JPH05268981A - 修飾転写調節単位とその用途 - Google Patents

修飾転写調節単位とその用途

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JPH05268981A JP3050647A JP5064791A JPH05268981A JP H05268981 A JPH05268981 A JP H05268981A JP 3050647 A JP3050647 A JP 3050647A JP 5064791 A JP5064791 A JP 5064791A JP H05268981 A JPH05268981 A JP H05268981A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 ヒトアデノウイルス２型由来の主要後期プロ
モーター（ＭＬＰ）を利用することを目的とする。 【構成】 アデノウイルスの主要後期プロモーターの上
流調節要素の近くに間隔をおいて位置するＢＫウイルス
のＰ２エンハンサー、アデノウイルス２型の主要後期プ
ロモーター、前記プロモーターを刺激する位置にあるポ
リ−ＧＴ要素、およびアデノウイルスのスプライスされ
た３分節系リーダー配列を含有するＤＮＡ配列を含有す
る修飾転写調節単位である。さらに、細胞内の上記修飾
転写単位を利用してアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の産物
を発現させて有用物質を産生する方法が含まれ、修飾転
写単位を含有するベクターで２回目の形質転換を行うこ
とによって、安定な形質転換細胞内の発現レベルを増大
させる方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】この発明は、ヒトアデノウイルス２型由来
の主要後期プロモーター(ＭＬＰ)を利用するものであ
る。ＭＬＰは、転写を開始するためのユニーク開始部位
(キャップ部位)を含有しており、これは、２つの調節要
素、すなわちキャップ部位に対してほぼ−２５〜−３１
の位置のＴＡＴＡ領域と、ほぼ−５２〜−６４の位置の
主要後期転写因子に対する結合部位、とによる指令を受
ける。さらにこの発明は、エンハンサー配列を利用し
て、アデノウイルスの主要後期プロモーターからの発現
を増大するものである。多くのエンハンサー配列が知ら
れており、遺伝子の発現を促進するそれらの性能は文献
によく記載されている。この発明で好ましいエンハンサ
ーはヒトポリオーマウイルスＢＫ、Ｐ２株(Ｂergら、Ｎ
ucl．Ａcids Ｒes．１６巻、９０５７頁、１９８８年)
由来のものである。このエンハンサーは、多くの細胞系
列(セルライン)で、後期プロモーター由来の発現を刺激
するが、アデノウイルスのＥ１a遺伝子産物のような大
きなＤＮＡウイルスの即時型（immediate-early）遺伝
子産物を発現する細胞に於いて最も有用である。これら
の条件下で、Ｅ１aタンパク質は、予想外のことである
が、ＢＫＶエンハンサーの活性を刺激する(Ｇrinnell
ら、Ｍol,Ｃell．Ｂiol．、８巻、３４４８頁、１９８
８年)。
【０００２】またこの発明では、コポリマーポリ(dＧ−
dＴ)・ポリ(dＡ−dＣ)すなわち“ＧＴ要素"が重要であ
る。この要素は、真核細胞のゲノム中に広く分布してお
り、いくつかの公知の遺伝子の非翻訳領域とイントロン
中に見出されている。この要素は、左回転(left−hande
d)のＤＮＡを形成することができ、組換えと遺伝子変換
の場合に役割を演ずることが示唆されている。この要素
は、ＳＶ４０初期プロモーターに対して弱いエンハンサ
ー活性をもっていることは示唆されているが、ＭＬＰと
一緒に用いた場合はエンハンサー活性をもっていない
(Ｂergら、Ｍol．Ｃell．Ｂiol．、９巻、５２４８頁、
１９８９年)。全く予想外のことであるが、エンハンサ
ー活性が、アデノウイルスのＥ１aタンパク質のよう
な、大きなＤＮＡウイルスの即時型遺伝子産物の存在
下、ＧＴ要素から引出すことができる。
【０００３】この発明に関連するその外の要素は、ヒト
アデノウイルス２型由来の３分節系（tripartite）リー
ダー(ＴＰＬ)配列を示す、合成により誘導されたＤＮＡ
配列である。この配列は、後期ウイルスmＲＮＡに見ら
れるもので、このようなウイルスの伝達暗号の翻訳を、
ウイルスの感染サイクルの後期には促進するが、感染に
続く初期には促進しないと考えられている(Ｚhangら、
Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．、２６４巻、１０６７９頁、１９８
９年;Ｄolphら、Ｊ．Ｖirol．、６２巻、２０５９頁１
９８８年)。しかし、効率的な転写(翻訳ではない)が、
感染後の後期に、アデノウイルスＴＰＬ配列に依存して
いるということ(Ａlonso−Ｃaplen、Ｊ．Ｖirol．、６
２巻、１６０６頁、１９８８年)と、転写を促進するに
は隣接イントロンの１４９個のヌクレオチドに加えて、
第１リーダー(nt４１まで)全体が必要であったというこ
とも報告されている。ＴＰＬが、感染サイクルの後期
に、アデノウイルス感染細胞の環境内でのみ非アデノウ
イルスmＲＮＡを安定化したと報告されている(Ｍooreと
Ｓhenk、Ｎucl．Ａcids Ｒes．、１６巻、２２４７
頁、１９８８年)。したがって、ＴＰＬが、ウイルス発
現に続く後期を除いて、遺伝子の発現を劇的に促進する
ことは、既刊の文献からは予想されないであろう。この
発明の合成配列は、後期感染条件下アデノウイルス感染
細胞には用いられない。対照的に、ベクターは初期ウイ
ルス機能を発現する形質転換細胞に用いられる。さら
に、合成ＴＰＬは、転写刺激を行うのに必要であると報
告されたイントロン配列を含有していない。予想外のこ
とであるが、この発明の合成ＴＰＬは、この発明のベク
ターからの発現を刺激するのみなず、後期ウイルス感染
細胞内で最適の転写を行うのに必要な配列を含有してい
る、従来から開示されている非スプライスＴＰＬ配列よ
りもほぼ２倍効率が良い。
【０００４】この発明は、アデノウイルスの主要後期プ
ロモーターの上流調節要素(ＭＬＴＦ)の近くに位置する
ＢＫウイルスのＰ２エンハンサー、アデノウイルス２型
の主要後期プロモーター、前記プロモーターを刺激する
位置にあるポリ−ＧＴ要素、およびアデノウイルスのス
プライスされた３分節系リーダー配列を含有するＤＮＡ
配列、を含有する修飾型転写調節単位に関する。この修
飾型転写単位は、有用な物質をコードする遺伝子の発現
を駆動する位置にあるとき、転写を大きく増大しそれ故
有用物質の発現レベルを大きく増大させるのに有用であ
る。この発明のその外の重要な態様は、宿主の真核細胞
内で組換え遺伝子の転写と発現を増大させるために、ア
デノウイルスのＥ１Ａ遺伝子産物のような、大きなＤＮ
Ａウイルスの即時型遺伝子産物の存在下で修飾転写調節
単位を用いる方法に関する。この発明の発現ベクターの
多様性は、クロラムフエニコールアセチルトランスフエ
ラーゼ、ヒトプロテインＣおよび活性ヒトプロテインＣ
のような多様なタンパク質の、当該修飾転写調節単位に
より駆動される高レベルの発現によって証明される。
【０００５】この発明を実施するとアデノウイルスで形
質転換された細胞内でヒトプロテインＣの発現が増大す
る。かような細胞は、ヒトプロテインＣまたは活性ヒト
プロテインＣのような、充分にγ−カルボキシル化され
たタンパク質を産生するのに特に好ましい宿主である。
従って、この発明には別の態様として、γ−カルボキシ
ル化タンパク質の改良製造方法が含まれる。この発明の
さらに他の重要な態様は、有用な遺伝子産物の発現をさ
らに増大する方法に関する。この方法は以下のようにし
て実施される。すなわち(a)有用な物質を発現し分泌す
るが、この発明の修飾転写調節単位を含有するベクター
を含有していない細胞クローンの安定な形質転換細胞を
得て、次いで(b)かような安定に形質転換されたクロー
ンを、同じ有用な物質をコードする遺伝子であってその
発現がこの発明の修飾転写調節単位で駆動される遺伝子
を含有するベクターで形質転換することによって実施さ
れる。上記の二重に形質転換された細胞をサブクローン
し、遺伝子発現に適した条件下で培養すると、第２のベ
クターで形質転換されなかったクローンと比較して、発
現レベルの劇的な増大が観察された。
【０００６】この発明のために以下の用語を次のように
定義する。 抗生物質:天然のまゝまたはわずかな化学的修飾によっ
て、他の微生物質もしくは真核細胞の増殖を阻害するか
または殺す、微生物によって産生される物質。 抗生物質耐性を供与する遺伝子:抗生物質に対する耐性
を供与する活性をコードするＤＮＡセグメント。 ＡpＲ:アンピシリン耐性表現型もしくは同表現型を供与
する遺伝子。 クローニング:組換えＤＮＡクローニングベクターにＤ
ＮＡのセグメントを組込むプロセス。 ＣmＲ:クロラムフエニコール耐性表現型または同表現型
を供与する遺伝子。 Ｅ１Ａ:ポリ−ＧＴ要素を活性化してエンハンサー活性
を発現し、かつＢＫウイルスエンハンサーを活性化でき
るアデノウイルスの即時初期遺伝子産物。 ep:Ｔ抗原遺伝子のＳＶ４０初期プロモーター、Ｔ抗原
結合部位、およびＳＶ４０の複製起点を含有するＤＮＡ
セグメント。 真核プロモーター:真核細胞内でプロモーターとして機
能するＤＮＡ配列。
【０００７】ＧＢＭＴ転写調節単位:アデノウイルスの
主要後期プロモーターの上流調節要素(ＭＬＴＦ)の近く
に位置するＢＫウイルスのエンハンサー要素、アデノウ
イルス２型の主要後期プロモーター、前記プロモーター
を刺激する位置にあるポリ−ＧＴ要素、およびアデノウ
イルス２型のスプライスされた３分節系リーダーをコー
ドするＤＮＡ配列を含有する修飾転写調節単位。このＧ
ＭＢＴ転写調節単位として最もよい例は、イー・コリ
(Ｅ．coli)Ｋ−１２ ＡＧ１／pＧＴＣ(ＮＲＲＬＢ−１
８５９３)内に見られるプラスミドpＧＴＣ中に見出され
る、約９００塩基対のＨindＩＩＩカセットである。 ＧＴエンハンサーシステム:ＭＬＰのようなプロモータ
ーに連結されたポリ−ＧＴ要素であり、このＭＬＰ内で
は、ポリ−ＧＴ要素は、それ自体エンハンサー活性をも
っていないが、Ｅ１Ａ遺伝子産物のような大きなＤＮＡ
ウイルスの即時型遺伝子の産物、または同様に活性化す
るウイルス遺伝子産物によって、エンハンサーとして活
性化される。 ＨmＲ:ハイグロマイシン耐性表現型または同表現型を供
与する遺伝子。 ＩＶＳ:イントロンをコードするＤＮＡであるが、介在
配列とも呼ばれる。
【０００８】大ＤＮＡウイルス:真核細胞に感染し、大
きさが約１０kbより大きいゲノムをもっているウイルス
であり、すなわちポックスウイルス、アデノウイルスお
よびヘルペスウイルスのいずれかである。 ＭＬＰ:アデノウイルスの主要後期プロモーターであ
り、本明細書では、アデノウイルス後期プロモーター、
アデノウイルス２型後期プロモーター、またはＡd２後
期プロモーターとも呼ばれている。 ＭＬＴＦ結合部位:アデノウイルスＤＮＡ内の、主要後
期転写因子(ＭＬＴＦ)が結合する部位。ＭＬＴＦはＭＬ
Ｐの活性を得るために必要である。 ＮeoＲ:ネオマイシン耐性を供与する遺伝子であり、ま
た真核細胞の宿主にＧ４１８耐性を供与するのに使用す
ることができる。 ori:プラスミドの複製起点。 pＡ:ポリアデニル化信号をコードするＤＮＡ配列。
【０００９】ポリ−ＧＴ要素:(ＧＴ)n−(ＣＡ)nのＤＮ
Ａ配列であって、本願では、nが２１の場合の配列を例
示しているが、nが２１より大きいかもしくは小さい、
長さが変化した配列も意味し、さらに化学的に合成され
た(ＧＴ)n−(ＣＡ)n配列;または(ＧＴ)n−(ＣＡ)nトラ
クトを含有するヒトゲノムＤＮＡ断片を意味する。 プロモーター:ＤＮＡのＲＮＡへの転写を指令するＤＮ
Ａ配列。 組換えＤＮＡクローニングベクター:自己複製因子もし
くは自己組込み因子であり、１つ以上の追加のＤＮＡセ
グメントを加えることができるか、もしくは加えられて
いるＤＮＡ分子からなる。 組換えＤＮＡ発現ベクター:プロモーターおよび関連す
る挿入部位を含有する組換えＤＮＡクローニングベクタ
ーであり、その挿入部位には、有用な産物をコードする
ＤＮＡ配列を挿入して発現することができる。 組換えＤＮＡベクター:組換えＤＮＡクローニングベク
ターもしくは組換えＤＮＡ発現ベクター。 レプリコン:組換えＤＮＡベクターの複製を調節するＤ
ＮＡ配列。
【００１０】制限断片:１つ以上の制限酵素の作用で生
成する線状ＤＮＡ。 rＲＮＡ:リポソームリボ核酸 感受性宿主細胞:所定の抗体などの毒性化合物の存在下
では、これらに対する耐性を供与するＤＮＡセグメント
なしで増殖することができない宿主細胞。 構造遺伝子:ひとつのポリペプチドをコードし、かつ開
始コドンと終止コドンをコードするＤＮＡを含有するＤ
ＮＡ配列。 ＴcＲ:テトラサイクリン耐性表現型または同表現型を供
与する遺伝子。 形質転換細胞:形質転換を受けた受容体宿主細胞。 形質転換:受容体宿主細胞へのＤＮＡの導入。 tＲＮＡ:転移リボ核酸。
【００１１】図１はＢＫウイルスの制限部位と機能地図
である。これらの地図の開示では、各図は正確な大きさ
の比率で画かれていない。図２はプラスミドpＢＫＥ１
の制限部位と機能地図である。図３はプラスミドpＢＫn
eo１の制限部位と機能地図である。図４はプラスミドp
ＳＶ２catの制限部位と機能地図である。図５はプラス
ミドpＬＰcatの制限部位と機能地図である。図６はプラ
スミドpＢＬcatの制限部位と機能地図である。図７はプ
ラスミドpＢＫcatの制限部位と機能地図である。図８は
プラスミドpＳＢＬcatの制限部位と機能地図である。図
９はプラスミドpＬ１３３の制限部位と機能地図であ
る。図１０はプラスミドpＬＰＣの制限部位と機能地図
である。図１１はプラスミドpＬＰＣ４の制限部位と機
能地図である。図１２はプラスミドpＳＶ２hygの制限部
位と機能地図である。図１３はプラスミドpＬＰＣhyg１
の制限部位と機能地図である。図１４はプラスミドpＢ
Ｗ３２の制限部位と機能地図である。図１５はプラスミ
ドpＬＰＣhd１の制限部位と機能地図である。図１６は
プラスミドpＧＴＣの制限部位と機能地図である。図１
７はプラスミドpＧＴ−dの制限部位と機能地図である。
図１８はプラスミドpＧＴ−hの制限部位と機能地図であ
る。
【００１２】この発明は、ＧＢＭＴ単位と命名された新
規な修飾型転写調節単位に関し、この単位は、アデノウ
イルスの主要後期プロモーターの上流調節要素の近くに
位置するＢＫウイルスのＰ２エンハンサー(ＭＬＴＦ)、
アデノウイルス２型の主要後期プロモーター、前記プロ
モーターを刺激する位置にあるポリ−ＧＴ要素、および
アデノウイルスのスプライスされた３分節系のリーダー
配列をコードするＤＮＡ配列を含有している。このＧＭ
ＢＴ単位は、有用な物質をコードする遺伝子が発現する
のに適正な位置にあるとき、真核細胞内でその有用な物
質を高レベルで発現させる。またこの発明は、ＧＢＭＴ
調節単位で転写を調節できる位置に有用な物質をコード
している組換えＤＮＡベクターを用いて、宿主細胞を形
質転換することによって、真核細胞の宿主中で有用な物
質を発現する方法に関する。形質転換された宿主細胞が
大ＤＮＡウイルスの即時型遺伝子産物を発現する場合、
予想外に高レベルの発現を得ることができる。このよう
な即時型遺伝子産物の例には、アデノウイルスＥ１Ａタ
ンパク質、アデノウイルスＥ１Ｂタンパク質、仮性狂犬
病ウイルスＩＥタンパク質、および単純ヘルペスウイル
スＩＣＰ４タンパク質が含まれる。このような即時型遺
伝子産物をコードする遺伝子は、ＧＢＭＴ単位とは別の
ベクター上で、宿主細胞内に同時形質転換することがで
きるか、またはＧＢＭＴ単位と同じベクター上で、宿主
細胞に形質転換できる。あるいは最も好ましいのは、宿
主細胞が、即時型遺伝子産物をすでに発現している樹立
細胞の場合である。当業者には、多くの樹立細胞系が即
時型遺伝子産物を発現すること、および、かような細胞
系(セルライン)が本発明の方法に特に有用なことは理解
されよう。
【００１３】この発明のさらに他の重要な態様は、安定
に形質転換された細胞系内で、有用な物質の発現レベル
を大きく増大させる方法に関する。宿主細胞は、第１に
ＧＢＭＴ単位を含有していない発現ベクターで安定に形
質転換され、次いで最高の発現レベルを示すサブクロー
ンを選択する。次にこれらのサブクローンは、その発現
がＧＢＭＴ単位によって駆動される有用な物質をコード
する遺伝子を含有するベクターで２回目の形質転換が行
われる。次いで、予想外に高いレベルの有用物質を分泌
するクローンとサブクローンを選択する。この発明の発
現ベクターは、有用物質をコードするＤＮＡ分子が、発
現するために正しい位置でベクターに容易に挿入できる
か、もしくは挿入されるように構築した。さらにＧＢＭ
Ｔ転写単位は、“カセット"を形成するように構築した
が、そのカセットは、発現ベクターから、比較的小さな
制限断片上に単離することができる。このカセットは、
各種の発現ベクター間で容易にシャトルすることができ
る。本明細書に具体的に例示した発現ベクターは、この
発明の方法において、転写を駆動するＧＢＭＴ単位を利
用している。
【００１４】この発明のこのような発現ベクターの１つ
は、ヒトプロテインＣをコードする遺伝子の転写と発現
を駆動する位置にあるＧＢＭＴ単位を含有するプラスミ
ドpＧＴＣである。ヒトプロテインＣをコードする遺伝
子は、１９８８年１０月４日に付与されたＢangらの米
国特許第４,７７５,６２１号に開示され特許請求されて
おり、この特許の全教示事項は本明細書に援用する。プ
ラスミドpＧＴＣは、エシエリキア・コリ(Ｅscherichia
coli)（大腸菌）Ｋ１２ ＡＧ１／pＧＴＣから常法で
単離することができる。この菌株の培養物は１９９０年
１月１８日に米国、イリノイ州、ペオリアにあるＮorth
ern Ｒegional Ｒesearch Ｌoboratoriesに寄託され
その永久貯蔵培養収集物になった。イー・コリＫ１２
ＡＧ１／pＧＴＣは、受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８５９
３号で入手することができる。プラスミドpＧＴＣの制
限部位と機能地図を添付図面の図１６に示す。この発明
の他のプラスミドもＧＢＭＴ単位を含有している。プラ
スミドpＧＴ−dはＧＢＭＴ単位を含有しているが、この
ＧＢＭＴ単位は、有用物質をコードする遺伝子の挿入
が、ＧＢＭＴカセットの下流のユニーク(単一の)ＢclＩ
部位を利用してイー・コリのdam-菌株内でＤＮＡを調製
することによって達成されるような位置にある。またプ
ラスミドpＧＴ−dは、メトトレキサートに対する耐性を
供与するので選択可能なマーカーとして有用なマウスdh
fr遺伝子を含有している。プラスミドpＧＴ−dは、イー
・コリＫ１２ＡＧ１／pＧＴ−dから単離することができ
る。この菌株は、１９９０年１月１８日にＮＲＲＬへ寄
託されたので受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８５９１号で入
手できる。プラスミドpＧＴ−dの制限部位と機能地図を
添付図面の図１７に示す。
【００１５】プラスミドpＧＴ−hもＧＢＭＴ単位を含有
し、そのＧＢＭＴ単位は、有用産物をコードする遺伝子
の挿入が、ＧＢＭＴカセットの下流のユニーク(単一の)
ＢclＩ部位を利用してイー・コリのdam-菌株内でＤＮＡ
を調製することによって達成できるような位置にある。
しかしプラスミドpＧＴ−hはハイグロマイシン耐性決定
基をコードする遺伝子を含有している。プラスミドpＧ
Ｔ−hはイー・コリＫ１２ＡＧ１／pＧＴ−hから単離す
ることができる。この菌株も、１９９０年１月１８日に
ＮＲＲＬに寄託された。その培養物は受入れ番号ＮＲＲ
Ｌ Ｂ−１８５９２号で入手できる。プラスミドpＧＴ
−hの制限部位と機能地図は添付図面の図１８に示す。
プラスミドpＧＴＣ、pＧＴ−dおよびpＧＴ−hの約９０
０塩基対のＨindＩＩＩカセット中に見られるＧＢＭＴ
単位は次のような配列を含有している。
【化４】
【００１６】このカセットは、ＢＫエンハンサーとアデ
ノウイルス２型の主要後期プロモーターとを最適間隔を
おいて含有しており、そのＢＫエンハンサーの上流にポ
リＧＴ要素を含有している。このＢＫエンハンサーは、
主要後期プロモーターから２００塩基対離れていてもよ
く、ポリＧＴ要素はプラスミドのどこに位置してもよ
い。さらにこのカセットは、ヨーロッパ特許願８７３０
３０８３．７号でＧrinnellらが先に開示したスプライ
スされていない変形よりも約２倍有効な合成の３分節系
リーダー配列を利用する。なお上記ヨーロッパ特許願の
