JPH03501566A - 新規なグルコースイソメラーゼ酵素とその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

〔発明の概要〕

本発明の一つの目的は、新規な変異型のグルコースイソメラーゼを提供し、少な くとも１つのアミノ酸が対応する野生型のグルコースイソメラーゼと異なってい るアミノ酸配列を有し、改良された性質を有する酵素をコードした遺伝子を発現 することによりこの酵素を得ることである。 本発明の他の目的は、このような新規な変異型のグルコースイソメラーゼでかつ 、対応する野生型の酵素の分子間及び分子内相互作用の変更に基づく、変異型の グルコースイソメラーゼの生産方法を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、工業的使用の際に改良された性質を有する変異型の 酵素を選択する方法を提供することである。 〔図面の簡単な説明〕 皿１．　５０ｍＭ　ＭＯＰ　５ＳｐＨ？、　２．２５℃でのＥｃｏＡｍｉ　（Ｄ 　Ｓ　Ｍ）の無金属グルコースイソメラーゼの熱失活反応速度論。 金属添加無。 皿上、５０ｍＭ　ＭＯＰ　Ｓ、　ｐＨ７，２，２５℃でのＥｃｏＡｍｉ（ＤＳＭ ）の熱失活の温度依存性のアーレニウスプロット。 皿上、添加金属無、７２℃の無金属ＥｃｏＡ■ｉ（ＤＳＭ）ＧｌＯ熱失活のｐｉ （依存性。 ＣＨＥＳ−Ｚ−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸 の熱失活の反応速度論へのイオン強度の影響、金属添加無。 凹ユ、５０ｍＭ　ＭＯＰ　Ｓ、　ｐＨ１，６，７２℃テノ無金属ＥｃｏＡｍｉ（ ＤＳＭ）の熱失活反応速度論へのイオン強度の影響、金属添加無。 Ｊｌｌｌ、７Ｍ尿素、２５℃でのＥｃｏＡｍｉ　（Ｄ　Ｓ　Ｍ）の長期のインキ ュベーシツン後のＥｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ＞　ＣＩの５ＥＣ−ＨＰＬＣ。 ■主人、尿素無、２５℃でシアネートで前処理したＥｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）の ５ＥＣ−ＨＰＬＣ０溶出緩衝液は５０＋＊Ｍ　Ｔｒｉｓ／ＨＣ１、ｐＨ８，０， １５０ｍＭ　ＮａＣ１，０，０２％ＮａＮ５であった。 ｌ旦、尿素無、２５℃でシアネートで処理したＥｃｏＡｍｉ（Ｄ　Ｓ　Ｍ）Ｇ！ のネイティブ（Ｎａｔｉｖｅ）　Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ　＊皿皿人、５Ｍ尿素の存在下 、２５℃でシアネートで前処理したＥｃｏＡｍｉｉ　（Ｄ　Ｓ　Ｍ）　Ｇ　Ｉの ５ＥＣ−ＨＰＬＣ。 ｌ旦、５Ｍ尿素の存在下、２５℃でシアネートで処理したＥｃｏＡｍｉ　（Ｄ　 Ｓ　Ｍ）のネイティブＰＡＧＥ。 皿上上、５０ｍ？ＩＭＯＰ　Ｓ、　ｐＨ７，７，６０℃テ（７）ＥｃｏＡｍｉ　 （Ｄ　ＳＭ）グリケーシッン（ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）白丸ニゲルコース添加無； 黒丸：＋２５０５Ｍグルコース；三角：可逆性の試験のために、グルコース（２ ５０ｍＭ）でインキュベートした後に長期間透析した。 図１２．　ＥｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）　Ｇ　１−変異型に２５３Ｑの熱失活反応 速度論。 皿上３．　ＥｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）　ＣＩ変異型に２５３Ｒの５Ｍ尿素、２５ ℃での四量体−二量体解離の反応速度論。 ｌｊ−，６０℃、１２．５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７，７でのＥｃｏＡｍｉ（ ＤＳＭ）Ｇｌ変異型に２５３Ｒのグリケーシッン誘導された失活の反応速度論。 皿星人、ｐＭａ／ｃ５−８の構造 ｐＭａ型ベクターにおいては、ヌクレオチド３４０９はＡからＧに変化しており 、一方ｐ　Ｍ　ｃ型ベクターにおいては、ヌクレオチド２２３８はＧからＣに変 化しており、それぞれクロラムフェニコールアセチル転移酵素遺伝子とβ−ラク タマーゼ遺伝子のアンバー停止コドンを作り、前記遺伝子を失活する（Ｐ、スタ ンセンら（１９８７）　、”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅ ｄ　Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｇ ａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘＤ　Ｎ　Ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐ Ｍａ／ｃ　ｐｈａｓｍｉｄ　Ｖｅｃｔｏｒｓ″、マックスブランク生化学研究所 で保有している、ＥＭＢＯ実習コースで使用されるマニュアル”　Ｄｉｒｅｃｔ ｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄＰｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ ｇ　”　ｓ　Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄｓ　Ｊｕｌｙ　４−１８．１９８７）。 図に示されている配列はｐＭａ５−８のものである。 ｍ、発現ベクターｐＭａ／　ｃ　５　Ｐ　＊に存在するラムダＰ、プロモーター 配列（ヌクレオチド３７５４がｐＭａ／ｃ５−８の３７６９に置き換わっている 。） ｍ旦０発現ベクターｐＭａ／ｃ　５Ｔに存在すＴａｃプロモーター配列（ヌクレ オチド３７５４がｐＭａ／ｃ　Ｓ−８の３７６９に置き換わっている。） ｍ、野生型アクチノプラネス　ミソーリエンシス（紅旦二且肚■−１ｓｓｏｕｒ ｉｅｎｓｉｓ）グルコースイソメラーゼの全遺伝子配列と誘導されるアミノ酸配 列。 皿上上、ｐＭａ／ｃ−１上のグルコースイソメラーゼ（ＣＩ）発現ユニットの物 理的地図、関連ある制限サイト％Ｐｌプロモーター及びタンパク質をコードして いる領域の位置が示されている。星印は、特定部位の突然変異誘発によって導入 された制限サイトを示す。 皿上工、様々なｐ）Ｉでのグルコースイソメラーゼ変異型の性質。 Ａｍ１ＷＴニブラスミドｐＭａ−１から生産された野生聖人、ｌヱニュエヱ之五 グルコースイソメラーゼＡｗｌｉＫ２５３Ｒ：突然変異したプラスミドｐＭａ− １，に２５３Ｒから生産された変異型に２５３Ｒグルコースイソメラーゼ Ａ−ｉＷＴＣ口）とＡｍ１Ｋ２５３Ｒ（○）について各々測定したにｄをプロッ トした。Ａｍ１Ｋ２５３Ｒは、広いｐＨ範囲に渡って改良されたＫｄ値を有する ことが見られる。 れるアミノ酸配列。 皿１皇、　ｐＭａ／　ｃ　−Ｇ　Ｉ　ｓ＠ｕｌ上のグルコースイソメラーゼ（Ｃ ＨＩ）発現ユニットの物理的地図、関連ある制限サイト、Ｔａｃブロモ−クー及 びタンパク質をコードしている領域の位置を示している。 ス主上、出所が異なるグルコースイソメラーゼのアミノ酸配列の並び、アクチノ プラネス　ミソーリエンシスグルコースイソメラーゼの全配列が示されているが 、他の出所からのグルコースイソメラーゼについては、アクチノプラネス　ミソ ーリエンシスグルコースイソメラーゼと異なるアミノ酸残基のみが示されている 。ヱムズ孟ユ王土（むｂ月１１蛙順）グルコースイソメラーゼのアミノ酸配列は 、公表されている配列（サージ、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、＋１６９　（１９ Ｂ？）６１２）のものと−残基異なる：公表されている配列のプロリン１７７が アルギニンであることがわかった。ストレプトマイセス　皇ルモプルカリス（旦 ■旦憇匹憇　旦肛懸と江肛ｉｓ）　配列ハ、アミノ酸３４６までが鋪シしされて いるだけである；未決定残基は、ブロック（・）で示しである。 ダッシュ（−）は、他のすべての配列と比較して、この位置にアミノ酸残基がメ １１（いことを示している。 異なる種は以下のような記号で示す。 八ａ＋ｉ：　アクチノプラネス　ミソーリエンシスＤＳＭ４６４３＾ｍｐ：　ア ムブラリエラ種Ａ、ＴＣＣ３１３５１ＡｒＬ：　アルスロバクタ−（＾ｒｔｈｒ ｏｂａｃｔｃｒ）種Ｓｍｕ　：　ストレプトマイセス　ムリヌスＤＳＭ４００９ １ＳＬｈ：　スト１ノブトマイセス　セルモブルガリスｌｌ５Ｍ　４０４４４〔 発明の詳細な説明〕 本発明に従って、変異型グルコースイソメラーゼ酵素は、野生型のグルコースイ ソメラーゼの構造の慎重な検討と使用条件下での、元のグルコースイソメラーゼ の失活に至る工程の慎重な生化学的研究を組み合せ、さらに野生型遺伝子配列の 理論的修飾を行うことにより、段組できる。工業的使用条件下での設計された変 異体の広範な研究により、改良された性質を有する変異体が同定されてきた。 本発明のグルコースイソメラーゼ酵素と一緒に本明細書で用いられる１改良され た性質”は、より高い転化性能及び／又は対応する野生型酵素と比較して、改良 された安定性、特に熱安定性を意味するものである。さらに、それ自体又は強化 された熱安定性と組合わせて、異なるｐＨで安定性が増加することも、“改良さ れた性質”のＪｌｌｌ１語に該当すると考える。 本発明は、ある種の酵素の活性が、多量体に１体、三量体、四量体等）の時に最 大となること及び、この活性はサブユニット間の相互作用が喪失すると減少しう るという発見に基づくものである。例えば、ヱえ土１工立主ス　ミソーリエンシ スグルコースイソメラーゼの酵素活性は、四量体構造に特有のものである。この 活性は、元来の四量体構造から二量体に解離すると実質的に喪失する。 それ故、本発明はサブユニット（−量体、二量体等）間の相互作用が強化されて 、酵素が特に使用条件で改良された性質を有するようになる、新規な変異型のグ ルコースイソメラーゼを提供する。さらに本発明は、グルコースイソメラーゼサ ブユニット間の相互作用を強化する方法を提供する。 好ましい実施態様に従うて、グルコースイソメラーゼの四量体構造は、四量体中 の二量体間の相互作用を強化するとによって安定化される。 四量体構造の安定性を改良するのに適切な方法は、例えば、イオン橋（ｔｏｎｉ ｃ　ｂｒｉｄｇｅｓ　）を導入することである。静電気的効果が、酵素機能と構 造に基本的な役割を果たすことは周知である（Ｊ、　Ａ、マシューら＋ｌ　ＣＲ ＣＣｒ１ｔ、１ｅａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｍｉａｔｒｙ。 ユ（１９８５）９１−１９７参照のこと、）彼らは、例えば、酵素触媒の９８依 存性について説明している。というのは、あるタンパク質の最適ｐ）ｌは、活性 サイトの周囲のイオン化基の存在によって決まるからである。静電気的相互作用 としては、水素結合やイオン（塩）橋が含まれ、これらは、全タンパク質構造の 安定化の際に重要である（Ａ、　Ｊ、ラッセルとＡ、　Ｒ，フェルシェＩ・（Ｆ ｅｒｓｈｔ）、Ｎａｔｕｒ＠３６　（１９８７）４９６−５００参照のこと）。 グルコースイソメラーゼ四量体が二量体に解離すると、酵素変性の主たる原因と なることを推察すると、この過程は、界面に補促の塩橋のような追加の安定化相 互作用を導入することにより妨げられる。 あるタンパク質に新しい塩橋を導入するためには、一つの可能性としては、２つ の隣接する残基を逆掻性に帯電するアミノ酸、例えば、アスパラギン酸とアルギ ニンのようなアミノ酸で置換し、次に、例えば、エネルギー地図計算により、イ オン相互作用が形成できるか調べることである。新しい塩橋をこのように導入す るには、２箇所の点変異が必要である。