HU215186B - Eljárás fehérje előállítására módosított transzkripciós kontrollegység alkalmazásával - Google Patents

Eljárás fehérje előállítására módosított transzkripciós kontrollegység alkalmazásával Download PDF

Info

Publication number
HU215186B
HU215186B HU91603A HU60391A HU215186B HU 215186 B HU215186 B HU 215186B HU 91603 A HU91603 A HU 91603A HU 60391 A HU60391 A HU 60391A HU 215186 B HU215186 B HU 215186B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
dna
plasmid
approximately
buffer
cells
Prior art date
Application number
HU91603A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT56885A (en
HU910603D0 (en
Inventor
David Thompson Berg
Brian William Grinnel
Original Assignee
Eli Lilly And Co.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eli Lilly And Co. filed Critical Eli Lilly And Co.
Publication of HU910603D0 publication Critical patent/HU910603D0/hu
Publication of HUT56885A publication Critical patent/HUT56885A/hu
Publication of HU215186B publication Critical patent/HU215186B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6464—Protein C (3.4.21.69)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/30—Vector systems having a special element relevant for transcription being an enhancer not forming part of the promoter region
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/55—Vector systems having a special element relevant for transcription from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/10—Vectors comprising a special translation-regulating system regulates levels of translation
    • C12N2840/105—Vectors comprising a special translation-regulating system regulates levels of translation enhancing translation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Treatments For Attaching Organic Compounds To Fibrous Goods (AREA)
  • Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Liquid Crystal Substances (AREA)
  • Financial Or Insurance-Related Operations Such As Payment And Settlement (AREA)
  • Superconductors And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Polymers With Sulfur, Phosphorus Or Metals In The Main Chain (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás fehérje termelésére egy óriás DNS vírűsigen kőrai géntermékét expresszáló eűkarióta gazdasejtben. Az eljárásszerint egy gazdasejtet i) A) egy adenővírűs-2 fő késői prőmőterének regűlációs elemétől (MLTF)űpstream irányban működőképesen elhelyezett BK vírűs P2 erősítőjét, B) az adenővírűs-2 fő késői prőmőterét, C) az említett prőmőter stiműlálására pőzíciőnált pőli-GT elemet, és D) egy, az adenővírűs kapcsőlt hárőm részből álló vezető szekvenciájáttartalmazó DNS szekvenciát tartalmazó módősítőtt transzkripciós kőntrőll egységet[GBMT], és ii) egy, az expresszióhőz megfelelő módőn pőziciőnált, az említettfehérjét kódőló DNS szekvenciát tartalmazó rekőmbináns DNS vektőrral transzfőrmálnak, a fenti lépésben említett sejtet a fehérje expressziójáhőz megfelelőkörülmények között tenyésztik, és a sejttenyészetből a termeltfehérjét kinyerik. Ugyancsak a találmány tárgya eljárás egy fehérje gazdasejtben történőtermelési szintjének növelésére, melynek sőrán egy gazdasejtet akívánt fehérjét expresszáló vektőrral stabilan tr nszfőrmálnak, astabil transzfőrmánst egy, a fenti vektőrtól eltérő, a fehérjét egyGBMT transzkripciós kőntrőllegység irányítása alatt expresszálóvektőrral transzfőrmálják, a kapőtt sejtet az expre szióhőz megfelelőkörülmények között tenyésztik, és a sejttenyészetből kinyerik akeletkezett fehérjét. ŕ