全教示事項は本願に援用する。具体的に述べると、ＧＢ
ＭＴＨindＩＩＩカセットのヌクレオチド６２〜１０４
はポリＧＴ(ＡＣ)要素を含有し、この要素は、大ＤＮＡ
ウイルスの即時型遺伝子産物のようなトランス作用遺伝
子産物の存在下で遺伝子発現を増大させるのに有用であ
る。真核発現にかようなＧＴ要素を使用することは、１
９９０年４月１１日に公告されたＢergらのヨーロッパ
特許公告０３６３１２７号に開示されている。なおこの
特許公告の全教示事項は本願に援用する。
【００１７】ＧＢＭＴＨindＩＩＩカセットのヌクレオ
チド３０６〜５０７は、アデノウイルスの主要後期プロ
モーターからの転写を増大するシス作用要素であるＢＫ
ウイルスＰ２エンハンサーを含有している。このＢＫエ
ンハンサーは、多種類の変異体が知られているが、３つ
の反復配列(原型)で構成された、ＤＮＡの明確なセグメ
ントである。この発明のＧＢＭＴカセット中に見られる
ＢＫエンハンサーは、塩基３０６から塩基３７６までと
さらに塩基４０９から塩基４７５まで反復して延びる６
８塩基対を含有している。３２塩基対が、塩基３７７か
ら塩基４０８までとさらに塩基４７６から塩基５０７ま
で反復して延びている。ＧＢＭＴカセットのＭＬＴＦ結
合部位は塩基５８１で始まり配列５'−ＧＧＣＣＡＣＧ
ＴＧＡＣＣ−３'を含有することが分かっている。アデ
ノウイルス主要後期プロモーターのＭＬＴＦ結合部位が
ＢＫウイルスのＰ２エンハンサーの近くに位置している
ことがＧＢＭＴ単位を使用することから生じる転写レベ
ルを増大させるのに役立つ。ＭＬＰの“ＴＡＴＡ"領域
がカセットの塩基６１２と６２０の間に見られ、一方ア
デノウイルスの合成の３分節系リーダー配列は塩基６４
３と８４４の間に位置している。
【００１８】いくつかの異なるプロモーター系を含有す
る各種のベクターを用いて宿主細胞を形質転換して、こ
の発明のＧＢＭＴ転写単位の強度を例示した。プラスミ
ドpＬＰＣ−hd、pＬＰＣ−hyg、pＬＰＣ−dhfrおよびp
ＢＬ２−ＣＡＴはすべてＢＬプロモーター系を含有して
いる。これらの各プラスミドの構築プロトコールは、後
記の実施例で詳細に開示する。ＢＬプロモーター系はア
デノウイルス２型の主要後期プロモーターと連結したＢ
Ｋウイルスエンハンサーを利用する。プラスミドpＬＡ
ＰＣ−ＩＲＳとpＳＢＬ−ＣＡＴはＳＢＬプロモーター
系を含有している。プラスミドpＬＡＰＣ−ＩＲＳは活
性ヒトプロテインＣをコードする遺伝子を含有している
が、このプラスミドの構築については、１９８９年６月
７日に公告されたＢangらのヨーロッパ特許公告０３１
９３１２号に記載されており、その教示事項は本明細書
に援用する。ＳＢＬプロモーター系は、アデノウイルス
主要後期プロモーターと連結したタンデムＳＶ４０エン
ハンサーＢＫエンハンサーを含有している。
【００１９】プラスミドpＬＰ−ＣＡＴは、アデノウイ
ルス後期プロモーターを含有し、エンハンサー配列を含
有していない。プラスミドpＧＴＣはＧＢＭＴ単位を含
有し、この単位はヒトプロテインＣをコードする遺伝子
の発現を駆動する位置にあるが、一方プラスミドpＧＴ
ＡＣ−hはＧＢＭＴ転写単位を含有し、この単位は活性
ヒトプロテインＣをコードする遺伝子の発現を駆動する
位置にある。前記の各プラスミドを用いてヒトの２９３
細胞を形質転換したが、これはアデノウイルスＥ１Ａ遺
伝子産物を発現する安定した形質転換細胞系である。シ
リアンハムスターＡＶ１２−６６４細胞のような、Ｅ１
Ａ遺伝子産物も発現する他の細胞系がこの発明の方法で
利用できかつ有用であることは当業者ならば分かるであ
ろう。
【００２０】２９３細胞を形質転換したときに、安定な
形質転換細胞を得るために、遺伝子産物の即時発現(３
日間の過渡的発現)をチェックするか、または選択薬剤
とともに培養した。各ベクターからの遺伝子産物の分析
法は、当該技術分野ではよく知られており、Ｇrinnell
ら、Ｂiotechnology、５巻、１１８９〜１１９２頁、１
９８７年;およびＧrinnelら、Ｍol．Ｃell．Ｂiol．、
６巻、３５９６〜３６０５頁、１９８６年に開示されて
いるが、その教示事項は本明細書に援用する。表１は過
渡(一時的)発現検定の結果を示し、一方表２は、安定に
組込まれたプラスミドからのチモーゲンと活性ヒトプロ
テインＣの発現の分析結果を示す。
【表１】 プロモーター強度の分析 (過渡的検定) プロモーター ベクター 発現の相対的レベル ＭＬＰ pＬＰ−ＣＡＴ １ ＢＬ pＢＬ２−ＣＡＴ(pＬＰＣ−hd) ７３a ＧＢＭＴ pＧＴＣ ５２７５ ＳＢＬ pＳＢＬ−ＣＡＴ ２３a a：ＭＬＰ、ＳＢＬおよびＢＬ間のプロモーター強度の
相対的レベルは、インジケーター遺伝子としてのＣＡＴ
遺伝子と、クロラムフエニコールアセチルトランスフエ
ラーゼ(ＣＡＴ)酵素とを用いて測定した。ＢＬとＧＢＭ
Ｔ間の相対的プロモーター強度は、インジケーター遺伝
子としてヒトプロテインＣ遺伝子を用い、標準ＥＬＩＳ
Ａ検定法で測定した。
【００２２】
【表２】 安定に組込まれたプラスミドからのヒトプロテインＣ発現の分析 活性プロテインＣ プロモーター ベクター x(ng／ml)a 範囲(ng／ml) x ng／１０6細胞 ＳＢＬ pＬＡＰＣ−ＩＲＳ ３３(n＝１２) １３−６９ ２６ ＧＢＭＴ pＧＴＡＣ−h １４６０(n＝２２) ６５２−３１１７ ６２２ a ０．９cm2の表面積全面増殖した培養物 ヒトプロテインＣ プロモーター ベクター x(ng／ml)a 範囲(ng／ml) x ng／１０6細胞 pＬＰＣ−hd ＢＬ pＬＰＣ−hyg １２０(n＝３０) １２−４８０ ９５ pＬＰＣ−dhfr ＧＢＭＴ pＧＴＣ ２９３０(n＝４８) ２７０−５０９５ ２３４０
【００２３】この発明のその外の態様は、実施例１１と
１２に示す。この実施例では、ヒトプロテインＣを産生
する安定に形質転換された細胞系が、pＧＴＣベクター
による形質転換によって増強された。まずプラスミドp
ＬＰＣを用いて２９３細胞を安定に形質転換し、一般の
バックグランド細胞集団の２〜３倍のヒトプロテインＣ
を分泌するサブクローンを選択した。これらの安定にト
ランスフエクトされた細胞を、次にプラスミドpＧＴＣ
で再形質転換を行った。このプラスミドはＧＢＭＴ転写
単位で駆動される、ヒトプロテインＣをコードする遺伝
子を含有している。全く予想外のことであるが、２９３
細胞をpＧＴＣで１回形質転換した場合よりもはるかに
多いクローンが産生されることが発見された。さらに、
この２重に形質転換された細胞は、ベクターpＬＰＣで
のみ形質転換し、次に生産性が最高のクローンを選択し
た親細胞系の３．５〜６．３倍のヒトプロテインＣを分
泌した。以下の実施例で、この発明の、ベクター、方
法、化合物、および組換え生物をより詳細に述べる。当
業者ならば、以下の実施例に記載されている特定の試
薬、装置および手法は単に例示されているだけであり、
この発明を限定するものでないことが分かるであろう。
【００２４】実施例１ ＢＫウイルスＤＮＡの調製 ＢＫウイルスは、受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ−８３７号で
Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollectionから得られ
る。このウイルスは凍結乾燥された形態で供給され、こ
れをハンクスの平衡塩類溶液(米国、ニユーヨーク州１
４０７２、グランド・アイランド、スタンレイ・ロード
３１７５、Ｇibco社)に、約１０5のプラーク形成単位(p
fu)／mlの力価となる様に再懸濁させる。ＢＫウイルス
ＤＮＡを調製するのによい宿主は一次ヒト胎児腎臓(Ｐ
ＨＥＫ)細胞であり、米国、ヴァージニア州２２１０
１、マクリーン、オールド・スプリングハウス・ロード
７６５５のＦlow Ｌaboratories Ｉnc．からカタログ
番号０−１００で、またはＭ．Ａ．Ｂioproduets社から
カタログ番号７０−１５１で入手できる。あるいは、Ｂ
ＫウイルスはＶero細胞(ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ８
１)中で増殖させることができる。約１０6のＰＨＥＫ細
胞の全面生長単層の入った約５つの７５mm2ポリスチレ
ンフラスコを用いてウイルスを調製する。１０5pfu／ml
の力価のＢＫウイルス約１mlを各フラスコに添加し、次
に３７℃で１時間インキュベートし、次に新たに調製し
た培地[ダルベッコの修飾イーグル培地(Ｇibco社)に１
％ウシ胎仔血清を補充したもの]を添加し、生成した感
染細胞を、３７℃で、１０〜１４日間インキュベートす
るか、またはウイルスの充分な細胞変性効果が観察され
るまでインキュベートする。この細胞変性効果は、細胞
系毎およびウイルス毎に変動するが、通常、細胞の、ラ
ウンディングアップ(rounding up)、クランピング(clu
mping)および培地ディスクからのはがれおちで構成され
ている。
【００２５】ウイルスは、３回の凍結乾燥サイクルによ
って細胞から放出され次に細胞の破片を５０００×gで
遠心分離することによって除去する。上澄み液１l中の
ウイルスを１００gのＰＥＧ−６０００を添加すること
によって沈澱させて集め、溶液を４℃で２４時間インキ
ュベートし、５０００×gで２０分間遠心分離する。生
成したペレットを、０．１×ＳＳＣ緩衝液(１×ＳＳＣ
＝０．１５Ｍ ＮaＣlおよび０．０１５Ｍクエン酸ナト
リウム、pＨ＝７)に、元の体積の１／１００になる様溶
解する。ウイルスの懸濁液を、試験管内の飽和ＫＢr溶
液１５mlの上に加層し、次に７５,０００×gで３時間遠
心分離する。遠心分離後、ＫＢr溶液中に２つのバンド
が現れれる。下方のバンドは、完全ビリオンを含有して
いるが、これを集め、溶離緩衝液としてＴＥ(１０mＭト
リス−ＨＣl、pＨ＝７．８および１mＭ ＥＤＴＡ)を用
いるセファデックスＧ−５０カラム(Ｓigma Ｃhemical
Ｃo．、米国、ミズーリ州６３１７８、セントルイス、
私書箱１４５０８)で脱塩する。
【００２６】ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)を、上記
カラムから得た精製ビリオンの溶液に、１％の濃度にな
る様添加する。プロナーゼを１００μg／mlの濃度まで
添加し、生成した溶液を３７℃で２時間インキュベート
する。得られた溶液に塩化セシウムを１．５６g／mlの
濃度まで添加し、次に臭化エチジウムを最終濃度１００
μg／mlまで添加する。得られた溶液を、Ｓorvall(Ｄup
ont Ｉnst．Ｐroducts社、Ｂiomedical Ｄivision、米
国、コネチカット州０６４７０、ニュートン)８６５ロ
ーターもしくは類似の垂直ローターで、２６０,０００
×gにて２４時間遠心分離する。遠心分離した後、ウイ
ルスＤＮＡのバンドを単離し、１００mＭトリス−ＨＣl
(pＨ＝７．８)で飽和したイソアミールアルコールで５
回抽出する。得られたＢＫウイルスＤＮＡの溶液を、Ｄ
ＮＡの２６０nm／２８０nm吸光率比が１．７５〜１．９
０の値になるまでＴＥ緩衝液に対して透柝する。ＤＮＡ
を、ＮaＣl濃度を０．１５Ｍに調節することによって沈
澱させ、２倍体積のエタノールを添加し、生成した溶液
を−７０℃で少なくとも２時間インキュベートし、１
２,０００×gで１０分間遠心分離する。得られたＢＫウ
イルスＤＮＡのペレットを１mg／mlの濃度となる様、Ｔ
Ｅ緩衝液中に懸濁する。
【００２７】実施例２ プラスミドpＢＫＥ１とpＢＫＥ２の構築 実施例１で調製したＢＫウイルスＤＮＡ約１μgを含有
するＴＥ緩衝液１μlを、１０×ＥcoＲＩ緩衝液(１．０
Ｍトリス−ＨＣl、pＨ＝７．５;０．５Ｍ ＮaＣl;５０
mＭ ＭgＣl2;および１mg／ml ＢＳＡ)と１５μlの水と
に溶解した。約２μlの制限酵素ＥcoＲＩ(約１０単位;
本明細書では、全酵素の単位は、酵素の実際の起源は異
なっているが、特にことわりがない限り、米国、マサチ
ューセッツ州０１９１５−９９９０、ビバーリー、トツ
ァー・ロード、３２、Ｎew Ｅngland Ｂiolabsの単位
の定義によっている)をＤＮＡの溶液に添加し、得られ
た反応混合物を３７℃で２時間インキュベートした。約
１μgのプラスミドpＵＣ８(米国、ニュージャージー
州、ピスカタウエイ、センテニアル・アベニュー８０
０、Ｐharmacia Ｐ−Ｌ Ｂiochemicals社から入手で
きる)を含有する１μlのＴＥ緩衝液を、ＥcoＲＩで消化
したＢＫウイルスＤＮＡを製造するのに利用したのとほ
ぼ同じ方法によってＥcoＲＩで消化した。ＥcoＲＩで消
化したプラスミドpＵＣ８ＤＮＡをＴＥ緩衝液で１００
μlまで希釈した。生成した溶液に約０．０６単位の仔
ウシ腸アルカリホスファターゼを添加し、得られた反応
混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。得られ
た溶液を、１×ＳＥＴ(５mＭトリス−ＨＣl、pＨ＝７．
８;５mＭ ＥＤＴＡ;および１５０mＭ ＮaＣl)、０．
３ＭＮaＯＡc、および０．５％ＳＤＳを含有するように
調節し、次いで６５℃で４５分間インキュベートした。
ホスファターゼ処理によってpＵＣ８ＤＮＡの自己連結
が防止される。
【００２８】ＥcoＲＩで消化したＢＫウイルスとプラス
ミドpＵＣ８ＤＮＡをまず緩衝フェノールで抽出し次に
クロロホルムで抽出した。各ＤＮＡ溶液のＮaＣlの濃度
を０．２５Ｍに調節し、２倍体積のエタノールを添加
し、生成した混合物をドライアイス−エタノール浴中で
５分間インキュベートし、次いで遠心分離してＤＮＡを
ペレットにすることによって、ＤＮＡを集めた。上澄液
は排棄し、ＤＮＡペレットを７０％エタノールですす
ぎ、乾燥し、ＢＫウイルスとプラスミドpＵＣ８の試料
それぞれを１０μlと３０μlのＴＥ緩衝液に再懸濁させ
た。約３μlの水と１μlの１０×リガーゼ緩衝液(０．
５Ｍトリス−ＨＣl、pＨ＝７．８;１００mＭ ＭgＣl2;
２００mＭ ＤＴＴ;１０mＭ ＡＴＰ;および０．５mg／
ml ＢＳＡ)とを、２μlのＥcoＲＩで消化したＢＫウイ
ルスと１μlのＥcoＲＩで消化したプラスミドpＵＣ８Ｄ
ＮＡの混合物中に添加した。１μl(約１０００単位)の
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを、上記のＤＮＡ溶液に添加し、得
られた反応混合物を１６℃で一夜インキュベートした。
連結させたＤＮＡは、所望のプラスミドpＢＫＥ１とpＢ
ＫＥ２を含有していたが、これらのプラスミドは、挿入
されたＢＫウイルスＤＮＡの配向だけが異なっている。
プラスミドpＢＫＥ１の制限部位と機能地図を添付図面
の図２に示す。
【００２９】イー・コリＫ１２ＪＭ１０３(Ｐharmacia
Ｐ−Ｌ Ｂiochemicals社から入手できる)含有のＬ−
ブロスの培養物５０mlを、６５０ナノメーターの光学濃
度(Ｏ．Ｄ．６５０)、が約０．４吸光単位になるまで増
殖させた。得られた培養物を氷上で１０分間冷却し、次
に遠心分離によって細胞を集めた。生成した細胞ペレッ
トを２５mlの冷１００mＭ ＭgＣl2に再懸濁させ、氷上
で２５分間インキュベートした。細胞を遠心分離して再
度ペレット化し、ペレットを２．５mlの冷１００mＭ Ｃ
aＣl2中に再懸濁させ、氷上で３０分間インキュベート
した。インキュベートした後、得られた細胞は、形質転
換ＤＮＡを取り込むのに充分な(コンピテント)細胞であ
る。この細胞懸濁液２００μlを、先に調製した連結Ｄ
ＮＡと混合し、氷上で３０分間インキュベートした。こ
の期間の最後に、細胞を水浴内に４２℃で２分間おき、
次いで氷中に戻してさらに１０分間おいた。細胞を遠心
分離で集め、Ｌブロス１ml中に再懸濁させ、３７℃で１
時間インキュベートした。
【００３０】細胞混合物の一部分づつを、１００μgア
ンピシリン１ml、４０μgＸ−gal／ml、および４０μg
ＩＰＩＧ／mlを含有するＬ寒天(１l当り１５gの寒天を
含有するＬブロス)のプレート上にプレートした。これ
らのプレートを３７℃で一夜インキュベートした。イー
・コリＫ１２ＪＭ１０３／pＵＣ８のような挿入断片な
しのプラスミドを含有するコロニーは、これらのプレー
ト上で青色を呈している。イー・コリＫ１２ＪＭ１０３
／pＢＫＥ１のような挿入断片を有するプラスミドを含
有するコロニーは白色である。いくつかの白色コロニー
を選択し、ＢＫウイルスの約５．２kbのＥcoＲＩ制限断
片の存在について、コロニーのプラスミドＤＮＡを制限
酵素分析することによってスクリーニングした。プラス
ミドＤＮＡは、以下の実施例に記載されているプラスミ
ドＤＮＡの単離方法にしたがって、イー・コリＫ１２Ｊ
Ｍ１０３／pＢＫＥ１とイー・コリＫ１２ＪＭ１０３／p
ＢＫＥ２の細胞から得た。ただしプラスミドＤＮＡを制
限酵素分析用として単離する際は上記方法は小規模で行
いＣsＣl勾配工程は省略される。
【００３１】実施例３ プラスミドpＢＫneo１とpＢＫneo２の構築 イー・コリＫ１２ＨＢ１０１／pdＢＰＶ−ＭＭＴneo細
胞は、凍結乾燥の形態で、Ａmerican Ｔype Ｃulture
Ｃollectionから受託番号ＡＴＣＣ３７２２４号で得
られる。凍結乾燥された細胞を、１００μg／mlのアン
ピシリンを含有するＬ寒天プレート上にプレートし、３
７℃でインキュベートし、単独コロニーの脱離物を得
る。５０μg／mlのアンピシリンを含有する１lのＬブロ
ス(１０gのトリプトファン、１０g ＮaＣlおよび５gの
酵母エキスを１l当り含有)に、イー・コリＫ１２ＨＢ１
０１／pdＢＰＶ−ＭＭＴneoのコロニーを接種し、Ｏ．
Ｄ．５９０が約１吸光単位になるまで３７℃でエアシエ
ーカー中でインキュベートし、次に１５０mgのクロラム
フエニコールを培養物に添加した。インキュベーション
を約１６時間続けた。クロラムフエニコールを添加する
とタンパク質合成が阻害されるので、さらに細胞が分裂
するのを阻害するが、プラスミドの複製は続けることが
できる。
【００３２】培養物を、Ｓorvall ＧＳＡローター(Ｄup
ont Ｃo．Ｉnstrument Ｐroducts、Ｂiomedical Ｄi
vision、米国コネチカット州０６４７０、ニュートン)
を用いて６０００rpmで、４℃にて５分間遠心分離し
た。得られた上澄液を排棄し、細胞のペレットを４０ml
のＴＥＳ緩衝液(１０mＭトリス−ＨＣl、pＨ＝７．５;
１０mＭ ＮaＣl;および１mＭ ＥＤＴＡ)中で洗浄し、
次に再度ペレット化した。上澄液を排棄し、細胞のペレ
ットをドライアイス−エタノール浴中で凍結させ次いで
解凍した。解凍した細胞ペレットを、２５％スクロース
と５０mＭ ＥＤＴＡの溶液１０ml内に再懸濁させた。約
１mlの５mg／mlリゾチーム溶液;３mlの０．２５Ｍ Ｅ
ＤＴＡ(pＨ＝８．０);および１００μlの１０mg／ml Ｒ
ＮアーゼＡを上記溶液に添加し、次に氷上で１５分間イ
ンキュベートした。３mlの溶菌溶液[３mlの１０％トリ
トン−Ｘ１００;７５mlの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ(pＨ＝
８．０);１５mlの１Ｍトリス−ＨＣl(pＨ＝８．０);お
よび７mlの水を混合して調製]を、リゾチームで処理し
た細胞に添加し、混合し、得られた溶液をさらに１５分
間、氷上でインキュベートした。溶解された細胞を、ド
ライアイス−エタノール浴中で凍結して解凍した。
【００３３】得られた溶液を、ＳＷ２７ローター(Ｂeck
man社、米国イリノイ州６０６４６、リンカーンウッ
ド、リンカーン・アベニュー、７３６０Ｎ)を用いて、
２５,０００rpmで４０分間遠心分離し、次に緩衝フエノ
ールで抽出して細胞の破片を除去した。約３０．４４g
のＣsＣlと、約１mlの５mg／ml臭化エチジウム溶液とを
上記細胞抽出液に添加し、次に溶液の体積を、ＴＥＳ緩
衝液によって４０mlに調節した。得られた溶液を、ＶＴ
i５０超遠心分離管(Ｂeckman)にデカントし、次にこれ
を密封し、ＶＴi５０ローターで、４２,０００rpmにて
約１６時間遠心分離した。得られたプラスミドのバンド
を、紫外線で目視可能にし、単離し、次にＴi７５管中
に入れ、ローター(Ｂeckman)を用いて５０,０００rpmで
１６時間遠心分離した。０．７６１g／ml ＣsＣlを含
有するＴＥＳを用いて、必要な体積の調節を行った。プ
ラスミドのバンドを再び単離し、塩で飽和したイソプロ
パノールで抽出して臭化エチジウムを除き、ＴＥＳ緩衝
液で１:３に希釈した。次に２倍体積のエタノールを溶
液に加え、一夜−２０℃でインキュベートした。得られ
た溶液をＳＳ３４ローター(Ｓorvall)を用いて１,００
０rpmで１５分間遠心分離することによってプラスミド
ＤＮＡをペレット化した。
【００３４】この方法で得た約１mgのプラスミドpdＢＰ
