HU215537B - Eljárás BHV-1-fertőzés elleni oltóanyag előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás BHV–1-fertőzés elleni őltóanyagelőállítására. A találmány szerinti őltóanyag úgy készül, hőgy őlyanBHV–1-törzset alkalmaznak, amely genőmja g–IV glikőprőteint kódőló részében módősítőtt, a módősítás a g–IV glikőprőtein szempőntjából nem esszenciálistartőmányőkban van, ezek a g–IV glikőprőtein szempőntjából nem esszenciális tartőmányők aPasteűr Intézetnél I 1204 szám alatt letétbe helyezett N 596 számúBHV-törzs g–IV glikőprőteinjében szereplő 310–338. a inősavnakmegfelelő epitőpőkra vőnatkőznak, és ezekben az N 569 számú BHV-törzs g–IV glikőprőteinje szempőntjábólnem esszenciális tartőmányőkban vad vírűsőkhőz képest egy vagy többnűkleőtid kicserélt, kivágőtt vagy inzertált. Az őltóanyag őltőttállatők és vad törzsekkel fertőzött állatők megkülönböztetésére isalkalmas. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás szarvasmarha-herpeszvírus (BHV-1) alapú oltóanyag előállítására vonatkozik. A vírusok genomjuk olyan részében tartalmaznak változást, mely rész esszenciális proteinek nem esszenciális részeit kódolja. A találmány szerinti oltóanyag segítségével az oltott szarvasmarhát meg lehet különböztetni vad vírusokkal fertőzött állattól.

Az 1-es típusú szarvasmarha-herpeszvírus (BHV-1)fertőzés főleg a szarvasmarha légzési rendszerének szervein és nemi szervein mutatkozik, de a perifériás, valamint a központi idegrendszeren is. A fertőzés okozta kórképeket fertőző szarvasmarha-rinotracheitiszként, fertőző szarvasmarha-vulvovaginitiszként és fertőző kiütéses balanofosztitiszként írják le. Emellett konjunktivitiszt, orchitiszt, endometritiszt, masztitiszt, abortuszt, agyhártya- és agyvelőgyulladást figyeltek meg. Az első fertőzés után a BHV-1-vírus az állat egész életén keresztül rejtve élhet az állatban. A feltételezések szerint a vírus az idegrendszer sejtjeiben, de hámsejtekben, a nyirokrendszerben és a limfocítákban is tartózkodik. A latens fertőzés olykor-olykor aktiválódik, ezért klinikai tünetek, víruskiválasztás időszakai és feltűnés nélküli tünetegyüttes, víruskiválasztással vagy enélkül, váltakozva követik egymást. Az aktivitás okai a fertőzött szervezet terhelése, például stressz, immunszuppresszió vagy másodlagos fertőzés formájában.

A BHV-1-vírus világszerte okozta nagy gazdasági károk (pl. tenyésztésben veszteségek, a tejhozam csökkenése, a megtermékenyülési ráta visszaesése, meddőség és elvetélés) miatt a megelőző intézkedéseknek nagy jelentősége van. A közvetlenül a betegségből származó károk mellett közvetett károk is vannak; például BHV-1-gyanús szarvasmarhák adásvétele mind nemzeti, mind nemzetközi szinten nagyon korlátozott.

A BHV-1-vírussal kapcsolatos betegségek megelőző leküzdésére attenuált BHV-1-törzsekből gyártott élő vakcinák, inaktivált oltóanyagok, valamint tisztított vírusprotein bázisú úgynevezett hasított vakcinák állnak rendelkezésre. A jelenleg a vírus kiirtására és a fertőzött állományok szanálására gyakorolt leküzdési programokban, valamint az állatexportban a vírushordozó szarvasmarhát BHV-1-vírusra fajlagos antitest kimutatásával azonosítják.

A BHV-1-vírus ellen oltott szarvasmarha és a BHV-1-vírussal fertőzött szarvasmarha között jelenleg különbséget tenni nem lehet, pedig a kettő megkülönböztetése nagyon növelné a fent említett programok hatékonyságát.

Más területeken lehetséges az oltott és a fertőzött állat megkülönböztetése. Például sertések számára kifejlesztettek olyan oltóanyagokat, amelyek az Aujeszky-vírus (Procines herpesz vírus 1) fertőzés klinikai megnyilvánulásait visszaszorítják, és lehetővé teszik az oltott és a fertőzött állat megkülönböztetését. Az ilyen oltóanyagok alapja olyan vírustörzs, amelyből a vírus szaporodásához nem szükséges proteinek, az úgynevezett nem esszenciális vírusproteinek részben vagy egészen hiányoznak. Az oltóanyag alapja egyben tisztított vírusprotein is lehet. A vakcinából hiányzó protein ellen fajlagos antitestek kimutatására kifejlesztett szerológiai teszt lehetővé teszi az Aujeszkyvírussal fertőzött sertések és az Aujeszky-vírus ellen beoltott sertések megkülönböztetését.

A 316 658 számú publikált európai szabadalmi bejelentésben ismertetett vakcina állítólag lehetővé teszi a beoltott és a fertőzött szarvasmarhák megkülönböztetését. Rekombináns technológiával olyan BHV-1-mutánst hoztak létre, amely - a nem esszenciális szerkezeti glikoprotein glll génjében lévő, kivágással vagy beépítéssel előidézett mutáció közvetkeztében - az említett glikoproteint nem tartalmazza.

A vírusproteineknek meghatározott biológiai funkciói vannak. Ha a vírusból komponensek, például glikoproteinek hiányoznak, akkor logikus, hogy a vírus egyes biológiai funkciói is hiányoznak. így az Aujeszkyvírus nem esszenciális glll szerkezeti glikoproteinjének például lényeges szerepe van az Aujeszky-vírus elleni immunválaszban. Főleg a herpeszvírusok elleni immunológiai védekezésben nagyon fontos celluláris védekező mechanizmusok az Aujeszky-vírus gül proteinje ellen irányulnak (Zuckermann és munkatársai, 1990, J. Virol. 64, 802-812).

A BHV-1-rendszerre átvive ez azt jelenti, hogy a funkciója alapján hasonló glll protein hiánya a BHV-1-vírus immunogenitásának a csökkenését eredményezné. A nagy immunogenitású BHV-1-oltóanyag előállítására ezért olyan BHV-1-mutánst kellene felhasználni oltóvírusként, amely nem a védekező mechanizmusok célját képező proteinekben vagy proteinszakaszokban hiányos, hanem másutt.

A találmány területe:

1. BHV-1-törzsek alkalmazása - a törzsek vad törzsekkel összehasonlítva azzal tűnnek ki, hogy egy vagy több megváltozott DNS-szekvencia alapján esszenciális proteinek nem esszenciális részeiben egy vagy több megváltozott aminosav-szekvenciát tartalmaznak - BHV-1-fertőzés elleni oltóanyag előállítására.

2. A BHV-1-törzsek 1. pont szerinti alkalmazása, ahol a változások az esszenciális glV glikoproteinben vannak.

3. A BHV-1-törzsek 1. pont szerinti alkalmazása, ahol a változások a glV glikoprotein azon részében vannak, amely közvetlenül a vírus membránburkából kiáll.

4. Az 1—3. pont szerinti alkalmazás, ahol BHV—1törzsként a BHV -1.3 jelű 3. szubtípust alkalmazzuk.

5. Az 1 -4. pont szerinti alkalmazás, ahol az N 569 jelű törzset alkalmazzuk.

6. Az 5. pont szerinti alkalmazás, ahol az N 569 törzsben - vad típussal összehasonlítva - a glV glikoprotein aminosav-szekvenciája a 310. és a 338. helyzet között megváltozott.

7. 1. pont szerinti BHV-1-vírustörzsek alkalmazása, ahol az N 569 törzs glV glikoproteinjének 310-338. aminosavának megfelelő glikoproteines aminosavszekvenciában van változás.

8. Eljárás BHV-l-törzsek előállítására az 1-7. pont szerinti alkalmazás céljaira:

HU 215 537 Β a-1) fertőzött természetes gazdából (pl. szarvasmarha, sertés, kecske) izolált, majd sejtekben több passzázsban tenyésztett BHV-1-törzs esszenciális proteineket kódoló génjeinek DNS-szekvenciáját meghatározzuk és ebből a kódolt aminosav-szekvenciát levezetjük, vagy a-2) az esszenciális vírusprotein aminosav-szekvenciáját közvetlenül meghatározzuk, majd

b) az a-1) vagy a-2) pont szerint meghatározott aminosav-szekvenciát BHV-1-vadtípusok megfelelő esszenciális aminosav-szekvenciával összehasonlítjuk, vagy

c) immunológiai módszerekkel, BHV-1-vírus vadtípusainak esszenciális proteinjeire fajlagos antitestek segítségével megváltozott aminosav-szekvenciákat keresünk és azokat a BHV-1-törzseket, amelyeket egy vagy több antitest nem ismert fel, szelektáljuk,

d) az a), b) vagy c) pont szerint kapott, a vadtípushoz viszonyítva megváltozott aminosavszekvenciával rendelkező törzseket is, a vadtípust is önmagában ismert módon antigenitásra vizsgáljuk. Ennek során az a), b) vagy c) pont szerint kapott törzsek megváltozott aminosav-szekvenciával analóg vadtípus-aminosavszekvenciának egy vagy több olyan epitop létrehozásában kell részt vennie, amely az a), b) vagy c) pont szerint kapott törzsekben nem fordul elő. BHV-1vírussal nem fertőzött szarvasmarhának nem lehet antiteste a vadtípus azon aminosavszekvenciája ellen, amely az a), b) vagy c) pont szerint kapott törzsekben megváltozott.

e) A d) pont szerint azonosított törzsek közül a szarvasmarhára nézve immunogén törzseket kiválasztjuk.

f) Az a-c) pontban leírtak helyett alternatív megoldásként BHV-1-törzsek genomjában nukleotid-szekvenciákat úgy változtathatunk meg, hogy esszenciális proteinek nem esszenciális részének aminosav-szekvenciája megváltozik, és emiatt egy vagy több, szarvasmarhára fajlagos epitop a vadtípushoz viszonyítva másmilyen vagy hiányzik.

9. BHV-1-törzsek olyan DNS-szekvenciáinak az alkalmazása, amelyek nem esszenciális résszel rendelkező esszenciális proteint kódolnak, az 1. pont szerint alkalmazható BHV-1-törzsek azonosítására, valamint az esszenciális proteinek nem esszenciális részét kódoló DNS-szekvenciák tervszerű módosítására, hogy (1) szerint alkalmazhatók legyenek.

10. DNS-szekvenciák, amelyek BHV-1-törzsek esszenciális proteinjeit kódolják és nukleotid-szekvenciájukban olyan módosítást tartalmaznak, amitől a kódolt protein aminosav-szekvenciája a nem esszenciális részekben a vadtípus megfelelő szekvenciájától eltérő.

11. DNS-szekvenciák, amelyek a BHV-1-törzsek glV proteinjét kódolják és nukleotid-szekvenciájukban olyan módosítást tartalmaznak, amitől a glV glikoprotein aminosav-szekvenciája a vadtípushoz viszonyítva másmilyen.

12. DNS-szekvencia, amely a BHV-1 N 569 törzs glV esszenciális glikoproteinjét kódolja, azzal jellemezve, hogy nukleotid-szekvenciájában olyan módosítást tartalmaz, amitől a glV protein aminosav-szekvenciája a 310. és a 338. aminosav között más, mint a vadtípus megfelelő szakasza.

13. Eljárás a 11. és 12. pont szerinti DNS-szekvenciák előállítására, ahol a 8. pont szerint előállított BHV-1-törzsekből a DNS-t önmagában ismert módon elkülönítjük vagy BHV-1-vadtípusok genomját ismert módon vektorokban klónozzuk, és a klónozott BHV-1 DNS-íragmensek nukleotidszekvenciáját oly módon megváltoztatjuk, hogy a BHV-l-genomba beépített szekvencia az 1. pont szerint alkalmazható BHV -1-törzseket eredményez, majd a megváltoztatott DNS-t a vektorokból ismert módon izoláljuk.

14. BHV-1-vírusból származó, a nem esszenciális részben megváltoztatott esszenciális proteinek alkalmazása az 1. pont szerint alkalmazható BHV -1 törzsek azonosítására, valamint oltóanyagok előállítására, végül megváltoztatott aminosav-szekvenciájú BHV-1 -törzsek előállítására.

15. BHV-1-törzsek esszenciális proteinjei, amelyek nem esszenciális részének aminosav-szekvenciája a vadtípussal összehasonlítva más.

16. BHV-l-törzsek glV proteinje, amely nem esszenciális részének aminosav-szekvenciája a vadtípussal összehasonlítva más.

17. A BHV-1 N 569 törzs glV proteinje, amelynek aminosav-szekvenciája a 310. és 338. aminosav között a vadtípus megfelelő szekvenciájától eltérő.

18. Eljárás a 15 -17. pont szerinti proteinek előállítására, ahol a 8. pont szerint előállított BHV-1törzsekből a proteint ismert módon elkülönítjük, vagy pedig az előállítani kívánt proteint kódoló gént prokarióta vagy eukarióta expressziós rendszerben klónozzuk és exprimáljuk.

19. BHV-l-vadtípus-törzsből származó esszenciális protein nem esszenciális része elleni antitest alkalmazása az 1. pont szerint alkalmazható BHV-ltörzsek azonosítására.

20. BHV-l-vadtípus-törzsből származó glV protein nem esszenciális része elleni antitest 19. pont szerinti alkalmazása.

21. Az 1. pont szerint alkalmazható BHV-1-törzsekből származó esszenciális proteinnek a vadtípusétól eltérő nem esszenciális része elleni antitestek.

22. Eljárás a 21. pont szerinti antitestek előállítására, ahol az állatokat (például házinyulat, egeret, kecskét, juhot) a 8. pont szerint előállított BHV-1törzzsel vagy BHV-1-törzsnek a nem esszenciális részben megváltoztatott esszenciális proteinjével vagy esszenciális protein nem esszenciális részében lévő megváltoztatott aminosav-szekvenciának megfelelő peptiddel immunizálunk, és a keletkezett antitesteket ismert módon izoláljuk.

HU 215 537 Β

23. A 21. pont szerinti antitest alkalmazása 1. pont szerint alkalmazható BHV-1-törzsek azonosítására.

24. A BHV-1-vadtípusú törzsekből származó esszenciális protein nem esszenciális részének aminosavszekvenciájával homológ, de az 1. pont szerint alkalmazott BHV-1-törzsekből származó esszenciális protein nem esszenciális részének aminosavszekvenciájával heterológ peptidek alkalmazása olyan szerológiai eljárásban, amellyel BHV-1vadtípus törzzsel fertőzött szarvasmarhát meg lehet különböztetni az 1. pont szerinti oltóanyaggal oltott szarvasmarhától.

