ii) Boc-(R)Cgl-Aze-OH

A Boc-(R)Cgl-Aze-OMe képletű vegyület hidrolízisét a Boc-(R)Cha-Pic-OEt képletű vegyülettel kapcsolatban megadott eljárást (lásd később) követve végezzük. A terméket etanol, aceton és víz 1:1:3,95 arányú elegyéből kristályosítjuk át.

'H-NMR-spektrum (500 MHz, CDC1₃, δ): 0,85-1,3 (m, 5H), 1,40 (s, 9H), 1,5-1,9 (m, 6H), 1,95-2,2 (m, 2H), 3,92 (m, 1H), 4,09 (m, 1H), 4,35 (m, 1H), 4,95 (m, 1H), 5,16 (széles d, 1H).

2. példa

A HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab képletű vegyület előállítása

a) Boc-(R)Cgl-Aze-Pab(Z)

3,40 g (10 mmol), az 1. példában leírtak szerint előállított Boc-(R)Cgl-Aze-OH, 5,13 g (42 mmol) 4-(dimetil-amino)-piridin (DMAP) és 120 ml acetonitril elegyéhez keverés közben 3,18 g H-Pab(Z)-hidrokloridot (előállítását lásd az 1. példában) adunk. A reakcióelegyet 2 óra hosszáig szobahőmérsékleten keveijük, utána lehűtjük -8 °C-ra, majd beadagolunk 2,01 g (10,5 mmol) l-[3-(dimetil-amino)-propil]-3-etil-karbodiimid-hidrokloridot (EDC). Ezután hagyjuk az elegyet szobahőmérsékletre melegedni, további 47 órán át folytatjuk a kevertetést, majd az oldószert elpárologtatjuk, és a párlási maradékot 200 ml etil-acetátban újból feloldjuk. A szerves fázist 50 ml vízzel, egyszer 50 ml és kétszer 25 ml 0,5 M kálium-hidrogén-szulfát-oldattal, kétszer 25 ml telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, valamint még egyszer 50 ml vízzel mossuk, szárítjuk és bepároljuk. Ilyen módon 5,21 g, a címben megnevezett vegyületet kapunk, a kitermelés 86%.

'H-NMR-spektrum (500 MHz, CDC1₃, δ): 0,8-1,9 [m, 2OH, ebből: 1,30 (s, 9H)], 2,35-2,6 (m, 2H), 3,74 (széles t, 1H), 4,10 (m, 1H), 4,25-4,4 (m, 2H), 4,45-4,6 (m, 1H, rotamerek), 4,75-5,0 (m, 1H, rotamerek), 5,08 (széles d, 2H), 5,15 (s, 2H), 7,15-7,35 (m, 5H), 7,41 (d, 2H), 7,77 (d, 2H), 8,21 (m, 1H).

b) H-(R)Cgl-Aze-Pab(Z)

18,8 g hidrogén-klorid 195 ml etil-acetáttal készített és jeges fürdővel lehűtött oldatához 40 ml etil-acetáttal együtt 4,69 g (7,743 mmol) Boc-(R)Cgl-Aze-Pab(Z) képletű vegyületet adunk. A reakcióelegyet hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni, 30 percig keverjük, utána 140 ml dietil-étert adunk hozzá, aminek eredményeképpen az eddig tiszta, éles oldatból csapadék válik le. Az elegyet 1 óra és 40 perc időtartamig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd a csapadékot kiszűrjük, 150 ml dietil-éterrel gyorsan átmossuk, végül vákuumban megszárítjuk. A kiszűrt és megszárított csapadékot ezután feloldjuk 50 ml vízben, az oldatot 15 ml 2 M nátrium-hidroxid-oldattal meglúgosítjuk, majd egyszer 100 és kétszer 50 ml metilén-dikloriddal extraháljuk. Az egyesített szerves oldószeres extraktumot 20 ml vízzel és 20 ml telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, végül bepároljuk. Ilyen módon 3,44 g, a címben megadott vegyületet kapunk, a kitermelés 88%.