Description

A jelen találmány a humán 2-típusú adenovírusból származó fő késői promotert (MLP) hasznosítja. Az MLP a transzkripció iniciációjához szükséges egyedülálló sart helyet („cap” = sapka helyet) tartalmaz, melyet 2 regulációs elem szabályoz, a cap helyhez viszonyítva megközelítően a -25--31 nukleotid számokkal jelölt helynél levő TATA régió és a körülbelül
-51--64 nukleotidoknál levő fő késői transzkripciós faktor kötési helye.
A jelen találmány továbbá hasznosít egy, az adenovírus MLP-jéből történő expresszió fokozására szolgáló erősítő szekvenciát. Számos erősítő szekvencia ismert, és a gén expresszióját fokozó képességük az irodalomban jól jellemzett. A találmányban előnyben részesített erősítő szekvencia a humán poliomavírus BK P2-es törzséből származik (Berg et al., 1988, Nucl. Acids Rés. 16:9Q57). Bár ez az erősítő szekvencia számos sejtvonalban a késői promoterből történő expressziót stimulálja, ez a leghasznosabb az olyan sejtekben, melyek az óriás DNS vírus igen korai géntermékeit expresszálják, mint például az adenovírusok Ela géntermékeit. Ilyen körülmények között az Ela protein nem várt módon stimulálja a BKV erősítő aktivitást (Grinnell et al., 1988, Mól. Cell. Bioi. 5:3448).
A találmányhoz lényeges a poli(dG-dT) poli(dA-dC) kopolimer, a „GT elem”. Ez az elem igen elterjedt az eukarióta genomban, és megtalálhatók számos ismert gén nem transziáit régióiban és intronjaiban. Az elem képes balmenetes DNS-at létrehozni, és feltételezések szerint szerepet játszik rekombinációs és génkonverziós folyamatokban. Míg a feltételezések szerint ez az elem gyenge erősítő aktivitást mutat az SV40 korai promoterével, nem rendelkezik erősítő aktivitással, ha az MLP-vel együttesen alkalmazzák (Berg et al., 1989, Mól. Cell. Bioi. 9:5248). Meglehetősen váratlanul az erősítő aktivitás kiváltható a GT elemből egy óriás DNS vírus igen korai géntermékének, mint például az adenovírus Ela proteinjének jelenlétében.
Egy másik, a találmányhoz tartozó elem a humán
2-típusú adenovírusból származó három részes vezető (TPL) szekvenciát képviselő szintetikusan előállított DNS szekvencia. Ezt a szekvenciát késői vírus mRNSeken találták meg, és feltételezik, hogy elősegíti a vírus információk transzlálását a vírusfertőzési ciklus késői szakaszában, azonban a fertőzést követő korai szakaszban nem (Zhang et al., 1989, J. Bioi. Chem. 264AQ679 and Dolph et al., 1988, J. Virol. 62:2059). Azonban arról is beszámoltak, hogy a hatékony transzkripció igen, viszont a transzláció nem függ az adenovírus TPL szekvenciáktól a fertőzés utáni késői szakaszban (Alonso-Caplen, 1988, J. Virol. 62:1606) és hogy a transzkripció fokozásához szükség van a teljes első vezető szekvenciára (a 41 nukleotidig) a szomszédos intron 149 nukleotidján túl. Beszámoltak arról, hogy a TPL nem adenovírus mRNS-akat csak egy adenovírus-fertőzött sejt teremtette környezetben stabilizál, a fertőzési ciklus késői fázisa során (Moore and Shenk, 1988, Nucl. Acids Rés. 16:2247). így a publikált irodalom alapján nem várnánk, hogy a TPL jelentős mértékben fokozná a gén expresszióját, kivéve a vírusfertőzést követő késői szakaszban. A jelen találmány szintetikus szekvenciáját nem alkalmazzuk az adenovírus-fertőzött sejtekben a késői infekciós körülmények között. Azonban a vektorokat a korai vírusfunkciókat expresszáló transzformált sejtekben alkalmazzuk. Továbbá, a szintetikus TPL nem tartalmazza a transzkripció stimulálásához szükséges említett intron szekvenciát. Nem várt módon a jelen találmány szintetikus TPL-je nem csupán a jelen találmány vektoraiból való expressziót stimulálja, hanem körülbelül kétszer hatékonyabb a korábban leírt nem összekapcsolt TPL szekvenciánál, mely tartalmazza a késői vírusfertőzött sejtekben az optimális transzkripcióhoz szükséges szekvenciát.
A jelen találmány egy módosított transzkripciós kontrollegységgel kapcsolatos, mely tartalmazza az adenovírus fő késői promoter upstream levő regulációs eleméhez (MLTF) közel elhelyezett BK vírus P2-es erősítő szekvenciáját, a 2-típusú adenovírus fő késői promoterét, az említett promoter stimulálására pozícionált poli-GT elemet és az adenovírus kapcsolt, három részből álló vezető szekvenciáját tartalmazó DNS szekvenciát. Ez a módosított transzkripciós egység, ha úgy pozícionálják, hogy egy hasznos anyagot kódoló gén expresszióját vezesse, ezen hasznos anyag transzkripciójának és így expressziós szintjének nagymértékű megnövelésében használható. A jelen találmány egy másik jelentős aspektusa egy olyan módszerrel kapcsolatos, melynek során a módosított transzkripciós kontrollegységet egy óriás DNS-vírus igen korai géntermékének, mint például az adenovírus Ela géntermékének a jelenlétében használnak az eukarióta gazdasejtekben levő rekombináns gének transzkripciójának és expressziójának növelése céljából. A jelen expressziós vektorok sokoldalúságát mutatja az olyan különböző fehérjék, mint a kloramfenikol acetiltranszferáz, humán protein C és aktivált humán protein C, módosított transzkripciós kontroll egy egységei által irányított magas szintű expresszió.
A találmány alkalmazása az adenovírus által transzformáit sejtekben való humán protein C expressziójának megnövekedését eredményezi. Az ilyen sejtek különösen előnyben részesített gazdák az olyan teljesen gamma-karboxilezett proteinek termelésében, mint a humán protein C vagy az aktivált humán protein C. Következésképpen a találmány egy további aspektusa a gamma-karboxilezett proteinek előállítására kifejlesztett módszert foglal magába.
A jelen találmány egy másik fontos aspektusa egy hasznos géntermék expressziójának további növelésére szolgáló módszerrel kapcsolatos. Ezt úgy végezzük, hogy
a) egy sejtklón olyan stabil transzformánsát nyeljük, mely egy hasznos anyagot expresszál és szekretál, de amely nem tartalmazza egy, a jelen találmány módosított transzkripciós kontrollegységét magába foglaló vektort,
b) majd egy ilyen stabilan transzformált kiónt transzformálunk egy ugyanezen hasznos anyagot kódoló gént tartalmazó vektorral, mely anyag expresszióját a jelen találmány módosított transzkripciós kontrollegysége irányítja. A második vektorral nem transzformált kiónokkal össze2
HU215 186Β hasonlítva, az expressziós színt drámai növekedését akkor figyeltük meg, amikor a kétszeresen transzformált sejteket szubklónoztuk, és a gén expressziójának megfelelő körülmények között tenyésztettük.
A következőkben megadjuk a találmányban használt fogalmak meghatározásait.
Antibiotikum mikroorganizmusok által termelt anyag, mely akár természetes állapotában, akár korlátozott kémiai módosítás után más mikroorganizmusok vagy eukariota sejtek szaporodását gátolja, vagy elpusztítja azokat.
Antibiotikum rezisztenciát biztosító gén egy antibiotikummal szembeni rezisztenciát biztosító aktivitást kódoló DNS szegment
ApR az ampicillin-rezisztens fenotípus vagy ugyanezen tulajdonságot adó gén
Klónozás egy DNS szegmens rekombináns DNS klónozó vektorba való beültetésének folyamata
CmR a kloramfenikol-rezisztens fenotípus vagy ugyanezen tulajdonságot adó gén
Ela az adenovírus igen korai génterméke, mely egy poliGT elemet az erősítő aktivitás expresszálására aktivál, valamint aktiválni képes a BK víruserősítő szekvenciát ep a T-antigén gén SV40 korai promoterét, a T-antigén kötési helyét és a replikáció SV40 origóját tartalmazó DNS szegment
Eukariota promoter bármely olyan DNS szekvencia, mely eukariota sejtekben promoterként funkcionál
GBMT transzkripciós kontroliegység egy módosított transzkripciós kontrollegység, mely az adenovírus fő késői promoterének (MLTF) regulációs elemétől upstream irányban közel elhelyezett BK vírus P2-es erősítő elemét, a 2-típusú adenovírus fő késői promoterét és az említett promoter stimulálására pozícionált poli-GT elemet, valamint egy a 2-típusú adenovírus kapcsolt, három részből álló vezető szekvenciáját kódoló DNS szekvenciát tartalmaz. A GBMT transzkripciós kontroliegységére a legjobb példa az E. coli K-12 AGl/pGTC (NRRL B-18593) törzsében található pGTC plazmidban talált megközelítően 900 bázispár hosszúságú HindlII kazetta.
GT-erősítő rendszer egy promoterhez, mint például az MLP-hez kapcsolt bármely poli-GT elem, melyben a poli-GT elem magában nem rendelkezik enhancer aktivitással, de egy óriás DNS-vírus igen korai génterméke, mint például az Ela génterméke által, vagy bármely hasonlóan aktiváló vírus géntermék által enhancer aktiválódik.
HmR higromicin-rezisztens fenotípus vagy ugyanezen tulajdonságot adó gén
IVS egy intront kódoló DNS, melyet közbeeső szekvenciának is nevezünk
Óriás DNS-vírus egy eukariota sejteket fertőző vírus, melynek genomja körülbelül 10 kbázisnál nagyobb, például bármely poxvírus, adenovírus és herpeszvírus
MLP az adenovírus fő késői promotere, melyre a találmányban mint adenovírus késői promoterre, 2-típusú adenovírus késői promoterre vagy Ad2 késői promoterre hivatkozunk.
MLTF kötési hely az adenovírus DNS-ban lévő hely, ahová a fő késői transzkripciós faktor (MLTF) kötődik; az MLTF-re az MLP aktivitásához van szükség
NeoR a neomicin-rezisztenciát adó gén, mely az eukariota gazdasejtekben a G418 rezisztencia biztosítására is használható őri a plazmid replikációs origója pA a poliadenilációs jelet kódoló DNS szekvencia poli-GT elem (GT)n-(CA)n DNS szekvenciája, melyet a találmányban olyan szekvenciával jellemzünk, ahol az n = 21, de amely vonatkozhat különböző hosszúságú szekvenciákra, ahol az n nagyobb vagy kisebb mint 21, valamint vonatkozhat kémiai úton szintetizált (GT)n - (CA)n szekvenciákra, vagy egy (GT)n (CA)n részt tartalmazó humán genom DNS fragmentjeire
Promoter egy DNS RNS-vá történő transzkripcióját irányító DNS szekvencia
Rekombináns DNS klónozó vektor bármely függetlenül replikálódó vagy integrálódó ágens, mely egy olyan DNS molekulát tartalmaz, melyhez több további DNS szegmens adható, vagy már adott
Rekombináns DNS expressziós vektor bármely rekombináns DNS klónozó vektor, mely egy promotert és egy kapcsolódó inzerciós helyet tartalmaz, melyhez egy hasznos terméket kódoló DNS szekvencia inzertálható és expresszálható
Rekombináns DNS vektor bármely rekombináns DNS klónozó vagy expressziós vektor
Replikon egy rekombináns DNS vektor replikációját szabályozó bármely DNS szekvencia
Restrikciós fragment egy vagy több restrikciós enzim működése révén létrehozott bármely lineáris DNS rRNS riboszomális ribonukleinsav
Szenzitív gazdasejt egy olyan gazdasejt, mely nem képes szaporodni egy adott antibiotikum vagy más toxikus vegyület
HU 215 186 Β jelenlétében az ezen anyagok ellen rezisztenciát adó
DNS szegment hiányában Struktur gén egy polipeptidet kódoló bármely DNS szekvencia, beleértve a start és stop kodonokat kódoló DNS-at is TcR a tetraciklin-rezisztens fenotípus, vagy az ugyanezen tulajdonságot adó gén Transzformáns a transzformáción keresztülment recipiens gazdasejt Transzformáció egy recipiens gazdasejtbe történő DNS bejuttatása tRNS transzfer ribonukleinsav
A továbbiakban megadjuk a találmányban mellékelt ábrák leírását.
1. ábra. A BK vírusrestrikciós hely és funkcionális térképe. A találmányban nem rajzoltuk méretarányosan az ábrákat.
2. ábra: a pBKEl plazmid restrikciós és funkcionális térképe
3. ábra: a pBKneol plazmid restrikciós és funkcionális térképe
4. ábra: a pSV2cat plazmid restrikciós és funkcionális térképe
5. ábra: a pLPcat plazmid restrikciós és funkcionális térképe
6. ábra: a pBLcat plazmid restrikciós és funkcionális térképe
7. ábra: a pBKcat plazmid restrikciós és funkcionális térképe
8. ábra: a pSBLcat plazmid restrikciós és fünkcionális térképe
9. ábra: a pL133 plazmid restrikciós és funkcionális térképe
10. ábra: a pLPC plazmid restrikciós és funkcionális térképe
11. ábra: a pLPC4 plazmid restrikciós és funkcionális térképe
12. ábra: a PSV2hyg plazmid restrikciós és funkcionális térképe
13. ábra: a pLPChygl plazmid restrikciós és funkcionális térképe
14. ábra: a pBW32 plazmid restrikciós és funkcionális térképe
15. ábra: a pLPChdl plazmid restrikciós és funkcionális térképe
16. ábra: a pGTC plazmid restrikciós és funkcionális térképe
17. ábra: a pGT-d plazmid restrikciós és funkcionális térképe
18. ábra: a pGT-h plazmid restrikciós és funkcionális térképe.
A jelen találmány a GBMT egységként jelölt új módosított transzkripciós kontroll egységgel kapcsolatos, mely az adenovírus fő késői promoterének regulációs elemétől (MLTF) upstream irányban közel elhelyezett BK vírus P2 erősítőjét, a 2-típusú adenovírus fő késői promoterét, az említett promoter stimulálására pozícionált poli-GT elemet, valamint az adenovírus kapcsolt, három részből álló vezető szekvenciáját kódoló DNS szekvenciát tartalmaz. A GBMT egység eukarióta sejtekben egy hasznos anyag magas szintű expresszióját fogja irányítani, ha az említett hasznos anyagot kódoló gént megfelelően pozícionáljuk az expresszió kiváltására.
A jelen találmány az eukarióta gazdasejtekben történő hasznos anyagok expressziójának módszereivel is kapcsolatos, melyekben az említett gazdasejteket olyan rekombináns DNS vektorral transzformáljuk, mely a hasznos anyagot olyan pozícióban kódolja, hogy a transzkripció a GBMT kontrollegység által szabályozható. Váratlanul magas expressziós szintet érhetünk el, ha a transzformált gazdasejt egy óriás DNS-vírus igen korai géntermékét expresszálja. Az ilyen igen korai géntermékekre példa az adenovírus E1A protein, az adenovírus E1B protein, az Aujeszky betegség vírusának IE proteinje és a herpes simplex vírus ICP4 protein. Az ilyen igen korai génterméket kódoló gén a GBMT egységtől szeparált vektoron kotranszformálható, vagy a GBMT egységgel azonos vektoron transzformálható a gazdasejtbe. Másik megoldásként és legelőnyösebben a gazdasejt egy olyan sejt, mely már expresszálja az igen korai génterméket. A tudomány e területén jártas szakemberek számára ismert, hogy számos kifejlesztett sejtvonal expresszálja az igen korai génterméket, és hogy az ilyen sejtvonalak különösen hasznosak a jelen módszerben.
A találmány egy másik jelentős aspektusa olyan módszerekkel kapcsolatos, melyekkel egy stabilan transzformáit sejtvonalban a hasznos anyag expressziós szintje jelentősen megnövelhető. Először a gazdasejtet egy a GBMT egységet nem tartalmazó expressziós vektorral stabilan transzformáljuk, majd a legmagasabb szintű expressziót mutató szubklónokat szelektáljuk. Ezeket a szubklónokat ezután másodszor is transzformáljuk egy, a hasznos anyagot kódoló gént tartalmazó vektorral, mely anyagok expresszióját a GBMT egység irányítja. A hasznos anyagokat várakozáson felüli mértékben szekretáló kiónokat és szubklónokat szelektálhatjuk.
A jelen találmány expressziós vektorait úgy hoztuk létre, hogy a hasznos anyagokat kódoló DNS-molekulák könnyen az expresszióhoz szükséges helyes pozícióba inzertálhatók vagy inzertáltak a vektorokban. Továbbá a GBMT transzkripciós egységet úgy szerkesztettük meg, hogy egy olyan „kazettát” alakítson, mely az expressziós vektorból egy viszonylag kis resktrikciós fragmenten legyen izolálható. A kazetta könnyen ingáztatható számos expressziós vektor között. A találmányban specifikusan példákkal bemutatott expressziós vektorok a jelen találmányban leírt módszerben a transzkripciót irányító GBMT egységet hasznosítják.
A jelen találmány egyik ilyen expressziós vektora a pGTC plazmid, a humán protein C-t kódoló gén transzkripciójának és expressziójának irányítására pozícionált GBMT egységet tartalmazza. A humán protein C-t kódoló gént a Bang et al., U. S. Patent No. 4775621 számú, 1988. október 4-én kiadott szabadalomban tették közzé és jogot formáltak rá, melynek teljes elméleti részét az irodalmi utalás révén a találmányba építettük. A pGTC plazmid hagyományos módon az Escherichia coli
HU 215 186 Β
K12 AGl/pGTC törzsből izolálható. A tenyészetet 1990. január 18-án deponálták, és állandó törzstenyészete lett a Northern Régiónál Research Laboratories (Preoria, Illinois) törzsgyűjteménynek. Az £. coli KI2 AGl/pGTC az NRRL B-18593 katalógusszám alapján szerezhető be. A pGTC plazmid restrikciós helye és funkciós térképe a csatolt rajzok között levő 16. ábrán látható.
A jelen találmány más plazmidjai is tartalmazzák a GBMT egységet. A pGT-d plazmid tartalmazza a GBMT egységet, melyet úgy pozícionáltunk, hogy a hasznos anyagot kódoló gén inzertálása a GBMT kazettától downstream irányban levő egyedi Bell helyet használva elvégezhető legyen, az E. coli da/n-törzsében elvégzett DNS preparálást követően. A pGT-d plazmid tartalmazza a patkány dhrf gént is, mely szelektálható markerként használható a methotrexate rezisztenciát adó tulajdonsága miatt. A pGT-d plazmid az E. coli K12 AGl/pGT-d törzsből izolálható, melyet 1990. január 18-án deponáltak az NRRL törzsgyűjteményben, és mely az NRRL B-18591 katalógusszám alapján szerezhető be. A pGT-d plazmid restrikciós helye és funkciós térképe a csatolt rajzok között levő 17. ábrán látható.
A pGT-h plazmid szintén tartalmazza a GBMT egysé5 get, melyet úgy pozícionáltunk, hogy a hasznos terméket kódoló gén inzertálása a GBMT kazettától downstream levő egyedi Bell helyet használva elvégezhető legyen, az E. coli íZaOT-törzsében elvégzett DNS preparálást követően. Azonban a pGT-h plazmid tartalmazza a higromicin rezisztencia meghatározóját kódoló gént. A pGT-h plazmid az E. coli K12 AGl/pGT-h törzsből izolálható, melyet szintén 1990. január 18-án deponáltak az NRRL törzsgyűjteménynél. A tenyészet az NRRL B18592 katalógusszám alapján szerezhető be. A pGT-h plazmid restrikciós helye és funkciós térképe a csatolt rajzok között levő 18. ábrán látható.
A pGTC, pGT-d és pGT-h plazmidok megközelítően 900 bázispár hosszúságú HindlU. kazettájában talált GBMT egység a következő szekvenciát tartalmazza:
AAGCTTTTCT CATTAAGGGA AGATITCCCC AGGGAGCTGT TTCAAGGGAT
CCTCGAGAAT TCACACAGAC ACACACACAC ACACACACAG ACACACACAC
ACACTCGAGG ATCCCTAAAA GGTCCATGAG CTCCATGGAT TCTTCCCTGT TAAGAACTTT ATCCATTTTT GCAAAAATTG CAAAAGAATA GGGATTTCCC
CAAATAGTTT TGCTAGGCCT CAGAAAAAGC CTCCACACGG TTACTACTTG
AGAGAAAGGG TGGAGGCAGA GGCGGCCTCG GCCTCTTATA TATTATAAAA
AAAAAGGCGA CAGGGAGGAG CTGCTTACCC ATGGAATGCA GCCAAACCAT
GACCTCAGGA AGGAAAGTGC ATGACTGGGC AGCCAGCCAG TGC-CAGTTAA
TAAGCAGCCA GACAGACATT TGCTTACCCA TGGAATGCAG CCAAACCATG
ACCTCAGGAA GGAAAGTC-CA TGACTGGGCA GCCAGCCAGT GGCAGTTAAT
AAGCAC-CAGC CAC-ACAGACA TGTTTTGCGA GCCTAGTCGC CCTCTTCGGC ATCAAGGAAG GT GATT GOTT TATAC-GTGTA GGCCACGTGA GCGGGTGTTC
CTGAAGGGGG GCTATAAAAG GGGGTGGGGG CC-CGTTCGTC CTCACTCTCT TCCGCATCGC TGTCTGCGAG GGCGÁGCTGT TGGGCTCGCG GTTGAGGACA AACTCTTCGC GGTCTTTCCA GTACTCTTGG ATCGGAAACC CGTCGGCCTC
CGAACGTACT CCGCCACCGA GGGACCTGAG CGAGTCCGCA TCGACCGGAT GGGAAAACCT CTCGAGAAAG GCGTCTAACC AGTCACAGTC GCAAGCTT;
Ez a kazetta a BK erősítőt a 2-típusú adenovírus fő késői promoteréhez viszonyítva optimális elhelyezkedésben tartalmazza, és a poli-GT elemet a BK erősítőtől upstream irányban. A BK erősítő akár 200 bázispár távolságra is lehet a fő késői promotertől és a poli-GT elem máshol helyezkedhet el a plazmidban. Továbbá a kazetta hasznosítja a szintetikus három részből álló vezető szekvenciát, mely körülbelül kétszer hatékonyabb, mint a korábban Grinnell által a 873030837 számú európai nyilvánosságra hozott szabadalmi leírásban közölt nem kapcsolt változat. A szabadalom teljes elméletét az idézett irodalom által a találmányba építettük.
Különösen a GBMT 77/nűŰII kazetta 62-104-ig terjedő nukleotidjai tartalmaznak egy poli-GT(AC) elemet, mely a transzműködésű géntermékek, mint például az óriás DNS-vírus igen korai génterméke, jelenlétében történő génexpresszió növelésére használható. Az ilyen
GT elemek eukarióta expresszióban való használatát Berg et. al. közük a 0363127 számú európai nyilvánosságra hozatali iratban, melynek teljes elméletét a találmányba építettük az irodalmi hivatkozás révén.
A GBMT HindlII kazetta 306-507-ig terjedő nukleotidjai tartalmazzák a BK vírus P2 cisz működésű erősítő elemét, mely fokozza az adenovírus fő késői promoteréből történő transzkripciót. A BK erősítő a DNS egy három ismétlődő szekvenciából álló (a prototípusban) meghatározott szegmentje, bár számos BK erősítő változat ismeretes. A jelen találmány GBMT ka5
HU215 186Β zettájában talált BK erősítő a 68 bázispárból álló ismétlődő részt tartalmazza, mely a 306-376 és a 409—475 bázispárig terjed. A 32 bázispárból álló ismétlés a 377N08, majd újra a 476-507 bázisig tart.
A GBMT kazetta MLTF kötési helyének indulását az 581-es bázisnál találtuk, és az 5’GGCCACGTGACC-3’ szekvenciát tartalmazza. Az adenovírus fő késői promotere MLTF kötési helyének a BK vírus P2 erősítőjéhez közeli pozicionálása segíti a GBMT egység használatából adódó transzkripciós szint növelését. Az MLP „TATA” régiója a kazetta 612 és 620 bázisai között található, míg az adenovírus szintetikus három részből álló vezető szekvenciája a 643 és 844 bázisok között helyezkedik el.
Számos különböző promoter rendszert tartalmazó különböző vektort transzformáltunk gazdasejtekbe, hogy példákkal szemléltessük a találmány GBMT transzkripciós egységének erejét. A pLPC-hd, pLPChyg, pLPC-dhfr és pBL2-CAT píazmidok mind tartalmazzák a BL promoter rendszert. Ezen píazmidok mindegyikének megszerkesztési eljárását a következő Példák című részben részletesen leírtuk. A BL promoter rendszer hasznosítja a BK-vírus erősítő a 2-típusú adenovírus fő késői promoterével együtt.
A pLAPC-IRS és pSBL-CAT píazmidok tartalmazzák az SBL promoterrendszert. Az aktivált humán protein C-t kódoló gént tartalmazó pLAPC-IRS plazmid megszerkesztését Bang et al. az European Patent Publication No. 0319312 számú 1989. június 7-én közzétett szabadalmukban közlik, melynek elméletét az irodalmi utalás révén a találmányba építettük. Az SBL promoterrendszer a tandem elrendezésű SV40 erősítő - BK erősítővel együtt tartalmazza az adenovírus fő késői promoterét.
A pLP-CAT plazmid az adenovírus késői promoterét tartalmazza, azonban erősítő szekvenciát nem. A pGTC plazmid a humán protein C-t kódoló gén expressziójának irányítására pozícionált GBMT egységet, míg a pGTAC-h plazmid az aktív humán protein C-t kódoló gén expressziójának irányítására pozícionált GBMT transzkripciós egységet tartalmazza. Valamennyi fent leírt plazmidot a humán 293 sejtekbe transzformáltuk, mely az adenovírus E1A géntermékét expresszáló stabilan transzformált sejtvonal. A képzett szakemberek számára nyilvánvaló lesz, hogy más az E1A génterméket expresszáló sejtvonalak, mint például a Szíriái Hörcsög AVI2-664 sejtek szintén elérhetők és alkalmazhatók a jelen találmány módszereiben.
A 293 sejtekbe való transzformáció során a különböző vektorokat vagy ellenőriztük a géntermék azonnali expressziójára (3 napos tranziens expresszió), vagy szelektív droggal együtt tenyésztettük, hogy stabil transzformánsokat nyerjünk. Az ilyen vektorokból származó géntermékek elemzésének módszerei jól ismertek a tudomány e területén, és a következő közleményekben található: Grinnell et al., 1987, Biotechnology, 5:1189-1192 és Grinnell et al., 1986, Mól. Cell. Bioi. 6:3596-3605. Ezek elméleteit az idézett irodalom révén a találmányba építettük. Az I. táblázat a tranziens expressziós vizsgálatok eredményeit mutatja, míg a II.
táblázat a stabilan integrálódott plazmidokból történő zimogén és aktivált humán protein C expresszió vizsgálatát mutatja.
I. táblázat
A Promoter erősség vizsgálata (Tranziens vizsgálat)
Promoter Vektor Az expresszió relatív szintje
MLP pLP-CAT 1
BL pBL2-CAT (pLPC-hd) 73a
GBMT pGTC 5257
SBL pSBL-CAT 23a
a: Az MLP, SBL és BL közötti promotererősség relatív szintjét kloramfenikol acetiltranszferáz (CAT) enzimmel és indikátorgénként CAT-t használva határoztuk meg. A BL és GBMT közötti relatív promotererősséget a standard ELISA vizsgálatban indikátor gén40 ként humán protein C-t alkalmazva határoztuk meg.
II. táblázat
A stabilan integrált plazmidokból expresszált humán protein C vizsgálata
Aktivált humán protein C
Promoter Vektor x(ng/ml)a tartomány (ng/ml) xng/106 sejt
SBL pLAPC-IRS 33(n= 12) 13-69 26
GBMT pGTAC-h 1460(n = 22) 652-3117 622
a: 0,9 cm2 felületen összeérésig szaporított tenyészetek
Humán protein C
Promoter Vektor x(ng/ml)a tartomány (ng/ml) xng/106 sejt
BL pLPC-hd pLPC-hyg 120 (n = 30) 12-480 95
GBMT pLPC-dhfr pGTC 2930 (n = 48) 270-5095 2340
HU 215 186 Β
A találmány egy másik aspektusát a 11. és 12. példákban szemléltetjük, ahol a humán protein C-t termelő stabilan transzformált sejtvonalakat a pGTC vektorral való transzformációval erősítettük. Először a pLPC plazmidot transzformáltuk stabilan a 293 sejtekbe, majd az általános háttér populációnál 2-3-szor több humán protein C-t kiválasztó szubklónokat szelektáltuk. Ezeket a stabilan transzfektált sejteket ezután a GBMT transzkripciós egység által irányított humán protein C-t kódoló gént tartalmazó pGTC plazmiddal újra transzformáltuk. A várakozástól teljesen eltérően sokkal több nagy termelésű kiónt fedeztünk fel, mint a 293 sejtek pGTC-vel való egyszeri transzformálásával. Továbbá a kétszer transzformált sejtek 3,5-6,3-szor több humán protein C-t szekretáltak, mint a csak a pLPC vektorral transzformált szülői sejtvonal, a legmagasabb termelésű kiónra való szelekciót követően.
A következő Példák sokkal teljesebben íiják le a jelen találmány vektorait, módszereit, vegyületeit és rekombináns szervezeteit. A tudomány e területén jártas szakember számára feltűnik, hogy a Példákban leírt konkrét reagensek, berendezések és eljárások csupán szemléltető jellegűek, és nem limitálják a jelen találmányt.
1. Példa
A BK-vírus DNS preparálása
A BK-vírust az American Type Culture Collection törzsgyűjteménytől az ATCC VR-837 katalógusszámon szereztük be. A fagyasztva szárított vírust Hankféle egyensúlyi sóoldatban (Gibco, 3175 Staley Road, Grand Island, NY 14072), körülbelül 105 tarfoltképző egység (pfu) per ml titer mennyiségben reszuszpendáltuk. A BK-vírus DNS preparálásához választott gazdaként a Flow Laboratories-tól (Inc., 7655 Old Sringhouse Road, McLean, VA 22101) a 0-100 katalógusszámon, vagy az M. A. Bioproducts-tól a 70-151 katalógusszámon beszerezhető elsődleges humán embrionális vese (PECH) sejtek szolgáltak. Másik lehetőségként a BK-vírus Verő sejtekben (ATCC CCL81 katalógusszám) szaporítható.
Körülbelül öt konfluens, monorétegű körülbelül 106 PECH sejtet tartalmazó 75 mm2 felületű polisztirén kombikot használtunk a víruspreparáláshoz. Körülbelül 1 ml 105 pfu/ml titerű BK-vírust adunk minden lombikhoz, melyeket ezután 37 °C hőmérsékleten 1 órán át inkubálunk, majd friss táptalajt adunk a lombikokhoz (10% magzati bovin szérummal kiegészített Dulbeccoféle módosított Eagle-féle táptalaj, Gibco) és a fertőzött sejteket 37 °C hőmérsékleten 10—14 napig inkubáljuk, vagy addig, amíg a vírus teljes citropatogén hatása észlelhető. Ez a citopatogén hatás sejtvonalról sejtvonalra és vírusról vírusra változik, de általában a sejtek felhajtásából, összecsomósodásából és a tenyészlemezról való leválásból áll.
A sejtekből a vírust 3 fagyasztási-olvasztási ciklussal szabadítjuk ki, és a sejtmaradványokat 5000 x g-n való centrifugálással távolítjuk el. Az 1 liter felülúszóban levő vírust úgy csapatjuk ki és gyűjtjük össze, hogy a felülúszóhoz adunk 100 g PEG-6000-t, az oldatot órán át 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 20 percig 5000 x g-n centrifugáljuk. A pelletet 0,1 * SSC pufferben (1 x SSC = 0,15 M NaCl és 0,015 M Na-citrát, pH = 7,0) az eredeti térfogat 1/100 részében újra oldjuk. A vírusszuszpenziót 15 ml kémcsőben levő telített KBr oldatra rétegezzük, melyet 75000 x g-n 3 órán át centrifugálunk. Két egyértelmű sávot kapunk a KBr-oldatban a centrifügálás után. A teljes viriont tartalmazó alsó réteget összegyűjtjük, és Sephadex8 G-50 oszlopon (Sigma Chemical Co., P.O. Box 14508, St. Luis, MO 63178) sómentesítjük elúciós pufferként TE-t (10 mM Tris-HCl, pH = 7,8; és 1 mM EDTA) használva.
Az oszlopról nyert tisztított virionok oldatához 1% végkoncentráció eléréséig nátrium dodecil szulfátot (SDS) és 100 pg/ml végkoncentráció eléréséig promázt adagolunk, és az oldatot 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután az oldathoz 1,56 g/ml sűrűség eléréséig cézium-kloridot és 100 pg/ml végkoncentráció eléréséig etidium-bromidot adunk. Az oldatot Sorvall (DuPont Inst. Products, Biomedical Division, Newton, CT 06470) 865-ös rotorral, vagy egy hasonló vertikális rotorral 260000 x g-n 24 órán át centrifugáljuk. Centrifugálás után a vírus DNS-réteget izoláljuk és ötször 100 mM Tris-HCl (pH = 7,8)-dal telített izoamil alkohollal extraháljuk. A BK-vírus DNS-oldatát ezután TE pufferrel szemben dializáljuk, míg a DNS 260 nm/280 nm abszorbancia aránya 1,75 és 1,90 közé nem esik. A DNS kicsapatását a NaCl koncentráció 0,15 M-ra igazításával, 2 térfogat etanol hozzáadásával, az oldat -70 °C hőmérsékleten legalább 2 órán át való inkubálásával és 10 percig 12000 x g-n történő centrifügálásával érjük el. A nyert BK-vírus DNS pelletet 1 mg/ml koncentrációban TE pufferben szuszpendáljuk.
2. Példa
A pBKEl és pBKE2 plazmidok megszerkesztése