さらに、局在する（ｉｓｏｌａｔ−ｅｄ ）帯電アミノ酸に近い残基を置換することにより、−回の点突然変異でイオン対 を形成することにより、塩橋を形成することもできる。 四量体構造の安定性を改良するもう一つの適切な方法は、ジスルフィド橋を導入 することである。ジスルフィド結合は、多くの細胞外タンパク質の一般的特徴で ある。これらの架橋の役割は、主として、タンパク質を安定化することであり、 この効果は最もよ（理解されているものの一つである。これは、一般に、変性状 態のエントロピーの減少により説明されているが、このような単純な記述では説 明できないいくつかの事実が残されている。　Ｔ、　Ｅ。 クレイトン、バイオエッセイズ第８巻（１９８８年）第５７〜第６３頁（Ｔ、　 Ｅ、　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ　、　Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ　８　（１９８Ｂ　）　５ ７−６３）には、生状態に導入された摂動も考慮に入れなければならないと記さ れている。 ジスルフィド橋を工学的に作り出す多くの試みがなされ、成功していると、文献 に報告されている。バントリアーノら、、バイオケミストリー第２６１（１９８ ７年）第２０７７〜第２０８２頁（Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏ　ｅｔ旦、、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６　（１９８７）　２０７７−２０８２）では、遺伝子 中に点変異により、２個のシスティン残基をズブチリシンに導入し、融点の３℃ の上昇が見られている。 Ｊ、　Ｅ、ビラフラン力ら、、バイオケミストリー第２１（１９８７年）第２１ ８２〜第２１８９（Ｊ、Ｅ、ν１ｌｌａｆｒａｎｃａ　ｅｔ　ａｌ−＋Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ２６　（１９８７）２１８２〜２１８９）は、点変異によりシ スティン残基をジハイドロホレート還元酵素に導入し、ジスルフィド橋を形成す るために野生型酵素中の遊離システィンの存在を利用していた。しかしながら、 このジスルフィド結合は予期しない効果を有する。というのは、変異型酵素は熱 変性に対する耐性が増加しないが、グアニジン塩酸塩変性に対する耐性が増すか らである。これらの２つの場合、変異した酵素は予期する程安定ではない。 これらの２つの一般的な方法は、上述したように、２点又は１点変異のどちらを 起こすにも適している。対称軸によって関係づけられている単量体ユニットを有 する多量体タンパク質（酵素）については、３つの可能性が存在しうる：遊離の システィンを要しないで、一点変異によりジスルフィド橋を生成するゆこの方法 は、ザウアーら０、バイオケミストリー第２５Ｓ（１９８６年）第５９９２〜第 ５９９８頁（Ｓａｖｅｒ旦ａｌ−＋　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５（１９８６ ）５９９２−５９９８）により、ラムダブレンサーに用いられて成功している： 融点の１０℃上昇、尿素変性に対する耐性の増加が得られ、さらに会合定数が改 良した。 後者の方法に対する前提条件としては、少なくとも２つの単量体間に対称軸が必 要である。対称軸は回転軸でもあるのだが、これらの軸の特性の一つはある点と この軸の間の距離が回転の際に維持されることである。それ故、多量体構造の対 称軸の近くニ導入された点変異は、この点の近くで再生されるであろう、この方 法は、一点変異により、単量体間にジスルフィド橋を導入するのに有利である。 本発明のもう一つの好ましい実施Ｍ様に従って、グルコースイソメラーゼの四量 体構造の安定性は、二量体構造を安定化することにより強化される。これは、酵 素の変性が少なくとも四量体から二量体への部分的、可逆的な反応で、かつ続い て二量体が各々２個の単量体に解離することであると思われる。二量体構造を安 定化することにより、二量体の変性の進行が遅くなり、その結果四量体の再結合 が改良されうる。単量体及び／又は二量体構造の感受性を減じる、化学修飾のた めの置換によっても安定性効果ををする可能性がある。というのは、タンパク質 が不可逆的に変性するからである。 本発明のさらに好ましい実施ＪＬＪにおいて、この四量体構造は、特別な突然変 異によりグルコースイソメラーゼの二量体構造又は単量体構造を安定化すること により、間接的に安定化する。単量体及び／又は二量体構造の重なり（ｐａｃｋ ｉｎｇ）を変えることにより、四量体構造の各部分のコンホメーシッンの自由度 は減少し、これにより、四量体に安定化効果がもたらされる。 酵素サブユニット間の相互作用を安定化する突然変異が、単量体タンパク質内の （折りたたみ）ドメイン間の相互作用を安定化できる可能性があることも明らか である。サブユニット及びドメインなる用語のさらに詳細な説明は、１９８９年 ７月１７日に出願された同時継続出願を参照のこと。 グルコースイソメラーゼの安定性を減少させようと思うなら、上述した安定化力 を同様の方法を用いて弱めることができることは、当業者にとって明白なことで ある。このような性質を有する変異体及びこのような変異体を得る方法もまた、 本発明の一部である。 本明細書では、アミノ酸に対する３文字及び１文字のコードを両方とも用いる。 このコードは以下の表１に説明する。 表　１ アルギニン　ＡｒｇＲｊリジン　Ｌｙｓ　Ｋアスパラギン　ＡｓｎＮｊメチオニ ン　Ｍｅｔ　Ｍグルタミン　ＧＩｙＧｊ）リプトファン　Ｔｒｐ　Ｗ本発明はま た、グルコースイソメラーゼサブユニット間の相互作用を改良する方法も提供す るが、これは分子の３次元じ３Ｄ”）構造を洞察することを基礎とする。酵素（ 又は酵素複合体）の３Ｄ構造に関する情報は、導入しろる突然変異を予測するた めには非常に重要である。 全体的な構造データが、ストレプトマイセス　ルビギノスス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｗ 　ｃｓｅ　ｒｕｂｉ　１ｎｏｓｕｓ　）のグルコースイソメラーゼについて（カ レルら、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２５９　（１９８４）　３２３０〜３ ２３６）、ストレプトマイセス　オリボクロモゲネス（旦皿口叩り憇　劇↓靭ｃ ｈｒぜμ通ｖ工）のグルコースイソメラーゼについて（ファーバーら、、Ｐｒｏ ｔｅｉｎ　Ｅｎｇ、１　（１９Ｂ　？）　４５９−４６６）、アルスロバクタ− について（ヘンリンクラ、＋ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ、工（１９８７）４６７−４ ７５）報告されている。 アミノ酸配列データはこれらの酵素について入手されていないが、ヱ久土ムエｉ 主λ　ミソ−１エンシスグルコースイソメラーゼとの３Ｄ構造のホモロジーがあ てはまる（Ｆ、レイら、　、　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ４　（１９８８）１６５−１７ ２参照のこと）０本明細書に開示されている方法の一般的な適応性を示すために 、様々の種起源のグルコースイソメラーゼの遺伝子がクローン化され、配列決定 されセルモブルガリスの遺伝子に由来するグルコースイソメラーゼのアミノ酸配 列は、対応していることが示されている。アムプラリｘ５種（Ｓａａｒｉ　％同 書）及びストレプトマイセス　ビオラセオリＮ−（Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅ ｓ、上６　（１９８８）９３３７）のグルコースイソメラーゼのアミノ酸配列は 公表されており、各々の遺伝子のヌクレオチド配列から由来しているが、アクチ ノプラネス　ｌソーリエンシスグルコースイソメラーゼと非常に類似している。 ビギノススグルコースイソメラーゼのアミノ酸配列がアムブラリ旦種グルコース イソメラーゼに対応していることを開示している。 多くのグルコースイソメラーゼの３Ｄ構造データが存在しないにも拘わらず、ア クチノマイセタレスからのすべてのグルコースイソメラーゼは類似の四量体組織 ををするという結論が得られる。 本発明の観点に従って、イオン橋は以下のようにグルコースイソメラーゼに導入 できる。カルボン酸エステル部位が正に帯電しうる原子（ＬｙｓとＡｒｇの末端 の窒素）から少なくとも８人離れている負に帯電した残基（ＡｓｐとＧｌｕ　、 問題となる使用条件で用いられるｐＨでイオン化される）を探して、グルコース イソメラーゼ四量体がスクリーニングされている。この基準を満足する１４残基 が見出されている。これらの候補の中で、残基は界面に存在し、さらにタンパク 質の内部に位置するように選ばれている。この後者の束縛は、タンパク質表面で 塩橋が形成する可能性を排除するためであり、これにより、全体的な安定性にわ ずかな影響を与えることが予想される（露出した帯電残基は実際水分子と水素結 合を有し、対イオンと相互作用する可能性がある）、従って、残基が埋め込まれ ている新しい塩橋を生成すると、２つの安定化の寄・与が組み合わさる：第一に 、埋め込まれている局在電荷の（好ましくない）存在がなくなること、第二に、 基質や溶媒の影響から保護するイオン対が生成されることである。 アクチノプラネス　ミソ−１エンシスグルコースイソメラーゼの１４の負に帯電 し、局在した残基の中で、３個が界面に位置する：Ａｓｐ　１４６、Ｇｌｕ　２ ２１及びＡｓｐ　２６４である。これらはすべて、比較的埋め込まれている（四 量体中で各々近づきうる表面は、４６．９及び４２人２である）０本発明の好ま しい実施態様において、上記した方法を用いて、これらの残基を有する新しい塩 橋が生成される。同様の突然変異は、他のグルコースイソメラーゼ（例えば上述 した起源から得られるが）に導入することができる。 上記した技術あるいは、当業者に公知の他の技術を用いて、四量体グルコースイ ソメラーゼ構造の安定性を強化するために、さらに数多い点変異を行なうことが できる。（アクチノブラネスミソーリエンシスグルコースイソメラーゼの構造デ ータについては、Ｆ、レイら、、１ｂｉｄ、参照のこと）、これらの中で、次の ような突然変異は１個の単量体サブユニットの安定化に関与する：−変性状態の エントロピーを減少させる目的で、Ｇ１ｙ残基を他の残基（α−へリンクスＢ） に置換する。 −疎水性の露出表面を減少するために、可撓性ループ（ｆｌｅｘｉｂｌｅｌｏｏ ｐ）　（α−へリンクスＧとβ−ストランド８間）を切断する。 −β−ストランドＥの初まりにＰｒｏ残基を導入する（変性状態のエントロピー を減少させる）。 一タンパク質構造の安定化にさらに寄与する芳香族クラスターを形成するために Ｐｈｅ　（α−ヘリックスＧ）に突然変異を起こさせる。 本発明のさらに好ましい実施Ｂ様において、リジンがらアルギニンへの置換をグ ルコースイソメラーゼ分子中のサイトで予備形成し、この安定性が増加すること がめられる０両残基とも、タンパク質の３Ｄ−構造において立体的に可能でなけ ればならない。 タンパク質中では、リジン残基は化学修飾されやすいが、アルギニンはそうでな い、それ故、リジンのε−アミノ基は、アルデヒドやケトンと反応して、シップ 塩基付加物、さらに修飾された生成物を生じることが知られており、遂には、生 物学的活性が喪失する結果となる（例えば、Ｐ、ヒギンズとＨ，パン、　Ｊ、　 Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｅｓ、２５６　（１９８１）　５２０４−５２０８参照のこと）、特に、高 濃度のグルコースとフルクトースが高温で存在するようなグルコースイソメラー ゼの使用において、このような化学修飾は酵素の不活性化に重要な要因である。 