'H-NMR-spektrum (500 MHz, CDC1₃, δ): 0,8-2,0 (m, 11H), 2,51 (m, 1H), 2,67 (m, 1H), 3,07 (d, 1H), 4,11 (m, 1H), 4,18 (m, 1H), 4,43 (dd, 1H), 4,53 (dd, 1H), 4,91 (m, 1H), 5,22 (s, 2H), 7,2-7,4 (m, 7H), 7,45 (d, 2H), 8,51 (d, 2H).

c) BnOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab(Z)

1,13 g (2,2 mmol) H-(R)Cgl-Aze-Pab(Z), 0,9 (2,6 mmol) benzil-[2{[(2-nitro-fenil)-szulfoníl]oxi}-acetát] [(2-NO₂)-Ph-SO₂-OCH₂-COBnj, 0,99 g (5,6 mmol) kálium-karbonát és 113 ml acetonitril elegyét 60 °C-os olajfürdőbe helyezve 3 óra hosszáig keverjük, majd az oldószert vákuumban elpárologtatjuk. A párlási maradóhoz etil-acetátot adunk, vízzel összerázzuk az elegyet, azután a szerves fázist 1 M kálium-hídrogén-szulfát-oldattal extraháljuk, és a vizes fázist etil-acetáttal mossuk. A vizes részt ezután 1 M nátrium-hidroxid-oldattal 8 feletti pH-júra lúgosítjuk, majd a lúgos elegyet etil-acetáttal extraháljuk. A szerves fázist vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, szüljük, végül vákuumban bepároljuk. A visszamaradó nyersterméket, amelynek a tömege 1,17 g, kétszer egymás után ílash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, először metilén-dikloriddal és ammóniával telített metanol 95:5 arányú elegyével, majd dietil-éter és ammóniával telített metanol 9:1 arányú elegyével eluálva az oszlopot. Az így kapott 0,525 g termék a címben megnevezett vegyület, a kitermelés 36%.

HU 216 631 Β

Az alkilezést elvégeztük benzil-[2- {[(4-nitro-fenil)-szulfonil]-oxi}-acetát]-tal [(4-NO₂)-Ph-SO₂-OCH₂-COBn] is, ugyanazt az eljárást követve, mint a címben megadott vegyület előállításánál, és így 52%-os kitermeléssel kaptuk a várt vegyületet.

'H-NMR-spektrum (500 MHz, CDC1₃, 5): 0,8-2,15 (m, 11H), 2,48 (m, 1H), 2,63 (m, 1H), 2,88 (d, 1H), 3,24 (d, 1H), 3,27 (d, 1H), 4,05 (m, 1H), 4,44 (m, 1H), 4,55 (m, 1H), 4,91 (m, 1H), 5,22 (s, 2H), 7,2-7,4 (m, 10H), 7,45 (d, 2H), 7,79 (d, 2H), 8,42 (m, 1H).

d/i) HOOC-CH₂— (R)Cgl-Aze-Pab-dihidroklorid mg BnOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab(Z) képletű vegyületet feloldunk 5 ml metanolban, pár csepp kloroformot és 5%-os csontszenes palládiumkatalizátort adunk az oldathoz, azután az elegyet légköri nyomáson hidrogénezzük 1 óra hosszáig. A katalizátort kiszűrjük, a szűrletet bepároljuk, majd a termék vizes oldatát liofilizáljuk, aminek eredményeképpen 11 mg, a címben megnevezett vegyületet kapunk. A kitermelés 72%.