25. A BHV-1-vadtípusú törzsekből származó glV glikoprotein nem esszenciális részének aminosavszekvenciájával homológ, de az 1. pont szerint alkalmazott BHV-1-törzsekből származó esszenciális protein nem esszenciális részének aminosavszekvenciájával heterológ peptidek alkalmazása olyan szerológiai eljárásban, amellyel BHV-1vadtípus törzzsel fertőzött szarvasmarhát meg lehet különböztetni az 1. pont szerinti oltóanyaggal oltott szarvasmarhától.

26. A BHV-1-vadtípusú törzsekből származó glV glikoprotein nem esszenciális részének aminosavszekvenciájával homológ, de a BHV-1 N 569 törzs glV glikoproteinjének a 310. és a 338. aminosav közötti megváltoztatott aminosav-szekvenciájával heterológ peptidek alkalmazása olyan szerológiai eljárásban, amellyel BHV-1-vadtípus törzzsel fertőzött szarvasmarhát meg lehet különböztetni az 1. pont szerinti oltóanyaggal oltott szarvasmarhától.

A fentiekben használt kifejezések jelentése az alábbi:

BHV: szarvasmarha-herpeszvírus

BHV-1 a szarvasmarha-herpeszvírus 1. szerotípusához tartozó vírus a „Vírus Diseases in Laboratory and Captive Animals” (F. J. Conraths, H. Ludwig, G. Darai, 1988, Verlag Martinus Nijhoff, Boston) nomenklatúrája szerint

BHV-1.3 a szarvasmarha-herpeszvírus 1. szerotípusának 3. szubtípusa. E szubtípus egyik képviselőjét első ízben Ausztráliában izolálták 1962ben, és N569 törzsként írták le (French, 1962, Ausztrálián Veterinary Journal 38, 216. oldaltól), Argentínában A663 törzsként (Carriollo és munkatársai, 1983, Zbl. Vet. Med. B. 30, 327. oldaltól), amikor a vírusos encefalitisz grasszált a csordákban. Mind Metzler és munkatársai (1986, Archives of Virology 87,205), mind Engels és munkatársai (1986/87, Vírus Research 6, 57) az általuk izolált, egységes restrikciós mintával rendelkező és a BHV-1 egyéb képviselőitől megkülönböztethető vírusokat a BHV-1. szerotípusának 3. szubtípusának írták le. A Bartha és munkatársai által Magyarországon egy encefalitiszes szarvasmarhából izolált

Na67 törzs (Bartha és munkatársai, 1969, Acta Veterinariae Academiae Scientarium Hungaricae 19, 145) is Magyar és munkatársai (1989, Acta Veterinaria Hungaricae 37,3) vizsgálatai szerint a tipikus BHV-1,3-DNSmintát mutatott. Studdert ezt a víruscsoportot „Bovine Encephalitis Herpesvirus (BEHV)”nek nevezi (Studdert, 1989, Vet. Rec. 584). A 3. szubtípus mennyiségi jelentősége a másik két szubtípus (1. és 2.) előfordulásához képest teljesen elhanyagolható. Az 1.1 és az 1.2 szubtípus a genom-DNS bizonyos restrikciós enzimekkel végzett kezelés után kapott jellemző DNS-mintában különbözik egymástól (Engels és munkatársai, 1981, Arch. Virol. 67,169. oldaltól kezdve). A két szubtípus jellemző képviselőjeként a Cooper-törzset (BHV-1.1) és a Schönböken-törzset (BHV-1.2) nevezzük meg.

Vadtípus, vadtípusú vírusok a szarvasmarha-herpeszvírus 1. típusához tartozó, természetes körülmények között előforduló vírusok. DNSszekvenciái esszenciális proteinek nem esszenciális részében lévő egy vagy több epitopot kódolnak, amely epitop a természetes körülmények között előforduló vírusok túlnyomó részben azonos, ezért a BHV-1-vadtörzsek jellegzetességének tekinthető. Ha a szarvasmarhában ez ellen az epitop ellen antitest termelődik, valószínű, hogy az állat vadtípusú BHV-1-vírussal fertőzött.

Esszenciális protein egy vagy több olyan protein, amely BHV-1-vírusok sejttenyészetben történő szaporodásához szükséges. Ezeket a proteineket a BHV-1 genomja kódolja; az érett vírus részei lehetnek, de hozzájárulhatnak a szaporodáshoz úgy is, hogy nem lesznek az érett vírusrészecskének a része. A BHV-1 esszenciális proteinjeinek példájaképpen a gB és gD proteint nevezzük meg (HSV-nomenklatúra szerint) (Wyler és munkatársai, Infectious Bovine Rhinotracheitis/Vulvovaginitis, „Developments in Veterinary Virology, Vol. „Herpesvirus Diseases of Cattle, Horses and Pigs”, ed. by Wittmann, Kluwer Academic Publishers, 1989). Esszenciális proteinek nem esszenciális részei Ezek az esszenciális proteinek olyan részei, amelyeknek az aminosav-szekvenciája megváltoztatható anélkül, hogy ez a proteinnek a vírusszaporodásban gyakorolt funkcióját gátolná. A jelen találmánnyal kapcsolatban fontos, hogy ezek a nem esszenciális részek - aminosavszekvenciájuk alapján - epitopokat képezhetnek és ezek az epitopok BHV-1-vírussal fertőzött szarvasmarhákban fajlagos antitestek képződését idézik elő. Megváltoztatott aminosav-szekvencia alatt itt azt értjük, hogy egy BHV-1-törzs esszenciális proteinjének legalább egy nem esszenciális része a vadtípusétól oly mértékben eltér, hogy a vadtípus megfelelő proteinjének megfelelő tartományában meglévő epitop a megváltoztatott aminosav-szekvenciájú vírus proteinjében már nincs meg. Ha szarvasmarhát a megváltoztatott aminosav-szekvenciájú vírussal vagy annak inaktivált

HU 215 537 Β formájával vagy töredékeivel oltunk, akkor legalább egy epitop ellen hiányzik a fajlagos antitest, amely vadtípusú vírussal történt fertőzés esetén megvolna.

A megváltozott aminosav-szekvenciák természetesen előforduló BHV-1-törzsekben léphetnek fel, például a BHV-1 N569 törzs glV (gD) esszenciális szerkezeti proteinjében a 310. és 338. aminosav közötti szakasz; vadtípusú törzsek sejttenyészetekben történő passzalása során alakulhatnak ki; vagy esszenciális proteinek nem esszenciális részeinek azonosítása után a BHV-1 genomjában lévő DNS-szekvencia megváltoztatásával géntechnológiai módszerekkel előállíthatok.

Az esszenciális protein nem esszenciális részében lévő aminosav-szekvencia változása egy vagy több aminosav felcserélésében, egy vagy több aminosav hiányában, egy vagy több aminosav járulékos beépítésében vagy a felsoroltak kombinációjában nyilvánul meg, és a vadtípushoz képest megváltozott nukleotid-szekvenciájú vírusgenomon alapul. Döntően fontos, hogy a változás az esszenciális proteinnek a vírus szaporodásában játszott szerepét nem blokkolhatja, és hogy a változásnak legalább egy epitop elvesztésével kell járnia (függetlenül attól, hogy egy vagy több új epitop is keletkezhet). Megváltoztatott DNS-szekvencia

Egy BHV-1-törzs genomjának nukleotid-szekvenciája a vadtípusétól eltér, ami egy vagy több nukleotid cseréjének, egy vagy több nukleotid deléciójának, egy vagy több nukleotid beépítésének vagy a felsorolt lehetőségek tetszőleges kombinációjának a következménye. A változás esszenciális proteinnek legalább egy nem esszenciális tartományában egy vagy több epitop elvesztését okozza, esetleg egy vagy több új epitop keletkezik is, de a proteinnek a szaporodásban betöltött szerepét nem gátolhatja.

glV glikoprotein a BHV-1 azon glikozilezett szerkezeti proteinje, amelyet a HSV-gD proteinje homológjának tekintenek (Wyler és munkatársai; Developments in Veterinary Virology, Vol. „Herpesvirus Diseases of Cattle, Horses and Pigs”, ed. by Wittmann, Kluwer Academic Publishers, 1989). A glV proteint kódoló gén nukleotidszekvenciáját és a genomban elfoglalt helyét a Schönböken és Australie BHV-1-törzsek esetén már tisztázták (Beninga, a Tübingi Egyetem Biológiai Tanszékén írt diplomamunka, 1989). Az érett, a sejten kívüli vírusrészecskében fellelhető glV glikoprotein SDSpoliakrilamid-gélen végzett elektroforézis útján megállapított relatív móltömege az 1.1 és az 1.2 szubtípusok esetén körülbelül 71000 (Wyler és munkatársai, Infectious Bovine Rhinotracheitis/Vulvovaginitis, „Developments in Veterinary Virology, Vol. „Herpesvirus Diseases of Cattle, Horses and Pigs”, ed. by Wittmann, Kluwer Academic Publishers, 1989). A BHV-1.3-törzsek glV proteinjének relatív móltömege mintegy 68 000.

A virusburokból közvetlenül kiálló rész a glV glikoprotein azon szakaszát jelenti, amely - az aminoterminális felől a karboxilterminális felé nézve röviddel az úgynevezett membrándomén előtt van. Beninga (Beninga, a Tübingi Egyetem Biológiai Tanszékén írt diplomamunka, 1989) a Schönböken és Australia nevű BHV-l-törzsek glV-génjének szekvenálása útján a protein másodlagos szerkezetéi valamint hidrofil és hidrofób tartományait meghatározta. E vizsgálatok szerint az aminoterminálisan erősen hidrofób tartomány helyezkedik el, amelyre körülbelül 300 aminosavból álló szekvencia következik, amelyben hidrofil és hidrofób részek vannak, és amely viszonylag erősen összehajtogatott. A C-terminális felé lineáris, főleg hidrofil jellegű szakasz következik. Ez a szakasz a Schönbök BHV-1-törzs esetén mintegy 50 aminosavból áll, a vírus membránburkolatából közvetlenül kiáll, aminosav-szekvenciájában a fent (3) említett változások vannak. A karboxilterminális felé igen hidrofób régia következik, ez a membrándomén, amely a glikoproteint a membránban rögzíti.

Természetes gazda lehet bármely állat, amelyet a BHV-1-vírussal lehet megfertőzni, és amelyben a vírus szaporodik. Természetes gazda lehet a szarvasmarha, sertés és kecske (Rolle és Mayr: Mikronbiologie, Infektions- und Seuchenlehre, F. Enke Verlag Stuttgart).

Sejtekben passzált BHV— 1-törzs azt jelenti, hogy BHV-l-törzset eukarióta szövettenyészet sejtjeiben szaporítunk. Ennek során egy szaporítás hozamát, vagy állatból nyert BHV-l-izolátumot adott esetben tárolás után szövettenyészetre viszünk, és miután a vírus ismét szaporodott, ismét kinyeijük. A szaporítási lépések száma a szövettenyészeti passzalás céljától függ. Ha nagyobb mennyiségű vírust akarunk nyerni elemzés vagy preparálás céljára, kisebb számú, például 1-10 szaporítási ciklus elegendő. Ha viszont a vírus biológiai vagy biokémiai tulajdonságait, például patogén hatását, aminosav-szekvenciáját és/vagy DNS-szekvenciáját akarjuk megváltoztatni, több sejtpaszszázsra van szükség. így például a szarvasmarhákra patogén Schönböken BHV-l-törzset mintegy 200 sejtpasszázson keresztül tenyésztve nem patogén törzset kaptunk.

A sejtpasszázshoz felhasznált sejtek kiválogatásával a biológiai vagy biokémiai tulajdonságokban mutatkozó változások fellépését befolyásolhatjuk. Például olyan sejt, amely nem a BHV-1 természetes gazdaszervezetéből származik, így például a kutyavesesejt, a nempatogén mutáns kialakulását elősegítheti, és az eredetileg patogén törzsből gyengített törzs lesz.

A DNS-szekvencia meghatározása itt azt jelenti, hogy a vizsgálni kívánt vírustörzset szaporítjuk, genomját izoláljuk és legalább részben vektorokban molekulárisán klónozzuk. Az esszenciális proteinek kódolására való vírusgénekkel rendelkező kiónok DNS-szondák segítségével hibridizálás útján azonosíthatók. DNS-szondaként például olyan DNS-fragmens vagy szintetikus oligonukleotid alkalmazható, amely BHV-1 vagy egyéb herpeszvírus esszenciális proteinjeit kódoló gének nukleotid-szekvenciájával rendelkezik. BHV-l-törzsek nukleotid-szekvenciai, illetve DNS-fragmensek, amelyek BHV-1-vírusok esszenciális proteinjeit kódoló géneket vagy részeiket tartalmazzák, ismertek például Beninga diplomamunkájából

HU 215 537 Β (Tübingi Egyetem Biológiai Tanszéke, 1989) vagy Chase és munkatársai cikkéből (Journal of Tisszue Culture Methods, 11, 75. oldaltól, 1988, valamint J. Gén. Virol. 70, 1561. oldaltól, 1989). A vírusgenom nem esszenciális proteineket kódoló DNS-szakaszát tartalmazó azonosított DNS-klónok segítségével ismert módon meghatározhatjuk e vírusgének nukleotid-szekvenciáját.

Az aminosavszekvencia közvetlen meghatározása azt jelenti, hogy egy vagy több esszenciális BHV-1proteinnek az aminosav-szekvenciáját ismert biokémiai módon meghatározzuk. A meghatározás előtt a BHV-1vírussal fertőzött sejtből vagy vírusrészecskékből származó esszenciális proteineket például immunaffmitáskromatográfiásan az esszenciális proteinre, például gBés gD-proteinre fajlagos antitestek alkalmazásával (Chase és munkatársai, Journal of Tisszue Culture Methods, 11, 75. oldaltól, 1988; Van Drunen Littel van den Hurk és munkatársai, Vaccine 8, 358. oldaltól, 1990; Fitzpatrick és munkatársai, Virology 176, 145. oldaltól, 1990; Duque és munkatársai, Vaccine 7, 513. oldaltól, 1989; Marshall és munkatársai, Virology 165, 338. oldaltól, 1988) tisztítjuk. Alternatív módon a szekvenálni kívánt proteint eukarióta vagy prokarióta expressziós rendszerekben szintetizálhatjuk, és utána immunaffinitás-kromatográfiásan tisztítjuk.

