HU214783B - Eljárás javított stabilitású glükóz-izomeráz enzimek és magas fruktóz- tartalmú szirup előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás a vad típűsú glükóz-izőmerázhőz képestjavítőtt stabilitású új glükóz-izőmerázők előállítására, amelyekglükóz frűktózzá alakításakőr ipari méretekben is jőbb kő verziótbiztősítanak. A találmány szerint génmanipűlációs technikákalkalmazásával az enzim alegységek közötti elektrősztatikűskölcsönhatásőkban szerepet játszó lizin maradékők legalább egyikét,előnyösen a Lys253-at arg ninre cserélik és/vagy adőtt esetben amőnőmer enzim stabilitását előnyösen javító Gly70®Ser70, Ala73®Ser73és Gly74®Thr74 cseréket végeznek. A találmány tárgyát képezi tővábbáegy új eljárás frűktóz szirűpők, főként magas frűktóz-tartalmúkűkőricaszirűpők előállítására ezen új enzimek alkalmazásával. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás javított stabilitású új glükóz-izomerázok előállítására, amelyek glükóz fruktózzá alakításakor ipari méretekben is jobb konverziót biztosítanak. A találmány tárgyát képezi továbbá egy új eljárás fruktóz szirupok, főként magas ffuktóztartalmú kukoricaszirupok előállítására ezen új enzimek alkalmazásával.

A glükóz-izomeráz glükóz ffuktózzá való reverzibilis izomerizációját katalizálja. A fruktózt napjainkban általánosan alkalmazzák cukor-helyettesítőként, minthogy az édessége nagyobb, mint a szacharózé és a glükózé. Több glükóz-izomerázt termelő mikroorganizmus ismert; lásd például a Wen-Pin Chen összefoglaló közleményeit [Process Biochemistry, 75, június/július (1980) 30—41 és augusztus/szeptember (1980) 36-41], amelyekben nagyszámú, glükóz-izomeráz termelésére képes mikroorganizmust sorol fel.

Különféle mikroorganizmusokat iparilag is használnak. Wen-Pin Chen leírja közleményeiben ezen mikroorganizmusok tenyésztési körülményeit és a termelt glükóz-izomeráz kinyerésének és tisztításának a módszereit.

Az intracelluláris glükóz-izomeráz enzim előállítása viszonylag költséges. Kifejlesztettek különböző olyan készítményeket, amelyek lehetővé teszik az enzim ismételt és folyamatos felhasználását. Ha az enzimet - általában vízben nem oldódó formában - immobilizáljuk, akkor mind bekeveréses (batch), mind folyamatos eljárásokban (például úgynevezett töltött ágyas reaktorokban) használható. A glükóz-izomeráz immobilizálásának az egyik fő hátránya a specifikus aktivitás lényeges csökkenése, amely az inért anyag jelenlétének a következménye. Ez a helyzet a felhasználás során még romlik, minthogy a glükóz-izomeráz magasabb hőmérsékleten inaktiválódik. A hő okozta inaktiválódás irreverzibilis aktivitásveszteséget eredményez.

Az enzimstabilitás megtartásában elért eredmények ellenére a normál alkalmazási körülmények között még mindig lényeges aktivitáscsökkenés tapasztalható. Ennek következtében továbbra is fennáll az igény új, kedvezőbb tulajdonságú glükóz-izomeráz enzimek iránt. A glükóz-izomeráz jobb hőstabilitása például lehetővé tenné annak a ténynek a kihasználását, hogy a magasabb hőmérséklet az izomerizálási folyamat egyensúlyát ffuktóz irányba tolja el. A legtöbb esetben a glükózizomerázt pH=7,5-nél alkalmazzák. Azonban a fruktóz ezen a pH-η nem stabil. Ezért fennáll a pH=7,5 alatt alkalmazható glükóz-izomeráz iránti igény is.

Kedvezőbb tulajdonságokkal rendelkező enzimek különböző módokon állíthatók elő. így például kereshetők klasszikus szűrővizsgálati módszerekkel, előállíthatok a meglévő fehérje kémiai módosításával vagy modem gén- és fehérje-technológiai módszerekkel.

A kívánt enzimaktivitással rendelkező szervezetek vagy mikroorganizmusok kiválasztását szolgáló szűrővizsgálatok például úgy végezhetők el, hogy a mikroorganizmusból vagy az adott mikroorganizmus tenyészetének a felülúszójából izolálják és tisztítják az enzimet, meghatározzák annak biokémiai tulajdonságait, és megvizsgálják, hogy ezen biokémiai tulajdonságok megfelelnek-e az alkalmazás igényeinek.

Ha az azonosított enzim nem nyerhető ki az azt termelő mikroorganizmusból, rekombináns DNS-technika alkalmazható az enzimet kódoló gén izolálására, a gén más organizmusban való expressziójára, majd a kifejezett enzimet izolálni és tisztítani lehet, és ezután lehet megvizsgálni, hogy az megfelelő-e a tervezett felhasználás számára.

A meglévő enzimek módosítása véghez vihető többek között kémiai módosító módszerekkel. Lásd például I. Svandsen közleményét [Carlsberg Rés. Commun., 44, 237-291 (1976)]. Ezek a módszerek általában csak kis mértékben specifikusak, így a közös oldallánccal rendelkező minden hozzáférhető csoportot módosítanak, vagy függnek a módosítandó aminosavak jelenlététől, és gyakran nem képesek módosítani a nehezen hozzáférhető aminosavakat, hacsak az enzimmolekula fehéijeszála nincs széttekeredve.

A kódoló gén mutagenezisével elért enzim-módosítás nem rendelkezik a fent említett aspecifítás hátrányával, és ezért ezt megfelelőbbnek gondoltuk. A mutagenezis végrehajtható véletlenszerű mutagenezissel vagy meghatározott helyre irányított mutagenezissel.

A teljes mikroorganizmus kémiai mutagénekkel vagy mutagén hatást kifejtő besugárzással elért véletlenszerű mutagenezise természetesen eredményezhet módosított enzimeket, de nehézkes szelekciós eljárások szükségesek a kívánt tulajdonságokkal rendelkező mutáns kinyerésére. A kívánt mutáns enzim izolálása a véletlenszerű mutagenezisnél nagyobb valószínűséggel érhető el úgy, hogy a kódoló gént klónozzuk, a gént in vitro vagy in vivő mutagenizáljuk, és a kódolt enzimet kifejezzük olymódon, hogy a mutált gént egy megfelelő gazdasejtben reklónozzuk, és a kódolt enzimet kifejezzük. Ebben az esetben is megfelelő biológiai szelekciós eljárásokkal kell rendelkezni a kívánt mutáns enzim kiválasztására. Ezek a biológiai szelekciós eljárások nem választják ki specifikusan a fruktóz előállításában alkalmazásra kerülő megfelelő enzimet.

A meghatározott helyre irányított mutagenezis (site directed mutagenesis, a továbbiakban SDM) a legspecifikusabb útja a módosított enzim előállításának; lehetővé teszi egy vagy több aminosav szubsztitúcióját egy másik kívánt aminosawal.

A jelen találmány egyik tárgya egy új glükóz-izomeráz mutáns előállításának a lehetővé tétele, amelyet a fent említett enzimet kódoló gének expressziójával oldottunk meg, és amely enzimek aminosav-szekvenciája legalább egy aminosav esetében eltér a vad típusú glükóz-izomerázétól, és kedvezőbb tulajdonságokkal rendelkezik.

A találmány egy másik tárgya egy eljárás, amely lehetővé teszi az ilyen új mutáns glükóz-izomerázok előállítását, amely eljárás a megfelelő vad típusú enzimek inter- és intramolekuláris kölcsönhatásainak a módosításán alapul.

A találmány egy további tárgya egy módszer, amely lehetővé teszi az ipari alkalmazás során kedvezőbb tulajdonságokkal rendelkező mutáns enzim kiválasztását.

HU 214 783 Β

Az ábrák rövid magyarázata:

1. ábra: Az EcoAmi(DSM)GI fémionmentes glükózizomerázának hő okozta inaktiválódási kinetikája 50 mM MOPS oldatban, pH=7,2-nél 25 °C-on. Fémet nem adtunk az elegyhez.

2. ábra: Azonos az 1. ábrával. Az elegyhez 10 mM

Mg²⁺-t adtunk.

3. ábra: Azonos az 1. ábrával. Az elegyhez 10 mM

Co²⁺-t adunk.

4. ábra: Az EcoAmi(DSM)GI (glükóz-izomeráz) hő okozta inaktiválódása hőmérsékletfuggésének Arrhenius görbéje 50 mM MOPS (3morfolino-propán-szulfonát, továbbiakban MOPS) oldatban, pH=7,2-nél 25 °C-on.

5. ábra: A pH hatása a fémionmentes EcoAmi(DSM)GI hő okozta inaktiválódására 72 °Con fémionok hozzáadása nélkül. CHES = 2(ciklohexil-amino)-etán-szulfonsav.

6. ábra: Az ionerősség hatása a fémionmentes EcoAmi(DSM) hő okozta inaktiválódási kinetikájára 50 mM MOPS oldatban, pH=6,7-nél 72 °C-on. Fémionokat nem adtunk az elegyhez.

7. ábra: Az ionerősség hatása a fémionmentes

EcoAmi(DSM)GI hő okozta inaktiválódási kinetikájára 50 mM MOPS oldatban, pH=7,6-nál 72 °C-on. Fémionokat nem adtunk az elegyhez.

8. ábra: Az EcoAmi(DSM)GI SEC-HPLC vizsgálata az EcoAmi(DSM)GI 7 M karbamid jelenlétében 25 °C-on végzett tartós inkubálás után.

9A. ábra: Cianáttal 25 °C-on karbamid nélkül előkezelt EcoAmi(DSM)GI SEC-HPLC vizsgálata. Az elúciós puffer 50 mM tris/HCl; pH=8,0; 150 mM nátrium-klorid; 0,02 t% nátrium-azid.

9B. ábra: Cianáttal 25 °C-on karbamid nélkül kezelt EcoAmi(DSM)GI natív PAGE vizsgálata.

IOA. ábra: Cianáttal 5 M karbamid jelenlétében 25 °Con előkezelt EcoAmi(DSM)GI SEC-HPLC vizsgálata.

IOB. ábra: Cianáttal 5 M karbamid jelenlétében 25 °Con előkezelt EcoAmi(DSM)GI natív PAGE vizsgálata.

11. ábra: Az EcoAmi(DSM)GI glikozid képzése 50 mM MOPS oldatban; pH=7,7, 60 °C. Fehér körök (o): nem adtunk glükózt az elegyhez; fekete körök (·) +250 mM glükóz; háromszögek (δ): 250 mM glükózzal végzett inkubálás után kimerítő dialízis következett a reverzibilitás tesztelésére.

12. ábra: Az EcoAmi(DSM)GI K253Q mutánsának hőmérséklet okozta inaktiválódási kinetikája.

13. ábra: Az EcoAmi(DSM)GI K253R mutáns tetramer-dimer disszociációjának kinetikája 25 °C-on 5 M karbamid jelenlétében.

14. ábra: Az EcoAmi(DSM)GI K253R mutáns glikozid-képződés okozta inaktiválódásának kinetikája 60 °C-on 12,5 mM kálium-foszfát jelenlétében; pH=7,7.

15A. ábra: A pMa/c5-8 szerkezete.

A pMa típusú vektor 3409-es nukleotidjában az A-t

G-ra cseréltük, míg a pMc típusú vektorban a 2238-as nukleotidban a G-t C-re cseréltük, így a klóramfenikol acetil-transzferáz génben, illetve a β-laktamáz génben amber stop-kodonokat hoztunk létre, így inaktiválva az adott géneket (P. Stanssens és mtsai, „Oligonucleotidedirected construction of mutations by the gapped duplex DNA method using the pMa/c plasmid vectors”, az EMBO laboratóriumi tanfolyam kézikönyve, a „Directed Mutagenesis and Protein Engineering” tanfolyamot 1987. július 4-18. között tartották Martinsriaedben, a Max Planck Intsitut fúr Biochemieben).

Az ábrában megadott szekvencia a pMa5-8 szekvenciája.

15B. ábra: A pMa/c5P_R expressziós vektorban lévő lambda P_R promoter szekvenciája (a pMa/c5-8 3754-gyel kicseréltük),

15C. ábra: A pMa/c5T expressziós vektorban lévő Tac promotor szekvenciája (a pMa/c5-8 3754 nukleotidját a 3769-cel kicseréltük).

16. ábra: A vad típusú Actinoplanes missouriensis glükóz-izomeráz teljes génszekvenciája és az abból következő aminosav-szekvencia.

17. ábra: A pMa/c-Ι glükóz-izomeráz expressziós egységének fizikai géntérképe.

A releváns restrikciós helyek pozícióit, a P_R promoter és a fehérje kódoló régiókat megjelöltük. A csillagok a meghatározott helyre irányított mutagenezissel bevitt restrikciós helyeket jelzik.

18. ábra: A glükóz-izomeráz mutáns tulajdonságai különböző pH-n.

AmiWT: A pMa-Ι plazmid által termelt vad típusú A. missouriensis glükóz-izomeráz.

AmiK253R: Mutált pMa-Ι K253R plazmid által termelt mutáns K253R glükóz-izomeráz.

Külön ábrázoljuk az AmiWT([]) és az AmiK253R (o) mért k_d értékeit. Látható, hogy az AmiK253 k_d értéke széles pH-tartományban kedvezőbb.

19. ábra: A Streptomyces murinus glükóz-izomeráz teljes génszekvenciája és az abból következő aminosav-szekvencia.

20. ábra: A pMa/c-GIsmul glükóz-izomeráz (GI) expressziós egységének fizikai térképe. A releváns restrikciós helyek pozícióit, a Tac promoter és a fehéqét kódoló régiót jeleztük.

21. ábra: A különböző eredetű glükóz-izomerázok aminosav-szekvenciáinak összehasonlítása. Az Actinoplanes missouriensis glükózizomeráz teljes szekvenciáját megadjuk, míg a más eredetű glükóz-izomerázok esetében csak az Actinoplanes missouriensis glükóz-izomeráztól eltérő aminosavakat adjuk meg. Az Ampullaria glükóz-izomeráz amino sav-szekvenciája egy aminosav esetében eltér a korábban közölt szekvenciától [Saari, J. Bacteriol., 169, 612, (1987)]: a közölt 177. prolinról megállapítottuk, hogy arginin.

HU 214 783 Β

A Streptomyces thermovulgaris glükóz-izomeráz szekvenciáját csak a 346. aminosavig határoztuk meg; a meg nem határozott aminosavakat () jellel jelöltük.

A (-) aláhúzás azt jelenti, hogy ezen a helyen hiányzik egy aminosav a többi szekvenciával összehasonlítva. A különböző fágokat a következőképpen jelöltük:

Ami: Actinoplanes missouriensis DSM 4643 Amp: Ampullaríella species ATCC 31351 Art: Arthrobacter species

Smu: Streptomyces murinus DSM 40091

SvN: Streptomyces violaceoniger CBS 409.73 Svr: Streptomyces violaceoruber LMG 7183 Sth: Streptomyces thermovulgaris DSM 40444

A jelen találmány szerint mutáns glükóz-izomeráz enzimeket lehet tervezni, ami a vad típusú glükózizomerázok szerkezetének gondos meghatározásán és az eredeti glükóz-izomerázoknak az alkalmazási körülmények közötti inaktiválódásához vezető folyamatok részletes biokémiai vizsgálatán alapul, és ezt követi a vad típusú gén szekvenciájának megfelelő módosítása. A tervezett mutánsok ipari alkalmazási körülmények közötti kiterjedt vizsgálatának eredményeképpen kedvezőbb tulajdonságokkal rendelkező mutánsokat azonosítottunk.

A glükóz-izomeráz enzimekkel kapcsolatban használt „kedvezőbb tulajdonságok” alatt a megfelelő vad típusú enzimekhez viszonyítva magasabb konverziós értéket és/vagy kedvezőbb stabilitást, különösen hőstabilitást értünk. Ezenkívül a különböző pH-knál nagyobb stabilitást, vagy ennek és a fokozott hőstabilitásnak az együttes megjelenését tekintjük „kedvezőbb tulaj donságoknak”.

A jelen találmány azon a felismerésen alapszik, hogy bizonyos enzimek aktivitása abban az esetben optimális, ha az enzimek multimer (dimer, trimer, tetramer stb.) formában vannak, és az adott aktivitás csökkenhet az alegységek közötti kölcsönhatások csökkenése következtében. Azt tapasztaltuk például, hogy az Actinoplanes missouriensis glükóz-izomeráz csak a tetramer szerkezetben aktív. Ez az aktivitás lényegében elvész, ha a natív tetramer szerkezet dimerré disszociál.

Ezért a jelen találmány olyan új mutáns glükózizomerázok előállítását teszi lehetővé, amelyekben az alegységek (monomerek, dimerek stb.) közötti kölcsönhatások nagyobb mértékűek, ami az enzimek kedvezőbb tulajdonságait eredményezi, különösen a felhasználás körülményei között. A találmány módszereket is megad, amelyekkel fokozni lehet a glükóz-izomeráz alegységek közötti kölcsönhatásokat.

A glükóz-izomeráz tetramer szerkezet stabilizálásának az előnyös megvalósítása úgy érhető el, hogy a tetramerben lévő dimerek közötti kölcsönhatásokat erősítjük.

A tetramer szerkezet stabilitásának a javítására alkalmas módszer például ionos hidak létrehozása. Jól ismert, hogy elektrosztatikus hatások alapvető szerepet játszanak az enzimek funkciójában és szerkezetében [lásd: J. A. Matthew és mtsai: CRC Critical Reviews in Biochemistry, 18, 91-197 (1985)]. Ők például arról számolnak be az enzimes katalízis pH-tól való függésével kapcsolatban, hogy az adott fehérje pH-optimumát az aktív helyet körülvevő ionizálható csoportok jelentése szabja meg. A hidrogén-kötések és ionos (só) hidak létrehozásában résztvevő elektrosztatikus kölcsönhatások fontosak az egész fehérjeszerkezet stabilizálása szempontjából [lásd: A. J. Russel és A. R. Fersht, Natúré, 36, 496-500 (1987)]. Annak a feltételezésnek az alapján, hogy a glükóz-izomeráz tetramer disszociációja dimerré a legnagyobb mértékben felelős az enzim denaturálódásáért, ez a folyamat megelőzhető oly módon, hogy a belső érintkezőfelületekre stabilizáló kölcsönhatást kifejtő további kiegészítő só-hidakat viszünk.

Egy adott fehérjébe új só-hidak bevitelére az egyik lehetőség az, hogy két szomszédos aminosavat helyettesítünk ellentétes töltésű aminosavval, például Asp-t és Arg-t, majd energiaprofil számításokkal megvizsgáljuk, hogy létrejött-e az ionos kölcsönhatás. Az ilyen új sóhíd bevitele kétpontos mutációt igényel. Egy másik módszer szerint létrehoztunk egy só-hidat oly módon, hogy egy izolált, töltéssel rendelkező aminosavhoz közeli aminosavat helyettesítünk, így egy egypontos mutációval hozunk létre egy ionos párt.

A tetramer szerkezet stabilitásának a fokozására egy másik alkalmas módszer a diszulfid-hidak létrehozása. A diszulfid-hidak jelenléte általános jellemvonása a legtöbb extracelluláris fehérjének. Ezeknek a keresztkötéseknek a szerepe legtöbbsör a fehérje stabilizálása, ez a hatás egyike a legismertebbeknek. Általában a nemszéttekeredett forma entrópiájának a csökkenésével magyarázzák, de több, eddig még meg nem magyarázott tény van ezenkívül. T. E. Creighton [Bioassays, 8, 57-63 (1988)] szerint a natív állapotba bevitt perturbációt is figyelembe kell venni.

Az irodalomban több, a diszulfid-hidak bevitelére irányuló kísérletről számolnak be, amelyek különböző eredményekkel jártak. Pantoliano és mtsai [Biochemistry, 26, 2077-2082 (1987)] a szubtilizinbe a génben végzett pontmutációkkal két ciszteint vittek be, így az olvadáspont 3 °C-kal való megnövekedését érték el. J. E. Villafranca és mtsai [Biochemistry, 26, 2182-2189 (1987)] a dihidrofolát-reduktázba pontmutációval egy ciszteint vittek be, kihasználva azt az előnyt, hogy a vad típusú enzimben egy szabad cisztein van, és így létrehoztak egy diszulfíd-hidat. Ennek a diszulfid-hídnak azonban nem várt hatása az volt, hogy a mutáns enzim hődenaturációval szembeni ellenállása nem növekedett, de ellenállóbbá vált a guanidin-hidrokloridos denaturációval szemben. Ebben a két esetben a mutáns enzimek nem érték el a várt stabilitást.

Amint az előbbiekben bemutattuk, a fenti két út alkalmas akár egypontos, akár kétpontos mutáció létrehozására. Multimer fehérjék (enzimek) esetében, amelyek szimmetrikus tengely mentén lévő monomer egységekből állnak, egy harmadik lehetőség is fennállhat: egy diszulfíd-híd létrehozása egypontos mutációval szabad cisztein jelenlétének az igénye nélkül. Ezt a módszert eredményesen alkalmazták Sauer és mtsai [Biochemistry, 25, 5992-5998 (1986)] a lambda-represszor esetében: az olvadási hőmérséklet 10 °C-os

HU 214 783 Β emelkedését érték el, a karbamidos denaturációval szembeni rezisztencia 60%-kal növekedett, és kedvezőbb lett a kötési állandó is.

Az utóbbi módszer egyik előfeltétele az, hogy legalább két monomer között egy szimmetriatengely legyen. Egy szimmetriatengely egyben rotációs tengely is, ezen tengelyek tulajdonságainak az egyike, hogy egy pont és a tengely közötti távolság a rotáció során megmarad. így a multimer szerkezet szimmetriatengelye közelében létrehozott pontmutációnak ehhez a ponthoz közel kell létrejönnie. Ez a módszer azzal az előnnyel jár, hogy egy egypontos mutációval egy intermonomer diszulfid-híd vihető be.

A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a glükóz-izomeráz tetramer szerkezetének a stabilizálása elérhető a dimer szerkezet stabilizálásával. Ez úgy képzelhető el, hogy az enzim denaturálódása részleges, a tetramer dimerekké és ezt követően a dimerek monomerekké való disszociációjának a reakciója reverzibilis. A dimer szerkezet stabilizálásával a dimer denaturálódásának folyamata lelassul, és annak következtében a tetramerré való visszaalakulás mértéke javul. Azoknak a szubsztitúcióknak, amelyek csökkentik a monomer és/vagy dimer szerkezetek érzékenységét a kémiai módosulásokkal szemben, szintén van stabilizáló hatásuk, így megakadályozzák a fehéije széttekeredésének az irreverzibilitását.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja a tetramer szerkezet indirekt módon, speciális mutációkkal történő stabilizálása a dimer szerkezet stabilizálásán keresztül, vagy még inkább a glükózizomeráz monomer szerkezetének a stabilizálásával. Megváltoztatva a monomer és/vagy dimer szerkezet összeépülését, a tetramer szerkezet minden egyes részének a konformációs szabadsága csökken, ami stabilizáló hatású a tetramerre.

Nyilvánvaló, hogy a mutációk az enzim alegységek közötti kölcsönhatások stabilizálása mellett képesek stabilizálni a feltekeredett monomer fehérjén belüli domének kölcsönhatásait is.

Az ezen a területen jártas szakember számára az is világos, hogy ha csökkent stabilitású glükóz-izomerázt kívánunk nyerni, a fent leírt stabilizáló erőket hasonló módszerek alkalmazásával gyengíthetjük. Az ilyen tulajdonságokkal rendelkező mutánsok és az ilyen mutánsok előállítására alkalmas eljárások szintén tárgyát képezik a jelen találmánynak.

A jelen leírásban az aminosavak jelölésére a hárombetűs és az egybetűs kódokat is alkalmazzuk. A kódokat az alábbi 1. táblázatban adjuk meg.

1. táblázat

Alanin	Alá	A	Leucin	Leu	L
Arginin	Arg	R	Lizin	Lys	K
Aszparagin	Asn	N	Metionin	Met	M
Aszparaginsav	Asp	D	Fenilalanin	Phe	F
Cisztein	Cys	C	Prolin	Pro	P
Glutaminsav	Glu	E	Szerin	Ser	s

Glutamin	Gin	Q	Triptofán	Trp	W
Glicin	Gly	G	Tirozin	Tyr	Y
Hisztidin	His	H	Valin	Val	V
Izoleucin	Ile	I

A találmány egy olyan módszert is tartalmaz a glükóz-izomeráz alegységek közötti kölcsönhatások javítására, amely eljárás a molekulák háromdimenziós („3D”) szerkezetén alapul. Az enzim (vagy az enzimkomplex) 3D szerkezetének az ismerete nagyon fontos, mert segítségével előre lehet tudni, hogy milyen mutációkat lehet végrehajtani.

A különböző mikroorganizmusok által termelt glükóz-izomerázok szerkezetével kapcsolatban több irodalmi adat áll rendelkezésünkre: Streptomyces rubiginosus [Carell és mtsai, J. Bioi. Chem., 259, 3230-3236 (1984)]; Streptomyces olivochromogenes [Farber és mtsai, Protein Eng., 7, 459-466 (1987)]; Arthrobacter [Henrich és mtsai, Protein Eng., 7, 467-^175 (1987)].

Bár ezeknek az enzimeknek az aminosav-szekvenciájára vonatkozó adatok nem állnak rendelkezésre, az Actinoplanes missouriensis glükóz-izomerázzal való 3D szerkezeti homológiájuk szembetűnő [lásd: F. Rey és mtsai: Proteins, 4, 165-172 (1988)]. A jelen leírásban megadott módszer általános alkalmazhatóságának a bemutatására a különböző fajokból származó glükózizomeráz géneket klónoztuk, és meghatároztuk szekvenciájukat. A Streptomyces violaceoruber, Streptomyces murinus, Arthrobacter spec. és Streptomyces thermovulgaris génjeiből következtetett glükózizomeráz aminosav-szekvenciákat homológnak találtuk. Az Ampullariella sp. (lásd Saari előbbi hivatkozását) és a Streptomyces violaceoniger [Nucl. Acids Rés., 76, 9337 (1988)] glükóz-izomeráz közölt aminosavszekvenciáit a megfelelő gén nukleotid szekvenciájából következtették, ezek a szekvenciák szoros homológiát mutatnak az Actinoplanes missouriensis glükózizomerázzal. Ezen kívül a WD 89/01520 leírja, hogy a Streptomyces rubiginosus glükóz-izomeráza homológ az Ampullariella sp. glükóz-izomerázával.

Annak ellenére, hogy a legtöbb glükóz-izomeráz esetében nem áll rendelkezésünkre adat a 3D szerkezettel kapcsolatban, le lehet vonni azt a következtetést, hogy minden Actinomycetalesből származó glükózizomeráz hasonló tetramer szerkezetű.

A találmány egyik tárgya szerint a glükózizomerázba a következők szerint lehet bevinni ionos hidakat: megkeressük a glükóz-izomeráz azon negatív töltésű csoportjait (Asp és Glu, amelyek az illető felhasználás körülményeinek pH értékénél ionizálnak), amelyeknek a karboxilcsoportja legalább 8^χ1θ-’° m (8 Á) távolságra van a pozitív töltésű atomoktól (a Lys és Arg kinyúló, disztális nitrogénjei). Tizennégy aminosavat találtunk, amelyek megfelelnek a fenti követelményeknek. Ezek közül kiválasztottuk azokat, amelyek a határfelületen helyezkednek el és azokat, amelyek a fehérje belsejében találhatók. Ez utóbbi megkötést abból a célból alkalmaztuk, hogy kiküszö5

HU 214 783 Β böljük a fehérje felületén való só-hidak képződésének a lehetőségét, amelyekről feltételeztük, hogy kisebb hatást fejtenek ki az általános stabilitásra (a szabadon álló, töltéssel rendelkező csoportok a vízmolekulákkal létesített hidrogénkötésekben és az ellenionokkal való kölcsönhatásban is részesek lehetnek). Eszerint egy belső, fedett csoportot tartalmazó új só-híd létrehozása két stabilizáló hatás kombinációját jelenti: először, eliminálja a nem kívánatos fedett izolált töltést, másodszor egy olyan ion-párt hoz létre, amely védett a szubsztrát vagy az oldószer hatásával szemben.

Az Actinoplanes missouriensis glükóz-izomeráz izolált 14 negatív töltésű aminosava közül 3 helyezkedik el a határfelületen: az Asp 146, Glu 221 és Asp 264. Ezek mindegyike viszonylag fedett (a tetramerben hozzáférhető felület: 46,9 és 42 Á²). A találmány előnyös megvalósítása szerint ezeket az aminosavakat magában foglaló új só-hidakat hoztunk létre az alább leírt módszerek alkalmazásával. Hasonló mutációkat lehet végrehajtani más, az előbb említett forrásokból eredő glükózizomerázokban is.

A fent leírt vagy a szakemberek által ismert technikákat alkalmazva különböző többpontos mutációkat lehet végrehajtani abból a célból, hogy fokozzuk a glükóz-izomeráz tetramer szerkezetének a stabilitását. (Az Actinoplanes missouriensis glükóz-izomeráz szerkezeti adatait lásd: F. Rey és mtsai előbb idézett közleményében.)

Ezek között a következő mutációk vannak kapcsolatban egy monomer alegység stabilitásával:

- a Gly szubsztitúciója más aminosavval (α-hélix B) abból a célból, hogy a széttekeredett állapot entrópiáját csökkentsük;

- egy flexibilis hurok kihasítása (az α-hélix G és a β-szál H között) a szabad hidrofób felület csökkentésére;

- a β-szál E kezdeténél egy Pro bevitele (csökkenti a széttekeredett állapot entrópiáját);

- mutáció Phe-vé (α-hélix G) abból a célból, hogy aromás aminosavakból álló csoportot hozzunk létre, és ezzel még egy külön hatást fejtsünk ki a fehérjeszerkezet stabilitására.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja szerint a lizint argininnel helyettesítjük a glükózizomeráz molekula azon helyein, amelyeken a stabilitás növekedését véltük elérni. Mindkét aminosavnak a fehérje 3D szerkezetében térbelileg hozzáférhetőnek kell lenni.

A fehérjékben a lizin hajlamos a kémiai módosulásra, de az arginin nem. így ismert, hogy a lizin epszilon aminocsoportja aldehidekkel és ketonokkal Schiffbázist képezve reagál, és további módosult anyagok keletkeznek, amely reakciók a biológiai aktivitás elvesztését eredményezik [lásd például: P. Higgíns és H. Bunn, J. Bioi. Chem., 256, 5204-5208 (1981)]. Különösen a glükóz-izomeráz felhasználás során, ahol nagy koncentrációban van jelen glükóz és fruktóz magasabb hőmérsékleten, ezek a kémiai módosulások fontos tényezőt jelentenek az enzim inaktiválásában. Ahol lizin van a domének és/vagy alegységek közötti határfelületen, az ezeken a helyeken végbemenő kémiai változás elősegíti a dómén és alegység disszociációt, és/vagy megakadályozza a domének és alegységek helyes reasszociációját, ennek következtében irreverzibilisen rögzíti ezek disszociált állapotát. Ezeken a helyeken mutációval a lizint argininnel helyettesítve kiküszöbölhető a lizin epszilon aminocsoportjának kémiai módosulása.

A glükóz-izomeráz molekulában a lizin-csoportokat specifikus arginin-csoportokra cserélve, a kémiai módosulás mértéke és annak hatása az enzimaktivitásra és/vagy a stabilitásra csökken. Következésképpen, egy lizin kicserélése argininre meg fogja javítani a glükózizomeráz stabilitását a felhasználás során.

Tehát a térbelileg alkalmas helyeken a lizinnek mutációval argininra való cserélése, azaz a lizin helyettesítése argininnel a fehérje stabilitásának a fokozódását eredményezi. Minthogy a guanidion-csoport jelenlétének a következtében az arginin-oldallánc flexibilitása kisebb, mint a liziné, a lizin argininra történő mutációja előnyös az entrópia szempontjából. Ezen kívül a guanidino-csoport képes több hidrogénkötést létrehozni a fehérjében a szomszédos aminosavak között, amely szintén javítja a stabilitást.

A találmány egy másik előnyös megvalósítása szerint, főleg abban az esetben, amikor a glükóz-izomeráz hővel szembeni stabilitását kívánjuk elérni, a kezdetben jelenlévő legalább egy lizin-csoportot és főleg az alábbiakban meghatározott helyeken lévő lizin-csoportot cserélünk ki argininre. A lizin helyettesítése argininnel megjavítja az elektrosztatikus (főleg az alegységek és/vagy domének határfelületei között létrejövő) kölcsönhatásokat, amelyekben részt vesz a helyettesítő arginin-csoport. Ezen megvalósításban előnyös a helyettesítendő lizin-csoport szempontjából, ha a feltekeredett, natív fehérje konformációban megfelel az alábbi követelményeknek:

1. A helyettesítendő csoportnak közvetlenül részt kell venni az elektrosztatikus kölcsönhatásokban, előnyösen az alegységek és/vagy domének határfelületein kell lennie.

2. A mutáció azon a helyen jöhet létre, amely térbelileg hozzáférhető a bevitt aminosav-csoport számára.

3. A csoportnak az oldószerek számára hozzáférhető helyen kell lennie, és előnyösen az alegységek és/vagy domének határfelületén kell elhelyezkednie. Előnyös, ha a glükóz-izomerázban olyan aminosavcsoportokat keresünk, amelyek megfelelnek az 1. és 2. követelményeknek, a fehérjében a legkisebb a hozzáférhető felületük (accesible surface area, továbbiakban ASA), ezzel párhuzamosan szükséges, hogy az ASA értéke alacsonyabb legyen, mint az adott csoport esetében átlagosan meghatározott. Azokon a helyeken, amelyek megfelelnek ezen követelményeknek, az oldallánc guanidino-csoportjának tulajdoníthatóan az arginin a lizinnel összehasonlítva egy kedvezőbb elektrosztatikus kölcsönhatást fejt ki [lásd többek között: D. Wigley és mtsai: Biochem. Biophys. Rés. Comm., 149, 927-929 (1987)].

HU 214 783 Β

Feltétlenül szükséges, hogy a jelen találmány szerint módosított mutáns glükóz-izomeráz megtartsa az eredeti enzimaktivitását. Ennek az enzimaktivitásnak a megtartására a helyettesítendő aminosav-csoport előnyösen nem azonos a katalízisben résztvevő csoportokkal vagy a kofaktor kötésben résztvevő csoportokkal.

Nyilvánvaló, hogy a jelen találmánynak megfelelően egy specifikus aminosav szubsztitúció a glükózizomeráz stabilitását a fent említett hatások, vagyis az elektrosztatikus kölcsönhatások erősségének a megváltoztatása, a szomszédos aminosavak közötti hidrogénkötések számának a megváltoztatása, az enzim konformációs entrópiájának a változtatása vagy a kémiai módosítás mértéke a befolyásolásainak kombinációján keresztül módosíthatja.

A jelen találmány szerinti glükóz-izomeráz a következő eljárásokkal állítható elő. Először elvégezzük a glükóz-izomeráz specifikus denaturáló körülmények között végbemenő inaktiválódásában szerepet játszó mechanizmus, illetve mechanizmusok alapos vizsgálatát. Ezek vizsgálatok eredményeiből kapott ismeretek felhasználásával azonosítjuk a specifikus lizin- vagy arginin-csoportokat, amelyek helyettesíthetők lehetnek. Ezt az enzim 3D szerkezetének az alapos vizsgálatával határozzuk meg olyan módszerekkel, mint például krisztallográfia [H. Wyckoff és mtsai: „Differentation Methods fór Biological Macromolecules”, Meth. Enzymol, 114-115. kötet (1985), Acad. Press], NMR analízis [K. Wurthrich, „NMR of Proteins and Nucleic Acids” J. Wiley and Sons (1986)], vagy a primer szerkezet alapján [összefoglalást lásd: W. Taylor, Protein Engineering, 2, 77 (1988)], vagy a homológ fehéqék rendelkezésre álló 3D szerkezetein alapuló szerkezeti származékok alapján [lásd például: T. Bundell és mtsai, Natúré, 326, 347 (1987)].

Végül, az előnyös helyen lévő aminosav helyettesítése elérhető szokásos módszerekkel, előnyösen a glükóz-izomerázt kódoló DNS-szekvencia egy helyre irányuló mutagenezisével, például Stanssens és mtsai (lásd előbb) által leírt vektorok és eljárások alkalmazásával és Zell és Fritz által leírt [EMBO J., 6, 1809 (1987)] baktériumtörzsekkel.

A fent tárgyalt mutációkat csak a találmány szemléltetéseként adtuk meg anélkül, hogy oltalmi körét korlátozni kívánnánk. A találmányt ezen kívül a továbbiakban még a következő, nem korlátozó példákkal mutatjuk be.

Amennyiben a példákban nem adjuk meg másképpen, a rekombináns DNS előállítására és kezelésére vonatkozó minden műveletet a Maniatis és mtsai (1982) által leírt standardizált eljárásokkal végeztünk.

A példákban alkalmazott vagy készített következő plazmidokat, vektorokat és baktériumtörzseket letétbe helyeztünk a „Deutsche Sammlung für Mikroorganismeri’-nél Göttingenben (NSZK) a budapesti egyezmény előírása szerint, vagy a „Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS)”-nél Baambah (Hollandia):

pMc5-8 DSM 4566 pMa5-8 DSM 4567 pECOR251 DSM 4711

E. coli K527 CBS 471.88

1. példa

Az actinoplanes missouriensis (DSM 43046)-ból származó glükóz-izomeráz gén izolálása és klónozása. D-glükóz-izomeráz termelése E. coliban

A D-glükóz-izomeráz (GI) elnevezést a Dxilózizomeráz [(D-xilóz)-ketolizomeráz, EC 5.3.1.5] szinonimájaként használjuk. Ez az enzim a D-xilózt Dxilulózzá izomerizálja. Az Actinoplanes missouriensis által termelt D-glükóz-izomerázt E. coli törzsekkel állítottuk elő, és ezeket EcoAMI(DSM)GI-vel jelöltük. Az Actinoplanes missouriensis Gl-t kódoló gént Gl-vel jelöljük az analóg E. coli xylA géntől való megkülönböztetés céljából.

Az Actinoplanes missouriensis DSM 43046-ból nyert teljes DNS-t Sau3A-val részlegesen emésztettük. Az emésztett terméket szacharóz gradiensen frakcionáltuk, és a 2 és 7 kilobázis (kb) közötti méretű fragmentumokat a pECOR251 plazmid egyetlen BglII helyére ligáltuk. A xilóz deficiens AB 1886 E. coli törzset - amint azt Howard és mtsai [Genetics, 53, 1119 (1966)] leírják és amely az AB 1157 (DSM 1563) E. coli törzsből származik - a ligációs eleggyel transzformáltuk, majd ezt követően olyan minimál-agar lemezeken [Miller (1972) „Experiments in Molecular Genetics”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.] tenyésztettük, amelyet 100 mg/1 ampicillinnel és 0,2 tömeg% xilózzal egészítettük ki (MMX). Harminchét kiónt nyertünk (ezeket ρΑΜΠ-137-tel jelöltük), és 100 mg/1 ampicillin tartalmú LB táptalajon szaporítottuk. Izoláltuk a rekombináns plazmid DNS-ζ és restrikciós enzimes hasítással analizáltuk azt. A plazmidok két csoportja volt felismerhető, az egyik (pAMI7) egy 2,8 kb méretű inszertumot, a másik (pAMI25) egy 4,0 kb méretű inszertumot tartalmaz. Egy alapos restrikciós analízis szerint mindkét inszertum egy közös, 2,0 kb méretű részt tartalmaz. Ennek a régiónak a szekvencia-analízisét kémiai lebontásos módszerrel elvégezve [A. Maxam és W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560 (1977)] azt találtuk, hogy a 1182 nukleotid hosszúságú nyitott leolvasási keret azonos a Gl-t kódoló régióval. A GI nukleotid szekvenciáját és az ebből eredő aminosav szekvenciát a

15. ábra mutatja be. A következőkben az aminosavak számozásánál erre a 15. ábrára utalunk.

A GI igen magas értékű expressziója érhető el E. coliban a gént a lambda-bakteriofág jobboldali irányú P_R promoterének a transzkripciós szabályozása alá helyezve a következő módon:

A pLK94 plazmidot [J. Botterman és M. Zabeau, DNA, 6, 583 (1987)] először a β-laktamáz gén PstI helyének az eliminálásával módosítottuk. Ezt úgy végeztük el, hogy izoláltuk a β-laktamáz gén N-terminális részét tartalmazó pLK70-70p 880 bp hosszúságú EcoRI/PstI fragmantumát és a β-laktamáz gén C-terminális részét tartalmazó pLK941700 bp hosszúságú EcoRI/PstI fragmentumát, valamint a replikációs origót. Ezután ezeket a fragmentumokat ligáivá kaptuk a pLK94p-t.

A pAMI7-et a Pstl-al hasítottuk, és az 1800 bp körüli hosszúságú két tisztított fragmentum elegyét, amelyek közül az egyik tartalmazza a GI gént, a

HU 214 783 Β pLK940 PstI helyére ligáltuk. A ligációs elegyet használtuk fel az AB 1886 E. coli törzs transzformálására. Az ampicillin rezisztens GI⁺ transzformátumokat MMX-en tenyésztve nyertük.

Néhány kiválasztott transzformátumból izoláltuk a plazmid DNS-t, és azokat restrikciós analízissel megvizsgáltuk. A Gl-t tartalmazó PstI fragmentumot magában foglaló pLK94p plazmidot pLK94GI-nek neveztük el. A GI orientációja olyan, hogy az egyetlen BamHI hely a GTG iniciációs kodontól „upstream” 5’ irányban körülbelül 470 bp távolságban helyezkedik el.

A pLK70-70p-t Pstl-gyel hasítottuk, DNS polimeráz I-gyel (Klenow-fragmentum) tompa végűvé tettük, majd ezt követően Xbal-gyel emésztettük.

A pLK94GI-t BamHI-gyel linearizáltuk, és Bal31 exonukleázzal emésztettük. A különböző időpontokban kivett mintákat - a reakciót dinátrium-etiléndiamintetraacetáttal (továbbiakban EDTA) leállítva Xbal-gyel hasítottuk, és gélelektroforézissel meghatároztuk a hasított BamHI-Xbal fragmentumok átlagos molekulaméretét. Az 1350 és 1450 bp közötti méretű fragmentumokat eluáltuk a gélből. Ezt a fragmentumot pLK70-70p-be ligáltuk. K.514 E. colit [C. Colson és mtsa Genetics, 52, 1043 (1965)] transzformáltunk a ligációs eleggyel, és kiválasztottuk az ampicillin rezisztens transzformánsokat 37 °C-on. A különböző transzformánsokból izolált plazmid DNS-t restrikciós analízissel vizsgáltuk. Huszonnégy intakt Gl-vel rendelkező plazmidot tartalmazó kiónt nyertünk, és megvizsgáltuk az EcoAmi(DSM)GI termelésüket. A tenyészeteket éjjelen át 37 °C-on tartottuk, majd a teljes sejtkivonatot poliakrilamid gélelektroforézissel (továbbiakban PAGE) frakcionáltuk 12,5% nátrium-dodecilszulfát (sodium-dodecyl-sulfate, továbbiakban SDS) jelenétében [U. Laemmli, Natúré, 227, 680 (1970)]. Összehasonlítva egy nem-transzformált kontroll K514 tenyészettel, az egyik klónról megállapítottuk, hogy egy 42 kilodaltonos (kd) méretű új fehérjét szintetizál nagy mennyiségben, amelyet Westem-blot analízissel azonosítottunk az EcoAMI(DSM)GI-vel, az analízishez tisztított Actinoplanes missouriensis Gl-vel szemben kifejlesztett poliklonális szérumot használtunk. Az E. coli K514-en magas EcoAmi(DSM)GI termelést biztosító plazmidot pLK70GI-nek neveztük el.

A Pr-Gí transzkripciós egység kihasítható EcoRI-XbaO fragmentumként, amelynek a szekvenciáját a 16. ábrában adjuk meg. Az agarózgélről történő elúció után a fragmentumot a pMa5-8-hoz és a pMc5-8-hoz ligáltuk, amelyeket EcoRI-el és Xbal-gyel hasítottunk, így kaptunk a pMa5-GI-t, illetve a pMc5-GI-t. Ezekről a vektorokról megállapítottuk, hogy egyenlő mértékben és hatásosan biztosítják az EcoAmi(DSM)GI szintézisét, és az expressziós szint nem tér el szignifikánsan a pLK70GI-vel elérttől.

A GI expresszióját tovább fokozhatjuk a GTG iniciációs kodont ATG triplettre cserélve. Ezt a 4. példában leírt egy helyre irányított mutagenezissel valósítottuk meg, indítóanyagként a ’-GGAC AGACATGGTTACC-3 ’ oligonukleotidot használva.

A K514 E. coli törzs vad típusú és mutáns GI enzimeket termel olyan táptalajon tenyésztve, amely 1% triptont, 1% nátrium-kloridot, 0,5% élesztőkivonatot és a pMA típusú vektor esetében ampicillint (100 mg/lit), a pMC típusú vektor esetében klóramfenikolt tartalmaz (25 mg/lit). A sejteket éjjelen át tenyésztettük 37 °C-on, majd centrifúgáltuk a tenyészetet. Az EcoAmi(DSM)GI enzimet a következőkben leírt módon lehet tisztítani. A sejtüledéket minimális térfogatú 0,05 M trisz(hidroximetil)-amino-metán (a továbbiakban tris/HCl), 0,1 mM kobalt(II)-klorid, 10 mM magnézium-klorid, 0,2 M kálium-klorid, 5% glicerin és 5 mM EDTA tartalmú pH=8,0 oldatban felszuszpendáltuk, az elegyhez 1,0 mg/ml végkoncentrációig lizozimet adtunk. 20 percig 0 °C-on állni hagytuk, a sejteket „French press” (sejtroncsoló berendezés) segítségével lizáltuk, centrifúgáltuk (30 perc, 23 000 g), a felülúszót azonos térfogat 5%-os streptomicin oldattal felhígítottuk. Három órán át inkubáltuk 4 °C-on, majd centrifugáltuk (30 perc, 23 000 g). A kapott felülúszót 70 °C-on tartottuk (a K253Q és a K100R mutánsokat csak 50 °C-ra melegítettük fel) 30 percen át, és ismét centrifugáltuk. A felső fázishoz 80 tömeg% koncentrációig ammónium-szulfátot adtunk. A csapadékot, amely az enzimaktivitás legnagyobb részét tartalmazta, centrifúgálással összegyűjtöttük, majd ismét feloldottuk 0,02 M tris/HCl, 5 mM EDTA, 0,85 M ammónium-szulfát oldatában. Ezt követően Phenyl-Superose, Sephacryl S-200 HR, majd végül Mono-Q HR 10/10 oszlopokon kromatografáltuk. Lényeges, hogy a kromatografálások során minden pufferhez hozzáadjunk 5 mM EDTA-t, hogy kiküszöböljük a fémionok jelenlétét. Felhasználás előtt a kapott enzimet háromszor dializáltuk 200-szoros térfogatú 10 mM EDTA-t tartalmazó 10 mM trietanolamin (pH=7,2) oldattal szemben (a végső pH 5,2 körüli), majd ismét dializáltuk 200-szoros térfogatú 5 mM (2-N-morfolino)-etánszulfonsavat (a továbbiakban MES) tartalmazó, pH=6,0 oldattal szemben, a puffért háromszor váltva. A végtermék enzimkészítmény fémion tartalmát atomabszorpciós spektrometriával határoztuk meg Varian SpectrAA 30/40 készüléken, és megállapítottuk, hogy az EcoAmi (DSM) GI fémmentes; az enzimhez igen nagy affinitással kötődő kobalt ionokat csak +1^10^-4 mól per mól EcoAmi (DSM) GI monomer mennyiségben tartalmazta. Ha az EDTA-t kihagyjuk a kromatográfiás elegyekből, az utóbbi érték 0,5 mól kobalt per mól enzim monomer értékre növekszik. Az EcoAmi(DSM)GI tisztaságát SDS-PAGE-vel ezüst festéssel, valamint Vydac C4 oszlopon végzett fordított fázisú nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával (high performance liquid chromatography, továbbiakban HPLC) vizsgáltuk.

A glükóz-izomeráz enzimaktivitását az alábbiakban leírt módon vizsgáltuk. 1 egység enzimaktivitás percenként 1,0 mikromol D-xilulózt vagy D-fruktózt termel; a specifikus aktivitást (spa) egység/mg GI enzimben fejezzük ki.

A D-xilóz-izomerázok lemezes elektroforézise után a láthatóvá tétel módszerét már korábban leírták [K. Yamanaka, Bull. Yamaguchi Med. School, 18,

HU 214 783 Β (1971)]: a trifenil-tetrazolium-klorid (továbbiakban TTC) módszer. Ez a festési mód azon alapszik, hogy a cukrok a tetrazolium sóval reagálva formazán képződik. A szobahőmérsékleten végbemenő reakció jellemző a ketózokra, míg az áldozok csak 100 °C-on reagálnak. így a gélen rózsaszínes-vöröses csíkként azonosítani lehet az aktív xilóz-izomerázt. Ezt az aktivitási tesztet kis módosítással alkalmassá tettük a Pharmacia Phast Systemben való felhasználásra. Röviden: az elektroforézist követően a natív PAGE gélt a PhastSystem festő edényébe helyeztük, és 15 percen át 50 °C-on inkubáltuk 20 mM tris/HCl, pH=7,2 oldattal, amely 50 mM xilózt, 10 mM magnézium-kloridot és 0,1 mM kobalt(II)-kloridot tartalmazott. Miután sómentesített vízzel 0,5 percen át mostuk 4 °C-on, a gélt 3 percre 20 °C-on 0,1 t%-os trifenil-tetrazoliumklorid 1 N nátrium-hidroxid oldattal frissen készült oldatába merítettük: a reakciót a gél 15 percen át 20 °Con 2 N sósavoldatba mártásával állítottuk le, végül vízzel mostuk (0,5 perc, 4 °C).

A Gl-aktivitás közvetlenül is meghatározható a 35 °C-on képződött xilulóz mennyiségének a 278 nm hullámhosszon mért adszorpciója alapján, amely xilulóz a glükóz-izomeráz xilóz izomerizálása következtében keletkezik. Ezt a mérést 10 mM magnéziumszulfát tartalmú 50 mM trietanol-amin pufferben (pH=7,5) végeztük 0,1 M xilóz jelenlétében. A vizsgálat során a glükóz-izomeráz végső koncentrációja ±0,01 mg/ml volt, amely értéket pontosan meghatároztunk az enzimvizsgálathoz szükséges oldat hígítása előtt, 1,0 mg/ml-es oldatra 278 nm-en 1,08 extinkciós koefficienst alkalmazva.

A D-szorbitol-dehidrogenáz kettős vizsgálatban a D-xilulóz enzim meghatározását 35 °C-on végeztük a korábban már leírt módszerrel [Kersters-Hilderson és mtsai, Enzyme Microb. Technoi., 9, 145 (1987)] 10 mM magnézium-szulfátot és 0,1 M xilózt tartalmazó 50 mM trietanol-amin oldatban (pH=7,5) ±2* 10+* M D-szorbitol-dehidrogenáz (L-iditol: NAD oxidoreduktáz; EC 1.1.14) és 0,15 nM NADH jelenlétében, az utóbbit nem adjuk az elegyhez, ha az inkubációs puffer 1 mM etilénbisz(oxi-etilén)-nitrilol-tetraecetsavat (a továbbiakban EGTA) is tartalmazott. Ebben a vizsgálatban a glükóz-izomeráz végső koncentrációja ±2,5xl0-³ mg/ml volt, amely mennyiséget a fentiekben már leírt módon pontosan meghatároztunk.

A Gl-aktivitás glükóz-szubsztráttal való meghatározása az izomeráz reakció során keletkező D-fruktóz mérése alapján is történhet cisztein-karbazolos módszerrel (a továbbiakban CCM), amely a keto-cukrok karbazollal savas közegben végbemenő, vörös terméket eredményező reakcióján alapszik (Dische és Borenfreund, 1951).

2. példa

Az EcoAmi(DSM)GI hő okozta inaktiválódásának kinetikája

A hő-inaktiválódás kinetikájára vonatkozó kísérleteket fémionmentes glükóz-izomerázzal végeztük, és az adott példákban megadjuk a hozzáadott anyagokat. Röviden: a tisztított enzimet a leírt pufferben ekvilibráltuk, és az oldatot gázt át nem eresztő Teflon-tűs Hamilton pipettával leszívtuk, amelyet előzőleg üvegköpennyel láttunk el, és vízfürdőn keresztül cirkulációval állítottuk be a jelzett hőmérsékletre (Lauda, RM6). Az előzetes vizsgálatok azt mutatták, hogy az enzimoldat hőmérsékletének a kiegyensúlyozása 25 °C-ról 85 °C-ra kevesebb, mint egy perc alatt elérhető. A megfelelő időpontokban mintákat vettünk ki Eppendorf csövekbe, és a hő okozta denaturációs folyamatot a minták 0 °C-ra való lehűtésével állítottuk le.

Másik esetben a nagyobb mennyiségű mintákat külön részletekben inkubáltuk „reacti”-edényekben (Pierce).

1. Hőmérséklettől és fémionoktól való függés

Az EcoAmi(DSM)GI hő-inaktiválódási kinetikáját 50 mM 3-morfolino-propánszulfonsav (továbbiakban MOPS) pH=7,2 oldatban végeztük 25 °C-on (pK_a=7,15, 25 °C-on; dH/ °C=-0,001). A hőmérséklettől való függést az 1. ábrában (itt nem adtunk fémionokat az elegyhez), a 2. ábrában (+10 mM magnézium-szulfát) és a 3. ábrában [+10 mM kobalt(II)-klorid] adtuk meg. Az összes adat figyelemreméltóan megegyezik az elméleti lefutási görbékkel, amelyek elsőrendű reakciónak felelnek meg, tekintet nélkül az alkalmazott hőmérsékletre és a fémionok jelenlétére és természetére.

Az adatok a magnézium és még nagyobb mértékben a kobaltionok stabilizáló hatását bizonyítják.

A hő okozta enziminaktiválódást irreverzibilis folyamatnak találtuk; eszerint a hő fehérjeaggregációt okoz. Bizonyítani tudtuk, hogy Ng²⁺ ionok jelenlétében az enzimaktivitás-veszteség nagy mértékben függ a fehérjekicsapódás mértékétől.

A 4. ábra összegezi az 1., 2. és a 3. ábrák adatait, és azt mutatja, hogy az alkalmazott hőmérsékleti intervallumokban az Arrhenius-görbe lineáris fémionok jelenlétében és anélkül.

Ezen eredmények azt bizonyítják, hogy az EcoAmi(DSM)GI hő denaturációja minden vizsgálati körülmény között egyetlen folyamat eredménye; nem ismert, hogy ugyanazon denaturálódást korlátozó lépésről van-e szó fémek jelenétében és távollétében, de az Arrhenius-görbék linearitása alátámasztja azt a feltételezést, hogy ez az egyetlen folyamat játszódik le a specifikus kísérleti körülmények között.

2. A pH-tól és az ionerősségtől való függés

A Gl-t stabilizáló fémionok affinitása erősen függ a pH-tól; pontosabban, jelentősen csökken pH=6 alatt. Következésképpen, a pH-nak az EcoAmi(DSM)GI termostabilitására gyakorolt hatását fémionmentes enzimmel vizsgáltuk fémionok hozzáadásával és anélkül.

Az EcoAmi(DSM)GI inaktiválódásának a kinetikája 72 °C-on pH=4,7 és 8,3 között mindig elsőrendű reakció szerint megy végbe. Az 5. ábra azt mutatja, hogy az inaktiválódás sebességi állandója, a k_D gyakorlatilag változatlan marad pH=5,5 és 6,7 között, de az ettől eltérő pH-értékeknél növekszik.

A 6. ábra bemutatja, hogy az enzim hő okozta inaktiválódása hozzáadott fémionok nélkül az ion9

HU 214 783 Β erősség függvényében növekszik. Ez a pH-függés adataival együtt nagy mértékben azt mutatja, hogy az EcoAmi(DSM)GI hő-stabilitásában a poláris csoportok játszanak szerepet.

A fentieket még alátámasztják a 7. ábrában található adatok, amelyekből látható, hogy a pH mérsékelt növekedése (azaz pH=6,7-ről pH=7,6-ra 72 °C-on) jelentősen megnöveli a nátrium-klorid destabilizáló hatását.

3. A karbamid és a danát hatásai

A GI négy azonos alegységből álló tetramer (F. Ray és mtsai előbbi hivatkozása).

A karbamid és a cianát hatást abból a célból vizsgáltuk, hogy megismerjük azon szerkezeti változásokat, amelyek a hőhatás eredményeképpen létrejövő enzimaktivitás-veszteséget okozzák, azaz az alegység-disszociációt és/vagy széttekeredést.

Az enzim oligomerizált állapotát méretkizárásos nagyhatású folyadékkromatográfiával (Size-exclusion high performance liquid chromatography, továbbiakban SEC-HPLC) vizsgáltuk Superose-12 oszlopon szobahőmérsékleten, elúciós pufferként 50 mM tris/HCl pH=8,0 és 150 mM nátrium-klorid oldatot használva 25 °C-on, majd ezt követően az enzimet szobahőmérsékleten tartósan inkubáltuk.

A natív GI a SEC-HPLC során tetramerként oldódott le. A 8. ábra azt mutatja, hogy a natív EcoAmi(DSM)GI tetramer dimerré történő disszociációjához tartós inkubációra van szükség karbamidban.

Ismert, hogy a karbamidból állás közben cianát képződik, így arra gondoltunk, hogy a cianát lehet a felelős az enzim kémiai módosításáért a megfigyelt alegység disszociáció során.

Ennek a feltételezésnek a vizsgálatára az enzimet 16-24 napon át inkubáltuk szobahőmérsékleten 0,2 M borát (pH=8,5) és 150 mM nátrium-klorid oldatban, amely oldat cianát koncentrációja 0 és 200 mM között volt, valamint ugyanezt elvégeztük frissen készített 5,0 M cianát-mentes karbamid oldattal 10 M karbamid törzsoldatot Milli-Q vízben frissen készítettünk, és ezt átfolyattuk egy AG 501-X8 (D) (Bio-Rad) gyantaoszlopon a gyártócég által javasolt módon; ez a kezelés eltávolítja az ionos szennyeződéseket, köztük a cianátot is.

A következőket figyeltük meg:

1. Csak cianáttal történő kezelés hatására nem változik az EcoAmi(DSM)GI elúciós görbéje a SEC-HPLC során (9A. ábra). Natív PAGE szerint az enzim egy, a dózistól függő kémiai módosulása tapasztalható, amelyet a negatív töltések növekedése bizonyít (9B. ábra, alsó rész), de a gél TTC-festése szerint látható enzimaktivitás-csökkenés nincsen.

2. Az EcoAmi(DSM)GI-t 16 napig inkubálva 5,0 molos cianát-mentes karbamidban a SEC-HPLC szerint dimer-képződés nem történt (10A. ábra). A natív PAGE vizsgálatokban bizonyos mértékű dimer-dimer disszociációt figyeltük meg (10B. ábra, felső rész), 0 mM nátrium-cianát, amely arra enged következtetni, hogy az alkalmazott karbamid-koncentrációnál (5 M) keletkező cianát minimális kémiai módosulást okoz, amely ugyan nem vezet közvetlenül a tetramer disszociációhoz, de olyan mértékben csökkenti a dimer-dimer asszociációt, hogy a disszociáció előrehaladhat a PAGE során alkalmazott elektromos tér hatására. Ezenkívül felvethető, hogy a karbamid és az elektromos tér kombinált hatása a tetramer dimerré történő disszociációjához vezet.

Az EcoAmi(DSM)GI 5,0 M karbamidos oldatához egyidejűleg cianátot adva, a koncentrációtól függő mértékben könnyen képződik dimer a tetramerből. Ezt bizonyították a SEC-HPLC (10A. ábra) és a natív PAGE (10B. ábra, alsó rész) adatai is. Magas cianát koncentrációjú oldatban történő inkubálás után a dimemek a PAGE-ban való visszamaradása valószínűleg annak a következménye, hogy ilyen körülmények között az enzim széttekeredésének a mértéke fokozódik. A natív PAGE-vizsgálat szerint a dimer nem rendelkezik GI aktivitással a TTC-festés eredménye alapján (10B. ábra, alsó rész). Ez alátámasztja azt a feltételezést, hogy az enzimaktivitás elvesztése a GI tetramer dimerré való disszociációjának és/vagy kémiai módosulásnak tulajdonítható.

Végeredményképpen, a cianát és a karbamid jelenléte egyaránt szükséges az EcoAmi(DSM)GI tetramer tapasztalt, dimerré való disszociációjához. Míg a cianát egyedül nem hatásos, a tetramer enzim szerkezetben a módosuló aminocsoport(ok), amelyek részt vesznek az enzim tetramer szerkezetének a stabilizálásában, nem hozzáférhetőek az oldószerek számára karbamid távollétében. A karbamid valószínűleg destabilizálja a dimer-dimer kölcsönhatást, ezáltal a korábban a dimerdimer felületekkel fedett aminosav(ak)at hozzáférhetővé teszi. Ezek az aminosavak, amelyek egy alfaés/vagy egy epszilon-aminocsoportot tartalmaznak, így hozzáférhetővé válnak a cianát általi karbamiláció számára. Másfelől, a cianát kovalens kapcsolódása az alegységek között lévő érintkező aminosav(ak)hoz stabilizálja az enzim dimer formáját. Ezért feltételezhető, hogy az EcoAmi(DSM)GI tetramerek dimerekké történő disszociációja egyike a hődenaturálódás első lépéseinek. Ennek a feltételezésnek az alátámasztásaként szolgál, hogy magasabb fehéqekoncentráció észrevehetően stabilizálja az enzimet a hődenaturálódással szemben (adatokat erre vonatkozóan nem közlünk).

4. Glikozid-képzés

A fehéij ékben glükóz és számos más cukor hatására glikozid-képződés megy végbe, vagyis az alfa- és az epszilon-aminocsoportok módosulnak. Előrelátható volt, hogy az alkalmazási körülmények között (magas glükóz-koncentrációk, pH=7,5, tartós felhasználás) az EcoAmi(DSM)GI-vel ugyanaz történik; közelebbről, ha az EcoAmi(DMS)GI tetramerek dimerekké disszociálnak magasabb hőmérsékleten, feltételezhető, hogy egyes aminosav(ak) karbamid jelenlétében cianáttal reagálva a tetramer-dimer disszociáció kísérő reakciójaként glikozidálódnak, és így csökkenhet a katalitikus aktivitásuk.

Fémion-mentes EcoAmi(DSM)GI-t inkubáltunk magnéziumionok távollétében 60 °C-on D-glükózzal (250 mM) 50 mM MOPS oldatban, pH=7,7. Megfelelő időpontokban mintákat vettünk ki, 25 °C-ra lehűtöttük,

HU 214 783 Β és mértük a maradék enzimaktivitást közvetlenül xilulóz abszorpciós módszerrel 278 nm-nél.

A 11. ábra A táblája azt mutatja, hogy a glükóz jelenléte szignifikánsan megnöveli az enzim 60 °C-on végbemenő hő-inaktiválódását. Ez a hatás nem reverzibilis, azaz a puffért 50 mM MES-re (pH=6,0) teljesen kicserélve és az elegyet 4 °C-on tartva az EcoAmi(DSM)GI katalitikus aktivitása nem állt vissza (11. ábra A táblájában a háromszöggel jelölt görbe). A reakciótermékek SEC-HPLC-vel való további vizsgálata világosan bizonyította, amint az előre várható is volt, hogy glikációt a tetramerek dimerré való disszociációja kíséri, a folyamat időtartamától függő mértékben (11. ábra B és C táblák). Ez a tapasztalat alátámasztja azt az állítást, hogy a tetramer hasadása magasabb hőmérsékleten megy végbe. A disszociálódott dimereket glükóz és az interdimer kapcsolatban lévő reaktív aminocsoportok közötti reakció okozta kovalens módosulás stabilizálja.

All. ábra D táblája azt mutatja, hogy a melegítés fehérje aggregátum keletkezését is okozza, amely aggregátum mérete az EcoAmi(DSM)GI tizenhatszorosa (±700 kilodalton, azaz négyszerese a GI tetramerének). Ez az aggregáció nagy mértékben fokozódik glükóz jelenlétében. Nem ismert, hogy az aggregátum-képződés a GI dimeré való disszociációjától fuggetlen-e, vagy csak annak a következménye.

Igen hasonló eredményeket kaptunk egy másik puffer-rendszerben, 12,5 mM kálium-foszfátban (pH=7,7) 60 °C-on.

Érdekes emlékeztetni arra, hogy a karbamid jelenléte szükséges volt ahhoz, hogy a cianát stabil GI dimereket képezzen, míg a glükóz ugyanilyen tulajdonságokat mutat magasabb hőmérsékleten karbamid jelenléte nélkül. Ezért levonhatjuk azt a következtetést, hogy mind a karbamid, mind a hő előidézi az EcoAmi(DSM)GI tetramerek dimerré való disszociációját, ezáltal a dimerek közötti felületen elhelyezkedő aminosavakat hozzáférhetővé teszi, az előzőleg nem hozzáférhető aminocsoportok így alkalmassá válnak arra, hogy cianáttal vagy glükózzal reagáljanak, és így az enzimet dimer állapotban rögzítsék.

3. példa

Az Actinoplanes missouriensis glükóz-izomeráz alegységeinek felületén lévő lizin-csoportok azonosítása

A GI egy tetramer, amely négy azonos alegységből (A, B, C és D) áll (Rey és mtsai előbb idézett közleménye) és két dimerből tevődik össze. így az alegységek közötti felületeket két kategóriába sorolhatjuk, az egy dimeren belüli monomerek közötti határfelületek (intradimer határfelületek) és két dimer közötti határfelület (interdimer határfelület).

Egy csoportról akkor mondjuk, hogy részt vesz az alegységek határfelületei közötti kapcsolatban, ha annak a hozzáférhető felületének a területe (accessible surface area, továbbiakban ASA) [B. Lee és F. Richards, J. Mól. Bioi., 55, 379 (1971)], amelyet az izolált alegység mérése alapján kalkulálunk, eltér az oligomer esetében meghatározottétól. A 2. táblázatban összegyűjtöttük az ASA-kat 20 alegység lizin-csoportjainak az esetében az izolált monomerekben és a GI tetramerben.

2. táblázat

K	ASAm	ASAT	Ab
10	65,4	65,4	0,0
42	52,6	52,6	0,0
76	77,1	77,1	0,0
100	142,4	142,4	0,0
100	150,0	0,8	149,2
118	17,9	6,8	11,1
132	147,4	147,4	0,0
149	6,9	3,2	3,7
183	8,0	0,1	7,9
239	167,0	167,0	0,0
240	19,2	18,1	1,1
253	111,5	1,5	110,0
294	51,5	28,7	22,8
309	93,2	93,2	0,0
319	30,0	30,0	0,0
323	83,0	83,0	0,0
339	78,0	50,3	27,7
344	178,1	125,8	52,3
375	132,0	119,2	12,8
381	114,2	67,7	46,5

Ezek közül az aminosav-csoportok közül 11 vesz részt az alegység határfelületek képzésében. Csak a Lys-100 és Lys-253 foglalnak el kiterjedt területet (149 Á², illetve 100 Á²) az alegység felületeken, és csaknem teljesen fedettek a tetramerben. Más szavakkal, mindkét csoport oldószerek számára nehezen hozzáférhető a tetramerben, tehát egyik csoport sem vesz részt az EcoAmi(DSM)GI katalitikus aktivitásban. Továbbá a Lys-100 és a Lys-253 részt vesznek az alegységek határfelületén az elektrosztatikus kölcsönhatásokban. Az ó-alegységben (A-Lyx-100) lévő Lys-100 a J?-alegységben a 373-as helyhez közeli, egy kis hélix utolsó tekeredésével képzett hidrogénkötésen keresztül stabilizál.

Az Λ-alegységben lévő Lys-253 (A-Lys-253) ezenkívül részt vesz az ionos intermedier kölcsönhatásban a C-alegység Asp-190-ével. Modell-felépítési technikákat alkalmazva [P. Delhaise és mtsai, J. Mól. Graph., 3, 116 (1984)] megfigyeltük, hogy nem valószínű, hogy a Lys-100 környezete alkalmas Arg-gal történő szubsztitúcióra, míg a Lys-253 mutációja argininre térbelileg lehetségesnek látszik, minthogy a fizikai érintkezési lehetőség nem rossz és az Asp-190nel való ionos kölcsönhatások kedvezőek maradnak.

Egy másik lizin-csoport, a K294 a dimer-dimer határfelületen helyezkedik el, azonban csak részben fedett

HU 214 783 Β a tetramerben (a hozzáférhető felület területe 22,8 Á²). Ez a csoport minden Actinomycetes eredetű glükózizomerázban megtalálható (lásd 10. példa és 21. ábra); azonban a K294 szintén kölcsönhatásba lép az N247-tel és a D257-tel, mindkettő résztvesz a fémionok kötésében. így a K294 a glükóz-izomeráz stabilitását különböző mechanizmusokkal stabilizálja.

4. példa

Az Actinoplanes missouriensis glükóz-izomerázban lévő specifikus lizinek más aminosavakkal történő helyettesítése A jelen találmány szerint a Lys-253 helyettesítése argininnel stabilizálja a dimer-dimer határfelületek közötti elektrosztatikus kölcsönhatásokat, és ezáltal növeli az EcoAmi(DSM)GI stabilitását a hődenaturálódással szemben. Továbbá ez a szubsztitúció megakadályozza a 253as helyen a kémiai módosulást (glükózzal vagy cianáttal).

Az A-Lys-253/C-Asp-190 ionpár elektrosztatikus kölcsönhatásainak az EcoAmi(DSM)GI hőstabilitásában való fontosságának a vizsgálatára a Lys-253-at glutaminra mutáltuk, hogy kiküszöböljük a lizin oldallánc ionos karakterét; ez a mutáció meglehetősen stabil.

Az egy helyre irányuló mutagenezist a hasított DNS („gapped” DNS, továbbiakban gDNS) módszerrel végeztük pMa5-8-hoz hasonló plazmidvektorokat alkalmazva (P. Stanssens és mtsai előbb idézett közleménye).

Minthogy a mutagenezis stratégiája azt igényli, hogy a mutagenezis helyétől upstream és downstream irányban lévő helyeken egyetlen restrikciós hely legyen, két új hasítási helyet vittünk be a Gl-t kódoló szekvenciába anélkül, hogy megváltoztattuk volna a kódolt aminosavszekvenciát. Egy KpnI helyet hoztunk létre a 177. helyen lévő G-t A-ra cserélve a következő oligonukleotid indítóanyagot alkalmazva:

’-CGAAGGGTACC AGG-3 ’.

Az Xhol helyet a 825 helyen a C-t G-re cserélve szerkesztettük a következő oligonukleotid indítóanyagot alkalmazva:

'-GCCGTTCTCGAGGAGGTCG-3 ’.

A GTG kodon ATG-vé változtatását (lásd 1. példa) és a KpnI hely kialakítását egyszeri mutagenezis kísérletben végeztük el, amelyben a megfelelő enzimesen foszforilált oligonukleotidokat egy olyan gDNS-hez illesztettük, amely egy egyszálas pMc5-GI-ből és a pMa5-GI nagy BamHI-Aat Π fragmentumából származik.

Az Xhol helyet külön kísérletben vittük be; az alkalmazott gDNS-t egy egyszálas pMc5-GI-ből és a pMa5_GI nagy Sacl-Smal fragmentumából szerkesztettük. A három mutánst egyetlen génbe gyűjtöttük a kettős mutáns megfelelő fragmentumainak és az Xhol mutánsok kombinációjával. A keletkező hármas mutánst pMa-I-el jelöltük. A komplementer pMc5-I-et úgy szerkesztettük, hogy a P_R-G7 hibridgént tartalmazó pMa5-I kis EcoRI-Xbal fragmentumát inzertáltuk a pMc5-8 EeoRI és Xbal helyei közé.

A vad típusú és a mutáns GI előállításában a pMa5-I és a pMc5-I alapvektorokat alkalmaztuk. Minden adott helyre irányuló mutagenezis kísérletben, amelyeket az alábbiakban írunk le, a pMa5-I egyszálas formájából készített gDNS-t és a pMc5-I egy megfelelő fragmentumát használtuk fel.

1. Lizin-253—>glutamin

A gDNS szerkesztése céljából a pMc5-I nagy Sacl-Xhol fragmentumát és a következő oligonukleotid indítóanyagot használtuk:

'-CCTGGTCGAACTGCGGGCCG-3 ’.

A mutáns enzim jól kifejeződött szubsztrátként xilózt alkalmazva a specifikus aktivitása 96%-a volt a vad típusú EcoAmi(DSM) GI specifikus aktivitásának (3. táblázat).

Az enzim 72 °C-on 50 mM MOPS (pH=7,4) oldatban végbemenő hő-inaktiválódásának a kinetikája fémionok távollétében elsőrendű reakció szerinti, és azt mutatja, hogy a mutáció a denaturációs sebességi állandó 60-szoros növekedését idézte elő, azaz a vad enzim esetében mért l^xlO^min-' értékről a K253Q esetében 0,9 min-'-re változott (12. ábra, A tábla).

mM magnézium-szulfát jelenlétében 85 °C-on 50 mM MOPS oldatban (pH=6,5) az elsőrendű reakció sebességi állandó értéke a K253Q esetében 1,2 mim¹, közel 350-szer nagyobb, mint a vad típusú enzimé (k_D = 3,4xl0-³min-¹).

A K253Q enzim oligomerszerkezetét méret-kiszorítási kromatografálással vizsgálva azt találtuk, hogy az egy intakt tetramer. Tartósan inkubálva 0,15 M nátrium-klorid tartalmú 0,2 M borát oldatban (pH=8,5), amely 5 M cianátmentes karbamidot is tartalmazott, bebizonyítottuk, hogy a K253Q mutáns könnyen disszociál dimerré, amint azt a 13. ábra A táblája összegezi, és a 13. ábra B táblájában lévő adatok mutatják a vad típusú és a mutáns enzimek dimer-képződésének a folyamatát; az adatok szerint a mutáns tetramer enzim dimerré disszociál, de a vad típus nem.

A fent leírt kísérletek az EcoAmi(DSM)GI molekula stabilitása szerkezeti alapjainak a megismerésére irányultak. A K253 csoport glutaminnal történt specifikus megváltoztatása egy hőmérsékletre és karbamidra érzékeny mutánst hozott létre, és ennek következtében azonosítottuk a lényeges kölcsönhatások helyét. Nyilvánvaló összefüggést tapasztaltunk a mutáns hő-inaktiválódásra való érzékenysége és a tetramemek szobahőmérsékleten karbamiddal előidézett dimerré történő disszociációja között.

2. Lizin-253—>arginin

A gDNS szerkesztése céljából a pMc5-I nagy Sacl-Xhol fragmentumát és a következő oligonukleotid indítóanyagot alkalmaztuk:

’-CCTGGTCGAACCGCGGGCCG-3 ’.

Az EcoAmi(DSM)GI mutáns, a K253R jól kifejeződött, és enzimatikus aktivitása 120%-a volt a vad típusúénak szubsztrátként xilózt alkalmazva (3. táblázat).

Ennek a mutánsnak a termostabilitását 50 mM N-(2hidroxi-etil)-piperazin-N’-2-etánszulfonsav (EPPS) (pH=7,5) és 5 mM magnézium-szulfát oldatban vizsgáltuk 82-92 °C között. A 4. táblázatban adjuk meg a K253R és a vad típusú enzim felezési idejét órákban. Az eredményeket azt mutatják, hogy ebben a hőmérséklettartományban a K253 lényegesen stabilabb, mint a vad típusú enzim.

HU 214 783 Β

A K253R mutáns stabilitását a magasabb hőmérsékleten végbemenő, glükóz-okozta inaktiválódás szempontjából is vizsgáltuk, mindkét enzimet 250 mM Dglükóz jelenlétében 60 °C-on inkubáltuk 12,5 mM kálium-foszfát pufferben (pH=7,7). A 14. ábrában láthatóan az inaktiválódást 70 órán át vizsgáltuk: az adatok világosan mutatják a K253R mutánsban elért fokozott védelmet az inaktiváló - irreverzibilis - kémiai módosulással szemben, így felezési ideje a vad típusúénak az ötszörösére növekedett.

Negatív kontrollként a Lys-100-at mutációval argininre cseréltük, amely esetben azt vártuk, amint azt már korábban említettük, hogy az új aminosav-csoport rossz térbeli hozzáférhetősége a stabilitás csökkenéséhez fog vezetni anélkül, hogy befolyásolná az enzim aktivitását.

3. Lizin-100—>arginin

A gDNS szerkesztéséhez a pMc5-I nagy KpnI-AatlI fragmentumát és a következő oligonukleotid indítóanyagot használtuk fel:

5’-CCGCCGTCCCGGAACACCGG-3’.

A K100R GI specifikus aktivitása xilóz szubsztrátot alkalmazva 22 egység/mg volt. Ez hasonló a vad típusú EcoAmi(DSM)GI aktivitásához (24,5 egység/mg). Ezen mutáns enzim hő-inaktiválódása azonban 100szor gyorsabban megy végbe (k_D= 0,3 mim¹) 50 mM EPPS oldatban (pH=7,5) 5 mM magnézium-szulfát jelenlétében 84 °C-on.

4. Lizin-294—>arginin

A gDNS szerkesztéséhez a pMc5-I nagy XhoI-SamI fragmentumát és a következő oligonukleotid indítóanyagot használtuk:

'-GGGACGGCCGGTAGTCGAAG-3 ’.

A K294R EcoAmi(DSM)GI mutáns jól kifejeződött, és enzimatikus aktivitása xilóz szubsztráttal mérve a vad típusú enzimének a 85%-a (3. táblázat).

Ezen mutáns termostabilitását 50 mM N-(2-hidroxietil)-piperazin-N’-2-etánszulfonsav (EPPS), pH=7,5 oldatban, 5 mM MgSO₄ jelenlétében 82-92 °C hőmérsékleteken vizsgáljuk. A K294R órákban kifejezett felezési idejét a 4. táblázatban adjuk meg. Az eredmények azt mutatják, hogy ebben a hőmérséklettartományban a K294R közel azonos stabilitással rendelkezik, mint a vad típusú enzim.

3. táblázat

	xilóz	glukóz
Spa	v max	Km	v * max	Km
WT-GI	24,5	24,2	4,8	34,8	290
K263R	30,0	24,6	5,3	27,2	177
K253Q	23	15,1	4,4	29,2	210
K100R	22,2	ND	ND	ND	ND
K294R	20,5	13,8	4,5	25,8	187
G70S; A73S; G74T	28	24,9	5,3	39,2	235

A vad típusú (WT) és mutáns EcoAmi(DSM)GI katalitikus paraméterei d-xilóz (kapcsolt vizsgálat) vagy D-glükóz szubsztrát esetében.

Spa specifikus aktivitás, a percenként keletkező mM tennék (D-xilulóz vagy D-fruktóz) (egység) per mg enzimben kifejezve

V_max egység per mg enzim-értékben fejeztük ki K_M a Michaelis konstans, mM-ban kifejezve ND nem határoztuk meg

4. táblázat

A vad típusú és szerkesztett mutáns glükóz-izomeráz inaktiválódása 50 mM EPPS-ben, pH=7,5, 84 °C-on, 5 mM magnézium-szulfát jelenlétében.

A felezési idő az az időtartam, amely szükséges a teljes enzimaktivitás 50%-os csökkenéséhez.

Hőmérséklet °C	82	84	86	88	90	92
WT-GI	11,85	3,80	1,07	0,25	0,080	0,032
K253R	17,65	4,17	1,11	0,32	0,094	0,037
K294R	9,39	1,57	0,43	0,14	0,056	ND
G70S;A73S;G74T	22,88	4,83	1,21	0,31	0,093	0,032

5. példa

A glükóz-izomeráz stabilizálása a monomeren belüli mutációval

Bár azok a mutációk, amelyek javítanák a monomer alegység stabilitását, a második példában leírtak szerint nem befolyásolják a glükóz-izomeráz tetramer stabilitását, néhány ilyen irányú mutációt mégis végrehajtottunk. A glükóz-izomeráz monomer 8 szálas β-törzsének B hélixéből származó maradékot mutáltuk abból a célból, hogy stabilizáljuk a monomert. A glicin 70-et szerinre, az alanin 73-at szerinre és a glicin 74-et treoninra cseréltük mutációval.

A gDNS szerkesztéséhez a pMc5-I nagy KpnI-AatlI fragmentumát és a következő oligonukleotid indítóanyagot alkalmaztuk:

’-GCCTTCTTGAAGGTCG AGATGATGGAGTCGCGG-3 ’. Az EcoAmi(DSM)GI mutáns, a G70S;A73S;G74T jól kifejeződött, és specifikus aktivitása 28 egység/mg volt (a vad típusúnak 115%-a) xilóz szubsztráttal meghatározva (3. táblázat).

Ezen mutáns termostabilitását 50 mM EPPS oldatban (pH=7,5) 5 mM magnézium-szulfát jelenlétében vizsgáltuk 82-92 °C hőmérséklettartományban. A G70S;A73S;G74T órákban kifejezett felezési idejét a 4. táblázatban adjuk meg. Az eredmények azt mutatják, hogy ebben a hőmérséklettartományban és az alkalmazott körülmények között a G70S;A73S;G74T sokkal stabilabb, mint a vad típusú enzim, és még a K253R mutánsnál is sokkal stabilabb.

6. példa

Vad típusú és mutáns A. missouriensis glükóz-izomeráz termelése és tisztítása a felhasználásban való tesztelés céljából Az A. missouriensis glükóz-izomeráz E. coliban való termelésére kizárólag a pMa típusú vektor expressziós egységet használtuk fel.

A glükóz-izomeráz deficiens K257 E. coli törzs (thi, thr, leu, tón A, lacY, supE, xylA, r_K~m_K ⁺) transzformán13

HU 214 783 Β magnézium-szulfát és 3 mM nátrium-szulfit jelenlétében; átalakítás: 45% fruktóz; pH=7,5 (35 °C-on mérve); Ca: < 3ppm. A k_d értékekre vonatkozó eredmények az 5. táblázatban láthatók.

sait, amelyek magukban foglalják az A. missouriensis glükóz-iozmeráz gént, és amely kódolja a vad típusú fehérét vagy a kívánt mutáns fehérjét, a következő összetételű táptalajon tenyésztettük: élesztőkivonat (20 g/1), Bacto tripton (40 g/1), kazaminosavak (4 g/1), nátriumklorid (10 g/1) és ampicillin (100 mg/1) a tenyésztés 16 órán át történt 37 °C-on. Centrifugálás után a sejteket minimális térfogatú pufferben felszuszpendáltuk, a puffer összetétele a következő volt: 20 mM tris, 10 mM EDTA, 50 mM glükóz, pH=8,0. Ezután 1,5 g/1 végkoncentrációig lizozimet adtunk az elegyhez. Miután 30 percen át inkubáltuk 37 °C-on, a szuszpenziót további 30 percen át 70 °C-on tartottuk. Ezután a szuszpenziót szobahőmérsékletre lehűtöttük és magnézium-kloridot és DNáz I-et adtunk hozzá 20 mM, illetve 1,5 mg/1 végkoncentrációig, és további 30 percen át inkubáltuk 37 °C-on. A sejttörmeléket centrifugálással elkülönítettük, és a felülúszót 50 mM tris pufferrel (pH=7,5) dializáltuk éjjelen át.

7. példa

A vad típusú és a mutáns glükóz-izomeráz immobilizálása

Az enzim oldata ioncserélő gyantán immobilizálható. Minden kísérlet előtt az ioncserélő gyantát regeneráltuk: a gyantán 0,5 N nátrium-hidroxid oldatot (10 ágytérfogatot), vizet (pH=8 eléréséig), 10 t%-os nátrium-klorid oldatot (20 ágytérfogatot) és vizet (20 ágytérfogatot) átfolyatva. A glükóz-izomeráz immobilizációjának a céljára a Lewatit MP500A (Bayer) és az Amberlite IRA 904 (Röhm és Haas) gyantákat választottuk ki. Az enzim adszorpciója ezeken az anioncserélő gyantákon igen hatásosan megy végbe. Lineáris összefüggés van az enzim adszorbeált mennyisége és az alkalmazásra kerülő oszlop aktivitása között.

g anioncserélő gyantát (CE formában) 50 ml pufferbe (50 mM tris-HCl, pH=7,5) tettünk. Tisztított glükóz-izomerázt adtunk hozzá, és a kötődés létrejötte céljából éjjelen át állni hagytuk 4 °C-on, a térfogatot 50 mM tris-HCl pufferrel (pH=7,5) kiegészítve.

8. példa

A vad típusú és mutáns glükóz-izomeráz felhasználhatóságának a vizsgálata A glükóz-izomeráz és mutánsai immobilizált formájának a kezdeti aktivitását és a stabilitását R. van Tilburg [Engineering Aspects of Biocatalysts in Industrial Starch Conversion Technology. Tézisek. Delftse Universitaire Pers. (1983)] szerint vizsgáltuk, mérve a 45%-os átalakításnál az átszivattyúzás sebességét az idő függvényében. Ezekből a K_o és k_d értékekből végeztük a számításokat. A K_o egy pszeudo elsőrendű reakció sebességi állandója és az enzimaktivitás mértékét jelenti. A k_d egy elsőrendű reakció görbéjének az állandója és az enzim stabilitásának a mértékét jelzi. Bár a k_d kiszámítását eddig csak a zselatinnal immobilizált glükóz-izomerázzal kapcsolatban írták le (R. van Tilburg, lásd fentebb), ugyanez a számítás alkalmazható a gyantán immobilizált glükózizomeráz esetében is. A kísérleti körülmények a következők voltak: 70 °C; reaktor: álló ágy, amelyen lefelé folyattuk át az anyagot; szubsztrát: 3 M glükóz, 3 mM

5. táblázat

Különböző gyantán immobilizált vad típusú és mutáns glükóz-izomerázok bomlási állandói

	kd(xl06 sec-1)	kjjxK^sec-1)
vad típus	2,7	2,4
K253R	1,0	0,7
K294R	2,8	2,9
K253Q	ND	3,7
(G70S;A73S;G74T)	2,0	2,1

Megjegyzés: A vad típusú és a mutáns enzimek előállítása, tisztítása és immobilizálása a 6. és 7. példákban megadott módon történt.

Az 5. táblázat adataiból arra lehet következtetni, hogy a K253R és a G70S;A73S;G74T mutánsoknak szignifikánsan kedvezőbb a stabilitása a 70 °C-on végzett felhasználási tesztben. Ezeket az eredményeket megfelelő pontossággal lehet átültetni az iparban általában alkalmazott hőmérsékleten végzett tesztek esetében várható eredményekké (R. van Tilburg, lásd fentebb).

A K253Q mutáns alacsony teljesítőképessége jelzi a 253-as helyen lévő bázikus csoport fontosságát, amint azt már a 4. példában leírt in vitro kísérletekből következtettük. A glutamin mutáns valószínűleg egyáltalán nem képez hidrogénkötést, így destabilizálja a dimerdimer kapcsolatot.

Hasonlóan a K294R mutáns stabilitása az in vitro kísérletekben nyert eredményekkel összhangban, valamivel kisebb, mint a vad típusú enzimé.

A fenti eredmények azt mutatják, hogy a glükózizomeráz dimer-dimer határfelületeinek a kedvezőbbé tétele az ipari alkalmazásban előnyösebb tulajdonságú enzimet eredményez. Nyilvánvaló, hogy egy szakember által a felületi kapcsolatokban résztvevő más csoportok is kiválaszthatók. A kémiai módosulás számára hozzáférhető csoportok vagy amelyek hidrogénkötése nem optimális, szintén helyettesíthetők más aminosawal a jelen találmány kitanítása alapján.

Meglepő módon azok a mutációk, amelyek a monomer alegység stabilitását célozták, szintén pozitív hatást gyakoroltak a tetramer stabilitására, amint azt a G70S;A73S;G74T mutáns k_d értékei bizonyítják.

Ezeknek az eredményeknek az értelmezésére felmerülhet az a gondolat, hogy az α-hélixben a glicin helyettesítése a fehérje széttekeredett formájának az entrópiáját csökkentheti, és ezáltal rezisztensebbé teheti a fehérjét a reverzibilis széttekeredéssel és denaturációval szemben [Proteins, 1,43-46 (1986)]. így a glükóz-izomeráz kémiai módosításokkal (így irreverzibilis denaturációval) szembeni érzékenysége a (részben) széttekeredett fehéqe esetében szignifikánsan csökkenhet, és ez hővel szemben sokkal stabilabb enzimet eredményez. Ezen kívül gondolhatunk arra a tényre, hogy a G70S;A73S;G74T mu14

HU 214 783 Β tánsba inszertált mutációk mind nagyobb mértékben hidrofil természetűek és ezért valószínűleg kedvező helyzetben van a B hélix szabad felületén. Ez a monomer a reverzibilis széttekeredéssel szembeni fokozott stabilitásához vezethet. Amint a fentiekben megállapítottuk, ez csökkentheti a tetramer fehérje érzékenységét az irreverzibilis denaturációval szemben.

Az ebben a példában bemutatott mutációk a glükózizomeráz minden α-hélixében keresztülvihetők. Az A. missouriensis glükóz-izomeráz 3D szerkezetéből megállapított hélix régiók (F. Rey és mtsai, lásd fentebb) a következő helyeken vannak: al 35—47, a2 64—80, a3 108-128, a4 150-173, a5 195-206, a6227-239, a7 264-276, a8 300-328. Előirányozhatjuk a glicincsoportok szubsztitúcióját, hidrofób csoportok bevitelét és prolin-csoport bevitelét is egy α-hélix amino végére.

A K253R és a G70S;A73S;G74T mutánsok a vad típusú glükóz-izomerázhoz képest kedvezőbb hőstabilitást mutatnak. Azonban a K253R mutáns stabilabb, mint a G70S;A73S;G74T a felhasználási teszt vizsgálatok szerint, ellentétben a 4. példában leírt in vitro kísérletek eredményeivel. Ez annak a ténynek lehet a következménye, hogy a laboratóriumi körülmények között kapott eredmények csak egy bizonyos mértékig adnak felvilágosítást az enzimnek a felhasználás körülményei közötti viselkedésére. Feltehetően az alkalmazás körülményei között használt magas glükóz-koncentráció és a glikozid-képzés folyamata, amely a glükóz-koncentrációtól függő, felelős ezért a jelenségért.

9. példa

A mutáns glükóz-izomeráz tulajdonságai különböző pH-kon

Összehasonlító vizsgálatokat végeztünk az A. missouriensis vad típusú és a K253R mutáns glükózizomerázzal különböző pH-értékeknél. A K253R és a vad típusú enzimkészítményeket Le watit-gyantán a 7. példában már leírtak szerint immobilizáltuk, és a 8. példában leírtak szerint izomerizációs vizsgálatnak vetettük alá. A körülmények az R. van Tilburg által (lásd előbbi hivatkozást) leírtak voltak, a különböző pH-értékeknél glükóz-szirupot alkalmazva. A 18. ábra bemutatja mindkét enzim k_d értékeit a pH függvényében. Látható, hogy a K253R mutáns kedvezőbb k_d értékkel rendelkezik pH=7,5 alatt egészen pH=5,8-ig. A méréseket minimálisan két párhuzamos kísérletben végeztük el. Ezek szerint a K253R nemcsak az ipari felhasználás magasabb hőmérsékletén rendelkezik előnyösebb tulajdonságokkal (magasabb átalakítási sebesség), hanem alacsony pH-η is (a fruktóz tennék jobb stabilitása).

10. példa

Más baktériumtörzsekből származó glükóz-izomeráz gének klónozása és szekvencia-meghatározása

A különböző baktériumokból származó glükózizomeráz aminosav-szekvenciájára vonatkozó adatok ismerete céljából a megfelelő baktériumok kromoszómájából E. coliban történő molekuláris klónozással izoláltuk a glükóz-izomerázt kódoló géneket.

Éne a célra a következő baktériumokat választottuk ki, amelyek közül többről ismert, hogy az iparban alkalmazható enzimet termel:

- Arthrobacter species

- Streptomyces violaceoruber LMG 7183

- Streptomyces thermovulgaris DSM 40444

- Streptomyces murinus DSM 40091

- Ampullariella species ATCC 31351

A fent megadott fajok mindegyikéből izoláltuk a kromoszomális DNS-t lényegében a Hopwood (lásd előbbi hivatkozást) által leírtak szerint.

Az Arthrobacter, S. violaceoruber és az Ampullariella esetében a Sau3AI restrikciós endonukleázzal végzett részleges hasítás és a kapott fragmentumoknak E. coliban való klónozása pontosan az 1. példában az A. missouriensis-re vonatkozóan leírtak szerint történt. Az

S. murinus és S. thermovulgaris kromoszomális DNS-ét teljesen elhasítottuk Pstl-gyel, majd pECOR251-be ligáltuk az 1. példában megadott módon.

A kívánt glükóz-izomeráz gént tartalmazó telepeket telep-hibridizációval detektáltuk az A. missouriensis glükóz-izomeráz gén 712 bp méretű Miül restrikciós fragmentumának a felhasználásával vagy a S. vioalaceoruber glükóz-izomeráz gén 853 bp méretű SacII restrikciós fragmentumának a felhasználásával.

A különböző baktériumokból származó glükózizomeráz gént tartalmazó rekombináns plazmidokat tovább vizsgáltuk restrikciós térképezéssel az A. missouriensis glükóz-izomeráz génnél leírt módon. A fehérjét kódoló régiók nukleotid szekvenciáját Maxam és Gilbert kémiai módszerével (lásd előbbi hivatkozást) végeztük.

A S. thermovulgaris glükóz-izomeráz gént tartalmazó kiónról megállapítottuk, hogy az inkomplett: csak a 346-os aminosavig terjedő kódoló szekvenciát (azonos az A. missouriensis glükóz-izomeráz 351-es helyével) határoztuk meg.

Meg kell jegyezni, hogy az Ampullariella sp. glükóz-izomeráz aminosav-szekvenciája eltér az irodalomban közölt szekvenciától, a 177. prolinról megállapítottuk, hogy az arginin.

Az ebben a példában leírt kísérletek eredményeit a 21. ábrában foglaltuk össze, amelyben a meghatározott nukleotid szekvenciából származtatott aminosav-szekvenciák igen nagy mértékben mutatnak kölcsönös homológiát.

11. példa

Az Ampullariella sp. glükóz-izomeráz expressziója és mutagenezise

Az Ampullariella sp. glükóz-izomeráz E. coliban való kifejezésére az A. missouriensis glükóz-izomeráz már rendelkezésre álló expressziós egységét használtuk fel. Lényegében az A. missouriensis expressziós vektort mutáltuk az Ampullariella sp. glükóz-izomeráz génjének a restrikciós fragmentumait felhasználva, amely gén magában foglalja a gén kódoló régióiban lévő nukleotidokat és az ezekből származó aminosavkülönbségeket. Egy kihasított duplex molekulát képeztünk, amely a következőkből áll: a pMa-I egyszálas

HU 214 783 Β

DNS és a pMcI 4104 bp méretű BstEII/NcoI fragmentuma, egy 124 bp méretű BstEIII/ApaLI fragmentum és egy 1059 bp méretű ApaLI/BassHII fragmentum, a két utóbbi fragmentum az Ampullariella sp. glükózizomeráz génből származott. Az eljárást lényegében az

1. példában leírt módon hajtottuk végre, beleértve a gén ismételten elvégzett szekvencia-meghatározását, a nem kívánt változások meghatározására. így a megfelelő plazmidot állítottuk elő, és azt pMc-GIampl-nek nevezzük.

Az aminosav-szekvenciák összehasonlítása azt mutatja, hogy az Ampullariella glükóz-izomeráz az A. missouriensis glükóz-izomerázhoz hasonlóan a 253. helyen egy lizin-csoportot tartalmaz. Ezért az Ampullariella sp. glükóz-izomerázt állítottuk elő, amelyben a 253. helyen lévő lizint (K) argininra (R) cseréltük, egy hasított duplex molekula felhasználásával, amelyet egy egyszálas pMcGIampl DNS és egy BamHI/HindlII-mal hasított pMa-GIampl-lel és a következő foszforilált mutagén oligonukleotid összeillesztésével képeztünk:

5-AGGTCCTGGTCGAACCGCGGGCCGTGCTGG-3’. Az összeillesztési lépést követő eljárás, azaz a keletkező mutáns kiválasztása és analízise pontosan az 1. példában leírt módon történt.

12. példa

A Streptomyces murinus glükóz-izomeráz expressziója és irányított helyen történő mutagenezise

A Streptomyces murinus glükóz-izomeráz gén expresszióját a pMaT5 plazmidnak a Tac promoterhez downstream irányban elhelyezkedő génjével hajtottuk végre. A pMaT5 a pMa5P_R plazmidnak egy származéka, amelyben a lambda P_R promotert a szabályozható Tac promoterrel helyettesítettük [H. de Boer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 21 (1983)]. Ezen expressziós vektort a 15A/C ábrában mutatjuk be.

A teljes Streptomyces murinus glükóz-izomeráz gént tartalmazó 1280 bp hosszúságú BstXI/MluI restrikciós fragmentumot DNS polimeráz I-gyel (Klenowfragmentum) kezeltük, hogy a fragmentumokat tompa végűvé tegyük, majd ezt követően pUC 19-be ligáltuk. Ezután a gént ismét hasítottuk BamHI és HindlII enzimekkel, és a BamHI/HindlII-mal hasított fragmentumokat pMc5T-be inszertáltuk. A kapott plazmidot pMcGISmul-nak neveztük el. A Streptomyces murinus glükóz-izomeráz nukleotid- és ebből eredő aminosavszekvenciáját és az expressziós egység szerkezetét a 19. illetve a 20. ábrában adjuk meg.

A S. murinus glükóz-izomeráz szintén tartalmaz a fehéijeszekvenciában a 253. helyen egy lizint, hasonlóan, mint a K253 az A. missouriensisben. A Streptomyces murinus glükóz-izomerázban a 253-as helyen lévő lizin (K) argininre (R) való kicserélését eredményező mutációt egy hasított duplex molekulával (amely egyszálas pMcGIsmul DNS-t és BamHI/HindlII-mal hasított pMa5T-t tartalmaz) és a következő foszforilált mutagén nukleotiddal hajtottuk végre:

’-GGTCCTGGTCGTACCGGATGCCGG ACTGG-3 ’.

A kapcsolási lépés eljárása, azaz a keletkező mutáns szelektálása és analízise lényegében az 1. példában leírtak szerint történt.

Meg kell jegyezni, hogy a találmány nem korlátozódik csupán a fent leírt és bemutatott mutációkra. Bár a fentiekben leírt találmányt részletesen leírtuk azok bemutatásaként és az érthetőség céljából a példákkal, nyilvánvaló, hogy bizonyos változtatásokat és módosításokat lehet rajta végezni a mellékelt igénypontok keretein belül.

Claims (9)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás a vad típusú glükóz-izomerázhoz képest javított pH és/vagy hőstabilitású és/vagy jobb konverziójú és a vad típusú glükóz-izomeráz aminosav-szekvenciájától legalább egy aminosav-maradékban eltérő aminosav-szekvenciájú, kívánt esetben hordozóhoz kötött (immobilizált) mutáns glükóz-izomeráz előállítására, azzal jellemezve, hogy azonosítjuk a glükóz-izomeráz alegységek közötti kölcsönhatásokban szerepet játszó lizin-maradékokat, és a génmanipulációs technikák standard eljárásai segítségével legalább egy ilyen lizinmaradékot egy arginin-maradékkal helyettesítünk, és/vagy a monomer alegység stabilitásában szerepet játszó 70 helyzetű glicint (Gly70) és 73 helyzetű alanint (Ala73) szerinnel és a 74 helyzetű glicint (Gly74) treoninnal helyettesítjük, és kívánt esetben a mutáns enzimet ismert módszerekkel hordozóhoz kötjük.

   (Elsőbbsége: 1988. 07. 15.)
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy legalább két domént tartalmazó monomer enzimben vagy egy legalább két - adott esetben doméneket tartalmazó - alegységből álló oligomer enzimben a más aminosav-maradékokkal elektrosztatikus kölcsönhatásban álló, és az illető doménekben oldószerek résére nehezen hozzáférhető helyeken lévő legalább egy lizin-maradékot helyettesítünk arginin-maradékkal.

   (Elsőbbsége: 1988. 07. 15.)
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Actinoplanes missouriensisből származó glükózizomerázban legalább egy lizin-maradékot egy argininmaradékkal helyettesítünk.

   (Elsőbbsége: 1988. 07. 15.)
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az Actinoplanes missouriensisből származó vad típusú glükóz-izomeráz aminosavszekvenciájával legalább 95% homológiát mutató mutáns glükóz-izomerázt állítunk elő.

   (Elsőbbsége: 1988. 07. 15.)
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az Actinoplanes missouriensisből származó glükóz-izomerázban a 253 helyzetű lizint (Lys253) argininnel (Arg253) és/vagy a 70 helyzetű glicint (Gly70) szerinnel (Ser70), a 73 helyzetű alanint (Ala73) szerinnel (Ser73) és a 74 helyzetű glicint (Gly74) treoninnal (Thr74) helyettesítjük.

   (Elsőbbsége: 1988. 07. 15.)

   HU 214 783 Β
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább a 253 helyzetű lizint (Lys253) helyettesítjük argininnel (Arg253).

   (Elsőbbsége: 1988. 07. 15.)
7. 7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 5 hogy legalább a 70 helyzetű glicint (Gly70) és a

   73 helyzetű alanint (Ala73) szerinnel és a 74 helyzetű glicint (Gly74) treoninnal helyettesítjük.

   (Elsőbbsége: 1988. 07. 15.)
8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mutáns enzimet ismert módszerekkel ismert hordozóhoz kötjük.

   (Elsőbbsége: 1988. 07. 15.)
9. 9. Új eljárás magas fruktóztartalmú szirup előállítására, azzal jellemezve, hogy glükóz-szirupot ismert módszerek szerint egy 1-8. igénypontok bármelyike szerint előállított mutáns glükóz-izomeráz enzimmel hozunk érintkezésbe.