リジン残基がドメイン及び／又はサブユニット間の界面内に存在すると、このサ イトでの化学修飾はドメイン又はサブユニット解離を促進し及び／又はサブユニ ット及び／又はドメインの正しい再結合を妨げ、その結果、ＭＭした状態に不可 逆的にトランプされるようになる傾向がある。 このようなサイトで、リジン残基がアルギニン残基に突然変異すると、リジンの ε−アミノ基を有する化学修飾は排除できる。この点については１９８９年７月 １７日に出願した我々の同時係属特許出願を参照のこと。 グルコースイソメラーゼ中で特定のりジン残基をアルギニン残基で置換すると、 化学修飾の範囲、酵素活性及び／又は安定性へのその影響は減少する。結果とし て、リジン残基をアルギニンに変えると、使用に際してグルコースイソメラーゼ の安定性は改良される。 同様に、リジンからアルギニンへの突然変異が立体的に可能であるサイトでは、 リジン残基をアルギニン残基で置換すると、タンパク質の安定性は増加する結果 となる。アルギニンの側鎖の可撓性は、グアニジニウム基の存在により、リジン より小さいので、リジンがアルギニンに突然変異することは、エントロピー的立 場からも好ましい、さらに、グアニジニウム基は、タンパク質中で隣接する残基 とより多くの水素結合を形成して、また安定性を改良することができる。 本発明のさらにもう一つの好ましい実施態様において、特にグルコースイソメラ ーゼの熱安定性が強化することをめられている場合には、最初に生じており、特 に後に明らかにされるタイプの位置にある少なくとも１個のりジン残基をアルギ ニンに変える。 リジンをアルギニンに置換すると、置換アルギニン残基がその後関与する静電気 的相互作用、特にサブユニット及び／又はドメイン間の界面内の相互作用が改良 される。この実８１！ｉＬｉ様において、置換されるレジン残基は、折りたたま れた生のタンパク質コンホメーシッンに関して、以下の要求に答えることが好ま しい。 １、置換される残基が、静電気的相互作用に、好ましくはサブユニット及び／又 はドメイン間の界面で直接的に関与すべきであ２、突然変異は、導入されるアミ ノ酸残基を立体的に可能にするサイトで起こるべきである。 ３、残基は、溶媒が近づきにくいサイト存在するべきで、好ましくは、サブユニ ット及び／又はドメイン間の界面の一部であるべきである。 好ましくは、（１１と（２）の基準を満し、タンパク質中に近づきうる表面領域 じＡＳＡ”）が小さく、同時にＡＳＡが与えられた残基について測定された平均 値よりも小さい値であるようなアミノ酸残基をグルコースイソメラー・ゼ中に探 すべきである。これらの必要条件を満足するサイトにおいて、アルギニンは、リ ジンに比べて、側鎖のグアニジニウム基の物理化学的性質により改良された静電 気的相互作用を提供する（例えば、Ｄ、ウィグレイら７゜Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉ ｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｅ、土工９　（１９８７）９２７−９２９参照 のこと）。 本発明が教示するように修飾された、変異型のグルコースイソメラーゼの酵素活 性の実質的な量を保持することが一般に望まれる。このように酵素活性を保持す るためには、置き換えられるアミノ酸残基は、好ましくは、触媒残基又は実質的 に補因子と結合するとわかっているものであるべきではない。 本発明に従って、特定のアミノ酸で置換すると、上述した影響、例えば、静電気 的相互作用の強度を変えること、隣接する残基との水素結合の数を変えること、 酵素のフンホメーシッンのエントロピーを変えること、又は化学修飾の範囲に影 響を及ぼすことを組み合わせて、グルコースイソメラーゼの安定性を変えること ができる。 本発明に記載の変異型グルコースイソメラーゼは、以下のような一般的手順で生 産することができる。第一に、特定の変性条件下でグルコースイソメラーゼを失 活する機構を注意深く分析する。 この分析から得られた知識を用いて、特定のリジン又はアルギニン残基を？ＩＦ 換の候補として同定できる。これは、結晶学（１１，ウィコンフら、＋　（１９ ８５）　１ｌＤｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ　！１ｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏ ｇｉｃａｌｌＩｌａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　”　、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙ ＋ｅｏ１．　Ｖｏｌｓ、　１１４−１１５、Ａｃａｄ。 Ｐｒｅｓｓ　）　、ＮＭＲ分析ＣＫ、　Ｗｕｔｈｒｉｃｈ　、（１９８６）　’ ″ＮＭＲｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　”中 、Ｊ、　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　）のような方法で測定するか、又は、１次 構造の分析に基づいて構造を予測しく文献としては、、　Ｉｐ）、　Ｔａｙｌｏ ｒ＋　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｚ−（１９８８）７７を参照 のこと）、又は同種のタンパク質から得られる３Ｄ構造を基に構造を引き出して （例えば、Ｔ、　Ｂｌｕｎｄｅｌｌら、、Ｎａｔｕｒｅ　３２６　（１９８７） ３４７を参照のこと）、酵素の３Ｄ酵素を慎重に偶べることにより行われる。 最後に、好ま１−いサイトに位置するアミノ酸残基の置換を常用の方法、特に、 例えばベクターとスタンセンス（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ　）ら（同書）に記載され ている手順、及びゼル（Ｚｅｌｌ）とフリフッ（Ｆｒｉｔｚ　）（ＥＭＢＯＪ、 ６　（１９８７）１８０９）が記載しているバクテリア株を用いて、グルコース イソメラーゼをコードしたＤＮＡ配列の特定部位の突然変異誘発により行な・う ことができる。 上述した突然変異は、本発明で例証した方法により行われただけであり、本発明 の範囲を制限する意図はない。本発明はさらに、以下の非制限的な実施例によっ て例証される。 実施例で別に特定しない限り、再結合ＤＮＡを生産及び操作するすべての方法は 、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（１９８２）が記載した標準化した手順に より行なった。 以下のプラスミド、ベクター及びバクテリア株は、実施例で使用されたり、用意 されたりしているが、ブタベスト条約の規定の下に、ドイツ微生物寄託機関（Ｄ ｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｓｎｌｕｎｇ　ｆｆｆｒ　Ｍｉｋｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍ ｅｎ）ゲッチンゲン、西ドイツ、又はオランダ微生物寄託機関　（Ｃｅｎｔｒａ ａｌ　Ｂｕｒｅａｕ　Ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ　（ＣＢＳ ）　）　、　ツイーン、オランダに寄託しである。 ｐＭｃ　５−８　ＤＳＭ４５６６ ｐＭａ　５−８　ＤＳＭ４５６７ ｐＥｃＯＲ２５１ＤＳＭ４７１１ Ｅ、ｃｏｌｉＫ５２７　ＣＢ５４７１．８８

【実施例〕

１ＪｕＬ上 アクチノプラネス　ミグ−１エンシス（ＤＳＭ４３０４６）か゛のグルコースイ ソメー−ゼ゛　−の　とクローニングによるＤ−グルコースイソメー−ゼの Ｄ−グルコースイソメラーゼ（Ｇｌ）をＤ−キシロースとＤ−キシルロースに変 換する酵素であるＤ−キシロースイソメラーゼ（Ｄ−キシロース）ケト−ルーイ ソメラーゼ、ＥＣ５，３，１゜５）と同様に使用した。工学的に作られた大腸菌 株から生産した（ＤＳＭ）Ｇｌと呼ぶ。Ｇｌをコードしたアクチノプラネス　亙 ソーリエンシスの遺伝子を類億の大ｌｌ！Ｎ粒上人遺伝子と区別するため、前者 を立上と呼ぶ。 ？’ｌ／７＝主２２　亙ヱニュエｌ之入ＤＳＭ４３０４６の全ＤＮＡを部分的に ５ａｕ３Ａで切断した。切片をシ！ｌＩ！勾配で分画し、２〜７キロベース（Ｋ ｂ）の間の長さを有するフラグメントをプラスミドｐＥｃＯＲ２５１の特別なり ｇ／１１サイトに結合した。 キシロースイソメラーゼ欠損、大腸菌株ＡＢ１８８６−ハワードーフレンダーら （Ｇｅｎｅｔｉｃｓ５３　（１９６６）　ｌ　１１９）に記載され、大腸菌株Ａ Ｂ１１５７　（ＤＳＭ１５６３）由来のものである−を結合混合物で形質転換し 、続いて最小寒天プレー）　（１１ｉ１１ｅｒ（１９７２）　”Ｅｘｐｅｒｉｍ ｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　”中、ＣｏｌｄＳｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ、　Ｎ、　Ｙ、　）に１００■／Ｅのアンピシリンと０．２％（Ｗ／ Ｖ）キシロース（ＭＭＸ）を加えて培養した。３７クローンが再生しくｐＡＭｌ ｌ−１３７と呼ぶ）、１００■／１アンピシリンを含有するＬＢ培地で培養した 。再結合プラスミドＤＮＡを単離し、制限切断で分析した。プラスミドの２グル ープが確認されたが、１つ（例えばｐＡＭＩ７）は２．８Ｘｂ挿入され、他の１ つ（例えば、ｐＡＭＩ２５）は４．ＯＫｂ挿入されていた。広範な制限分析によ れば、両タイプの挿入とも、約２．ＯＫｂの共通な領域を有することを示してい た。この領域の配列決定を化学的分解法（Ｉｔ、　？１ａｘａ園と−、　Ｇ１１ ｂｅｒｔ。 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　７土（１９７７ ）５６０）で行なったところ、読み取り枠は１１８２の長さのヌクレオチドを有 しており、Ｇ１をコードしている領域であることを確認した。立上のヌクレオチ ド配列を、これに由来するアミノ酸配列とともに図１５に示す、以下、アミノ酸 の番号付は図１５を参照のこと。 立上の非常に高い発現は、以下のように、遺伝子をλバクテリオファージの右へ 向かうプロモーター（Ｐ、）の転写条件下に置くことにより、大腸菌中で行なう ことができた。 プラスミドｐＬ　Ｋ　９４　（Ｊ、ＢｏｔｔｅｒｍａｎとＭ、Ｚａｂｅａｕ、　 Ｄ　Ｎ　Ａ　６（１９８７）５８３）をまず、β−ラクタマーゼ遺伝子のＰｓｔ ｌサイトを除去して変化させた。これは、β−ラクタマーゼ遺伝子のＮ末端部を 含有するｐＬＫ７０−７０ｐの８８０ｂｐＥＣｏＲＩ／Ｐｓｔｌフラグメント（ ＢｏｔｔｅｒｍａａとＺａｂｅａｕ、同書）と、β−ラククマーゼ遺伝子のＣ末 端部を含有するｐＬＫ９４の１７００塩基対（ｂｐ）　ＥＣｏＲＩ　／　Ｐｓｔ 　Ｔフラグメントを複製元と同様、単離することによって行なった。続いてこれ らのフラグメントを結合してρＬＫ９４ｐを得た。 ｐＡＭＩ７をＰｓｔｌで切断し、約１８００ｂｐの長さの２つの精製したフラグ メント（そのうちの１つは立上遺伝子を含有する）の混合物をｐＬＫ９４ｐのＰ ｓｔｌサイトに結合した。この結合混合物を用いて大腸菌株ＡＢ１８８６を形質 転換した。ＭＭＸ上で培養したところ、アンピシリン耐性でＧｌ”の形質転換細 胞が得られた。 プラスミドＤＮＡをいくつかの選択した形質転換細胞から単離し、制限分析で同 定した。立上を含有するＰｓｔｌフラグメントを有するプラスミドｐＬＫ９４ｐ をｐＬＫ９４ＧＩと呼ぶことにした。立上の定位（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ　） は、独特のＢａｍＨＩサイトがＧＴＧ開始コドンから約４７０ｂＰ上流に位置す るものである。 ｐＬＫ７０−７０ｐをＰｓｔｌで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウフラ グメント）でプラントエンドを作り、続いてＸｂａｌで切断した。 ｐＬＫ９４ＣＩをＢａｍＨＩで線状にし、エキソヌクレアーゼＢａ１３１で切断 した。サンプルは様々な時間で採取し−この反応はエチレンジアミン四酢酸二ナ トリウムで停止した一Ｘｂａｌで切断し、ゲル電気泳動で分析して組換えＢａｍ ＨＩ　−Ｘｂａ　Ｘフラグメントの平均サイズを測定した。１３５０〜１４５０ ｂｐに渡るサイズのフラグメントをゲルから抽出した。このフラグメントをｐｌ Ｊ７０−７０ｐに結合した。大腸菌Ｋ　５１４　（Ｃ，Ｃｏ１５ｏｎ　ら、。 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ５２　（１９６５）　１０４３）をこの結合混合物で形質転換 し、アンピシリン耐性の形質転換細胞を３７℃で選択した。プラスミドＤＮＡを いくつかの形質転換細胞から単離して、制限分析で同定した。完全な立上を有す るプラスミドを含有する２４クローンを保持し、ＥｃｏＡｍｉ　（Ｄ　ＳＭ）　 Ｇ　Ｉの生産試験を行なった。 培養を１晩３７℃で行ない、その後全細胞抽出物を１２．５％ドデシル硫酸ナト リウム（ＳＤＳ）存在下、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分画 した（Ｕ、　Ｌａｅ＋ｕ＋ｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ２２７（１９７０）６８０）、 形質転換していないに５１４対照培養と比較すると、クローンの一つは、分子量 ４２キロドルトン（Ｘｄ）の新しいタンパク質を高いレベルで合成することが見 出され、これは、精製した？？＋／７’−主２エ　ミソーリエンシスＧｌに対し て産生したポリクローナル血清を用いてウェスタンブロンドにより、ＥｃｏＡｍ ｊ　（ＤＳＭ）　ＣＩと同定された。大腸菌に５１４にＥｃｏＡｍｉ　（Ｄ　Ｓ Ｍ）　ＣＩの高い生産をもたらすプラスミドをｐＬＫ７０ＣＩと呼ぶことにした 。 ＰＲ−Ｇ１転写ユニットはＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　Ｉフラグメントとして切断で き、この配列は図１６に示した。アガロースゲルから抽出した後、このフラグメ ントをＥｃｏＲＩとＸｂａｌで切断したｐＭｃ５−８とｐＭｃ５−８の両方に結 合し、各々ｐＭａ５−ＧｌとｐＭｃ５−Ｇｌを得た。これらのベクターは、Ｅｃ ｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）Ｇｌと等価で効率的な合成に関与することが見出されたが 、発現レベルはｐＬＫ７０ＧＩで得られるものとそれ程異ならなかった。 立上の発現はＧＩＧ開始コドンをＡＴＣ；　）リプレントに変えることによりさ らに増加できた。これは、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、実施 例４に記載するように特定部位の突然変異誘発により行なった： ５　’　−ＧＧＡＣＡＧＡＣＡＴＧＧＴＴＡＣＣ−３’野生型と変異型Ｇｌ酵素 を、１％トリプトファン、１％ＮａＣ１，０，５％酵母エキス、及びｐＭＡタイ プのベクターにはアンピシリン（１００■／ｌ）又は９ＭＣタイプのベクターに はクロラムフェニコール（２５■／ｌ）を有する培地中で培養した大！！菌株に ５１４で生産した。細胞を１晩３７℃で培養し、遠心分離にかけた＊　ＥｃｏＡ ｍｉ　（Ｄ　Ｓ　Ｍ）　ＣＩ酵素を以下のように精製した。セルペレット（ｃｅ ｌｌ　ｐｅｌｌｅｔ　）を０．０５　Ｍ　＋−リス（ヒドロキシメチル）アミノ メタン（Ｔｒｉｓ／Ｈｉ）　、Ｏ，ＩＩＩＭ　ＣＯＣ／！　、１０ｍＭ　ＭｇＣ ｌ、。 ０．２ＭＫＣｌ、５％グリセロール、及び５ｍＭ　ＥＤＴＡＳｐＨ８，０の最小 容量で再懸濁し、ライソザイムを加えて最終濃度を１．０■／１１１にした。２ ０分間Ｏ℃に静置した後、細胞をフレンチプレスを用いて破壊し、遠心分離しく ３０分、２３，０００ｇ）、上澄液を同じ容量の５％ストレプトマイシンスルフ ェートで希釈した。 インキュベーションを３時間４℃に維持し、続いて遠心分離した（３０分、２３ ，０００ｇ）。得られた上澄液を、３０分間で７０℃まで加熱しく但し、５０℃ までしか加熱しない変異株に２５３ＱとＫ１００Ｒは除り）、再び遠心分離にか けた。可溶性の上相は８０％硫酸アルミニウムからなる。はとんどの酵素活性を 有する沈殿物を遠心分離で回収し、それから、０．０２　Ｍ　Ｔｒｉｓ／　ＩＣ １，５＋ｓＭＥＤＴＡ、、０．８５Ｍ硫酸アンモニウムに溶解した。続いて、フ ェニル−スーパーロース（Ｐｈｅｎｙｌ−３ｕｐｅｒｏｓｅ）　、セファクリル Ｓ−２００ＨＲ，及び最後にモノ−ＱＨＲ１０／１０のクロマトグラフィーの工 程をとった。重要なのは、５ｔＭＥＤＴＡをクロマトグラフィー用の全緩衝液に 添加することが、金属イオンを除去するために必要であることである。使用する 前に、得られた酵素を、１０ｍＭＥＤＴＡ　（最終ｐＨは約５．２である）を含 有する１０１トリエタノール−アミン、ＰＨ７，２の２００容量で３回、再度、 ５ｍＭ（２Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）　、ｐＨ６，０の２０ ０容量で、緩衝液を３回変えて透析した。最終酵素標本の含金属をパリアンスベ クトルＡＡ３０／４０　（〜’ａｒｉａｎ　５ｐｅｃ？、ｒ　ＡＡ３０／４０） の原子吸光分光分析法により測定し、ＥｃｏＡｍｉ　（ＤＳカ）Ｇ１が無金属で あることがわかった；例としては、コバ用ｌ−イオンは、高い親和力で酵素に結 合しているのだが、ｌ　ｍｏｌのＥｃｏＡｍｉ（ＤＳＭ）Ｇｌモノマー当たりわ ずか±Ｉ　Ｋ４０”’モルの割合を占めている（ＥＤＴＡがクロマトグラフィー 用緩衝液中にないと、後者の値は、１　ｍｏｌの酵素単量体当たり０．５ｍｏｌ のコバルト量まで上昇した）　、　ＥｃｏＡｍｉ　（Ｄ　ＳＭ）　ＣＩの純度は 、５ＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色法で、またバイダンク（Ｖｙｄａｃ　）　Ｃ４カラ ムを用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ’）で評価した。 グルコースイソメラーゼの酵素活性を以下に記述するようにアッセイした（酵素 活性１ユニツトは、１分間当たり、１Ｎ節。ｌのＤ−キシロース又はＤ−フルク トース生産物を生産し、比活性＝Ｓｐａ−はｌ■のＣＩ酵素当たりのユニットで 表現される）。 トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）アッセイは以前にディスク電気 泳動上のＤ−キシロースイソメラーゼの映像として記載した（Ｋ、　Ｙａｍａｎ ａｋａ　−、Ｂｕｌｉ、　Ｙａｍａｇｕｃｈｉ　Ｍｅｄ、　５ｃｈｏｏｌＩ＆　 ＜１９７１）１）、この染色法は、室温で糟がテトラゾリウム塩と反応してホル マザンを形成することに基づくものである；この反応は、室温でケトースに特有 のものであり、アルドースは１００℃でしか反応しない。ゲル上で、活性キシロ ースイソメラーゼは、それ故、ピンク−赤バンドで同定できる。わずかに変更し て、この活性試験は、薬学のファストシステム（Ｐｈａｓｔ、　Ｓｙｓｔｅｍ） の使用に応用されている。簡単に言うと、以下の電気泳動、ネイティブ−ＰＡＧ Ｅゲルをファストシステム染色チェンバーに変え、１５分間、５０℃で、２０　 ｍＷ　Ｔｒｉｓ／　ＨＣ１、ｐＨ７，２に５０ｍＭキシロース、１０ｍＭ　Ｍｇ ＣＪｚ　％　０．１ｍＭ　Ｃｏ１Ｊｔを加えてインキュベートした；脱イオン水 で０．５分４℃で洗浄した後、ゲルを３分間２０℃でｌ　Ｎ　ＮａＯＨ中で新た に調製した０、１％トリフェニル−テトラゾリウム−クロリド中に浸漬した；ゲ ルを２２Ｎ）ＩＣｆ中で１５分間２０℃でインキュベートすることにより反応を 止めた；最後の洗浄を水中（０，５分４℃）で行なった。 Ｇｌ活性は、３５℃でグルコースイソメラーゼによるキシロースの異性化により 生じるキシロースの２７８ｎｍでの吸収の増加を測定することにより、ｍアッセ イすることもできる。このアッセイは、０．１Ｍキシロースの存在下、ｌ　Ｏｍ Ｍ　Ｍｇ５Ｏ＊を含有する５０ｄ）リエタノールアミン緩衝液、ｐ）１７．５で 行なった。このアッセイにおけるグルコースイソメラーゼの最終濃度は、±０． ０１■／ｓｉｔで、酵素アッセイ混合物に希釈する前に、１．０■／−！の酵素 溶液に対し２７８ｎ−での１゜０８の減衰係数を用いて吸収スペクトルにより正 確に測定した。 Ｄ−ソルビトール　−ヒドロ°　−ゼカップルドアーセイにおいて、Ｄ−キシロ ースの酵素測定を、インキュベーション緩衝液が１ｍＭエチレンビス（オキシエ チレン−ニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）も含有する他は、以前に記載されている ように（にｅｔｓｔｅｒｓ−Ｂｉｌｄｅｒｓｏｎ　ら＋Ｉ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉ ｃｒｏｂ、Ｔｅｃｂｎｏｌ、９　（１９８７）　１　４　５）±２　Ｘ　１　（ １”ＭＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ（Ｌ−イジトール；　ＮＡＤオキサイ ド−還元酵素、ＥＣ１，１，１４）の存在下で、５０ｍＭ）リエタノールアミン 、ｐＨ７゜５．１０−けＭｇ５Ｏ＊、及び０．１　Ｍキシロース中で３５℃で行 なった。このアッセイにおけるグルコースイソメラーゼの最終濃度は±２．５Ｘ １０−３■乙ｉで、上述したように正確に測定した。 基質としてグルコースを用いて、Ｇｌ活性をアッセイすることもでき、この場合 、システィン−カルバゾール法（ＣＣＭ）　を用いて異性化反応中に生産される Ｄ−フルクトースを測定して行われるが、この方法は、酸の中でケトｌがカルバ ゾールと反応して、紫色の生成物を生じることに基づくものである（Ｄｉｓｃｈ ｅとＢｏｒｅｎｆｒｅｕｎｄｓ　１９５１　）　ｍ１児烈Ｉ ＥｃｏＡｗｉ　（Ｄ　Ｓ　Ｍ）　Ｇ　Ｉ　の魅パ東　論熱失活速度論の実験を、 ！金員グルコースイソメラーゼに各々特定の場合に記載されている添加物を加え て行なった。簡単に言うと、精製した酵素を望ましい緩衝液中で平衡にし、この 溶液を指示された温度にセントした循環する水浴（ラウダ、ＲＭε）に連結した ガラスマントル中に予め挿入しておいた、テフロン針付きハミルトンガスータイ トストリンジ（ｌ（ａｓｉｌｔｏｎ　ｇａｓ−ｔｉｇｈｔ。 ｓｔｒｉｎｇｅ　）中に吸引した。予備実験は、この酵素溶液の２５から８０℃ への温度平衡が、１分以内に行なわれたことを示した。適当な時間に、アリコー トを工ンペンドルフ管に入れ、サンプルを０℃まで冷却することにより熱変性工 程を消失した・また・大サンプルをリヤクチ−バイアル（Ｒｅａｃｔｉ−Ｖｉａ ｌｓ）　（ヒース）中の個々のアリコートとしてインキュベートした。 １、：び ５０ｍＭ　（３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸）（ＭＯＰＳ＞　、 ２５℃でｐ！１７．２（２５℃でｐＫａ　−７，３，５；　ｄｌ（／℃−−０． ００１）におけるＥｃｏＡｗｉｉ　（Ｄ　ＳＭ）　Ｇ　ＩＯ熱失活の速度論を温 度の関数として、図１　（金属添加熱）、図２（＋１０ｍＭＭｇ５Ｏ４）・及び 図３　（＋　１０　ＣｏＣ１ｔ）に示す、すべてのデータの点は、使用温度及び 金属イオンの存在又は性質に拘らず、−次反応に相当する理論的な減衰曲線に見 事に一敗している。 このデータは、また、マグネシウムの安定化効果、及び、コバルトイオンについ てはそれ以上の効果を示している。熱による酵素の失活は不可逆的であることが 見出された；従って、加熱によりタンパク質の凝集を引き起こすことが示された 。汽ｇ″２の存在下では、酵素活性の喪失は、タンパク質の沈殿の程度とかなり 良い相関があると説明できる。 図４は図１．２、及び３のデータをまとめており、この温度間隔においては、金 属の有無に拘わらず、アーレニウスプロットは直線であることを示している。 この結果は、ＥｃｏＡｍｉ　（Ｄ　ＳＭ）　Ｇ　ＩＯ熱変性は、試験したすべて の条件下で１つの事から生じていることを示している；金属の有無により同じ制 限工程が優勢か否がはわがらないが、アーレニウスプロットの直線性は、この工 程がある特定の実験条件下で特別なものである主張を支持する。 ２、ｐＵ　びイオン Ｇｌを安定化する金属の親和力はｐｌ！依存性が大きい；特に、ＰＨ６以下では かなり減少する。従って、ＥｃｏＡｍｉ　（Ｄ　Ｓ　Ｍ）　Ｇ　Ｉの熱安定性へ のｐＨの影響は、添加金属無で無金属酵素を用いて研究した。 ４、７〜８．３のＰＨ範囲においては、ＥｃｏＡｍｉ　（Ｄ　ＳＭ）　Ｇ　Ｉの ７２℃での失活は、常に１次反応速度論に従った０図５は、失活速度定数に、が 、ｐＨ５，５〜６．７の間で実質的に変化せず、しかしこのＰＨ範囲のどちらの 側でも増加していた。 図６は、添加金属無の酵素の熱失活の速度論がイオン強度の関数として増加した ことを説明している。これは、ｐＨ依存性のデータとともに、極性残基がＥｃｏ Ａｍｉ　（ＤＳＭ）　ＣＩの熱安定性に必要なことを強力に示している。 この条件は、図７のデータによってさらに支持されており、図７は、ｐＨが徐々 に増加するとく即ち、７２℃でＰＨ６，７からｐ）１７．６に）、塩化ナトリウ ムの不安定化効果がかなり増幅することを示している。 ３、とシアネートのづ Ｇｌは、４個の同じサブユニットからなる四量体である（Ｆ。 Ｒｅｙら、、同書）。 尿素とシアネートの影響は、加熱の結果として酵素活性が喪失する、即ちサブユ ニットの解離及び／又は変性を説明しうる構造の変化を同定する試みにおいて主 張された。 酵素のオリゴマー化状態をスーパロース−１２を用いたゲル濾過高速液体クロマ トグラフィー（Ｓ　Ｅ　Ｃ−ＨＰ　Ｌ　Ｃ）により室温で分析したが、この際に 、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＪ　２５℃でｐＦＩ８．ｏ及び１５０■ＭＮａＣ１ から成る溶ｇ！緩衝液を用いた。続いて、７Ｍ尿素中室温で、酵素を長時間イン キュベートした。 生Ｇｌは、５ＥＣ−ＨＰＬＣ上で四量体として溶離することを示す。 図８は、尿素中の長時間インキュベーションは、生ＥｃｏＡ■ｉ（ＤＳＭ）Ｇｌ −四量体の二量体への解離を引き起こすのに必要であることを示している。 シアネートは溶液中に静置するだけで尿素から発生することが知られており、シ アネートによる酵素の化学的修飾は観察されるサブユニットの解離に関係がある かもしれないと考えられている。 この仮説を試すために、酵素を１６〜２４時間、室温で、０．２Ｍボロネートｐ ）１８．５と０〜２００ｍＭ１度のシアネートを含有する１　５０ｇ＋？ｌ　Ｎ ａＣＪとこれに新たに調製した５、　０　Ｍの−＞７＄二）Ｅ１旦星と尿素（ミ リーＱ水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ　ｊｌａｔｅｒ　）中で、新たに調整した１０Ｍ尿素 の原液を製造の要請に従ってＡＧ５０１−Ｘ８（Ｄ）樹脂のカラム（バイオ−ラ ンド）に通した；この処理により、シアネート化するイオン性不純物を除去した ）の存在の有無で、インキュベートした。 以下のことが観察された： １、　シアネート単独で処理すると、５ＥＣ−ＨＰＬＣ上のＥｃｏＡ＋ｓｉ（Ｄ ＳＭ）ＣＩの溶離プロフィールは変わり得なかった。ネイティブＰＥＧＥは、負 の電荷が増加しても（図９Ｂ、上パネル）のゲルのＴＴＣ−染色に示されるよう に酵素活性の見かけの喪失がなければ（図９Ｂ、下パネル）酵素の化学修飾の投 与量依存性の根鉢はなかった。 ２．５．０Ｍのシアネートを有しない尿素中でＥｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）　Ｇｌ を１６日間インキュベートした後、二量体の形成は５ＥＣ−ＨＰＬＣでは見られ なかった（図１ＯＡ）、Ｌかし、ある二量体−二量体解離は、ネイティブＰＥＧ Ｅの後に観察されており（図１０Ｂ、上パネル、ＯｍＭ　ＮａＣＮ０）　、これ は用いられる尿素濃度（５モル）において、発生したシアネートがわずかに化学 修飾を引き起こすが、これは四量体の解離には直接的に至らず、二量体−二量体 会合を弱めて、ＰＡＣ；Ｅの際に印加される電場の影響下で、解離が生じうるよ うになることを示唆している。 さらに、尿素と電場の影響が重なって四量体から二量体への解離が引き起こされ るという考えも提唱できる。 ３．５．０Ｍ尿素中のＥｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）　ＣＩにシアネートを同時に添 加すると、濃度に依存して四量体がら二量体への解離が容易に引き起こされた。 これは５ＥＣ−ＨＰＬＣデータｃ図１０Ａ）によってもネイティブＰＡＧＥ　（ 図１０Ｂ、上パネル）によっても示された。インキュベーション後、高いシアネ ート濃度での二量体のＰＡＧＥにおける減速は、この条件下で酵素の変性が増加 した結果であるようだ、ネイティブＰＡＧＥ上で、二律はＴＴＣ染色後、ＧＩ− 活性を示さなかった（図１０Ｂ。 パネル）、この発見は、酵素活性は、Ｇｌ−四量体が二量体解離すること及び／ 又は化学修飾により喪失することを示唆する。 結論として、シアネートと尿素の両方の存在により、ＥｃｏＡｍｉ（ＤＳＭ）四 量体から二量体へ解離が観察されるようになる。シアネート単独では効果がない ので、化学修飾されたアミノ基、これは酵素の四量体構造の安定化に必要である が、尿素が存在しなければ溶媒が接近できない、尿素はおそらく、二量体／二量 体相互作用を不安定化させ、これにより、二量体／二量体界面内に埋め込まれて いるアミノ酸が露出する。従って、これらの残基は、α−及び／又はε−アミノ 基を有するが、シアネートによりカルバミル化が可能になる０次に、シアネート のサブユニット間に接触する残基への共有結合は、酵素の二量体形成を安定化す る。それ故、ＥｃｏＡｓｉ　（Ｄ　Ｓ　Ｍ）　Ｇ　Ｉ四量体の二量体への解離は 、おそらく熱変性の初期に起こっている現象の一つと提唱できる。この仮説を支 持して、タンパク質濃度が高いと、熱による変性に対して酵素を安定化すること が観察され得た（データは示していない）。 ４、グリケージコン タンパク質は、グリケージコン、即ち、α−及びＣ−アミノ基がグルコースや数 多（の他の糖により非酵素的に修飾されることがわかっている。使用条件下にお いて（高いグルコース濃度、ｐＨ７，５、及び長時間の利用）　、ＥｃｏＡｍｉ 　（Ｄ　Ｓ　Ｍ）　ＣＩのグリケージコンは、起こり得る；特に、ＥｃｏＡｉｉ ｉ　（Ｄ　Ｓ　Ｍ）　Ｇ　Ｉ四量体が高い温度で二量体に解離するならば、尿素 の存在下でシアネートと反応する同じアミノ酸残基が、四量体−二量体解離とお そらく触媒活性の喪失を伴ってグリケーシヲンすると予測した。 無金属Ｅｃｏｌ１ｗｉ　（Ｄ　Ｓ　Ｍ）　Ｇ　Ｉは、マグネシウムの　で６０℃ で５０＋ｍ１つＭＯＰＳ、６０℃でｐＨ７，７中にＤ−グルコース（２５０ｗＭ ）無又は有でインキュベートした。適当な時間に、アルコートを取り、２５℃ま で冷却して、２７８ｎ−での直接キシロース吸光アッセイで残留酵素活性を試験 した。 図１１．パネルＡは、グルコースの存在により、６０℃での酵素の熱失活速度が 、かなり増加したことを示している。この効果は、可逆ではない、というのは、 ５０！ＩＭ　ＭＥＳ、　ｐＨ６，０，４℃に対する広範な緩衝液の変更により、 ＥｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）　ＣＩ　（図１１、パネルＡの三角）の触媒効率は回 復できなかつたからである。さらに、５ＥＰ−ＨＰＬＣで反応生成物を分析する と、予測されるように、グリケーシッンは、時間に依存して、四量体から二量体 に解離することによって完了したこと（図１１、パネルＢ及びＣ）、四量体の解 離が高温で生じるという主張を支持する発見が明瞭に説明された。解離した二量 体は、二量体間の接触の中に存在するであろう反応性アミノ基のグルコースによ る共有的な修飾によりトラップされる。 図１１．パネルＤは、加熱により、約１６量体の大きさのＥｃｏＡｍｉ　（ＤＳ Ｍ）　Ｇ　１　（±７００キロドルトン、即ち、４ＧＩ四量装置子）を有するタ ンパク質凝集を形成し；この凝集はグルコースの存在により大変強化されたこと を示している。しかしながら、凝集の形成は、Ｇｌの二量体への解離と独立に、 あるいは単に続いて起こるだけなのかはわかっていない。 非常に類似する結果が、異なる緩衝液系、即ち１２．５ｍＭリン酸カリウム、６ ０℃でｐＨ７，７で再現し得た。 シアネート化して、安定なＧｌ二量体を生成するには尿素の血止が必要で、一方 、グルコースは尿素の存在無で高温で同じ性質を示すことは興味深い、それ故、 我々は、尿素も加熱もＥｃｏＡｍｉ（ＤＳＭ）Ｇｌ 量体間界面に位置するアミノ酸残基を露出する；これらのうち、以前は接近でき なかったアミノ基がシアネート又はグルコースと反応できるようになり、二量体 状態に酵素をトラップすると結論することができる。 裏施班主 アクチノプラネス　ミソーリエンシスのグルコースイソメラーゼのサブユニット 　のリジン　の６ Ｇｌは、２つの二量体（ＡＢとＣＤ）のアフセンブトと見られる４個の等価のサ ブユニット（ＡＳＢＳＣ及びＤ）から成る四量体である。それ故、サブユニット 界面は２つのカテゴリーに区別することができ、１つは１個の二量体内の単量体 間の界面（二量体内界面）であり、他の１つは、２個の二量体間の界面（二量体 間界面）である。 解離したサブユニット中で計算した接近できる表面領域（ＳＡＳ）ＣＢ、リーと Ｆ。リチャード、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、５５　（１９７１）　３７９）が オリゴマー中で測定したものと異なっているなら、残基はサブユニット界面の接 触に関与しているといえる０表２に、解離した単量体中及びＧｌ四四棒体中両方 の２０サブユニツトリジン残基に対するＡＳＡまとめた。 ｉ　１３２　１４７．４　１４７．４　０．Ｏ１ｉ３０９　９３．２　９３．２ 　０．０　；これらの残基のうち１１個のものが、サブユニット界面に関与して いるように思われる。ＬＹＳ−１００とＬＹＳ−２５３のみがサブユニット界面 内の広い領域（各々１４９人３と１１０人寞）に埋まっており、はぼ完全に四量 体中に埋まっている。換言すれば、これらの残基の双方とも、四　でのｒ　′　 は　い。 また、どちらの残基とも、ＥｃｏＡｍｔ　（Ｄ　Ｓ　Ｍ）　ＣＩの触媒活性を有 しない、さらに、ＬＹＳ−１００とＬＹＳ−２５３はサブユニット界面の　０・ 　を　する、Ｓ−サブユニット＜Ａ−ＬＹＳ−１００）中のＬＳＹ−１００は、 Ｂ−サブユニット中の３７３部位の近（の小へリンクスの最後の曲がりを水素結 合により安定化している。一方、Ａ−サブユニット（Ａ　−Ｌ　Ｙ　Ｓ　−２５ ２）のＬＹＳ−２５３はＣ−サブユニットのＡＳＰ−１９０とイオン性二量体間 の相互作用を有する。モデル構築法＜ｍｏｄｅｌ　ｂｕｉｌｄｉｎｇｔｅｃｈｎ ｉｑｕｅｓ）　、（Ｐ、デルヘイズら、、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｇｒｏｐｈ、　３　 （１９８４）１１６に記載されている）を用いると、ＬＹＳ−１００の環境はＡ ＲＧへの置換を可能にしそうではなく、一方、ＬＹＳ−２５３からＡＲＧへの突 然変異は、悪影響をもたらす物理的接触が存在せず、ＡＳＰ−１９０とのイオン 性相互作用が好ましい状態で保持されているので、：生り堡亙亘であることが認 められた。 もう１つのりジン残基であるに２９４は、二量体−二量体界面に位置するが、部 分的に四量体中に埋まっているに過ぎない（接近可能な表面領域２２．８人３） 。この残基は、すべてのアクチノマイセートグルコースイソメラーゼ中でしっか りと保存されている（実施例１０及び図２１参照のこと）；シかしながら、Ｎ２ ９４はまたＮ２４７及びＤ２５７と相互作用し、両者とも金属結合を有する。従 ってに２９４は異なる機構でグルコースイソメラーゼの安定性に影響する。 大Ｕ土 アクチノプラネス　ミソーリエンシスのグルコ−Ｚ　！　’／　−Ｌ々：：、。 ゼ　の　のリジン　のアミノ 本発明に従えば、ＬＹＳ−２５３をアルギニンで置換すると・二量体−二量体界 面間の静電気的相互作用を安定化し、これによリ、熱失活に対するＥｃｏＡｍｉ 　（Ｄ　Ｓ　Ｍ　）の安定性は増加する。さらに、この置換により、２５３位の （グルコース又はシアネートによる）化学修飾も妨げられる。 ＥｃｏＡｍｉ　（Ｄ　Ｓ　Ｍ）　ＣＩの熱安定性における、Ａ−ＬＹＳ−２５３ ／Ｃ−ＡＳＰ−１９０イオン対の静電気的相互作用の重要性を主張するためには 、ＬＹＳ−２５３をグルタミンに変異して、リジン側鎖のイオン性を排除したが 、この突然変異はさもなければ保存される理屈はない。 特定部位の突然変異誘発は、ｐＭａ５−８及びｐＭａ５−８のようなプラスミド ベクターを用いて、切断された二重ＤＮＡ（ｇｄＤＮＡ）法に従って行なった（ Ｐ、スタンセン立、同書）。 突然変異誘発の計画には、突然変異すべき領域の上流及び下流の特定の制限サイ トを使用する必要カミあるので、コードされたアミノ酸配列を変えることなく、 Ｇｌコード配列中に２つの切断□サイトをさらに導入した。Ｋｐｍｌサイトを以 下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて１７７部位のＧのヌクレオチド塩基 を変更することにより生成した： ５　’　−ＣＧＡＡＧＧＧＴＡＣＣＡＧＧ−３’Ｘｈｏｌサイトを以下のオリゴ ヌクレオチドプライマーを用いて８２５部位のＧをＣに置換して生成した：５　 ’　−ＧＣＣＧＴＴＣＴＣＧＡＧＧＡＧＧＴＣＧ−３’ＧＴＧからＡＴＧコドン への転換（実施例１参照）及びＫｐｎｌサイトの生成は１回の突然変異誘発実験 で完了し、これにより、関連ある酵素によりリン酸化されたオリゴヌクレオチド は、一本ｉ１　ｐＭａ５−　Ｇ　ＩとｐＭａ５−ＧｌのＢａｍＨＩ　−Ａａｔｌ ｌ大フラグメントに由来するｇｄＤＮＡにアニールされた。 Ｘｈｏｌサイトは、別の実験で導入した；用いられる。ｄＤＮＡは、一本１１（ ｐＭａ５−ＧｌとｐＭａ５−Ｇｌの５ａｃｌ　５ｅａｌ大フラグメントから構成 されたものであった。３つの突然変異は二重変異体とＸｈｏｌ変異体の適当なフ ラグメントを結合することにより、−末鎖遺伝子中に集めたものであった。この 結果生じた三重変異体をｐＭａ−１と呼んだ、捕捉的なｐＭａ５−１は、ｐＭａ ５−１のＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ　Ｉ小フラグメントの挿入により構成されたもの で、ｐＭａ５−８のＥｃｏＲｌとＸｂａｌサイトの間にＰＩ　−Ｇ±ハイブリッ ド遺伝子を含有した。 ｐＭａ５　１とｐＭａ５　１は、野生型と変異型Ｇｌの両方の生産のために使用 される基本的なベクターである。すべての特定部位の突然変異誘発試験において 、後述するように、−末鎖型のｐＭａ５−１とｐＭａ５−１の適当なフラグメン トから作製されたｇｄＤＮＡを使用した。 １、＋ジンー２５３→グル　ミン ｇｄＤＮＡの構成に、ｐＭａ５−１のＳａｃ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ大フラグメント と以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた：５　’　−ＣＣＴＧＧＴＣＧ ＡＡＣＴＧＣＧＧＧＣＣＧ−３’変異型酵素はよく発現した；キシロースを基質 として用いた比活性は、野生型ＥｃｏＡｍｉ　（Ｄ　ＳＭ）　ＣＩの９６％であ った（表３）。 ７２℃、５０ｍＭＭ０　Ｐ　Ｓ、　７２℃でｐＨ７，４、金属熱における熱失活 は、−次反応速度論に従い、この突然変異は野生型の１．４×１０−”ｗｉｎ− ’からに２５３Ｑの０．！Ｊｓｉｎ−’に変性速度定数の６０倍増加を引き起こ したことを示した（図１２、パネルＡ）、１０５ＭＭｇ５Ｏ４（Ｄ存在下、８５ ℃、５０＋５ＭＭ０　Ｐ　Ｓ、　８５℃テｐＨ６，５ニおいて（図１２、パネル Ｂ）、−次崩壊速度定数は、Ｋ２５３Ｑに対して１．２ｍ１ｎ−１の値を存し、 野生型酵素（Ｋｎ　−３，４Ｘｌ０−”■ｉ〔りの約３５０倍大きかった。 ゲル濾過クロマトグラフィーで、Ｋ２５３Ｑ酵素のオリゴマー構造を分析したと ころ、四量体そのままであった。しかしながら、０．２Ｍボレート、ｐＨ８，５ ，０，１５Ｍ　ＮａＣ１中の５モルのシアネートを有しない尿素中で長時間イン キュベートすると、図１３、パネルＡに示すように、Ｋ２５３Ｑ変異体は容品に 二量体に解離した；図１３、パネルＢで、野生型及び変異型酵素の二量体形成の 生成曲線を示すデータをまとめた；このデータは、変異型酵素の四量体から二量 体への解離を示しているが、野生型酵素のは示していない。 上述した実験は、ＥｃｏＡｍｉ（ＤＳＭ）Ｇ１分子の安定化の構造的基盤を証明 する。残基に２５３のグルタミンへの特定の変化は、温度及び尿素感受性の突然 変異を引き起こし、結果として、本質的な相互作用の位置を同定した。明らかな 相互関係が変異体の熱失活の感受性と室温で尿素によって促進される四量体から 二量体への解離の程度の間にある。 ２．１ジン−２５３−アルギニン ｇｄＤＮＡの構成に、ｐＭａ５−１のＳａｃ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ大フラグメント と以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した：５　’　−ＣＣＴＧＧＴＣ ＧＡＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＧ−３’Ｅｃｏ＾−ｉ　（ＤＳＭ）変異型に２５３Ｒ は、よく発現し、キシロースを基質とする酵素活性は、野生型の１２０％を示し た（表３）。 この変異型の熱安定性を、５０ｍＭ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルビヘラジンーＮ ’−２−：Ｌ夕７ス）Ｌｔ＊７ｒｌｌ”）　（ＥＰＰＳ）、ｐＨ７，５，５ｓｉ Ｍ　Ｍｇ５Ｏａ中で、８２〜９２℃の温度範囲で試験した０表４に、Ｋ２５３Ｒ と野生型酵素の半減期を時間で挙げた；この結果は、この温度範囲に渡って、Ｋ ２５３Ｒが野生型酵素より定常的に安定であることを示している。 高温でのグルコースによる失活に関して変異型に２５３Ｈの安定性を主張するた めに、両方の酵素を２５０＠ＭＤ−グルコースの存在下、６０℃で、１２．５ｍ Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐ）１７．７中でインキュベートした０図１４に、約 ７０時間のインキュベーションの時間、経過を示した；このデータは明確に、Ｋ ２５３Ｒ変異体中で行なわれた失活する一不可逆的な一化学修飾に対する防御が 、半減期として、野生型と比較して５倍増加したことを示している。 負の対照実験として、ＬＹＳ−１００をアルギニンに突然変異したが、この場合 、前述したように、新しい残基の立体的調節がうまくいかず、酵素活性に影響を 与えることなく、安定性が減少することが予測された。 ３、リジン−１００→アルギニン ｇｄＤＮＡの構成に、ｐＭａ５−１のＫｐｍｌ　−ＡａｔＩＩ大フラグメントと 以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた：５　’　−ＣＣＧＣＣＧＴＣＣ ＣＧＧＡＡＣＡＣＣＧＧ−３’Ｋ１００ＲＣＩの比活性は、キシロースを基質と して用いると２２ユニツト／■であった。従って、野生型ＥｃｏＡｍｉ　（Ｄ　 Ｓ　Ｍ）　Ｇｌの活性に匹敵する（　２４．５ユニツト／■）、シかしながら、 この変異型酵素の熱失活は、５０ｍＭＥＰＰＳ、８４℃でｐ）１７．５．５ｍＭ Ｍｇ５Ｏａにおいて、１００倍速く、Ｋｍ　−０，３ｓｉｎ−’で進行した。 ４．１ジン−２９４→アルギニン ｇｄＤＮＡの構成に、ｐＭａ５−１のＸｈｏ　Ｉ　−Ｓｅａ　Ｉ大フラグメント と以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた：５　’　−ＧＧＧＡＣＧＧＣ ＣＧＧＴＡＧＴＣＧＡＡＧ−３’ＥｃｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）　ＣＩ変異型に２９ ４Ｒはよく発現し、キシロースを基質とする酵素活性は、野生型の８５％であっ た（表３）・この変異体の熱安定性を５０−Ｍ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルビベ ラシアーＮ’−２−ｘタンス／Ｌ／ホン酸）　（ＥＰＰＳ）　、ｐＨ７，５，５ ＋ｓＭ　Ｍｇ５Ｏ，中で、８２〜９２℃の温度範囲に渡って試験した。 Ｋ２９４Ｒの半減期を時間単位で、表４に挙げた；この結果はこの温度範囲に渡 って、Ｋ２９４Ｒは、野生型酵素とほぼ同じ安定性を有することを示している。 Ｄ−キシロース’＝ＵＪ・　゛　）　はＤ−グルコースる　（ＷＴ）とＦ　Ｅｃ ｏＡｍｉ　（ＤＳＭ）　ＣＩの　バーメーＳｐａｍ１分（ユニット）あたり、酵 素１■あたりの生成物（Ｄ−キシロース又はＤ−フルクトース）のμｓｏｌで表 わした比活性 Ｖ　ｗａｘは、酵素１■あたりのユニットで表現する。 ＫＮは、ミカエリス定数で１で表わす。 Ｎ、−測定なし キシロース　グルコース Ｓｐａ　Ｖｍａｘ　にｍ　Ｖ＋ｓａｘ　Ｋｍ縁ｒ−Ｇ４　２４．５　２４．２　 ４゜８　３４．８　２９０に２５３Ｒ３０，０２４，６５，３２７，２１７７に ２５３Ｑ　２３　１５．１　４．４　２９．２　２１０Ｋ１００Ｒ２２，２ＮＤ 　ＮＤ　Ｎｌ）　ＮＤＫ２９４Ｒ２０，５１３，８４，５２５，８１８７Ｇ７０ Ｓ；Ａ７３Ｓ：Ｇ７４Ｔ　２Ｂ　２４．９　５，３　３９．２　２３５５０ｍＭ ＥＰＰＳ、８４℃でＢ７．５．５−門ＭＳＯ６にお番ると工　に　′　れた・　 グルコースイソメー−ゼの半減期は、全酵素活性が５０％まで減少するのに要す る時間である。 賀Ｔ−Ｇｌ　１１．８５　３．８０　１．０７　０．２５　０．０８０　０．０ ３２に２５３Ｒ１？、６５　４．１？　１．１１　０．３２　０．０９４　０． ０３７に２９４Ｒ９，３９１，５７０，４３０，１４０，０５６八ＤＧ７０Ｓ； Ａ７３Ｓ；Ｇ７ＪＴ　２２．８Ｂ　４．８３　１．２１　０．３１　０．０９３ 　０゜０３２叉立五ｌ の′ｈｒ・　によるグルコースイソメー−ゼの単量体サブユニットの安定性を改 良する突然変異は、実施例２に関しては、グルコースイソメラーゼの四量体の安 定化に影響しないようであるが、この方法でいくつかの突然変異を行なった。 α−へワンリスを安定させ、間接的に単量体を安定化する目的で、グルコースイ ソメラーゼ単量体の８末鎖のβ−バレル（β−ｂａｒｒｅｌ）のへリフリスＢか らの３個の残基を突然変異させた。グリシン７０をセリンに、アラニン７３をセ リンに、グリシン７４をトレオニンに変異した。 ｇｄＤＮＡの構成に、ｐＭｃ５−１のＫｐｎ　Ｉ　−Ａａｔｎ大フラグメントと 以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。 ５　’　−ＧＣＣＴＴＣＴＴＧＡＡＧＧＴＣＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＴＣＧＣ ＧＧ−３’ＥｃｏＡ＊ｉ　（ＤＳＭ）　ＣＩ変異型、Ｇ７０Ｓ：Ａ７３ＳｊＧ７ ４Ｔはよく発現し、この比活性はキシロースを基質として２８ユニツト／■（野 生株の１１５％）であつた（表３）。 この変異体の熱安定性を５０閣Ｍ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′ −２−エタンスルホンＩＩり（ＥＰＰＳ）　、ｐＨ７，５，５ｍＭ　ＭｇＳＯ４ 中、８２〜９２℃の温度範囲で試験した。Ｇ７０Ｓ；Ａ７３ＳＨＧ７４Ｔの半減 期を時間単位で表４に挙げる；この結果は、この温度範囲にわたって、使用され る条件下において、Ｇ７０Ｓ；Ａ７３Ｓ；Ｃ；７４Ｔは野生型酵素より安定で、 さらに変異型Ｋ　２５３　Ｒより安定であることを示している。 亥笠且立 に　る　と・　声のＡ、ミソーリエンシスグルコースイソメー−ゼの　と 大腸菌における＾、１ヱニュ玉ヱ之玉グルコースイソメラーゼの生産に、ｐＭａ 型ベクター上の発現ユニットを専ら使用した。 野生型タンパク質又は望ましい変異型タンパク質をコードしているＡ、ミソーリ エンシスグルコースイソメラーゼ遺伝子を有する、グルコースイソメラーゼ欠損 大腸菌株に５２７の形質転換細胞（皿上ロユ臣己、加」３肛＋　ＥｌＪ、　ｒｍ −１１＋−）を以下の組成を有する培地中で培養した：酵母エキス（２０ｇ／ｘ ）、バタトトリブトン（Ｂａｃｔｏ　ｔｒｙｐｔｏｎｅ）　（４０ｇ　／　ｊ！ 　）　、カザミノＨ（Ｃａｓａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ）　（４ｇ／ｆｆ１）　、 、　ＮａＣ１（１０ＥｌＪ）　、及びアンピシリン（１００■、＃）１６時間３ ７℃、遠心分離した後１．ニーｃｖｍｎを、２０ｍＭ）！Ｊス、１０ｍＭＥＤＴ Ａ、５０ｍＭグルコース、ｐＨ８，０からなる最小容量の緩衝液中で再懸濁した 。リゾチームをその後添加して、最終濃度１゜５ｇ／ｚにした。３７℃で３０分 間インキュベートした後、このサスベンジリンを３０分かけて７０℃まで加熱し た０次にこのサスベンジランを室温まで冷却し、Ｍｇ１Ｊ’ｚとデオキシリボヌ クレアーゼｌを添加して、最終濃度を各々２０　ｍＭ＆　１．５　ｚ／　Ｊにし 、さらに３０分間３７℃でインキュベートした。細胞破片を遠心分離で沈殿させ 、上澄み液を一晩５０ｗＭ）リス（ｐＨ７，５）で透析した。 スｎｕ と′　グルコースイソメー−ゼｍ 酵素溶液は、イオン交換樹脂に固定化できるゆ各々の実験の前に、イオン交換樹 脂を、０．５　ＮａＯＨ溶液（＞１０ベッド体積）、水（ｐＨ＜８まで）、１０ ％Ｎａ０）Ｉ溶ｉ’ｌ！　（＞　１０ベッド体積）、及び水（〉２０ベッド体積 ）で樹脂を処理することにより再生する。レジンズレワチフトＭＰ５００Ａ（バ イヤー）とアンバーライトＩＲＡ９０４（レーン＆ホーズ）をグルコースイソメ ラーゼの固定化のために選択した。これらの陰イオン交換樹脂上への酵素の吸着 は高い効率で起こる。吸着される酵素量と使用カラムの活性の間には直線関係が ある。 Ｌｏｇの陰イオン交換樹脂（Ｃ１−型）を５Ｏｍｌの緩衝液（５０ｍＭ）リス塩 酸、ｐＨ７，５）中に置く、精製したグルコースイソメラーゼを加え、１晩４℃ でＳＯｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）を有する全容量１００ｍ１中で結合 させた。 １旅五ｌ と゛　声グルコースイソメーーゼの 固定化したグルコースイソメラーゼとその変異体の初期活性と安定性をＲ，フォ ンテルベルグに従って、時間の関数として４５％転化におけるポンプ速度（ｐｕ ｍｐ　ｒａｔｅ　＞を測定することにより決定した（論文；工業的でん粉転化技 術における生物的触媒の工学的見地、デルフト大学ペルス１９８３）。これによ りＫｏとＫｄが計算できる。Ｋｏ、擬−次反応速度定数は酵素活性の基準である 。Ｋｄ。 −次崩壊定数は、酵素の安定性の基準である。Ｋｄ計算は、ゼラチン固定化した グルコースイソメラーゼのみに記述してきたが（Ｒ。 フォンテルベルグ、同書）、同じ計算は樹脂固定化したグルコースイソメラーゼ にも用いることができる。実験条件は：温度７０℃；反応器：ダウンフローパフ クトベッド（ｄｏｗｎｆｌｏｗ　ｐａｃｋｅｄｂｅｄ）　；基ｔ：　３Ｍグルコ ース、３　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏａ、３　ｍＭ　Ｎａ＊ＳＯｓ　ｉ転化率：４５％７７ ｍ、クトーｘ　；ｐＨ７，５（３５℃で測定）　；Ｃａ：　＜３ｐｐｍであった 。　Ｋｄの結果は表５に示す。 ｌ−立 なる１　に　れた　と・　グルコースイソメラー野生型　２．７　２．４ Ｋ　２５３　Ｒ１，００，７ Ｋ　２９４　Ｒ２，８２，９ Ｋ　２５３　Ｑ　ｎ、ｄ、　３．７ （Ｇ７０Ｓ；Ａ７３Ｓ；Ｇ７４Ｔ）　２．０　２．１注：野生型も変異型酵素と も生産し、精製し、実施例６及び７の記載に従って固定した。 表５から変異型に２５３ＲとＧ７０Ｓ；Ａ７３Ｓ；Ｇ７４Ｔの両方とも７０℃使 用試験においてかなり改良された安定性ををすると推測できる。これらの結果は 、かなりの正確さをもって、もし試験が工業的に用いられる温度で行なわれるな らば、得られるであろう結果に翻訳することができる（Ｒ，フォンテルベルグ、 同書）。 変異型に２５３Ｑの性能が低いことは、実施例４で記述した跋ｍの実験から既に 推測されているように、２５３部位の塩基性残基の重要性を示している。グルタ ミン変異体はおそらく、水素結合を全く形成せず、これにより二量体−二量体接 触を不安定化させる。 同様に、Ｋ２９４Ｒ変異体は、広肱宣ｎの実験から得られる結果に従えば、野生 型酵素より活性が幾分低い。 上述の結果は、グルコースイソメラーゼの二量体−二量体界面接触を改良すれば 、工業的使用において優れた作用を有する酵素が得られることを示している。界 面接触を有する他の残基もまた、当業者は選択できる。化学修飾に感受性のある 残基又は、最適な水素結合を示さない残基を、本明細書の訓示に従って、他のア ミノ酸に置換することもできる。 変異型、Ｇ７０Ｓ；Ａ７３Ｓ；Ｇ７４Ｔで観察されたＫｄ値によって証明された ように、単量体サブユニットを安定化させる目的の突然変異もまた、驚くべきこ とに、四量体の安定化に正の効果を示す。 これらの結果を合理的に説明する試みにおいて、α−ヘリフクス中のグリシン残 基の置換は、タンパク質の変性状態のエントロピーを減少させ、その結果タンパ ク質は可逆的な変性に対して耐性を増すことを心に留めるべきである（Ｐｒｏｔ ｅｉｎｓ、　１　（１９８６）４３−４６）、そうすると、グルコースイソメラ ーゼの（部分的）変性タンパク質の化学修飾（及びその結果生じる不可逆的変性 ）に対する感受性は、かなり低くなり、その結果酵素の熱安定性は増すであろう 、さらに、変異型Ｇ１０Ｓ；Ａ７３Ｓ：Ｇ７４Ｔに挿入された突然変異はすべて より親水性で、従ってヘリックスＢの露出した表面上に接近しそうである。これ により、単量体の可逆的変性に対する安定性は強化する。以前に述べたように、 これにより、四量体タンパク質の不可逆的変性に対する感受性が低下する。 本実施例で例証された突然変異は、グルコースイソメラーゼの全α−へリックス において同様の方法で起こすことができる。ムｌヱニュ玉ヱ＞Ｘグルコースイソ メラーゼの３Ｄ構造から決定されたヘリックス領域（Ｆ、レイら、、同書、）は 、α１　３５−４７、α２　６４−８０、α３　１０８−１２８、α４　１５０ −１７３、α５　１９５−２０６、α６　２２７−２３９、α７２６４−２７６ 、α８　３００−３２８の部位である。グリシン残基の置換、疎水性残基の導入 及びα−ヘリフクスのアミノ末端のプロリン残基の導入を考案できる。 工学的に作り出された変異型に２５３Ｒと０７０３；Ａ７３Ｓ；Ｇ７４Ｔの両方 とも、野生型グルコースイソメラーゼと比較して熱安定性が改良される。しかし ながら、変異型に２５３Ｒは、実施例４に記述した跋ｍの実験の結果とは逆に使 用試験において、変異型Ｇ７０Ｓ；Ａ７３Ｓ：Ｇ７４Ｔより安定であるようであ る。これは、実験室条件下で得られた結果により、使用条件下における酵素の性 能をある程度予測できるだけであるという事実の反映であるように思われる。多 分、使用条件下で用いられる高いグルコース濃度及びグルコース濃度に依存する グリケーション工程がこの現象に関与する。 叉立五ｌ なるＨでの゛　グルコースイソメー−ゼの変ｇ型に２５３Ｒ及びＷＴ人、ミソー リエンシスグルコースイソメラーゼを使用して異なったｐｎでの比較試験を行っ た。に２５３Ｒ及びＷＴの酵素標本を実施例７に記載の様にレワチフト（Ｌｅｗ ａｔｉｔ）上に固定し、実施例８に記載した様に異性化試験を行、うた０条件と しては、種々のｐＨのグルコースシロップを使用し、Ｒ。フォンテルベルグ（同 書）の記載の通りとした０図１８に両酵素のＫｄ値をｐＨの関数として示す。変 異型に２５３ＲはｐＨ値７．５からＰＨ５，８で改良されたＫｄを示している。 測定は少なくとも２回実施した。前述の様に、変異型に２５３Ｒは高温（高転化 速度）でばかりではなくより低いｐＨ（生産されたフルクトースの安定性が増す ）での工業的使用に優れた作用を示す。 実施■上皇 のバクテ１ア　か゛のグルコースイソメラーゼ゛　云　のクローニングと配　゛ 異なるバクテリアのグルコースイソメラーゼのアミノ酸配列の情報を得るため１ 、グルコ−反イソメラーゼをコードした遺伝子を大腸菌中での分子クローニング によってそれぞれのバクテリアの染色体から単離した。 次のバクテリアを前記の目的のために選択したが、それらのいくつかのものは工 業的に使用されている酵素である。 −アルスロバクタ一種 一ストレブトマイセス　立上ｉ皇土土二／Ｘに　ＬＭＧ７１８３−ストレプトマ イセス　セルモブルガリス　ＤＳＭ４０４４４−ストレプトマイセス　ムリヌス 　０３Ｍ４００９１−１請１≧ＬＬＬ孟種　ＡＴＣＣ３１３５１前述した全ての 種の染色体ＤＮＡをホンプウッド（Ｅｏｐｗｏｏｄ）（同書）に記載の様に単離 及び精製した。 １」り（二と！シム：、５−」辷（ｉ皇オ」ニー竺二及びＩＪ１２し九五立につ いては、制限エンドヌクレアーゼ５ａｕ３ＡＩで部分的に切断し・実施例１のＡ 、ミソー！エンシスにつし１て記載したと同様に大腸菌中で得られたフラグメン トを正確にクローニングした・盈Ｂ及びＳ７セルモブルガｉスの染色体ＤＮＡ４ よ、実施例１に記載した様にＰｓｔｌで完全に切断した後、ｐＥｃＯＲ２５１中 に結合させた。 望まれるグルコースイソメラーゼ遺伝子を含有するコロニーを、Ａ、ミソ−１エ ンシスグルコースイソメラーゼ遺伝子の７１２　ｂｐＭｌｕ　Ｉ制限フラグメン トまたは−≦工ｔ？ｔ−ｔ：ｌｂ−二べニーグルコースイソメラーゼ遺伝子中に 組み込んだ８５３ｂｐＳａｃｌｌ制限フラグメントを使用してコロニーハイブリ ッド法により検出した。 異なったバクテリアのグルコースイソメラーゼ遺伝子を含む再結合プラスミドを さらに、Ａ、ミソ−１エンシスグルコースイソメラーゼ遺伝子について記載した 様に制限地図によって同定した。 タンパク質コード領域のヌクレオチド配列分析をマクサム−ギルバート（同書） が考案した化学的方法を使用して行った。 Ｓ、サルモブルガリスグルコースイソメラーゼ遺伝子を含有するクローンは、不 完全なものであることが判明した。アミノ酸３４６までのコード配列（Ａ、ミソ −１エンシスグルコースイソメラーゼの３５１部位と同等）がそれ故に確立され た。 ヱ互１立ユニ立ｓｐ、グルコースイソメラーゼのアミノ酸配列は、公表されてい る配列とは異なっていた。すなわち公表されていた配列のプロリン１７７はアル ギニンであった。 本実施例の結果を図２１にまとめるが、アミノ酸配列は、確立されたヌクレオチ ド配列から導出されたものであって、相互の頻億性を最大限に示す様に配列した ものである。 叉五■土工 アムプ゛ｉエラＳ、グルコースイソメー−ゼの　と’ｌ然・大腸菌中で”７罠、 ７’−’　：Ｌ−ｓｐ、グルコースイソメラーゼを発現するために、Ａ、ミソ− １エンシスグルコースイソメラーゼに対してすでに入手されている有効な発現単 位を使用した。実際にはＡ、ミソーリエンシス発現ベクターは、全ヌクレオチド とこれにより生じる２つの遺伝子のコード領域のアミノ酸配列の違いを保存して いる、アムブラリエラ種グルコースイソメラーゼ遺伝子の制限フラグメントを用 いて、然変異させたＨｐＭａ−１の一本鎖ＤＮＡ及びｐＭｃ−１の４１０７　ｂ ｐ　ＢｓｔＥ　Ｉ　Ｉ／Ｎｃｏｌフラグメント、１２４　ｂｐ　ＢｓｔＥＩＩ／ ＡｐａＬ　１フラグメント、及び１０５９ｂｐ　ＡｐａＬ　Ｉ／Ｂｓ５Ｈ１１フ ラグメントからなる切断された二重分子が形成され、このうち後者２つのフラグ メントはアムプラリ旦種グルコースイソメラーゼ遺伝子から得られたものである 。 前述の方法を望ましくない変化を検査するためにヌクレオチド配列の決定を更新 しながら実施例１の記載のように継続した。前述の様にして、正しいプラスミド が見出され、これをｐＭｃ−Ｃｌａｍｐｌと命名した。 アミノ酸配列の比較によって、二ム１立ユニ立グルコースイソメラーゼはＡ、ミ ソ−１エンシスグルコースイソメラーゼと同様に等傷部位２５３にリジン残基を 含有していることが示された。 したがってヱムフ立ユニ立種の変異型グルコースイソメラーゼの部位２５３のリ ジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）で置換したものが、一本［ｐＭｃ−Ｇ１ａ＋＊ｐ ｌ　ＤＮＡをＢａｍＨＩ　／　Ｈｉｎｄ　ｍ切断されたｐＭａ　−Ｇ　Ｉ　ａｍ ｐ　１及びリン酸化した突然変異誘発性オリゴヌクレオチドでアニールすること で形成される切断された二重分子を用いて製造した。 ５　’　−ＡＧＧＴＣＣＴＧＧＴＣＧＡＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧ− ３’アニーリングの次の処置、すなわち得られた変異体の選択及び分析を実施例 １に記載したと同様にして行なった。 スｌ医上主 ストレプトマイセス　ムｉヌスグルコースイソメー−ゼのと　の′然　・ ストレプトマイセス　ｇグルコースイソメラーゼ遺伝子の発現を、前記の遺伝子 をプラスミドｐＭａＴ５のＴｉｅプロモーターの下流に置くことで行なった。ｐ ＭａＴ５はプラスミドｐＭａ５Ｐｍから誘導されるが、前記のラムダＰａプロモ ーターが調整可能なＴａｃプロモーターで置換される。（Ｈ，デボーア、Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、６０　（１９８３）　 ２１）本発現ベクターの構造を図１５２／Ｃに示す、完全なストレプトマイセス 　ムリヌスグルコースイソメラーゼ遺伝子を含有する１２８０ｂｐ　ＢｓｔＸ　 Ｉ／Ｍｌｕｌ制限フラグメントをＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウフラグメント ）で処理し、フラグメントの末端をブランドエンドに変換し、続いてｐＵｃ１９ に結合した０次いで前記の遺伝子をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄｌｌ＋を使用して再 び切断し、Ｂａ＊Ｈ１／Ｈ３ｎｄｎｌ切断したｐＭｃ５Ｔに挿入した。得られた プラスミドをｐＭｃ　−Ｇ　Ｉ　ｓ−ｕ　１と命名した。前記のヌクレオチド及 びストレプトマイセス　ムリヌスグルコースイソメラーゼのアミノ酸配列及び発 現ユニットの構造を図１９及び２０にそれぞれ示す。 また、呈、止ユＸＸグルコースイソメラーゼはりジン残基をタンパク質配列の部 位２５３に有しており、これは人、ｌヱニュエヱ之五〇に２５３と等価である。 ストレプトマイセス　ｌ入グルコースイソメラーゼ中のりジン２５３（Ｋ）をア ルギニン（Ｒ）に置換することで得られる突然変異を、−重鎖ｐＭｃ−ＧＩｓｍ ｕｌＤＮＡ％　ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ　ｍ切断したｐＭａ５Ｔ、及びリン酸化変 異誘発性オリゴヌクレオチド５　’　−ＣＧＴＣＣＴＧＧＴＣＧＴＡＣＣＧＧ＾ ↑ＧＣＣＧＧＡＣＴＧＧ−３’からなる切断された２重分子を使用して導入した 。アニール工程の次の処置、すなわち得られた変異体の選択と分析を実施例１に 記載と同様に行なった。 本発明は前述に示唆及び例示した突然変異に制限されるものではない。 これまで記載した本発明は理解を明瞭にする目的のため、例示及び実施例として 詳細に記載したものであって、多少の変更及び修正は添付する請求の範囲の含ま れるものである。 浄ｌＦ（内容ｊこ変更なし） 時間（分） 浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇｕｒｅ　２ ５０ｍＭ　ＭＯＰＳ、２５℃で　ｐＨ７，２、＋１０ｍ）ｌ　５１ｇ　におけλ ＥｅｏＡｍｉ（ＤＳＭ）　ＧＩ　の熱失活速度論時間（分） 浄書（１５；ン二こｊにになし） ｐｉｇｕｒａコ ５０ｍＭ　ＭＯＰＳ、２５°Ｃで　ｐＨ７，２、＋１０ｍＭ　Ｃｏ　におけるＥ ｃｏＡｍｉ（ＤＳＭ）　ＧＩの熱失活速度論□−一■ 時間（分） 浄書（丙ｇ；こ変更なＬ′ Ｆｉｇｕｒｅ　４ １次失活速度定数 醇 浄−ｆｔ、；′：に：こ、五史’−；ｔ＝）Ｆｉｇｕｒｅ　５ ７２℃、金属添加無におけるＥｃｏＡｍｉ（ＤＳＭ）グルコースーイソメラーゼ Ｏ熱失活のｐＨ依存性 Ｐｉ　留　活　性　（χ） ＃雷（古ギｉ；こニクミなしン Ｆｉｇｘπ＠７ 残　留　活　性　［Ｘ） 浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇｕｒａ　８ 吸　光　度　（Ａ２Ｂ０） Ｆｉｇｕｒｅ　９Ａ Ｔ 浄書（内容に変更なし） Ｆｉｇｕｒｅ　１０Ａ ａＣＮＯ 浄書（内容に変更・シし） Ｆｉｇｕｒｅ　ＩＯＢ 辻　￥モモモモ　４ ２１　゛　・φ　峨−―、− 浄！（内容に変更なし） ＦｉｇＬｌｒ＠ｉｌ ＯＳｏ　２０　３０　４０　５０　６０　７０呻　関　（時間） 浄Ｗ（内容に変更なし） Ｆｉｇｕｒｅ　１２ ０Ｘ’Ｒ異１ｌＫ２５３Ｑの熱失活速度論時　間　（分） 浄書（Ｆ″イＳユニ２）Σζ≧・しン Ｆｉｇｕｒａ　ｌコＡ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−１２の５ＥＣ−ＨＰＬＣ浄書（Ｆミ昼−こ変ｊミなし） Ｆｉｇｕｒｅ　ｌコＢ Ｇに量体（イ） 浄督（Ｆ′５台、こ哀史なし） Ｆｉｇｕｒｅ　１４ 残　留　活　性　（Ｘｌ Ｆｉｇｕｒａ　１５Ａ Ｆｉｇｕｒｅ　１５Ａ　（ｃｏｎｔｉｎｕａｄ、　１）Ｆｉｇｕｒａ　１５人　 （ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ、２）Ｆｉｇｕｒｅ　１５人　（ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ、３ ）αχ江σひＡＣ）込０χコマ込α　０フｆｌス　Ｃ３３１０３３２０３３３０ ３：１４０　３３５０　３：３６０Ｆｉｇｕｒｅ　１５Ｂ １ｏ　２０　３０　４０　５０　６０ Ｃ’１ＭＴｌ丁ＳＡ！ ７０　８０　９０　１００　１１０　１、！０Ｏａａズフｄ込入 Ｔ〕ズχマユ℃Ｃ Ｆｉｇｕｒｅ　１５Ｃ ＱνｎｃＡｃＡＧＧＡＡＡｏ０３℃ｍ Ｆｉｇｕｒｅ工６ 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Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．変異型のグルコースイソメラーゼ酵素であって、野生型のグルコースイソメ ラーゼ酵素と少なくとも１アミノ酸が異なるアミノ酸配列を有するグルコースイ ソメラーゼ酵素をコードした遺伝子を発現することによって得られ、かつ、使用 条件下で改良された性能を示すことを特徴とする変異型のグルコースイソメラー ゼ酵素。
2. ２．自然に存在しているグルコースイソメラーゼ又は同じ本質的な生物学的活性 を有するその変異型と以下の点で区別できること、すなわち、自然に存在してい るグルコースイソメラーゼが有する生物学的性質を実質的に変えることなく、自 然に存在するグルコースイソメラーゼの、又はその変異型の場合にはリジン残基 のアルギニン残基への置換又は逆にアルギニン残基のリジン残基への置換を可能 にするようなサイトにおいて、少なくとも１個のアミノ酸残基（置換アミノ酸残 基）が、自然に存在するグルコースイソメラーゼ又はその変異型におけるリジン の代わりにアルギニン、又は自然に存在するグルコースイソメラーゼ又はその変 異型におけるアルギニンの代わりにリジンであるという点で区別できることを特 徴とす、請求の範囲１に記載の変異型グルコースイソメラーゼ酵素。
3. ３．（１）少なくとも２個のドメインを有する単量体酵素又は、その一部又は全 部が任意にドメインを含むサブユニットを少なくとも２個有するオリゴマー酵素 であり、（２）前記ドメイン又は、適当な場合には、サブユニットが溶媒の接近 性が低いサイトを有し、 （３）前記サイトのいくつかが、他のサイトの他のアミノ酸残基と静電気的な相 互作用を有するアミノ酸残基を有し、前記置換アミノ酸残基を含有する前記サイ トが、溶媒の接近性が近い前記サイトの１つと一致することを特徴とする、請求 の範囲１又は２に記載に変異型のグルコースイソメラーゼ酵素。
4. ４．アクチノプラネスミソーリエンシスに由来する請求の範囲１から３のうち１ つに記載の変異型のグルコースイソメラーゼ酵素。
5. ５．前記グルコースイソメラーゼのアミノ酸配列が、野生型のアクチノプラスミ ソーリエンシス株由来のグルコースイソメラーゼのアミノ酸配列と少なくとも６ ５％の類似性を示す、請求の範囲１から４のうちの１つに記載の変異型のグルコ ースイソメラーゼ酵素。
6. ６．Ｌｙｓ２５３がＡｒｇ２５３で、及び／又はＧｌｙ７０がＳｅｒで、及び／ 又はＡｌａ７３がＳｅｒで、及び／又はＧｌｙ７４がＴｈｒで置換した、アクチ ノプラネス　ミソーリエンシス由来の、請求の範囲１から５のうちの１つに記載 の変異型のグルコースイソメラーゼ酵素。
7. ７．少なくともＬｙｓ２５３がＡｒｇ２５３で置換した、請求の範囲６に記載の 変異型のグルコースイソメラーゼ酵素。
8. ８．少なくともＧｌｙ７０、Ａｌａ７３及びＧｌｙ７４が各々Ｓｅｒ、Ｓｅｒ及 びＴｈｒで置換した、請求の範囲６に記載の変異型のグルコースイソメラーゼ酵 素。
9. ９．対応する野生型の酵素と比較して、標準的使用条件下において、改良された 熱安定性を示す、請求の範囲１から８のうち１つに記載されている変異型のグル コースイソメラーゼ酵素。
10. １０．対応する野生型の酵素と比較して、様々のｐＨ値で改良された安定性を示 す、請求の範囲１から９のうちの１つに記載の変異型のグルコースイソメラーゼ 酵素。
11. １１．請求の範囲１から１０のうち１つに記載の変異型グルコースイソメラーゼ 酵素を有する固定化されたグルコースイソメラーゼ酵素。
12. １２．フルクトースシロップの生産において、請求の範囲１から１１のうち１つ に記載の変異型のグルコースイソメラーゼを使用すること。
13. １３．出発グルコースイソメラーゼと比較して、安定性についての付随する変異 の効果と本質的に同じ種類の生物学的活性を有する、出発グルコースイソメラー ゼ由来の変異型のグルコースイソメラーゼ酵素の生産方法であって、出発グルコ ースイソメラーゼが、出発グルコースイソメラーゼの生物学的活性を実質的に変 化させることなく、リジン残基のアルギニンヘの置換又はその逆を立体的に可能 とするサイトに位置するリジン残基又はアルギニン残基を初期に有するものから 選ばれ；前記初期リジンをアルギニン残基に又は逆に前記初期アルギニン残基を リジン残基に置換することを含む方法。