Az 1. példa szerint előállított BK-vírus DNS-ának μΐ TE pufferben levő körülbelül 1 pg mennyiségét μΐ 10 x EcoRI pufferben (1,0 M Tris-HCl, pH = 7,5; 0,5 M NaCl; 50 mM MgCl2; és 1 mg/ml BSA) és 15 μΐ H2O-ban feloldottuk. Körülbelül 2 μΐ (körülbelül 10 egység; a találmányban minden enzimegység erre vonatkozik, ha másként nem jelöltük, a New England Biolabs, 32 Tozer Road, Beverly, MA 01915-9990, egység definíciójára vonatkozik, bár az enzimek eredete eltérő lehet) EcoRI restrikciós enzimet adtunk a DNS oldathoz, és a kapott reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk.
A pUC8 plazmid körülbelül 1 pg mennyiségét (Pharmacia P-L Biochemicals, 800 Centennial Ave., Piscataway, N. J. 08854) 1 pl TE pufferben EcoRI-gyel emésztettük, alapjában véve az EcoRI-gyel emésztett BK-vírus DNS előállításakor alkalmazott módszer szerint. Az EcoRI-gyel emésztett pUC8 plazmid DNS-at 100 μΐ-re hígítottuk TE pufferban; körülbelül 0,06 egység borjúbél alkalikus foszfatázt adtunk az oldathoz, és a kapott reakcióelegyet 30 percig 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Az oldatot beállítottuk úgy, hogy 1 x SETet (5 mM Tris-HCl, pH = 7,8; 5 mM EDTA; és 150 mM NaCl) 0,3 M Na NaOAc-t és 0,5 3 SDS-t tar7
HU 215 186 Β talmazzon, majd 45 percig 65 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A foszfatázos kezelés megvédi a pUC8 DNS-at attól, hogy saját magával ligáljon.
Az EcoRI-gyel emésztett BK vírus és pUC8 plazmid DNS-at először pufferolt fenollal, majd kloroformmal extraháltuk. A DNS-at oly módon gyűjtöttük össze, hogy a DNS-oldatok NaCl koncentrációit 0,25 M-ra igazítottuk, 2 térfogat etanolt adtunk hozzá, a kapott reakcióelegyet szárazjég-etanol fürdőben inkubáltuk 5 percig, és a DNS pelletizálása céljából centrifugáltuk. A felülúszót leöntöttük, és a DNS pelleteket 70%-os etanollal mostuk, szárítottuk és 10 μΐ illetve 30 μΐ TE pufferben reszuszpendáltuk a BK illetve a pUC8 plazmid mintákat.
Körülbelül 3 μΐ H2O és 1 pl 10 χ ligáz puffért (0,5 M Tris-HCl, pH = 7,8; 100 mM MgCl2; 200 mM DTT; 10 mM ATP és 0,5 mg/ml BSA) adtunk a 2 μΐ £coRI-gyel emésztett BK-vírus és az 1 μΐ £coRI-gyel emésztett pUC8 plazmid DNS-keverékhez. A DNS-oldathoz 1 μΐ (körülbelül 1000 egység) T4 DNS ligázt adtunk és a kapott reakcióelegyet 16 °C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáltuk. A ligáit DNS alkotja a kívánt pBKEl és pBKE2 plazmidokat, melyek csupán az inzertált BK vírus DNS orientációjában különböznek. A pBKEl plazmid restrikciós helye és fünkciós térképe a csatolt rajzok között levő 2. ábrán látható.
A Pharmacia P-L Biochemicals-től beszerezhető E. coli KI2 JM103 törzsének 50 ml-nyi tenyészetét L táplevesben szaporítottuk 650 nm-en (O. D.65O) körülbelül 0,4 abszorbancia egységű optikai denzitás eléréséig. A tenyészetet jégen 10 percig hűtöttük, és a sejteket centrifugálással gyűjtöttük össze. A sejt pelletet 25 ml hideg 100 mM-os MgCl2-ban reszuszpendáltuk és 25 percig jégen inkubáltuk. A sejteket ismét centrifúgálással pelletizáltuk, majd 2,5 ml, hideg 100 mM-os CaCl2-ban reszuszpendáltuk, és jégen 30 percig inkubáltuk. Inkubálás után a sejtek alkalmasak a transzformáló DNS felvételére.
Ezen sejtszuszpenzió 200 μΐ mennyiségét összekevertük a fent leírt módon preparált ligáit DNS-val és a keveréket 30 percig jégen inkubáltuk. Ezen periódus után a sejteket 2 percre 42 °C hőmérsékletű vízfürdőbe helyeztük, majd további 10 percre visszahelyeztük őket a jégre. A sejteket centrifugálással gyűjtöttük össze, és 1 ml L órán át inkubáltuk.
A sejtkeverék azonos mennyiségű részeit 100 pg ampicillin/ml 40 pg X-gal/ml és 40 pg IPTG/ml tartalmú L agarlemezre (L tápleves literenként 15 g agarral) szélesztettük. A lemezeket egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Azok a telepek, melyek az inzert nélküli píazmidot tartalmazzák, mint például az E. coli K12 JM103/pUC8, ezeken az agarlemezeken kék színűek.
Azok a telepek, melyek az inzerttel rendelkező píazmidot tartalmazzák, mint például az E. coli KI 2 JM103/pBKEl, fehérek. Számos fehér telepet szelektáltunk és szkrineltünk plazmid DNS-uk restrikciós enzim analízisével a BK-vírus körülbelül 5 kilobázisú EcoRI restrikciós fragmentjének jelenlétére. A plazmid DNS-at az E. coli K12 JM103 (pBKEl és E. coli
KI2 JM103/pBKE2 sejtekből nyertük a következő példában leírt plazmid DNS izolálási eljárással alapjában véve megegyező módon, bár az eljárást kisebb léptékben és a CsCl grádiens lépcsők kihagyásával végeztük, ha a plazmid DNS-at csupán a restrikciós enzim analíziséhez izoláltuk.
3. Példa
A pBKneol és pBKneo2 plazmidok megszerkesztése
Az E. coli K12 HBlOl/pdBPV-MMTneo sejteket liofilezett formában az American Type Culture Collection törzsgyűjteménytől az ATCC 37224 katalógusszámon szereztük be. A liofilezett sejteket 100 pg/ml ampicillint tartalmazó L agar lemezekre szélesztettük, és 37 °C hőmérséklet inkubáltuk, hogy egyedülálló telepizolátumokat kapjunk.
pg/ml ampicillint tartalmazó 11 L táplevest (10 g tripton; 10 g NaCl és 5 g élesztókivonat per liter) inokuláltunk az E. coli KI2 HBlOl/pdBPV-MMtneo egy telepével, levegőkeverőben (air-shaker) 37 °C hőmérsékleten addig inkubáltuk, míg az O.D.590 érték elérte a körülbelül 1 abszorbancia egységet. Ekkor 150 mg kloramfenikolt adtunk a tenyészethez. Az inkubálást körülbelül 16 órán át tovább folytattuk; a kloramfenikol gátolja a protein szintézist, így gátolja a további sejtosztódást, de nem akadályozza a plazmid replikáció folytatódását.
A tenyészetet Sorvall rotorban (DuPont Co., Instrument Products, Biomedical Division, Newtown, CN 06470) 5 percig 4 °C hőmérsékleten 6000/perc fordulaton centrifugáltuk. A kapott felülúszót leöntöttük, és a sejtpelletet 40 ml TES pufferben (10 mM Tris-HCl, pH = 7,5; 10 mM NaCl; és 1 mM EDTA) mostuk és ezután újra pelletáltuk. A felülúszót leöntöttük, és a pelletet szárazjég-etanol fürdőben megfagyasztottuk, majd felolvasztottuk. A felolvasztott sejtpelletet 10 ml 25%-os szacharóz és 50 mM EDTA oldatában reszuszpendáltuk. Körülbelül 1 ml lizozimoldatot (5 mg/ml); 3 ml EDTA-t (0,25 M; pH = 8,0) és 100 pl RNáz A-t (10 mg/ml) adtunk az oldathoz, melyet ezután 15 percig jégen inkubáltunk. 3 ml lizáló oldatot (3 ml 10%-os Triton-X 100, 75 ml 0,25 M-os EDTA, pH = 8,0; 15 ml 1 M-os Tris-HCl, pH = 8,0; és 7 ml víz összekeverésével készítettük) adtunk a lizozimmal kezelt sejtekhez, összekevertük, és a nyert oldatot újabb 15 percig jégen inkubáltuk. A lizált sejteket megfagyasztottuk szárazjég-etanol fürdőben, majd felolvasztottuk.
A sejtmaradványokat az oldatból centrifúgálással 25000 rpm, 40 perc, SW27 rotor (Beckman, 7360, N. Lincoln Ave., Lincolnwood, IL 60646) és pufferolt fenollal való extrahálással távolítottuk el. Körülbelül 30,44 g CsCl-ot és körülbelül 1 ml etidium-bromid-oldatot (5 mg/ml) adtunk a sejtkivonathoz, majd az oldat térfogatát 40 ml mennyiségre egészítettük ki TES pufferrel. Az oldatot VTÍ50 ultracentrifuga csőbe (Beckman) dekantáltuk, melyet ezután lezártunk, és körülbelül 16 órán át 42000 rpm fordulaton VTÍ50 rotorban centrifúgáltuk. Az így nyert plazmid sávot, melyet UV-fénnyel tettünk láthatóvá, izoláltuk, és Ti75-ös cső8
HU 215 186 Β be és rotorba (Beckman) helyezve 16 órán át 50000 rpm fordulaton centrifugáltuk. Bármely szükséges térfogatigazítást 0,761 g/ml CsCl-ot tartalmazó TES-t használva végeztünk. A plazmid sávot újra izoláltuk, sóval telített izopropanollal extraháltuk az etidium-bromid eltávolítása céljából és 1:3 arányban hígítottuk TES puffenel. Ezután két térfogat etanolt adtunk az oldathoz, melyet ezután -20 °C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáltunk. A plazmid DNS-at az oldat SS34 rotorban (Sorvall) 15 percig tartó 10000 rpm fordulaton történő centrifugálásával pelletáltuk.
Az ily módon nyert pdBPV-MMTneo plazmid DNS körülbelül 1 mg mennyiségét 1 ml TE pufferben szuszpendáltuk és -20 °C hőmérsékleten tároltuk. Az itt leírt plazmidizolálási eljárást általában akkor alkalmazzuk, ha nagy mennyiségű, nagyon tiszta plazmid DNSat akarunk előállítani. Az eljárás módosítható, hogy gyorsan nyerjünk kevesebb, kisebb tisztaságú DNS-at. Ilyenre a transzformánsok egy adott plazmid jelenlétére való szkrinelésekor van szükség. Ilyen esetben csupán körülbelül 5 ml tenyésztett sejtet használunk, a sejteket egy megfelelően lecsökkentett mennyiségű lizis pufferben lizáljuk, és a centrifugálási lépéseket fenolos és kloroformos extrahálással helyettesítjük.
A fenti módon előállított pdBPV-MMTneo plazmid DNS körülbelül 5 pg (5 pl) mennyiségét és az 1. példában leírt módon előállított BK-vírus DNS 5 pg (5 pl) mennyiségét 37 °C hőmérsékleten 2 órán át 2 pl 10 x BamHI puffért (1,5 M NaCl; 60 mM Tris-HCl, pH = 7,9; 60 mM MgCl2; és 1 mg/ml BSA), 1 μί Βα/κΗΙ restrikciós enzimet és 7 μί H2O-t tartalmazó oldatban emésztésnek vetettünk alá. A reakciót azonos térfogatú fenolos extrahálással állítottuk le, melyet két kloroformos extrahálás követett. Ezután a Ba/nHI-gyel emésztett DNS-akat kicsapattuk, centrifugálással összegyűjtöttük és 5 μί H2O-ban reszuszpendáltuk.
Körülbelül 1 pl 10 x ligáz puffért adtunk a BawHIgyel emésztett pdBPV-MMTneo plazmid (1 μί) és a őawiHI-gyel emésztett BK-vírus DNS (1 pl) keverékéhez. Miután 1 μί (körülbelül 1000 egység) T4 DNS ligázt és 6 μί H2O-t adtunk a DNS-keverékhez, a nyert reakcióelegyet 16 °C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáltuk. A ligáit DNS alkotta a kívánt pBKneol és pBKneo2 plazmidokat, melyek csupán a BK vírus DNS orientációjában különböznek. A pBKneol plazmid egy restrikciós helye és funkciós térképe a csatolt rajzok között levő 3. ábrán látható.
Az E. coli K12 HB101 sejtek liofilezett formában a Northern Régiónál Research Laboratory törzsgyűjteménytől szerezhetők be az NRRL B-15626 katalógusszámon. Az E. coli K12 HB101 sejteket tenyésztettük, alkalmassá tettük a transzformációra, és a fent leírt módon preparált ligáit DNS-val transzformáltuk, alapjában véve a 2. példában leírt eljárásnak megfelelően. A transzformált sejteket 100 pg/ml ampicillint tartalmazó L agarlemezekre szélesztettük. Az E. coli K12 HBlOl/pBKneol és E. coli K12/pBKneo2 transzformánsokat az ampicillin rezisztens fenotípus és plazmid DNS-uk restrikciós enzim analízise alapján azonosítottuk.
4. Példa
A pBLcat plazmid megszerkesztése
A) A köztes pLPcatplazmid megszerkesztése
Az adenovírus 2 (Ad2) virion DNS-a egy kétszálú körülbelül 35,94 kilobázisú lineáris molekula. Az Ad2 késői promoter az Ad2 genom körülbelül 0,316 kilobázisú AccI-PvuII restrikciós fragmensén izolálható; ez a körülbelül 0,32 kilobázisú restrikciós fragmens megfelel az Ad2 genom 5755 és 6071 nukleotid pozíciók közötti szekvenciának. Hogy a kívánt körülbelül 0,32 kbázisú AccI-PvuII restrikciós fragmenst izoláljuk, először az Ad2 DNS-at a Ball restrikciós enzimmel emésztjük és a körülbelül 0,32 kbázisú AccI-PvuII restrikciós fragmens teljes szekvenciáját tartalmazó körülbelül 2,4 kbázisú Ball restrikciós fragmenst izoláljuk. Ezután a körülbelül
2,4 kbázisú Ball restrikciós fragmenst AccI és PvuII enzimekkel emészttetjük, hogy a kívánt fragmenst megkapjuk.
Az Ad2 DNS körülbelül 50 pg mennyiségét (a BRL-től szerezhető be) 80 pl H2O-ban és 10 pl 10 χ Ball pufferben (100 mM Tris-HCl, pH = 7,6; 120 mM MgCl2; 100 mM DTT; és 1 mg/ml BSA) oldjuk fel. A Ball restrikciós enzim körülbelül 10 pl (körülbelül 20 egység) mennyiségét adjuk az Ad2 DNS oldatához, és a kapott reakcióelegyet 4 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk.
A öa/I-gyel emésztett DNS-at agaróz-gélre helyezzük, és addig végzünk vele elektroforézist, míg a restrikciós fragmenst szeparáljuk. Az elektroforézisen átesett DNS-at a gél etidium-bromid (0,5 pg/ml) hígított oldatával történő festésével és a festett gél hosszú hullámhosszú UV-fénynek való kitevésével tesszük láthatóvá. A DNS-agaróz gélről való izolálásának egyik módszere a következő. Egy kis rést készítünk a gélen az izolálni kívánt fragment előtt és NA-45 DEAE membrán (Schelicher és Schuell, Keene, NH 03431) egy kis darabját helyezzük minden résbe. További elektroforézis eredményeként a DNS nem-kovalens módon kötődik a DEAE membránhoz. Miután az izolálni kívánt fragment a DEAE membránhoz kötődött, a membránt eltávolítjuk és alacsony sótartalmú pufferben (100 mM KCI; 0,1 mM EDTA és 20 mM Tris-HCl, pH = 8,0) mossuk. Ezután a membránt egy kis kémcsőbe helyezzük és magas sótartalmú pufferbe (1 M NaCl; 0,1 mM EDTA; és 20 mM Tris-HCl, pH = 8,0) merítjük és 65 °C hőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk, hogy a DEAE papírról a DNS-at eltávolítsuk. A 65 °C hőmérsékleten való inkubálás után az inkubációs puffért összegyűjtjük, és a membránt magas sótartalmú pufferben mossuk. A magas sótartalmú mosó oldatot és a magas sótartalmú inkubációs puffért összegyűjtjük.
A magas só-DNS-oldat térfogatát úgy igazítjuk, hogy a NaCl koncentrációja 0,25 M legyen, ezután 3 térfogat hideg abszolút etanolt adunk az oldathoz. A kapott oldatot összekeverjük és -70 °C hőmérsékletre helyezzük 10-20 percre. Ezután az oldatot 15 percig 15 000 rpm fordulaton centrifugáljuk. A maradvány só eltávolítása céljából újabb kicsapatás után a DNS pelletet etanollal mossuk, szárítjuk, 20 pl TE pufferben
HU 215 186 Β reszuszpendáljuk és ezután ez tartalmazza az Ad2 kívánt restrikciós fragmensének körülbelül 3 pg mennyiségét. A kapott tisztított fragmenst 10 μί TE pufferben oldjuk fel.
Körülbelül 6 μί H2O-t és 2 μί 10 * Accí puffért (60 mM NaCl; 60 mM Tris-HCl, pH = 7,5; 60 mM MgCl2; 60 mM DTT; és 1 mg/ml BSA) adunk az Ad2 körülbelül 2,4 kbázisú BaB restrikciós fragmensét tartalmazó oldathoz. Miután 2 μί (körülbelül 10 egység) Accí restrikciós enzimet adunk a DNS oldathoz a reakcióelegyet 37 °C hőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk. Az rtccl-gyel való emésztés után a DNS-at etanolos kicsapatással összegyűjtjük és 16 μί H2O és 2 pl 10 x PvwII puffer (600 mM NaCl; 60 mM Tris-HCl; pH = 7,5; 60 mM MgCl2; 60 mM DTT; és mg/ml BSA) keverékében reszuszpendáljuk. Miután μί (körülbelül 10 egység) PvwII restrikciós enzimet adunk a DNS oldatához, a reakcióelegyet 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk.
Az Ad2 ^ccI-Pví/II-vel emésztett körülbelül
2,4 kbázisú Ball restrikciós fragmentjét körülbelül 6%os políakrilamid gélre helyezzük, és addig végezzük az elektroforézist, míg az Ad2 késői promotert tartalmazó körülbelül 0,32 kbázisú AccI-PvuII restrikciós fragmens elválik a többi emésztési terméktől. A gélt etidium-bromiddal megfestjük, UV-fénnyel megvilágítjuk és a körülbelül 0,32 kbázisú AccI-PvuII restrikciós fragmenst tartalmazó gélszakaszt kivágjuk a gélből, összezúzzuk és egy éjszakán át áztatjuk szobahőmérsékleten körülbelül 250 μί extrakciós pufferben (500 mM NH4OAc; 10 mM MgOAc; 1 mM EDTA; és 0,1% SDS). A következő reggelen a keveréket centrifugáljuk és a pelletet eltávolítjuk. A felülúszóban levő DNS-at etanollal kicsapatjuk és 2 pg tRNS-at adunk az oldathoz, hogy elérjük a kívánt fragmens teljes kicsapódását. Körülbelül 0,2 pg 0,32 kbázisú AccI-PvuII restrikciós fragmenst nyerünk, amit 7 μί H2O-ban szuszpendálunk.
Körülbelül 0,25 pg (0,5 μί-ben) BcB linkért (5’-CTGATCAG-3’, beszerezhető a New England Biolabstól), melyet a későbbi 10 A példában leírt eljárással alapjában véve megegyező módon kinázzal kezeltünk, adtunk a körülbelül 0,32 kbázisú AccI-PvuII restrikciós enzimet tartalmazó oldathoz, majd μί 10 x ligáz puffért adtunk a DNS oldathoz. A kapott reakcióelegyet egy éjszakán át 16 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A BcB linkerek csak az AccI-PvuII restrikciós fragment PvwII végéhez tudtak ligálódni. A DNS szekvenálás később fényt derített arra, hogy 4 BcB linker kapcsolódott az AccI-PvuII restrikciós fragment PvuII végéhez. Ezeket az extra BcB linkereket el lehet távolítani Rc/I-gyel történő emésztéssel és újraligálással, azonban az extra BcB linkereket nem távolítottuk el, mivel nem gátolták az extra linkereket tartalmazó vektorok megfelelő működését.
Az E. coli KI 2 HB101/pSV2cat sejteket liofilezett formában az ATCC törzsgyűjteménytől szereztük be az ATCC 37155 katalógus számon és a pSV2cat plazmid DNS-at a 3. példában leírt eljárással alapjában véve megegyező módon izoláltuk a sejtekből. A pSV2cat plazmid egy restrikciós helye és funkciós térképe a csatolt rajzok között levő 4. ábrán látható. Körülbelül 1 mg pSV2cat plazmid DNS-at nyerünk és ezt 1 ml TE pufferben oldjuk fel. A pSV2cat plazmid DNS körülbelül 3 pg (3 pl) mennyiségét adtuk 2 μί 10 χ Accí pufferhez és 16 μί H20-hoz majd 3 μί (körülbelül 9 egység) Accí restrikciós enzimet adtunk a pSV2cat DNS oldatához. A kapott reakcióelegyet 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Az Accl-gyel emésztett pSV2cat plazmid DNS-at ezután Stul restrikciós enzimmel emészttettük 3 μί 10 χ Síül puffer (1,0 M NaCl; 100 mM Tris-HCl, pH = 8,0; 100 mM MgCl2; 60 mM DTT; és 1 mg/ml BSA), 5 μί H2O és körülbelül 2 μί (körülbelül 10 egység) ΛμΙ restrikciós enzim hozzáadásával. A reakcióelegyet 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A reakciót úgy állítottuk le, hogy egyszer fenollal és kétszer kloroformmal végeztünk extrahálást. Körülbelül 0,5 pg mennyiséget nyertünk a kívánt fragmensből, melyet 20 pl TE pufferben oldottunk fel.
Az AccI-StuI-gyel emésztett pSV2cat plazmid DNS körülbelül 4 pl mennyiségét összekevertük az Ad2 körülbelül 0,32 kbázisú AccI-PvuII (BcB kötőkkel kapcsolódó) restrikciós fragment 7 pl mennyiségével, majd miután 3 pl 10 χ ligáz puffért, 15 pl H2O-t és 2 pl (körülbelül 1000 egység) T4 DNS ligázt adtunk ehhez, a ligációs reakcióelegyet egy éjszakán át 16 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A ligáit DNS alkotta a kívánt pLPcat plazmidot, azt a plazmidot, mely tartalmazza az Ad2 késői promoterét úgy pozícionálva, oly módon, hogy az a kloramfenikol acetiltranszferáz gén granszkripcióját, és így expresszióját hozza létre. A pLPcat plazmid restrikciós helyeit és funkciós térképét az 5. ábra szemlélteti.
A ligáit DNS-sel a 2. példában leírtakkal lényegében megegyező módon E. coli K12 HB101 sejteket transzformáltunk. A transzformált sejteket 50 pg/ml ampicillint tartalmazó L agarra szélesztettük; az E. coli KI2 HBlOl/pLPcat transzformánsok azonosítására plazmid DNS restrikciós enzim analízist alkalmaztunk. A transzformánsokból lényegében a 3. példában leírt plazmid izolálási módszerrel izoláltuk a pPLcat plazmid DNS-t, melyet azután a későbbi műveletekben használtunk fel.
B) A végleges pBLcat plazmid megszerkesztése pl TE pufferben körülbelül 88 pg pBKneol plazmid DNS-t adtunk 7,5 pl 10 x Accí puffer, 30 pl víz és 15 pl (körülbelül 75 egység) Accí restrikciós enzim elegyéhez, és a kapott reakcióelegyet 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Az Accl-gyel emésztett BKvírus DNS-t agaróz-gélre vittük, és a ~ 1,4 kb fragmenst, mely a BK erősítőt tartalmazza, elválasztottuk a többi emésztési terméktől. A ~ 1,4 kb restrikciós fragmenst ezt követően lényegében a 4A példában leírt módszert alkalmazva izoláltuk. A fragmens körülbelül 5 pg mennyiségét 5 pl 10 χ PvwII pufferben, 45 pl H2O-ban és 5 pl (körülbelül 25 egység) PvwII restrikciós enzimben reszuszpendáltuk, és a reakcióelegyet 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A PvwII-vel emésztett DNSat ezután izoláltuk és a 4A. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon a ligáláshoz preparáltuk. A kí10
HU215 186Β vánt körülbelül 1,28 kbázisú Accl-Pvull fragment körülbelül 2 pg mennyiségét kinyertük, és 5 μί TE pufferben feloldottuk.
Körülbelül 1 pg pLPcat plazmid DNS-at oldottunk fel 5 μί 10 χ Accl pufferben és 40 μί H2O-ban. Körülbelül 5 μί (körülbelül 25 egység) Accl restrikciós enzimet adtunk a pLPcat plazmid DNS oldatához, és a reakcióelegyet 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Az Accl-gyel emésztett pLPcat plazmid DNS-at etanollal kicsapattuk és 5 μί 10 x SmI pufferben, 40 μί H2O-ban és 5 μί (körülbelül 25 egység) Stul restrikciós enzimben reszuszpendáltuk, és a reakcióelegyet 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Az HccI-StwI-gyel emésztett pLPcat plazmid DNS-at több alkalommal etanolos kicsapatásnak vetettük alá, hogy az E. coli replikációs origóját és az Ad2 késői promoterét tartalmazó körülbelül 4,81 kbázisú XccI-S/wI restrikciós fragmenst megtisztítsuk a többi emésztési terméktől. A restrikciós fragmens körülbelül 16 bázispár hosszúságú. A kívánt körülbelül 4,81 kbázisú restrikciós fragment 1 pg mennyiségét kinyeijük és 20 pl TE pufferben oldottuk fel.
A pLPcat plazmid körülbelül 4,81 kbázisú Accl-Stull restrikciós fragmensének 5 pl mennyiségét hozzáadtuk a BK vírus körülbelül 1,28 kbázisú Accl-Pvull restrikciós fragment 5 pl mennyiségéhez. Miután hozzáadtunk 3 pl 10 x ligáz puffért, 15 pl H2O-t és 2 pl (körülbelül 1000 egység) T4 DNS ligázt a DNS keverékéhez, a kapott Íigációs reakcióelegyet egy éjszakán át 16 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A ligáit DNS képezte a kívánt pBLcat plazmidot. A pBLcat plazmid egy restrikciós helyét és funkciós térképét a csatolt rajzok között levő 6. ábra szemlélteti.
A ligáit DNS-at a 3. példában leírt módszerrel alapjában véve egyező módon végzett E. coli KI2 HB101 sejtek transzformálásához használtuk. Az E. coli KI2 HBlOl/pBLcat transzformánsok azonosítását plazmid DNS-uk restrikciós enzim analízisével végeztük. A pBLcat plazmid DNS-at a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon preparáltuk a további szerkezetekben való alkalmazás céljából.
5. Példa
A pSBLcat plazmid megszerkesztése
Körülbelül 100 pg pBLcat plazmid DNS-at oldottunk fel 10 pl 10 x HindlII pufferben (0,5 M NaCl; 0,1 M Tris-HCl, pH = 8,0; 0,1 M MgCl2; és 1 mg/ml BSA) és 80 pl H2O-ban. Körülbelül 10 pl (körülbelül 100 egység) HindlII restrikciós enzimet adunk a pBLcat plazmid DNS oldatához és a kapott reakcióelegyet 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. AH/«űiHI-mal emésztett pBLcat plazmid DNS-at agaróz gélre helyeztük és az elektroforézist addig végeztük, míg a BK erősítőt és az Ad2 késői promotert tartalmazó körülbelül 0,87 kbázisú HindlII restrikciós fragmens jól elvált a többi emésztési terméktől. Ezután a körülbelül 0,87 kbázisú fragmenst izoláltuk és a ligáláshoz előkészítettük a 4A. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon. A kívánt fragmensből körülbelül 10 pg mennyiséget nyertünk, és ezt 50 pl TE pufferben feloldottuk.
pl TE pufferben levő körülbelül 1 pg pSV2cat plazmid DNS-at oldottunk fel 2 pl 10 x HindlII pufferben és 16 pl H2O-ban. Körülbelül 1 pl (körülbelül 10 egység) HindlII restrikciós enzimet adtunk a DNS oldatához, és a reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A reakciót a reakcióelegy egyszeri fenollal és kétszeri kloroformmal történő extrahálásával állítottuk le. A Efíntflll-mal emésztett pSV2cat plazmid DNS-at etanollal kicsapattuk és 100 pl TE pufferben reszuszpendáltuk. A //znc/III-mal emésztett pSV2cat plazmid DNS-at borjúbél alkalikus foszfatázzal kezeltük a 2. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon, majd 10 pl TE pufferben reszuszpendáltuk.
A pBLcat plazmid körülbelül 0,87 kbázisú HindHA restrikciós fragmensének körülbelül 5 pl mennyiségét 10 pl //zní/III-mal emésztett pSV2cat plazmidhoz adtuk hozzá, majd 3 pl 10 χ ligáz puffért, 2 pl (körülbelül 1000 egység) T4 DNS ligázt és 13 pl H2O-t adtunk a DNS oldatához. A reakcióelegyet 2 órán keresztül 16 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A ligáit DNS képezte a kívánt pSBLcat plazmidot. A ligáit DNS-at az E. coli K12 HB101 sejtek a 2. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon végzett transzformálásához használtuk. A transzformált sejteket ampicillint tartalmazó L agarlemezre szélesztettük és az ampieiílin rezisztens transzformánsok plazmid DNS-át az E. coli K12 HBlOl/pSBLcat transzformánsok azonosítása céljából restrikciós enzim analízissel vizsgáltuk. A BK erősítőt és az Ad2 késői promoterét kódoló körülbelül 0,87 kbázisú HindlII restrikciós fragment inzertálódhat a 7//«<YIII-mal emésztett pSBLcat plazmidba a 2 orientáció egyikében, melyek közül csupán az egyik eredményezi a pSBLcat plazmidot. A pSBLcat plazmid egy restrikciós helyét és funkciós térképét a csatolt rajzok között levő 8. ábra szemlélteti.
6. Példa
A pLPC plazmid megszerkesztése
Körülbelül 20 pg pBLcat plazmid DNS-at oldottunk fel 10 pl 10 χ HindlII pufferben és 80 pl H2Oban. Körülbelül 10 pl (körülbelül 100 egység) HmalII restrikciós enzimet adtunk a pBLcat plazmid DNS oldatához, és a kapott reakcióelegyet 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A 7/z«JIII-mal emésztett pBLcat plazmid DNS-at agaróz-gélre helyeztük, és addig végeztünk elektroforézist, míg a BK enhancert, és az Ad2 késői promotert tartalmazó körülbelül 0,87 kbázisú HindlII restrikciós fragmens elkülönült a többi emésztési terméktől. Ezután a körülbelül 0,87 kbázisú fragmenst izoláltuk és a ligáláshoz előkészítettük a 4A) példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon. Körülbelül 2 pg mennyiséget nyertünk a kívánt fragmensből, melyet 5 pl TE pufferben oldottunk fel.
A pL133 plazmid a humán protein C zimogén formájának teljes cDNS kódoló szekvenciáját tartalmazza. A pL133 plazmidot Bang et al. az U.S. Patent No. 4775624 számú, 1988. október 4-én közzétett szabadalmi leírásban tették közzé. A pL133 plazmid egy restrik11
HU 215 186 Β ciós helyét és funkciós térképét a csatolt rajzok között levő 9. ábra szemlélteti.
Körülbelül 0,5 μg pL133 plazmid DNS-at oldottunk fel 2 μί 10 χ HindlII pufferben és 16 μί H2O-ban. Körülbelül 1 μΐ (körülbelül 10 egység) HindlII restrikciós enzimet adtunk a DNS oldatához, a kapott reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A DNS-at ezután TE pufferrel 100 μί-re hígítottuk és a 2. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon borjúbél alkalikus foszfatázzal kezeltük. A HindlIImal emésztett pL133 plazmid DNS-at kétszer fenollal, egyszer kloroformmal extraháltuk, etanollal kicsapattuk és 10 μΐ TE pufferben reszuszpendáltuk.
A pBLcat plazmid körülbelül 0,87 kbázisú HindlII restrikciós fragmensének körülbelül 5 μί mennyiségét hozzáadtuk a H/WHI-mal emésztett pL133 plazmid
1,5 μί mennyiségéhez, majd 1 μί 10 χ ligáz puffért, 1 μί (körülbelül 1000 egység) T4 DNS ligázt és 1,5 μί H2O-t adtunk a DNS oldatához. A reakcióelegyet egy éjszakán át 16 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A ligáit DNS képezte a kívánt pLPC plazmidot. A pLPC plazmid restrikciós és funkcionális térképét a csatolt rajzok között levő 10. ábra mutatja.
A ligáit DNS-at a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon végzett E. coli K12 HB101 sejtek transzformálásához használtuk. A transzformált sejteket ampicillint tartalmazó L agarlemezekre szélesztettük, és az ampicillin rezisztens transzformánsok plazmid DNS-át az E. coli K12 HBlOl/pLPC transzformánsok azonosítása céljából restrikciós enzim analízissel vizsgáltuk. A BK enhancert és az Ad2 késői promotert kódoló körülbelül 0,87 kbázisú HindlII restrikciós Fragment a H/wí/III-mal emésztett pL133 plazmidba két orientációba inzertálódhat, melyek közül csupán az egyik eredményezi a pLPC plazmidot.
7. Példa
A pLPC4 és pLPCS plazmidok megszerkesztése
Az 1. példa szerint előállított BK vírus DNS 1 μg (1 μί) mennyiségét és 1 pg (1 μί) pLPC plazmidot oldottunk fel 2 μί 10 x EcoRI pufferben és 14 μί H2Oban. A DNS oldathoz körülbelül 2 μί (körülbelül 10 egység) EcoRI restrikciós enzimet adtunk, és a kapott reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Az EcoRI-gyel emésztett BK-vírus és pLPC plazmid DNS keverékét egyszer pufferolt fenollal és egyszer kloroformmal extraháltuk. Ezután a DNSat összegyűjtöttük úgy, hogy a NaCl koncentrációját 0,25 M-ra igazítottuk, 2 térfogat etanolt adtunk az oldathoz, az oldatot szárazjég-etanol fürdőben inkubáltuk percig, majd centrifugáltuk, hogy a DNS-at pelletizáljuk. A felülúszót leöntöttük, a DNS pelletet 70%-os etanollal mostuk, szárítottuk és 12 μί TE pufferben reszuszpendáltuk.
Az EcoRI-gyel emésztett BK vírus és pLPC plazmid DNS keverékéhez körülbelül 13 μί H2O-t és μί 10 x ligáz puffért adtunk A DNS oldatához 2 μί (körülbelül 1000 egység) T4 DNS ligázt adtunk és a kapott reakcióelegyet 2 órán keresztül 16 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A ligáit DNS képezte a kívánt pLPC4 és pLPC5 plazmidokat, melyek csupán az inzertált BK-vírus DNS orientációjában különböztek. A pLPC4 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a csatolt rajzok között levő 11. ábra szemlélteti.
A ligáit DNS képezte a kívánt pLPC4 és pLPC5 plazmidokat és a 2. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon transzformáltuk az E. coli K12 HB101 alkalmas sejtekbe. A transzformált sejteket 100 μg/ml ampicillint tartalmazó L agar lemezekre szélesztettük. Az E. coli K12 HB101/pLPC4 és E. coli KI 2 HB101/pLPC5 transzformánsokat ampicillin rezisztens fenotípusuk és plazmid DNS-uk restrikciós enzim analízissel végzett vizsgálata alapján azonosítottuk.
8. Példa
A pLPChygl és pLPChyg2 plazmidok megszerkesztése