Ｖ−ＭＭＴneoＤＮＡを１mlのＴＥ緩衝液に懸濁させて
−２０℃で貯蔵した。上記のプラスミド単離法は、一般
に、非常に純粋なプラスミドＤＮＡを大量に得たい時に
利用される。この方法は、例えば、所定のプラスミドの
存在について形質転換細胞をスクリーニングするときに
必要な少量の低純度のＤＮＡを速やかに得るために、培
養細胞を約５mlだけ用い、適切にスケールダウンした量
の溶解緩衝液に細胞を溶解し、次いで遠心分離工程の代
わりにフエノールとクロロホルムで抽出することによっ
て改変することができる。上記のようにして製造したプ
ラスミドpdＢＰＶ−ＭＭＴneoＤＮＡの約５μg(５μl)
と、実施例１で作ったＢＫウイルスＤＮＡの５μg(５μ
l)を各々、２μlの１０×ＢamＨＩ緩衝液(１．５Ｍ Ｎ
aＣl;６０mＭトリス−ＨＣl、pＨ＝７．９;６０mＭ Ｍ
gＣl2;および１mg／ml ＢＳＡ)、１μlの制限酵素Ｂam
ＨＩ、ならびに７μlの水を含有する溶液中で、３７℃
にて２時間消化した。反応を同体積のフエノールで抽出
して停止させ、次いでクロロホルムで２回抽出した。次
にＢamＨＩで消化した各ＤＮＡを沈澱させ、遠心分離し
て集めて５μlの水に再懸濁させた。
【００３５】約１μlの１０×リガーゼ緩衝液を、Ｂam
ＨＩで消化したプラスミドpdＢＰＶ−ＭＭＴneo(１μl)
とＢamＨＩで消化したＢＫウイルスＤＮＡ(１μl)の混
合物に添加した。１μl(約１０００単位)のＴ４ＤＮＡ
リガーゼと６μlの水を上記ＤＮＡ混合物に添加した
後、得られた反応混合物を１６℃で一夜インキュベート
した。連結したＤＮＡは、所望のプラスミドpＢＫneo１
とpＢＫneo２を構成していた。これらのプラスミドはＢ
ＫウイルスＤＮＡの配向だけが異なっている。プラスミ
ドpＢＫneo１の制限部位と機能地図を添付図面の図３に
示す。イー・コリＫ１２ＨＢ１０１細胞は、Ｎorthern
Ｒegional Ｒesearch Ｌaboratoryから受託番号Ｎ
ＲＲＬ Ｂ−１５６２６の下、凍結乾燥された形態で入
手できる。イー・コリＫ１２ＨＢ１０１細胞を培養し、
形質転換を行えるようにし、上記のようにして調製した
連結ＤＮＡを用い、実質的に実施例２の方法によって形
質転換した。形質転換された細胞を、１００μg／mlの
アンピシリンを含有するＬ寒天プレート上にプレートし
た。イー・コリＫ１２ＨＢ１０１／pＢＫneo１とイー・
コリＫ１２／pＢＫneo２の形質転換細胞は、そのアンピ
シリン耐性表現型と、そのプラスミドＤＮＡの制限酵素
分析によって同定した。
【００３６】実施例４ プラスミドpＢＬcatの構築 Ａ．中間プラスミドpＬＰcatの構築 アデノウイルス２(Ａd２)のビリオンＤＮＡは、大きさ
が約３５．９４kbの二重鎖線状分子である。Ａd２の後
期プロモーターは、Ａd２ゲノムの約０．３１６kbのＡc
cＩ−ＰvuＩＩ制限断片上に単離することができるが、
この約０．３２kbの制限断片はＡd２ゲノムのヌクレオ
チド位置５７５５〜６０７１の配列に相当する。所望の
約０．３２kbＡccＩ−ＰvuＩＩ制限断片を単離するため
に、Ａd２ＤＮＡをまず制限酵素ＢalＩで消化して約
０．３２kbのＡccＩ−ＰvuＩＩ制限断片の全配列を含有
する約２．４kbのＢalＩ制限断片を単離する。次に、こ
の約２．４kbのＢalＩ制限断片をＡccＩ−ＰvuＩＩで消
化すれば、所望の断片が得られる。約５０μgのＡd２Ｄ
ＮＡ(ＢＲＬから入手できる)を８０μlの水と１０μlの
１０×ＢalＩ緩衝液(１００mＭトリス−ＨＣl、pＨ＝
７．６;１２０mＭ ＭgＣl2;１００mＭ ＤＴＴ;および
１mg／ml ＢＳＡ)に溶解する。得られたＡd２ＤＮＡの
溶液に約１０μl(約２０単位)の制限酵素ＢalＩを添加
し、生成した反応混合物を３７℃で４時間インキュベー
トする。
【００３７】ＢalＩで消化したＤＮＡをアガロースゲル
に負荷し、電気泳動法に付して制限断片を充分に分離さ
せる。得られたゲルを臭化エチジウムの希薄溶液(０．
５μg／ml)で染色し、染色したゲルを長波長の紫外線
(ＵＶ)に暴露することによって、電気泳動に付したＤＮ
Ａを目視可能にする。ＤＮＡをアガロースゲルから単離
する一方法は次のとおりである。所望の断片の前のゲル
に小さなスリットを作り、ＮＡ−４５ＤＥＡＥ膜(Ｓchl
eicher and Ｓchuell、米国、ニューハンプシャー州
０３４３１、キーン)の小片を各スリット内に置く。さ
らに電気泳動を行うと、ＤＮＡは非共有結合的にＤＥＡ
Ｅ膜に結合する。所望の断片をＤＥＡＥ膜に結合させた
後、膜を取出し、低塩緩衝液(１００mＭ ＫＣl;０．１
mＭ ＥＤＴＡ;および２０mＭトリス−ＨＣl、pＨ＝８)
ですすぐ。次に膜を小さな試験管に入れて高塩緩衝液
(１Ｍ ＮaＣl;０．１mＭ ＥＤＴＡ;および２０mＭトリ
ス−ＨＣl、pＨ＝８)に浸漬し、次いで６５℃で１時間
インキュベートしてＤＮＡをＤＥＡＥ紙から取り出す。
６５℃でインキュベートした後、インキュベーション緩
衝液を集め、膜を高塩緩衝液ですすぐ。このすすぎに用
いた高塩溶液を、高塩インキュベーション緩衝液ととも
にプールする。
【００３８】上記の高塩ＤＮＡ溶液の体積を、ＮaＣl濃
度が０．２５Ｍになるように調節し、次に３倍体積の冷
無水エタノールを上記溶液に添加する。得られた溶液を
混合し、−７０℃で１０〜２０分間静置する。次にこの
溶液を１５,０００rpmで１５分間遠心分離する。残留塩
を除くためにさらに沈澱法に付した後、ＤＮＡペレット
をエタノールですすぎ、乾燥し、２０μlのＴＥ緩衝液
に再懸濁させて、Ａd２の所望の制限断片約３μgを調製
する。得られた精製断片を１０μlのＴＥ緩衝液に溶解
する。約６μlのＨ2Ｏと２μlの１０×ＡccＩ緩衝液(６
０mＭ ＮaＣl;６０mＭトリス−ＨＣl、pＨ＝７．５;６
０mＭ ＭgＣl2;６０mＭ ＤＴＴ;および１mg／mlＢＳ
Ａ)をＡd２のＢalＩ制限断片(約２．４kb)の溶液に添加
する。このＤＮＡ溶液に、約２μl(約１０単位)の制限
酵素ＡccＩを添加した後、反応混合物を３７℃で２時間
インキュベートする。ＡccＩで消化した後、エタノール
沈澱法でＤＮＡを集め、これを、１６μlの水と２μlの
１０×ＰvuＩＩ緩衝液(６００mＭ ＮaＣl;６０mＭトリ
ス−ＨＣl、pＨ＝７．５;６０mＭ ＭgＣl2;６０mＭ Ｄ
ＴＴ;および１mg／ml ＢＳＡ)に再懸濁させる。ＤＮＡ
の溶液に約２μl(約１０単位)の制限酵素ＰvuＩＩを添
加した後、得られた反応混合物を３７℃で２時間インキ
ュベートする。
【００３９】ＡccＩとＰvuＩＩで消化された約２．４kb
の、Ａd２のＢalＩ制限断片を約６％のポリアクリルア
ミドゲルに負荷し電気泳動に付して、Ａd２後期プロモ
ーターを含有する約０．３２kbのＡccＩ−ＰvuＩＩ制限
断片を他の消化産物から分離する。得られたゲルを臭化
エチジウムで染色し、紫外線を用いて目視し、約０．３
２kbのＡccＩ−ＰvuＩＩ制限断片を含有するゲルのセグ
メントをゲルから切取り、砕いて、一夜、室温で、約２
５０μlの抽出緩衝液(５００mＭ ＮＨ4ＯＡc;１０mＭ
ＭgＯＡc;１mＭ ＥＤＴＡ;および０．１％ＳＤＳ)に浸
漬する。翌朝、混合物を遠心分離し、ペレットを排棄す
る。上澄み液中のＤＮＡをエタノールで沈澱させる。次
に約２μlのtＲＮＡを添加して所望の断片を完全に沈澱
させる。約０．３２kbのＡccＩ−ＰvuＩＩ制限断片約
０．２μgが得られ、これを７μlの水に懸濁させる。
【００４０】約０．２５μg(０．５μl中)のＢclＩリン
カー(５'−ＣＴＧＡＴＣＡＧ−３'、Ｎew Ｅngland
Ｂiolabs社から入手できる)を、下記実施例１０Ａの方
法に実質的にしたがってキナーゼ処理をしたものを、約
０．３２kbのＡccＩ−ＰvuＩＩ制限断片の溶液に添加
し、次いでこのＤＮＡ溶液に１μl(約１０００単位)の
Ｔ４ＤＮＡリガーゼと１μlの１０×リガーゼ緩衝液を
添加し、得られた反応混合物を１６℃で一夜インキュベ
ートした。ＢclＩリンカーは、ＡccＩ−ＰvuＩＩ制限断
片のＰvuＩＩ末端にのみ連結できた。ＤＮＡの配列を決
定した結果、４つのＢclＩリンカーがＡccＩ−ＰvuＩＩ
制限断片のＰvuＩＩ末端に連結していることが判明し
た。これらのエキストラＢclＩリンカーは、ＢclＩによ
る消化と再連結によって除去することができる。しか
し、エキストラＢclＩリンカーは、このエキストラリン
カーを含有するベクターが適正に機能するのを妨げない
場合には除去しない。
【００４１】イー・コリＫ１２ＨＢ１０１／pＳＶ２cat
細胞を、凍結乾燥の形態にて、受託番号ＡＴＣＣ３７１
５５の下でＡＴＣＣから入手し、この細胞から、実施例
３の方法にほぼしたがってプラスミドpＳＶ２catＤＮＡ
を単離した。プラスミドpＳＶ２catの制限部位と機能地
図を添付図面の図４に示す。約１mgのプラスミドpＳＶ
２catＤＮＡが得られ、これを１mlのＴＥ緩衝液に溶解
する。約３μg(３μl)のプラスミドpＳＶ２catＤＮＡ
を、２μlの１０×ＡccＩ緩衝液と１６μlの水に添加
し、得られたpＳＶ２catＤＮＡ溶液に３μl(約９単位)
の制限酵素ＡccＩを添加し、得られた反応混合物を３７
℃で２時間インキュベートした。次に、ＡccＩで消化さ
れたプラスミドpＳＶ２catＤＮＡに対して、３μlの１
０×ＳtuＩ緩衝液(１．０Ｍ ＮaＣl;１００mＭトリス−
ＨＣl、pＨ＝８．０;１００mＭ ＭgＣl2;６０mＭ ＤＴ
Ｔ;および１mg／mlＢＳＡ)、５μlの水、ならびに約２
μl(約１０単位)の制限酵素ＳtuＩを添加することによ
って、このプラスミドを制限酵素ＳtuＩで消化した。得
られた反応混合物を３７℃で２時間インキュベートし
た。反応混合物をフエノールで１回次いでクロロホルム
で２回抽出することによって反応を終了させた。約０．
５μgの所望の断片が得られ、２０μlのＴＥ緩衝液に溶
解した。
【００４２】約４μlのＡccＩ−ＳtuＩ消化プラスミドp
ＳＶ２catＤＮＡを、前記の、Ａd２のＡccＩ−ＰvuＩＩ
制限断片(約０．３２kb)(ＢclＩ断片が連結している)の
約７μlと混合し、３μlの１０×リガーゼ緩衝液、１５
μlの水および２μl(約１０００単位)のＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを添加した後、得られた連結反応混合物を一夜１６
℃でインキュベートした。連結されたＤＮＡは、所望の
プラスミドpＬＰcat、すなわちクロラムフエニコールア
セチルトランスフエラーゼ遺伝子の転写と発現を駆動す
るように配置されたＡd２後期プロモーターを含有する
プラスミドを形成していた。プラスミドpＬＰcatの制限
部位と機能地図を、添付図面の図５に示す。連結したＤ
ＮＡを、実施例２の方法にほぼしたがってイー・コリＫ
１２ＨＢ１０１細胞を形質転換するのに用いた。形質転
換された細胞を５０μg／mlのアンピシリンを含有する
Ｌ寒天上にプレートし、プラスミドＤＮＡの制限酵素分
析を利用してイー・コリＫ１２ＨＢ１０１／pＬＰcat形
質転換細胞を同定した。プラスミドpＬＰcatＤＮＡは、
次の構築に使用するため、実施例３に記載されたプラス
ミド分離法に実質的にしたがって、その形質転換細胞か
ら単離した。
【００４３】Ｂ．プラスミドpＢＬcatの最終的な構築 約８８μgのプラスミドpＢＫneo１ＤＮＡを含有する５
０μlのＴＥ緩衝液を、７．５μlの１０×ＡccＩ緩衝
液、３０μlの水および１５μl(約７５単位)の制限酵素
ＡccＩに添加し、得られた反応液を３７℃で２時間イン
キュベートした。ＡccＩで消化したＢＫウイルスＤＮＡ
をアガローカゲルに負荷し、ＢＫエンハンサーを含有す
る約１．４kbの断片を別の消化産物から分離した。次
に、実施例４Ａに記載の方法に実質的にしたがって、約
１．４kbのＡccＩ制限断片を単離した。約５μgの上記
断片を、５μlの１０×ＰvuＩＩ緩衝液、４５μlの水お
よび５μl(約２５単位)の制限酵素ＰvuＩＩに再懸濁
し、得られた反応混合物を３７℃で２時間インキュベー
トした。次に実施例４Ａの方法に実質的にしたがって、
ＰvuＩＩで消化したＤＮＡを、単離し連結用に調製し
た。所望の約１．２８kbのＡccＩ−ＰvuＩＩ断片約２μ
gが得られ、５μlのＴＥ緩衝液に溶解した。
【００４４】約１μgのプラスミドpＬＰcatＤＮＡを、
５μlの１０×ＡccＩ緩衝液と４０μlの水に溶解した。
約５μl(約２５単位)の制限酵素ＡccＩをプラスミドpＬ
ＰcatＤＮＡの溶液に添加し、得られた反応液を３７℃
でインキュベートした。ＡccＩ消化プラスミドpＬＰcat
ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、５μlの１０×ＳtuＩ
緩衝液、４０μlの水および５μl(約２５単位)の制限酵
素ＳtuＩに再懸濁し、得られた反応液を３７℃で２時間
インキュベートした。ＡccＩ−ＳtuＩ消化プラスミドp
ＬＰcatＤＮＡをエタノールで数回沈澱させて、イー・
コリの複製起点とＡd２の後期プロモーターを含有する
約４．８１kbのＡccＩ−ＳtuＩ制限断片を、その外の制
限産物すなわち大きさが約１６bpの制限断片から精製し
た。所望の約４．８１kbの制限断片の約１μgが得ら
れ、２０μlのＴＥ緩衝液に溶解した。
【００４５】プラスミドpＬＰcatの約４．８１kbのＡcc
Ｉ−ＳtuＩ制限断片の５μlを、ＢＫウイルスの約１．
２８kbのＡccＩ−ＰvuＩＩ制限断片の５μlに添加し
た。上記のＤＮＡ混合物に、３μlの１０×リガーゼ緩
衝液、１５μlの水および２μl(約１０００単位)のＴ４
ＤＮＡリガーゼを添加した後、生成した連結反応液を１
６℃で一夜インキュベートした。連結ＤＮＡは所望のプ
ラスミドpＢＬcatを形成していた。プラスミドpＢＬcat
の制限部位と機能地図を添付図面の図６に示す。連結さ
れたＤＮＡは、実施例３に記載された方法に実質的にし
たがって、イー・コリＫ１２ＨＢ１０１細胞を形質転換
するのに使用した。イー・コリＫ１２ＨＢ１０１／pＢ
Ｌcat形質転換細胞は、そのプラスミドＤＮＡを制限酵
素分析することによって同定した。プラスミドpＢＬcat
のＤＮＡを、次の構築に使用するために、実施例３の方
法にほぼしたがって調製した。
【００４６】実施例５ プラスミドpＳＢＬcatの構築 約１００μgのプラスミドpＢＬcatＤＮＡを、１０μlの
１０×ＨindＩＩＩ緩衝液(０．５Ｍ ＮaＣl;０．１Ｍト
リス−ＨＣl、pＨ＝８．０;０．１Ｍ ＭgＣl2;および１
mg／ml ＢＳＡ)と８０μlの水に溶解した。プラスミドp
ＢＬcatＤＮＡの上記溶液に、約１０μl(約１００単位)
の制限酵素ＨindＩＩＩを添加し、得られた反応液を３
７℃で２時間インキュベートした。ＨindＩＩＩ消化プ
ラスミドpＢＬcatＤＮＡをアガロースゲルに負荷し電気
泳動に付して、ＢＫエンハンサーとＡd２後期プロモー
ターを含有する約０．８７kbのＨindＩＩＩ制限断片
を、その外の消化産物から充分に分離し、次にこの約
０．８７kbの断片を、実施例４Ａの方法に実質的にした
がって、単離し連結用に調製した。所望の断片約１０μ
gが得られ、５０μlのＴＥ緩衝液に溶解した。約１μg
のプラスミドpＳＶ２catＤＮＡを含有する１μlのＴＥ
緩衝液を、２μlの１０×ＨindＩＩＩ緩衝液と１６μl
の水に溶解した。約１μl(約１０単位)の制限酵素Ｈind
ＩＩＩをＤＮＡの溶液に添加し、得られた反応液を３７
℃で２時間インキュベートした。反応混合物をまずフエ
ノールで抽出し次いでクロロホルムで２回抽出すること
によって反応を停止させた。ＨindＩＩＩ消化プラスミ
ドpＳＶ２catＤＮＡをエタノールで沈澱させ、１００μ
lのＴＥ緩衝液に再懸濁させた。ＨindＩＩＩ消化プラス
ミドpＳＶ２catＤＮＡを、実施例２の方法に実質的にし
たがって、仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、
１０μlのＴＥ緩衝液に再懸濁させた。
【００４７】プラスミドpＢＬcatの約０．８７kbのＨin
dＩＩＩ制限断片約５μlを、１０μlのＨindＩＩＩ消化
プラスミドpＳＶ２catに添加し、次いでそのＤＮＡ溶液
に、３μlの１０×リガーゼ緩衝液、２μl(約１０００
単位)のＴ４ＤＮＡリガーゼおよび１３μlの水を添加
し、得られた反応液を１６℃で２時間インキュベートし
た。連結させたＤＮＡは所望のプラスミドpＳＢＬcatを
形成していた。連結させたＤＮＡを、実施例２の方法に
実質的にしたがってイー・コリＫ１２ＨＢ１０１を形質
転換するのに使用した。形質転換させた細胞をアンピシ
リンを含有するＬ寒天上にプレートし、アンピシリン耐
性形質転換細胞のプラスミドＤＮＡを、制限酵素分析法
によって試験してイー・コリＫ１２ＨＢ１０１／pＳＢ
Ｌcat形質転換細胞を同定した。ＢＫエンハンサーとＡd
２後期プロモーターをコードする約０．８７kbのＨind
ＩＩＩ制限断片は、２つの配向のうち１つの配向のＨin
dＩＩＩ消化pＳＢＬcatに挿入することができたが、そ
の１つの配向のものだけがプラスミドpＳＢＬcatを形成
する。プラスミドpＳＢＬcatの制限部位と機能地図を添
付図面の図８に示す。
【００４８】実施例６ プラスミドpＬＰＣの構築 約２０μgのプラスミドpＢＬcatＤＮＡを１０μlの１０
×ＨindＩＩＩ緩衝液と８０μlの水に溶解した。このプ
ラスミドpＢＬcatＤＮＡ溶液に、約１０μl(約１００単
位)の制限酵素ＨindＩＩＩを添加し、得られた反応液を
３７℃で２時間インキュベートした。ＨindＩＩＩ消化
プラスミドpＢＬcatＤＮＡをアガロースゲルに負荷し電
気泳動に付して、ＢＫエンハンサーとＡd２後期プロモ
ーターを含有する約０．８７kbＨindＩＩＩ制限断片を
他の消化産物から分離し、次いでその約０．８７kbの断
片を、実施例４Ａの方法に実質的にしたがって、単離し
連結用に調製した。約２μgの所望の断片が得られ、こ
れを５μlのＴＥ緩衝液に溶解した。プラスミドpＬ１３
３は、チモーゲン型のヒトプロテインＣに対する全cＤ
ＮＡ暗号配列を含有している。プラスミドpＬ１３３
は、１９８８年１０月４日に発行されたＢangらの米国
特許第４,７７５,６２４号に開示され特許請求されてお
り、その全教示事項を本明細書に援用する。プラスミド
pＬ１３３の制限部位と機能地図は添付図面の図９に示
す。
【００４９】約１．５μgのプラスミドpＬ１３３ＤＮＡ
を２μlの１０×ＨindＩＩＩ緩衝液と１６μlの水に溶
解した。このＤＮＡ溶液に約１μl(約１０単位)の制限
酵素ＨindＩＩＩを添加し、得られた反応液を３７℃で
２時間インキュベートした。次にこのＤＮＡをＴＥ緩衝
液で１００μlにまで希釈し、実施例２の方法に実質的
にしたがって仔ウシ腸アルカリフォスファターゼで処理
した。ＨindＩＩＩ消化プラスミドpＬ１３３ＤＮＡをフ
エノールで２回クロロホルムで１回抽出し、エタノール
で沈澱させ、１０μlのＴＥ緩衝液に再懸濁させた。プ
ラスミドpＢＬcatの約０．８７kbのＨindＩＩＩ制限断
片約５μlを、１．５μlのＨindＩＩＩ消化プラスミドp
Ｌ１３３に添加し、次にそのＤＮＡ溶液に、１μlの１
０×リガーゼ緩衝液、１μl(約１０００単位)のＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼおよび１．５μlの水を添加し、得られた
反応液を１６℃で一夜インキュベートした。連結させた
ＤＮＡは所望のプラスミドpＬＰＣを形成していた。プ
ラスミドpＬＰＣの制限部位と機能地図を添付図面の図
１０に示す。得られた連結ＤＮＡを、実施例３の方法に
実質的にしたがって、イー・コリＫ１２ＨＢ１０１を形
質転換するの使用した。形質転換細胞をアンピシリン含
有のＬ寒天上にプレートし、アンピシリン耐性形質転換
細胞のプラスミドＤＮＡを、制限酵素分析法によって試
験してイー・コリＫ１２ＨＢ１０１／pＬＰＣ形質転換
細胞を同定した。ＢＫエンハンサーとＡd２後期プロモ
ーターをコードする約０．８７kbのＨindＩＩＩ制限断
片を、２つの配向のうち１つの配向のＨindＩＩＩ消化
プラスミドpＬ１３３に挿入することができたが、この
１つの配向のものだけがプラスミドpＬＰＣを形成す
る。
【００５０】実施例７ プラスミドpＬＰＣ４とpＬＰＣ５の構築 実施例１で調製したＢＫウイルスＤＮＡ約１μg(１μl)
と、１μgのプラスミドpＬＰＣ(１μl)とを、２μlの１
０×ＥcoＲＩ緩衝液と１４μlの水に溶解した。そのＤ
ＮＡ溶液に約２μl(約１０単位)の制限酵素ＥcoＲＩを
添加し、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベー
トした。ＢＫウイルスとプラスミドpＬＰＣのＤＮＡの
ＥcoＲＩ消化混合物を緩衝化フエノールで１回およびク