‘H-NMR-spektrum (500 MHz, D₂O, δ): 1,0-2,0 (m, 11H), 2,10 (m, 1H), 2,44 (m, 1H), 4,11 (m, 1H), 2,82 (m, 1H), 3,90 (s, 2H), 4,09 (d, 1H), 4,4-4,55 (m, 2H), 4,66 (s, 2H), 5,08 (m, 1H), 7,65 (d, 2H), 7,89 (d, 2H). ^l3C-NMR-spektrum (75,5 MHz, D₂O, δ): 167,3, 167,9, 169,9 és 172,4 (amidin és karbonil szénatomok).

d/ii) HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab

BnOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab(Z) képletű vegyületet feloldunk 99%-os etanolban, majd az oldatot 5%-os csontszenes palládiumkatalizátor jelenlétében, légköri nyomáson 5 óra hosszáig hidrogénezzük. A katalizátort Celite-rétegen kiszűrjük, és a szűrletet bepároljuk, aminek eredményeképpen 97%-os kitermeléssel kapjuk a címben megadott vegyületet.

H-NMR-spektrum (500 MHz, CD₃OD, δ): (két rotamer keverékéből a többségi rotamer): 1,00 -1,12 (m, 1H), 1,13-1,34 (m, 4H), 1,55-1,70 (m, 3H), 1,73-1,85 (m, 2H), 1,94-2,02 (széles d, 1H), 2,32-2,42 (m, 1H), 2,54-2,64 (m, 1H), 2,95-3,10 (AB-rendszer + d, 3H), 4,18-4,25 (széles q, 1H), 4,28-4,32 (széles q, 1H), 4,43-4,60 (AB-rendszer, 2H), 4,80-4,85 (dd, 1H), 7,48-7,54 (d, 2H), 7,66-7,71 (d, 2H).

A kisebbségi rotamer elkülönült jelei a spektrumban: 0,95 (m), 1,43 (m), 2,24 (m), 2,84 (d), 3,96 (m), 4,03 (m), 7,57 (széles d), 7,78 (széles d).

^l3C-NMR-spektrum (125 MHz, CD₃OD, δ): 168,0, 173,0, 176,3 és 179,0 (amidin és karbonil szénatomok).

A megfelelő (S)-izomerek analóg módon állíthatók elő Boc-(S)Pgl-OH felhasználásával. A d/ii) pont szerint előállított szabad bázisból ismert módszerekkel állíthatók elő gyógyászatilag elfogadható sók.

3. példa

Gyógyszerkészítmények előállítása

A hatóanyag pufferral készült oldatában feloldjuk a felszívódást fokozó szert, és az oldatot pufferral adott térfogatra kiegészítjük.

a) A jelű készítmény

HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab (bázis): 1,1 mg/10 ml Szacharóz-monosztearát (S-1570): 1,1 mg/lOml

Foszfátpuffer (KH₂PO₄:Na₂HPO₄, 0,1 M, pH=7,4):

ml-ig

b) B jelű készítmény

HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab (bázis): 1,1 mg/lOml Szacharóz-monopalmitát (P-1570): 1,1 mg/10 ml Foszfátpuffer (KH₂PO₄: Na₂HPO₄, 0,1 M, pH=7,4):

ml-ig

c) C jelű készítmény

HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab (bázis): 1,1 mg/10 ml Solutol (PEG-660 hidroxi-sztearát, BASF):

mg/10 ml

Nátrium-klorid-oldat (0,9 g/1, pH = 7,4): 10 ml-ig

d) D jelű készítmény

HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab (bázis): 1,1 mg/10 ml Nátrium-dioktil-(szulfo-szukcinát) (DSS):

2,2 mg/10 ml

Nátrium-klorid-oldat (0,9 g/1, pH=7,4): 10 ml-ig

e) E jelű készítmény

HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab (bázis): 1,1 mg/10 ml Dodecil-maltozid: 2,2 mg/10 ml Nátrium-klorid-oldat (0,9 g/1, pH=7,4): 10 ml-ig

f) Fjelű készítmény

HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab (bázis): 1,1 mg/10 ml EDTA: 17 mg/ml

Nátrium-klorid-oldat (0,9 g/1, pH=7,4): 10 ml-ig

g) G jelű készítmény

HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab (bázis): 1,1 mg/10 ml Palmitoil-DL-kamitin: 2,2 mg/10 ml Nátrium-klorid-oldat (0,9 g/1, pH = 7,4): 10 ml-ig

h) //jelű készítmény

HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab (bázis): 0,5 mg/ml EDTA: 2 tömeg%

Nátrium-klorid-oldat (0,9 g/1)

i) / jelű készítmény

HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab (bázis): 0,43 mg/ml Captex (propilénglikol-dikaprilát/dikaprát; Karlshamns, Svédország): 72 tömeg%

Capmul (glicerin-dilaurát; Karlshamns, Svédország):

tömeg%

Tween 80: 3 tömeg%

Nátrium-klorid-oldat (0,9 g/1)

j) ./jelű készítmény

HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab (bázis): 0,43 mg/ml Olívaolaj: 100tömeg%

Olajsav

k) AT jelű készítmény

HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab (bázis): 0,43 mg/ml Polikarbofil (Carbopol; akrilsav polimer; BFGoodrich, USA): 0,5 tömeg%

Foszfátpuffer (0,1 M, pH=7,4)

Az A-G jelű készítményeket patkányokból származó, Ussing-féle kamrába beépített csípőbél- vagy vastagbélszegmenseken vizsgáltuk Artursson és munkatársai leírása [Pharm. Rés., 10, 1123-29 (1993)] szerint. Az intesztinális membrán két oldalán elhelyezkedő oldatokból szabályos időközönként mintát vettünk, és megmértük az oldatokban a HOOC-CH₂-(R)Cgl--Aze-Pab koncentrációját. Az intesztinális membránon való áthaladás képességét tekintettük a permeabilitás mértékének. A permeabilitási koefficienst a

HU 216 631 Β

Papp=dQ/dt· 1/AC_U egyenlet alapján számítottuk ki a mérési eredményekből, ezért a számításokhoz meghatároztuk a vegyület állandósult megjelenési sebességét (dQ/dt) az A területű bélszegmens savóhártya felőli oldalán, valamint a kiindulási koncentrációt (C_u) a nyálkahártya felőli oldalon.

Az A és B jelű készítményekkel elvégzett vizsgálatok során kapott eredményeket az 1. ábra, míg a C és D, E és F, valamint a G jelű készítmények vizsgálati eredményeit sorrendben a 2., 3. és 4. ábra mutatja. Az ábrákban, az egyes oszlopok felett N értékeként megadott számok a felhasznált patkányok számát jelentik.

Az eredmények alapján megállapíthatjuk, hogy a szacharóz észtereinek, monosztearátjának és monopalmitátjának jelenlétében, továbbá a glükóz-észter, dodecil-maltozid jelenlétében az intesztinális membrán áteresztőképessége a HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab képletű vegyületre nézve kétszeresére vagy háromszorosára növekszik a felszívódást fokozó szer nélkül alkalmazott kontrolihoz képest. Azonos nagyságrendű növekedést figyelhettünk meg a membrán permeabilitását illetően azoknál a készítményeknél, amelyek felületaktív anyagokat, így Solutolt vagy nátrium-dioktil-(szulfoszukcinát)-ot (DSS), továbbá zsírsavszármazékot, így palmitoil-DL-kamitint vagy etilén-diamin-tetraecetsavat (EDTA), amely kalciumkelátorként ismert, tartalmaznak. Mindezek a hatásfokozó anyagok megnövelik a HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab képletű trombininhibitorra nézve az intesztinális permeabilitást, miáltal nagyobb mennyiségű hatóanyag kerül be a szisztémás keringésbe, vagyis javítják a biológiai hozzáférhetőséget.

A Η, I, J és AT jelű készítményeket in vivő körülmények között, intraduodenálisan katéterezett, nem altatott patkányokon vizsgáltuk. Az /, J és K jelű készítményeket bolus injekció, a //jelű készítményt pedig 60 percig tartó infúzió formájában adtuk be az állatoknak. A különböző készítmények beadását követő 4 órán át, meghatározott időpontokban vérmintát vettünk az állatoktól, megmértük a plazmában a HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab koncentrációját, majd a görbe alatti területből (area under the curve=AUC), standard farmakokinetikai módszerekkel (Rowland and Tozer: Clinical Pharmacokinetics, concepts and applications, 1980) kiszámítottuk a biológiai hozzáférhetőség mértékét.

A H, /, J és K jelű készítményekkel patkányokon, in vivő körülmények között kapott vizsgálati eredményeket az 5. és 6. ábrákon szemléltetjük. Látható, hogy a biológiai hozzáférhetőség a különböző készítmények esetében 2-10-szeresre növekedett a kontrollkísérlethez képest, ahol vivőanyagként 8-as pH-jú foszfátpuffert használtunk.

Az összes vizsgált készítmény esetében kimutatható volt, hogy növekszik a duodenumba bejuttatott HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab képletű trombininhibitor biológiai hozzáférhetősége. Valószínűnek látszik tehát, hogy a gyomor-bél csatornából való felszívódást fokozó, általánosan használt adalékok többé vagy kevésbé befolyásolják ennek a hatóanyagnak a biológiai hozzáférhetőségét orális alkalmazás esetén, és hasonló hatást eredményezhetnek más alkalmazási módok, például rektális, bukkális, nazális vagy pulmonális alkalmazás esetén is.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Gyógyszerkészítmény, amely HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab képletű trombininhibitort vagy fiziológiásán elfogadható sóját és egy vagy több felszívódást fokozó segédanyagot, valamint adott esetben egy gyógyszerészeti vivőanyagot tartalmaz.
2. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a felszívódást fokozó segédanyag egy felületaktív anyag.
3. A 2. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a felületaktív anyag egy alkil-glikozid, előnyösen cukor-glikozid.
4. A 2. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a felületaktív anyag egy cukor-zsírsav-észter.
5. A 4. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a cukor-zsírsav-észter szacharóz-monosztearát vagy szacharóz-monopalmitát.
6. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a felszívódást fokozó segédanyag egy lipid.
7. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a felszívódást fokozó segédanyag egy zsírsav vagy kamitinnak valamilyen zsírsavszármazéka.
8. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a felszívódást fokozó segédanyag egy növényi olaj.
10. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a felszívódást fokozó segédanyag egy etilénglikol- vagy akrilát-polimer.
11. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a felszívódást fokozó segédanyag lipidek, egy lipid és egy növényi olaj vagy egy lipid és egy felületaktív anyag kombinációjából áll.
12. A 1-11. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab képletű hatóanyag szabad bázis formájában van.
13. Eljárás az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab képletű vegyület oldatához egy felszívódást fokozó segédanyagot adunk, adott esetben az elegy pH-ját egy puffer hatású anyaggal fiziológiásán elfogadható értékre állítjuk be, és gyógyszerkészítménnyé kiszereljük.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a HOOC-CH₂-(R)Cgl-Aze-Pab képletű vegyület szabad bázis vagy fiziológiásán elfogadható só formájának oldatához a felületaktív anyagok, így alkilglikozidok, cukor-zsírsav-észterek, továbbá lipidek, zsírsavak, kamitin zsírsavszármazékai, növényi olajok, kelátképző anyagok, etilénglikol- vagy akrilát-polimerek vagy ezek kombinációi közül választott egy vagy több felszívódást fokozó segédanyagot adunk, adott esetben egy puffer hatású anyaggal az oldat pH-ját fiziológiásán elfogadható értékre állítjuk, és gyógyszerkészítménnyé kiszereljük.
15. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy felszívódást fokozó segédanyagként szacharóz-monosztearátot vagy szacharóz-monopalmitátot adunk az oldathoz.