Az E. coli K12 RRl/pSV2hyg sejteket a Northern Régiónál Research Laboratory-tól, az NRRL B-18039 katalógus számon szereztük be. A pSV2hyg plazmid DNS-at a sejtekből a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon nyertük. A pSV2hyg plazmid restrikciós és funkcionális térképét a csatolt rajzok között levő 12. ábra szemlélteti.
Körülbelül 10 pg (10 μί TE pufferben) pSV2hyg plazmidot adtunk 2 μί 10 x BamHI pufferhez és 6 μί H2O-hoz. A DNS oldatához körülbelül 2 μί (körülbelül 20 egység) BűotHI restrikciós enzimet adtunk, és a reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A reakcióelegyet először fenollal, majd kétszer kloroformmal extraháltuk. A EawHI-gyel emésztett pSV2hyg plazmid DNS-at agaróz-gélre helyeztük és a higromicin rezisztencia gént tartalmazó, körülbelül
2,5 kbázisú restrikciós fragmentet a 4A) példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon izoláltuk.
Körülbelül 5 μΐ 10 χ Klenow puffért (0,2 mM a 4 dNTP mindegyikéből; 0,5 M Tris-HCl, pH = 7,8; 50 mM MgCl2; 0,1 mM 2-merkaptoetanol; és 100 pg/ml BSA) és 35 μί H2O-t adtunk a EazwHI-gyel emésztett pSV2hyg plazmid DNS oldatához, majd körülbelül 25 egység Klenow enzimet (körülbelül 5 pl, a BRL forgalmazása szerint) adtunk a DNS oldatához. A reakcióelegyet 30 percig 16 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A Klenowval kezelt, Εα/ηΗΙ-gyel emésztett pSV2hyg plazmid DNS-at egyszer fenollal és egyszer kloroformmal extraháltuk, majd etanolos kicsapatásnak vetettük alá. A kívánt fragmentből körülbelül 2 pg mennyiséget nyertünk, és ezt 5 μί TE pufferben szuszpendáltuk.
Körülbelül 10 pg (10 pl) pLPC plazmid DNS-at adtunk hozzá 2 μί 10 χ Stul pufferhez és 6 μί H2O-hoz. Körülbelül 2 μί (körülbelül 10 egység) Stul restrikciós enzimet adtunk a DNS oldatához, majd a reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A Síwl-gyel emésztett pLPC plazmid DNS-at etanollal kicsapattuk, centrifugálással összegyűjtöttük és 2 μί 10 χ Ndel puffer (1,5 M NaCl; 0,1 M Tris-HCl, pH = 7,8; 70 mM MgCl2 60 mM 2-merkaptoetanol; és 1 mg/ml BSA) és 16 μί H2O elegyében reszuszpendáltuk. Ezután körülbelül 2 μί (körülbelül 10 egység) Ndel restrikciós enzimet adtunk a 5/wI-gyel emésztett
HU215 186Β
DNS oldatához, és a reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk.
Az Wel-ó/wl-gyel emésztett pLPC plazmid DNS-at etanolos kicsapatásnak vetettük alá, centrifügálással összegyűjtöttük és 5 pl 10 x Klenow pufferben és 40 μΐ H2O-ban reszuszpendáltuk. Körülbelül 5 μΐ (körülbelül 25 egység) Klenow enzimet adtunk a DNS oldatához és a nyert reakcióelegyet 30 percig 16 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A Klenow reakció után a reakcióelegyet agaróz-gélre helyeztük, és a körülbelül 5,82 kbázisú Ndel—Stul restrikciós fragmenst izoláltuk a gélről. A kívánt fragmensből körülbelül 5 pg mennyiséget nyertünk, melyet 5 μΐ TE pufferben szuszpendáltunk.
A pSV2hyg plazmid Klenowval kezelt körülbelül
2,5 kbázisú BamHI restrikciós fragmensének körülbelül 2 μΐ mennyiségét összekevertük a pLPC plazmid Klenowval kezelt körülbelül 5,82 kilobázisú Ndel-Stul restrikciós fragmensének körülbelül 1 μΐ mennyiségével. Körülbelül 3 pl 10 χ ligáz puffért, 2 μΐ T4 DNS ligázt (körülbelül 1000 egység), 1 μΐ T4 RNS ligázt (körülbelül 1 egység) és 14 μΐ H2O-t adtunk a DNS oldatához. A kapott reakcióelegyet egy éjszakán át 16 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A ligáit DNS képezte a kívánt pLPC hygl és pLPChyg2 plazmidokat, melyek csupán a pSV2hyg plazmid körülbelül 2,5 kbázisú Klenowval kezelt, RuzwHI restrikciós fragment orientációjában különböznek. A pLPChygl plazmid restrikciós és funkcionális térképét a csatolt rajzok között levő 13. ábra szemlélteti. A ligáit DNS-at a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon az E. coli K12 HB101 sejtek transzformálására használtuk. A kívánt E. coli KI2 HB101/pLPChygl és E. coli KI2 HB101/pLPChyg2 transzformánsokat ampicillint tartalmazó L agarra szélesztettük, és plazmid DNS-uk restrikciós enzim analízisével azonosítottuk őket.
9. Példa
A pBW32 plazmid megszerkesztése
A) A köztespTPA103 plazmid megszerkesztése
A pTPA plazmid tartalmazza a humán szövet plazminogén aktivátort (PTA) kódoló szekvenciát. A pTPA102 plazmid az E. coli K12 MM294/pTPA102 törzsből izolálható, mely az NRRL B-15834 katalógusszámon a Northern Régiónál Research Laboratory, USA törzsgyűjteményből szerezhető be. A pTPA102 plazmidot a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon izoláltuk az E. coli K12 MM294/pTPA102 törzsből.
Körülbelül 50 pg pTPA102 plazmidot (körülbelül 50 pl TE pufferben) adtunk 10 pl 10 χ Tthl 1II pufferhez (0,5 M NaCl; 80 mM Tris-HCl, pH = 7,4; 80 mM MgCl2; 80 mM 2-merkaptoetanol; és 1 mg/ml BSA) és 80 pl H2O-hoz. A DNS oldathoz körülbelül 10 pl (körülbelül 50 egység) Tthl 1II restrikciós enzimet adtunk, és a reakcióelegyet 2 órán keresztül 65 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A reakcióelegyet agaróz-gélre helyeztük, és a TPA-t kódoló szekvenciát tartalmazó körülbelül 4,4 kbázisú Tthl 1II restrikciós fragmenst izoláltuk a gélből. A többi emésztési terméket, a 3,1 kbázisú és a 0,5 kbázisú restrikciós fragmenseket eltávolítottuk. Körülbelül 10 pg mennyiséget nyertünk a kívánt körülbelül 4,4 kbázisú 77/zl 111 restrikciós fragmensből, és ezt 10 pl TE pufferben szuszpendáltuk.
Körülbelül 5 pl 10 χ Klenow puffért és 30 pl H2O-t adtunk a körülbelül 4,4 kbázisú 77A111I restrikciós fragmenset tartalmazó oldathoz. Miután körülbelül 5 pl (körülbelül 5 egység) Klenow enzimet adtunk az oldathoz, a reakcióelegyet 30 percig 16 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A Klenow reakció után a DNS-at etanollal kicsapattuk és 3 pl 10 χ ligáz pufferben és 14 pl H2Oban reszuszpendáltuk.
A SazwHI linkért (New England Biolabs), melynek szekvenciája a következő
5’- CGGATCCG—3’ llllllll
3’- GCCTAGGC-5’ kinázzal kezeltük, majd a következők szerint készítettük el a ligáláshoz. 4 pl linkért (körülbelül 2 pg) oldottunk fel 20,15 pl H2O-ban és 5 pl 10 x kináz pufferben (500 mM Tris-HCl, pH = 7,6; és 100 mM MgCl2), 2 percig inkubáltuk 90 °C hőmérsékleten, majd szobahőmérsékletűre hűtöttük. A keverékhez 5 pl gamma-32 P-ATP-t (körülbelül 20 Ci) 2,5 pl M DTT-t és 5 pl polinukleotid kinázt (körülbelül 10 egység) adtunk, majd a reakcióelegyet 30 percig 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Ezután 3,35 pl 0,01 M ATP-t és 5 pl kinázt adtunk az elegyhez, és a reakciót újabb 30 percig hagytuk lejátszódni 37 °C hőmérsékleten. A radioaktív ATP használata segítette annak meghatározását, hogy vajon a kötők a cél DNS-hoz kötődtek-e.
Körülbelül 10 pl kinázzal kezelt BamHI linkért adtunk a körülbelül 4,4 kbázisú Tthl 111 restrikciós fragment oldatához, és 2 pl T4 DNS ligáz (körülbelül 1000 egység) és 1 pl T4 RNS ligáz (körülbelül 2 egység) hozzáadása után a ligációs reakcióelegyet egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A ligáit DNS-at etanollal kicsapattuk, és 5 pl 10 χ HindlII pufferben és 40 pl H2O-ban reszuszpendáltuk. Körülbelül 5 pl (körülbelül 50 egység) HindlII restrikciós enzimet adtunk a DNS oldatához, és a reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk.
A //zHű/HI-mal emésztett DNS-at etanollal kicsapattuk, és 10 pl 10 χ BazzzHI pufferben és 90 pl H2O-ban reszuszpendáltuk. Körülbelül 10 pl (körülbelül 100 egység) őazwHI restrikciós enzimet adtunk a DNS oldatához és a reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A SawHI-gyel való emésztés után a reakcióelegyet agaróz-gélre helyeztük, és a körülbelül 2,0 kbázisú őazwHI-/7z'«z/III restrikciós fragmenst izoláltuk a gélről. A kívánt ffagmentből körülbelül 4 pg mennyiséget nyertünk, melyet 5 pl TE pufferben szuszpendáltunk.
A pTPA103 plazmid megszerkesztéséhez a pTPA102 plazmidból származó körülbelül 2,0 kbázisú BamHl-HindHI restrikciós fragmenst a RflzwHI-77z>zt7III-mal emésztett pRC plazmidba inzertáltuk. A pRC plazmidot úgy hoztuk létre, hogy egy, az E. coli trp promoter és operátor (trpPO) szekvenciáját tartalmazó körülbelül 288 bázispár hosszúságú £coRI-C/aI restrikciós fragmenst az fcoRI-C/al13
HU 215 186 Β pTPA102 plazmid DNS-akat a korábban említett sejtvonalakból lehet kinyerni a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon. A pTPA102 plazmid ezen körülbelül 0,29 kbázisú EcoRI-C/αΙ restrikciós fragmense tartalmazza az E. coli trp gén transzkripciós aktiváló szekvenciáját és a transzlációs aktiváló szekvenciájának zömét. Ezen plazmid az alábbiakban leírt szekvenciával rendelkezik:
gyei emésztett pKC7 plazmidba inzertáltuk. A pKC7 plazmidot az American Type Culture Collection törzsgyűjteménytől az ATCC 37084 katalógusszámú E. coli K12 N100) pKC7 törzsében lehet beszerezni. A írpPO-t tartalmazó körülbelül 288 bázispár hosszúságú AcoRI-C/αΙ restrikciós fragmenst az E. coli K12 MM294/pTPA102 (NRRL B-15834) törzsből izolálható pTPA102 plazmidból lehet izolálni. A pKC7 és
5’-aattcacgct1ogtggtgttat2oggtcggtggt5ocgctagggtg4°
I I I I I f I I I I I II II I I I i I | I| i f 1 111(1(1/1/ jP-GTGCGA CACCACAATA CCAGCCACCA GCGATCCCAC'
CCGACGCGCA5°TCTCGACTGC6oACGGTG0ACC7oAATGCTTCTG8° I I I I 1 t I I 11 1 I I I | I I I I I I I I 11 I 11 I I (UHUIK
GGCTGCGCGT AGAGCTGACG TGCCACGTGG TTACGAAGAC
GCGTCAGGCA9oGCCAATCG&AlooAGCTGTGGTAlloTGGCTGTGCA12° I Ul II I I (Ι II III | f III / I I I II | III I I | | I II I I I
CGCAGTCCGT CGGTTAGCCT TCGACACCAT ACCGACACGT
GGTCGTATAA1^OTCACCGCATA14oATTCGAGTCG15oCT.CAAGGCGC16°
I11 I 11I I I I IIí I I I II I | 11 I I I I II I I iI II I I I I I I
GCAGCATATT AGTGGCGTAT TAAGCTCAGC GAGTTCCGCG actcccgttc17°cggataatgt18otttttgctcc19ogacatcataa2o° I II ll I III I l lII I l 11 II 111 I I | I l l I I I I I I Ijl I I TGAGGGCAAG GCCTATTACA AAAAACGAGG CTGTAGTATT
GGGTTGCGGC21 °AAATATTCTG22 °AAATGAGCTG2 5°TTGACAATT A240, I I 111 I I III I Hl l I I I, I I I l l I l III I ll I I I I ll I I
GCGAAGGCCG TTTATAAGAC TTTACTCGAC AACTGTTAAT
ATCATCGAAC TAGTTAACTA ll II I 1 II l I I I I I 1 l I ll I TAGTAGCTTG ATCAATTGAT
GTACGCAAGT ' TCTCGTAAAA' Il I I I ItI 11 II I I 111 111 CATGEGTTCA AGAGCATTTT
AGGGTAT287-^» i ( I I I l |
TCCCATAGC-5’ így, a pRC plazmid létrehozásához körülbelül 2 pg pKC7 plazmidot (10 μΐ TE pufferben) adtunk 2 μΐ 10 * Clal pufferhez (0,5 M NaCl; 60 mM Tris-HCl, pH = 7,9; 60 mM MgCty; és 1 mg/ml BSA) és 6 μΐ H2O-hoz. Körülbelül 2 μΐ (körülbelül 10 egység) Clal restrikciós enzimet adtunk a pKC7 plazmid DNS oldatához, és a kapott reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A C/al-gyel emésztett pKC7 plazmid DNS-at etanollal kicsapattuk, és 2 μΐ 10 * £coRI pufferben és 16 μΐ H2O-ban reszuszpendáltuk. Körülbelül 2 μΐ (körülbelül 10 egység) £coRI restrikciós enzimet adtunk a C/al-gyel emésztett pKC7 plazmid DNS oldatához, a kapott reakcióelegyet 50 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk.
Az £coRI-C/aI-gycl emésztett pKC7 plazmid DNS-at egyszer fenollal, majd kétszer kloroformmal extraháltuk. Ezután a DNS-at etanollal kicsapattuk, és 3 μΐ 10 * ligáz pufferben és 20 μΐ H2O-ban reszuszpendáltuk. A pKC7 plazmid restrikciós és funkcionális térképét Maniatis et al. Moleculra Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) című munkájában a 8. oldalon lehet megtalálni.
Körülbelül 20 pg pTPA102 plazmidot (körülbelül 20 pl TE pufferben) adtunk 10 pl 10 * Clal pufferhez és
HU215 186Β μΐ H2O-hoz. Körülbelül 10 μΐ (körülbelül 50 egység) Clal restrikciós enzimet adtunk a pTPA102 plazmid DNS oldatához, a kapott reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A Clal-gyel emésztett pTPA102 plazmid DNS-at etanollal kicsapattuk, és 10 μΐ 10 χ EcoRI pufferben és 80 μΐ H2O-ban reszuszpendáltuk. Körülbelül 10 μΐ (körülbelül 50 egység) EcoRI restrikciós enzimet adtunk a C/oI-gyel emésztett pTPA102 plazmid DNS oldatához, és a kapott reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk.
Az EcoRI-C/al-gyel emésztett pTPA102 plazmid DNS-at egyszer fenollal extraháltuk, 7%-os poliakrilamid gélre helyeztük, és az elektroforézist addig végeztük, míg a ZrpPO-t tartalmazó körülbelül 288 bázispár hosszúságú EcoRI-C/oI restrikciós fragmens el nem különült a többi emésztési terméktől. A körülbelül 288 bázispár hosszúságú EcoRI-C/αΙ restrikciós fragmenst izoláltuk a gélből. A kívánt fragmentből körülbelül 1 pg mennyiséget nyertünk, ezt 5 μΐ TE pufferben szuszpendáltuk, és hozzáadtuk a fent leírt módon preparált EcoRI-C/oI-gyel emésztett pKC7 plazmid DNS oldatához. Ezután körülbelül 2 μΐ (körülbelül 1000 egység) T4 ligázt adtunk a DNS oldatához, és a ligációs reakcióelegyet 2 órán keresztül 16 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A ligáit DNS képezte a kívánt pRC plazmid DNS-at.
A ligáit DNS-at az E. coli K12 HB101 alkalmas sejtek 2. példában leírt eljárásával alapjában véve egyező módon végzett transzformációjához használtuk. A transzformált sejteket 100 pg/ml ampicillint tartalmazó L agarra szélesztettük és a kívánt E. coli KI2 HBlOl/pRC telepek azonosítása céljából az ampicillin rezisztens transzformánsokat plazmid DNSuk restrikciós enzim analízisével szkrineltük. A pRC plazmid DNS-at az E. coli K12 HBlOl/pRC transzformánsokból a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon nyertük.
Körülbelül 2 pg pRC plazmid DNS-at (2 pl TE pufferben adtunk 2 pl 10 x HindlII pufferhez és 16 pl H2O-hoz. Körülbelül 2 pl (körülbelül 10 egység) HindlII restrikciós enzimet adtunk a pRC plazmid DNS oldatához és a kapott reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A ///«í/III-mal emésztett pRC plazmid DNS-at etanollal kicsapattuk, és 2 pl 10 x Εα/wHI pufferben és 16 pl H2O-ban reszuszpendáltuk. Körülbelül 2 pl (körülbelül 10 egység) EíwjHI restrikciós enzimet adtunk a HíWIII-mal emésztett pRC plazmid DNS oldatához, és a reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk.
A őaw7HI-//í«<TIII-mal emésztett pRC plazmid DNSat egyszer fenollal és kétszer kloroformmal extraháltuk. A DNS-at etanollal kicsapattuk és 3 pl 10 χ ligáz pufferben és 20 pl H2O-ban reszuszpendáltuk. Ezután a őű/wHI-T/műüII-mal emésztett pRC plazmid DNS oldatához a pTPA102 plazmid körülbelül 2,0 kbázisú HindlII-BamHI restrikciós fragmens körülbelül 4 pg (körülbelül 5 pl TE pufferben) mennyiségét adtuk hozzá. A DNS oldatához körülbelül 2 pl (körülbelül 1000 egység) T4 DNS ligázt adtunk, a reakcióelegyet 16 °C hőmérsékleten 2 órán keresztül inkubáltuk. A ligáit DNS képezte a kívánt pTPA103 plazmid DNS-at.
Hogy csökkentsük a nemkívánatos transzformánsokat, a ligáit DNS-at Ncol restrikciós enzimmel való emésztésnek vetettük alá, mely enzim a pRC plazmidokat hasítja, a pTPA103 plazmidokat azonban nem. így a ligáit DNS Acol-gyel való emésztése csökkenti a nemkívánatos transzformánsokat, mivel a linearizált DNS az E. col i-t kisebb gyakorisággal transzformálja, mint a zárt, kör alakú DNS. A ligáit DNS emésztéséhez a DNS-at először etanollal kicsapattuk, majd 2 pl 10 x Ncol pufferben (1,5 M NaCl; 60 mM Tris-HCl, pH = 7,8; 60 mM MgCl2; és 1 mg/ml BSA) és 16 pl H2O-ban reszuszpendáltuk. A DNS oldatához körülbelül 2 pl (körülbelül 10 egység) Ncol restrikciós enzimet adtunk, és a kapott reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk.
A ligáit, majd Acol-gyel emésztett DNS-at az E. coli K12 RV308 (NRRL B-15624) transzformánsokhoz használtuk. Az E. coli K12 RV308 sejteket alkalmassá tettük a transzformációra, majd transzformáltuk őket a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon. A transzformációs keveréket 100 pg/ml ampicillint tartalmazó L agarra szélesztettük. Az ampicillin rezisztens transzformánsokat kanamicin érzékenységre teszteltük, mivel a pRC plazmid kanamicin rezisztenciát biztosít, a pTPA103 plazmid azonban nem. Az ampicillin rezisztens, kanamicin érzékeny transzformánsokat a plazmid DNS preparálásához használtuk. Az E. coli K12 RV308/pTPA103 transzformánsok azonosítása céljából a plazmid DNS-at restrikciós enzim analízissel vizsgáltuk. A pTPA103 plazmid DNS-at E. coli K12 RV308/pTPA103 sejtekből a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon izoláltuk.
B) A köztes pBW25 plazmid megszerkesztése
Körülbelül 1 pg pTPA103 plazmid DNS-at (1 pl TE pufferben) adtunk 2 pl 10 χ BglII pufferhez és 16 pl H2O-hoz. Körülbelül 1 pl (körülbelül 5 egység) őg/II restrikciós enzimet adtunk a pTPA103 plazmid DNS oldatához, és a reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A Eg/II-vel emésztett pTPA103 plazmid DNS-at etanollal kicsapattuk, és 5 pl 10 χ Klenow pufferben és 44 pl H2O-ban reszuszpendáltuk. Körülbelül 1 pl (körülbelül 1 egység) Klenow enzimet adtunk a Eg/II-vel emésztett pTPA103 plazmid DNS oldatához és a reakcióelegyet 2 órán keresztül 16 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A Klenowval kezelt, őg/II-vel emésztett pTPA103 plazmid DNS-at etanollal kicsapattuk és 3 pl 10 χ ligáz pufferben és 22 pl H2Oban reszuszpendáltuk.
Körülbelül 2 pl (0,2 pg) kinázzal nem kezelt Ndel linkért (New England Biolabs), melynek szekvenciája
5’-GCATATGG-5» , NI Ilii I 5’-GGTATACC—5’, adtunk a Klenowval kezelt, Eg/II-vel emésztett pTPA103 plazmid DNS oldatához, 2 pl (körülbelül 1000 egység) T4 DNS ligázzal és 1 pl (körülbelül 2 egység) T4 RNS ligázzal együtt, és a kapott ligációs
HU215 186Β reakcióelegyet egy éjszakán keresztül 4 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A ligáit DNS képezte a pTPA103derWeI plazmidot, mely alapjában véve hasonló a pTPA103 plazmidhoz, azzal az eltéréssel, hogy a pTPA103derWeI plazmidnak egy Ndel felismerő szekvenciája van ott, ahol a pTPA103 plazmidnak egy Bglll felismerő szekvenciája van.
A ligáit DNS-at az E. coli K12 RV308 kompetens sejtek transzformálásához használtuk a 2. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon. A transzformáit sejteket ampicillint tartalmazó L agarra szélesztettük, és az E. coli KI2 RV308/pTPA103derWel transzformánsokat plazmid DNS-uk restrikciós enzim analízisével azonosítottuk. A pTPAl03derM7eI plazmid DNSat a transzformánsokból izoláltuk a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon végzett további szerkesztésekhez.
Körülbelül 10 pg pTPA103der/V<7eí plazmid DNSat (10 μί TE pufferben) adtunk 2 μί 10 χ A vall pufferhez (0,6 M NaCl; 60 mM Tris-HCl, pH = 8,0; 0,1 M MgCl2; 60 mM 2-merkaptoetanol; és 1 mg/ml BSA) és 6 μί H2O-hoz. Körülbelül 2 μί (körülbelül 10 egység) Avall restrikciós enzimet adtunk a DNS-hoz és a kapott reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Az/vall-vei emésztett DNS-at agaróz-gélre helyeztük és az elektroforézist addig végeztük, míg a körülbelül 1,4 kbázisú restrikciós fragmens el nem különült a többi emésztési terméktől. A pTPA103dcr/VcfeI plazmid körülbelül 1,4 kbázisú /vall restrikciós fragmensét izoláltuk a gélből. A kívánt fragmensből körülbelül 2 pg mennyiséget nyertünk, melyet 5 μί TE pufferben szuszpendáltunk.
Körülbelül 5 μΐ 10 χ Klenow puffért, 35 μί H2O-t és 5 μί (körülbelül 5 egység) Klenow enzimet adtunk a körülbelül 1,4 kbázisú Avall restrikciós fragment oldatához, és a reakcióelegyet 30 percig 16 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A Klenowval kezelt DNS-at etanollal kicsapattuk és 3 μί 10 χ ligáz pufferben és 14 μί H2Oban reszuszpendáltuk.
Körülbelül 2 ug Hpal linkért, melynek szekvenciája
5’-CGTTAACG-3’
I111I I I I
3*-GCAATTGC-5’, a 10A) példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon kinázzal kezeltünk. Körülbelül 10 μί kinázzal kezelt kötőt adtunk a pTPA103derAWeI plazmid Klenowval kezelt, körülbelül 1,4 kbázisú Avall restrikciós fragmensének oldatához, 2 μί (körülbelül 1000 egység) T4 DNS ligázzal és 1 μί (körülbelül 1 egység) T4 RNS ligázzal együtt. A reakcióelegyet egy éjszakán át 16 °C hőmérsékleten inkubáltuk.
A ligáit DNS-at egyszer fenollal, kétszer kloroformmal extraháltuk, etanollal kicsapattuk és 2 μί 10 χ EcoRI pufferben és 16 μί H2O-ban reszuszpendáltuk. Körülbelül 2 μί (körülbelül 10 egység) EcoRI restrikciós enzimet adtunk a DNS oldatához, és a reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Az EcoRIgyel emésztett DNS-at egyszer fenollal, kétszer kloroformmal extraháltuk, etanollal kicsapattuk és 3 pl 10 x ligáz pufferben és 20 μί H2O-ban reszuszpendáltuk. A fragmensnek, mely körülbelül 770 bázispár hosszúságú és a ΖφΡΟ-t és a TPA amino-végét kódolja, így preparálva van egy EcoRI kompatibilis vége és egy tompa vége. A pUC19TPAFE plazmid létrehozása céljából ezt a fragmentet az EcoRI-Swal-gyel emésztett pUC19 plazmidba ligáltuk.
Körülbelül 2 μί pUC19 plazmidot (a Bethesda Research Laboratories-tól szerezhető be) oldottunk fel 2 μί 10 χ Smal pufferben (0,2 KC1; 60 mM Tris-HCl, pH = 8,0; 60 mM MgCl2; 60 mM 2-merkaptoetanol; és mg/ml BS BSA) és 16 μί H2O-ban. A DNS oldatához körülbelül 2 μί (körülbelül 10 egység) Smal restrikciós enzimet adtunk és a reakcióelegyet 2 órán keresztül 25 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A Smal-gyel emésztett pUC19 plazmid DNS-at etanollal kicsapattuk, centrifugálással összegyűjtöttük és 2 μί 10 x EcoRI pufferben és 16 μί H2O-ban reszuszpendáltuk. Körülbelül μί (körülbelül 10 egység) EcoRI restrikciós enzimet adtunk a Smal-gyel emésztett pUC19 plazmid DNS oldatához, és a reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Az EcoRl-Smai-gyel emésztett pUC19 plazmid DNS-at egyszer fenollal, kétszer kloroformmal extraháltuk és 5 μί TE pufferben reszuszpendáltuk.
Az EcoRI-5/naI-gyel emésztett pUC19 plazmid DNS-at hozzáadtuk a pTPalO3der7V<7cI píazmidból származó körülbelül 770 bázispár hosszúságú EcoRI tompa végű restrikciós fragmenst tartalmazó oldathoz. A DNS oldatához körülbelül 2 μΐ (körülbelül 1000 egység) T4 DNS ligázt adtunk, és a reakcióelegyet egy éjszakán át 16 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A ligáit DNS képezte a kívánt pUC19TPAFE plazmidot.
A többszörös klónozási helyű pUC19 plazmid, mely tartalmazza a pUC19TPAFE plazmid megszerkesztésében hasznosított EcoRI és Smal felismerési szekvenciákat, a lacZ alfa fragmentet kódoló szekvencián belül helyezkedik el. A lacZ alfa fragment olyan sejtekben való expressziója, melyek lacZ Δ M15 mutációt tartalmaznak (a béta-galaktozidázt kódoló lacZ gén mutációja) lehetővé teszi ezen sejtek számára, hogy a funkcionális béta-galaktozidáz molekulát expresszálják, így lehetővé teszi ezen sejtek számára, hogy az X-Galt (5bromo-4-kloro-3-indolil-beta-D-galakto-piranozid), egy színtelen vegyületet, az indigó színű hidrolízis termékévé hidrolizálják. A DNS pUC19 plazmid többszörös klónozási helyére történő inzerciója félbeszakítja a lacZ alfa fragmentet kódoló szekvenciát. Az ilyen plazmidot hordozó, lacZ Δ M15 mutációjú sejtek nem képesek az X-Galt hidrolizálni (ugyanezt az elvet használjuk, amikor a pUC8 plazmidba klónozunk, lásd a 2. példát). A pUC19TPAFE plazmidot képző ligáit DNSat az E. coli K12 RR1A M15 (NRRL B-15440) sejtek transzformálásához használtuk, melyeket a 2. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon tettünk a transzformációra alkalmassá.
A transzformált sejteket 100 μg/ml ampicillint, 40 Bg/ml X-Galt és 1 mM IPTG-t tartalmazó L agarra szélesztettük. Az indigó színt nem mutató telepeket tenyésztettük és a plazmid DNS preparálásához használtuk.
HU 215 186 Β
Az E. coli KI 2 RR1 (Μ 15) pUC 19TPAFE transzformánsokat plazmid DNS-uk restrikciós enzim analízisével azonosítottuk. A pUC19TPAFE plazmid DNS-at az E. coli K12 RR1 (M15) pUC19TPAFE sejtekből a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon izoláltuk további szerkesztésekben való alkalmazás céljából.
Körülbelül 7 pg pUC19TPAFE plazmidot (20 μί TE pufferben) adtunk 10 μί 10 * Hpal pufferhez (0,2 M KC1 0,1 M Tris-HCl, pH = 7,4; és 0,1 M MgCl2) és 70 μί H2O-hoz. Körülbelül 3 μί (körülbelül 6 egység) Hpal restrikciós enzimet adtunk a pUC19TPAFE plazmid DNS oldatához és a reakcióelegyet 20 percig 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A rövid reakcióidővel a részleges Hpal emésztést kívántuk elérni. A reakcióelegy térfogatát 150 μί-re egészítettük ki 1 χ öawHI pufferrel (150 mM NaCl2; a sókoncentráció emelése inaktiválja a Hpdl-ét). Körülbelül 1 μί (körülbelül 16 egység) Eo/wHI restrikciós enzimet adtunk a Hpalgyel részlegesen emésztett DNS oldatához, és a reakcióelegyet 90 percig 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk.
A BamHl-Hpál-gyel részlegesen emésztett pUC19TPAFE plazmid DNS-at etanolos kicsapatással koncentráltuk, 1,5%-os agaróz-gélre helyeztük és a pUCATPAFE plazmid replikonját, béta-laktamáz génjét és az egész TPA-t kódoló DNS-át tartalmazó körülbelül 3,42 kbázisú Hpal-BamHl restrikciós fragmentet a kívánt fragmentet tartalmazó gélszegmens kivágásával izoláltuk a gélből. A gélszegmenst fagyasztottuk, majd a szegmensből a folyadékot kipréseltük. A folyadékból a DNS-at etanollal kicsapattuk. A kívánt ffagmentből körülbelül 1 pg mennyiséget nyertünk és azt 20 pl TE pufferben szuszpendáltuk.
Körülbelül 10 pg pTPA103 plazmidot (10 pl TE pufferben) oldottunk fel 10 pl 10 χ Seal pufferben (1,0 M NaCl; 60 mM Tris-HCl, pH = 7,4; és 60 mM MgCl2; 10 mM DTT; és 1 mg/ml BSA) és 80 pl H2Oban. Körülbelül 3 pl (körülbelül 18 egység) Seal restrikciós enzimet adtunk a pTPA103 plazmid DNS oldatához, és a kapott reakcióelegyet 90 percig 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A reakcióelegy térfogatát kiegészítettük 150 pl-re 1 x BamHI pufferrel, és körülbelül 1 pl (körülbelül 16 egység) BamHI restrikciós enzimet adtunk az oldathoz, amit ezután 90 percig 37 °C hőmérsékleten inkubáltunk. A DNS-at etanollal kicsapattuk, centrifugálással összegyűjtöttük, és az elektroforézis elvégzéséhez reszuszpendáltuk. A ScoI-EozwHI-gyel emésztett pTPA103 plazmid DNS-at 1,5%-os agaróz-gélre helyeztük és az elektroforézist addig végeztük, míg a körülbelül 1,015 kbázisú Scal-BamHl restrikciós fragment el nem különült a többi emésztési terméktől. ApTPA103 plazmid TPA karboxil végét kódoló DNS-at tartalmazó körülbelül 1,015 kbázisú Scal-BamHl restrikciós fragmenst izoláltuk a gélből. A kívánt fragmensből 0,5 pg mennyiséget nyertünk, és ezt feloldottuk 20 pl üveg-desztillált H2O-ban.
A pUC19TPAFE plazmid körülbelül 3,42 kbázisú BamHl-Hpal restrikciós fragmensének körülbelül 2 pl mennyiségét hozzáadtuk a pTPA103 plazmid körülbelül 1,015 kbázisú ó'cal-SozwHI restrikciós fragmensének 2 pl mennyiségéhez. A keverékhez hozzáadtunk pl 10 χ ligáz puffért és 1 pl (körülbelül 1 Weiss egység; a ligázt a Promega Biotec, 2800 S Fish Hatchery Road, Madison, WI 53711-től szereztük be) T4 DNS ligázt, és a reakcióelegyet egy éjszakán keresztül 16 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A ligáit DNS képezte a kívánt pBW25 plazmidot.
A ligáit DNS-at az E. coli K12 JM105 (a BRL-től szerezhető be) transzformációjára használtuk. A törzset a 2. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon tettük a transzformációra alkalmassá, azzal az eltéréssel, hogy 50 mM CaCl2-ot használtunk az eljárás során. A transzformált sejteket 100 pg/ml ampiciílint tartalmazó BHI (Difco Laboratories, Detroit, Mi) agarra szélesztettük és az E. coli K12 JM105/pBW25 transzformánsokat plazmid DNS-uk restrikciós enzim analízisével azonosítottuk. A pBW25 plazmid EcoRI restrikciós enzimmel való emésztése körülbelül 3,38 kbázisú és körülbelül 1,08 kbázisú restrikciós fragmenseket eredményez. A pBW25 plazmidot a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon készítettük elő a további szerkesztésekben való felhasználáshoz.
C) A TPA kódoló régió helyspecifikus mutagenezise és a pBW28 plazmid megszerkesztése
Körülbelül 5 pg pBW25 plazmidot (10 pl üvegdesztillált H2O-ban) adtunk körülbelül 10 pl 10 χ HindlII reakció pufferhez és 80 pl H2O-hoz. Körülbelül 1 pl (körülbelül 20 egység) HindlII restrikciós enzimet adtunk a pBW25 plazmid DNS oldatához és a kapott reakcióelegyet 90 percig 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A //zot/III-mal emésztett pBW25 plazmid DNS oldatához körülbelül 3 pl (körülbelül 24 egység) EcoRI restrikciós enzimet és 10 pl 1 M Tris-HCl-ot (pH = 7,6) adtunk és a reakcióelegyet 90 percig 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Az EcoRI-T/zw/III-mal emésztett pBW25 plazmid DNS-at etanolos kicsapatással koncentráltuk és 1,5%-os agaróz gélre helyeztük. Az elektroforézist addig végeztük, míg a körülbelül 810 bázispár hosszúságú EcoRl-Hindlll restrikciós fragmens el nem különült a többi emésztési terméktől. A körülbelül 810 bázispár hosszúságú EcoRl-Hindlll restrikciós fragmentből körülbelül 0,5 pg mennyiséget izoláltunk a gélből, ligáláshoz előkészítettük és 20 pl üveg-desztillált H2O-ban reszuszpendáltuk.
Az M13mp8 DNS (a New England Biolabs-tól szerezhető be) replikációs formájának (RF) körülbelül
4,5 pg mennyiségét (35 pl üveg-desztillált H2O-ban) adtunk 10 pl 10 x HindlII pufferhez és 55 pl H2O-hoz. Körülbelül 1 pl (körülbelül 20 egység) HindlII restrikciós enzimet adtunk az M13mp8 DNS oldatához és a kapott reakcióelegyet 1 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Körülbelül 3 pl (körülbelül 24 egység) EcoRI restrikciós enzimet és körülbelül 10 pl 1 M Tris-HCl-ot (pH = 7,6) adtunk a Hindlll-mal emésztett M13mp8 DNS oldatához, és a reakcióelegyet 1 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A Hindlíl-EcoRl-gyel emésztett M13mp8 DNS-at etanolos kicsapatással összegyűjtöttük, agaróz-gélen való elektroforézishez reszuszpendáltuk és a nagy restrikciós fragmentet gélelektroforézissel izoláltuk. Az M13mp8 nagy EcóRI-Hindlll restrikciós ffagmenséből körülbe17