ロロホルムで１回抽出した。次に、以下のようにしてＤ
ＮＡを集めた。すなわちＮaＣlの濃度を０．２５Ｍに調
節し、２倍体積のエタノールを添加し、得られた溶液を
ドライアイス−エタノール浴中で２分間インキュベート
し、生成した溶液を遠心分離してＤＮＡをペレット化し
た。上澄み液を排棄し、ＤＮＡペレットを７０％エタノ
ールですすぎ、乾燥し、１２μlのＴＥ緩衝液に再懸濁
させた。
【００５１】約１３μlの水と３μlの１０×リガーゼ緩
衝液を、ＢＫウイルスとプラスミドpＬＰＣのＤＮＡの
ＥcoＲＩ消化混合物に添加した。このＤＮＡ溶液に２μ
l(約１０００単位)のＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、得
られた反応液を１６℃で２時間インキュベートした。連
結させたＤＮＡは所望のプラスミドpＬＰＣ４とpＬＰＣ
５を形成していた。これらのプラスミドは挿入されたＢ
ＫウイルスのＤＮＡの配向だけが異なっている。プラス
ミドpＬＰＣ４の制限部位と機能地図を添付図面の図１
１に示す。連結されたＤＮＡは所望のプラスミドpＬＰ
Ｃ４とpＬＰＣ５を形成しており、実施例２の方法に実
質的にしたがって、イー・コリＫ１２ＨＢ１０１のコン
ピテント細胞を形質転換するのに使用した。形質転換さ
れた細胞を１００μg／mlのアンピシリンを含有するＬ
寒天上にプレートした。イー・コリＫ１２ＨＢ１０１／
pＬＰＣ４とイー・コリＫ１２ＨＢ１０１／pＬＰＣ５の
形質転換細胞を、それらのアンピシリン耐性表現型と、
それらのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析とによって同
定した。
【００５２】実施例８ プラスミドpＬＰＣhyg１とpＬＰＣhyg２の構築 イー・コリＫ１２ＲＲＩ／pＳＶ２hyg細胞は、受託番号
ＮＲＲＬ Ｂ−１８０３９の下で、Ｎorthern Ｒegion
al Ｒesearch Ｌaboratoryから得られる。プラスミド
pＳＶ２hygＤＮＡは、実施例３の方法に実質的にしたが
って、上記の細胞から得られる。プラスミドpＳＶ２hyg
の制限部位と機能地図を添付図面の図１２に示す。約１
０μg(１０μlのＴＥ緩衝液中)のプラスミドpＳＶ２hyg
を２μlの１０×ＢamＨＩ緩衝液と６μlのＨ2Ｏに添加
した。このＤＮＡ溶液に約２μl(約２０単位)の制限酵
素ＢamＨＩを添加し、得られた反応液を３７℃で２時間
インキュベートした。反応液をまずフエノールで抽出し
次にクロロホルムで２回抽出した。ＢamＨＩ消化プラス
ミドpＳＶ２hygＤＮＡをアガロースゲルに負荷し、ハイ
グロマイシン耐性遺伝子を含有する約２．５kbの制限断
片を、実施例４Ａに記載の方法に実質的にしたがって単
離した。約５μlの１０×クレノウ緩衝液(４種のdＮＴ
Ｐの各々が０．２mＭ;０．５Ｍトリス−ＨＣl、pＨ＝
７．８;５０mＭ ＭgＣl2;０．１Ｍ２−メルカプトエタ
ノール;および１００μg／ml ＢＳＡ)と３５μlの水を
ＢamＨＩ消化プラスミドpＳＶ２hygＤＮＡの溶液に添加
し、次にそのＤＮＡ混合物に約２５単位のクレノウ酵素
(約５μl、ＢＲＬが市販している)を添加し、得られた
反応液を１６℃で３０分間インキュベートした。クレノ
ウ酵素で処理されたＢamＨＩ消化プラスミドpＳＶ２hyg
ＤＮＡをフエノールで１回抽出しクロロホルムで１回抽
出し、次いでエタノールで沈澱させた。約２μgの所望
の断片が得られ、５μlのＴＥ緩衝液に懸濁させた。
【００５３】約１０μg(１０μl)のプラスミドpＬＰＣ
ＤＮＡを２μlの１０×ＳtuＩ緩衝液と６μlの水に添加
した。得られたＤＮＡ溶液に約２μl(約１０単位)の制
限酵素ＳtuＩを添加し、生成した反応液を３７℃で２時
間インキュベートした。ＳtuＩ消化プラスミドpＬＰＣ
ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、遠心分離で集め、２μ
lの１０×ＮdeＩ緩衝液(１．５Ｍ ＮaＣl;０．１Ｍトリ
ス−ＨＣl、pＨ＝７．８;７０mＭ ＭgＣl2;６０mＭ２−
メルカプトエタノール;および１mg／ml ＢＳＡ)と１６
μlの水に再懸濁させた。得られたＳtuＩ消化ＤＮＡの
溶液に約２μl(約１０単位)の制限酵素ＮdeＩを添加
し、生成した反応混合物を３７℃で２時間インキュベー
トした。生成したＮdeＩ−ＳtuＩ消化プラスミドpＬＰ
ＣＤＮＡをエタノールで沈澱させ、遠心分離で集め、５
μlの１０×クレノウ緩衝液と４０μlのＨ2Ｏに再懸濁
させた。得られたＤＮＡ溶液に約５μl(約２５単位)の
クレノウ酵素を添加し、生じた反応液を１６℃で３０分
間インキュベートした。クレノウ反応の後、反応混合物
をアガロースゲルに負荷し、ゲルから、約５．８２kbＮ
deＩ−ＳtuＩ制限断片を単離した。約５μgの所望の断
片が得られ、それを５μlのＴＥ緩衝液に懸濁させた。
【００５４】プラスミドpＳＶ２hygのクレノウ処理Ｂam
ＨＩ制限断片(約２．５kb)の約２μlを、プラスミドpＬ
ＰＣのクレノウ処理ＮdeＩ−ＳtuＩ制限断片(約５．８
２kb)の約１μlと混合し、そのＤＮＡ溶液に、約３μl
の１０×リガーゼ緩衝液、２μlのＴ４ＤＮＡリガーゼ
(約１０００単位)、１μlのＴ４ＲＮＡリガーゼ(約１単
位)および１４μlの水を添加した。生成した反応液を１
６℃で一夜インキュベートした。連結されたＤＮＡは、
所望のプラスミドpＬＰＣhyg１とpＬＰＣhyg２を形成し
ていたが、これらのプラスミドは、プラスミドpＳＶ２h
ygのクレノウ処理ＢamＨＩ制限断片(約２．５kb)の配向
についてのみ異なっている。プラスミドpＬＰＣhyg１の
制限部位と機能地図を添付図面の第１３図に示す。連結
されたＤＮＡを、実施例３の方法に実質的にしたがって
イー・コリＫ１２ＨＢ１０１の形質転換に用いた。所望
のイー・コリＫ１２ＨＢ１０１／pＬＰＣhyg１とイー・
コリＫ１２ＨＢ１０１／pＬＰＣhyg２の形質転換細胞
を、アンピシリンを含有するＬ寒天上にプレートし、こ
れらプラスミドＤＮＡの制限酵素で同定した。
【００５５】実施例９ プラスミドpＢＷ３２の構築 Ａ．中間プラスミドpＴＰＡ１０３の構築 プラスミドpＴＰＡ１０２は、ヒト組織プラスミノーゲ
ン活性化因子(ＴＰＡ)の暗号配列を含有している。プラ
スミドpＴＰＡ１０２はイー・コリＫ１２ＭＭ２９４／p
ＴＰＡ１０２から単離することができる。この菌株は受
託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５８３４の下で、Ｎorthern
Ｒegional Ｒesearchから入手できる。プラスミドpＴ
ＰＡ１０２ＤＮＡは、実施例３の方法に実質的にしたが
ってイー・コリＫ１２ＭＭ２９４／pＴＰＡ１０２から
単離される。約５０μgのプラスミドpＴＰＡ１０２(約
５０μlのＴＥ緩衝液中)を、１０μlの１０×Ｔth１１
１Ｉ緩衝液(０．５Ｍ ＮaＣl;８０mＭトリス−ＨＣl、p
Ｈ＝７．４;８０mＭ ＭgＣl2;８０mＭ２−メルカプトエ
タノール;および１mg／ml ＢＳＡ);および８０μlの水
に添加した。生成したＤＮＡ溶液に、約１０μl(約５０
単位)の制限酵素Ｔth１１１Ｉを添加し、得られた反応
液を６５℃で２時間インキュベートした。生じた反応混
合物をアガロースゲルに負荷し、ＴＰＡ暗号配列を含有
する約４．４kbのＴth１１１Ｉ制限断片をゲルから単離
した。その外の消化産物すなわち３．１kbと０．５kbの
制限断片は排棄した。約１０μgの所望の約４．４kbの
Ｔth１１１Ｉ制限断片が得られ、１０μlのＴＥ緩衝液
に懸濁させた。
【００５６】約５μlの１０×クレノウ緩衝液と３０μl
の水を、約４．４kbのＴth１１１Ｉ制限断片を含有する
溶液に添加し、さらに約５μlのクレノウ酵素(約５単
位)を添加した後、反応混合物を１６℃で３０分間イン
キュベートした。クレノウ反応の後、ＤＮＡをエタノー
ルで沈澱させ、３μlの１０×リガーゼ緩衝液と１４μl
の水に再懸濁させた。 ＢamＨＩリンカー(Ｎew Ｅngland Ｂiolabs)は、下記
配列:
【化５】 をもっているが、それをキナーゼ処理し、次の工程によ
る連結用に調製した。４μlのリンカー(約２μg)を２
０．１５μlの水と５μlの１０×キナーゼ緩衝液(５０
０mＭトリス−ＨＣl、pＨ＝７．６および１００mＭ Ｍg
Ｃl2)に溶解し、９０℃で２分間インキュベートし、次
に室温まで放冷した。生成した反応混合物に、５μlの
γ−32Ｐ−ＡＴＰ(約２０μＣi)、２．５μlの１Ｍ Ｄ
ＴＴおよび５μlのポリヌクレオチドキナーゼ(約１０単
位)を添加し、次いで３７℃で３０分間インキュベート
した。次に３．３５μlの０．０１Ｍ ＡＴＰと５μlの
キナーゼを添加し、反応をさらに３７℃で３０分間続け
た。リンカーが標的ＤＮＡに連結したかどうかを決定す
るために放射性ＡＴＰを利用する。
【００５７】約１０μlのキナーゼ処理をしたＢamＨＩ
リンカーを、約４．４kbＴth１１１Ｉ制限断片の溶液に
添加し、２μlのＴ４ＤＮＡリガーゼ(約１０００単位)
と１μlのＴ４ＲＮＡリガーゼ(約２単位)を添加した
後、生成し連結反応液を４℃で一夜インキュベートし
た。連結ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、５μlの１０
×ＨindＩＩＩ緩衝液と４０μlの水に再懸濁させた。約
５μl(約５０単位)の制限酵素ＨindＩＩＩを上記ＤＮＡ
溶液に添加し、生成した反応液を３７℃で２時間インキ
ュベートした。ＨindＩＩＩ消化ＤＮＡをエタノールで
沈澱させ、１０μlの１０×ＢamＨＩ緩衝液と９０μlの
水に再懸濁させた。約１０μl(約１００単位)の制限酵
素ＢamＨＩをＤＮＡ溶液に添加し、生成反応液を３７℃
で２時間インキュベートした。ＢamＨＩで消化した後、
反応混合物をアガロースゲルに負荷し、約２．０kbのＢ
amＨＩ−ＨindＩＩＩ制限断片をゲルから単離した。所
望の断片約４μgが得られ、約５μlのＴＥ緩衝液に懸濁
させた。
【００５８】プラスミドpＴＰＡ１０３を構築する為
に、プラスミドpＴＰＡ１０２由来の約２．０kbのＢam
ＨＩ−ＨindＩＩＩ制限断片を、ＢamＨＩ−ＨindＩＩＩ
消化プラスミドpＲＣに挿入した。プラスミドpＲＣは、
イー・コリtrpオペロンのプロモーターとオペレーター
(trpＰＯ)の配列を含有する約２８８bpのＥcoＲＩ−Ｃl
aＩ制限断片を、ＥcoＲＩ−ＣlaＩ消化プラスミドpＫＣ
７に挿入することによって構築した。プラスミドpＫＣ
７は、Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollectionに受
託番号ＡＴＣＣ３７０８４で寄託されているイー・コリ
Ｋ１２Ｎ１００／pＫＣ７から得ることができる。trpＰ
Ｏを含有する約２８８bpのＥcoＲＩ−ＣlaＩ制限断片は
プラスミドpＴＰＡ１０２から単離することができる
が、このpＴＰＡ１０２はイー・コリＫ１２ＭＭ２９４
／pＴＰＡ１０２(ＮＲＲＬ Ｂ−１５８３４)から単離
できる。プラスミドpＫＣ７とプラスミドpＴＰＡ１０２
のＤＮＡは、実施例３の方法に実質的にしたがって前記
細胞系から得ることができる。プラスミドpＴＰＡ１０
２の、約０．２９kbの上記ＥcoＲＩ−ＣlaＩ制限断片
は、イー・コリtrp遺伝子の転写活性化配列とほとんど
の翻訳活性化配列を含有し、下記の配列をもっている。
【化６】
【００５９】このように、プラスミドpＲＣを構築する
ために、約２μgのプラスミドpＫＣ７を含有する１０μ
lのＴＥ緩衝液を、２μlの１０×ＣlaＩ緩衝液(０．５
Ｍ ＮaＣl;６０mＭトリス−ＨＣl、pＨ＝７．９;６０m
Ｍ ＭgＣl2;および１mg／ml ＢＳＡ)と６μlの水に添加
した。得られたプラスミドpＫＣ７ＤＮＡの溶液に、約
２μl(約１０単位)の制限酵素ＣlaＩを添加し、生成し
た反応液を３７℃で２時間インキュベートした。ＣlaＩ
消化プラスミドpＫＣ ７ＤＮＡをエタノールで沈澱さ
せ、２μlの１０×ＥcoＲＩ緩衝液と１６μlの水に再懸
濁させた。約２μl(約１０単位)の制限酵素ＥcoＲＩを
ＣlaＩ消化プラスミドpＫＣ７ＤＮＡの溶液に添加し、
得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。
ＥcoＲＩ−ＣlaＩ消化プラスミドpＫＣ７ ＤＮＡをフエ
ノールで１回次いでクロロホルムで２回抽出した。ＤＮ
Ａをエタノールで沈澱させ、３μlの１０×リガーゼ緩
衝液と２０μlの水とに再懸濁させた。プラスミドpＫＣ
７の制限部位と機能地図は、Ｍaniatisら、Ｍolecular
Ｃloning(Ｃold Ｓpring ＨarborＬaboratory、１
９８２年)、８頁から入手できる。
【００６０】約２０μgのプラスミドpＴＰＡ１０２を含
有する約２０μlのＴＥ緩衝液を１０μlの１０×ＣlaＩ
緩衝液と６０μlの水に添加した。約１０μl(約５０単
位)の制限酵素ＣlaＩを、プラスミドpＴＰＡ１０２ Ｄ
ＮＡの溶液に添加し、得られた反応液を３７℃で２時間
インキュベートした。ＣlaＩ消化プラスミドpＴＰＡ１
０２ ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、１０μlの１０×
ＥcoＲＩ緩衝液と８０μlの水に再懸濁させた。得られ
たＣlaＩ消化プラスミドpＴＰＡ１０２ ＤＮＡの溶液
に、約１０μl(約５０単位)の制限酵素ＥcoＲＩを添加
し、生成した反応液を３７℃で２時間インキュベートし
た。ＥcoＲＩ−ＣlaＩ消化プラスミドpＴＰＡ１０２ Ｄ
ＮＡを、フエノールで１回抽出し、７％ポリアクリルア
ミドゲルに負荷して電気泳動に付し、trpＰＯを含有す
る約２８８bpのＥcoＲＩ−ＣlaＩ制限断片を他の消化産
物から分離した。約２８８kpのＥcoＲＩ−ＣlaＩ制限断
片をゲルから単離した。所望の断片約１μgが得られ、
これを５μlのＴＥ緩衝液に懸濁させ、前記のようにし
て調製したＥcoＲＩ−ＣlaＩ消化プラスミドpＫＣ７ Ｄ
ＮＡの溶液に添加した。次にＴ４ＤＮＡリガーゼの約２
μl(約１０００単位)をＤＮＡの混合物に添加し、生成
した連結反応液を１６℃で２時間インキュベートした。
連結させたＤＮＡは所望のプラスミドpＲＣ ＤＮＡを形
成していた。
【００６１】連結させたＤＮＡを用い、実施例２の方法
に実質的にしたがってイー・コリＫ１２ＨＢ１０１コン
ピテント細胞を形質転換した。形質転換された細胞を１
００μg／mlのアンピシリンを含有するＬ寒天上にプレ
ートし、アンピシリン耐性形質転換細胞を、そのプラス
ミドＤＮＡを制限酵素分析して所望のイー・コリＫ１２
ＨＢ１０１／pＲＣコロニーを同定することによってス
クリーニングした。実質的に実施例３の方法にしたがっ
て、イー・コリＫ１２ＨＢ１０１／pＲＣ形質転換細胞
から、プラスミドpＲＣ ＤＮＡを得た。約２μgのプラ
スミドpＲＣ ＤＮＡを含有する２μlのＴＥ緩衝液を、
２μlの１０×ＨindＩＩＩ緩衝液と１６μlの水に添加
した。このプラスミドpＲＣ ＤＮＡの溶液に約２μl(約
１０単位)の制限酵素ＨindＩＩＩを添加し、生成した反
応液を３７℃で２時間インキュベートした。ＨindＩＩ
Ｉ消化プラスミドpＲＣ ＤＮＡをエタノールで沈澱さ
せ、２μlの１０×ＢamＨＩ緩衝液と１６μlの水に再懸
濁させた。このＨindＩＩＩ−消化プラスミドpＲＣＤＮ
Ａの溶液に約２μl(約１０単位)の制限酵素ＢamＨＩを
添加し、生成した反応液を３７℃で２時間インキュベー
トした。
【００６２】得られたＢamＨＩ−ＨindＩＩＩ消化プラ
スミドpＲＣ ＤＮＡをフエノールで１回抽出し、次いで
クロロホルムで２回抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈
澱させ、３μlの１０×リガーゼ緩衝液と２０μlの水に
再懸濁させた。得られたＢamＨＩ−ＨindＩＩＩ消化プ
ラスミドpＲＣ ＤＮＡの溶液に、プラスミドpＴＰＡ１
０２の約２．０kbのＨindＩＩＩ−ＢamＨＩ制限断片約
４μg(約５μlのＴＥ緩衝液中)を添加した。このＤＮＡ
混合物に約２μl(約１０００単位)のＴ４ＤＮＡリガー
ゼを添加し、得られた反応液を１６℃で２時間インキュ
ベートした。連結したＤＮＡは所望のプラスミドpＴＰ
Ａ１０３ＤＮＡを形成していた。望ましくない形質転換
細胞を減らすために、連結したＤＮＡを制限酵素ＮcoＩ
で消化した。この酵素はプラスミドpＲＣを切断する
が、プラスミドpＴＰＡ１０３を切断しない。したがっ
て連結ＤＮＡをＮcoＩで消化すると望ましくない形質転
換細胞が減少する。というのは、線状化されたＤＮＡ
は、閉じた環状ＤＮＡよりも低頻度でイー・コリを形質
転換するからである。連結させたＤＮＡを消化するため
に、ＤＮＡをまずエタノールで沈澱させ、次いで２μl
の１０×ＮcoＩ緩衝液(１．５Ｍ ＮaＣl;６０mＭトリス
−ＨＣl、pＨ＝７．８;６０mＭ ＭgＣl2;および１mg／m
l ＢＳＡ)と１６μlの水に再懸濁させた。このＤＮＡ溶
液に約２μl(約１０単位)の制限酵素ＮcoＩを添加し、
得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。
【００６３】上記の連結してＮcoＩで消化したＤＮＡを
用いてイー・コリＫ１２ＲＶ３０８(ＮＲＲＬ Ｂ−１
５６２４)を形質転換した。このイー・コリＫ１２ＲＶ
３０８細胞をコンピテント細胞にし、実施例３の方法に
実質的にしたがって形質転換した。その形質転換混合物
を、１００μg／mlのアンピシリンを含有するＬ寒天上
にプレートした。得られたアンピシリン耐性形質転換細
胞をカナマイシンに対する感受性について試験した。と
いうのは、プラスミドpＲＣはカナマイシン耐性を与え
るがプラスミドpＴＰＡ１０３は与えないからである。
このアンピシリン耐性カナマイシン感受性形質転換細胞
を用いてプラスミドＤＮＡを調製し、得られたプラスミ
ドＤＮＡを制限酵素分析法で試験してイー・コリＫ１２
ＲＶ３０８／pＴＰＡ１０３形質転換細胞を同定した。
実施例３の方法に実質的にしたがって、プラスミドpＴ
ＰＡ１０３ＤＮＡを、イー・コリＫ１２ＲＶ３０８／p
ＴＰＡ１０３細胞から単離した。
【００６４】Ｂ．中間プラスミドpＢＷ２５の構築 約１μgのプラスミドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡを含有する
１μlのＴＥ緩衝液を、２μlの１０×ＢglＩＩ緩衝液と
１６μlの水に添加した。得られたプラスミドpＴＰＡ１
０３ ＤＮＡの溶液に約１μl(約５単位)の制限酵素Ｂgl
ＩＩを添加し、生成した反応液を３７℃で２時間インキ
ュベートした。ＢglＩＩ消化プラスミドpＴＰＡ１０３
ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、５μlの１０×クレノ
ウ緩衝液と４４μlの水に再懸濁させた。得られたＢgl
ＩＩ消化プラスミドpＴＰＡ１０３ＤＮＡの溶液に、約
１μlのクレノウ酵素(約１単位)を添加し、生成した反
応液を１６℃で２時間インキュベートした。クレノウ酵
素で処理したＢglＩＩ消化プラスミドpＴＰＡ１０３ Ｄ
ＮＡをエタノールで沈澱させ、３μlの１０×リガーゼ
緩衝液と２２μlの水に懸濁させた。 下記配列:
【化７】 を有するキナーゼ処理をしていないＮdeＩリンカー(Ｎe
w Ｅngland Ｂiolabs)の約２μl(０．２μg)を、２μ
l(約１０００単位)のＴ４ＤＮＡリガーゼと１μl(約２
単位)のＴ４ ＲＮＡリガーゼとともに、クレノウ酵素で
処理したＢglＩＩ消化プラスミドpＴＰＡ１０３ ＤＮＡ
の溶液に添加し、得られた連結反応液を４℃で一夜イン
キュベートした。連結したＤＮＡはプラスミドpＴＰＡ
１０３derＮdeＩを形成していたが、これは、プラスミ
ドpＴＰＡ１０３がＢglＩＩ認識配列をもっている位置
にＮdeＩ認識配列をもっていること以外、プラスミドp
ＴＰＡ１０３と実質的に同じである。
【００６５】連結したＤＮＡを用いて、実施例２に記載
の方法に実質的にしたがって、イー・コリＫ１２ＲＶ３
０８コンピテント細胞を形質転換した。形質転換細胞を
アンピシリン含有のＬ寒天上にプレートし、イー・コリ
Ｋ１２ＲＶ３０８／pＴＰＡ１０３derＮdeＩ形質転換細
胞を、そのプラスミドＤＮＡを制限酵素分析することに
よって同定した。プラスミドpＴＰＡ１０３derＮdeＩ
ＤＮＡを、実施例３の方法に実質的にしたがって、次の
構築に使うために、形質転換細胞から単離した。約１０
μgのプラスミドpＴＰＡ１０３derＮdeＩ ＤＮＡを含有
する１０μlのＴＥ緩衝液を、２μlの１０×ＡvaＩＩ緩
衝液(０．６Ｍ ＮaＣl;６０mＭトリス−ＨＣl、pＨ＝
８．０;０．１Ｍ ＭgＣl2;６０mＭ２−メルカプトエタ
ノール;および１mg／ml ＢＳＡ)と６μlの水に添加し