Az aminosavszekvencia összehasonlítása

A vizsgált BHV-1-törzs esszenciális proteinjeinek aminosav-szekvenciáját összehasonlítjuk egy vagy több BHV-1-vadtípusú törzs megfelelő esszenciális proteinjeinek aminosav-szekvenciájával. Az összehasonlítani kívánt aminosav-szekvenciákat azonos orientációban (aminoterminálistól a karboxiterminális felé) úgy helyezzük el egymás mellett, hogy minél több helyzetben azonos aminosav legyen. Ennek elérésére az egyes aminosav-szekvenciákat szétválasztani és megszakítani is szabad.

A BHV-1-vadtípusú vírusok esszenciális proteinjeiben olyan epitopokat keresünk, amelyek a vizsgált BHV-1-törzs esszenciális proteinjeiben nincsenek meg. Ha a vadtípusú vírus esszenciális proteinjének aminosav-szekvenciájában legalább öt egymásra következő aminosav van, amely a BHV-1-törzs megfelelő proteinjében ezen a ponton nincs, ez már utal a vizsgált BHV-1-törzs epitopjainak megváltozására.

Fajlagos antitestek

Egyrészt BHV-1-vadtörzsek esszenciális proteinjeinek részei elleni antitesteket hordozó állatok széruma vagy szérumfrakciója. Másrészt monoklonális antitestek (hibridomatenyészet közegének alakjában vagy hibridomasejtekkel kezelt egerek intraperitoneális folyadéka formájában), amelyek BHV-1-vadtípusú vírus esszenciális proteinjeinek egyes epitopjait felismerik. Esszenciális proteinjeik megfelelő tartományában megváltozott aminosav-szekvenciát tartalmazó BHV-1-törzseket ezek az antitestek nem ismerik fel.

Szarvasmarhákból származó szérumok vagy szérumfrakciók különösen előnyösek.

Az antitestek előállítására BHV-1-vírus ellen antitesttel nem rendelkező állatot, például szarvasmarhát BHV-1-vadtípusú törzs esszenciális proteinjeinek részeivel - adott esetben adjuváns adagolása mellett immunizálunk az antigén egyszeri vagy többszöri alkalmazásával. Az immunizált állatok széruma tisztítás nélkül vagy csak az immunizáláshoz használt antigének elleni antitesteket tartalmazó szérumfrakcióként alkalmazható. Az ilyen szérumfrakció például affinitás-kromatográfiásan tisztítható.

A szarvasmarhákat ép BHV -1 -vadtípusú vírussal is immunizálhatjuk. Ez esetben a BHV-1-vadvírus esszenciális proteinjeinek csak egyes részeit felismerő antitesteket tartalmazó szérumfrakcíókat mindenképpen tisztítási eljárással lehet csak nyerni. Ez úgy történhet, hogy a szérumot BHV-1-vadtípusú vírus esszenciális proteinjeinek tisztított részeivel kezeljük, a proteinrészeket antigénként használva az antitestek adszorbeálására. Az adszorbeált antitesteket eluáljuk és összegyűjtjük (immunafFinitás-kromatográfíás eljárás).

Különösen előnyösen ép BHV-1-vadtípusú vírussal vagy e vírusok esszenciális proteinjeivel vagy e proteinek részeivel immunizált egerekből nyert monoklonális antitesteket alkalmazunk. Az állatok immunizálása, a lépsejtjeik mielomasejtekkel történő fuzionálása és az antitestek kinyerése a monoklonális antitestek előállításához ismert és szokásosan alkalmazott módszerei szerint történik („Antibodies, a Laboratory Manual”, E. Harlow und D. Lane; Cold Spring Harbor Laboratory; 1988). Ha az egereket ép BHV-1-vadvírussal oltottuk, a BHV-1-vadvírus esszenciális proteinjei ellen antitesteket képező hibridoma-tenyészeteket szelektálni kell. A hibridoma-tenyészetek szelektálása céljából például a sejttenyészet felülúszóját ELISAteszttel vizsgáljuk, BHV- 1-vadvírus esszenciális proteinjeit vagy e proteinek részeit alkalmazva antigénként. Immunológiai módszerek

Olyan technikák, amelyek segítségével szérummal, szérumfrakcióval vagy monoklonális antitestekkel a BHV-1-vírusok esszenciális proteinjeinek részeit vizsgálhatjuk (áttekintést az alábbi irodalom ad: „Antibodies, a Laboratory Manual” E. Harlow és D. Lane; Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Az itt alkalmazott szérumok, szérumfrakciók vagy monoklonális antitestek BHV-1-vadtípusú vírusok esszenciális proteinjeinek részeit felismerik. Olyan BHV-1-törzseket keresünk, amelyek esszenciális proteinjeit a fenti szérumok, szérumfrakciók vagy monoklonális antitestek nem ismerik fel, azaz olyan BHV-1-vírusokat, amelyek esszenciális proteinjeikben a BHV-1-vadtípusétól eltérő epitopok varrnak. Az alkalmazandó technika megválasztása a rendelkezésre álló szérumoktól, szérum-frakcióktól vagy monoklonális antitestektől függ. Példaként az immuno-blotot (Western biot) említjük meg, amelynek során a BHV-1 proteinjeit ismert módon SDSpoliakrilamid gélelektroforézissel szétválasztjuk, majd elektromos térben szűrőpapírra, például nitrocellulóz szűrőre futtatjuk. A szűrőt után a BHV-1-vadtípus esszenciális proteinjeinek részeit felismerő antitesteket tartalmazó szérummal vagy szérumfrakcióval vagy a BHV-1-vadtípus esszenciális proteinjeit felismerő monoklonális antitestekkel inkubáljuk. Az antitestek a szűrőn lévő antigénekhez való kapcsolódását ismert mó6

HU 215 537 Β dón enzim közvetítette színreakcióval láthatóvá tesszük („Antibodies, a Laboratory Manual”, E. Harlow und D. Lane; Cold Spring Harbor Laboratory; 1988).

Más példa az ismert Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay, amely szintén antitestek antigénekhez való megkötését enzimes színreakció útján teszi láthatóvá. Antigénként BHV-1-vírust alkalmazunk („Antibodies, a Laboratory Manual”, E. Harlow und D. Lane; Cold Spring Harbor Laboratory; 1988).

További példa az ismert immunfluoreszcencia-teszt, amely a létrejött antitest-antigén kapcsolatot fluoreszkálással mutatja ki.

Antigenitás vizsgálata

A vizsgált BHV-1-törzsben nem azonosítható (megváltozott) aminosav-szekvenciának megfelelő BHV- 1-vadtípusbeli aminosav-szekvencia-darabot megvizsgáljuk arra nézve, hogy állatban hat-e antigénként, azaz kiváltja-e antitestek képződését. Ez több módon vizsgálható, például úgy, hogy

- megvizsgáljuk az aminosav-szekvencia vízoldékonyságát, megjósoljuk a lehetséges szekunder szerkezetét, ennek alapján felbecsülni lehet a felületi expozíció valószínűségét;

-a vizsgált BHV-1-törzsben nem azonosítható (megváltozott) aminosav-szekvenciának megfelelő BHV-l-vadtípusbeli aminosav-szekvencia-darabot szintetikusan állítjuk elő, majd állatnak, előnyösen szarvasmarhának adjuk be. Ezután az immunizálás után például hetente vérmintát veszünk és a vérszérumot vizsgáljuk arra nézve, hogy tartalmazza-e a szintetikus pepiidet felismerő antitestet;

- BHV-1-vadtípusú vírussal fertőzött állatok, előnyösen szarvasmarhák szérumában keressük a BHV-1-vadtípusú vírus esszenciális proteinjeinek azon aminosav-szekvenciáját felismerő antitesteket, amely a vizsgált BHV-1-törzsben nem volt azonosítható. Például megvizsgáljuk, hogy a szérum képes-e a vizsgált BHV-1-törzsben nem azonosítható szakasznak megfelelő BHV-l-vadtípusbeli aminosav-szekvenciát megkötni. Erre való technika például az ismert ELISA (EnzymeLinked-Immunoadsorbent-Assay) -teszt vagy az antigénként szintetikus peptideket alkalmazó Immuno-Dot-Blot.

Epitop

Aminosav-szekvencia, illetve adott esetben glikozilezett aminosav-szekvencia alapú fajlagos kötési hely antitestek számára

Nukleotid-szekvenciák a BHV-1 genomjában lévő DNS részei

A nukleotid-szekvencia megváltoztatása minden olyan módszer, amely a BHV-1-vírus esszenciális proteinjeit kódoló nukleotid-szekvenciák megváltoztatására alkalmas. A változás oka lehet:

- egy vagy több nukleotid deléciója és/vagy

- egy vagy több nukleotid inzertálása és/vagy

- egy vagy több nukleotid kicserélése. Nukleotid-szekvenciák megváltoztatására kidolgozott módszerek egész sorát a „Molecular cloning” c. könyv tartalmazza (2nd edition 1989, ed. J. Sambrock, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press). A nukleotid-szekvencia megváltoztatásának az a célja, hogy a BHV-1 esszenciális proteinjein el-eltűnjön egy vagy több epitop anélkül, hogy a protein biológiai szerepe a vírus szaporodásában meghiúsulna. Deléció =egy szekvenciából egy vagy több építőelemet eltávolítani anélkül, hogy a protein funkciója gátolt lenne. Szubsztitúció =cgy szekvenciából egy építőelemet egy másik építőelemmel helyettesítünk anélkül, hogy a protein funkciója gátolt lenne

A DNS izolálása azt jelenti, hogy DNS-tartalmú elegyből (például BHV-1 tisztított vírusrészecskéiből) a DNS-t ismert módszerekkel extraháljuk (Virologische Arbeitsmethoden Bd. III, ed. A. Mayr; P. A. Bachmann; B. Mayr-Bibrack; G. Wittmann: Gustav Fischer Verlag). A genom molekuláris klónozása (lásd 14. pont) során a BHV-1-vírus genom-DNS-ét izoláljuk és a vírus esszenciális proteinjeit kódoló DNSffagmenseket, géneket vagy DNS-szekvenciákat elteqedten használt plazmidokba (pl. pBR322, pUC18/19 stb.) beépítjük. Az esszenciális proteineket kódoló géneket vagy e gének egyes részeit tartalmazó DNS-szekvenciákat úgy találjuk a BHV-1 genomján, hogy

- ezek a szekvenciák eleve ismertek (pl. a gl génje, lásd Chase és munkatársai, 1989, J. gén. Virol. 70, 1561-1569), vagy

- más herpeszvírusok, például Herpes simplex, Aujeszky, lóherpesz 1 és 4 vírusok esszenciális proteinjeit kódoló, ismert szekvenciájú gének homológiája alapján ezeket az ismert szekvenciájú DNS-szakaszokat a BHV-l-genom ffagmenseivel DNS/DNS-hibridizáljuk.

DNS-fragmensek előállítására és klónozására az alábbi könyvben találhatók módszerek: „Molecular cloning” (2nd edition 1989, ed. J. Sambrock, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press). A BHV-1-vírus DNS-fragmenseit beépítve tartalmazó plazmid arra szolgál, hogy az eredetileg izolált DNSfragmensről azonos másolatok készüljenek.

Vektorok

A BHV-l-genom DNS-fragmenseinek klónozására és/vagy adott esetben a BHV-1 esszenciális proteinjeit kódoló DNS-szekvenciák tervszerű megváltoztatására bármely ismert, a kereskedelemben kapható, baktérium vagy eukarióta plazmidvektort (pl. pBR322, puC18/19 stb.) vagy baktérium fágot (pl. lambda Ml3 stb.) alkalmazhatunk. A BHV-1 DNS-fragmenseinek a vektorba történő beépítésére, a gazdasejtekben végzett szaporításra, majd a kapott DNS újbóli izolálására az alábbi könyv tartalmaz módszereket: „Molecular cloning” (2nd edition 1989, ed. J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

A BIIV-1-vírus nem esszenciális tartományukban megváltoztatott esszenciális proteinjeinek felhasználása BHV—1-törzsek azonosítására

HU 215 537 Β azt jelenti, hogy esszenciális proteinjeiben megváltoztatott aminosav-szekvenciát tartalmazó BHV-1-törzset, amelynek alkalmazhatósága az 1. pont szerinti oltóanyag előállítására már bizonyítást nyert, egyéb, az 1. pont szerint alkalmazható BHV-1-törzsek azonosítására használunk fel az alábbiak szerint:

a) Ha találunk megváltozott aminosav-szekvenciát, ezzel egyben a BHV-1-törzs esszenciális proteinjében olyan nem esszenciális részt találtunk, amelynek aminosav-szekvenciáját meg lehet változtatni anélkül, hogy a protein működésképtelenné válna. Ez egyszerűsíti az esszenciális proteinjeikben megváltozott aminosavszekvenciát tartalmazó további BHV-1-törzsek utáni keresést, mert már jobban behatárolhatjuk az esszenciális proteinnek azt a részét, amelyet meg kell vizsgálni.

b) Ha a BHV-1-törzs esszenciális proteinjeiben tudjuk a nem esszenciális részeket, ez egyszerűsíti a BHV-1-törzsek 8f) pont szerinti előállítását, mert tudjuk az esszenciális proteinnek azt a részét, amely a genom DNS-módosításával megváltoztatható.

c) BHV-1-törzsek esszenciális proteinjeinek nem esszenciális részében lévő, megváltoztatott aminosavszekvenciát felismerő antitestek arra is alkalmazhatók, hogy segítségükkel azonos változást tartalmazó további BHV -1 -törzseket találjuk.

d) A BHV-1 megváltoztatott aminosav-szekvenciát tartalmazó esszenciális proteinjeit BHV-1-oltóanyag immunogén alkotójaként alkalmazhatjuk. Erre a célra az említett proteineket tiszta formában kell előállítani, például vírustartalmú anyagból biokémiai vagy immunológiai tisztítási eljárásokkal vagy e proteineket kódoló gének baktériumos vagy eukarióta expressziós rendszerekben történő kifejezése útján. Miután az adott protein immunogenitásáról meggyőződtünk, a proteint adott esetben adjuvánsok adagolásával - BHV-1-vírus elleni oltóanyagként alkalmazhatjuk.

A proteinek izolálása

A 16-18. pont szerinti proteinek előállítására az ismert módszereket alkalmazzuk, amelyekkel vírustartalmú anyagból vírusprotein izolálható. Az ilyen módszerek például:

a) A tisztítani kívánt proteinre fajlagos antitestekkel történő tisztítás például immunaffinitás-kromatográfiásan („Antibodies, a Laboratory Manual”, E. Harlow und D. Lane; Cold Spring Harbor Laboratory; 1988).

b) a proteinek tisztítása kromatográfiás módszerrel, például különleges töltési viszonyaik alapján ioncserélő gyantán végzett kromatográfiás tisztítás vagy móltömegük alapján molekulaszitával végzett kromatográfiás tisztítás.

Proteinek pro- vagy eukarióta expressziós rendszerekben történő expresszálása a 16-18. pont szerinti előállítására abban áll, hogy a molekuláris genetika ismert módszerei szerint a proteint klónozott gének segítségével. A leggyakrabban alkalmazott módszerek és alkalmazásuk vonatkozásában áttekintést ad az alábbi irodalom: „Molecular cloning” (2nd editioin 1989, ed. J. Sambrock, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Először az esszenciális proteineket kódoló géneket a

BHV-1 genomjából kell izolálni. Ezeket a DNS-fragmenseket úgy illesztjük a plazmidba, hogy a kódolt protein szintézise lehetséges. Expressziós rendszerek példájaként az alábbiakat nevezzük meg:

a) prokarióta rendszerek, például a lambda-gt-11 rendszer E. coli-val;

b) eukarióta rendszerek, például expressziós élesztőrendszerek, vírusos vektorrendszerek, például Vaccinia-rendszerek vagy bakulovírus-rendszerek. Szerológiai eljárás

BHV-1-vadtípusú vírussal fertőzött szarvasmarha és az 1. pont szerinti oltóanyaggal beoltott és/vagy nem BHV-1-fertőzött szarvasmarha megkülönböztetésére. Az eljárás abban áll, hogy a szarvasmarha vérszérumát megvizsgáljuk, tartalmaz-e antitesteket a BHV-1-vadtípusú törzs esszenciális proteinjeinek azon aminosavszekvenciái ellen, amelyek az 1. pont szerinti oltóanyag előállítására használt BHV-1-törzsekben módosultak. Ha igen, az állat BHV-1-vadtípusú törzzsel fertőződött meg. Ha nem, két lehetőség áll fenn: vagy az 1. pont szerint előállított BHV-1-oltóanyaggal oltották az állatot, vagy az se nem fertőzött, se nem oltott. Mindenesetre az olyan szarvasmarha, amelynek széruma a BHV-1-vadtípusú vírusnak ezt az aminosav-szekvenciáját nem ismeri fel, sohasem volt fertőzve BHV-1-vadtípusú törzzsel.

A BHV—1-vadtípusú törzs aminosav-szekvenciáit felismerő antitestek kimutatása például az ELISA-teszttel lehet. Ebben az ELISA-tesztben antigénként a BHV-1-vadtípus olyan rövid, például kémiailag előállított aminosavlánc-darabját használjuk, amely az 1. pont szerinti oltóanyag BHV-1-törzsekben nincsen (mert módosult).

Ha ezen túlmenően azt is akarjuk megvizsgálni, hogy a BHV-1-vadtípusú vírus aminosav-szekvenciája ellen antitestekkel nem rendelkező állat be van-e oltva az 1. pont szerinti oltóanyaggal, akkor a szérumban további, BHV-ra fajlagos antitesteket keresünk, például olyan ELISA-teszttel, amelyben komplett BHV-1 részecskék az antigént képezik. Ha ilyen antitestek vannak, az első ELISA-eredménnyel kombinációban azt bizonyítja, hogy a vizsgált állatot korábban az 1. pont szerinti oltóanyaggal immunizálták.

A 8. pont szerinti eljárás részletes leírása A. Módosult aminosav-szekvenciát tartalmazó

BHV-1-törzsek azonosítása A BHV—1-törzs szaporítása, genomjónak tisztítása és molekuláris klónozása 8a—1) pont szerint

Az eltérő aminosav-szekvencia keresése céljából végzett szaporításhoz minden BHV-1-törzs alkalmas. Előnyösen a BHV-1.3 szubtípushoz tartozó törzset, különösen előnyösen a BHV-1.3 N569 törzset alkalmazzuk. Ezt a törzset 1992. április 13-án a Budapesti Szerződés szabályai szerint a CNCM Pasteur-Intézetnél.

A vírust a szokásos módon állati sejtek sejttenyészetében, primer sejtekben vagy állandó sejtvonalban szaporítjuk. Alkalmasak például szarvasmarhasejtek, majomsejtek, sertéssejtek vagy kutyasejtek. Előnyösen szarvasmarha-vesesejtet, például az MD BK (ATCC

HU 215 537 Β

CCL22) permanens szarvasmarha-vesesejtet vagy származékait, vagy az EBK jelű primer szarvasmarha-vesesejtet, vagy majomvesesejtet, így a VERŐ permanens majomvesesejtet (ATCC CRL1586, CRL1587) vagy származékait vagy kutyavesesejtet, például az MDCK permanens kutyasejtet (ATCC CCL34) vagy származékait alkalmazzuk.

A vírusszaporítás ismert módon álló, gördülő vagy hordozós tenyészetekben történik, összefüggő sejtrétegben vagy szuszpenziós tenyészetében. A sejtek szaporításához felhasznált közeg bármilyen sejttenyésztő közeg lehet, például a Flow Laboratories GmbH cég (Post 1249, 5309 Meckenheim) termékismertetőjében szereplő közegek, ezek közül különösen előnyös a Minimál Essential Médium (MEM), amely lényeges alkotóként aminosavakat, vitaminokat, sókat és szénhidrátokat tartalmaz. Ezt kiegészítjük pufferoló anyagokkal, például nátrium-hidrogén-karbonáttal vagy (hidroxietil)piperazin-N-2-etánszulfonsawal és adott esetben állati szérummal, például szarvasmarha- vagy ló- vagy totális szérummal. Különösen előnyös a borjú totális széruma 1-30 térfogat%, előnyösen 2-10 térfogat% koncentrációban.

A vírus szaporításához szolgáló sejteket vagy sejtréteget a szokásos módon majdnem a konfluenciáig vagy az optimális sejtsűrűségig szaporítjuk. Mielőtt a sejteket a vírussal megfertőzzük, a sejtszaporító közeget célszerűen eltávolítjuk és a sejteket előnyösen vírusszaporító közeggel mossuk. Vírusszaporító közegként minden ismert sejttenyésztő közeg alkalmazható, előnyös a fent említett MEM-közeg. Utána vírusszuszpenzióval megfertőzzük a sejteket. A vírusszaporító közeggel hígított vírusszuszpenzió olyan sűrűségű, hogy a MOI-érték (multiplicity of infection, azaz hány fertőző vírusrészecske jut egy sejtre), 0,01-50, előnyösen 0,10-10 legyen.

A vírusszaporító közeg állati szérumot tartalmazhat. Amennyiben szérumot is alkalmazunk, annak koncentrációja a vírusszaporító közegben 1-30 térfogat%, előnyösen 2-10 térfogat%.

A fertőzést és a vírus szaporítását szobahőmérséklet és 40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 32 °C és 39 °C közötti hőmérsékleten, különösen előnyösen 37 °C-on végezzük néhány napon keresztül, előnyösen addig, míg a megfertőzött sejtek el nem pusztultak teljesen.

A vírustartalmú közeget feldolgozzuk, például a sejttörmeléket 0,1-0,45 pm pórusú szűrővel és/vagy centrifugával (akár 10000 g-vel) eltávolítjuk.

A szűrletet, illetve a felülúszót felhasználjuk a vírus feldúsítására és tisztítására. Először nagy fordulatszámú centrifugával addig centrifugáljuk a folyadékot, míg a vírusrészecskék ki nem ülepednek. Adott esetben további tisztító műveleteket, például sűrűségi gradiensben történő centrifugálást végezhetünk.

A fentiek szerint szaporított és tisztított vírusok genomját az alábbiak szerint izoláljuk és tisztítjuk.

A natív vírus-DNS-t előnyösen úgy különítjük el, hogy a tisztított virionokat detergens és proteáz vizes oldatával kezeljük.

Detergensként anionos, kationos, amfotér vagy nemionos detergenseket alkalmazhatunk. Előnyben részesítjük az ionos detergenseket, különösen előnyös a nátrium-dodecil-szulfát vagy a nátrium-lauril-szulfát.

Proteázként minden olyan proteázt alkalmazhatunk, amely detergens jelenlétében működik. Ilyen például a pronáz és a proteináz K. A. proteináz K előnyös.

A detergensek koncentrációja 0,1-10 térfogat%, előnyösen 0,5-3 térfogat%. A proteáz koncentrációja 0,01-10 mg, előnyösen 0,05-0,5 mg/ml víruslizátum.

A detergens és a proteáz előnyösen vizes, pufferolt, DN-áz inhibitort tartalmazó oldatban van jelen. Pufferanyagok lehetnek például gyenge savak erős bázissal alkotott sói, például trisz(hidroxi-metil-amino-metán) vagy erős savak gyenge bázissal alkotott sói, például primer foszfátok, vagy a felsoroltak keverékei. Előnyös a trisz(hidroxi-metil-amino-metán) alkalmazása.

A pufferanyagok vagy pufferrendszerek olyan koncentrációban kerülnek alkalmazásra, hogy a DNS a beálló pH-érték mellett ne denaturálódjon. A pH előnyösen 5 és 9 közötti, különösen előnyösen 6 és 8,5 közötti, a legelőnyösebben 7 és 8 közötti. Főleg a semleges tartományban végezzük az extrahálást.

DN-áz inhibitorként például etilén-diamin-tetraecetársavat alkalmazhatunk 0,1-10 mmol, előnyösen körülbelül 1 mmol koncentrációban.

Utána a víruslizátum lipofil részeit extraháljuk. Extrahálószerként oldószerek, így fenol, kloroform, izoamilalkohol vagy a felsoroltak elegyei alkalmazhatók. Előnyös a fenol, kloroform és izoamilalkohol elegye, és az extrahálás lehet egy- vagy többlépcsős. Az utolsó lépésben előnyös a kloroform/izoamilalkohol elegy alkalmazása. Alternatívaként először fenolt, utána kloroform és izoamilalkohol elegyét alkalmazhatjuk.

A vírus-DNS-t más módon, például a víruslizátumot CsCl-sűrűséggradiensben centrifugálva gélelektroforetikusan (Sharp és munkatársai, Biochem. 1973 (12), 3055-3063) is kinyerhetjük.

A nukleinsavak extrahálását például az alábbi irodalom tárgyalja: „Molecular cloning” (2nd edition 1989, ed. J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Az extrahált DNS-t előnyösen alkohollal, különösen előnyösen etanollal vagy izopropanollal egyértékű só, például alkálifém-klorid vagy -acetát, előnyösen lítium-klorid, nátrium-klorid vagy nátrium-acetát, kálium-acetát jelenlétében kicsapjuk a vizes oldatból.

Az alkalmazott alkohol koncentrációja 40-100 térfogat%, előnyösen 60-80 térfogat%, különösen előnyösen körülbelül 70 térfogat%.

A klorid, illetve acetát koncentrációja 0,01 és 1 mol/1, előnyösen 0,1-0,8 mol/1. LiCl₂ alkalmazása esetén a sókoncentráció 0,1-1 mol/1, előnyösen 0,4-0,8 mol/1.

Nukleinsavak kicsapására a fent említett „Molecular Cloning” c. könyv részletesen ismertet módszereket. A kicsapott DNS-t például centrifugálással lehet elkülöníteni a vizes szuszpenzióból. Az elkülönített DNS-t előnyösen alkohollal, például 70 térfogat%-os etanollal mossuk és végül vizes pufferoldatban újból feloldjuk.

Pufferanyagként például trisz(hidroxi-metil)-aminometánt alkalmazhatunk 1-100 mmol, előnyösen

HU 215 537 Β

10-50 mmol koncentrációban. A pH-érték előnyösen 6-8,5, különösen előnyösen 7-8.

További adalékként az oldat például EDTA-t (etilén-diamin-tetraecetsavat) tartalmazhat 0,1-10 mol/1, előnyösen 1-10 mmol/1 koncentrációban.

Alternatív módon a kicsapott DNS újra oldatba viteléhez 0,1 χ SSC-puffer (Molecular Cloning, loc. cit.) vagy ammónium-karbonát-puffer is alkalmazható.

A fentiek szerint tisztított vírus DNS-t restrikciós enzimekkel kezeljük a gyártók előírásai szerint. Az enzim akkor alkalmas, ha a vírus genomján legalább egy fajlagos vágóhelyet felismer.

A kapott genom-fragmenseket például elektroforézissel szétválasztjuk, az elválasztáshoz használt gélből (pl. agaróz) izoláljuk, és a vizsgálni kívánt DNS-szekvenciát tartalmazó fragmenst plazmidba vagy fágvektorba klónozzuk.

A DNS-fragmensek szétválasztása történhet kromatográfiásan vagy elektroforetikusan. Alkalmas kromatográfiás eljárás például a gélszűrés.

Az elektroforetikus eljárások során hordozóként például agaróz- vagy poliakrilamid-gélt alkalmazhatunk, az elektroforetikus puffer lehet például etiléndiamin-tetra-ecetsav/foszfátpuffer (ÉPP) vagy trisz(hidroxi-metil)-amino-metán/borát/etilén-diamin-tetraecetsav-puffer (TBE), mely utóbbinak az összetétele az alábbi:

trisz 10-100 mmol/1, előnyösen 40-90 mmol/1, különösen előnyösen 80-90 mmol/1, bórsav 10-100 mmol/1, előnyösen 40-90 mmol/1, különösen előnyösen 80-90 mmol/1,

EDTA 1-10 mmol/1, előnyösen 1 -2,5 mmol/1, pH 7-9, előnyösen 8-8,5, vagy trisz(hidroximetil)-aminometán/acetát/EDTApuffer (TAE);

trisz 10-100 mmol/1, előnyösen 30-90 mmol/1, különösen előnyösen 40 mmol/1, nátrium-acetát: 1-100 mmol/1, előnyösen 5-50 mmol/1,

EDTA 1-10 mmol/1, előnyösen 1 -2,5 mmol/1, pH 7-9, előnyösen 7,5-8,5.

Az elektroforézis során alkalmazható pufferek részletes felsorolása, leírása az alábbi irodalomban található:

- Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988, Verlag Wiley-Interscience, 1987;

- A Practical Guide in Molecular Cloning, B. Perbei, 2^nd edition Verlag Wiley-Interscience 1988;

- Molecular Cloning (lásd fent);

- Virologische Arbeitsmethoden, III. kötet, Gustav Fischer Verlag, 1989.

Az eljárás teljes leírása az alábbi irodalomban található: „Molecular cloning” (2^nd edition 1989, ed. J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press), valamint Virologische Arbeitsmethoden, lásd fent.