HU 215 186 Β lül 1 pg mennyiséget nyertünk és ezt 20 pl üveg-desztillált H2O-ban szuszpendáltuk. Az M13mp8 nagy EcoRl-Hindlll restrikciós fragmensének körülbelül pl mennyiségét, 2 pl 10 χ ligáz puffért, 12 pl H2O-t és körülbelül 1 pl (körülbelül 1 Weiss egység) T4 DNS ligázt adtunk a pBW25 plazmid körülbelül 810 bázispár hosszúságú EcoRl-Hindlll restrikciós fragmensének pl mennyiségéhez. A kapott ligációs reakcióelegyet egy éjszakán keresztül 16 °C hőmérsékleten inkubáltuk.
A BRL-től beszerezhető E. coli JM103 sejteket kompetensekké tettük és a BRL M13 Cloning/„Dideoxy” Sequencing Instruction Mannual-ban leírt eljárással egyező módon a ligációs keverékkel transzfektáltuk, azzal az eltéréssel, hogy a transzfekciónkénti DNS mennyiségét megváltoztattuk. A rekombináns plakkokat a bétagalaktozidáz alfa-fragmenst-kódoló gén inzertációs inaktiválásával azonosítottuk, mely módon ezek a plakkok elveszítették azt a képességüket, hogy az X-Galt annak indigó színű termékévé hasítsák. Szkrinelési célokból 6 fehér plakkot helyeztünk 2,5 ml L táplevesbe, melyhez minimál táptalajon tenyésztett 0,4 ml E. coli KI2 JM103at adtunk, a proAB-t hordozó episzóma megtartásának biztosítása végett a logaritmikus szaporodási fázisban. A plakkokat tartalmazó oldatot levegős rázóban 37 °C hőmérsékleten 8 órán keresztül inkubáltuk. 1,5 ml aliquotból a sejteket pelletáltuk és az RF DNS-at Bimbóim és Doly (1979, Nuc. Acids Rés; 7:1513) alkalikus miniszkrinelő eljárásával alapjában véve egyező módon izoláltuk. A tenyészeteket 4 °C hőmérsékleten törzstenyészetként tároltuk. A pM8BW26 jelzésű kívánt fág, az M13mp8 körülbelül 7,2 kbázisú EcoRl-Hindlll rest5 rikciós fragmenséhez ligáivá tartalmazza a pBW25 plazmid körülbelül 810 bázispár hosszúságú EcoRl-Hindlll restrikciós fragmensét.
Körülbelül 50 pl lóg fázisú E. coli JM103-at fertőztünk a pM8BW26-tal, és levegős rázóban 37 °C hőmér10 sékleten 18 órán keresztül inkubáltuk. A fertőzött sejteket alacsony sebességen végzett centrifugálással pelletizáltuk és a tenyészet felülúszójából az egyszálú pM8BW26 DNS-at az „Instruction Manual” eljárásának léptéknövelésével preparáltuk. Az egyszálú pM8BW2615 ot mutagenezisnek vetettük alá az Adelman et al. [1983, DNA 2(3):183.193] elméletével alapjában véve egyező módon, azzal az eltéréssel, hogy a Klenow reakciót szobahőmérsékleten 30 percig, majd 37 °C hőmérsékleten 60 percig, majd 10 °C hőmérsékleten 18 óráig végeztük.
Továbbá az SÍ-gyei való kezelést 20 °C hőmérsékleten végeztük, a puffer sókoncentrációja pedig fele volt a forgalmazók által javasolt koncentrációnak, és az Ml3 szekvenáló prímért (BRL) használtuk. A natív TPA 87-261 nukleotidjai között levő aminosav-maradé25 kok kódoló szekvenciája deléciójának kiválasztására használt szintetikus oligodezoxiribonukleotid primer a következő szekvenciájú:
5’-GGGAAGTGCTGTGAAATATCCACCTGCGGCCTGAGA-3’.
A kapott mutagenezises keveréket az E. coli KI2 JM103 sejtek a fent leírt infekciós eljárással megegyező módon való transzfekciójához használtuk. A kívánt mutánsokat az FR DNS restrikciós enzim analízise és a Maxam és Gilbert-féle DNS szekvenálás révén azonosítottuk. A deléciót szenvedett natív TPA 87-261 aminosav-maradékokat kódoló szekvenciáját tartalmazó kívánt mutánst pM8BW27-nek jelöltük.
A pBW28 plazmid megszerkesztéséhez számos DNS fragmens szükséges. Az első fragmenst úgy nyertük, hogy körülbelül 20 pg RF pM8BW27 DNS-at (20 pl üveg-desztillált H2O-ban) adtunk 10 pl 10 * Ndel pufferhez és 60 pl H2O-hoz. A pM8 BW27 plazmid DNS oldatához körülbelül 10 pl (körülbelül 50 egység) Ndel restrikciós enzimet adtunk és a reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Az AWel-gyel emésztett pM8BW27 plazmid DNS-at etanollal kicsapattuk, centrifugálással összegyűjtöttük, és 10 pl 10 * EcoRI pufferben és 90 pl H2O-ban reszuszpendáltuk. Körülbelül 10 pl (körülbelül 50 egység) EcoRI restrikciós enzimet adtunk az Wel-gyel emésztett pM8BW27 plazmid DNS-hoz, és a reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Az EcoRI-AWel-gyel emésztett pM8BW27 plazmid DNS-at agaróz-gélen való elektroforézisnek vetettük alá. Ezt ad35 dig végeztük, míg a deléciós helyet átfogó TPA kódoló szekvencia részét tartalmazó körülbelül 560 bázispár hosszúságú Ndel-EcoRI restrikciós fragmens el nem különült a többi emésztési terméktől. A körülbelül 560 bázispár hosszúságú Ndel-EcoRl restrikciós fragmenst a gélből izoláltuk. A kívánt fragmensből körülbelül 0,5 pg mennyiséget nyertünk, melyet 20 pl üveg-desztillált H2O-ban reszuszpendáltunk.
A pBW28 plazmid létrehozásához szükséges második fragmenst automatizált DNS szintetizáló hoztuk lét45 re egyszerre egy szálat szintetizálva. A két komplementer szálat, melyek a Xbal és Ndel átfedéseket mutató kétszálú DNS szegment létrehozására hibridizálódnak, kinázzal kezeltük, és a 9 A. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon egyesítettük. A kötő szekvenciája a következő:
Xbal ’ -CTAGAGGGTATTAATAATGTATCGATTTAAATAAGGAGGAATAACA-5» l I II1 I II | I I I ι I II II 111 I I II I I I 111 I ι ι l I |l l |1 | TCCCATAATTATTACATAGCTAAATTTATTCCTCCTTATTÓTAT'
Kdei
A pBW28 plazmid létrehozásához szükséges harmadik fragmenst úgy állítottuk elő, hogy körülbelül 20 pg pTPAl 03 plazmidot (20 pl TE pufferben) adtunk pl 10 * őawHI pufferhez és 60 pl H2O-hoz. Körülbelül 10 pl (körülbelül 50 egység) SawHI restrikciós enzimet adtunk a pTPA103 plazmid DNS oldatához, és
HU 215 186 Β a reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A EawHI-gyel emésztett pTPA103 plazmid DNS-at etanollal kicsapattuk és centrifugálással összegyűjtöttük, majd 10 μΐ 10 χ EcoRI pufferben és 80 μί H2O-ban reszuszpendáltuk. A EawHI-gyel emésztett pTPA103 plazmid DNS oldatához körülbelül 10 μί (körülbelül 50 egység) EcoRI restrikciós enzimet adtunk, és a kapott reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A BowHI-EcoRI-gyel emésztett pTPA103 plazmid DNS-at agaróz-gélre helyeztük és a gélelektroforézist addig végeztük, míg a TPA karboxil végét kódoló szekvenciát tartalmazó körülbelül 689 bázispár hosszúságú EcoRI BamHI restrikciós ffagment el nem különült a többi emésztési terméktől. Körülbelül 0,5 pg körülbelül 689 bázispár hosszúságú fragmenst izoláltuk a gélből, és ezt ezután 10 μί üvegdesztillált H2O-ban reszuszpendáltuk.
A pBW28 plazmid létrehozásához szükséges utolsó fragmenst a pLllO plazmidból izoláltuk. A pLllO plazmid létrehozása a következő példák között szereplő 9D) példában került leírásra.
Körülbelül 25 pg pLl 10 plazmidot (25 μί TE pufferben) adtunk 10 pl 10 * Xbal pufferhez (0,5 M NaCl; 60 mM Tris-HCl, pH = 7,9; 60 mM MgCl2; és 1 mg/ml BSA) és 55 μί H2O-hoz. Körülbelül 10 μί (körülbelül 50 egység) Xbal restrikciós enzimet adtunk a pLllO plazmid DNS oldatához és a kapott reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A ΆΕαΙ-gyel emésztett pLllO plazmid DNS-at etanollal kicsapattuk, és centrifügálással összegyűjtöttük, majd 10 μί 10 χ SozmHI pufferben és 89 μί H2O-ban reszuszpendáltuk. Körülbelül 1 μί (körülbelül 5 egység) Eo/mHI restrikciós enzimet adtunk aAóol-gyel emésztett pLllO plazmid DNS oldatához, és a kapott reakcióelegyet a részleges ZtozwHI emésztés elérése végett 30 percig inkubáltuk 37 °C hőmérsékleten. A ATvd-őamHIgyel részlegesen emésztett pLIOO plazmid DNS-at agaróz-gélre helyeztük és az elektroforézist addig végeztük, míg a körülbelül 6,0 kbázisú Xbal-BamHl fragment tisztán el nem különült az emésztés más termékeitől. A körülbelül 6,0 kbázisú restrikciós fragmenst izoláltuk a gélből. Körülbelül 0,5 pg körülbelül 6,0 kbázisú Xbal-BamHl restrikciós fragmenst nyertünk, melyet körülbelül 40 μί üveg-desztillált H2O-ban reszuszpendáltunk. Ez a körülbelül 6,0 kbázisú Xbal-BamHl restrikciós fragment az EK-BGH-t kódoló DNS kivételével a teljes pLllO plazmidot tartalmazza.
A pBW28 plazmid létrehozásához a következő ffagmenteket kevertük össze: a pLl 10 plazmid körülbelül 6,0 kbázisú BamHl-Xbal restrikciós fragmensének körülbelül 0,1 pg (körülbelül 8 pl) mennyiségét; a pM8BW27 plazmid körülbelül 560 bázispár hosszúságú Ndel-EcoRl restrikciós fragmensének körülbelül 0,05 pg (körülbelül 2 pl) mennyiségét; a pTPA103 plazmid körülbelül 689 bázispár hosszúságú EcoRI-Βα/ηΗΙ restrikciós fragmensének körülbelül 0,1 pg (körülbelül 2 pl) mennyiségét és a körülbelül 45 bázispár hosszúságú Xbal-Ndel szintetikus linker körülbelül 0,02 pg (körülbelül 1 pl) mennyiségét. Körülbelül 2 pl 10 χ ligáz puffért és 1 pl (körülbelül 1 Weiss egység) T4 DNS ligázt adtunk a DNS keverékéhez, és a kapott ligációs reakcióelegyet 2 órán keresztül 4 °C hőmérsékleten inkubáltuk.
A ligáit DNS képezte a kívánt pBW28 plazmidot.
A ligáit DNS-at az E. coli K12 MM294 (NRRL B-15 625) sejtek transzformálásához használtuk, mely sejteket a 2. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon tettünk a transzformációra alkalmassá, azzal az eltéréssel, hogy 50 mM CaCl2-ot használtunk az eljárás során. A lambda pL promoter és a hőérzékeny lambda pL represszort kódoló gén pBW28 plazmidban való jelenlétének következtében a transzformálási eljárást és a transzformánsok tenyésztését némileg módosítottuk. A sejteket a transzformáció és az ezt követő tenyésztés idején nem tettük ki 32 °C hőmérsékletnél magasabb hőnek. A példa következő részében a lambda pL promotert és ennek hőérzékeny represszorát kódoló plazmidok kezelési eljárásával sokkal teljesebben fogunk foglalkozni. A kívánt E. coli KI 2 MM294/pBW28 transzformánsokat tetraciklin rezisztenciájuk, ampicillin érzékeny fenotípusuk és plazmid DNS-uk restrikciós enzim analízise révén azonosítjuk.
D) ApLl 10plazmid megszerkesztése
A pLllO plazmidot kiindulási anyagként a pKC283 plazmidot használva hoztuk létre. Az E. coli K12 BE1201 (pKC283 liofilezett formáit az NRRL B-15830 katalógusszámon az NRRL-tői lehet beszerezni, A liofilezett formákat 10 ml L táplevest tartalmazó kémcsövekbe dekantáltuk, és 32 °C hőmérsékleten 2 órán keresztül inkubáltuk, ekkor a tenyészethez 50 pg/ml ampicillint adtunk, és ezután egy éjszakán keresztül 32 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Az E. coli K12 BE1201/pKC283 sejteket 32 °C hőmérsékleten tenyésztettük, mert a pKC283 plazmid pL promotert tartalmazzák, és mert az E. coli KI2 BE 1201 sejtek a sejt DNS-ába integrálódott hőérzékeny cl represszor gént tartalmaznak. Amikor a vad típusú lambda pL represszor gént tartalmazó sejteket vagy a lambda pL promotert nem tartalmazó sejteket használjuk a plazmid izolálási eljárás során, ahogy a következő példákban leírjuk, az inkubációs hőmérséklet 37 °C.
Az egy éjszakán át inkubált tenyészet egy kis részét 50 pg/ml ampicillint tartalmazó L agarlemezekre szélesztettük oly módon, hogy az E. coli K12 BE120 l/pKC283 sejtekből egyedülálló telepizolátumokat kapjunk. A nyert egyedülálló telepet 10 ml 50 pg/ml ampicillint tartalmazó L táplevesbe oltottuk, és 32 °C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáltuk erős rázatás mellett. A 10 ml egy éjszakán át tenyésztett sejteket 500 ml L táplevesbe inokuláltuk, és 32 °C hőmérsékleten erős rázatás mellett addig szaporítottuk, míg a sejtek elérték a stacioner fázist. Ezután a pKC283 plazmid DNS-at a sejtekből a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon preparáltuk. Körülbelül 1 mg pKC283 plazmidot nyertünk, melyet TE pufferben körülbelül 1 pg/pl koncentrációban 4 °C hőmérsékleten tároltunk.
Körülbelül 10 pl (körülbelül 10 pg) pKC283 plazmid DNS-at kevertünk össze 20 pl 10 x közepes sótartalmú restrikciós pufferrel (500 mM NaCl; 100 mM Tris-HCl, pH = 7,5; 100 mM MgCl2; és 10 M DTT), 20 pl 1 mg/ml
HU 215 186 Β
BSA-val, 5 μΐ PvwII restrikciós enzimmel (körülbelül 25 egység) és 145 μΐ vízzel és a kapott reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Az itt leírt restrikciós enzimreakciót rutin módon állítottuk le fenolos és ezt követően kloroformos extrahálással. Ezután a DNS-at kicsapattuk, etanollal mostuk, és a DNS-at TE pufferben reszuszpendáltuk. Miután a PvwII emésztést a fent leírt módon leállítottuk, a Pv«II-vel emésztett pKC283 plazmid DNS-at kicsapattuk, és 5 μΐ TE pufferben reszuszpendáltuk.
Körülbelül 600 pikomol (pM) Xhol (5’-CCTCGAGG-3’) kinázzal kezeltünk egy olyan keverékben, mely 10 pl 5 χ kináz puffért (300 mM Tris-HCl, pH = 7,8; 50 mM MgCl2; és 25 mM DTT), 5 μΐ 5 mM-os ATP-t, 24 μΐ H2O-t, 0,5 μΐ T4 polinukleotid kinázt (a P-L Biochemicals meghatározása szerint körülbelül 2,5 egység), 5 μΐ 1 mg/ml BSA-t és 5 μΐ 10 mM-os spermidint tartalmazott. Az elegyet 30 percig 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Körülbelül 12,5 μΐ kinázzal kezelt Xhol linkért adtunk 5 μΐ PvwII-vel emésztett pKC283 plazmid DNS-hoz, majd
2,5 μΐ 10 * ligáz puffért, 2,5 μΐ (a P-L Biochemicals meghatározása szerint körülbelül 2,5 egység) T4 DNS ligázt, 2,5 μΐ 10 mM-os spermidint és 12,5 μΐ vizet adtunk a DNS-hoz. A reakcióelegyet egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A ligációs reakció után a reakcióelegyet úgy módosítottuk, hogy összetétele megfeleljen a magas sótartalmú pufferénak (0,1 M NaCl; 0,05 M Tris-HCl, pH = 7,5; 10 mM MgCl2; és 1 mM DTT). Körülbelül 10 μΐ (körülbelül 100 egység) Xhol restrikciós enzimet adtunk az elegyhez, és azt 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk.
A reakciót leállítottuk, aXhol-gyel emésztett DNSat kicsapattunk, reszuszpendáltuk és a fent leírt módon ligáltuk, azzal az eltéréssel, hogy a ligációs elegyhez nem adtunk Xhol linkért. A ligáit DNS képezte a kívánt pKC283PX plazmidot.
Az NRRL B-15993 katalógusszámon az NRRL-től beszerezhető E. coli K12 ΜΟ(λ+) tartalmazza a vad típusú lambda pL cl represszor gént, így a lambda pL promoter transzkripciója nem következik be az E. coli KI2 ΜΟ(λ+) sejtekben. Az E. coli Κ12ΜΟ(λ+) egyedülálló telepeit izoláltuk, és 10 ml egy éjszakás sejttenyészetet készítettünk; ampicillint nem használtunk a szaporító táptalajban. 50 μΐ egy éjszakás tenyészetet használtunk 5 ml L tápleves inokulálásához, mely tápleves szintén tartalmazott 10 mM MgSO4-ot és 10 mM MgCl2-ot. A tenyészetet erős rázatás mellett 37 °C hőmérsékleten egy éjszakán át inkubáltuk. Másnap reggel a tenyészetet 10 mM MgSO4-ot és 10 mM MgCl2-ot tartalmazó L táplevessel 200 ml-re hígítottuk. A hígított tenyészetet erős rázatás mellett 37 °C hőmérsékleten addig inkubáltuk, míg az O. D.590 körülbelül 0,5 lett, mely körülbelül 1 χ 108 sejt/ml sejtsűrűséget jelzett. A tenyészetet jeges vízfürdőben 10 percig hűtöttük, majd a sejteket 4000 x g fordulaton 4 °C hőmérsékleten 10 percig tartó centrifúgálással összegyűjtöttük. A sejtpelletet 100 ml hideg 10 mM-os NaClban reszuszpendáltuk, majd azonnal újra pelletizáltuk centrifúgálással. A sejtpelletet 100 ml 30 mM-os
CaCl2-ban reszuszpendáltuk, és 20 percig jégen inkubáltuk.
A sejteket centrifúgálással ismét összegyűjtöttük, és 10 ml 30 mM-os CaCl2-ban reszuszpendáltuk. A sejteket 1-0,5 ml mennyiségben a fenti módon preparált ligáit DNS-hoz adtuk; a DNS-at 30 mM-os CaCl2-ban készítettük. A sejt - DNS keveréket 1 órán keresztül jégen inkubáltuk, 90 másodpercig 42 °C hőmérsékleten hősokkoltuk, és ezután körülbelül 2 percig jégen hűtöttük. A sejt-DNS elegyet 10 ml-re hígítottuk IB táplevessel, 125 ml-es lombikban, és 1 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. 100 μΐ mennyiséget ampicillin tartalmú L agarra szélesztettünk, és 37 °C hőmérsékleten a telepek megjelenéséig inkubáltunk.
A telepeket egyedileg tenyésztettük, és az egyedi telepek plazmid DNS-át restrikciós enzim analízissel és gélelektroforézissel vizsgáltuk. A plazmid DNS izolálását a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon, kisebb léptékben végeztük, de a CsCl-os grádiens lépést a kívánt E. coli KI2 MO (λ+)/ pKC283PX transzformánsok azonosításának elvégzéséig elhagytuk.
pg pKC283PX plazmid DNS-at oldottunk fel 20 μΐ 10 x magas sótartalmú puffer, 20 μΐ 1 mg/ml BSA, 5 μΐ (körülbelül 50 egység) BglII restrikciós enzim, 5 μΐ (körülbelül 50 egység) Xhol restrikciós enzim és 150 μΐ víz elegyében, és a kapott reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A reakciót leállítottuk; a őg/II-YüoI-gyel emésztett DNS-at kicsapattuk, és a DNS-at 5 μΐ TE pufferben reszuszpendáltuk.
A BglII és Xhol restrikciós enzimes hasításra jellemző egy szálú DNS végekkel rendelkező DNS kötőt automatizált DNS szintetizálón szintetizáltuk és a 9A) példában leírt módon kinázzal kezeltük. A DNS kötő szekvenciája a következő volt:
5’-GATCTATTAACTCAATCTAGAC-3’ mi mm 111111
3»-ATAATTGAGTTAGATCTGAGCT-5’.
A kötő és Bg/II-ATíoI-gyel emésztett pKC283PX plazmid ligálását a fent leírt ligációs eljárással alapjában véve egyező módon végeztük. A ligáit DNS képezte a kívánt pKC283-L plazmidot. A pKC283-L plazmid DNS-at az E. coli K12 ΜΟ(λ+) transzformálásához használtuk, a kapott E. coli KI2 MO (Á )/pKC283-L transzformánsokat ampicillin rezisztens fenotípusuk és plazmid DNS-uk restrikciós enzim analízise révén azonosítottuk.
Körülbelül 10 pg pKC283-L plazmid DNS-at oldottunk fel 20 pl 10 χ magas sótartalmú puffer, 20 μΐ 1 mg/ml BSA, 5 pl (körülbelül 50 egység) Xhol restrikciós enzim és 155 pl víz elegyében és a kapott reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A ATioI-gyel emésztett pKC283-L plazmid DNS-at ezután kicsapattuk és 2 pl 10 x nick transzlációs puffer (0,5 M Tris-HCl, pH = 7,2; 0,1 M MgSO4; és 1 mM DTT), az egyes dezoxiribonukleotid foszfátokat 2 mM mennyiségben tartalmazó oldatból 1 μΐ, 15 μΐ H2O; 1 μΐ (P-L Biochemicals meghatározása alapján körülbelül
HU 215 186 Β egység) Klenow és 1 μΐ 1 mg/ml BSA elegyében reszuszpendáltuk. A reakcióelegyet 30 percig 25 °C hőmérsékleten inkubáltuk, a reakciót az oldat 5 percig 70 °C hőmérsékleten való inkubálásával állítottuk le.
BamHI kötőket (5’-CGGGATCCCG-3’) kezeltünk kinázzal és ligáltuk őket a Xhol-gyel emésztett Klenowval kezelt pKC283-L plazmid DNS-hoz a fent leírt kötő ligációs eljárással alapjában véve egyező módon. A ligációs reakció után a DNS-at körülbelül 100 egység őowHI-gyel emésztettük 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten, magas sótartalmú pufferben. A EowHI-gyel való emésztés után a DNS-at ligálásra készítettük elő és a körülbelül 5,9 kbázisú BamHI restrikciós ffagmentet ligációval kör alakúvá tettük, és a fent leírt eljárással alapjában véve egyező módon E. coli KI2 ΜΟ(λ+) sejtekbe transzformáltuk. Az E. coli KI2 MO(Á+)/pKC283-LB transzformánsokat azonosítottuk, majd a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon a transzformánsokból a pKC283-LB plazmid DNS-at preparáltuk.
Körülbelül 10 pg pKC283PX plazmidot emésztettünk SaB restrikciós enzimmel magas sótartalmú pufferben, Klenowval kezeltük, és a fent leírt eljárással alapjában véve egyező módon EcoRI kötőkhöz (5-GAGGAATTCCTC-3’) ligáltuk. Az EcoRI restrikciós enzimmel történő emésztés után, mely körülbelül 2,1 kbázisú DNS kivágását eredményezte, a körülbelül 4,0 kbázisú EcoRI restrikciós ffagmentet kör alakúvá ligáltuk, hogy a pKC283PRS plazmidot kapjuk. A ligáit DNS-at az E. coli Κ12ΜΟ(λ+) sejtek transzformálásához használtuk, majd miután az E. coli KI 2 MO (Á+)/pKC283PRS transzformánsokat azonosítottuk, a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon a transzformánsokból a pKC283PRS plazmid DNS-at izoláltuk.
Körülbelül 10 pg pKC283PRS plazmidot emésztettünk 200 μί magas sótartalmú pufferben körülbelül 50 egység PstI és Sphl restrikciós enzimekkel. A reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Ezután a reakcióelegyet elektroforézises vizsgálatnak vetettük alá 0,6%-os alacsony gélképzési hőmérsékletű agaróz gélen (FMC Corporation, Maríné Colloids Division, Rockland, Maine 04841) 2-3 óra ideig körülbelül 130 V és 75 mA értékek mellett Tris-Acetát pufferben.
A gélt etidium-bromid hígított oldatával festettük meg, és a hosszú hullámhosszú UV fénnyel láthatóvá tett, a körülbelül 0,85 kbázisú Pstl-Sphl restrikciós fragmenst tartalmazó DNS sávot a gélből kis szegmentben kimetszettük. A szegmens térfogatát a szegmens súly- és sűrűségadataival határoztuk meg, majd azzal egyenlő térfogatú 10 mM Tris-HCl-ot (pH = 7,6) adtunk a szegmentet tartalmazó kémcsőhöz. Ezután a szegmentet 72 °C hőmérsékleten történő inkubálással felolvasztottuk. A pKC283PRS plazmid körülbelül 0,85 kbázisú Pstl-Sphl restrikciós fragmenséből körülbelül 1 pg mennyiséget nyertünk, körülbelül 100 μί térfogatban. Hasonló módon a pKC283-LB plazmidot PstI és Sphl restrikciós enzimmel való emésztésnek vetettük alá és a kapott körülbelül 3,0 kbázisú restrikciós fragmenst agaróz gélen való elektroforézissel izoláltuk, és a ligáláshoz előkészítettük.
A pKC283PRS plazmid körülbelül 0,85 kbázisú Pstl-Sphl restrikciós fragmensét a pKC283-LB plazmid Pstl-Sphl restrikciós fragmenséhez ligáltuk. A ligáit DNS képezte a kívánt pL32 plazmidot. A pL32 plazmidot az E. coli KI2 ΜΟ(λ+) sejtekbe transzformáltuk; a pL32 plazmid DNS-at az E. coli KI2 MO(Á+)/pL32 transzformánsokból a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon preparáltuk. A pL32 plazmid DNS vizsgálata kimutatta, hogy egynél több EcoRI kötő kapcsolódik a Klenowval kezelt pKC283PX plazmid SaB végeihez. Az egynél több EcoRI linker jelenléte nem befolyásolja a pL32 plazmid, vagy származékainak felhasználását és a Xhol restrikciós hely jelenléte alapján detektálható, mely akkor jön létre, ha két EcoRI linkért ligálunk egymáshoz.
A pCCIOl plazmidot az U. S. Patent Application Serial No. 586581 számú szabadalom 1984. március 6-án lerakott, X-5872A jogi lajstromszámú szabadalom 3. példájában írták le, melyet a referencia révén a találmányba építettünk. Az EK-BGH-t kódoló DNS izolálása céljából körülbelül 10 pg pCCIOl plazmidot emésztettünk körülbelül50-50 egység Xbal és BozwHI restrikciós enzimeket tartalmazó 200 pl magas sótartalmú pufferben. Az emésztési termékeket agaróz-gélen végzett gélelektroforézissel különítettük el és az EK-BGH-t kódoló körülbelül 0,6 kbázisú Xbal-BamHI restrikciós fragmenst a gélből izoláltuk és ligáláshoz előkészítettük.
A pL32 plazmidot szintén Xbal és BamHI restrikciós enzimekkel való emésztésnek vetettünk alá, majd a körülbelül 3,9 kbázisú restrikciós fragmenst izoláltuk, és a ligáláshoz előkészítettük. A pL32 plazmid körülbelül 3,9 kbázisú Xbal-BamHI restrikciós fragmensét a pCCIOl plazmid körülbelül 0,6 kbázisú Xőűrl-EawHI restrikciós fragmenséhez ligáltuk, hogy megkapjuk a pL47 plazmidot. A pL47 plazmidot az £. coli K12 ΜΟ(λ+) sejtekbe transzformáltuk és az E. coli KI 2 MO(Á+)/pL47 transzformánsokat azonosítottuk. A transzformánsokból pLA-7 plazmid DNS-at preparáltunk a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon.
A pPR12 plazmid tartalmazza a hőérzékeny pL represszor gén cI857-et és a pBR322 plazmid tetraciklin rezisztenciát adó génjét. A pPR12 plazmidot az U. S. Patent #4436815 számú 1984. március 13-án megadott szabadalomban írták le.
Körülbelül 10 pg pPR12 plazmidot emésztettük körülbelül 50 egység EcoRI restrikciós enzimmel 200 pl magas sótartalmú pufferben 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten. Az EcoRI-gyel emésztett pPR12 plazmidot kicsapattuk és Klenowval kezeltük a fent leírt eljárással alapjában véve egyező módon. A Klenowval való kezelés után az EcoRI-gyel emésztett, Klenowval kezelt pPR12 plazmid DNS-at ligálással újra körré zártuk, és a kívánt pPR12 ARI plazmidot képző ligáit DNS-at az E. coli K12 RV 308 (NRRL B-15624) sejtek transzformálására használtuk. A transzformánsokat tetraciklin (10 pg/ml) rezisztenciájuk alapján szelektáltuk. Az E. coli K12 RV308/pPR12 ARI transzformánsok azonosí21
HU 215 186 Β tása után a transzformánsokból a pPR12/Rl plazmid DNS-at a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon preparáltuk.
Körülbelül 10 pg pPR12/Rl plazmidot emésztettünk körülbelül 50 egység Aval restrikciós enzimmel 200 pl közepes sótartalmú pufferben 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten. Az rival-gyel emésztett pPR12ARl plazmid DNS-at kicsapattuk, és Klenowval kezeltük. A Klenow reakció után az rtvul-gyel emésztett, Klenowval kezelt pPR12ARl plazmid DNS-at £coRI kötőkhöz (5’-GAGGAATTCCTC-3’) ligáltuk, kicsapattuk, 50 egység EcoRI restrikciós enzimet tartalmazó 200 pl magas sótartalmú pufferben reszuszpendáltuk, és 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Az £coRI-gyel való emésztés után a reakcióelegyet alacsony olvadáspontú agaróz-gélre helyeztük és a körülbelül 5,1 kbázisú EcoRI restrikciós fragmenst a gélről tisztítottuk, Iigálással újra körré zártuk, hogy megkapjuk a kívánt pPR12ARl plazmidot. A pPR12ARl plazmid DNS-at E. coli sejtekbe transzformáltuk; a transzformánsok szelektálása a tetraciklin rezisztencián alapult. A pPR12ARl plazmid DNS transzformánsokból való kinyerése a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon történt.
Körülbelül 10 pg pPR12ARl plazmid DNS-at szuszpendáltunk körülbelül 50-50 egység PstI és EcoRI restrikciós enzimeket tartalmazó körülbelül 200 pl magas sótartalmú pufferben és az emésztési reakcióelegyet 37 °C hőmérsékleten 2 órán keresztül inkubáltuk. A reakcióelegyet agaróz-gélre helyeztük, és apPR12ARl plazmid körülbelül 2,9 kbázisú EsíI-EcoRI restrikciós fragmensét izoláltuk, és a ligáláshoz előkészítettük.
Körülbelül 10 pg pL47 plazmidot emésztettünk PstI és SozwHI restrikciós enzimekkel 200 pl magas sótartalmú pufferben 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten. A PstI őamHI-gyel emésztett DNS-at agaróz-gélre helyeztük és a replikáció origóját és az ampicillin rezisztenciát adó gén egy részét tartalmazó, körülbelül 2,7 kbázisú Pstl-BamHI restrikciós fragmenst izoláltuk és a ligálásra előkészítettük. Egy külön reakció során körülbelül 10 pg pL47 plazmid DNS-at emésztettünk EcoRI és Sa/wHI restrikciós enzimekkel 200 pl magas sótartalmú pufferben 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten, majd a lambda pL transzkripciót aktiváló szekvenciát, az E. coli Ipp transzláció aktiváló szekvenciát és az EK-BGH-t kódoló DNS-at tartalmazó körülbelül 1,03 kbázisú EcoRl-BamHI restrikciós fragmentet izoláltuk, és a ligáláshoz előkészítettük.
A pL47 plazmid körülbelül 2,7 kbázisú Pstl-BamHI és körülbelül 1,03 kbázisú EcoRI-Ea/nHI restrikciós fragmenseit a pPR12ARl plazmid körülbelül 2,9 kbázisú Pstl-EcoRI restrikciós fragmenséhez ligáltuk, hogy létrehozzuk a pLllO plazmidot. A ligáit DNS-at az E. coli K12 RV308 transzformálásához használtuk. A tetraciklin rezisztenciát vettük alapul a transzformánsok szelektálása során.
Két PstI restrikciós enzim felismerési hely van az EK-BGH-t kódoló régióban, melyeket nem rajzoltunk le a csatolt rajzok között levő restrikciós helyek és fünkciós térképek között.
E) A pBW32 plazmid végső megszerkesztése
Körülbelül 10 pg pSV2-B-globin DNS-at (NRRL B-15 928) oldottunk fel 10 pl 10 * HindlII puffer, 5 pl (körülbelül 50 egység) HindlII restrikciós enzim és 85 pl H2O elegyében és a kapott reakcióelegyet 2 órára 37 °C hőmérsékletre helyeztük. A reakcióelegyet ezután LiCL-ban 0,15 M-ossá tettük, majd 2,5 térfogat etanol hozzáadása és szárazég-etanol fürdőben való inkubálása után a DNS-at centrifügálással pelletizáltuk.
A DNS pelletet 10 pl 10 x Bglll puffer, 5 pl (körülbelül 50 egység) Bglll restrikciós enzim és 85 pl H2O elegyében feloldottuk és 2 órára 37 °C hőmérsékletre helyeztük. A Eg/II-vel való emésztés után a reakcióelegyet 0,85%-os agaróz-gélre helyeztük, és a fragmenteket elektroforézissel szeparáltuk. A gélt etidium bromiddal és UV fénnyel láthatóvá tettük és a kívánt körülbelül 4,2 kbázisú HindlII-BgllI fragmenst tartalmazó részt a korábban leírt módon kivágtuk a gélből. A pelletet 10 pl H2O-ban reszuszpendáltuk; ez körülbelül 5 pg mennyiséget tartalmazott a pSV2-B-globin plazmid kívánt körülbelül 4,2 kbázisú HindlII-BgllI restrikciós fragmenséből. A TPA-t kódoló pTPA103 plazmid körülbelül 2,0 kbázisú HindlII-BamHI restrikciós fragmentjét a pTPA103 plazmidból a már említett elvekkel egyező módon izoláltuk. A pTPA103 plazmid körülbelül 2,0 kbázisú HindlII-BamHI restrikciós fragmenséből körülbelül 5 pg mennyiséget nyertünk és ezt 10 pl H2O-ban szuszpendáltuk, és -20 °C hőmérsékleten tároltuk.
A pSV2-B-globin plazmid körülbelül 4,2 kbázisú BgllII-HindlII restrikciós fragmensének 2 pl mennyiségét és a pTPA103 plazmid körülbelül 2,0 kbázisú HindlII-BamHI fragmensének 4 pl mennyiségét összekevertük, és 2 pl 10 * ligáz puffer, 11 pl H2O és 1 pl T4 DNS ligáz (körülbelül 500 egység) elegyével 4 °C hőmérsékleten egy éjszakán keresztül inkubáltuk. A ligáit DNS-at az E. coli K12 RR1 sejtek (NRRL B-15210) transzformálásához használtuk, mely sejteket a 2. példában leírt elmélettel alapjában véve egyező módon tettünk a transzformációra alkalmassá. Az E. coli K12 RRl/pTPA103 transzformánsokból a plazmid DNS-at a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon nyertük.