た。上記のＤＮＡに約２μl(約１０単位)の制限酵素Ａv
aＩＩを添加し、生成した反応液を３７℃で２時間イン
キュベートした。ＡvaＩＩで消化したＤＮＡをアガロー
スゲルに負荷し電気泳動を行わせて、約１．４kbの制限
断片を他の消化産物から分離した。そのゲルから、プラ
スミドpＴＰＡ１０３derＮdeＩの約１．４kbのＡvaＩＩ
制限断片を単離した。約２μgの所望の断片が得られ、
これを５μlのＴＥ緩衝液に懸濁させた。
【００６６】約５μlの１０×クレノウ緩衝液、３５μl
の水および５μl(約５単位)のクレノウ酵素を、約１．
４kbのＡvaＩＩ制限断片の溶液に添加し、得られた反応
液を１６℃で３０分間インキュベートした。クレノウ酵
素で処理をしたＤＮＡをエタノールで沈澱させ、３μl
の１０×リガーゼ緩衝液と１４μlの水に再懸濁させ
た。 下記配列:
【化８】 を有するＨpaＩリンカー約２μgを、実施例１０Ａの方
法に実質的にしたがってキナーゼ処理をした。キナーゼ
処理をしたリンカー約１０μlを、２μl(約１０００単
位)のＴ４ＤＮＡリガーゼと１μl(約１単位)のＴ４ＲＮ
Ａリガーゼとともに、プラスミドpＴＰＡ１０３derＮde
Ｉのクレノウ酵素で処理をした約１．４kbのＡvaＩＩ制
限断片に加え、得られた反応液を一夜１６℃でインキュ
ベートした。連結したＤＮＡをフエノールで一回抽出し
クロロホルムで２回抽出し、エタノールで沈澱させ、２
μlの１０×ＥcoＲＩ緩衝液と１６μlの水に再懸濁させ
た。上記のＤＮＡ溶液に、約２μl(約１０単位)の制限
酵素ＥcoＲＩを添加し、得られた反応液を３７℃で２時
間インキュベートした。ＥcoＲＩで消化されたＤＮＡを
フエノールで１回、クロロホルムで２回抽出し、エタノ
ールで沈澱させ、３μlの１０×リガーゼ緩衝液と２０
μlの水に再懸濁させた。このようにして調製された断
片は、大きさが約７７０bpでtrpＰＯとＴＰＡのアミノ
末端をコードするが、１つのＥcoＲＩ適合性末端と１つ
の平滑末端とをもっており、それをＥcoＲＩ−ＳmaＩ消
化プラスミドpＵＣ１９に連結させてプラスミドpＵＣ１
９ＴＰＡＦＥを形成させた。
【００６７】約２μlのプラスミドpＵＣ１９(Ｂethesda
Ｒesearch Ｌaboratories社より入手可能)を、２μl
の１０×ＳamＩ緩衝液(０．２Ｍ ＫＣl:６０mＭトリス
−ＨＣl、pＨ＝８．０;６０mＭ ＭgＣl2;６０mＭ２−メ
ルカプトエタノール;および１mg／ml ＢＳＡ)と１６μl
の水に溶解した。このＤＮＡ溶液に約２μl(約１０単
位)の制限酵素ＳamＩを添加し、得られた反応液を２５
℃で２時間インキュベートした。ＳamＩ消化プラスミド
pＵＣ１９ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、遠心分離し
て集め、２μlの１０×ＥcoＩ緩衝液と１６μlの水に再
懸濁させた。生成したＳamＩ消化プラスミドpＵＣ１９
ＤＮＡの溶液に、約２μl(約１０単位)の制限酵素Ｅco
ＲＩを添加し、得られた反応液を３７℃で２時間インキ
ュベートした。生成したＥcoＲＩ−ＳamＩ消化プラスミ
ドpＵＣ１９ＤＮＡをフエノールで１回、クロロホルム
で２回抽出し、５μlのＴＥ緩衝液に再懸濁させた。Ｅc
oＲＩ−ＳamＩ消化プラスミドpＵＣ１９ＤＮＡを、プラ
スミドpＴＰＡ１０３derＮdeＩ由来の約７７０bpのＥco
ＲＩ−平滑末端制限断片を含有する溶液に添加した。こ
のＤＮＡ混合物に、約２μl(約１０００単位)のＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを添加し、生成した反応液を１６℃で一夜
インキュベートした。連結させたＤＮＡは所望のプラス
ミドpＵＣ１９ＴＰＡＦＥを形成していた。
【００６８】プラスミドpＵＣ１９の多クローニング部
位は、プラスミドpＵＣ１９ＴＰＡＦＥの構築に利用さ
れるＥcoＲＩとＳamＩの認識配列を含有しているが、Ｌ
acＺα断片の暗号配列内に位置している。β−ガラクト
シダーゼをコードするlacＺ遺伝子の変異体であるlacＺ
△Ｍ１５変異体を含有する細胞内でlacＺα断片を発現
させれば、これらの細胞から機能的β−ガラクトシダー
ゼ分子を発現させることができ、したがってこれらの細
胞は、無色の化合物であるＸ−Ｇal(５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド)を加水分解して、そのインジゴで着色される加水分
解生成物にすることができる。プラスミドpＵＣ１９の
多クローニング部位にＤＮＡを挿入すると、lacＺα断
片の暗号配列を中断するので、かようなプラスミドの宿
主である、lacＺ△Ｍ１５変異体を有する細胞は、Ｘ−
Ｇalを加水分解できない(この同じ原理はプラスミドpＵ
Ｃ８にクローン化するときに利用されている。実施例２
参照)。プラスミドpＵＣ１９ＴＰＡＦＥを形成した連結
ＤＮＡは、実施例２の方法に実質的にしたがって形質転
換されうるよう、コンピテントにしたイー・コリＫ１２
ＲＲ１△Ｍ１５(ＮＲＲＬ Ｂ−１５４４０)の細胞を形
質転換するのに用いた。
【００６９】形質転換した細胞を、１００μg／mlのア
ンピシリン、４０μg／mlのＸ−Ｇalおよび１mＭＩＰＴ
Ｇを含有するＬ寒天上にプレートした。インジゴ色を示
すことができなかったコロニーを継代培養し、プラスミ
ドＤＮＡを作るのに用い、イー・コリＫ１２ＲＲ１△Ｍ
１５／pＵＣ１９ＴＰＡＦＥ形質転換細胞を、そのプラ
スミドＤＮＡを制限酵素分析することによって同定し
た。プラスミドpＵＣ１９ＴＰＡＦＥ ＤＮＡを、次の構
築に使うために、実施例３の方法に実質的にしたがっ
て、イー・コリＫ１２ＲＲ１△Ｍ１５／pＵＣ１９ＴＰ
ＡＦＥ細胞から単離した。約７μgのプラスミドpＵＣ１
９ＴＰＡＦＥを含有する２０μlのＴＥ緩衝液を、１０
μlの１０×ＨpaＩ緩衝液(０．２Ｍ ＫＣl;０．１Ｍト
リス−ＨＣl、pＨ＝７．４;および０．１Ｍ ＭgＣl2)と
７０μlの水に添加した。約３μl(約６単位)の制限酵素
ＨpaＩをプラスミドpＵＣ１９ＴＰＡＦＥ ＤＮＡの溶液
に添加し、得られた反応液を３７℃で２０分間インキュ
ベートし、ＨpaＩで部分的に消化するように反応時間を
短かく設計した。反応液を、１×ＢamＨＩ緩衝液(１５
０mＭ ＮaＣl;１０mＭトリス−ＨＣl、pＨ＝８．０;お
よび１０mＭ ＭgＣl2;塩の濃度を上げるとＨpaＩを不活
性化する)で１５０μlに調節した。約１μl(約１６単
位)の制限酵素ＢamＨＩを部分的にＨpaＩで消化したＤ
ＮＡの上記溶液に添加し、得られた反応液を３７℃で９
０分間インキュベートした。
【００７０】ＢamＨＩ−部分的−ＨpaＩ消化したpＵＣ
１９ＴＰＡＦＥ ＤＮＡを、エタノールで沈澱させて濃
縮し、１．５％のアガロースゲルに負荷し、レプリコ
ン、β−ラクタマーゼ遺伝子、およびプラスミドpＵＣ
ＡＴＰＡＦＥのＴＰＡをコードするＤＮＡ全部を含有す
る約３．４２kbのＨpaＩ−ＢamＨＩ制限断片を、所望の
断片を含有するゲルのセグメントから切取り、これを凍
結し、次いでセグメントから液体をしぼりだすことによ
って、ゲルから単離した。エタノールで沈澱させて、Ｄ
ＮＡを上記の液体から沈澱させた。約１μgの所望の断
片が得られ、これを２０μlのＴＥ緩衝液に懸濁させ
た。約１０μgのプラスミドpＴＰＡ１０３を含有する１
０μlのＴＥ緩衝液を、１０μlの１０×ＳcaＩ緩衝液
(１．０Ｍ ＮaＣl;６０mＭトリス−ＨＣl、pＨ＝７．
４;６０mＭのＭgＣl2;１０mＭ ＤＴＴ;および１mg／ml
ＢＳＡ)と８０μlの水に溶解した。得られたプラスミド
pＴＰＡ１０３ＤＮＡの溶液に、約３μl(約１８単位)の
制限酵素ＳcaＩを添加し、得られた反応液を３７℃で９
０分間インキュベートした。反応液の体積を、１×Ｂam
ＨＩ緩衝液で１５０μlに調節し、その混合物に約μl
(約１６単位)の制限酵素ＢamＨＩを添加し、３７℃で９
０分間インキュベートした。得られたＤＮＡをエタノー
ルで沈澱させ、遠心分離によって集め、電気泳動に付す
ために再懸濁を行った。ＳcaＩ−ＢamＨＩ消化プラスミ
ドpＴＰＡ１０３ＤＮＡを、１．５％のアガロースゲル
に負荷して電気泳動を行い、約１．０１５kbのＳcaＩ−
ＢamＨＩ制限断片を、他の制限産物から分離した。プラ
スミドpＴＰＡ１０３のＴＰＡカルボキシル末端をコー
ドするＤＮＡを含有する約１．０１５kbのＳcaＩ−Ｂam
ＨＩ制限断片をゲルから単離し、約０．５μgの所望の
断片が得られ、これをガラス容器で蒸留した水２０μl
に溶解した。
【００７１】プラスミドpＵＣ１９ＴＰＡＦＥの約３．
４２kbＢamＨＩ−ＨpaＩ制限断片約２μlと、２μlの１
０×リガーゼ緩衝液と１μlのＴ４ＤＮＡリガーゼ(約１
ワイス単位;このリガーゼは、米国、ウィズコンシン州
５３７１１、マディソン、フィッシュ・ハッチエリー・
ロード、２８００Ｓ．のＰromega Ｂiotec社から入手
した)とともに、プラスミドpＴＰＡ１０３の約１．０１
５kbのＳcaＩ−ＢamＨＩ制限断片約２μlに添加し、得
られた反応液を１６℃で一夜インキュベートした。連結
させたＤＮＡは所望のプラスミドpＢＷ２５を形成して
いた。
【００７２】連結させたＤＮＡは、５０mＭＣaＣl2を使
うことを除いて実施例２の方法に実質的にしたがって、
形質転換されうるようにコンピテントにしたイー・コリ
Ｋ１２ＪＭ１０５(ＢＲＬ社から入手)を形質転換するの
に用いた。形質転換された細胞を１００μg／mlのアン
ピシリンを含有するＢＨＩ(Ｄifco Ｌaboratories社、
米国、ミシガン州、デトロイト)上にプレートし、イー
・コリＫ１２ＪＭ１０５／pＢＷ２５形質転換細胞を、
そのプラスミドＤＮＡを制限酵素分析することによって
同定した。プラスミドpＢＷ２５を制限酵素ＥcoＲＩで
消化することによって約３．３８kbと約１．０８kbの制
限断片が得られる。プラスミドpＢＷ２５は、次の構築
に用いるために、実施例３の方法にしたがって製造され
る。
【００７３】Ｃ．ＴＰＡ暗号領域の部位特異的突然変異
誘発とプラスミドpＢＷ２８の構築 約５μgのプラスミドpＢＷ２５を含有する１０μlのガ
ラス容器蒸留水を、約１０μlの１０×ＨindＩＩＩ反応
緩衝液と８０μlの水に添加した。得られたプラスミドp
ＢＷ２５のＤＮＡの溶液に、約１μl(約２０単位)の制
限酵素ＨindＩＩＩを添加し、生成した反応液を３７℃
で９０分間インキュベートした。得られたＨindＩＩＩ
消化プラスミドpＢＷ２５ＤＮＡの溶液に、約３μl(約
２５単位)の制限酵素ＥcoＲＩと１０μlの１Ｍトリス−
ＨＣl、pＨ＝７．６を添加し、生成した反応液を３７℃
で９０分間インキュベートした。生成したＥcoＲＩ−Ｈ
indＩＩＩ消化プラスミドpＢＷ２５ＤＮＡをエタノール
で沈澱させて濃縮し、１．５％のアガロースゲルに負荷
し、電気泳動に付して約８１０bpのＥcoＲＩ−ＨindＩ
ＩＩ制限断片を他の消化産物から分離した。上記の約８
１０bpのＥcoＲＩ−ＨindＩＩＩ制限断片の約０．５μg
をゲルから単離し、連結用に調製し、ガラス容器で蒸留
した水２０μlに再懸濁した。
【００７４】複製型(ＲＦ)のＭ１３mp８ＤＮＡ(Ｎew
Ｅngland Ｂiolabsから入手できる)約４．５μgを含有
するガラス容器で蒸留した水３５μlを、１０μlの１０
×ＨindＩＩＩ緩衝液と５５μlの水に添加した。得られ
たＭ１３mp８ＤＮＡの溶液に約１μl(約２０単位)の制
限酵素ＨindＩＩＩを添加し、生成した反応液を３７℃
で１時間インキュベートした。得られたＨindＩＩＩ消
化Ｍ１３mp８ＤＮＡの溶液に、約３μl(約２４単位)の
制限酵素ＲcaＲＩと約１０μlの１Ｍトリス−ＨＣl、p
Ｈ＝７．６を添加し、生成反応液を３７℃で１時間イン
キュベートした。ＨindＩＩＩ−ＥcoＲＩ消化Ｍ１３mp
８ＤＮＡをエタノールで沈澱させて集め、アガロースゲ
ル電気泳動に付すために再懸濁を行い、大きな制限断片
をゲル電気泳動法で単離した。Ｍ１３mp８の大きなＥco
ＲＩ−ＨindＩＩＩ制限断片約１μgが得られ、２０μl
のガラス容器蒸留水に懸濁させた。Ｍ１３mp８の大きな
ＥcoＲＩ−ＨindＩＩＩ制限断片約２μl、２μlの１０
×リガーゼ緩衝液、１２μlの水、および約１μl(約１
ワイス単位)のＴ４ＤＮＡリガーゼを、プラスミドpＢＷ
２５の約８１０bpのＥcoＲＩ−ＨindＩＩＩ制限断片３
μlに添加し、生成した連結反応液を１６℃で一夜イン
キュベートした。
【００７５】イー・コリＪＭ１０３細胞(ＢＲＬから入
手できる)を、トランスフエクションに使用されるＤＮ
Ａの量を変えることを除いて、ＢＲＬ社のＭ１３Ｃloni
ng／■Ｄideoxy'Ｓequencing Ｉnstruction Ｍannual
に記載の方法に実質的にしたがって、前記連結混合物で
トランスフエクトした。組換えプラークを、β−ガラク
トシダーゼα−断片をコードする遺伝子の挿入失活(こ
れによって、Ｘ−ガルが切断され、そのインジゴで着色
される切断産物になる性質が失われる)によって、同定
した。スクリーニングするために、６個の白色のプラー
クを、２．５mlのＬブロスに採取し、これに０．４mlの
イー・コリＫ１２ＪＭ１０３を添加し、proＡＢを保持
するＦエピソームを確実に保持するように、対数増殖期
で最少培地中で培養した。プラーク含有溶液を空気振盪
器中、３７℃で８時間インキュベートした。１．５mlづ
つの液から細胞をペレット化し、Ｂirnboim and Ｄol
y、Ｎuc．Ａcids Ｒes．、７巻、１５１３頁１９７９
年のアルカリミニスクリーン法に実質的にしたがって、
ＲＦＤＮＡを単離した。残りの各培養物を４℃で貯蔵し
た。pＭ８ＢＷ２６と呼称される所望のファージは、Ｍ
１３mp８の約７．２kbＥcoＲＩ−ＨindＩＩＩ制限断片
に連結された、プラスミドpＢＷ２５の約８１０bpのＥc
oＲＩ−ＨindＩＩＩ制限断片を含有していた。対数増殖
期のイー・コリＪＭ１０３の約５０mlをpＭ８ＢＷ２６
に感染させて空気振盪器を用いて３７℃で１８時間イン
キュベートした。感染した細胞を低速遠心分離によって
ペレット化し、前記Ｉnstruction Ｍannualの方法をス
ケールアップすることによって、培養上澄み液から一本
鎖pＭ８ＢＷ２６ＤＮＡを調製した。クレノウ反応を室
温で３０分間行い、次に３７℃で６０分間、次に１０℃
で１８時間行うことを除いて、Ａdelmanら、ＤＮＡ２
(３)、１８３〜１９３頁、１９８３年の教示事項に実質
的にしたがって一本鎖pＭ８ＢＷ２６に突然変異を誘発
させた。さらに、Ｓ１処理を２０℃で行い、緩衝液の塩
濃度をメーカーが推奨する濃度の１／２にし、Ｍ１３配
列決定プライマー(ＢＲＬ)を使用した。未変性ＴＰＡの
アミノ酸残基８７〜２６１の暗号配列を欠失させるのに
使用される合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライ
マーは次のとおりである。
【化９】 ５'−GGGAAGTGCTGTGAAATATCCACCTGCGGCCTGAGA−３'
【００７６】得られた突然変異誘発混合物を、前記感染
法に実質的にしたがってイー・コリＫ１２ＪＭ１０３を
トランスフエクトするのに用いた。所望の突然変異体
を、ＲＦＤＮＡの制限酵素分析法と、ＭaxamとＧilbert
のＤＮＡ配列決定法とで同定した。所望の突然変異体
は、未変性のＴＰＡから失欠させた、アミノ酸残基８７
〜２６１の暗号配列をもっていたが、これをpＭ８ＢＷ
２７と命名した。プラスミドpＢＷ２８を構築するに
は、各種のＤＮＡ断片が必要である。これらの断片の第
１のものは、約２０μgのＲＦpＢＷ２７ＤＮＡを含有す
る２０μlのガラス容器蒸留水を、１０μlの１０×Ｎde
Ｉ緩衝液と６０μlの水に添加することによって得た。
約１０μl(約５０単位)の制限酵素ＮdeＩをプラスミドp
ＢＷ２７ＤＮＡの混合物に添加し、得られた反応液を３
７℃で２時間インキュベートした。上記のＮdeＩ消化プ
ラスミドpＢＷ２７ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、遠
心分離で集め、１０μlの１０×ＥcoＲＩ緩衝液と９０
μlの水に再懸濁させた。このＮdeＩ消化プラスミドpＭ
８ＢＷ２７ＤＮＡの溶液に約１０μl(約５０単位)の制
限酵素ＥcoＲＩを添加し、得られた反応液を３７℃で２
時間インキュベートした。ＥcoＲＩ−ＮdeＩ消化プラス
ミドpＭ８ＢＷ２７ＤＮＡを、アガロースゲルによる電
気泳動に付して、約５６０bpのＮdeＩ−ＥcoＲＩ制限断
片を他の消化産物から分離したが、この断片は欠失部位
にのびるＴＰＡ暗号配列の部分を含有している。約５６
０bpのＮdeＩ−ＥcoＲＩ制限断片をゲルから単離し、約
０．５μgの所望の断片が得られ、２０μlのガラス容器
蒸留水に懸濁させた。
【００７７】プラスミドpＢＷ２８を構築するのに必要
な第２の断片は、自動ＤＮＡ合成機で一度に合成される
一本鎖である。その２つの相補的連鎖は、ハイブリッド
を形成して、ＸbaＩとＮdeＩのオーバーラップを有する
二本鎖ＤＮＡセグメントを生成するが、実施例９Ａの方
法に実質的にしたがってキナーゼ処理を行いアニールさ
れる。そのリンカーの構造は次のとおりである。
【化１０】 プラスミドpＢＷ２８を構築するのに必要な第３の断片
は、約２０μgのプラスミドpＴＰＡ１０３を含有する２
０μlのＴＥ緩衝液を、１０μlの１０×ＢamＨＩ緩衝液
と６０μlの水に添加することによって調製した。約１
０μl(約５０単位)の制限酵素ＢamＨＩを上記のプラス
ミドpＴＰＡ１０３ＤＮＡの溶液に加え、生成した反応
混合物を３７℃で２時間インキュベートした。生成した
ＢamＨＩ消化プラスミドpＴＰＡ１０３ＤＮＡをエタノ
ールで沈澱させ、遠心分離により集め、１０μlの１０
×ＥcoＲＩ緩衝液と８０μlの水に再懸濁させた。得ら
れたＢamＨＩ消化プラスミドpＴＰＡ１０３ＤＮＡの溶
液に約１０μl(約５０単位)の制限酵素ＥcoＲＩを添加
し、生成した反応液を３７℃で２時間インキュベートし
た。ＢamＨＩ−ＥcoＲＩ消化プラスミドpＴＰＡ１０３
ＤＮＡをアガロースゲルに負荷し、電気泳動に付して、
約６８９bpのＥcoＲＩ−ＢamＨＩ制限断片(ＴＰＡのカ
ルボキシル末端の暗号配列を含有している)を他の消化
産物から分離した。約０．５μgの約６８９bpの断片を
ゲルから単離し、次に１０μlのガラス容器蒸留水に再
懸濁させた。
【００７８】プラスミドpＢＷ２８を構築するのに必要
な最後の断片はプラスミドpＬ１１０から単離した。プ
ラスミドpＬ１１０の構築は実施例９d、すなわちこの実
施例の次の節に開示されている。約２５μgのプラスミ
ドpＬ１１０を含有する２５μlのＴＥ緩衝液を、１０μ
lの１０×ＸbaＩ緩衝液(０．５Ｍ ＮaＣl;６０mＭトリ
ス−ＨＣl、pＨ＝７．９;６０mＭ ＭgＣl2;および１mg
／ml ＢＳＡ)と５５μlの水に添加した。生成したプラ
スミドpＬ１１０ＤＮＡの溶液に約１０μl(約５０単位)
の制限酵素ＸbaＩを添加し、得られた反応液を３７℃で
２時間インキュベートした。ＸbaＩ消化プラスミドpＬ
１１０ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、遠心分離により
集め、１０μlの１０×ＢamＨＩ緩衝液と８９μlのＨ2
Ｏに再懸濁させた。得られたＸbaＩ消化プラスミドpＬ
１１０ＤＮＡの溶液に約１μl(約５単位)の制限酵素Ｂa
mＨＩを添加し、生成した反応液を３７℃で３０分間イ
ンキュベートして部分的にＢamＨＩで消化した。ＸbaＩ
で消化しＢamＨＩで部分的に消化したプラスミドpＬ１
１０ＤＮＡをアガロースゲルに負荷し電気泳動に付して
約６．０kbのＸbaＩ−ＢamＨＩ断片を他の消化産物から
明確に分離した。ゲルから約６．０kbの制限断片を単離
したが、約６．０kbのＸbaＩ−ＢamＨＩ制限断片約０．
５μgが得られ、約４０μlのガラス容器蒸留水に懸濁さ
せた。この約６．０kbのＸbaＩ−ＢamＨＩ制限断片は、
ＥＫ−ＢＧＨをコードするＤＮＡを除いてプラスミドp
Ｌ１１０全体を含有している。
【００７９】プラスミドpＢＷ２８を構築するには、以
下の断片をともに混合する。すなわち、プラスミドpＬ
１１０の約６．０kbＢamＨＩ−ＸbaＩ制限断片の約０．
１μg(約８μl);プラスミドpＭ８ＢＷ２７の約５６０bp
のＮdeＩ−ＥcoＲＩ制限断片の約０．０５μg(約２μ
l);プラスミドpＴＰＡ１０３の約６８９bpのＥcoＲＩ−
ＢamＨＩ制限断片の約０．１μg(約２μl);および約４
５bpのＸbaＩ−ＮdeＩ合成リンカーの約０．０２μg(約
１μl)である。このＤＮＡ混合物に約２μlの１０×リ
ガーゼ緩衝液と１μl(約１ワイス単位)のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを添加し、得られた連結液を４℃で一夜２時間イ
ンキュベートした。連結されたＤＮＡは所望のプラスミ
ドpＢＷ２８を形成していた。連結されたＤＮＡは、コ
ンピテント細胞にされたイー・コリＫ１２ＭＭ２９４
(ＮＲＲＬ Ｂ−１５６２５)を、５０mＭ ＣaＣl2を使
用することを除いて実施例２の方法に実質的にしたがっ
て形質転換するのに使用した。プラスミドpＢＷ２８上
にλpＬプロモーターと温度感受性λpＬレプレッサーを
コードする遺伝子が存在するので、形質転換法と形質転
換体の培養をいくぶん変更した。細胞は、形質転換とこ
れに続く培養中３２℃を超える温度には暴露しなかっ
た。この実施例の次の節で、λpＬプロモーターとその
温度感受性レプレッサーをコードするプラスミドを扱う
方法についてより詳細に述べる。所望のイー・コリＫ１
２ＭＭ２９４／pＢＷ２８形質転換体を、そのテトラサ
イクリン耐性のアンピシリン感受性表現型およびそのプ
ラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した。
【００８０】Ｄ．プラスミドpＬ１１０の構築 プラスミドpＫＣ２８３を出発物質と用いて、プラスミ
ドpＬ１１０を構築した。イー・コリＫ１２ＢＥ１２０
１／pＫＣ２８３の凍結乾燥品がＮＲＲＬから受入れ番
号ＮＲＲＬ Ｂ−１５８３０で得られる。この凍結乾燥
品を、Ｌブロスが１０mlづつ入った試験管にデカントし
て３２℃で２時間インキュベートし、次いで培養物にア
ンピシリンを添加して５０μg／mlの濃度とし、次に３
２℃で一夜インキュベートした。イー・コリＫ１２ＢＥ
１２０１／pＫＣ２８３細胞を３２℃で培養した理由
は、プラスミドpＫＣ２８３がpＬプロモーターを含有
し、イー・コリＫ１２ＢＥ１２０１細胞が細胞ＤＮＡに
組込まれた温度感受性cＩレプレッサー遺伝子を含有し
ているからである。このプラスミド単離法で利用される
細胞が、野生型λpＬレプレッサー遺伝子を含有してい
るか、またはλpＬプロモーターを含有していない場合
は、以下の実施例で述べるように、インキュベーション
温度は３７℃である。
【００８１】一夜培養物の少量部分を、イー・コリＫ１
２ＢＥ１２０１／pＫＣ２８３の単コロニー単離物を得
る方法で、５０μg／mlアンピシリンを含有するＬ寒天
プレート上に置いた。得られた単コロニーを、５０μg
／mlのアンピシリンを含有するＬブロス１０mlに接種
し、はげしく振盪しながら３２℃で一夜インキュベート
した。この一夜培養物１０mlを５００mlのＬブロスに接
種し、培養物が定常期に到達するまではげしく振盪しな
がら３２℃でインキュベートした。この細胞から、実施
例３の方法に実質的にしたがってプラスミドpＫＣ２８
３ＤＮＡを調製した。約１mgのプラスミドpＫＣ２８３
が得られ、ＴＥ緩衝液中、約１μg／μlの濃度で、４℃
にて貯蔵した。約１０μl(約１０μg)のプラスミドpＫ
Ｃ２８３ＤＮＡを、２０μlの１０×培地塩制限緩衝液
(５００mＭ ＮaＣl;１００mＭトリス−ＨＣl、pＨ＝
７．５;１００mＭ ＭgＣl2;および１０mＭ ＤＴＴ)、２
０μlの１mg／ml ＢＳＡ、５μlの制限酵素ＰvuＩＩ(約
２５単位)、ならびに１４５μlの水と混合し、得られた
反応液を３７℃で２時間インキュベートした。本願に記
載されている制限酵素反応は、通常、フエノールによる
抽出とこれに続くクロロホルムによる抽出で終止させ、
次いでＤＮＡを沈澱させ、エタノールで洗浄し、生成し
たＤＮＡをＴＥ緩衝液に再懸濁させる。上記のようにＰ
vuＩＩ消化を終止させた後、生成したＰvuＩＩ消化プラ
スミドpＫＣ２８３ＤＮＡを沈澱させ、次に５μlのＴＥ
緩衝液に再懸濁させた。
【００８２】約６００ピコモル(pＭ)のＸhoＩリンカー
(５'−ＣＣＴＣＧＡＧＧ−３')を、１０μlの５×キナ
ーゼ緩衝液(３００mＭトリス−ＨＣl、pＨ＝７．８;５
０mＭＭgＣl2;および２５mＭ ＤＴＴ)、５μlの５mＭ
ＡＴＰ、２４μlの水、０．５μlのＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ(Ｐ−Ｌ Ｂiochemicals社によって定義され
ている約２．５単位)、５μlの１mg／ml ＢＳＡ、およ
び５μlの１０mＭスペルミジンを含有する混合物中で、
３７℃で３０分間インキュベートすることによってキナ
ーゼ処理を行った。約１２．５μlのキナーゼ処理をし
たＸhoＩリンカーを、５μlのＰvuＩＩ消化プラスミドp
ＫＣ２８３ＤＮＡに添加し、次いで２．５μlの１０×
リガーゼ緩衝液、２．５μlのＴ４ＤＮＡリガーゼ(Ｐ−
Ｌ Ｂiochemicals社によって定義されている約２．５
単位)、２．５μlの１０mＭスペルミジン、および１
２．５μlの水を上記のＤＮＡに添加した。得られた連
結反応液を４℃で一夜インキュベートした。連結反応の
後、反応混合物を、高塩緩衝液(０．１Ｍ ＮaＣl;０．
０５Ｍトリス−ＨＣl、pＨ＝７．５;１０．０mＭ ＭgＣ
l2;および１mＭ ＤＴＴ)の組成に調節した。この混合物
に約１０μl(１００単位)の制限酵素ＸhoＩを添加し、
得られた反応液を３７℃で２時間インキュベートした。
反応を終止させ、ＸhoＩ消化ＤＮＡを沈澱させて、再懸
濁させ、ＸhoＩリンカーを連結混合物に添加しないこと
を除いて上記のように連結した。連結させたＤＮＡは所
望のプラスミドpＫＣ２８３ＰＸを形成していた。
【００８３】イー・コリＫ１２ＭＯ(λ＋)は、ＮＲＲＬ
から受入れ番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５９９３で入手できる
が、野生型λpＬcＩレプレッサー遺伝子を含有するの
で、λpＬプロモーター由来の転写はイー・コリＫ１２
ＭＯ(λ＋)細胞では起こらない。イー・コリＫ１２ＭＯ
(λ＋)の単コロニーが単離され、その細胞の１０mlの一
夜培養物を作製するが、増殖培地にアンピシリンは使用
されていない。５０μlの一夜培養物を用いて、５mlの
Ｌブロスに接種したが、このＬブロスは１０mＭＭgＳＯ
4と１０mＭ ＭgＣl2を含有している。培養物をはげしく
振盪しながら３７℃で一夜インキュベートした。翌朝、
培養物を、１０mＭ ＭgＳＯ4と１０mＭＭgＣl2を含有す
るＬブロスで２００mlまで希釈した。この希釈培養物
を、Ｏ．Ｄ．590が約０．５になるまで、はげしく振盪
しながら３７℃でインキュベートした。Ｏ．Ｄ．590の
上記の値は細胞密度が約１×１０8細胞／mlであること
を示している。培養物を氷水浴中で１０分間冷却し、４
℃で１０分間４０００×gで遠心分離して細胞を集め
た。得られた細胞をペレットを１００mlの１０mＭ冷Ｎa
Ｃlに再懸濁させ、次いで直ちに遠心分離によって再ペ
レット化した。細胞ペレットを１００mlの３０mＭ Ｃa
Ｃl2に再懸濁させて、氷上で２０分間インキュベートし
た。
【００８４】細胞を遠心分離によって再び集めて１０ml
の３０mＭ ＣaＣl2に再懸濁させた。この細胞の０．５m
lをさきに調製した連結ＤＮＡに添加し、そのＤＮＡの
ＣaＣl2濃度を３０mＭにした。得られた細胞−ＤＮＡ混
合物を、氷上で１時間インキュベートし、９０秒間４２
℃で熱ショックを与え、次いで氷上で約２分間冷却し
た。得られた細胞−ＤＮＡ混合物を、１２５mlのフラス
コに入れた１０mlのＬＢ培地に入れて希釈し、３７℃で
１時間インキュベートした。１００μlづつを、アンピ
シリンを含有するＬ寒天プレート上にプレートし、コロ
ニーが現われるまで３７℃でインキュベートした。生成
した各コロニーを別個に培養し、個々のコロニーのプラ
スミドＤＮＡを制限酵素分析法とゲル電気泳動法によっ
て試験した。プラスミドＤＮＡの単離は実施例３の方法
にしたがって小規模に実施したが、ＣsＣlの勾配段階は
所望のイー・コリＫ１２ＭＯ(λ＋)／pＫＣ２８３ＰＸ
形質転換細胞が同定されるまで省略した。
【００８５】１０μgのプラスミドpＫＣ２８３ＰＸ Ｄ
ＮＡを、２０μlの１０×高塩緩衝液、２０μlの１mg／
ml ＢＳＡ、５μl(約５０単位)の制限酵素ＢglＩＩ、５
μl(約５０単位)の制限酵素ＸhoＩおよび１５０μlの水
に溶解し、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベ
ートした。反応を停止させ、ＢglＩＩ−ＸhoＩ消化ＤＮ
Ａを沈澱させ、そのＤＮＡを５μlのＴＥ緩衝液に再懸
濁させた。ＢglＩＩとＸhoＩの制限酵素による切断に特
徴的な一本鎖ＤＮＡの断端を有するＤＮＡリンカーを自
動ＤＮＡ合成器を用いて合成し、実施例９Ａに記載して
いるようにしてキナーゼ処理をした。そのＤＮＡリンカ
ーは以下の構造を有する。
【化１１】
【００８６】上記リンカーとＢglＩＩ−ＸhoＩ消化プラ
スミドpＫＣ２８３ＰＸを、上記の連結法に実質的にし
たがって連結した。連結したＤＮＡは所望のプラスミド
pＫＣ２８３−Ｌを形成していた。プラスミドpＫＣ２８
３−Ｌ ＤＮＡを、イー・コリＫ１２ＭＯ(λ＋)の形質
転換に用い、得られたイー・コリＫ１２ＭＯ(λ＋)／p
ＫＣ２８３−Ｌ形質転換細胞を、そのアンピシリン耐性
表現型と、そのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によっ
て同定した。約１０μgのプラスミドpＫＣ２８３−Ｌの
ＤＮＡを、２０μl１０×高塩緩衝液、２０μlの１mg／
ml ＢＳＡ、５μl(約５０単位)の制限酵素ＸhoＩ、およ
び１５５μlの水に溶解し、生成した反応液を３７℃で
２時間インキュベートした。ＸhoＩで消化したプラスミ
ドpＫＣ２８３−Ｌ ＤＮＡを沈澱させ、２μl−１０×
ニックトランスレーション緩衝液(０．５Ｍトリス−Ｈ
Ｃl、pＨ＝７．２;０．１Ｍ ＭgＳＯ4;および１mＭ Ｄ
ＴＴ)、各デオキシヌクレオチド三リン酸が２mＭの溶液
１μl、１５μlの水、１μlのクレノウ酵素(Ｐ−Ｌ Ｂ
iochemicals社が定義している約６単位)、ならびに１μ
lの１mg／mlＢＳＡに再懸濁させた。得られた反応液を
２５℃で３０分間インキュベートし、次いで溶液を７０
℃で５分間インキュベートすることによって反応を停止
させた。
【００８７】ＢamＨＩリンカー(５'−ＣＧＧＧＡＴＣＣ
ＣＧ−３')をキナーゼ処理し、ＸhoＩで消化してクレノ
ウ酵素で処理したプラスミドpＫＣ２８３−Ｌ ＤＮＡ
に、上記のリンカー連結法に実質的にしたがって連結し
た。連結反応の後、ＤＮＡを、高塩緩衝液中３７℃で約
２時間約１００単位のＢamＨＩで消化した。ＢamＨＩに
よる消化の後、ＤＮＡを連結用に調製し、次いで約５．
９kbのＢamＨＩ制限断片を連結によって環状にし、この
環状ＤＮＡを用い、上記方法に実質的にしたがってイー
・コリＫ１２ＭＯ(λ＋)を形質転換した。イー・コリＫ
１２ＭＯ(λ＋)／pＫＣ２８３−ＬＢ形質転換細胞を同
定し、次に、実施例３の方法に実質的にしたがって上記
形質転換細胞からプラスミドpＫＣ２８３−ＬＢ ＤＮＡ
を製造した。約１０μgのプラスミドpＫＣ２８３ＰＸ
を、高塩緩衝液中、制限酵素ＳalＩで消化し、クレノウ
酵素で処理し、上記の方法に実質的にしたがってＥcoＲ
Ｉリンカー(５'−ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣ−３')に連
結した。制限酵素ＥcoＲＩで消化(約２．１kbのＤＮＡ
を切除することになる)した後、約４．０kbのＥcoＲＩ
制限断片を連結して環状にしてプラスミドpＫＣ２８３
ＰＲＳを得た。連結したＤＮＡを用いてイー・コリＫ１
２ＭＯ(λ＋)を形質転換し、イー・コリＫ１２ＭＯ(λ
＋)／pＫＣ２８３ＰＲＳ形質転換細胞に同定した後、実
施例３の方法に実質的にしたがって、プラスミドpＫＣ
２８３ＰＲＳ ＤＮＡを上記形質転換細胞から製造し
た。
【００８８】約１０μgのプラスミドpＫＣ２８３ＰＲＳ
を、２００μlの高塩緩衝液中、制限酵素ＰstＩとＳph
Ｉの各々約５０単位で消化した。反応液を３７℃で約２
時間インキュベートした後、生成した反応混合物を、
０．６％低ゲル化温度アガロース(米国、メイン州０４
８４１、ロックランド、ＦＭＣ Ｃorporation、Ｍarin
eＣolloids Ｄivision)のゲル上で、トリス−アセテー
ト緩衝液中約１３０Ｖおよび約７５mＡで２〜３時間電
気泳動に付した。そのゲルを臭化エチジウムの希薄溶液
で染色して、約０．８４kbのＰstＩ−ＳphＩ制限断片を
構成するＤＮＡのバンドを長波長の紫外線によって目視
可能し、小さなセグメントのゲルから切取った。セグメ
ントの体積を、セグメントの重量と密度によって測定
し、同じ体積の１０mＭトリス−ＨＣl、pＨ７．６を、
該セグメントの入っている試験管に添加した。次にその
セグメントを７２℃でインキュベートすることによって
溶融させた。プラスミドpＫＣ２８３ＰＲＳの約０．８
５kbのＰstＩ−ＳphＩ制限断片約１μgが約１００μlの
体積で得られた。類似の方法で、プラスミドpＫＣ２８
３−ＬＢを制限酵素ＰstＩとＳphＩで消化し、得られた
約３．０kbの制限断片を、アガロースゲル電気泳動法で
単離し、連結用に調製した。
【００８９】プラスミドpＫＣ２８３ＰＲＳの約０．８
５kbのＰstＩ−ＳphＩ制限断片を、プラスミドpＫＣ２
８３−ＬＢの約３．０kbのＰstＩ−ＳphＩ制限断片に連
結した。連結させたＤＮＡは所望のプラスミドpＬ３２
を形成していた。プラスミドpＬ３２を用いてイー・コ
リＫ１２ＭＯ(λ＋)細胞を形質転換させ、そのイー・コ
リＫ１２(λ＋)／pＬ３２形質転換細胞から、実質的に
実施例３の方法にしたがってプラスミドpＬ３２ＤＮＡ
を製造した。プラスミドpＬ３２のＤＮＡを分析した結
果、１つ以上のＥcoＲＩリンカーが、プラスミドpＫＣ
２８３ＰＸのクレノウ酵素で処理されたＳalＩ断端に連
結していることが分かった。１つ以上のＥcoＲＩリンカ
ーが存在しても、プラスミドpＬ３２、もしくはプラス
ミドpＬ３２の誘導体の有用性には影響せず、ＸhoＩ制
限部位の存在によって検出でき、このＸhoＩ制限部位
は、２つのＥcoＲＩリンカーがともに連結されている場
合はいつでも生成している。プラスミドpＣＣ１０１
は、１９８４年３月６日に出願された米国特許願第５８
６,５８１号(代理人整理番号Ｘ−５８７２Ａ)の実施例
３に開示されている。この出願は本願に援用する。ＥＫ
−ＢＧＨをコードするＤＮＡを単離するために、約１０
μgのプラスミドpＣＣ１０１を、制限酵素ＸbaＩとＢam
ＨＩを各々約５０単位含有する高塩緩衝液２００μl中
で消化した。消化産物をアガロースゲル電気泳動法で分
離し、ＥＫ−ＢＧＨをコードする約０．６kbのＸbaＩ−
ＢamＨＩ制限断片をゲルから単離し、連結用に調製し
た。
【００９０】プラスミドpＬ３２も制限酵素ＸbaＩとＢa
mＨＩで消化し約３．９kbの制限断片を単離し、連結用
に調製した。プラスミドpＬ３２の約３．９kbＸbaＩ−
ＢamＨＩ制限断片を、プラスミドpＣＣ１０１の約０．
６kbのＸbaＩ−ＢamＨＩ制限断片に連結してプラスミド
pＬ４７を得た。プラスミドpＬ４７を用いて、イー・コ
リＫ１２ＭＯ(λ＋)を形質転換し、イー・コリＫ１２Ｍ
Ｏ(λ＋)／pＬ４７形質転換細胞を同定した。この形質
転換細胞から実施例３の方法に実質的にしたがって、プ
ラスミドpＬ４７ＤＮＡを製造した。プラスミドpＰＲ１
２は、温度感受性pＬレプレッサー遺伝子cＩ８５７と、
プラスミドpＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性を供与
する遺伝子を含有している。プラスミドpＰＲ１２は、
１９８４年３月１３日に特許を付与された米国特許第
４,４３６,８１５号に開示され特許請求がなされてい
る。
【００９１】約１０μgのプラスミドpＰＲ１２を、２０
０μlの高塩緩衝液中、約５０単位の制限酵素ＥcoＲＩ
で、３７℃にて２時間消化した。ＥcoＲＩ消化プラスミ
ドpＰＲ１２ＤＮＡを沈澱させ、次いで上記の方法に実
質的にしたがってクレノウ酵素で処理した。クレノウ反
応の後、ＥcoＲＩで消化されクレノウ酵素で処理された
プラスミドpＰＲ１２のＤＮＡを連結によって再度環状
化し、その連結ＤＮＡは、所望のプラスミドpＰＲ１２
△Ｒ１を形成していたが、このプラスミドを用いてイー
・コリＫ１２ＲＶ３０８(ＮＲＲＬ Ｂ−１５６２４)を
形質転換した。形質転換細胞は、テトラサイクリン(１
０μg／ml)耐性に基づいて選択した。イー・コリＫ１２
ＲＶ３０８／pＰＲ１２△Ｒ１形質転換細胞を同定した
後、プラスミドpＰＲ１２△Ｒ１を、実施例３の方法に
実質的にしたがって形質転換細胞から製造した。
【００９２】約１０μgのプラスミドpＰＲ１２△Ｒ１
を、２００μlの培地塩緩衝液中、約５０単位の制限酵
素ＡvaＩで、３７℃にて２時間消化した。ＡvaＩ消化プ
ラスミドpＰＲ１２△２１ＤＮＡを沈澱させ、クレノウ
酵素で処理した。クレノウ反応の後、ＡvaＩで消化して
クレノウ酵素で処理したプラスミドpＰＲ１２△Ｒ１Ｄ
ＮＡをＥcoＲＩリンカー(５'−ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴ
Ｃ−３')に連結し、沈澱させ、約５０単位の制限酵素Ｅ
coＲＩを含有する約２００μlの高塩緩衝液に再懸濁さ
せ、３７℃で約２時間インキュベートした。ＥcoＲＩに
よる消化の後、得られた反応混合物を低温溶融性アガロ
ースゲルに負荷し、約５．１kbのＥcoＲＩ制限断片をゲ
ルから精製し、連結して再び環状化して所望のプラスミ
ドpＰＲ１２ＡＲ１を得た。プラスミドpＰＲ１２ＡＲ１
のＤＮＡを用いてイー・コリＫ１２ＲＶ３０８を形質転
換したが、形質転換細胞の選択はテトラサイクリン耐性
に基づいて行った。この形質転換体から、実施例３の方
法に実質的にしたがってプラスミドpＰＲ１２ＡＲ１Ｄ
ＮＡを製造した。約１０μgのプラスミドpＰＲ１２ＡＲ
１のＤＮＡを、制限酵素ＰstＩのＥcoＲＩを各々約５０
単位づつ含有する約２００mlの高塩緩衝液に懸濁させ、
得られた消化反応液を３７℃で約２時間インキュベート
した。次に反応混合物をアガロースゲルに負荷し、プラ
スミドpＰＲ１２ＡＲ１の約２．９kbのＰstＩ−ＥcoＲ
Ｉ制限断片を単離し、連結用に調製した。
【００９３】約１０μgのプラスミドpＬ４７を、２００
μlの高塩緩衝液中、制限酵素ＰstＩとＢamＨＩで、３
７℃にて２時間消化した。ＰstＩ−ＢamＨＩ消化ＤＮＡ
をアガロースゲルに負荷し、複製起点と、アンピシリン
耐性を供与する遺伝子の部分を含有する約２．７kbのＰ
stＩ−ＢamＨＩ制限断片を単離し連結用に調製した。別
の反応で、約１０μgのプラスミドpＬ４７ＤＮＡを、２
００μlの高塩緩衝液中、制限酵素ＥcoＲＩとＢamＨＩ
とで３７℃にて２時間消化して、λpＬ転写活性化配
列、イー・コリlpp翻訳活性化配列、およびＥＫ−ＢＧ
ＨをコードするＤＮＡを含有する約１．０３kbのＥcoＲ
Ｉ−ＢamＨＩ制限断片を単離して連結用に調製した。プ
ラスミドpＬ４７の、約２．７kbのＰstＩ−ＢamＨＩ制
限断片と約１．０３kbのＥcoＲＩ−ＢamＨＩ制限断片
を、プラスミドpＰＲ１２ＡＲ１の約２．９kbのＰstＩ
−ＥcoＲＩ制限断片に連結してプラスミドpＬ１１０を
構築し、この連結させたＤＮＡを用いてイー・コリＫ１
２ＲＶ３０８を形質転換させた。テトラサイクリン耐性
を、形質転換細胞を選択する基準として利用した。２つ
のＰstＩ制限酵素認識部位がＥＫ−ＢＧＨのコドン領域
に存在するが添付図面の制限部位と機能地図には示して
いない。
【００９４】Ｅ．プラスミドpＢＷ３２の最終的な構築 約１０μgのプラスミドpＳＶ２−β−グロビンＤＮＡ
(ＮＲＲＬ Ｂ−１５９２８)を、１０μlの１０×Ｈind
ＩＩＩ反応緩衝液、５μl(約５０単位)の制限酵素Ｈind
ＩＩＩ、および８５μlの水に溶解し、この反応液を３
７℃で２時間放置した。次に反応混合物のＬiＣlを０．
１５Ｍにし、２．５倍体積のエタノールを添加してドラ
イアイス−エタノール浴でインキュベートした後、ＤＮ
Ａを遠心分離でペレット化した。得られたＤＮＡペレッ
トを、１０μlの１０×ＢglＩＩ緩衝液、５μl(約５０
単位)の制限酵素ＢglＩＩおよび８５μlの水に溶解し、
得られた反応液を３７℃で２時間放置した。ＢglＩＩで
消化の後、反応混合物を０．８５％のアガロースゲルに
負荷し、断片を電気泳動法で分離した。臭化エチジウム
と紫外線を用いてゲルを目視可能にし、所望の約４．２
kbのＨindＩＩＩ−ＢglＩＩ断片を含むバンドを、前記
のようにしてゲルから切取った。ペレットを１０μlの
水に再懸濁させたが、このペレットは、プラスミドpＳ
Ｖ２−β−グロビンの所望の約４．２kbのＨindＩＩＩ
−ＢglＩＩ制限断片約５μgを形成していた。ＴＰＡを
コードする、プラスミドpＴＰＡ１０３の約２．０kbの
ＨindＩＩＩ−ＢamＨＩ制限断片を、前記教示事項に実
質的にしたがってプラスミドpＴＰＡ１０３から単離し
た。プラスミドpＴＰＡ１０３の約２．０kbのＨindＩＩ
Ｉ−ＢamＨＩ制限断片の約５μgが得られ、１０μlの水
に懸濁し、−２０℃で貯蔵した。
【００９５】プラスミドpＳＶ２−β−グロビンの約
４．２kbのＢglＩＩ−ＨindＩＩＩ制限断片２μlと、プ
ラスミドpＴＰＡ１０３の約２．０kbのＨindＩＩＩ−Ｂ
glＩＩ断片４μlを混合し、次いで、２μlの１０×リガ
ーゼ緩衝液、１１μlの水、および１μlのＴ４リガーゼ
(約５００単位)とともに、４℃で一夜インキュベートし
た。形質転換されうるようにコンピテント細胞にされた
イー・コリＫ１２ＲＲ１細胞(ＮＲＲＬ Ｂ−１５２１
０)を、上記の連結させたＤＮＡを使用し、実施例２の
教示事項に実質的にしたがって形質転換した。プラスミ
ドＤＮＡを、イー・コリＫ１２ＲＲ１／pＴＰＡ３０１
形質転換細胞から、実施例３の方法に実質的にしたがっ
て得た。プラスミドpＳＶ２−dhfrは、形質転換された
真核細胞の選択と、dhfr遺伝子に共有結合で連結された
ＤＮＡの増幅とに有用なデヒドロ葉酸レダクターゼ(dhf
r)を含有している。１０μgのプラスミドpＳＶ２−dhfr
(イー・コリＫ１２ＨＢ１０１／pＳＶ２−dhfr、ＡＴＣ
Ｃ３７１４６から単離されたもの)を、１０μlの１０×
ＰvuＩＩ緩衝液、２μl(約２０単位)のＰvuＩＩ制限酵
素および８８μlの水と混合し、得られた反応液を３７
℃で２時間インキュベートした。反応を、フエノールと
クロロホルムの抽出によって終止させ、次にＰvuＩＩ消
化プラスミドpＳＶ２−dhfrＤＮＡを沈澱させ遠心分離
によって集めた。
【００９６】ＢamＨＩリンカー(５'−ＣＧＧＡＴＣＣＣ
Ｇ−３')をキナーゼ処理し、以下の方法で連結用に調製
した。１μgのリンカー含有の５μlの水に、１０μlの
５×キナーゼ塩(３００mＭトリス−ＨＣl、pＨ＝７．
８;５０mＭ ＭgＣl2;および２５mＭ ＤＴＴ)、５μlの
５mＭ ＡＴＰ、５μlのＢＳＡ(１mg／ml)、５μlの１０
mＭスペルミジン、１９μlの水、ならびに１μlのポリ
ヌクレオチドキナーゼ(１０単位／μl)を添加した。こ
の反応液を３７℃で６０分間インキュベートして−２０
℃で貯蔵した。５μl(約５μg)のＰvuＩＩ消化プラスミ
ドpＳＶ２−dhfrと、１２μl(約０．２５μg)のキナー
ゼ処理をしたＢamＨＩリンカーとを混合し、１１μlの
水、２μlの１０×リガーゼとともに、１６℃で一夜イ
ンキュベートした。上記の連結反応混合物に、１０μl
の１０×ＢamＨＩ反応緩衝液、１０μl(約５０単位)の
ＢamＨＩ制限酵素および４８μlの水を添加し、次いで
３７℃で３時間インキュベートした。反応液を１％アガ
ロースゲルに負荷し、所望の約１．９kbの断片(dhfr遺
伝子を含有)をゲルから単離した。これらの実施例で製
造したリンカー付加物は、アガロースゲルで通常どおり
に精製して、最終ベクター中に多くのリンカー配列が入
る可能性を少なくした。得られた約３μgの断片を１０
μlのＴＥ緩衝液に懸濁させた。
【００９７】次に、約１５μl(約１μg)のプラスミドp
ＴＰＡ３０１を上記のようにＢamＨＩ制限酵素によって
消化した。プラスミドpＴＰＡ３０１中には非反復Ｂam
ＨＩ部位があるので、このＢamＨＩ消化によって線状の
プラスミドpＴＰＡ３０１ＤＮＡが生成する。ＢamＨＩ
消化プラスミドpＴＰＡ３０１をエタノールで沈澱さ
せ、９４μlの水に再懸濁させ、１μlの仔ウシ腸アルカ
リフォスファターゼ(米国、マサチューセッツ州０２１
７３、レキシントン、スプリング・ストリート１２８、
Ｃollaboratine Ｒesearch社)と５μlの１Ｍトリス−
ＨＣl、pＨ＝９．０を用いて６５℃にて４５分間ホスフ
ァターゼ処理を行った。上記ＤＮＡをフエノール:クロ
ロホルムで抽出し次にクロロホルム:イソアミルアルコ
ールで抽出し、エタノールで沈澱させ、２０μlの水に
再懸濁させた。１０μl(約０．２５μg)のホスファター
ゼ処理をしたプラスミドpＴＰＡ３０１を、５μlのＢam
ＨＩ、dhfr遺伝子を含有する制限断片(約１．５μg)、
３μlの１０×リガーゼ緩衝液、３μl(約１５００単位)
のＴ４ＤＮＡリガーゼおよび９μlの水に加えた。この
連結反応を、１５℃で一夜インキュベートしたが、連結
されたＤＮＡは所望のプラスミドpＴＰＡ３０３ＤＮＡ
を形成していた。
【００９８】プラスミドpＴＰＡ３０３を、イー・コリ
Ｋ１２ＲＲ１(ＮＲＲＬ Ｂ−１５２１０)の形質転換に
用い、得られたイー・コリＫ１２ＲＲ１／pＴＰＡ３０
３形質転換細胞を、そのアンピシリン耐性表現型と、そ
のプラスミドＤＮＡの制限酵素分析とによって同定し
た。プラスミドpＴＰＡ３０３を、実施例３の方法に実
質的にしたがって上記の形質転換細胞から単離した。p
ＢＲ３２２レプリコンとプラスミドpＴＰＡ３０１由来
のβ−ラクタマーゼ遺伝子とをコードする約２．７kbの
ＥcoＲＩ−ＢglＩＩ制限断片を単離するために、約１０
μgのプラスミドpＴＰＡ３０１を、１×ＢglＩＩ緩衝液
中に２０単位のＢglＩＩ制限酵素を含有する４００μl
の全反応体積中３７℃で完全に消化する。このＢglＩＩ
消化の後、トリス−ＨＣlの濃度を１１０mＭに調節し、
２０単位のＥcoＲＩ制限酵素をＢglＩＩ消化ＤＮＡに添
加した。生成したＥcoＲＩ−ＢglＩＩ消化ＤＮＡをアガ
ロースゲルに負荷し電気泳動に付して、約２．７kbＥco
ＲＩ−ＢglＩＩ制限断片を他の消化産物から分離し、次
にこの約２．７kbの断片を単離し、連結用に調製した。
【００９９】dhfr遺伝子を含有する制限断片を単離する
ために、プラスミドpＴＰＡ３０３を、ＨindＩＩＩとＥ
coＲＩの制限酵素で２重消化を行って、dhfr遺伝子を含
有する約２３４０bpのＥcoＲＩ−ＨindＩＩＩ制限断片
を単離して回収した。ＴＰＡのカルボキシル末端のコド
ン領域とＳＶ４０プロモーターとを含有する、プラスミ
ドpＴＰＡ３０３の約２kbのＨindＩＩＩ−ＳstＩ制限断
片を単離するために、プラスミドpＴＰＡ３０３を、１
×ＨindＩＩＩ緩衝液中で、ＨindＩＩＩとＳstＩの制限
酵素で２重消化した。約１．７kb断片をゲルから単離
し、連結用に調製した。
【０１００】プラスミドpＢＷ２８の、約６８０bpのＸh
oＩＩ(ＢglＩＩオーバーラップによる連結に対して適合
性である)−ＳstＩ制限断片であって、修飾ＴＰＡのア
ミノ末端に対するコドン領域を含有する断片を単離する
ために、約１０μgのプラスミドpＢＷ２８を、１×Ｘho
ＩＩ緩衝液(０．１Ｍトリス−ＨＣl、pＨ＝８．０;０．
１Ｍ ＭgＣl2;０．１％トリトンＸ−１００;および１mg
／ml ＢＳＡ)中で、ＸhoＩＩ酵素で完全に消化した。得
られたＸhoＩＩ消化ＤＮＡを、エタノールで沈澱させて
回収し、次いでこれをＳstＩ酵素で完全に消化した。生
成したＸhoＩＩ−ＳstＩ消化ＤＮＡをアクリルアミドゲ
ルに負荷し、所望の断片をゲルから単離して連結用に調
製した。上記の各断片:すなわち、プラスミドpＴＰＡ３
０１の約２．７kbＥcoＲＩ−ＢglＩＩ制限断片;プラス
ミドpＴＰＡ３０３の約２．３４kbのＥcoＲＩ−ＨindＩ
ＩＩ制限断片;プラスミドpＴＰＡ３０３の約１．７kbの
ＳstＩ−ＨindＩＩＩ制限断片;およびプラスミドpＢＷ
２８の約０．６８kbのＳstＩ−ＸhoＩＩ制限断片の約
０．１μgづつを、連結してプラスミドpＢＷ３２を作製
した。この連結混合物を用い、５０mＭ ＣaＣl2を使う
ことを除いて実施例２に教示されているようにして、イ
ー・コリＫ１２ＭＭ２９４を形質転換した。形質転換細
胞は、そのアンピシリン耐性表現型と、そのプラスミド
ＤＮＡの制限分析によって同定した。プラスミドpＢＷ
３２のＤＮＡは、実施例３の方法に実質的にしたがっ
て、イー・コリＫ１２ ＭＭ２９４／pＢＷ３２形質転換
細胞から得た。プラスミドpＢＷ３２の制限部位と機能
地図を添付図面の第１４図に示す。
【０１０１】実施例１０ プラスミドpＬＰＣhd１、pＬＰＣhd２、pＬＰＣdhfr１
およびpＬＰＣdhfr２の構築 Ａ．プラスミドpＬＰＣhd１とpＬＰＣhd２の構築 約２０μgのプラスミドpＢＷ３２を含有する２０μlの
ＴＥ緩衝液を、１０μlの１０×ＢamＨＩ緩衝液と６０
μlの水に添加した。このプラスミドpＢＷ３２ＤＮＡの
溶液に、約１０μl(約５０単位)の制限酵素ＢamＨＩを
添加し、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベー
トした。生成したＢamＨＩ消化プラスミドpＢＷ３２の
ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、遠心分離によって集
め、５μlの１０×クレノウ緩衝液、４５mlの水および
２μl(約１００単位)のクレノウ酵素に再懸濁させた。
得られた反応液を１６℃で３０分間インキュベートし
た。次に反応混合物をアガロースゲルに負荷し、電気泳
動に付して、消化産物を明確に分離した。プラスミドp
ＢＷ３２の約１．９kbのクレノウ処理ＢamＨＩ制限断片
であってdhfr遺伝子を含有する断片をゲルから単離し、
実施例４Ａの方法に実質的にしたがって連結用に調製し
た。約４μgの所望の断片が得られ、５μlのＴＥ緩衝液
に懸濁させた。
【０１０２】約２００μgのプラスミドpＬＰＣhyg１を
含有する１００μlのＴＥ緩衝液を、１５μlの１０×Ｅ
coＲＩ緩衝液と３０μlの水に添加した。得られたプラ
スミドpＬＰＣhyg１ＤＮＡの溶液に、約５μl(約５０単
位)の制限酵素ＥcoＲＩを添加し、生成した反応液を３
７℃で約１０分間インキュベートした。短かい反応時間
を算出して、ＥcoＲＩによる部分消化を行わせた。プラ
スミドpＬＰＣhyg１は、２つのＥcoＲＩ制限部位をもっ
ているが、そのうちの１つはハイグロマイシン耐性を付
与する(ＨmＲ)遺伝子の暗号配列内に存在しているの
で、dhfr遺伝子を含有する制限断片を、上記ＨmＲ遺伝
子には存在しない。プラスミドpＬＰＣhyg１のＥcoＲＩ
部位に挿入することが望ましい。ＥcoＲＩによって部分
的に消化したプラスミドpＬＰＣhyg１のＤＮＡをアガロ
ースゲルに負荷し、電気泳動に付して、別個に切断した
プラスミドpＬＰＣhyg１ＤＮＡを未切断のプラスミドＤ
ＮＡおよび他の消化産物から分離した。別個に切断した
ＤＮＡをゲルから単離し、実施例４Ａの方法に実質的に
したがって連結用に調製した。ＲcoＲＩで別個に切断し
たプラスミドpＬＰＣhyg１約２μgが得られ、２５μlの
ＴＥ緩衝液に懸濁させた。この試料に、約５μl(約２５
単位)のクレノウ酵素、５μlの１０×クレノウ緩衝液、
および４０μlの水を添加し、生成した反応液を１６℃
で６０分間インキュベートした。クレノウ処理をしたＥ
coＲＩ部分消化ＤＮＡをフエノールで２回抽出し次にク
ロロホルムで１回抽出し、エタノールで沈澱させ、次に
２５μlのＴＥ緩衝液に再懸濁させた。
【０１０３】プラスミドpＢＷ３２の約１．９kbのクレ
ノウ処理ＢamＨＩ制限断片約５μlと、別個にＥcoＲＩ
で切断したプラスミドpＬＰＣhyg１ＤＮＡ約５μlとを
混合し、このＤＮＡ混合物に、１μlの１０×リガーゼ
緩衝液、５μlの水、１μl(約５００単位)のＴ４ＤＮＡ
リガーゼおよび１μl(約２単位)のＴ４ＲＮＡリガーゼ
を添加し、生成した反応液を１６℃で一夜インキュベー
トした。連結させたＤＮＡは所望のプラスミドpＬＰＣh
d１とpＬＰＣhd２を形成していたが、これらのプラスミ
ドは、dhfr遺伝子を含有する約１．９kbの断片の配向だ
けが異なっている。形質転換を受けうるようコンピテン
ト細胞にされたイー・コリＫ１２ＨＢ１０１細胞を、上
記連結ＤＮＡを用いて、実施例２の方法に実質的にした
がって形質転換した。形質転換細胞を１００μg／mlの
アンピシリンを含有するＬ寒天上にプレートし、アンピ
シリン耐性形質転換細胞を、そのプラスミドＤＮＡの制
限酵素分析法で分析して、イー・コリＫ１２ＨＢ１０１
／pＬＰＣhd１とイー・コリＫ１２ＨＢ１０１／pＬＰＣ
hd２の形質転換細胞を同定した。プラスミドpＬＰＣhd
１の制限部位と機能地図を添付図面の第１５図に示す。
プラスミドpＬＰＣhd１とプラスミドpＬＰＣhd２のＤＮ
Ａを、実施例３の方法に実質的にしたがって適切な形質
転換細胞から単離した。プラスミドpＬＰＣhd３とpＬＰ
Ｃhd４は、構造がプラスミドpＬＰＣhd１とpＬＰＣhd２
に類似している。プラスミドpＬＰＣhd３とpＬＰＣhd４
は、出発物質としてプラスミドpＬＰＣhyg１ではなくて
プラスミドpＬＰＣhyg２を使うことを除いて、プラスミ
ドpＬＰＣhd１とpＬＰＣhd２を構築するのに使う方法に
実質的にしたがって構築される。
【０１０４】Ｂ．プラスミドpＬＰＣdhfr１とpＬＰＣdh
fr２の構築 約１００μgのプラスミドpＢＷ３２を含有する１００μ
lのＴＥ緩衝液を、１５μlの１０×ＢamＨＩ緩衝液と２
５μlの水に添加した。このプラスミドpＢＷ３２ＤＮＡ
の溶液に約１０μl(約２５単位)の制限酵素ＢamＨＩを
添加し、得られた反応液を３７℃で２時間インキュベー
トした。ＢamＨＩ消化プラスミドpＢＷ３２ＤＮＡを、
実施例１０Ａの方法に実質的にしたがってクレノウ酵素
で処理した。平滑断端の断片をエタノールで沈澱させ、
１０μlのＴＥ緩衝液に再懸濁させ、アガロースゲルに
負荷し、電気泳動に付し、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺
伝子を含有する約１．９kbのＢamＨＩ制限断片を他の消
化産物から分離した。この約１．９kbの制限断片をゲル
から単離し、実施例４Ａの方法に実質的にしたがって連
結用に調製した。約１０μgの所望の断片が得られ、こ
れを５μlのＴＥ緩衝液に懸濁させた。実施例８で作製
した。約５μlのＮdeＩ−ＳtuＩ消化プラスミドpＬＰＣ
ＤＮＡを、プラスミドpＢＷ３２の約１．９kbのＢamＨ
Ｉ制限断片をクレノウ処理したもの５μl、１．５μlの
１０×リガーゼ緩衝液、１μl(約１０００単位)のＴ４
ＤＮＡリガーゼ、１μl(約２単位)のＴ４ＲＮＡリガー
ゼ、および１．５μlの水に添加した。得られた連結反
応液を１６℃で一夜インキュベートした。連結させたＤ
ＮＡは所望のプラスミドのpＬＰＣdhfr１とpＬＰＣdhfr
２を形成していたが、これらのプラスミドは、dhfr遺伝
子を含有する約１．９kbの断片の配向だけが異なってい
る。この連結させたＤＮＡを用いて、実施例２の方法に
実質的にしたがつてイー・コリＫ１２ＨＢ１０１を形質
転換した。形質転換された細胞を、アンピシリンを含有
するＬ寒天にプレートし、アンピシリン耐性のイー・コ
リＫ１２ＨＢ１０１／pＬＰＣdhfr１とイー・コリＫ１
２ＨＢ１０１／pＬＰＣdhfr２形質転換細胞を、そのプ
ラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した。
【０１０５】実施例１１ この発明の発現ベクターによる真核宿主細胞形質転換細
胞の構築と、これらの形質転換細胞における組換え遺伝
子発現レベルの測定。 この発明の重要な態様は、Ｅ１Ａ遺伝子の産物の存在下
で遺伝子の発現を刺激するためのＢＫエンハンサーとＧ
Ｔエンハンサーの使用に関する。２９３細胞は本来的に
Ｅ１Ａ遺伝子産物を発現するので、２９３細胞がこの発
明の真核発現ベクターの好ましい宿主である。２９３細
胞は、アデノウイルス５型(いずれの特定の型のアデノ
ウイルスもこの発明の方法においてＥ１Ａ遺伝子産物を
供給するのに使用できることに留意のこと)で形質転換
されたヒト胎児（胚）腎臓細胞であり、受託番号ＣＲＬ
１５７３でＡＴＣＣから入手できる。しかし、この発明
の発現ベクターは、Ｅ１Ａ遺伝子産物が存在していなく
ても、広範囲の宿主細胞内で機能する。さらに、Ｅ１Ａ
遺伝子(Ｇrinnellら、Ｍol．Ｃell．Ｂiol．、６巻、３
５９６〜３６０５頁、１９８６年)を含有するベクタ
ー、例えばプラスミドpＬＰＣＥ１ＡとpＬＰＣＥ１Ａ
１、もしくはせん断された(sheered)アデノウイルスＤ
ＮＡで形質転換するか、またはアデノウイルスによる感
染によって、Ｅ１Ａ遺伝子産物を非Ｅ１Ａ産生細胞系に
導入することができる。
【０１０６】下記の形質転換法では、２９３細胞を宿主
細胞細胞系と呼んでいるが、この方法は、一般に、ほと
んどの真核細胞系に適用できる。２９３細胞は、受託番
号ＣＲＬ１５７３でＡＴＣＣから得られ、２５mm2のフ
ラスコに入っており、このフラスコ中には、熱で不活性
化したウマ血清を１０％含有するイーグルの最少必須培
地に存在する約５．５×１０6の細胞の全面成長単層が
入っている。このフラスコを３７℃でインキュベート
し、培地は１週間に２回取替える。培地を取出し、ハン
スクの平衡塩類溶液(Ｇibco)ですすぎ、１〜２分間の間
に０．２５％のトリプシンを添加し、新鮮培地ですす
ぎ、吸引し、新しいフラスコに、１:５もしくは１:１０
の継代培養比で入れることによって、細胞の継代培養を
行う。
【０１０７】形質転換を行う１日前に、細胞を、０．７
×１０6細胞／皿の量で接種する。培地は形質転換を行
う４時間前に変える。エタノールで沈澱させ滅菌したプ
ラスミドＤＮＡの水溶液を用いて、４０μg／mlＤＮＡ
と２５０mＭ ＣaＣl2を含有する２×ＤＮＡ−ＣaＣl2溶
液を調製する。２８０mＭ ＮaＣl、５０mＭ Ｈepesおよ
び１．５mＭリン酸ナトリウムを含有し、pＨを７．０５
〜７．１５に調節した２×ＨＢＳを調製する。上記の２
×ＤＮＡ−ＣaＣl2溶液を、同体積の滅菌２×ＨＢＳに
滴下する。木綿のプラグを備えた１mlの滅菌プラスチッ
クピペットを、２×ＨＢＳの入った混合管に挿入し、Ｄ
ＮＡを添加しながら吹込みによって泡を導入する。リン
酸カルシウム−ＤＮＡの沈澱を、撹拌せずに室温で３０
〜４５分間生成させる。次に沈澱を、プラスチックピペ
ットでゆるやかにピペッテイングすることによって混合
し、１mlの沈澱(１プレート当り)を、受容体細胞を被覆
する１０mlの増殖培地に直接添加する。３７℃で４時間
インキュベートした後、培地を、１０％のウシ胎仔血清
を含有するＤＭＥＭと取替えて、選択圧を与える前に、
細胞をさらに７２時間インキュベートさせる。組換えヒ
トプロテインＣを発現する形質転換細胞用の増殖培地
は、１〜１０μg／mlのビタミンＫすなわち前記タンパ
ク質のγ−カルボキシル化に必要な補助因子を含有して
いる。真核細胞内で機能する選択マーカーを含有してい
ないプラスミドについては、形質転換するのに次のプラ
スミドの混合物を利用する。すなわち、そのプラスミド
の混合物とは、選択マーカーを欠いているこの発明の発
現ベクター;および真核細胞内で機能する選択マーカー
を含有する発現ベクターの混合物である。この同時形質
転換法によれば、両方の形質転換プラスミドを含有する
細胞を同定することができる。
【０１０８】ハイグロマイシン耐性を供与する遺伝子を
含有するプラスミドでトランスフェクトした細胞につい
ては、ハイグロマイシンを、増殖培地に、約２００〜４
００μg／mlの最終濃度まで添加する。次に細胞を、培
地を３〜４日間隔で変えながら３７℃で２〜４週間イン
キュベートする。得られたハイグロマイシン耐性のコロ
ニーを、別個の培養フラスコに移して特性決定を行う。
ネオマイシン(Ｇ４１８もネオマイシンの代わりに使用
される)耐性コロニーの選択は、Ｇ４１８をハイグロマ
イシンの代わりに３００μg／mlの最終濃度まで添加す
ることを除いて、ハイグロマイシン耐性細胞の選択法に
実質的にしたがって行われる。２９３細胞はdhfr陽性で
あるので、dhfr遺伝子を含有するプラスミドをもってい
る２９３形質転換細胞は、dhfr陽性表現型に基づいて単
独で選択されない。そしてこの表現型は、ヒポキサンチ
ンとチミンを欠く培地で増殖できる。機能性dhfr遺伝子
を欠き、dhfrを含有するプラスミドで形質転換される細
胞系は、dhfr＋表現型に基づいて選択できる。
【０１０９】遺伝子もしくはプラスミドをdhfr欠乏細胞
系に導入するために選択マーカーとして、ジヒドロ葉酸
レダクターゼ(dhfr)を使用し、次にメトトレキセート
を、プラスミドのコピー数を増幅するために用いること
は、文献によく発表されている。dhfrを、dhfr産生細胞
中で選択マーカーおよび増幅マーカーとして用いること
は充分には研究されていないが、霊長類の細胞内で有効
な同時増幅を行うには、メトトレキセートを用いて同時
増幅を行う前に直接に選択できるマーカーを用いて初期
の選択を行う必要がある。この発明の使用は、使用され
る選択マーカーによって限定されない。さらに、メタロ
チオネイン遺伝子のような増幅マーカー、アデノシンデ
アミナーゼ遺伝子、またはＰ−糖タンパク質が例として
挙げられる多重遺伝子抵抗族のメンバーが利用できる。
２９３細胞では、ハイグロマイシンＢ耐性を供与する遺
伝子のような選択マーカーを含有するベクターで形質転
換し、次いでメトトレキセートを用いて増幅することが
有利であるが、メトトレキセートは、２９３細胞中のマ
ウスのdhfr含有プラスミドを直接選択するのに使用する
ことはできない。同時増幅のレベルは、サザーンハイブ
リッド形成法などの当該技術分野で公知の方法で測定す
ることができる。
【０１１０】具体的には、ベクターpＬＰＣとpＳＶ２hy
gを用いて２９３細胞を形質転換して培養すると最高レ
ベルのプロテインＣの産生量(２４ウエルの微量滴定プ
レートで約０．２μg／ml)が得られた。その形質転換細
胞をサブクローン化し、約２〜３倍のプロテインＣを産
生することができるクローンを選択した。このサブクロ
ーンを安定な形質転換細胞ＣＣ３１１と呼称する。
【０１１１】実施例１２ 高生産性の安定な形質転換細胞の構築 エシエリキア・コリ(Ｅscherichia coli)Ｋ１２ＡＧ１
／pＧＴＣ細胞は、凍結乾燥品の形態で、米国、イリノ
イ州、ペオリアのＮational Ｒegional Ｒesearch
Ｌaboratoriesから得られる。イー・コリＫ１２ＡＧ１
／pＧＴＣは、１９９０年１月１８日にＮＲＲＬに寄託
され、そこの永久貯蔵培養品になり、受託番号ＮＲＲＬ
Ｂ−１８５９３で公けに入手できる。この培養物を再
構成させ、実施例３の教示事項に実質的にしたがって、
プラスミドを培養物から精製する。プラスミドpＬＰＣ
は、この発明のＧＢＭＴ修飾転写単位の後に発現する位
置にある、ヒトプロテインＣのcＤＮＡ配列を含有して
いる。プラスミドpＧＴＣの制限部位と機能地図を添付
図面の図１６に示す。プラスミドpＧＴＣを用い、実施
例１１の教示事項に実質的にしたがってＣＣ３１１クロ
ーンを形質転換した。同様にして、プラスミドpＬＰＣ
−hd、pＬＰＣ−hygおよびpＬＰＣ−dhfrをすべて用い
て２９３細胞を形質転換した。安定な形質転換とサブク
ローニングを確認した後、各形質転換細胞が産生するヒ
トプロテインＣの相対的なレベルを、Ｇrinnelら、Ｂio
technology、５巻、１１８９−１１９２頁、１９８７年
に記載されている標準のＥＬＩＳＡ検定法を用いて試験
した。またその全教示事項は本明細書に援用する。上記
検定法から得た結果は、プラスミドpＬＰＣ−hd、pＬＰ
Ｃ−hygもしくはpＬＰＣ−dhfrで形質転換された細胞
は、平均して１２０ng／mlのプロテインＣを分泌し、一
方プラスミドpＧＴＣで形質転換されたＣＣ３１１細胞
は平均して２９３０ng／mlのプロテインＣを分泌するこ
とを示した。これらの実験結果は、前記第２表に示して
ある。Ｇrinnelらの上記のＢiotechnology誌の報告、ま
たは１９９０年４月１１日に公告されたyanのヨーロッ
パ特許公告第０３６３１２６号の教示事項にしたがっ
て、上澄み液からプロテインＣを回収することができ、
これらの全教示事項は本明細書に援用する。
【０１１２】実施例１３ 活性化ヒトプロテインＣを分泌する安定な形質転換細胞
の構築 プラスミドpＬＡＰＣ−ＩＲＳは、ＢＫエンサーおよび
ＳＶ４０Ｔ抗原と連結したアデノウイルス後期プロモー
ターで駆動される、活性型(チモーゲンではない)プロテ
インＣの遺伝子配列を含有している。プラスミドpＬＡ
ＰＣ−ＩＲＳの構築は、１９８９年６月７日に公告され
たＢangらのヨーロッパ特許公告第０３１９３１２号に
開示されている。その全教示事項は本明細書に援用す
る。活性化プロテインＣをコードする遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片は、制限酵素ＢclＩで消化することによっ
て、プラスミドpＬＡＰＣ−ＩＲＳから容易に取出すこ
とができる。エシエリキア・コリＫ１２ＡＧ１／pＧＴ
−d細胞は、この細胞が１９９０年１月１８日に寄託さ
れその永久保存培養品になったＮＲＲＬから得られる。
イー・コリＫ１２ＡＧ１／pＧＴ−d細胞は、ＮＲＲＬ
Ｂ−１８５９１の受託番号で入手できる。プラスミドp
ＧＴ−dは、マウスdhfr遺伝子とともにこの発明のＧＢ
ＭＴ修飾転写単位を含有している。プラスミドpＧＴ−d
はＧＢＭＴ単位からの発現を行う位置にある遺伝子を含
有していないが、かような遺伝子をプラスミドに容易に
挿入する位置にあるＢclＩ部位を含有している。プラス
ミドpＧＴ−dの制限部位と機能地図を添付図面の図１７
に示す。
【０１１３】エシエリキア・コリＫ１２ＡＧ１／pＧＴ
−h細胞もＮＲＲＬから入手できるが、この細胞も１９
９０年２月１８日にＮＲＲＬに寄託されそこの永久貯蔵
培養品になった。イー・コリＫ１２ＡＧ１／pＧＴ−h細
胞は受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１８５９２号で入手でき
る。プラスミドpＧＴ−dは、ハイグロマイシン耐性を供
与する遺伝子とともにこの発明のＧＢＭＴ単位を含有し
ている。プラスミドpＧＴ−dは、プラスミドpＧＴ−dと
同様に、ＧＢＭＴ単位からの発現を行う位置にある遺伝
子を含有していないが、いずれの遺伝子も挿入する位置
にあるＢclＩ部位をもっている。プラスミドpＧＴ−hの
制限部位と機能地図を添付図面の図１８に示す。プラス
ミドpＬＡＰＣ−ＩＲＳを制限酵素ＢclＩで消化し、活
性化プロテインＣをコードする遺伝子を含有する制限断
片を精製した。プラスミドＤＮＡのＢclＩによる消化
は、配列５'−ＧＡＴＣ−３'中のアデニンをメチル化す
ると阻害される。それ故、プラスミドpＧＴ−hは、dam
遺伝子(その産物は配列５'−ＧＡＴＣ−３'内のアデニ
ン残基をメチル化する)によってコードされるようなア
デニンメチラーゼを欠いたイー・コリ宿主細胞から作製
した。イー・コリＫ１２ＧＭ４８(ＮＲＲＬ Ｂ−１５
７２５)は、機能性damメチラーゼを欠いているので、プ
ラスミドpＧＴＡＣ−h構築の出発物質として用いるプラ
スミドpＧＴ−hＤＮＡを調製するのに用いる適切な宿主
である。
【０１１４】イー・コリＫ１２ＧＭ４８細胞を培養し、
形質転換されうるようにコンピテント細胞にし、プラス
ミドpＧＴ−hを用い、実施例２の方法に実質的にしたが
ってイー・コリＫ１２ＧＭ４８細胞を形質転換した。得
られた形質転換細胞をアンピシリンを含有するＬ寒天上
にプレートし、次いでアンピシリン耐性のイー・コリＫ
１２ＧＭ４８／pＧＴ−h形質転換細胞がコロニーを生成
したならば、このコロニーの１つを用い、実質的に実施
例２の方法にしたがってプラスミドpＧＴ−hＤＮＡを作
製した。約１mgのプラスミドpＧＴ−hＤＮＡが得られ、
これを約１mlのＴＥ緩衝液に懸濁させた。次にプラスミ
ドpＧＴ−hを制限酵素ＢclＩで消化し、このベクターを
精製し、最初の方の実施例に実質的にしたがって、この
ベクターを活性化プロテインＣ遺伝子を含有する断片に
連結した。この反応によってプラスミドpＧＴＡＣ−hが
生成し、このプラスミドは、ＧＢＭＴ修飾転写単位によ
って発現される位置にある、活性化プロテインＣをコー
ドする遺伝子を含有している。次に、プラスミドpＬＡ
ＰＣ−ＩＲＳとpＧＴＡＣ−hを用い、実質的に実施例１
１の教示事項にしたがって、２９３細胞を形質転換し
た。個々のクローンを０．９cm2の表面積に全面成長増
殖させた後、細胞の平均発現レベルを、標準プロテイン
ＣのＥＬＩＳＡ検定法を用いて比較した。pＬＡＰＣ−
ＩＲＳの培養物は、平均して、約３３ng／mlの活性化プ
ロテインＣを産生し、一方pＧＴＡＣ−hの培養物は、平
均して約１４６０ng／mlの活性化プロテインＣを産生し
た。これらの実験の結果を表２に示す。
【０１１５】実施例１４ 過渡発現 相対プロモーター強度も過渡発現検定システムを用いる
ことによって測定できる。これらのシステムはクロラム
フエニコールアセチルトランスフエラーゼ(ＣＡＴ)の発
現に基づいたものが多い。ＣＡＴを検定するかような方
法の１つは、Ｇrinnelら、Ｍol．Ｃell．Ｂiol．、６
巻、３５９６−３６０５頁、１９８６年に開示されてい
る。実施例１３の方法に実質的にしたがってＧＭ４８内
で増殖させたプラスミドpＧＴＣ(１μg／ml)の５μl、
５μlの１０×ＢclＩ緩衝液(１．５Ｍ ＫＣl、１００m
Ｍトリス−ＨＣl、pＨ７．４および１００mＭ ＭgＣl2)
５μlの制限酵素ＢclＩおよび３５μlの水をまず混合す
ることによって、ＣＡＴを発現する発現ベクターが構築
される。３７℃で１時間後に、５３０３塩基対のベクタ
ー断片を、０．１％アガロースゲル上で単離し、ＢioＲ
ad Ｐrep−Ａ−Ｇene kitを用いて精製される。約４
０μlのＴＥ緩衝液(pＨ８．０)を、０．０５単位の仔ウ
シ腸アルカリホスファターゼ(ＢＭＢ)とともに、５０μ
lのベクターに添加する。反応を３７℃で３０分間続け
させ、次に温度が６５℃に４５分間シフトされたときに
１０μlの５mＭ ＥＧＴＡを添加する。ベクターをフエ
ノール／クロロホルムで抽出し、アルコールで沈澱さ
せ、２０μlの水に再懸濁させる。
【０１１６】約５μlの０．１μg／μl ＣＡＴ ＧenＢl
ock(ＰＬ Ｐharmacia ＨindＩＩＩＣＡＴベクター、カ
タログ番号２７−４８９５−０１)、各々０．２mＭの４
種のdＮＴＰの同体積混合物(５００mＭトリスpＨ７．
８、５０mＭ ＭgＣl2、１００mＭ２−メルカプトエタノ
ールおよび１００μg／mlのヌクレアーゼなしのＢＳＡ
中)の５μl、ならびに１μlのクレノウ(ＢＲＬ)を混合
し、２５℃で３０分間放置する。得られた混合物を７０
℃で５分間加熱し、エタノールで沈澱させた。得られた
ＤＮＡを、１０μlの１０mlトリス(pＨ７．６)と２μl
の連結緩衝液(０．５Ｍトリス、pＨ７．６、１００mＭ
ＭgＣl2、１００mＭ ＤＴＴおよび５００μg／ml ＢＳ
Ａ)に再懸濁させ、２μl(０．２μg)リン酸化ＢclＩリ
ンカー(ＮewＥngland Ｂiolabs社)、１μlのバクテリ
オファージＴ４ＤＮＡリガーゼおよび２μlの１０mＭ
ＡＴＰを添加する。インキュベーションを１６℃で１２
時間続いて６８℃で１５分間行った。次に２０μlの１
０×ＢclＩ緩衝液、１５０μlの水、および２０μlの制
限酵素ＢclＩを添加し、得られた混合物を３７℃で２時
間インキュベートした。フエノール／クロロホルムによ
って抽出しエタノールで沈澱させた後、得られたＤＮＡ
を５０μlの水に再懸濁し、次いでＤＮＡをセファロー
ス(Ｓepharose)ＣＬ４８スピンカラム(Ｓpin column)
を通過させることによって過剰のリンカーを除去する。
【０１１７】次に７μlのベクター、１μlの１０×リガ
ーゼ緩衝液、１μlのリガーゼおよび１μgの前記ＣＡＴ
断片を１６℃で１２時間混合することによって、ＣＡＴ
遺伝子をベクターのバックボーンに連結する。生成した
ＤＮＡを用い、前記実施例に実質的にしたがって、イー
・コリＫ１２ＡＧ１コンピテント細胞(Ｓtratagene)を
形質転換してプラスミドpＧＴ−ＣＡＴを作製した。次
に、プラスミドpＧＴ−ＣＡＴを用い、前記実施例の教
示事項に実質的にしたがって２９３細胞を形質転換す
る。また他のプロモーターおよび転写調節単位を含有す
る他のベクターを用いて、２９３細胞が形質転換される
が、過渡発現のレベルが測定される。Ｇrinnelら、Ｂio
technology、５巻、１１８９−１１９２頁、１９８７
年;Ｇrinnellら、Ｍol．Ｃell．Ｂiol．、６巻３５９６
〜３６０５頁、１９８６年に開示されているとおりのク
ロラムフエニコールアセチルトランカフエラーゼ検定法
とヒトプロテインＣＥＬＩＳＡ試験法が好ましい。試験
結果を表１に示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年１２月２２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】追加
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＢＫウイルスの制限部位と機能地図である。
【図２】 プラスミドpＢＫＥ１の制限部位と機能地図
である。
【図３】 プラスミドpＢＫneo１の制限部位と機能地図
である。
【図４】 プラスミドpＳＶ２catの制限部位と機能地図
である。
【図５】 プラスミドpＬＰcatの制限部位と機能地図で
ある。
【図６】 プラスミドpＢＬcatの制限部位と機能地図で
ある。
【図７】 プラスミドpＢＫcatの制限部位と機能地図で
ある。
【図８】 プラスミドpＳＢＬcatの制限部位と機能地図
である。
【図９】 プラスミドpＬ１３３の制限部位と機能地図
である。
【図１０】 プラスミドpＬＰＣの制限部位と機能地図
である。
【図１１】 プラスミドpＬＰＣ４の制限部位と機能地
図である。
【図１２】 プラスミドpＳＶ２hygの制限部位と機能地
図である。
【図１３】 プラスミドpＬＰＣhyg１の制限部位と機能
地図である。
【図１４】 プラスミドpＢＷ３２の制限部位と機能地
図である。
【図１５】 プラスミドpＬＰＣhd１の制限部位と機能
地図である。
【図１６】 プラスミドpＧＴＣの制限部位と機能地図
である。
【図１７】 プラスミドpＧＴ−dの制限部位と機能地図
である。
【図１８】 プラスミドpＧＴ−hの制限部位と機能地図
である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/69 ＺＮＡ 15/86 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ブライアン・ウィリアム・グリンネル アメリカ合衆国46250インディアナ州イン ディアナポリス、ヘイネス・コート5038番

Claims (31)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 大ＤＮＡウイルスの即時型遺伝子産物を
    発現する真核宿主細胞内での有用物質の生産方法であっ
    て、 (a)(i)(Ａ)アデノウイルスの主要後期プロモーターの上
    流調節要素(ＭＬＴＦ)の近くに位置するＢＫウイルスの
    Ｐ２エンハンサー、(Ｂ)アデノウイルス２型の主要後期
    プロモーター、(Ｃ)前記プロモーターを刺激する位置に
    あるポリ−ＧＴ要素、(Ｄ)アデノウイルスのスプライス
    された３分節系リーダー配列を含有するＤＮＡ配列、を
    含有する修飾転写調節単位、および (ii)前記有用物質が発現され得る位置にある、前記有用
    物質をコードしているＤＮＡ配列を、含有する組換えＤ
    ＮＡベクターで前記宿主細胞を形質転換し; (b)前記有用物質をコードする前記ＤＮＡ配列を発現す
    るのに適切な条件下で前記(a)工程の前記細胞を培養し;
    次いで (c)前記有用物質を前記細胞培養物から回収する;ことか
    らなる方法。
  2. 【請求項２】 前記の真核宿主細胞が、アデノウイルス
    で形質転換された宿主細胞である請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記真核宿主細胞が、２９３宿主細胞お
    よびＡＶ１２−６６４宿主細胞からなる群から選択され
    る請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記真核宿主細胞が２９３細胞である請
    求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記有用物質がヒトプロテインＣである
    請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記有用物質がヒトプロテインＣである
    請求項４記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記の修飾転写調節単位が、下記配列: 【化１】 を含有する請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 真核宿主細胞が２９３細胞である請求項
    ７記載の方法。
  9. 【請求項９】 有用物質がヒトプロテインＣである請求
    項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 修飾転写調節単位を含有する組換えＤ
    ＮＡベクターであって、その修飾転写調節単位が、 (a)アデノウイルスの主要後期プロモーターの上流調節
    要素(ＭＬＴＦ)の近くに位置するＢＫウイルスのＰ２エ
    ンハンサー、 (b)アデノウイルス２型の主要後期プロモーター、 (c)前記プロモーターを刺激する位置にあるポリ−ＧＴ
    要素、 (d)アデノウイルスのスプライスされた３分節系リーダ
    ー配列を含有するＤＮＡ配列を、含有するものである組
    換えＤＮＡベクター。
  11. 【請求項１１】 さらに、 (e)有用物質をコードし、前記有用物質を発現する位置
    にあるＤＮＡ配列、を含有する請求項１０記載の組換え
    ＤＮＡベクター。
  12. 【請求項１２】 さらに、 (f)選択マーカーをコードする遺伝子、を含有する請求
    項１１記載の組換えＤＮＡベクター。
  13. 【請求項１３】 修飾転写調節単位が下記配列: 【化２】 を含有する請求項１０記載の組換えＤＮＡベクター。
  14. 【請求項１４】 さらに、有用物質をコードするＤＮＡ
    配列を含有し、そのＤＮＡ配列がその有用物質を発現す
    る位置にある請求項１３記載の組換えＤＮＡベクター。
  15. 【請求項１５】 前記の有用物質をコードする前記遺伝
    子がヒトプロテインＣをコードしている請求項１４記載
    の組換えＤＮＡベクター。
  16. 【請求項１６】 プラスミドpＧＴＣである請求項１５
    記載の組換えＤＮＡベクター。
  17. 【請求項１７】 さらに、選択マーカーをコードする遺
    伝子をコードしている請求項１３記載の組換えＤＮＡベ
    クター。
  18. 【請求項１８】 選択マーカーをコードする遺伝子がdh
    fr遺伝子である請求項１７記載の組換えＤＮＡベクタ
    ー。
  19. 【請求項１９】 プラスミドpＧＴ−dである請求項１８
    記載の組換えＤＮＡベクター。
  20. 【請求項２０】 選択マーカーをコードする遺伝子がハ
    イグロマイシン耐性を供与する遺伝子である請求項１７
    記載の組換えＤＮＡベクター。
  21. 【請求項２１】 プラスミドpＧＴ−hである請求項２０
    記載の組換えＤＮＡベクター。
  22. 【請求項２２】 請求項１０のベクターで形質転換され
    た組換え宿主細胞。
  23. 【請求項２３】 イー・コリＫ１２ ＡＧ１／pＧＴＣ
    (ＮＲＲＬ Ｂ−１８５９３)である請求項２２記載の組
    換え宿主細胞。
  24. 【請求項２４】 イー・コリＫ１２ ＡＧ１／pＧＴ−h
    (ＮＲＲＬ Ｂ−１８５９２)である請求項２２記載の組
    換え宿主細胞。
  25. 【請求項２５】 イー・コリＫ１２ ＡＧ１／pＧＴ−d
    (ＮＲＲＬ Ｂ−１８５９１)である請求項２２記載の組
    換え宿主細胞。
  26. 【請求項２６】 ２９３／pＧＴＣである請求項２２記
    載の組換え宿主細胞。
  27. 【請求項２７】 ２９３／pＬＰＣ／pＧＴＣである請求
    項２２記載の組換え宿主細胞。
  28. 【請求項２８】 宿主細胞内での有用産物の産生レベル
    を増大させる方法であって、 (a)有用な物質を発現し分泌するが、この発明の修飾転
    写調節単位を含有するベクターを含有していない細胞ク
    ローンの安定な形質転換細胞を得て、 (b)前記の安定な形質転換細胞を、異なるベクター、す
    なわち転写がＧＢＭＴ転写単位： 【化３】 で駆動されるような位置にある、前記有用産物をコード
    する遺伝子を含有するベクターで形質転換し、 (c)工程(b)の前記細胞を前記有用産物をコードする前記
    遺伝子を発現するのに適切な条件下で培養し、次いで (d)前記有用産物を前記細胞培養物から回収する;工程か
    らなる方法。
  29. 【請求項２９】 前記有用産物がヒトプロテインＣであ
    る請求項２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記の安定な形質転換細胞が２９３／
    pＬＰＣである請求項２８記載の方法。
  31. 【請求項３１】 工程(b)の前記ベクターがプラスミドp
    ＧＴＣである請求項３０記載の方法。
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