A vizsgálni kívánt fragmenst például úgy izolálhatjuk, hogy a fragmenst tartalmazó hordozódarabot áram alatt eluáljuk. Alternatív megoldás az alacsony olvadáspontú agarózzal dolgozó módszer vagy a DNSfragmens adszorbeálása üvegfelületen (Gene-clean^R módszer).

A DNS-fragmens vektorba történő beépítése céljából kétszálú plazmid- vagy fág-DNS-t restrikciós enzimekkel kezeljük, hogy beépítésre (inszertálásra) alkalmas végek keletkezzenek. Alkalmas plazmidok például: pAT153, pACYC184, pUC18/19, pBR322, pSP64/65. Fágvektorként lambda-fágok variánsai jöhetnek számításba, például -ZAP, -gtlO/11 vagy a M13mpl8/19 fág.

Az alkalmazható restrikciós enzimek ismertek (pl. Gene 92 (1989), Elsevier Science Publishers BV Amsterdam).

A restrikciós enzimmel vágott plazmidot vagy fágvektort a beépíteni kívánt DNS-fragmens feleslegével (pl. 5:1 arányban) összekeverjük, majd ligázzal kezeljük, a két DNS végeinek összenövesztése céljából. A ligáz: olyan enzim, amely képes két DNS-molekula 3’-OH-5’-OH-csoporton keresztül történő összekapcsolására.

A ligáit elegyet a plazmidok és fágok szaporítása céljából pro- vagy eukarióta sejtekbe, előnyösen baktériumokba juttatjuk, és ezeket szaporítjuk. Baktériumként például az Escherichia coli K-12 törzs vagy származékai, például K-12-600 (Molecular cloning) jöhetnek számításba.

A ligálási elegy és a baktériumtenyészet előkészítése ismert módon történik (a fent megadott irodalom: Molecular cloning).

A beépített idegen DNS-t hordozó plazmidot vagy fágot tartalmazó baktériumokat szelektáljuk. Virus-DNS-szekvenciák meghatározása, a meghatározott szekvenciából a megfelelő protein aminosav-szekvenciájának levezetése (8a-1)

A fentiek szerint klónozott vírus-DNS-fragmensek, illetve szubklónjaik nukletod-szekvenciáját a szokásos módszerekkel (A Practical Guide in Molecular Cloning,

B. Perbei, 2^nd edition Verlag Wiley-Interscience 1988; Molecular Cloning (lásd fent) vagy Virologische Arbeitsmethoden, III. kötet, Gustav Fisch Verlag, 1989, ed. A Mayr, P. A. Bachmann, B. Mayr-Bibrack és G. Wittmann) határozzuk meg.

A nukleotid-szekvenciából az ismert genetikai kód alapján a vírusprotein aminosav-szekvenciáját határozzuk meg (Biochemie, A. L. Lehninger Verlag Chemie 1977).

Vírusprotein közvetlen aminosav-szekvenálása 8a-2) szerint

Az aminosav-szekvencia meghatározását nem kell feltétlenül a DNS-szekvenálás alapján elvégezni, hanem a tisztított proteint közvetlenül is lehet szekvenálni. Az erre szolgáló különböző módszerek például az alábbi irodalomban találhatók: Virologische Arbeitsmethoden, III. kötet, Gustav Fischer Verlag, 1989, ed. A Mayr, P. A. Bachmann, B. Mayr-Bibrack és G. Wittmann). Vírusprotein megváltozott aminosav-szekvenciájának felismerése 8b) szerint

A megvizsgált BHV-1-törzs aminosav-szekvenciáját összehasonlítjuk más BHV-l-törzsek és/vagy izolátumok vagy vadtípusú törzsek megfelelő aminosav-szekvenciájával, így találjuk a protein megváltozott

HU 215 537 Β régióit. A megváltozott (vagy megváltoztatott) régiót akkor tekintjük a találmány céljaira alkalmasnak, ha a módosulás legalább egy epitop elvesztését okozta, azaz ha az aminosav-szekvencia legalább 5 egymásra követő aminosavban különbözik az összehasonlításra használt törzsétől. Ettől függetlenül egy vagy több új epitop keletkezhet is.

A vírusproteinben megváltozott régiót tartalmazó BHV-1 -törzsek azonosítására alkalmas immunológiai módszer (8c)

A vírusprotein megváltozott régióit nemcsak DNSszekvenálás vagy aminosav-szekvenálás alapján lehet azonosítani, hanem alternatív módon olyan poli- vagy monoklonális antitestek segítségével is, amelyek egy BHV-l-vadtörzs egyetlen enzimjének csak egy részét fajlagosan felismerik. Megvizsgáljuk, hogy ezek az antitestek milyen mértékben képesek a vizsgálni kívánt BHV-1-törzshöz kötődni. Az erre alkalmas módszerek például: immunfluoreszcencia-teszt, ELISA, immunobiot. Ha az antitest a BHV-1-vadtípusú törzshöz kötődik, a vizsgált BHV-1-törzshöz azonban nem, akkor a vizsgált BHV-1-törzs proteinje abban a szekvenciában szenvedett változást, amely szekvenciát az adott antitest felismerné.

B. Az antigenitás vizsgálata (8d)

1. Aminosav-szekvencia antigenitásának elméleti értékelése

Az aminosav-szekvencia fíziko-kémiai jellege, például a hidrofób, illetve hidrofil viselkedés mértéke valószínűsíti az adott aminosav-szekvencia antigenitását. A potenciálisan antigén szekvenciák azonosítása alkalmas komputerprogramok segítségével történik.

2. Az antigenitás in vivő vizsgálata

BHV-1-vadtípusú törzsnek a vizsgált BHV-1törzsben megváltozottnak azonosított aminosav-szekvenciának megfelelő szekvenciát tartalmazó proteinjét kémiailag szintetizáljuk vagy biokémiailag tisztítjuk, majd állatban, előnyösen szarvasmarhában vizsgáljuk az antigenitását. Amennyiben a peptid haptén, célszerűen hordozóhoz kötjük beadás előtt. Alkalmas hordozók példáiként az alábbiakat nevezzük meg: szarvasmarha-szérumalbumin, ovalbumin vagy KHL (Keyhole Limpet Hemocyanin). A szintetikus peptid és a hordozó összekapcsolása ismert módon történik az alábbiak szerint.

Szarvasmarhákat változatlan aminosav-szekvenciájú BHV-1-törzzsel megfertőzünk, utána azt vizsgáljuk, hogy képződik-e antitest. Hetente vagy havonta mintát veszünk az állat szérumából és immunológiailag teszteljük. Ha az állatok a fertőzéshez felhasznált BHV-1-törzs azon aminosav-szekvenciáját felismerő antitesteket képeznek, amely szekvenciának megfelelő szakaszt a vizsgált BHV-1-törzsben megváltozottnak azonosítottuk, akkor a meg nem változott szekvencia antigenitását bizonyítottnak tekintjük. A meg nem változott aminosav-szekvencia elleni antitestek kimutatására például az ELISA-teszt alkalmas, amelynek során a meg nem változott aminosav-szekvenciát vagy annak részeit tartalmazó peptidet alkalmazunk antigénként.

A megváltozott aminosav-szekvenciát tartalmazó

BHV-1-törzzsel egyszeresen vagy többszörösen megfertőzött vagy e törzs inaktivált vírusával kezelt szarvasmarha nem képezhet antitestet a vadtípusú vírus azon aminosav-szekvenciája ellen, amely a vizsgált BHV-1törzs megváltozottnak azonosított aminosav-szekvenciájának a helyén van.

3. BHV-1-törzs antitest szempontjából ismert szarvasmarhaszérum vizsgálata Olyan szarvasmarhaszérumot, amelynek a BHV-1törzs ellen fajlagos antitesttartalmát ismerjük, megvizsgáljuk arra nézve, hogy tartalmaz-e olyan BHV-1-antitestet, amely a vadtípusú törzsnek a megváltozott törzsben megváltozottnak azonosított aminosav-szekvencia helyén lévő aminosav-szekvenciáját felismeri. A vizsgált, megváltozott aminosav-szekvenciájú BHV-1törzs 1. pont szerinti találmány szerinti oltóvírusként akkor alkalmas, ha

1) a BHV-1 elleni antitesteket tartalmazó szérum a meg nem változott szekvencia ellen is tartalmaz antitesteket (például vírussemlegesítési teszttel vagy antigénként BHV-1-vírust alkalmazó ELISAteszttel állapítható meg) és

2) a BHV -1 ellen kimutatható antitesteket nem tartalmazó szarvasmarhaszérum a meg nem változott aminosav-szekvencia ellen sem tartalmaz kimutatható antitestet.

C. Az immunogenitás vizsgálata 8c szerint

A találmány értelmében BHV-1-jelzővakcina vírustörzseként alkalmas BHV-1-törzs megkeresése során a törzs immunogenitását is vizsgáljuk az alábbiak szerint.

A vizsgált BHV-1-törzset vagy szaporodásra képes vírusként (élővakcina) vagy maktivált vírusként, adott esetben adjuvánssal kiszerelve szarvasmarhába juttatjuk. Ez intramuszkulárisan, szubkután, intratracheálisan, intranazálisan, intravaginálisan, intrapreputálisan vagy a konjunktivális zsákba applikálva történhet. Az oltás eredményét ellenőrizhetjük

- szerológiailag, azaz képződtek-e a fertőzés után BHV-1-vírusra fajlagos antitestek (semlegesítési teszt vagy ELIZA),

- megfertőzést kísérletben, virulens BHV-1-törzs felhasználásával; immunizált és nem immunizált állatoknak a kísérleti fertőzésre kiváltott klinikai reagálását hasonlítjuk össze.

Az alkalmas törzsek egy vagy két immunizálás után észrevehetően csökkentik a BHV-1-fertőzés klinikai tüneteit.

D. BHV-1-törzsek 8f) szerinti géntechnológiai előállítása 1. pont szerinti alkalmazás céljából

D.l A BHV-1 esszenciális proteinjeinek nem esszenciális részeinek azonosítása

Az esszenciális proteinekben lévő, a vírus szaporodása szempontjából nem esszenciális szakaszok azonosítására két módszer van:

a) létező BHV-1-törzsekben felkutatjuk a megváltozott aminosav-szekvenciákat. A fent már leírtak szerint megváltozott aminosav-szekvenciát tartalmazó BHV-1-törzseket DNS- vagy aminosav-elemzéssel

HU 215 537 Β azonosítjuk. Azonosítás után a megfelelő genomszekvenciát molekulárisán klónozzuk (ha ez eddig még nem történt meg).

b) Proteineket kódoló genomszekvenciát módosítunk, például nukleotidek kicserélése, kivágása, beépítése útján, utána megvizsgáljuk a módosítás jelentőségét a módosított vírus szaporodási képessége szempontjából. A vizsgált genomszekvencia és belőle adódó aminosav-szekvencia a vírus szaporodása szempontjából nem esszenciálisnak tekinthető, ha az aminosav-szekvencia módosítása nem szünteti meg a vírus szaporodását.

D.2 Az azonosított, nem esszenciális szekvenciáknak BHV-1 -törzzsel fertőzött szarvasmarhákra gyakorolt antigénhatásának kimutatása

a) Aminosav-szekvencia antigenitásának elméleti értékelése

A D.l szerint azonosított aminosav-szekvencia elméleti értékelése a fent leírtak szerint történik.

b) Az antigenitás in vivő vizsgálata

A vírus szaporodása szempontjából nem esszenciálisnak minősített aminosav-szekvenciát kémiailag szintetizáljuk vagy BHV-1-vírusból biokémiai tisztítással kinyerjük, majd állaton, előnyösen szarvasmarhán vizsgáljuk a peptid antigenitását a már leírt módon.

A lényeg az, hogy a BHV-1-vírusban nem esszenciálisnak azonosított aminosav-szekvenciát BHV-1-vírussal fertőzött állat szervezete felismeri-e mint antigént.

A szarvasmarhákat BHV-1-vírussal megfertőzzük, utána megvizsgáljuk, hogy képződtek-e antitestek. Hetente vagy havonta szérummintát veszünk és immunológiai teszteket végzünk vele. Ha az állatok a fertőzés után antitesteket képeznek a fentiek szerint azonosított aminosav-szekvencia ellen, e szekvencia antigenitását bizonyítottnak tekintjük. Immunológiai módszer az aminosav-szekvencia elleni antitestek kimutatására például az ELISA-teszt, amelyben antigénként a fenti, BHV-1-vadtípusú törzsből izolált aminosav-szekvenciát alkalmazzuk. A pepiidet kémiailag szintetizálhatjuk vagy BHV-1-vadtípusú törzsből biokémiai tisztítással nyeljük.

Azt tapasztaltuk, hogy BHV-1-vírussal fertőzött vagy ezt a vírust inaktivált antigénként tartalmazó szarvasmarhák a BHV-1-vírusban nem esszenciálisnak azonosított aminosav-szekvencia ellen többszörös beadás után sem képeznek antitesteket.

D.3 BHV-1-mutáns előállítása az azonosított aminosav-szekvenciának beépítés, helyettesítés vagy kivágás útján végzett módosításával

A nem esszenciálisnak azonosított szekvenciát kivágás, helyettesítés vagy beépítés útján változtathatjuk meg. Első lépésként a nem esszenciális aminosav-szekvenciát kódoló DNS-szekvenciát hordozó genom-fragmenst molekulárisán klónozzuk. Ezt követően ezekből az előnyösen vektorokban klónozott DNS-szekvenciákból a molekuláris genetika ismert módszereivel a nem esszenciális aminosav-szekvenciát kódoló DNS-szekvenciát részben vagy teljesen eltávolítjuk és/vagy más nukleotid-szekvenciát építünk be. Ha a vírus szaporodása szempontjából esszenciális proteinnek csak egy részét eltávolítjuk, nem szabad, hogy e hiány a protein működését gátolja, a vírusszaporodásban való szerepét meghiúsítsa. Az aminoszekvencia megváltoztatásának a vírus szaporodására gyakorolt hatását szövettenyészetben vizsgáljuk. Esszenciális protein nem esszenciális részében megváltoztatott aminosav-szekvenciát tartalmazó, 1. pont szerinti oltóanyag előállítására alkalmazható vírusnak szövettenyészetben szaporíthatónak kell lennie.

Ha beépítünk egy nukleotid-szekvenciát, a megfelelő protein funkciójának szintén nem szabad változnia, mert a vírus szaporodása szempontjából esszenciális proteinről van szó. A beépített rész aminosav-szekvenciát kódolhat, amely alapján a módosított vírus azonosítható. A fentiek szerint kivágással vagy beépítéssel módosított DNS-szekvenciát például ko-transzfekció útján a BHV-l-vírus genomjával rekombinálhatjuk olyan rekombináns BHV-l-vírus előállítása céljából, amelyből a nem esszenciális aminosav-szekvencia részben vagy teljesen hiányzik, vagy amely ehelyett új, megváltoztatott aminosav-szekvenciát tartalmaz.

D.4X BHV-l-vírus elleni antitestek és az azonosított aminosav-szekvencia elleni antitestek előfordulásának korrelációja

Olyan szarvasmarhaszérumot, amelynek a BHV-1törzs ellen fajlagos antitesttartalmát ismerjük, megvizsgálunk arra nézve, hogy tartalmaz-e olyan antitestet, amely az azonosított aminosav-szekvenciát felismeri. Megfelelő vizsgálati módszer például az ELISA-teszt, amelyben antigénként az azonosított aminosav-szekvenciát alkalmazzuk.

A nem esszenciálisnak azonosított aminosav akkor alkalmazható találmány szerinti jelzőként BHV-1 elleni vakcinában, ha

1) a BHV-1 elleni antitesteket tartalmazó szérum a meg nem változott szekvencia ellen is tartalmaz antitesteket (például vírussemlegesítési teszttel vagy antigénként BHV-1-vírust alkalmazó ELISA-teszttel állapítható meg) és

2) a BHV-1 ellen kimutatható antitesteket nem tartalmazó szarvasmarhaszérum a meg nem változott aminosav-szekvencia ellen sem tartalmaz kimutatható antitestet.

Tesztként a már említett ELISA-teszt jöhet számításba, antigénként az azonosított aminosa-szekvenciával. D.5 Az immunogenitás vizsgálata

A vizsgálat a fent leírtak szerint történik.

I. Anyagok, módszerek

1. A sejt- és vírusanyag

Sejtrendszerként permanens szarvasmarha-vesesejtet (MDBK-sejtet) alkalmaztuk. Az alábbi BHV-1törzsek kerültek felhasználásra:

- BHV-1.1 Schleswig-Holstein (SH)

- BHV-1.2a Schönböken (SB)

- BHV-1.2b Ausztrália 12 (Ausl2)

-BHV-1.3 N569

Az SH, SB és Ausl2 törzsek a BHV-1-vadtípusú törzseket képviselték.

2. Sejt- és vírusszaporítás

Sejtszaporítás céljából 50 χ 10³ sejt/ml koncentrációjú MDBK-sejtszuszpenzió 100 ml-jét 175 cm² felületű

HU215 537B

Roux-palackba bemérjük és az alábbi összetételű közegben szaporítjuk: E-MEM + 0,85 g hidrogénkarbonát/1 (Mayr és munkatársai, 1974, Virologische Arbeitsmethoden II. köt. Gustav Fischer Verlag Stuttgart) + 10% borjúfotusz-szérum.

Vírusszaporítás céljából 3-5 nap elteltével a Rouxpalackokból eltávolítjuk a közeget az összefüggő sejtpázsit felől (kb. 500xlO⁶ sejt/Roux-palack), és E-MEM-ből és 2,0 g/1 hidrogén-karbonátból álló közeggel (Mayr és munkatársai, 1974, Virologische Arbeitsmethoden II. köt. Gustav Fischer Verlag Stuttgart) helyettesítjük. A sejteket 0,01-0,5 MOI értékű vírusmennyiséggel megfertőzzük. A fertőzés után 3-4 nappal, a 100%-os citopatogén hatás beálltakor a vírust begyűjtjük.

3. A vírustiter meghatározása

A vírusszuszpenziók titelj ének a meghatározására 96-lyukas lemezeket (Nunc), amelyeket összefüggő sejtpázsit fedi, lóg 10-lépésekkel 10¹ és 10 ⁹ közötti hígitási sort készítünk a vírusból, hígításhoz a vírusszaporításhoz is alkalmazott közeget használva. A lemez mindegyik mélyedésébe 200 μΐ hígított vírusszuszpenziót juttatunk, mindegyik hígítás 8 ismétlésben. Az elért vírustitert Spearman és Kárber módszerével (Mayr és munkatársai, 1974, Virologische Arbeitsmethoden II. köt. Gustav Fischer Verlag Stuttgart) számítjuk ki.

4. A BHV-1 szerkezeti fehérjének előállítása

Vírusprotein kinyerése céljából összefüggő MDBKsejteket megfertőzünk, és a fertőzés utáni 6. órától a 20. óráig ³⁵S-metioninnal metabolikusan megjelölünk. A vírusos glV proteint mono-fajlagos anti-glV-szérummal kicsapjuk, 10%-os SDS-poliakrilamin-gélen Lámmli módszerével szétválasztjuk, és fluorgráfia után autoradiográfiásan láthatóvá tesszük. A kísérletben a glV protein legnagyobb része már glikozilezett volt. A kicsapás csak a protein érett formáját érintette.

5. Vírus-DNS tisztítása

Összefüggő sejtpázsittal benőtt Roux-palackokat a vírussal oltunk, majd 37 °C-on 3-4 napon át inkubálunk. Ha a citopatogén hatás 100%-os, az egész szuszpenziót 20 percen át 5000 g-vel centrifugáljuk. Az üledéket foszfátpufferben (140 mmol/1 NaCl, 2,7 mmol/1 KC1, 6,5 mmol/1 Na₂HPO₄, 0,7 mmol/1 CaCl₂, 0,5 mmol/1 MgCl₂, 1,5 mmol/1 KH₂PO₄) újból szuszpendáljuk és újból centrifugáljuk (10000 g/20 perc). A felülúszókat egyesítjük, 100000 g-vel centrifugáljuk, és a vírusból álló üledék 100 μΐ közeggel készített szuszpenzióját egy éjszakán át állni hagyjuk. Ezt követően a víruspellethez 5 ml foszfátpuffert adunk, amely 5 mmol/1 MgCl₂-t tartalmaz, és homogenizálás után DN-ázI-et adagolunk 100 μg/ml végkoncentrációig. Az elegyet 37 °C-on 1 órán át inkubáljuk. A DN-ázos kezelés után a vírustörmeléket 100000 g-vel egy órán át 10%-os szacharóz-párnán keresztül centrifugáljuk. A szilárd anyagot 1,8 ml 8,0 pH-jú trisz-pufferben szuszpendáljuk, 200 μΐ 20%-os szarkozilt adagolunk és az elegyet 56 °C-on egy órán át inkubáljuk. A vírus-DNS-t 20 °C-on, fix szögű rotorban 300000 g mellett 48 órán keresztül CsCl₂-egyensúlyi gradiensben (5,7 mmol/1 CsCl₂, 10 mmol trisz pH 7, 100 mmol/1 EDTA) centrifugáljuk, a gradienst frakcionáljuk és az egyes részeket 0,6%-os agaróz-gélen vizsgáljuk. A DNS-tartalmú frakciókat egyesítjük, még egyszer CsCl₂-gradiensben centrifugáljuk, majd 20 mmol/1 8,0 pH-jú trisz-pufferrel szemben dializáljuk. A DNSkoncentrációt fotometriásan, 260 nm hullámhossz mellett határozzuk meg.

6. glV klónozása és szekvenálása

6.1 Klónozás

Az SB BHV-1-törzs tisztított DNS-ét Hindlll restrikciós enzimmel vágjuk (az enzimet Boehringer/Mannheim gyártja, felhasználás a gyártó adatai szerint). A kapott fragmenseket 0,6%-os agarózgélen TA-pufferban (33 mmol/1 trisz, 66 mmol/1 kálium-acetát, 10 mmol/1 Mg-acetát, pH jégecettel 7,9; 0,1 mg/ml BSA, 0,5 mmol/1 DDT) elektroforézis útján szétválasztjuk. A 6,6 kbp-nyi HindlII-L-fragmenst elektro-eluáljuk (Sambrook és munkatársai, 1989, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press). A HindlII-L-fragmenst a pUC12 vektor HindlII-vágóhelyébe beleillesztjük T4-ligáz segítségével. E célból a vektor DNS-ét Hindlll enzimmel kezeljük, az üres önmagába zárást az 5’-foszfátcsoport alkálikus foszfatázzal végzett lehasításával megakadályozzuk, és a vektor linearizált DNS-ét az izolált HindlIIfragmenssel és T4-ligázzal együtt inkubáljuk.

Az Ausl2 törzs esetén az SB törzs HindlII-Lfragmensével kereszthibridizáló, 8,0 kbp-nyi HindlIIDNS-ffagmenst a fent leírtak szerint izoláljuk, és szintén a pUC12 vektor linearizált DNS-ével és T4-ligázzal inkubáljuk.

Ezt követően a plazmidokat E. coli C600 baktériumokba transzformáljuk (Sambrook és munkatársai, 1989, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press), és a rekombináns plazmidokat tartalmazó baktériumklónokat - felismerhető az ampicillinrezisztencia és a hiányzó lacZ.aktivitás alapján - szelektáljuk (Sambrook és munkatársai, 1989, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Szekvenálás céljából a rekombináns plazmidokat tartalmazó baktériumokat szaporítjuk és a plazmidDNS-t tisztítjuk (Sambrook és munkatársai (1989) Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Utána a DNS-t Pstl enzimmel vágjuk, és a kapott fragmenseket 0,6%-os agarózgélen elektroforézis útján szétválasztjuk, majd elektro-eluáljuk (Sambrook és munkatársai (1989) Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Az izolált DNS-fragmensek a pEMBL19 szekvenáló vektorba illesztjük, majd azt a vektort E. coli C600 baktériumokban szaporítjuk (Sambrook és munkatársai (1989) Molecular Cloning. Cold. Spring Harbor Laboratory Press).

Az N569 törzs glV-génjének azonosítására a törzs genom-DNS-ét Pstl enzimmel hasítjuk, és a fragmenseket 0,6%-os agarózgélen TA-pufferben elektroforézis útján szétválasztjuk. Ezt követően a DNS-fragmenseket Southern Biot segítségével nitrocellulóz-lemezre visszük át (Sambrook és munkatársai (1989) Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press) és az SB-törzs radioaktív jelzéssel ellátott HindlII-Lfragmensével hibridizáljuk (Sambrook és munkatársai

HU 215 537 Β (1989) Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press). A hibridizációs reakció alapján

10.1 kbp méretű fragmenst azonosítunk az N569 glVgénjének hordozójaként. A glV-gén azonosítása után a megfelelő 10,1 kbp-fragmenst gélelektroforetikusan, 5 majd elektro-eluálással elkülönítjük és T4-ligázzal és SB- és Aus 12 törzsek kapcsán már leírtak szerint a pUC12 vektor Pstl-vágóhelyébe illesztjük. E célból a vektor DNS-ét PstI enzimmel vágjuk, az üres visszazárást az 5’-foszfátcsoport alkálikus foszfatázzal végzett lehasításával megakadályozzuk, és a linearizált vektorDNS-t az izolált 10,1 kbp-fragmenssel és T4-ligázzal inkubáljuk.

6.2 Szekvenálás

A Pstl-fragmensek szekvenálását olyan módszer segítségével végeztük, amelyet „chromosomenwalking”-nak is neveznek. A módszer jól alkalmazható akkor, ha egy meglévő klón nagy szakaszait további szubklónozás nélkül gyorsan akarjuk szekvenálni. Ennek során primerként szintetikus nukleotideket alkal- 20 mázunk, amely a beépített rész különböző helyein hibridizálnak, és ott indítjuk a Sanger-féle szekvenálást.

A fragmenseket a Pstl-vágóhely felől szekvenáljuk.

A szekvencia végével hibridizáló új oligonukleotidet készítünk, ezt az egyetemes primer helyett alkalmazzuk. Az új primerrel tovább szekvenálunk a ffagmensekbe, és a fenti eljárásmódot ismételjük. Tekintettel arra, hogy a fragmensek egy-két helyen nem lapolják át egymást, a fragmenseket az ExoIII/Sl rendszenei célravezetőén kurtítjuk, kigáljuk, majd E. coli C600 baktériumokban klónozzuk. Ezekből a szubklónokból adódnak a szükséges átlapolások a már meglévő szekvenciákhoz.

7. BHV-l-vírus elleni szérumsemlegesító antitestek meghatározása

A szérumsemlegesítési tesztet semlegesítő BHV-1antitestek kimutatására a Virologische Arbeitsmethoden

II. kötetben (Gustav Fischer Verlag Stuttgart) előírásai szerint végezzük.

8. A peptid hordozóként használt boíjúszérum-albuminhoz (BSA) történő kapcsolása

8.1 Pep2

A szintetikusan előállított Pep2 aminosav-szekvenciája a Schönböken BHV-l-törzs glV proteinje 317-333. amínosavjának felel meg:

gly-gly-ala-glu-gly-pro-lys-pro-gly-pro-ser-proasp-ala.

8.2 Pep3

A szintén kémiailag szintetizált Pep3 és Pep2 15 aminosavja mellett a Schönböken BHV-1-törzs glVjének további 15 aminosavját tartalmazza, így az SB BHV-l-törzs glV peptidjének 307-338. aminosavjával rendelkezik:

asp-gly-glu-ser-gln-thr-pro-glu-ala-asn-gly-glyala-glu-gly-glu-pro-lys-pro-gly-pro-ser-pro-asp-alaasp-arg-pro-giu-gly.

8.3 A szintetikus peptid és a BSA összekapcsolása mg szintetikusan előállított peptidet (Pep2 vagy Pep3) 1 ml 7,4 pH-jú foszfátpufferben oldunk és a pHértéket 7,0-ra állítjuk. Pep2 esetén 11 mg, Pep3 esetén 6,2 mg BSA-t 1 ml PBS-pufferben feloldunk, és az oldatot erélyes keverés közben a peptidoldathoz adjuk. 10 Ezt követően 2 ml 0,2%-os, PBS-pufferrel készített glutáraldehid-oldatot adunk a peptid-BSA-elegyhez. Az elegyet szobahőmérsékleten egy éjszakán inkubáljuk, a következő napon még 0,8 ml 1 mólos, BPS-pufferrel készített glicinoldatot adagolunk, az elegyet egy órán át 15 keverjük, majd a kapott konjugátumot 7,4 pH-jú PBSpufferrel szemben 5 órán át dializáljuk, adagokba osztjuk, majd -20 °C-on befagyasztjuk.

9. ELISA BHV-l-antitest meghatározása (TV-ELISA) szarvasmarhaszérumban

A TV (=teljes vírus) ELISA-teszt során antigénként az SH BHV-1 -törzs gradienssel tisztított vírusrészecskéit. A 96 lyukú lemez (Immulon, F-forma, Dynatech) mindegyik mélyedésébe 50 ng antigén 50 μΐ coating-pufferrel (1,06 g Na₂CO₃, 2,93 g 25 NaHCO₃ 1 liter desztillált vízre, pH 9.6) készített elegyét juttatjuk. Utána a lemezeket 37 °C-on 16 órán át CO₂ alatt inkubáljuk. Utána a lemezeket háromszor mossuk mosópufferrel (PBS + 0,05% Tween 20 + IM NaCl), utána (kivéve az üres értéket szolgáltató le30 mezt) blokkpuffert (200 μΐ PBS/Tween + IM NaCl + 2% ovalbumin) adunk rájuk. Mind a lemezeket, mind az 1:100 arányban blokkpufferrel hígított szérumokat egy órán át 37 °C-on inkubáljuk. Mosópufferrel háromszor mossuk a lemezeket, utána két ismétlés35 ben mélyedésenként 100 μΐ szérumot (1:100 1:51200 arányban hígított) pipettálunk a lemezekre. Nedves kamrában 37 °C-on végzett egy órás inkubálás után a lemezeket alaposan mossuk, majd mélyedésenként 50 μΐ POD-kapcsolt házinyúl-antimarha-kon40 jugátumot (0,05% Tweent tartalmazó PBS-pufferrel 1:2000 arányban hígítva) adagolunk. A lemezeket újból 37 °C-on 2 órán át inkubáljuk, mossuk, lyukanként 100 μΐ szubsztrátumoldattal (11 mg ABTS 100 ml desztillált vízzel és 2,1 g citromsavval készített 45 4,2 pH-jú oldata) látjuk el, majd sötétben 60 percen át inkubáljuk. Az optikai sűrűséget 405 nm hullámhossz mellett mérjük. Az ELISA-tesztben 0,1 értékű extinkciót eredményező szérumhígítást antítesttitemek definiáljuk. Az 1:1000 értéket meghaladó titer 50 esetén a szérumot BHV-1-pozitívnek értékeltük.

Mindegyik ELISA-tesztnél az alábbi kontrollokat is indítottuk:

Kontroll	antigén	1. AT	2. AT	Szubsztrátum
üres érték	nem	nem	nem	igen
antigén kontroll	igen	nem	igen	igen

HU 215 537 Β

Táblázat (folytatás)

Kontroll	antigén	1. AT	2. AT	Szubsztrátum
antitest kontroll	nem	igen	igen	igen
konjugát kontroll	nem	nem	igen	igen

10. Antigénként szintetikus peptiddel (Pep2) dolgozó

ELISA-teszt szarvasmarhaszérum vizsgálásához, a

BHV-1 gD-proteinje elleni antitestek mennyiségi meghatározása céljából (Pep-ELISA).

A Pep-ELISA-tesztben a Dynatech cég F alakú, lyukú, immulon nevű lyuklemezét. Antigénként a BSA-hoz kapcsolt Pep2 peptidet alkalmaztuk (lásd 8. pont), 100 ng/lyuk mennyiségben, 50 μΐ fedő pufferben.

Az előkészített lemezeket +37 °C-on nedves kamrában 16 órán keresztül inkubáltuk, majd mosópufferrel (PBS + 0,05% Tween 20) háromszor mostuk. Ezt követően az összes mélyedésbe 200 μΐ blokkoló puffért (PBS + 0,05% Tween 20+1% sovány tejpor), illetve a vizsgálni kívánt szérumokat (1:100 arányban blokkoló pufferrel hígítva, 1,5 M NaCl) adtuk. Mind a blokkolt lemezeket, mind a hígított szérumokat 37 °C-on 1 órán át inkubáltuk. Ezt követően a vizsgálni kívánt szérumok

1:100 - 1:3200 arányú hígításait (a hígítószer 1,5 M

NaCl-t tartalmazó blokkoló puffer) a lemezekre pipettáltuk, és a lemezeket 37 °C-on 2 órán át inkubáltuk. Utána a lemezeket mosópufferrel háromszor mostuk, és mindegyik mélyedésbe 50 μΐ házinyúl-antimarha-POD-konjugátumot (mosópufferrel 1:2000 arányban hígítva) adtunk. A lemezeket 37 °C-on 2 órán át inkubáltuk, háromszor mosópufferrel mostuk, és mindegyik mélyedésbe 100 μΐ szubsztrátumoldatot pipettáltunk (11 mg ABTS, 98 ml szubsztrátumpufferben oldva; az utóbbi 2,1 g citromsav 98 ml desztillált vízzel készített oldata, pH 4,2). A lemezeket sötétben, 37 °C-on egy órán át inkubáltuk, utána a színreakciót 100 μΐ 1%-os SDS-oldattal leállítottuk. A mérés 405 nm hullámhossznál történt.

Mindegyik ELISA-tesztnél az alábbi kontrollokat is indítottuk:

Kontroll	antigén	l.AT	2. AT	Szubsztrátum
üres érték	nem	nem	nem	igen
antigén kontroll	igen	nem	igen	igen
antitest kontroll	nem	igen	igen	igen
konjugát kontroll	nem	nem	igen	igen

Kiértékelés

Ha a szérum 1:100 hígításának extinciójából kivonjuk az antitest-kontroli extinkcióját és a maradék 0,100 O.D.-nál nagyobb, a szérum BHV-1-pozitív.

Ha a szérum 1:100 hígításának extinkciójából kivonjuk az antitest-kontroli extinkcióját és a maradék 0,100 O.D.-nál kisebb, a szérum BHV-1-negatív.

11. Dót biot

A protein felvitele előtt a hordozó membránt (immobilien P, Millipore) metanollal nedvesítjük, majd bő desztillált vízzel mossuk és felhasználásig foszforpufferben tároljuk. 0,5 pg és 1,0 pg szintetikus peptidet (Pep3 + BSA), illetve 1,0 pg borjúszérum albumint (BSA) - mindkét esetben 100 pl foszfátpufferben - a membránszűrőre viszünk. A membrán szabad megkötési helyeit 2 órán keresztül blokkoló pufferrel (PBS + 0,5% sovány tejpor + 0,05% Tween) lefedjük. Utána a membránt 2 órán át az 1. antitesttel (1:50 arányban hígítva, PBS + 0,05% Tween elegyével) inkubáljuk, utána a 2. antitesttel (anti-szarvasmarha-POD-konjugátum; Sigma); 1:2000 arányban hígítva PBS és 0,05% Tween elegyével) további 2 órán át inkubáljuk. Az inkubálás minden esetben szobahőmérsékleten történik. Az utolsó mosás után az alábbi összetételű szubsztrátumkeveréket adagoljuk :

mM NaCH₃COO-oldat, pH 5,0-5,5

10 mg 3-amino-9-etil-karbazol, oldva 3 ml DMSO-ban

0,004 ml 30%-os H₂O₂-oldat.

Az elszíneződést 15 perc elteltével kiértékeljük. A Pep3 proteinre fajlagos antitestnek a Pep3 proteinhez való kapcsolódását tehát membránon (kártyán), színre45 akció segítségével mutathatjuk ki.

12. Szarvasmarhaszérumok

A Pep-ELISA, W-ELISA, SNT- és Dotblot-tesztek során elvégzendő szerológiai vizsgálatokhoz olyan szarvasmarhákból vettünk szérumot, amelyek az alábbi

BHV -1 -törzsekkel lettek fertőzve:

- Australia 12

-N569

- Schönböken

- Schleswig-Holstein

Ezen túlmenően a Pep-ELISA, VV-ELISA és SNT-tesztben észak-németországi szarvasmarhák szérumát is alkalmaztuk; az e szérumban lévő, BHV-1-re fajlagos antitesteket ELISA-teszttel meghatároztuk.

II. Eredmények

1. A glV-protein méretkülönbségei

HU 215 537 Β

Az SB, Ausl2 és N569 BHV-l-törzsek glV proteinjeit a 4. pont szerint kinyertük és gélelektroforetikusan megvizsgáltuk, ugyanis a proteinek móltömegét a protein gélben történő vándorlásának sebességéből vezetjük le.

A gélelektroforetikusan vizsgált minták alapján megállapítottuk, hogy az Ausl2, SB és N569 törzsek glV proteinjének méretében észrevehető eltérések vannak. Az Ausl2 glV proteinjének móltömege 84000 volt, az SB-é 72 000 és az N569-é 68 000.

Ez a méretkülönbség elméletileg a különböző BHV-l-törzsek glV-génjében lévő nyitott olvadókeret (open reading frame, ORF) méretkülönbségére vezethető vissza. Más lehetőség a glV-protein leolvasás alatt és után végbemenő módosulásai.

A különböző BHV-l-törzsek glV-proteinje nyitott olvasókeretének meghatározására az Ausl2, N569 és SB-törzsek glV-génjének teljes szekvenciáját meghatároztuk, egymással összehasonlítottuk és az aminosav-szekvenciát belőle levezettük. Az a. ábrán az Ausl2- és SB BHV-l-törzsek glV-proteinjének aminosav-szekvenciáját, a 2. ábrán az N569 és SB-törzsek glV-proteinjének aminosav-szekvenciáját hasonlítjuk össze.

Az Ausl2 esetén a glV nyitott olvasókerete 1524 bázispárt ölel fel, amely 507 aminosavat kódol. SB esetén 1254 bázispár van, amely 417 aminosavat kódol. A glVgénekben lévő nyitott olvasókeret méretkülönbsége egy ismétlődő szekvenciára vezethető vissza. Ez a 90 bázispámyi szekvencia az Ausl2-törzs esetén közvetlen ismétlésként négyszer szerepel egymás után, míg az SBtörzsben csak egy van belőle. Az SB-törzsben az ismétlődő szekvencia a nyitott olvasókeretben a 1022-1111. bázispár helyét foglalja el, a 306-335. aminosavat kódolja az alábbi sorrendben:

P-E-G-D-G-E-S-Q-T-P-E-A-N-G-GA-E-G-E-P-K-P-G-S-P-D-A-D-R.

Az Ausl2-törzs esetén ez az ismétlődő szekvencia a 1318-1408. bázispár helyét foglalja el, és a 306-425. aminosavat kódolja, az SB-törzs szekvenciájának négyszeres másolatát.

Az N569-törzs a repeat (ismétlődő) szekvencia (akár az SB esetén, itt is csak egyszer szerepel) tartományában más aminosav-szekvenciát mutat, mint az SBés az Ausl2-törzs. E tartományban az SB- és az N569törzs között csupán 19% homológia áll fenn, ami kevés ahhoz viszonyítva, hogy az egész glV-proteint alapul véve a két BHV-1-törzs közötti homológia 81,5%. Az N569 repeat szekvenciája az alábbi:

E-G-P-A-A-A-G-P-D-G-P-P-P-G-E-PR-P-G-P-G-G-P-G-A-D-V-D-R.

Tekintettel arra, hogy mind az SB, mind az N569 esetén a glV-protein 417 aminosavból áll, az elektroforetikusan talált méretkülönbség nem lehet a különböző méretű nyitott leolvasókeretnek a következménye. Inkább az van, hogy az N569-törzs esetén a 44. aminosav, a treonin helyett izoleucin szerepel. Ezzel a proteinnek egy glikozilező hellyel kevesebb van, vélhetően ez az oka a gélelektroforézis során figyelt eltérő viselkedésének.

2. Komputerelemzés

Az SB-törzs glV-proteinjét „Chou-Fosman Prediction” segítségével vizsgálva azt találtuk, hogy a repeat tartomány potenciálisan antigént (hidrofil tartományt) képez.

3. Antigenitás szarvasmarhákban

Az Ausl2-, SB-, SH- és N569 BHV-1-törzsekkel történő fertőzés előtt és után vett szérumokat, valamint ellenőrzött állományból származó, ismert antitest titerű állatokból vett szérumokat vizsgálunk Pep-ELISAteszttel, hogy van-e Pep2 elleni antitest, VV-ELISAés SNT-teszttel, hogy van-e BHV-1 elleni antitest és dotblot-ban, hogy van-e Pep3 elleni antitest.

3.1 Australia-12-szérumok

Az 1. táblázat 7 állatból vett 18 szérumminta eredményét mutatja az Ausl2 BHV-1-törzzsel végzett fertőzés előtt és után. A szérumokat Pep-ELISA-, W-ELISA-, SNT- és dotblot-teszttel vizsgáltuk Pepés BHV-1 elleni fajlagos antitestek jelenlétére. A terhelési fertőzés előtt egyik szérumban sem voltak kimutathatók BHV-1, Pep2 és Pep3 elleni antitestek.

Fertőzés után az SNT-teszttel majdnem az összes szérumban - kivéve OM25123 szérumában az első fertőzés után, és OM25123 szérumában még az erősítő fertőzés után sem - kimutathatók voltak a vírussemlegesítő antitestek. Az OM25123 harmadik fertőzés után mutatkoztak BHV-1 elleni antitestek.

A fertőzés utáni szérumokban a W-ELISA-teszttel is lehetett kimutatni a BHV-1-re fajlagos antitesteket, kivéve az OM25124 szérumát az első fertőzés után.

A vírussemlegesítő antitesteket tartalmazó szérumokban ELISA-teszttel Pep2 elleni antitestek is voltak kimutathatók, kivéve az OM87 szérumát, amely SNTteszttel kimutatható BHV-1 elleni vírussemlegesítő antitestekkel rendelkezett ugyan, de ELISA-val kimutatható Pep2 elleni antitesteket nem tartalmazott.

Az OM25123 számú szarvasmarha szérumában az első fertőzés után, az OM25126 számú szarvasmarha szérumában az ismételt fertőzés után sem a szérumsemlegesítési tesztben (SNT), sem a Pep-ELISA-tesztben nem lehetett BHV-1 elleni és Pep2 elleni antitesteket kimutatni.

Az első fertőzés után vett, vírussemlegesítő antitesteket tartalmazó szérumokban dotblot segítségével Pep3 elleni antitesteket mutattunk ki. Az OM25123 számú állatból (1990. 09. 21-én) fertőzés után vett, szérumsemlegesítő és ELISA-antitesteket nem tartalmazó szérumában a dotblot-teszttel Pep3 elleni antitesteket lehetett kimutatni.

3.2 N569-szérumok

Az 1. táblázattal analóg módon a 2. táblázat a fertőzés előtt és után vett szarvasmarhaszérumokban Pep-ELISA-, W-ELISA- és SNT- teszttel kimutatható Pep2, illetve BHV-1-vírusrészecskék elleni antitestek meglétét mutatja.