A pSV2-dhfr plazmid a transzformált eukarióta sejtek szelekciójában és a dhfr génhez kovalensen kapcsolódó DNS amplifikálásában használható dihidrofolát reduktáz (dhfr) gént tartalmazza. 10 pg pSV2-dhfr plazmidot (az E. coli K12 HB101/pSV2-dhfr, ATCC 37146 számú törzséből izoláltuk) adtunk 10 pl 10 x EvwII puffer, 2 pl (körülbelül 20 egység) PvuII restrikciós enzim és 88 pl H2O elegyéhez és a kapott reakcióelegyet 37 °C hőmérsékleten 2 órán keresztül inkubáltuk. A reakciót fenolos és kloroformos extrahálással állítottuk le, majd a PvuII-vel emésztett pSV2-dhfr plazmid DNS-at kicsapattuk, és centrifugálással összegyűjtöttük.
őamHI linkereket (5’-CGGATCCCG-3’) kinázzal kezeltünk és a következő eljárás szerint a ligáláshoz előkészítettük. 1 pg kötőhöz (5 pl H2O-ban) 10 pl 5 * kináz sókat (300 mM Tris-HCl, pH = 7,8; 50 mM MgCl2; és 25 mM DTT), 5 pl 5 mM-os ATP-t, 5 pl
HU 215 186 Β
BSA-t (1 mg/ml), 5 μΐ 10 mM-os spermidint, 19 μί H2O-t és 1 μΐ polinukleotid kinázt (10 egység/μί) adtunk. A reakcióelegyet 37 °C hőmérsékleten 60 percig inkubáltuk, majd -20 °C hőmérsékleten tároltuk. 5 μΐ (körülbelül 5 pg) PvwII-vel emésztett pSV2-dhfr plazmidot és 12 μί (körülbelül 25 pg) kinázzal kezelt BamHI linkereket kevertünk össze, és 11 μί H2O-val, μί 10 χ ligáz pufferrel és 1 μΐ (körülbelül 1000 egység) T4 DNS ligázzal inkubáltuk 16 °C hőmérsékleten egy éjszakán keresztül.
μΐ 10 x BamHI puffért, 10 μΐ (körülbelül 50 egység) PnzwHI restrikciós enzimet és 48 μΐ H2O-t adtunk a ligációs elegyhez, melyet ezután 3 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltunk. A kapott reakcióelegyet 1%-os agaróz-gélre helyeztük, és a dhff gént tartalmazó kívánt körülbelül 1,9 kbázisú fragmentet izoláltuk a gélből. Az ezen példákban szereplő linker hozzáadása után mindig rutinszerű tisztítást végeztünk egy agarózgélen, hogy a több kötő szekvencia előfordulásának valószínűségét csökkentsük a végső vektorban. Körülbelül 3 pg mennyiséget nyertünk a fragmentből, melyet 10 μΐ TE pufferben szuszpendáltunk.
A következőkben megközelítően 15 μΐ (körülbelül 1 pg) pTPA301 plazmidot emésztettünk BamHI restrikciós enzimmel a fenti módszer szerint. Mivel egy egyedüli Ρα/wHI hely van a pTPA301 plazmidban, ez a Sa/wHI-gyel való emésztés lineáris pTPA301 plazmid DNS-at eredményez. A Βα/wHI-gyel emésztett pTPA301 plazmidot etanollal kicsapattuk, 94 μΐ H2Oban reszuszpendáltuk és foszfátos kezelésnek vetettük alá 1 μΐ borjúbél alkalikus foszfatázt (Collaborative Research, Inc., 128 Spring Street, Lexington, MA 02173) és 5 μΐ 1 M-os Tris-HCl-ot (pH = 9,0) használva, 65 °C hőmérsékleten 45 percig. A DNS-at fenokkloroform, majd kloroform.izoamilalkohol elegyével extraháltuk, etanollal kicsapattuk és 20 μΐ H2O-ban reszuszpendáltuk. 10 μί (körülbelül 25 pg) foszfatázzal kezelt pTPA301 plazmidot adtunk 5 μΐ dhfr gént tartalmazó BamHI restrikciós fragmenthez (körülbelül 0,5 μg), μΐ 10 χ ligáz pufferhez, 3 μΐ (körülbelül 1500 egység) T4 DNS Iigázhoz és 9 μΐ H2O-hoz. Ezt a ligációs reakcióelegyet egy éjszakán keresztül 15 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A ligáit DNS képezte a kívánt pTPA303 plazmid DNS-at.
A pTPA303 plazmidot az E. coli K12 RR1 (NRRL B-15210) sejtek transzformálásához használtuk, és a kapott E. coli KI2 RRl/pTPA303 transzformánsokat ampicillin rezisztens fenotípusuk és plazmid DNS-uk restrikciós enzim analízise alapján azonosítottuk. A pTPA303 plazmidot a transzformánsokból a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon izoláltuk.
A pBR322 replikont és β-laktamáz gént kódoló körülbelül 2,7 kbázisú EcoRI-őg/II restrikciós fragmens pTPA301 plazmidból való izolálásához körülbelül 10 μg pTPA301 plazmidot emésztettünk teljesen 400 μΐ teljes reakcióelegy térfogatban 20 egység BgíII restrikciós enzimmel (1 x BglII pufferben) 37 °C hőmérsékleten. A Pg/II-vel való emésztés után a Tris-HCl koncentrációját 110 mM-osra igazítottuk, és 20 egység
EcoRl restrikciós enzimet adtunk a őg/II-vel emésztett DNS-hoz. Az EcoRI-BgllI-vel emésztett DNS-at agaróz-gélre helyeztük és az elektroforézist addig végeztük, míg a körülbelül 2,7 kbázisú EcoRI-BgEI restrikciós fragmens el nem különült a többi emésztési terméktől, majd a körülbelül 2,7 kbázisú fragmentet izoláltuk, és a ligáláshoz előkészítettük.
A dhfr gént tartalmazó restrikciós fragment izolálásához a pTPA303 plazmidot HindlII és EcoRl restrikciós enzimekkel történő kettős emésztésnek vetettük alá, és a dhfr gént tartalmazó körülbelül 2340 bázispár hosszúságú EcoRI-HindlIÍ restrikciós fragmenst izoláltuk és feltártuk.
A TPA karboxil végét kódoló régiót és az SV40 promotert tartalmazó pTPA303 plazmid körülbelül kbázisú Hindlíl-Sstl restrikciós ffagmensének izolálása céljából a pTPA303 plazmidot HindlII és &íl restrikciós enzimekkel való kettős emésztésnek vetettük alá 1 χ HindlII pufferben. A körülbelül 1,7 kbázisú fragmentet izoláltuk a gélből, és a ligáláshoz előkészítettük.
A módosított TPA amino végét kódoló régiót tartalmazó pBW28 plazmid körülbelül 680 bázispár hosszúságú XhoII (a őg/II átfedéssel való ligálására alkalmas) SStI restrikciós fragmens izolálása céljából, körülbelül 10 pg pBW28 plazmidot emésztettünk teljesen Xhol enzimmel 1 χ XhoII pufferben (0,1 M Tris-HCl, pH = 8,0; 0,1 M MgCl2; 0,1% Triton X-100; és 1 mg/ml BSA). A.XhoII-vel emésztett DNS-at etanolos kicsapatással kinyertük, és &rl enzimmel való teljes emésztésnek vetettük alá. A ATjoil-S.s/I-gyel emésztett DNS-at akrilamid gélre helyeztük, és a kívánt fragmenst izoláltuk a gélből, majd a ligáláshoz előkészítettük.
A pTPA301 plazmid körülbelül 2,7 kbázisú EcoRI-őg/Π restrikciós fragmensének, a pTPA303 plazmid körülbelül 2,34 kbázisú EcoRI-77/n<7III restrikciós fragmensének, a pTPA303 plazmid körülbelül 1,7 kbázisú Sstl-HindlII restrikciós fragmensének és a pBW28 plazmid körülbelül 0,68 kbázisú Sstl-XhoH restrikciós fragmensének körülbelül 0,1 pg mennyiségeit egymáshoz ligáltuk, hogy létrehozzuk a pBW32 plazmidot. A ligációs keveréket az E. coli KI2 MM294 sejtek transzformálásához használtuk, a 2. példában leírt eljárásnak megfelelően, azzal az eltéréssel, hogy 50 mM CaCl2-ot használtunk az eljárás során. A transzformánsokat ampicillin rezisztens fenotípusuk és plazmid DNS-uk restrikciós enzim analízise alapján azonosítottuk. A pBW32 plazmid DNS-at az E. coli K12 MM294/pBW32 transzformánsokból a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon nyertük. A pBW32 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a csatolt rajzok között levő 14. ábrán szemléltetjük.
10. példa
A pLPChdl, pLPChd2, pLPCdhfrl és pLPCdhfr2 píazmidok megszerkesztése
A) A pLPChdl és pLPChd2 píazmidok megszerkesztése
Körülbelül 20 pg pBW32 plazmidot (20 μί TE pufferben) adtunk 10 pl 10 x BamHI pufferhez és 60 μί H2O-hoz. A pBW32 plazmid DNS oldatához körülbe23
HU 215 186 Β lül μΐ (körülbelül 50 egység) EawHI restrikciós enzimet adtunk, és a kapott reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A Ea/wHI-gyel emésztett pBW32 plazmid DNS-at etanollal kicsapattuk, centrifugálással összegyűjtöttük, és 5 μΐ 10 * Klenow pufferben, 45 μΐ H2O-ban és 2 μΐ (körülbelül 100 egység) Klenow enzim elegyében reszuszpendáltuk. A reakcióelegyet 30 percig 16 °C hőmérsékleten inkubáltuk, majd a reakcióelegyet agaróz-gélre helyeztük és az elektroforézist addig végeztük, míg az emésztés termékei tisztán el nem különültek. A pBW32 plazmid dhfr gént tartalmazó körülbelül
1,9 kbázisú Klenowval kezelt EűotjHI restrikciós fragmensét a gélből izoláltuk és a 4A) példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon a ligáláshoz előkészítettük. A kívánt fragmentből körülbelül 4 μg mennyiséget nyertünk, melyet 5 μΐ TE pufferben szuszpendáltunk.
Körülbelül 200 μg pLPChygl plazmidot (100 μΐ TE pufferben) adtunk 15 μΐ 10 χ EcoRI puffer és 30 μΐ H2O elegyéhez. Körülbelül 5 μΐ (körülbelül 50 egység) EcoRI restrikciós enzimet adtunk a pLPChygl plazmid DNS oldatához és a kapott reakcióelegyet 37 °C hőmérsékleten 10 percig inkubáltuk. A rövid reakcióidőt a részleges EcoRI emésztés elérése végett alkalmaztuk. A pLPChygl plazmid két EcoRI restrikciós hellyel rendelkezik, melyek közül az egyik a higromicin rezisztenciát biztosító (HmR) gént kódoló szekvencián belül van. Célunk az volt, hogy a dhfr gént tartalmazó restrikciós fragmenst inzertáljuk a pLPChygl plazmid nem a HmR génben levő EcoRI helyére. A részlegesen EcoRI-gyel emésztett pLPChygl plazmid DNS-at agaróz gélre helyeztük és az elektroforézist addig végeztük, míg az egyszeresen hasított pLPChygl plazmid DNS elkülönült a nem vágott plazmid DNS-tól és a többi emésztési terméktől. Az egyszeresen hasított DNS-at izoláltuk a gélből és a 4A) példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon előkészítettük a ligáláshoz. Az egyszeres EcoRI hasitású pLPChygl plazmidból körülbelül 2 pg mennyiséget nyertünk, és 25 μΐ TE pufferben szuszpendáltuk. Ehhez a mintához körülbelül 5 μΐ (körülbelül 25 egység) Klenow enzimet, 5 μΐ 10 x Klenow puffért és 40 μΐ H2O-t adtunk és a reakcióelegyet 60 percig 16 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A Klenowval kezelt, részlegesen EcoRI-gyel emésztett DNS-at ezután kétszer fenollal és egyszer kloroformmal extraháltuk, etanollal kicsapattuk és 25 μΐ TE pufferben reszuszpendáltuk.
A pBW32 plazmid körülbelül 1,9 kbázisú Klenowval kezelt EazwHI restrikciós fragmentjének körülbelül 5 μΐ mennyiségét hozzáadtuk az egyszeres EcoRI hasitású pLPChygl plazmid DNS körülbelül 5 μΐ mennyiségéhez és 1 μΐ 10 χ ligáz puffért, 5 μΐ H2O-t, 1 μΐ (körülbelül 500 egység) T4 RNS ligázt adtunk a DNS elegyhez. A kapott reakcióelegyet egy éjszakán át 16 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A ligáit DNS képezte a kívánt pLPChdl és pLPChd2 plazmidokat, melyek csupán a dhfr gént tartalmazó körülbelül 1,9 kbázisú fragment orientációjában térnek el egymástól.
A ligáit DNS-at a 2. példában leírt módon transzformációra alkalmassá tett E. coli K12 HB101 sejtek transzformálására használtuk. A transzformált sejteket 100 pg/ml ampicillint tartalmazó L agarra szélesztettük és az ampicillin rezisztens transzformánsokat plazmid DNS-uk restrikciós enzim analízise alapján vizsgáltuk az E. coli K12 HB101 (pLPChdl és az E. coli KI2 HB101) pLPChd2 transzformánsok azonosítása céljából. A pLPChdl plazmid restrikciós és funkcionális térképét a csatolt rajzok között látható 15. ábra mutatja. A pLPChdl és pLPChd2 plazmid DNS-akat a megfelelő transzformánsokból a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon izoláltuk.
A pLPChd3 és pLPChd4 plazmidok szerkezete hasonló a pLPChdl és pLPChd2 plazmidok szerkezetéhez. A pLPChd3 és pLPChd4 plazmidok megszerkesztése a pLPChdl és pLPChd2 plazmidok megszerkesztéséhez használt eljárással alapjában véve egyező módon történt azzal az eltéréssel, hogy a pLPChygl plazmid helyett a pLPChyg2 plazmidot használtuk kiindulási anyagként.
B) A pLPChdfrl és pLPChdfr2 plazmidok megszerkesztése
Körülbelül 100 μg pBW32 plazmidot (100 μΐ TE pufferben) adtunk 15 μΐ 10 x őazuHI puffer és 25 μΐ H2O elegyéhez. Körülbelül 10 μΐ (körülbelül 25 egység) BamHI restrikciós enzimet adtunk a pBW32 plazmid DNS oldatához és a kapott reakcióelegyet 2 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A őawHI-gyel emésztett pBW32 plazmid DNS-at Klenowval kezeltük a 10A) példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon. A tompa végű fragmenst etanollal kicsapattuk, 10 μΐ TE pufferben reszuszpendáltuk, agaróz-gélre helyeztük, és a gélelektroforézist addig végeztük, míg a dihidrofolát reduktáz gént tartalmazó körülbelül
1,9 kbázisú RaraHI restrikciós fragment el nem különült a többi emésztési terméktől. Ezután a körülbelül
1,9 kbázisú restrikciós fragmenst izoláltuk a gélből és a 4A) példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon a ligáláshoz előkészítettük. A kívánt fragmensből körülbelül 10 μg mennyiséget nyertünk, melyet 50 μΐ TE pufferben szuszpendáltuk.
A 8. példa szerint preparált körülbelül 5 μΐ AJel-S'ZwI-gyel emésztett pLPC plazmid DNS-at adtunk a pBW32 plazmid Klenowval kezelt, körülbelül
1,9 kbázisú őazwHI restrikciós fragment 5 μΐ mennyiségéhez, 1,5 μΐ 10 χ ligáz puffer, 1 μΐ (körülbelül 1000 egység) T4 DNS ligáz, 1 μΐ (körülbelül 2 egység) T4 RNS ligáz és 1,5 μΐ H2O elegyéhez. A kapott ligációs reakcióelegyet egy éjszakán keresztül 16 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A ligáit DNS képezte a kívánt pLPCdhfrl és pLPCdhfr plazmidokat, melyek csupán a dhfr gént tartalmazó körülbelül 1,9 kbázisú fragment orientációjában különböztek. A ligáit DNS-at a. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon végzett E. coli KI2 HB101 sejtek transzformáláshoz használtuk. A transzformált sejteket ampicillin tartalmú L agarra szélesztettük, és az ampicillin rezisztens E. coli KI2 HBlOl/pLPCdhfrl és £. coli KI 2 HB101/pLPCdhfr2 transzformánsokat plazmid
HU 215 186 Β
DNS-uk restrikciós enzim analízise alapján azonosítottuk.
11. Példa
A jelen találmány expressziós vektorainak eukariota gazdasejt transzformánsainak megszerkesztése és ezen transzformánsok rekombináns gén expressziós szintjeinek meghatározása
A jelen találmány egy fontos aspektusa az Ela géntermék jelenlétében a gén expressziót stimuláló BK enhancer és GT enhancer használatával foglalkozik. Mivel a 293 sejt konstitutívan expresszálja az E1A génterméket, a 293 sejtet kedveljük a jelen találmány eukariota expressziós vektorainak gazdájaként. A 293 sejtek az 5-típusú adenovirussal (megjegyzés: bármely adenovírus használható az E1A géntermék biztosítására a jelen találmány módszerében) transzformált humán embrióvese-sejtek és ezek a CRL 1575 katalógus számon szerezhetők be az ATCC törzsgyűjteménytől. Azonban a jelen találmány expressziós vektorai számos gazdasejtben funkcionálnak, még akkor is, ha az El A géntermék nincs jelen. Továbbá az El A géntermék bevihető ElA-t nem termelő sejtvonalba, akár az E1A gént tartalmazó vektorral való transzformáció segítségével (Grinnell et al., 1986, Mól. Cell. Bioi. 6:3596 3605) mint például a pLPCElA és pLPCIAl plazmidokkal, vagy tisztított adenovírus DNS-val vagy az adenovirussal való megfertőzéssel.
Az alábbiakban leírt transzformációs eljárás a 293 sejtekre vonatkozik mint gazdasejtvonalra; azonban az eljárás általában alkalmazható a legtöbb eukariota sejtvonalra.
A 293 sejteket a CRL 1573 katalógus számon az ATCC törzsgyűjteménytől szereztük be, 25 mm2 lombikban, mely összeérő monorétegben körülbelül 5,5xlO6 sejtet tartalmazott 10% hővel inaktivált lószérumot tartalmazó Eagle-féle Minimál Alap Táptalajon (Eagle’s Minimum Essential Médium). A lombikot 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk; a táptalajt hetente kétszer cseréltük. A sejteket úgy oltottuk át, hogy a táptalajt eltávolítottuk, a sejteket Hank-féle Egyensúlyi sóoldattal (Gibco) mostuk, 1-2 percre 0,25%-os tripszint adtunk hozzá, friss táptalajjal mostuk, lecsapoltuk és új lombikokba adagoltuk szét. Az átoltási arány 1:5 vagy 1:10 volt.
A transzformáció előtti napon a sejteket 0,7x106 sejt/petricsésze mennyiségben oltottuk. A táptalajt a transzformáció előtt 4 órával cseréltük. Steril, etanollal kicsapott, H2O-ban oldott plazmid DNS-at használtunk a 40 pg/ml DNS-at és 250 mM CaCl2-ot tartalmazó 2xDNS-CaCl2 oldat elkészítéséhez. 2xHBS-t készítettünk úgy, hogy 280 mM NaCl-ot, 50 mM Hepest és 1,5 mM Na-foszfátot tartalmazzon és a pH-t 7,05-7,15 értékre állítottuk be. A 2 x DNS - CaCl2 oldatot cseppenként adtuk az azonos térfogatú steril 2 x HBS oldathoz. 1 ml-es vattadugóval ellátott steril műanyag pipettát tettünk a 2 x HBS oldatot tartalmazó keverő kéncsőbe és fújással buborékoltattuk az oldatot a DNS adagolás alatt. A kalcium-foszfát-DNS csapadék képződést rázás nélkül 30—45 percig szobahőmérsékleten való inkubálással nyertük.
A csapadékot ezután óvatos műanyag pipettán való átengedéssel kevertük össze és 1 ml (per lemez) csapadékot adtunk közvetlenül a 10 ml szaporító táptalajhoz, mely elfedte a recipiens sejteket. 37 °C hőmérsékleten 4 óráig tartó inkubálás után a táptalajt 10%-os magzati szarvasmarha szérumot tartalmazó DMEM-mel helyettesítettük, és a sejteket további 72 óráig inkubáltuk a szelekciós nyomás biztosítása előtt. A rekombináns humán protein C-t expresszáíó transzformánsok szaporító táptalaja 1-10 pg/ml K vitamint, egy a protein γkarboxilálásához szükséges kofaktort tartalmazott. Az olyan plazmidok számára, melyek nem tartalmaznak az eukariota sejtekben funkcionáló szelektálható markert, a transzformációs eljárás egy plazmid keveréket használ: a jelen találmány szelektálható markert nélkülöző expressziós vektort; és az eukariota sejtekben funkcionáló szelektálható markert tartalmazó expressziós vektort. Ez a kotranszfekciós technika lehetővé teszi a mindkét transzformáló plazmidot tartalmazó sejtek azonosítását.
A higromicin rezisztenciát adó gént tartalmazó plazmidokkal transzfektált sejtek esetében a szaporító táptalajhoz körülbelül 200—400 pg/ml végkoncentrációban higromicint adtunk. Ezután a sejteket 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk 2-4 hétig, 3-4 napos időközökben történő táptalaj cserével. A kapott higromicin rezisztens telepeket ezután egyéni tenyészlombikokba oltottuk jellemzés céljából. A neomicin (G418-at is használtunk a neomicin helyett) rezisztens telepek szelekcióját a higromicin rezisztens sejtek szelekciós eljárásával egyező módon végeztük, azzal az eltéréssel, hogy G418-at adtunk 300 pg/ml végkoncentráció eléréséig higromicin helyett. A 293 sejtek dhfr pozitívak, így a dhfr gént tartalmazó plazmidokat tartalmazó 293 transzformánsokat nem egyedül a dhfr-pozitív fenotípus alapján szelektáltuk, mely a sejtek azon képességét jelzi, hogy hipoxantin és tiamin hiányos táptalajban is képesek szaporodni. Azok a sejtvonalak, melyekből hiányzik a funkcionális dhfr gén és melyeket dhfr-t tartalmazó plazmidokkal transzformáltunk, szelektálhatok a dhff+ fenotípus alapján.
A dihidrofolát reduktáz (dhfr) gén szelektálható markerként való alkalmazása a gén vagy a plazmid dhfr dificiens sejtvonalba való bejuttatása és a methotrexát további alkalmazása a plazmid kópia számának amplifikálása céljából az irodalomban jól megalapozott. Bár a dhfr termelő sejtekben való dhfr szelektálható és amplifikálható markerként való alkalmazását még nem tanulmányozták behatóan, a főemlős sejtek hatékony koamplifikálásához egy kezdeti szelekcióra van szükség, mely során egy közvetlenül szelektálható markert alkalmazunk a methotrexátot alkalmazó koamplifikálás előtt. A jelen találmány alkalmazását az alkalmazott szelektálható marker nem korlátozza. Sőt olyan amplifikálható markerek használhatók, mint a metallothionein gének, adenozin deamináz gének, vagy a multigén rezisztens család tagjai, melyekre példa például a Pglükoprotein. A 293 sejtek esetén előnyös olyan szelektálható markert, mint a higromicin B rezisztenciát adó gént tartalmazó vektorral végezni a transzformációt,
HU 215 186 Β majd az amplifikálást methotrexátot alkalmazva végezni, mely vektor nem használható a patkány dhfr-t tartalmazó plazmidok direkt szelektálására a 293 sejtekben. A koamplifikálás mértékét a Southem-féle hibridizációs technikával vagy más a tudomány e területén ismert technikával lehet mérni.
Különösen a pLPC és pSV2hyg vektorokat transzformáltuk a 293 sejtekbe, majd ezeket a legmagasabb termelési szint eléréséig tenyésztettük (körülbelül 2 pg/ml 24 cellás mikrotiter lemezben). A transzformánsokat szubklónoztuk, és szelektáltunk egy olyan kiónt, mely 2-3-szor több protein C termelésére képes. Ezt a szubklónt jelöltük a stabil CC311-es transzformánsnak.
12. Példa
Magas termelésű stabil transzformánsok megszerkesztése
Az Escherichia coli K12 AGl/pGTC sejteket liofilezett formában a National Régiónál Research Laboratoriestól (Peoria, Illinois) szereztük be. Az E. coli K12 AGl/pGTC törzset 1990. január 18-án deponálták, és azóta megtalálható az NRRL törzsgyűjteményben. A törzset az NRRL B-18593 katalógusszámon lehet beszerezni. A tenyészetet újra aktiváltuk, és a plazmidot a 3. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon tisztítva kinyertük a tenyészetből. A pGTC plazmid tartalmazza a protein C cDNS szekvenciáját, úgy pozícionálva, hogy a jelen találmány GBMT módosított transzkripciós egysége után legyen expressziója. A pGTC plazmid egy restrikciós helye és funkcionális térképe a csatolt rajzok között levő 16. ábrán látható.
A pGTC plazmidot all. példa elméletével alapjában véve egyező módon a CC311 kiónba transzformáltuk. Ezzel analóg módon a pLPC-hd, pLP-hyg és pLPC-dhfr plazmidokat a 293 sejtekbe transzformáltuk. A stabil transzformáció igazolása és a szubklónozás után az egyes transzformánsok relatív humán protein C termelési szintjét a Grinnell et al. (1987, Biotechnology, 5:1189-1192) által leírt standar ELISA módszerrel teszteltük, mely módszer elméletét az irodalmi hivatkozás révén beépítettük a találmányba. A vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy a pLPC-hd, pLPC-hyg vagy pLPC-dhfr plazmidokkal transzformált sejtek átlagos protein C termelése 120 ng/ml volt, míg a pGTC plazmiddal transzformált CC311 sejteké átlagosan 2930 ng/ml. A kísérlet eredményeit a korábban bemutatott IL táblázatban foglaltuk össze. A protein C kinyerhető a felülúszóból Grinnell et al. (Biotechnology, lásd fent) vagy Yan 0363126 számú európai nyilvánosságra hozatali irat leírásaival egyező módon, melyek elméletét az irodalmi utalás révén a találmányba építettünk.
13. Példa
Aktivált humán protein C-t szekretáló stabil transzformánsok megszerkesztése
A pLAPC-IRS plazmid az adenovírus késői promotere a BK enhancer, valamint az SV40 T antigén által együttesen irányított protein C aktivált formájának (inkább mint zimogén formájának) génszekvenciáját tartalmazza. A pLAPC-IRS plazmid megszerkesztését Bang et al. 0319312 számú európai nyilvánosságra hozatali iratban írták le, mely módszer teljes elméletét az irodalmi utalás révén a találmányba építettük. Az aktivált protein C-t kódoló gént tartalmazó DNS fragment könnyen kinyerhető a pLAPC-IRS plazmidból BcB restrikciós enzimmel végzett emésztés révén.
Escherichia coli K12 AGl/pGT-d sejteket szereztünk be az NRRL törzsgyűjteménytől, ahol ezt a törzset 1990. január 18-án deponálták és mely azóta része a törzsgyűjteménynek. Az E. coli KI2 AGl/pGT-d sejteket az NRRL B-18591 katalógus számon lehet beszerezni. A pGT-d plazmid tartalmazza a jelen találmány GBMT módosított transzkripciós egységét és a patkány dhfr gént. A pGT-d plazmid nem tartalmaz egy, a GBMT egységből való expresszáláshoz pozícionált gént, azonban egy ilyen gén plazmidba való könnyű inzertálására pozícionált BcB helyet igen. A pGT-d plazmid egy restrikciós és funkcionális térképét a csatolt rajzok között levő 17. ábrán szemléltetjük.
Az Escherichia coli K12 AGl/pGT-h sejteket az NRRL törzsgyűjteménytől szereztük be, melyeket szintén 1990, január 18-án deponáltak, és melyek azóta a törzsgyűjtemény részét képezik. Az E. coli K12 AGl/pGT-h sejteket az NRRL B-18592 katalógusszámon lehet beszerezni. A pGT-d plazmid tartalmazza a jelen találmány GBMT egységét és a higromicin rezisztenciát adó gént. A pGT-h a pGT-d plazmidhoz hasonlóan nem tartalmaz egy a GBMT egységből való expresszálásra pozícionált gént, azonban bármely gén inzertációjához pozícionált BcB helyet igen. A pGT-h plazmid egy restrikciós és funkcionális térképét a csatolt rajzok között levő 18. ábrán mutatjuk be.
A pLAPC-IRS plazmidot a BcB restrikciós enzimmel emésztettük és az aktivált protein C-t kódoló gént tartalmazó restrikciós fragmenst tisztítottuk. A plazmid DNS BcB enzimmel való emésztését gátolja az 5’-GATC-3’ szekvenciában levő adenin metilálása. Ezért a pGT-h plazmidot az adenin metilázt - mint például a dam gén által kódolt metilázt, melynek terméke metilálja az 5’-GATC-3’ szekvenciában levő adenin maradékot - nem tartalmazó E. coli gazdasejtből preparáltuk. Az E. coli K12 GM48 (NRRL B-15725) sejtekből hiányzik a funkcionális dam metiláz és így ezek a sejtek megfelelő gazdák a pGATC-h plazmid megszerkesztéséhez kiindulási anyagként használt pGT-h plazmid DNS preparálásához.
Az E. coli K12 GM48 sejteket tenyésztettük, és a transzformációra alkalmassá tettük őket; a pGT-h plazmidot használtuk az E. coli K12 GM48 sejtek a 2. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon való transzformálásához. A transzformált sejteket ampicillin tartalmú L agarra szélesztettük, és miután az ampicillin rezisztens E. coli KI 2 GM48/pGT-h transzformánsok telepeket képeztek, egy ilyen telepet használtunk a 2. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon végzett pGT-h plazmid DNS preparálásához. A pGT-h plazmid DNS-ból körülbelül 1 mg mennyiséget nyertünk, és ezt körülbelül 1 ml TE puf26
HU215 186Β ferben szuszpendáltuk. A pGT-h píazmidot ezután Bell restrikciós enzimmel emésztettük, a vektort tisztítottuk és az aktivált protein C gént tartalmazó fragmenshez ligáitok a korábbi példákkal egyező módon. Ez a reakció eredményezi a pGTAC-h píazmidot, mely a GBMT módosított transzkripciós egység általi expresszálásra pozícionált aktivált protein C-t kódoló gént tartalmazza.
Ezután a pLAPC-IRS és pGATC-h plazmidokat a 293 sejtekbe transzformáitok all. példában leírt eljárással alapjában véve egyező módon. Miután az egyes kiónok összeérésig szaporodtak 0,9 cm2 felületen, a sejtek átlagos expressziós szintjét összevetettük a standard protein C ELISA vizsgálatot használva. A pLAPC-IRS tenyészet megközelítően átlagosan 33 ng/ml, míg a pGATC-h tenyészet körülbelül 1460 ng/ml aktivált protein C-t termelt átlagosan. A kísérleti eredményeket a II. táblázat mutatja.
14. Példa
Tranziens expresszió
A relatív promoter erősség meghatározható tranziens expressziós vizsgálati rendszerek használatával is, melyek gyakran a kloramfenikol acetiltranszferáz (CAT) expresszióján alapulnak. Egy ilyen CAT vizsgálati módszert Grinnell et al. írták le (1986, Mól. Cell. Bioi. 6:3596-3605). A CAT expressziójához egy expressziós vektort úgy hoztunk létre, hogy először összekevertünk a 13. példában leírt eljárásnak megfelelően GM48-ban szaporított 5 pl pGTC (1 pg/ml) píazmidot, 5 pl 10 x Bell puffért (1,5 M KC1; 100 mM Tris-HCl, pH = 7,4; és 100 mM MgCl2), 5 pl Bell restrikciós enzimet és 35 pl vizet. 37 °C hőmérsékleten való 1 órás inkubálás után az 5303 bázispár hosszúságú vektor fragmenst 1%-os agaróz-gélen izoláltuk és BioRad Prep-A-Gene kitet használva tisztítottuk.
Körülbelül 40 pl TE puffért (pH=8,0) adtunk 50 pl vektorhoz és 0,05 egység borjúbél alkalikus foszfatázhoz (BmB). A reakcióelegyet 30 percig 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk, majd 10 pl 500 mM-os EGTA-t adtunk a reakcióelegyhez ahogy a hőmérsékletet felemeltük 65 °C hőmérsékletre és 45 percig inkubáltuk. A vektort fenollal (kloroformmal extraháltuk, alkohollal kicsapattuk és 20 pl vízben reszuszpendáltok.
Körülbelül 5 pl 0,1 pg/pl-es CAT GenBlock-ot (PL Pharmacia HindlII CAT vektor, Katalógus #27-489501), 5 pl-t a 4 dNTP egyenként 0,2 mM-os, egyenlő térfogatú keverékéből (500 mM Tris pH = 7,8; 50 mM MgCl2; 100 mM 2-merkaptoetanol és 100 pg/ml nukleázmentes BSA elegyében) és 1 pl Klenow-t (BRL) kevertünk össze és a kapott reakcióelegyet 25 °C hőmérsékleten 30 percig inkubáltuk. Az elegyet ezután 5 percig 70 °C hőmérsékleten hőkezeltük, majd etanollal kicsapattok. A DNS-at 10 pl 10 mM-os Trisben (pH = 7,6) reszuszpendáltuk, és 2 pl ligációs puffért (0,5 M Tris, pH = 7,6; 100 mM MgCl2 100 mM DTT és 500 pg/ml BSA), 2 pl (0,2 pg) foszforilált Bell linkereket (New England Biolabs), 1 pl bakteriofág T4 DNS ligázt és 2 pl 10 mM-os ATP-t adtunk az elegyhez. Az inkubálást 12 óráig 16 °C hőmérsékleten, majd 15 percig 68 °C hőmérsékleten végeztük. Ezt követően 20 pl 10 χ Bell puffért, 150 pl vizet és 20 pl Bell restrikciós enzimet adtunk az elegyhez és ezt 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. A fenol/kloroformos extrahálás és etanolos kicsapatás után a DNSat 50 pl H2O-ban reszuszpendáltuk, és a feleslegben levő linkereket a DNS Sepharose CL4B Spin oszlopon való keresztül futtatással távolítottuk el.
Ezután a CAT gént a vektor gerincéhez ligáitok úgy, hogy 7 pl vektor, 1 pl 10 χ ligáz puffer, 1 pl ligáz és 1 pg CAT fragment elegyét 16 °C hőmérsékleten 12 órán át inkubáltuk. A DNS-at E. coli K12 AG1 kompetens sejtekbe (Stratagene) transzformáltok a korábbi példákkal alapjában véve egyező módon, hogy a pGT-CAT plazmid létrejöjjön.
Ezután a pGT-CAT píazmidot a 293 sejtekbe transzformáltuk a korábbi példák elméletével alapjában véve egyező módon. Más promotereket és transzkripciós kontroliegységeket tartalmazó más vektorokat szintén transzformáltunk a 293 sejtekbe, és a tranziens expresszió szintjeit meghatároztuk. A kloramfenikol acetiltranszferáz vizsgálata és a humán protein C ELISA teszteket részesítettük előnyben, akárcsak Grinnell et al. (1987 Biotechnology 5:1189-1192), Grinnell et al. (1986, Mól Cell. Bioi. 6:3596-3605). Az eredményeket az I. táblázat mutatja.

Claims (13)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás fehéije termelésére egy óriás DNS-vírus igen korai géntermékét expresszáló eukarióta gazdasejtben azzal jellemezve, hogy
    I) egy gazdasejtet
    i) A) egy adenovírus-2 fő késői promoterének regulációs elemétől (MLTF) upstream irányban működőképesen elhelyezett BK vírus P2 erősítőjét,
    B) az adenovírus-2 fő késői promoterét,
    C) az említett promoter stimulálására pozícionált poli-GT elemet, és
    D) egy, az adenovírus kapcsolt három részből álló vezető szekvenciáját tartalmazó DNS szekvenciát tartalmazó módosított transzkripciós kontroll egységet [GBMT], és ii) egy, az expresszióhoz megfelelő módon pozícionált, az említett fehérjét kódoló DNS szekvenciát tartalmazó rekombináns DNS vektorral transzformálunk,
    II) az (I) lépésben említett sejtet a fehérje expressziójához megfelelő körülmények között tenyésztjük, és
    III) a sejttenyészetből a termelt fehéijét kinyerjük.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy eukarióta gazdasejtként egy adenovírussal transzformáit gazdasejtet alkalmazunk.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy eukarióta gazdasejtként 293 vagy AV12-664 gazdasejteket alkalmazunk.
    HU215 186 Β
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy eukarióta gazdasejtként egy 293 gazdasejtet alkalmazunk.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy humán protein C-t állítunk elő.
  6. 6. A 4. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy humán protein C-t állítunk elő.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a következő szekvenciájú módosított transzkrip5 ciós kontrollegységet [GBMT] alkalmazzuk:
    AAGCTTTTCT CATTAAGGGA AGATTTCCCC AGGCAGCTCT TTCAAGGGAT CCTCGAGAAT TCACACACAC ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC ACACTCGAGG ATCCCTAAAA GGTCCATGAG CTCCATGGAT TCTTCCCTGT TAAGAACTTT ATCCATTTTT GCAAAAATTG CAAAAGAATA GGGATTTCCC CAAATAGTTT TGCTAGGCCT CAGAAAAAGC CTCCACACCC TTACTACTTG AGAGAAAGGG TGGAGGCAGA GGCGGCCTCG GCCTCTTATA TATTATAAAA AAAAAGGCCA CAGGGAGGAG CTGCTTACCC ATGGAATGCA GCCAAACCAT GACCTCAGGA AGGAAAGTGC ATGACTGGGC AGCCAGCCAG TGGCAGTTAA TAAGCAGCCA GACAGACATT TGCTTACCCA TGGAATGCAG CCAAACCATG ACCTCAGGAA GGAAAGTGCA TGACTGGGCA GCCAGCCAGT GGCAGTTAAT AAGCAGCAGC CAGACAGACA TGTTTTGCGA GCCTAGTCGC CCTCTTCGGC ATCAAGGAAG GTGATTGGTT TATAGGTGTA GGCCACGTGA CCGGGTGTTC CTGAAGGGGG GCTATAAAAG GGGGTGGGGG CGCGTTCGTC CTCACTCTCT TCCGCATCGC TGTCTGCGAG GGCCAGCTGT TGGGCTCGCG GTTGAGGACA AACTCTTCGC GGTCTTTCCA GTACTCTTGG ATCGGAAACC CGTCGGCCTC CGAACGTACT CCGCCACCGA GGGACCTGAG CGAGTCCGCA TCGACCGGAT CGGAAAACCT CTCGAGAAAG GCGTCTAACC AGTCACAGTC GCAAGCTT.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy eukarióta gazdasejtként egy 293 sejtet alkalmazunk.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, 35 hogy humán protein C-t állítunk elő.
  10. 10. Eljárás egy fehérje gazdasejtben történő termelési szintjének növelésére, azzal jellemezve, hogy
    i) egy gazdasejtet a kívánt fehérjét expresszáló vektorral stabilan transzformálunk, ii) a stabil transzformánst egy, az i) pont szerinti vektortól eltérő, a fehéqét kódoló gént egy GBMT transzkripciós kontroliegység irányítása alatt expresszáló vektorral transzformáljuk, iii) az ii) lépés szerinti sejtet az expresszióhoz megfelelő körülmények között tenyésztjük, és iv) a sejttenyészetből kinyerjük a keletkezett fehérjét.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy humán protein C-t állítunk elő.
  12. 12. A 10. igénypont szerinti eljárás azzaljellemezve, 40 hogy az i) lépésben stabil transzformánsként a
    293/pLPC-t állítjuk elő.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a ii) lépésben vektorként a pGTC plazmidot alkalmazzuk.
HU91603A 1990-02-23 1991-02-22 Eljárás fehérje előállítására módosított transzkripciós kontrollegység alkalmazásával HU215186B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US48408290A 1990-02-23 1990-02-23