Az N569 BHV-1-törzzsel végzett fertőzés előtt egyik szérumban sem - sem SNT-, sem W-ELISA-, sem Pép-ELISA-teszttel - lehetett kimutatni BHV-1 vagy Pep2 elleni antitesteket. A fertőzés után SNT- és VV-ELISA-teszttel mindkét szérumban

HU 215 537 Β

BHV-1-re fajlagos antitestek jelenléte kimutatható. Pep2 elleni antitesteket azonban még terhelő újrafertőzés után sem találtunk.

Ez azt jelenti, hogy az N569-törzzsel fertőzött szarvasmarhák W-ELISA- és SNT-tesztben felismerhető, BHV-1 ellen fajlagos antitesteket képeznek, a fertőzés utáni Pep-ELISA-teszttel kimutatható, az SB- és Aul2-törzs glV-proteinjében meglévő, az N569-törzs glV-proteinjéből azonban hiányzó Pep2 peptidet azonban nem ismerik fel antigénként.

3.3 Schleswig-Holstein- és Schönböken-szérumok

A 3. táblázat az SB- és SH BHV-1-törzzsel fertőzött állatok szérumában fertőzés előtt és után fellelhető antitesteket mutatja. E szérumok esetében is a Pep-ELISA-, W-ELISA-, SNT- és dotblot-teszteket alkalmaztuk Pép és BHV-1 elleni antitestek kimutatására. Az SB- és SH BHV-1-törzzsel történő fertőzés előtt egyik szérumban sem, fertőzés után mindegyik szérumban mindegyik módszerrel lehetett kimutatni az antitesteket.

3.4 Ellenőrzött állományból származó állatok széruma

A 4. táblázat az ellenőrzött állományokból származó, ismert antiteststátuszú állatok szérumának vizsgálata során kapott eredményeket mutatja. A szérumokat Pep2-ELISA- és VV-ELISA-teszttel vizsgáltuk BHV-1 és Pep2 elleni antitestek jelenlétére.

A 31 pozitív szérum közül 29-ben a W-ELISAteszttel BHV-1 elleni antitesteket találtunk. Pep-ELISAteszttel mind a 31 pozitív szérumban a Pep2 elleni antitest is kimutatható volt.

A 6 negatív szérumban VV-ELISA-teszttel BHV-1 elleni antitestet nem találtuk, Pep-ELISA-val kimutatható Pep2 elleni antitestek a 6 szérum közül 5ben nem voltak.

4. Az N569-törzs immunogenitásának vizsgálata

Az 5. táblázat az N569-törzzsel immunizált állatok szérumának SNT-teszttel végzett vizsgálata során kapott eredményeket mutatja. A 4 szarvasmarhát különböző módon immunizáltuk az N569-törzzsel.

Legkésőbb az immunizálás után 13 nappal mindegyik oltott állat szérumában szérumsemlegesítő antitesteket találtunk. A legmagasabb antitest-titert (1:152) az intravénásán (i.v.) oltott állat érte el. Intramuszkuláris, illetve intranazális oltás után (i. m., illetve i. n.) az antitest-szint 1:45, illetve 1:27 volt, míg intravaginás (i. vág.) alkalmazás után az antitest-titer 1:9 volt.

5. Összegzés

Az N569 megváltozott aminosav-szekvenciája elleni antitestek és BHV-1-vírusrészecskék elleni antitestek kombinált összehasonlítása révén különbséget tudunk tenni BHV-1-antitestmentes állatok, az N569törzzsel immunizált állatok és vad típusú törzsekkel fertőzött állatok között.

Az N569-törzs mind a négy alkalmazási módon (i. v., i. m., i. n., i. vág.) felhasználva szarvasmarhára immunogénnek bizonyult.

Az ábrák leírása

Az 1. ábra összehasonlítást mutat az Au2- és a Schönböken BHV-1-törzs glV-proteinjének aminosav-szekvencia között. A szekvenciát és a homológiát a PC-gén nevű PD-program segítségével azonosítottuk. A felső szekvencia az Ausl2-törzsé, az alsó a Schönböken-törzsé. A szekvenciák a glV-protein 5’végénél (N-terminális) kezdődnek és a C’-végénél (Cterminális) végződnek. Az összekötő vonalak homológiát mutatnak. A nyilak a cisztein aminosavat jelölik.

A 2. ábra összehasonlítást mutat az N569- és a Schönböken BHV-l-törzs glV-proteinjének aminosavszekvencia között. A szekvenciát és a homológiát a PCgén nevű PD-program segítségével azonosítottuk. A felső szekvencia az N569-törzsé, az alsó a Schönböken-törzsé. A szekvenciák a glV-protein 5’-végénél (N-terminális) kezdődnek és a C’-végénél (C-terminális) végződnek. Az összekötő vonalak homológiát mutatnak. A szintetizált Pep3 szekvenciáját aláhúztuk. A 41-43. aminosav helyén lévő kis box az N569 BHV-l-törzs hiányzó glikozilezési helyét jelzi.

A táblázatok leírása

Az 1. táblázat a szérumvizsgálat eredményét mutatja az Ausl2 BHV-1-törzzsel végzett fertőzés előtt és után. A szérumokat Pep-ELISA-, VV-ELISA-, SNTés doblot-teszttel vizsgáltuk Pép- és BHV-1 elleni fajlagos antitestek jelenlétére.

A 2. táblázat a szérumvizsgálat eredményét mutatja az N569 BHV— 1-törzzsel végzett fertőzés előtt és után. A szérumokat Pep-ELISA-, VV-ELISA-, SNT- és dotblot-teszttel vizsgáltuk Pép- és BHV-1 elleni fajlagos antitestek jelenlétére.

A 3. táblázat a szérumvizsgálat eredményét mutatja az SB- és SH BHV-1-törzzsel végzett fertőzés előtt és után. A szérumokat Pep-ELISA-, VV-ELISA-, SNTés dotblot-teszttel vizsgáltuk Pép- és BHV-1 elleni fajlagos antitestek jelenlétére.

A 4. táblázat a Pep2-ELISA-, VV-ELISA- és SNT- teszt olyan szérum vizsgálata során kapott eredményeit mutatja, amelynek antiteststátuszát az Oldenburgi Állategészségügyi Hivatal ELISA-val vizsgálta és szavatolta. 31 pozitív és 6 negatív szérum állt rendelkezésre. A Pep-ELISA- és a W-ELISA-tesztet mindegyik szérummal végeztük, az SNT-teszt három pozitív szérum esetén került alkalmazásra.

Az 5. ábra az N569-törzzsel immunizált szarvasmarhák szérumában SNT-teszttel kimutatható reciprok antitest-titert mutatja.

HU 215 537 Β

1. táblázat

«···* * ·· ······ ·· ·

U la U U b bhhhUMhtMb 4-> 4-> 4J 4-> 4-> X-> JJ*J4J*JU4J*J4J4J

222223222322323

g 888888888888888888 § 5858588SSSSSSSS88 S 3 8383 8SF3S sdR3SR3FÍR _ΛΛιΛΙΛ„3?ϊ?3?5&?$8 8«8«8 ««aSaStetejQjQjQjQjQjQgJjQjgjQjQjQ

Dotblothoz 1990. 11. 06-án vett szérumot használtunk, mert az 1990. 10. 30-án vett elfogyott. SN-titer 1:54

HU 215 537 B ts _ coca un öil

Ϊ

I mi <S _ 1 tH U> 0O( oo fS cn» üti

2. táblázat

Q n*

I * fa (Nf-IHH

SSŐS * « * * o o oo o o oo

Γ- I Ή a s

Ch eh eh CTb <?£?

$ 8 88 5 8 58 3 8 38

00

SS

HU 215 537 Β

II

05 05 03 < Ό 03 «

8^ ^v Kg* & é ^vq

JL Ό r? JL ·Ο <5

S £§ ’i K

F*h& β c cs uá § i-t M>

SS* *^5 ^3 ^3 *^3 ^3 ·«···>«·· ccccccccc

Ő^SS'O'O'd’ö'ó’d’d’ö'O

O f*> O CO · ··♦♦···· *· * **fie(scecscc ο o oo

I

-c 'ζ$

1000505 · · · ...·..

Ο O köicta ΌΌΌΌΌΌΌΌ Ο Ο ······♦·» * * **fiCCCCffCEfi o o © © e$ o, 1

N I ........ · ·

Ψ’βΌ’βΌΒΌ’βΌ'β * I * c cecccacc © o

IGI’d’O'd’d’O'd’exj'O *1*1 ccccBcecc o o

4~> £J 4J 4-> Ü4J4J4JP4JPP ····· ········

Socooooö8 88888885? 0808588538538 fi Rf5?5 3 SS 3F3 83 R8

CO £OfO s ⁵

E *O •υ n N -Λ crt ._ kÓ

O OS O> Os Ch —

888

HU 215 537 Β

4. táblázat

Pep-HJSA [o.D. 405 nm] BSA-Bep2 Pep2W-EUSA

CH	Vírus	1	O.D.	AK-K	1 AK-K	IPejy-Elisa	1, Titer LW-Elisa (refciprok)
mi pos.	FS*	1	0,293	0,000	1 0,293	pos.	1 3769	1	pos.
NH2 pos.	re*	1	0,518	0,049	I 0,469	pos.	1 11487	1	pos.
NM3 pos.	re*	1	0,330	0,000	1 0,330	pos.	1 2468	1	pos.
NM4 pos.	re*	l	0,364	0,117	1 0,247	pos.	1 3634	1	pos.
NM6 pos.	re*	1	0,520	0,228	1 0,292	pos.	1 2349	1	pos.
MÍ7 pos.	re*	1	0,468	0,152	1 0,316	pos.	i 2480	1	pos.
NM8 pos.	re*	1	0,537	0,218	1 0,319	pos.	1 1720	1	pos.
Μβ pos.	re*	1	0,219	0,004	1 0,215	pos.	1 6583	1	pos.
KQO pos.	re*	1	0,366	0,215	1 0,151	pos.	1 5760	1	pos.
mii pos.	re*	1	0,272	0,169	1 0,103	pos.	1 1482	1	pos.
ΜΠ.2 pos.	re*	1	0,251	0,113	1 0,138	pos.	I 5404	1	pos.
M0.3 pos.	re*	1	0,522	0,141	1 0,381	pos.	1 2677	1	pos.
MQ4 pos.	re*	1	0,361	0,165	1 0,196	pos.	1 8873	1	pos.
mi5 pos.	re*	»	0,395	0,225	1 0,170	pos.	1 1363	1	pos.
MU6 pos.	FS*	1	0,353	0,115	1 0,238	pos.	1 1376	1	pos.
Mtt7 pos.	re*	1	0,351	0,111	1 0,240	pos.	1 368	1	neg.
mie pos.	FS*	1	0,320	0,137	1 0,183	pos.	1 1511	1	pos.
MQ9 pos.	re*	1	0,359	0,172	1 0,187	pos.	1 947	1	neg.
MQO pos.	re*	1	0,425	0,226	1 0,199	pos.	1 1060	1	pos.
Md pos.	re*	1	0,576	0,135	1 0,441	pos.	1 1842	1	pos.
MC2 pos.	FS*	I	0,599	0,151	1 0,448	pos.	1 1264	1	pos.
}«23 pos.	re*	1	0,474	0,118	1 0,356	pos.	1 1391	1	pos.
MG4 pos.	re*	1	0,582	0,118	1 0,464	pos.	1 2133	1	pos.
m25 pos.	re*	1	0,348	0,092	1 0,256	pos.	1 1805	1	pos.
MG6 pos.	re*	1	0,264	0,129	1 0,135	pos.	1 1295	1	pos.
NM27 pos.	re*	1	0,325	0,086	1 0,239	pos.	1 1481	1	pos.
ΙΜ28 pos.	re*	1	0,348	0,154	1 0,194	pos.	1 2355	1	pos.
MÍ29 pos.	FS*	1	0,368	0,117	1 0,251	pos.	1 2967	1	pos.
MQO pos.	re*	1	0,261	0,136	1 0,125	pos.	1 6568	1	pos.
ΜΟ1 pos.	re*	1	0,493	0,152	1 0,341	pos.	1 4416	J	pos.
mi neg.	re*	1	0,092	0,008	1 0,084	neg.	1 310	1	neg.
NH2 neg.	re*	1	0,097	0,004	1 0,093	neg.	1 390	1	neg.
MO neg.	re*	1	0,212	0,007	1 0,205	pos.	1 281	1	neg.
MM neg.	re*	I	0,204	0,105	1 0,099	neg.	1 748	1	neg.
M6 neg.	re*	1	0,096	0,048	1 0,048	neg.	1 560	1	neg.
MI6 neg.	re*	1	0,030	0,043	1 -0,013	neg.	1 562	1	neg.

* Ellenőrzött állományból származó, ismert BHV-1 státuszú állatok széruma, ELISA-val vizsgálva.

Claims (3)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás BHV-1-fertőzés elleni oltóanyag előállítására, mely oltóanyag alkalmas az oltott állatok és vad törzsekkel fertőzött állatok megkülönböztetésére is, azzal jellemezve, hogy egy BHV-1-törzset, amely

   - genomja g-IV glikoproteint kódoló részében módosított,

   - a módosítás a g-IV glikoprotein szempontjából nem esszenciális tartományokban van,

   - ezek a g-IV glikoprotein szempontjából nem esszenciális tartományok a Pasteur Intézetnél I 1204 szám alatt letétbe helyezett N 596 számú BHV-l-törzs g-IV glikoproteinjében szereplő 310-338. aminosavnak megfelelő epitopokra vonatkoznak,

   - és ezekben az N 569 számú BHV-l-törzs g-IV glikoproteinje szempontjából nem esszenciális tartományokban vad vírusokhoz képest egy vagy több nukleotid kicserélt, kivágott vagy inzertált, megfelelő hordozóanyaggal keverünk össze.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jelle5 mezve, hogy BHV-1-törzsként a Pasteur Intézetnél

   I 1204 szám alatt letétbe helyezett N 596 számú BHV-1-törzset alkalmazunk.
3. 3. Eljárás BHV-1 vad vírusokkal fertőzött szarvasmarhák és a Pasteur Intézetnél 11204 szám alatt letétbe

   10 helyezett N 596 számú BHV-l-törzs bázisú oltóanyaggal oltott szarvasmarhák megkülönböztetésére, azzal jellemezve, hogy a szarvasmarhák szérumát szokásos módszerekkel a BHV-1 vad vírusok g-IV glikoproteinjének nem esszenciális tartományaival ho15 mológ, és a Pasteur Intézetnél 1 1204 szám alatt letétbe helyezett N 596 számú BHV-l-törzs g-IV glikoproteinjében 310-338. aminosav-pozícióban szereplő, módosított aminosav-szekvenciával heterológ protein elleni antitestek jelenlétére vizsgáljuk.