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU910603D0 HU910603D0 (en) 1991-09-30
HUT56885A HUT56885A (en) 1991-10-28
HU215186B true HU215186B (hu) 1998-10-28

Family

ID=23922667

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU91603A HU215186B (hu) 1990-02-23 1991-02-22 Eljárás fehérje előállítására módosított transzkripciós kontrollegység alkalmazásával

Country Status (12)

Country Link
US (2) US5573938A (hu)
EP (1) EP0445939B1 (hu)
JP (1) JP3014475B2 (hu)
AT (1) ATE153072T1 (hu)
AU (1) AU638796B2 (hu)
CA (1) CA2036913C (hu)
DE (1) DE69126053T2 (hu)
ES (1) ES2102385T3 (hu)
GR (1) GR3024137T3 (hu)
HU (1) HU215186B (hu)
IE (1) IE910612A1 (hu)
IL (1) IL97312A (hu)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU765709B2 (en) * 1992-12-03 2003-09-25 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
US5618714A (en) * 1993-12-15 1997-04-08 Eli Lilly And Company Methods for producing protein C
US6630137B1 (en) 1997-04-28 2003-10-07 Eli Lilly And Company Activated protein C formulations
WO1998048818A1 (en) * 1997-04-28 1998-11-05 Eli Lilly And Company Activated protein c formulations
HUP0003964A2 (en) * 1997-06-05 2001-03-28 Lilly Co Eli Methods for treating thrombotic disorders
US6548296B1 (en) 1997-07-23 2003-04-15 Roche Diagnostics Gmbh Methods for identifying human cell lines useful for endogenous gene activation, isolated human lines identified thereby, and uses thereof
HUP0001237A3 (en) 1997-10-20 2002-01-28 Lilly Co Eli Methods for treating vascular disorders
BR9914735A (pt) 1998-10-22 2001-07-03 Lilly Co Eli Processo para tratamento de sépsia
ES2259248T3 (es) 1998-11-13 2006-09-16 Eli Lilly And Company Uso de la proteina c humana para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de trombocitopenia inducida por heparina.
ATE235915T1 (de) 1998-11-20 2003-04-15 Lilly Co Eli Behandlung von hämorrhagischem virusfieber mit protein c
DK1133314T3 (da) 1998-11-23 2003-04-14 Lilly Co Eli Protein C til behandling af seglcellesygdom og thalassæmi
AU6199100A (en) * 1999-06-25 2001-01-31 Hybritech Incorporated Cloning and expressing of human cathepsin k in mammalian cells
US7204981B2 (en) 2000-03-28 2007-04-17 Eli Lilly And Company Methods of treating diseases with activated protein C
WO2001089558A2 (en) 2000-05-24 2001-11-29 Eli Lilly And Company Formulations and use of activated protein c and protein c zymogen for treating hypercoagulable states
ES2385251B1 (es) 2009-05-06 2013-05-06 Fundació Privada Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge Adenovirus oncolíticos para el tratamiento del cáncer.

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4436815A (en) 1981-11-27 1984-03-13 Eli Lilly And Company Method for stabilizing and selecting recombinant DNA containing host cells
US4775624A (en) 1985-02-08 1988-10-04 Eli Lilly And Company Vectors and compounds for expression of human protein C
US4935349A (en) * 1986-01-17 1990-06-19 Zymogenetics, Inc. Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus
US4775621A (en) 1986-02-25 1988-10-04 North Carolina State University Method of distinguishing invasive E. coli that cause septicemia
EP0245949B1 (en) * 1986-04-09 1997-10-29 Eli Lilly And Company A method of using eukaryotic expression vectors comprising the bk virus enhancer
US4992373A (en) * 1987-12-04 1991-02-12 Eli Lilly And Company Vectors and compounds for direct expression of activated human protein C
US4981952A (en) 1988-10-04 1991-01-01 Eli Lilly And Company Method for the purification of vitamin K-dependent proteins
CA1332049C (en) 1988-10-07 1994-09-20 Eli Lilly And Company Eukaryotic expression
US5043270A (en) * 1989-03-31 1991-08-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Intronic overexpression vectors
US5270178A (en) * 1990-02-23 1993-12-14 Eli Lilly And Company Vectors and compounds for expression of zymogen forms of human protein C

Also Published As

Publication number Publication date
IL97312A0 (en) 1992-05-25
IL97312A (en) 1999-01-26
DE69126053T2 (de) 1997-09-25
CA2036913C (en) 1999-12-14
DE69126053D1 (de) 1997-06-19
ATE153072T1 (de) 1997-05-15
CA2036913A1 (en) 1991-08-24
ES2102385T3 (es) 1997-08-01
GR3024137T3 (en) 1997-10-31
AU7130691A (en) 1991-08-29
US5573938A (en) 1996-11-12
EP0445939B1 (en) 1997-05-14
US5661002A (en) 1997-08-26
JP3014475B2 (ja) 2000-02-28
HUT56885A (en) 1991-10-28
HU910603D0 (en) 1991-09-30
JPH05268981A (ja) 1993-10-19
EP0445939A1 (en) 1991-09-11
AU638796B2 (en) 1993-07-08
IE910612A1 (en) 1991-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR970002166B1 (ko) 단백질 c를 암호화하는 dna 서열, 이를 함유하는 재조합 벡터, 재조합 벡터를 함유하는 포유동물 세포 및 단백질 c를 제조하는 방법
HU215186B (hu) Eljárás fehérje előállítására módosított transzkripciós kontrollegység alkalmazásával
US6242192B1 (en) Method of using eukaryotic expression vectors comprising the bk virus enhancer
EP0245949B1 (en) A method of using eukaryotic expression vectors comprising the bk virus enhancer
US5506118A (en) Method of using eukaryotic expression vectors comprising a poly GT element in the presence of trans-acting gene products
EP0584845B1 (en) A method of using eukaryotic expression vectors comprising the BK virus enhancer
EP0247843A2 (en) Human protein S, A plasma protein regulator of hemostasis
Weidle et al. Establishment of a temperature-inducible cell line for human plasminogen activator (tissue-type) by transfection of monkey cells with expression constructs

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees