FI102541B - Uudet glukoosi-isomeraasientsyymit ja niiden käyttö - Google Patents

Description

102541

Uudet glukoosi-isomeraasientsyymit ja niiden käyttö Nya glukosisomerasenzymer och deras användning Tämä keksintö koskee uusia glukoosi-isomeraaseja, jotka ovat sopivia käytettäväksi teollisissa menetelmissä, erityisesti muutettaessa glukoosia fruktoosiksi. Keksintö koskee myös näiden uusien entsyymien käyttöä fruktoosisii-rappien, erityisesti runsaasti fruktoosia sisältävien maissisiirappien, valmistuksessa.

Glukoosi-isomeraasi katalysoi glukoosin reversiibelin iso-meroitumisen fruktoosiksi. Fruktoosi on nykyään yleisesti käytetty sokerisubstituutti johtuen sen suuremmasta makeudesta esim. sakkaroosiin ja glukoosiin verrattuna. Monien mikro-organismien tiedetään tuottavan glukoosi-isomeraa-sia, katso esimerkiksi Wen-Pin Chen esittämiä katsausartikkeleja julkaisuissa Process Biochemistry, 15, kesäkuu/ heinäkuu (1980) 30-41 ja elokuu/syyskuu (1980) 36-41, joissa on esitetty luettelo suuresta joukosta mikro-organismeja, jotka pystyvät tuottamaan glukoosi-isomeraasia.

Useita mikro-organismeja on käytetty hyväksi teollisesti. Wen-Pin-Chenin esittämässä viitteessä kuvataan mikro-organismien kasvatusolosuhteet ja tuotetun glukoosi-isomeraa-sin talteenotto- ja puhdistusmenetelmät.

Glukoosi-isomeraasin, joka on solunsisäinen entsyymi, tuottaminen on suhteellisen kallista. On kehitelty erityisiä koostumuksia entsyymin toistuvan ja jatkuvan käytön mahdollistamiseksi. Immobilisoimalla entsyymi, tavallisesti veteen liukenemattomaan muotoon, sitä voidaan käyttää .. sekä panosmenetelmissä että jatkuvissa menetelmissä (esim.

pakatut kerrosreaktorit, Packed-bed reactors). Glukoosi-isomeraasin immobilisoinnin eräänä suurimpana haittana on spesifisen aktiivisuuden olennainen aleneminen, johtuen inertin materiaalin käytöstä. Tilanne jopa pahenee käytön 2 102541 aikana, koska glukoosi-isomeraasi inaktivoituu korotetuissa lämpötiloissa. Lämmön indusoiman huononemisen tuloksena on aktiivisuuden irreversiibeli häviö.

Entsyymistabiliteetin säilyttämisyrityksistä huolimatta aktiivisuuden häviötä yhä esiintyy normaaleissa käyttöolosuhteissa. Tästä syystä on jatkuvasti tarvetta uusista, parannetut ominaisuudet omaavista entsyymeistä, kuten glukoosi-isomeraasista. Glukoosi-isomeraasin parannettu lämpöstabiliteetti esimerkiksi tekee mahdolliseksi käyttää hyväksi sitä seikkaa, että isomeroitumisen tasapaino siirtyy fruktoosiin päin korkeammissa lämpötiloissa. Useimpia glukoosi-isomeraaseja käytetään pH-arvossa 7,5. Tässä pH-arvossa fruktoosi ei kuitenkaan ole pysyvä. Tästä johtuen tarvitaan myös glukoosi-isomeraaseja, joita voidaan käyttää pH:ssa, joka on alle 7,5.

Parannetut ominaisuudet omaavat entsyymit voidaan kehittää tai löytää useilla tavoilla, esimerkiksi klassisilla seulontamenetelmillä, olemassa olevien proteiinien kemiallisella modifikaatiolla tai käyttämällä modernia geeni- ja proteiinitekniikkaa.

Organismien tai mikro-organismien, joilla on haluttu ent-symaattinen aktiivisuus, seulonta voidaan tehdä esimerkiksi eristämällä ja puhdistamalla entsyymi mikro-organismista tai tällaisten mikro-organismien kasvatussupernatantis-ta, määrittämällä sen biokemialliset ominaisuudet ja tarkistamalla vastaavatko nämä biokemialliset ominaisuudet käyttövaatimuksia.

Ellei indentifioitua entsyymiä voida saada sen luonnollisesta, tuottavasta organismista, voidaan käyttää yhdistel-mä-DNA-tekniikkaa entsyymiä koodittavan geenin eristämiseksi, geeni ilmennetään toisessa organismissa, ilmennetty 3 102541 entsyymi eristetään ja puhdistetaan ja testataan, onko se sopiva aiottuun käyttötarkoitukseen.

Olemassa olevien entsyymien modifikaatio voidaan aikaansaada mm. kemiallisilla modifikaatiomenetelmillä. Katso esimerkiksi I.Svendsen, Carlsberg Res.Commun. 4Λ (1976), 237-291. Yleensä nämä menetelmät ovat liian epäspesifisiä, koska ne modifioivat kaikki helposti lähestyttävät tähteet, joilla on tavallinen sivuketju, tai ne ovat riippuvaisia modifioitaviksi sopivien aminohappojen läsnäolosta ja usein ne ovat kykenemättömiä modifioimaan vaikeasti saavutettavia aminohappoja ellei entsyymimolekyyli ole laskostumaton.

Entsyymimodifikaatiota, joka suoritetaan mutagenoimalla koodittava geeni, eivät edellä mainitut epäspesifisyydet haittaa ja tästä johtuen sen on arveltu olevan paras. Mu-tagenointi voidaan tehdä joko satunnaisilla mutagenoin-neilla tai paikkaan kohdistetuilla mutagenoinneilla.

Satunnaiset mutagenoinnit, joissa koko mikro-organismit käsitellään kemiallisilla mutageeneilla tai mutagenoivalla säteilytyksellä, voivat tietysti johtaa modifioituihin entsyymehin, mutta sen jälkeen tarvitaan voimakkaat valin-tamenetelmät halutut ominaisuudet omaavien mutanttien etsimiseksi. Suurempi mahdollisuus haluttujen mutanttient-syymien eristämiseksi satunnaisilla mutagenoinneilla voidaan aikaansaada kloonaamalla koodittava geeni, mutagenoimalla se in vitro tai in vivo ja ilmentämällä kooditettu entsyymi siten, että mutatoitu geeni kloonataan uudestaan sopivassa isäntäsolussa. Myös tässä tapauksessa täytyy olla käytettävissä sopivat, biologiset valintamenetelmät haluttujen mutanttientsyymien valitsemiseksi. Nämä biologiset valintamenetelmät eivät spesifisesti valitse entsyymejä, jotka ovat sopivia käytettäväksi fruktoosin tuotannossa .

4 102541

Paikkaan kohdistettu mutagenointi (side-directed mutagenesis = SOM) on kaikkein spesifin keino modifoitujen entsyymien saamiseksi, sen tehdessä mahdolliseksi yhden tai useamman aminohapon spesifisen korvaamisen millä tahansa, toisella, halutulla aminohapolla.

Tämän keksinnön eräänä kohteena on uudet mutanttiglukoosi-isomeraasit, jotka saadaan ilmentämällä geenit, jotka koo-dittavat mainittuja entsyymejä, joissa aminohapposekvenssit eroavat ainakin yhden aminohapon suhteen vastaavista villityyppisistä glukoosi-isomeraaseista ja joilla on parannetut ominaisuudet.

Keksinnön toisena kohteena on menetelmä tällaisten uusien mutanttiglukoosi-isomeraasien valmistamiseksi, joka menetelmä perustuu vastaavien, villityypisten entsyymien molekyylien välisten ja molekyylin sisäisten vuorovaikutusten modifikaatioihin.

vielä keksinnön eräänä toisena kohteena on menetelmä, jolla parannetut ominaisuudet omaavat mutanttientsyymit valitaan teollisen käytön kuluessa.

Lyhyt kuvaus piirustuksista:

Kuvio 1. EcoAmi(DSM)-GI:n metallivapaan glukoosi-isome-raasin lämpöinaktivoitumiskinetiikka 50 mMrssa MOPS:ää, pH

7.2 25 °C:ssa. Ei lisätty metallia.

Kuvio 2. Sama kuin kuvio 1. Lisätty 10 mM Mg2+:aa.

Kuvio 3. Sama kuin kuvio 1. Lisätty 10 mM Co2+:aa.

Kuvio 4. Lämpötilan riippuvuuden Arrhenius-käyrä EcoAmi (DSM)-GI:n lämpöinaktivoitumiselle 50 mM:ssa MOPS:ää, pH

7.2 25 eC:ssa.

5 102541

Kuvio 5. Metallivapaan EcoAmi(DSM)-GI:n lämpö inak ti voi-tumisen pH-riippuvuus 72 *C:ssa lisätyn metallin puuttuessa. CHES = 2-(sykloheksyyliamino)etaanisulfonihappo.

Kuvio 6. Ionivahvuuden vaikutus metallivapaan EcoAmi(DSM)-GI:n lämpöinaktivoitumisen kinetiikkaan 50 mM:ssa MOPS:ää, pH 6,7 72 °C:ssa. Ei lisätty metallia.

Kuvio 7. Ionivahvuuden vaikutus metallivapaan EcoAMI(DSM)-GI:n lämpöinaktivoitumisen kinetiikkaan 50 mM:ssa MOPS:ää, pH 7,6 72 eC:ssa. Ei lisätty metallia.

Kuvio 8. EcoAmi(DSM)-GI:n SEC-HPLC EcoAmi(DSM)-GI:n pit kitetyn inkuboinnin jälkeen 7 M:ssa ureaa 25 °C:ssa.

Kuvio 9A. Etukäteen syanaatilla käsitellyn EcoAmi(DSM)-GI:n SEC-HPLC 25 °C:ssa ilman ureaa. Eluointipuskurissa oli 50 mM Tris/HCl:ää, pH 8,0, 150 mM NaClrää, 0,02 %:

NaN3:a.

Kuvio 9B. Syanaatilla käsitellyn EcoAmi(DSM)-GI:n natiivi PAGE 25 *C:ssa ilman ureaa.

Kuvio 10A. Etukäteen syanaatilla käsitellyn EcoAmi(DSM)- • · GI:n SEC-HPLC 5 M:n ureaa läsnäollessa 25 eC:ssa.

Kuvio 10B. Syanaatilla käsitellyn EcoAmi(DSM)-GI:n natiivi PAGE 5 M:n ureaa läsnäollessa 25 eC:ssa.

. Kuvio 11. EcoAmi(DSM)-GI:n glykosylaatio 50 mMrssa MOPS:ää, pH 7,7 60 °C:ssa.

Avoimet ympyrät: ei lisätty glukoosia; mustatut ympyrät: lisätty glukoosia 250 mM; kolmiot: glukoosin (250 mM) kanssa suoritettua inkubointia seurasi laaja dialyysi re-versibiliteetin testaamiseksi.

β 102541 6

Kuvio 12. EcoAmi(DSM)-GI-mutantin K253Q lämpöinaktivoitu-miskinetiikka.

Kuvio 13. Tetrameeri-dimeeri-dissosiaation kinetiikka 25 °C: ssa EcoAmi(DSM)-GI-mutantilia K253R 5 M:ssa ureaa.

Kuvio 14. EcoAmi(DSM)-GI-mutantin K253R glykosylaatio-indusoidun inaktivoitumisen kinetiikka 60 °C:ssa 12,5 mMtssa kaliumfosfaattia, pH 7,7.

Kuvio 15A. pMA/c5-8:n rakenne.

pMa-tyyppisessä vektorissa nukleotidi 3409 on muutettu A:sta G:ksi, kun taas pMc-tyyppisessä vektorissa nukleotidi 2238 on muutettu G:stä C:ksi, luomalla amber-lopetusko-doneja kloramfenikoliasetyyli-transferaasigeenissä ja vastaavasti β-laktamaasigeenissä, tehden mainitut geenit inaktiivisiksi (P.Stanssens et ai. (1987), "Oligonucleotide-directed construction of mutations by the gapped duplex DNA method using the pMA/c plasmid vectors", käsikirja, jota käytettiin EMBO-laboratoriokurssilla "Directed Mutagenesis and Protein Engineering", joka pidettiin 4-18. heinäkuuta 1987 , kurssipaikkana oli Max Planck Insitut fiir Biochemie, Martinsried. Kuviossa esitetty sekvenssi on pMa5-8:n sekvenssi.

* · ·

Kuvio 15B. Lambda PR-promoottorisekvenssi, joka esiintyy ilmentymisvektorissa pMa/c5PR (korvaa pMa/c5-8:n nukleotidit 3754-3769).

Kuvio 15C. Tac-promoottorisekvenssi, joka esiintyy ilmen-tymisvektorissa pMa/c5T (korvaa pMa/c5-8:n nukleotidit 3754-3769).

Kuvio 16. Villityyppisen Actionoplanes missouriensis-qlu-koosi-isomeraasin täydellinen geenisekvenssi ja siitä päätelty aminohapposekvenssi.

7 102541

Kuvio 17. Glukoosi-isomeraasi(GI)-ilmentymisyksikön fysikaalinen kartta pMa/c-I:ssä. Asiaankuuluvien restriktio-kohtien, PR-promoottorin ja proteiinia koodittavan alueen kohdat merkitty. Tähdet osoittavat paikkaan kohdistetuilla mutagenoinneilla aikaansaatuja restriktiokohtia.

Kuvio 18. Glukoosi-isomeraasimutantin ominaisuudet eri pH-arvoissa.

AmiVT: villityyppinen A.missouriensis-qlukoosi-isome- raasi valmistettiin plasmidista pMa-I.

AmiK253R: mutantti K253R-glukoosi-isomeraasi valmistettiin mutatoidusta plasmidista pMa-I.k253R.

Erilliset k^-mittaukset AmiVT:lle ([]) ja AmiK253R:lle (o) on merkitty. Voidaan todeta, että AmiK253R:llä on parantunut k^-arvo laajalla pH-alueella.

Kuvio 19: villityyppisen Streptomyces murinus-glukoosi-iso-meraasin täydellinen geenisekvenssi ja siitä päätelty aminohapposekvenssi.

Kuvio 20. Glukoosi-isomeraasi(GI)-ilmentymisyksikön fysikaalinen kartta pMa/c-GIsmul:11a. Asiaankuuluvien restrik-tiokohtien, Tac-promoottorin ja proteiinia koodittavan alueen kohdat on merkitty.

Kuvio 21. Eri lähteistä peräisin olevien glukoosi-isome-raasien aminohapposekvenssien ryhmittely. Actinoplanes missouriensis-qlukoosi-isomeraasin täydellinen sekvenssi on esitetty kun taas muista lähteistä saaduille glukoosi-isomeraaseille on esitetty ainoastaan ne aminohappotäh-·· teet, jotka eroavat Actinoplanes missouriensis-qlukoosi- isomeraasista. Ampullariella-qlukoosi-isomeraasin aminohapposekvenssi eroaa julkaistusta sekvenssistä (Saari, J. Bacteriol., 169 (1987) 612) yhdellä tähteellä: julkaistun sekvenssin proliinin 177 todettiin olevan arginiini.

8 102541

Streptomyces thermovulgaris-sekvenssi on rakennettu ainoastaan aminohappoon 346 asti, määrittelemättömät tähteet on esitetty mustalla neliöllä (a).

Viiva (-) osoittaa aminohappotähteen puuttumista tässä asemassa verrattuna mihin tahansa toiseen sekvenssiin. Erilaiset lajit on esitetty seuraavilla symboleilla:

Ami: Actinoplanes missouriensis DSM 4643

Amp: Ampullariella-lajit ATCC 31351

Art: Arthrobacter-lajit

Smu: Streptomyces murinus DSM 40091

Svn: Streptomyces violaceoniqer CBS 409.93

Svr: Streptomyces vlolaceoruber LMG 7183

Sth: Streptomyces thermovulqaris DSM 40444 Tämän keksinnön mukaisesti mutanttiglukoosi-isomeraasient-syymit voidaan suunnitella villityyppisten glukoosi-isome-raasien rakenteen huolellisen tutkimisen perusteella, johon yhdistyy huolellinen biologinen tarkastelu prosessista, joka johtaa alkuperäisten glukoosi-isomeraasien inak-tivoitumiseen käyttöolosuhteissa, jonka jälkeen suoritetaan villityyppisen geenisekvenssin rationaalinen modifikaatio. Suunniteltujen mutanttien laaja tutkiminen teollisissa käyttöolosuhteissa on johtanut parannetut ominaisuu- • « * det omaavien mutanttien identifioimiseen.

Käytettäessä tässä sanontaa "parannetut ominaisuudet", esiintyvien glukoosi-isomeraasientsyymien yhteydessä, tarkoitetaan suurempaa konversiotehoa ja/tai parannettua stabiliteettia, erityisesti lämpöstabiliteettia suhteessa vastaaviin, villityyppisiin entsyymeihin. Lisäksi eri pH-arvoissa lisääntyneen stabiliteetin sellaisenaan tai yhdistyneenä lisääntyneeseen lämpöstabiliteettiin katsotaan kuuluvan käsitteen "parannetut ominaisuudet" piiriin.

9 102541 Tämä keksintö perustuu havaintoon, että tiettyjen entsyymien aktiivisuus on optimaalinen, kun entsyymi on multi-meerisessä (dimeerisessä, trimeerisessä, tetrameerisessä, jne.) muodossa ja että mainittu aktiivisuus voi alentua johtuen alayksiköiden välisen vuorovaikutuksen vähenemisestä. Esimerkiksi on todettu, että Actinoplanes missouriensis-qlukoosi-isomeraasin entsymaattinen aktiivisuus on ainutlaatuinen tetrameerisessä rakenteessa. Tämä aktiivisuus on olennaisesti hävinnyt sen jälkeen, kun na-tiivi, tetrameerinen rakenne on dissosioitunut dimeereik-si.

Tästä syystä tämä keksintö koskee uusia mutanttiglukoosi-isomeraaseja, joissa vuorovaikutus alayksiköiden (monomee-rien, dimeerien, jne.) välillä on kasvanut, josta on seurauksena entsyymien parannetut ominaisuudet, erityisesti käyttöolosuhteissa. Keksintö koskee myös menetelmiä vuorovaikutusten lisäämiseksi glukoosi-isomeraasin alayksiköiden välillä.

Edullisen suoritusmuodon mukaan glukoosi-isomeraasin tet-rameerisen rakenteen stabilointi aikaansaadaan lujittamalla vuorovaikutusta dimeerien välillä tetrameerissä.

• ·

Sopiva menetelmä tetrameerisen rakenteen stabiliteetin parantamiseksi on esimerkiksi ionisiltojen liittäminen. On hyvin tunnettua, että elektrostaattiset vaikutukset näyttelevät perustavaa laatua olevaa osaa entsyymitoiminnassa ja rakenteessa (katso J.A.Matthew et ai., CRC Critical Reviews in Biochemistry, 1(5 (1985) 91-197 ). Ne vastaavat esimerkiksi entsyymikatalyysin pH-riippuvuudesta, koska aktiivikohtaa ympäröivät, ionisoituvat ryhmät määrittelevät optimi-pH:n annetulle proteiinille. Elektrostaattisiin vuorovaikutuksiin osallistuvat vetysidokset ja ioni(suola) sillat ovat tärkeitä koko proteiinirakenteen stabiloin- 10 102541 nissa (katso A.J. Russell ja A.R.Fersht, Nature 36 (1987) 496-500). Olettamuksen mukaan, että glukoosi-isomeraasi-tetrameerin dissosiaatio dimeereiksi on pääasiallisesti syynä entsyymin denaturoitumiseen, tämä prosessi voidaan estää liittämällä rajapintoihin lisää stabiloivia vuorovaikutuksia, kuten täydentäviä suolasiltoja.

Yhtenä mahdollisuutena uusien suolasiltojen liittämiseksi annettuun proteiiniin on korvata kaksi vierekkäistä tähdettä vastakkaisen varauksen omaavilla aminohapoilla, esimerkiksi Asp ja Arg, jonka jälkeen tarkiste taan, esimerkiksi energiakarttalaskelmilla, että ionivuo-rovaikutus voi muodostua. Tämä, uuden suolasillan liittäminen vaatii kaksi pistemutaatiota. Vaihtoehtoisesti suo-lasilta voidaan muodostaa korvaamalla tähde, joka on lähellä eristettyä, varautunutta aminohappoa, jolloin muodostuu ionipari yhdellä ainoalla pistemutaatiolla.

Toinen sopiva menetelmä tetrameerisen rakenteen stabiliteetin parantamiseksi on liittää disulfidisiltoja. Disul-fidisidokset ovat useiden solun ulkopuolisten proteiinien yhteinen ominaisuus. Näiden ristiinkytkijöiden osa on ensi sijassa stabiloida proteiineja, tämän vaikutuksen ollessa yksi parhaiten tunnettuja. Sen selitetään yleisesti johtu- • van laskostumattoman tilan entropian vähenemisestä, mutta tällainen yksinkertainen selitys jättää useat seikat vaille selitystä. T.E.Creighton, Bioassays 8.(1988) 57-63, osoittaa, että natiiviin tilaan aiheutettu perturbaatio (häiriötila) täytyy myös ottaa huomioon.

» '

Monia yrityksiä on tehty ja kirjallisuudessa raportoitu disulfidisiltojen rakentamiseksi vaihtelevalla menestyksellä. Pantoliano et ai., Biochemistry 26 (1987) 2077-2082, ovat liittäneet kaksi kysteiinitähdettä subti-lisiinin geenin pistemutaatioilla, saaden 3 eC:n nousun 11 102541 sulamislämpötilaan. J.E.villafranca et ai., Biochemistry 26 (1987) 2182-2189, ovat liittäneet pistemutaatiolla kys-teiinitähteen dihydrofolaattireduktaasiin ja hyödyntäneet vapaan kysteiinin villityyppisessä entsyymissä disulfidi-sillan muodostamiseksi. Tällä disulfidisidoksella on kuitenkin odottamaton vaikutus, koska mutanttientsyymillä ei ole lisääntynyttä resistenssiä lämpödenaturoitumiseen nähden, mutta sillä on enemmän resistenssiä guanidiinihydro-klorididenaturoitumisessa. Näissä kahdessa tapauksessa mu-tatoidut entsyymit eivät ole niin pysyviä kuin odotettiin.

Nämä kaksi yleistä keinoa ovat sopivia joko kaksois- tai yksinkertaisen pistemutaation suorittamiseksi, kuten edellä kuvattiin. Multimeerisille proteiineille (entsyymeille), jotka muodostuvat monomeerisistä yksiköistä, joita yhdistää symmetria-akseli, voi olla olemassa kolmas mahdollisuus: muodostetaan disulfidisilta yhdellä ainoalla pistemutaatiolla ilman, että vaatimuksena on vapaa Cys. Tätä menetelmää käytti menestyksellisesti Sauer et ai., Biochemistry 25 (1986) 5992-5998, lambda-repressorissa, he saivat 10 eC:n lisäyksen sulamislämpötilaan, 60 %:n lisäyksen resistenssiin ureadenaturoitumiselle ja lisäksi sidosvakio parani.

« 9

Viimeksi mainitussa menetelmässä esivaatimuksena on symmetria-akselin esiintyminen ainakin kahden monomeerin välillä. Symmetria-akselin ollessa myös rotaatioakseli, näiden akselien yhtenä ominaisuutena on, että etäisyys yhden pisteen ja akselin välillä rotaatioiden aikana säilyy.

Näin pistemutaatio, joka tuodaan lähelle multimeerisen ra- *’ kenteen symmetria-akselia, tulee läheisesti toistamaan tätä kohtaa. Tämän menetelmän tarjoama etu on mahdollisuus liittää disulfidisilta monomeerien välille yhdellä ainoalla pistemutaatiolla.

12 102541

Keksinnön toisen, edullisen suoritusmuodon mukaan glukoo-si-isomeraasin tetrameerisen rakenteen lisääntynyt stabiliteetti saavutetaan stabiloimalla dimeerinen rakenne.

Tämä voidaan kuvitella, koska entsyymin denaturoituminen on ainakin osaksi tetrameerin reversiibeli reaktio dimee-reiksi ja kummankin dimeerin myöhemmin tapahtuva dissosi-oituminen kahdeksi monomeeriksi. Stabiloimalla dimeerinen rakenne, dimeerin denaturoituminen tapahtuu paljon hitaammin ja sen seurauksena uudelleenassosioituminen tetramee-riksi parantuu. Substituutioilla, jotka vähentävät mono-meerisen ja/tai dimeerisen rakenteen alttiutta kemialliseen modifikaatioon, voi olla myös stabiloiva vaikutus, koska ne kumoavat proteiinin laskostumattomuuden irrever-siibelisyyden.

Edelleen keksinnön edullisessa suoritusmuodossa tetramee-rinen rakenne stabiloidaan epäsuorasti, stabiloimalla glukoosi-isomeraasin dimeerinen rakenne tai jopa monomee-rinen rakenne erityismutaatioilla. Muuttamalla monomeeris-ten ja/tai dimeeristen rakenteiden pakkausta tetrameerisen rakenteen jokaisen osan konformaation vapaus vähenee, jonka vaikutus tetrameeriin on stabiloiva.

On selvää, että mutaatiot, jotka stabiloivat vuorovaiku- • tuksia entsyymialayksiköiden välillä, pystyvät myös stabiloimaan vuorovaikutuksia (laskostuvien) alueiden välillä monomeerisessa proteiinissa. Yksityiskohtaisemmat selitykset käsitteille alayksiköt ja alueet, on esitetty rinnak-kaishakemuksessamme WO 90/00605, joka myös on jätetty 17. heinäkuuta 1989.

Alan ammattimiehille on myös selvää, että jos halutaan saada glukoosi-isomeraaseja, joilla on alentunut stabiliteetti, edellä kuvattuja stabiloivia voimia voidaan heikentää käyttämällä samanlaisia menetelmiä. Tällaiset omi- • 4 13 102541 naisuudet omaavat mutantit ja menetelmät tällaisten mu-tanttien muodostamiseksi ovat myös osa tätä keksintöä.

Tässä selityksessä käytetään aminohapoille sekä kolmikirjaimisia että yksikirjaimisia koodeja. Tämä koodi on selitetty seuraavassa taulukossa 1.

Taulukko l

alaniini Ala A leusiini Leu L

arginiini Arg R lysiini Lys K

asparagiini Asn N metioniini Met M

asparagiinihappo Asp D fenyylialaniini Phe F

kysteiini Cys C proliini Pro P

glutamiinihappo Glu E seriini Ser S

glutamiini Gly G tryptofaani Trp W

histidiini His H tyrosiini Tyr Y

isoleusiini Ile I väliini Vai V

Keksintö koskee myös menetelmää vuorovaikutuksen parantamiseksi glukoosi-isomeraasialayksiköiden välillä, joka menetelmä perustuu molekyylien kolmidimensionaalisen ("3D") rakenteen tarkasteluun. Entsyymin (tai entsyymikompleksin) 3D-rakenteen tiedoilla on suuri merkitys, jotta voidaan ennustaa, mitä mutaatioita voidaan tehdä.

Bruttorakennetiedot on esitetty Streptomyces rubiqinosus- glukoosi-isomeraasille (Carell et ai., J.Biol.Chem. 259 « 1 ·* (1984) 3230-3236), Streptomyces olivochromoqenes-glukoosi- isomeraasille (Farber et ai., Protein Eng. 1 (1987) 459-466) ja Arthrobacter-qlukoosi-isomeraasilia (Henrick et ai., Protein Eng. 1^ (1897) 467-475).

14 102541

Vaikka näille entsyymeille ei ole saatavilla mitään aminohapposekvenssit ietoj a, 3D-rakenteen homologia Actinopla-nes missouriensis-qlukoosi-isomeraasin kanssa on huomiota herättävä (katso F.Rey et ai., Proteins 4 (1988) 165-172). Käyttämällä menetelmiä, kuten edellä kuvattuja tai muita, alan ammattimiesten hyvin tuntemia menetelmiä, voidaan tehdä useita muita pistemutaatioita tetrameerisen glukoosi- isomeraasi rakenteen stabiliteetin lisäämiseksi. (Acti-noplanes missouriensis-qlukoosi-isomeraasin rakennetiedot, katso F.Rey et ai., ibid.). Näistä seuraavat mutaatiot koskevat yhden monomeerisen alayksikön stabiliteettia: - Gly-tähteiden substituutio muiksi tähteiksi (a-helix B), tarkoituksena laskostumattoman tilan entropian alentaminen - taipuisan silmukan pois leikkaaminen (α-helix G:n ja β-säikeen H välillä) hydrofobisen, altistuneen pinnan pelkistämiseksi - Pro-tähteen liittäminen β-säikeen E alkuun (laskostumattoman tilan entropian alentamiseksi) - mutaatio Phe:ksi (α-helix G) aromaattisen ryhmän muodostamiseksi ylimääräisen myötävaikutuksen saamiseksi proteiinirakenteen stabiliteettiin.

Keksinnön eräässä toisessa, edullisessa suoritusmuodossa korvataan arginiinilla lysiini glukoosi-isomeraasi-mole-kyylin kohdissa, joiden stabiliteettia on tarkoitus lisä-tä. Molempien tähteiden täytyy steerisesti mahtua proteiinin 3D-rakenteeseen.

Proteiineissa lysiinitähteet, muttei arginiinit, ovat taipuvaisia kemialliselle modifikaatiolle. Näin ollen lysii- 15 102541 nin epsilon-aminoryhmän tiedetään reagoivan aldehydien ja ketonien kanssa muodostaen Schiff-emäsaddukteja ja muita modifikaatiotuotteita, jotka mahdollisesti ovat syynä biologisen aktiivisuuden häviöön (katso esim. P.Higgins & H.Bunn, J. Biol.Chem. 256 (1981) 5204-5208). Erityisesti glukoosi-isomeraasin käytössä, jossa esiintyy glukoosin ja fruktoosin korkeita konsentraatioita korotetuissa lämpötiloissa, tällaiset kemialliset modifikaatiot ovat tärkeä tekijä entsyymi-inaktivoitumisessa. Kun lysiinitähteitä esiintyy rajapinnoilla alueiden ja/tai alayksiköiden välillä, kemiallinen modifikaatio tällaisissa kohdissa oletettavasti edistää alueen tai alayksikön dissosiaatiota ja/tai estää alayksiköiden ja/tai alueiden oikeata uudel-leenassosioitumista, niiden ollessa siten irreversiibelis-ti suljettuna dissosiaatiotilaan. Tällaisissa kohdissa ly-siinitähteiden mutaatiot arginiinitähteiksi eliminoivat kemialliset modifikaatiot, joissa lysiinin epsilon-amino-ryhmä on osallisena. Tässä yhteydessä viittaamme rinnak-kaishakemukseemme WO 90/00605, joka on myös jätetty 17. heinäkuuta 1989.

Korvaamalla spesifiset lysiinitähteet arginiinitähteillä glukoosi-isomeraasissa, kemiallisen modifikaation esiintyminen ja sen vaikutus entsyymiaktiivisuuteen ja/tai stabi- • liteettiin vähenee. Sen seurauksena lysiinitähteen vaihto arginiiniin parantaa glukoosi-isomeraasin stabiliteettia käytön aikana.

Myös kohdissa, joissa mutaatio lysiinistä arginiiniksi steerisesti mahtuu tapahtumaan, arginiinitähteiden korva-tessa lysiinitähteet, tuloksena on yhä proteiinin stabiliteetin kasvu. Koska arginiinilla sivuketjun joustavuus on vähäisempi kuin lysiinillä, johtuen guanidiniumryhmästä, lysiinin mutaatio arginiiniksi on edullinen entropian perusteella. Lisäksi guanidiiniryhmä pystyy muodostamaan

• I

,6 102541 useampia vetysidoksia viereisten tähteiden kanssa proteiinissa, mikä myös johtaa parannettuun stabiliteettiin.

Vielä eräässä toisessa, keksinnön mukaisessa, edullisessa suoritusmuodossa, jossa erityisesti tavoitellaan glukoosi-isomeraasin termisen stabiliteetin lisäystä, ainakin yksi lysiinitähde, joka esiintyy alussa ja erityisesti jäljempänä määritellyssä, erityisessä asemassa, muutetaan argi-niiniksi. Lysiinin korvaaminen arginiinilla parantaa elektrostaattisia vuorovaikutuksia, joissa korvaava argi-niinitähde sen jälkeen on osallisena, erityisesti vuorovaikutuksissa alayksiköiden ja/tai alueiden välisen rajapinnan sisällä. Tässä suoritusmuodossa korvattavan lysii-nitähteen tulisi mieluimmin täyttää seuraavat vaatimukset verrattuna laskostettuun, natiiviin proteiinikonformaa-tioon: 1. Korvattavan tähteen tulisi olla suoraan osallisena elektrostaattisissa vuorovaikutuksissa, mieluimmin alayksiköiden ja/tai alueiden välisellä rajapinnalla.

2. Mutaation tulisi tapahtua kohdassa, johon liitettävä aminohappo voidaan steerisesti mahduttaa.

3. Tähteen tulisi esiintyä kohdassa, jossa liuottimen luoksepäästettävyys on alhainen ja mieluimmin sen tulisi olla osa alayksiköiden ja/tai alueiden välistä rajapintaa.

Mieluimmin tulisi etsiä glukoosi-isomeraasin aminohappotähteitä, joilla, samalla kun ne täyttävät kriteerit (1) ja (2), on pienin helposti lähestyttävä pinta-ala (acces-. sible surface area = ASA) proteiinissa, edellyttäen saman- :* aikaisesti, että ASA:11a on arvo, joka on alhaisempi kuin keskimäärin on määritetty annetuille tähteille. Kohdissa, jotka täyttävät nämä esivaatimukset, arginiini, verrattuna lysiiniin, aikaansaa parannetun elektrostaattisen vuorovaikutuksen johtuen sen sivuketjussa sijaitsevan guanidi- 17 102541 niumryhmän fysikaalis-kemiallisista ominaisuuksista (katso esim. D.Wigley et ai., Biochem.Biophys.Res.Comm. 149 (1987) 927-929).

Yleensä on toivottavaa säilyttää mutanttiglukoosi-isome-raasien, jotka on modifioitu tässä keksinnössä esitetyllä tavalla, entsymaattisen aktiivisuuden olennainen määrä. Tällaisen entsymaattisen aktiivisuuden säilyttämiseksi aminohappotähteiden, jotka on tarkoitus korvata, ei tulisi mielellään olla sellaisia, jotka on identifioitu katalyyttisiksi tähteiksi tai jotka olennaisesti liittyvät kofak-torien sitoutumiseen.

On selvää, että tämän keksinnön mukaisesti spesifisellä aminohapposubstituutiolla voidaan modifioida glukoosi-isomeraasin stabiliteettia edellä mainituilla, yhdistetyillä vaikutuksilla, esim. sellaisilla vaikutuksilla, kuten lisäämällä elektrostaattisen vuorovaikutuksen voimakkuutta, lisäämällä vierekkäin sijaitsevien tähteiden vety-sidosten lukumäärää, lisäämällä entsyymin rakenteellista entropiaa tai vaikuttamalla kemiallisen modifikaation laajuuteen.

Tämän keksinnön mukainen mutanttiglukoosi-isomeraasi voidaan tuottaa seuraavalla, yleisellä menetelmällä. Ensin suoritetaan glukoosi-isomeraasi-inaktivoitumiseen liittyvän mekanismin tai mekanismien huolellinen analyysi spesifisissä, denaturoivissa olosuhteissa. Tästä analyysistä saatua tietoa käyttämällä voidaan sen jälkeen spesifiset lysiini- ja arginiinitähteet identifioida ehdokkaiksi kor-vausreaktioon. Tämä tehdään tutkimalla huolellisesti entsyymin 3D-rakenne, joka määritetään menetelmillä, kuten kristallografialla (H.Wyckoff et ai., (1985) "Diffraction Methods for Biological Macromolecules", Meth.Enzymol.

Vois. 114-115, Acad.Press), NMR-analyysillä (K.Wuthrich 18 102541 (1986) "NMR of Proteins and Nucleic Acids", J,Wiley &

Sons), tai vaihtoehtoisesti primäärisen rakenteen analyysiin perustuvista rakenne-ennusteista (viitteenä katso w.Taylor, Protein Engineering 2 (1988) 77) tai rakennejoh-dannaisista, jotka perustuvat saatavissa oleviin, homologisten proteiinien 3D-rakenteisiin (katso esim. T. Blundell et ai., Nature 326 (1987) 347).

Lopuksi edullisessa kohdassa sijaitsevan aminohappotähteen substituutio voidaan aikaansaada tavanomaisilla menetelmillä, erityisesti glukoosi-isomeraasia koodittavan DNA-sekvenssin paikkaan kohdistetulla mutagenoinnilla, käyttäen esimerkiksi vektoreita ja menetelmiä, kuten kuvaavat Stanssens et ai. (ibid.) ja bakteerikantoja, joita kuvaavat Zell ja Fritz (EMBO J. 6 (1987) 1809).

Edellä mainitut mutaatiot on esitetty ainoastaan keksintöä kuvaavina, tarkoituksena ei ole keksinnön piirin rajoittaminen. Seuraavat, ei-rajoittavat esimerkit kuvaavat edelleen keksintöä.

Ellei esimerkeissä muuten erikoisesti mainita, kaikki menetelmät yhdistälmä-DNA:n valmistamiseksi ja manipuloimiseksi suoritettiin standardisoiduilla menetelmillä, jot-ka Maniatis et ai. (1982) ovat kuvanneet.

Seuraavat plasmidit, vektorit ja bakteerikannat, joita käytetään tai valmistetaan esimerkeissä, on talletettu laitokseen Deutsche Sammlung fiir Mikroorganismen, Göttingen, Länsi-Saksa, Budapestin sopimuksen mukaisesti tai :1 laitokseen Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS),

Baarn, Alankomaat: 19 102541 pMc5-8 DSM 4566 pMa5-8 DSM 4567 pECOR251 DSM 4711 E.coli K527 CBS 471.88

Esimerkki 1

Actinoplanes missouriensis1sta (DSM 43046) saadun glukoosi-isomeraaslgeenin eristäminen ja kloonaus, D-qlukoosi-lsome-raasin tuottaminen E.coll'ssa

D-glukoosi-isomeraasia (GI) käytetään synonyymisestä D-ksyloosi-isomeraasille [(D-ksyloosi) ketoli-isomeraasi, EC

5.3.1.5], joka on entsyymi, joka muuttaa D-ksyloosin D-ksyluloosiksi. Actinoplanes missouriensis * ista saatua D-glukoosi-isomeraasia, joka tuotetaan käyttämällä E.coli-kantoja, merkitään EcoAmi(DSM)-GI. GI:tä koodittavan Actinoplanes missouriensis-geenin erottamiseksi vastaavasta E.coli xylA-geenlstä, ensiksi mainittua merkitään GI.

Actinoplanes missouriensis DSM 43046:sta saatu kokonais-DNA katkaistiin osittain Sau3A:lla. Digestifraktioitiin sakkaroosigradientilla ja fragmentit, joiden pituudet olivat 2-7 kiloemästä (ke), ligoitiin plasmidin pECOR521 ai-* noaan Bglll-kohtaan. Ksyloosi-isomeraasi-vajavainen E.coli-kanta AB 1886 - jota kuvaavat Howard-Flanders et ai. (Genetics 52 (1966) 1119) ja joka johdetaan E.coli-kannasta AB 1157 (DSM 1563) - transformoitiin ligointi-seoksella, jonka jälkeen kasvatettiin minimaaliagarlevyil-lä (Miller (1972) julkaisussa "Experiments in Molecular :* Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring

Harbor, N.Y.), joita oli täydennetty 100 mg:lla/ml ampisil-liinia ja 0,2 %:lla (paino/til.) ksyloosia (MMX). 37 kloonia otettiin talteen (merkittiin pAMIl-137) ja kasvatettiin LB-kasvatusalustassa, joka sisälsi 100 mg/ml ampisil- ,n 102541 20 liinia. Yhdistelmäplasmidi-DNA eristettiin ja analysoitiin restriktiokatkaisuilla. Kaksi plasmidiryhmää voitiin tunnistaa, yksi (esim. pAMI7) sisälsi 2,8 ke:n insertin, toinen (esim. pAMI25) sisälsi 4,0 ke:n insertin. Laaja rest-riktioanalyysi osoitti, että molemmilla inserttityypeillä oli yhteisenä noin 2,0 ke:n alue. Tämän alueen sekvenssi-määritys kemiallisella degradaatiomenetelmällä (A.Maxam ja W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74 (1977) 560) paljasti avoimen lukuvaiheistuksen, jonka pituus oli 1182 nukleotidia ja joka identifioitiin GI:n koodittavana alueena. GI:n nukleotidisekvenssi yhdessä siitä päätellyn aminohapposekvenssin kanssa on esitetty kuviossa 15. Seuraavassa aminohappojen numerointi viittaa kuvioon 15.

GI:n erittäin suuri ilmentyminen voitiin aikaansaada E.colizssa laittamalla geeni bakteriofaagi lambdan oikeanpuoleisen promoottorin (PR) transkriptionaalisen ohjauksen alaiseksi seuraavalla tavalla:

Plasmidi pLK94 (J.Botterman ja H.Zabeau, DNA 6 (1987) 583) modifioitiin ensin β-laktamaasigeenin Pstl-kohdan eliminoimiseksi. Tämä tehtiin eristämällä pLK70-70p:n (Botter-man ja Zabeau, ibid) 880 emäsparia (ep) käsittävä EcoRI/Pstl-fragmentti, joka sisältää β-laktamaasigeenin N-terminaalisen osan, ja pLK94:n 1700 emäsparia käsittävän EcoRI/Pstl-fragmentin, joka sisältää β-laktamaasigeenin C-terminaalisen osan sekä replikaation alkukohdan. Näiden fragmenttien myöhemmin tapahtuva ligointi tuottaa plasmi-din pLK94p.

'· pAMI7 katkaistiin Pstl:llä ja kahden, puhdistetun, pituu deltaan noin 1800 emäsparia olevan fragmentin, joista toinen sisältää GI-geenin, seos ligoitiin pLK94p:n Pstl-kohtaan. Ligointiseosta käytettiin E.coli-kannan AB 1886 transformoimiseksi. Ampisilliini-resistentit, GI+-trans-formantit saatiin kasvattamalla MMX:llä.

21 102541

Plasmidi-DNA eristettiin muutamasta, valitusta transfor-mantista ja karakterisoitiin restriktioanalyysillä. Plas-midi pLK94p, jossa oli GI:n sisältävä Pstl-fragmentti, merkittiin pLK94GI. GI:n suunta on sellainen, että ainoa BarnHI-kohta sijaitsee noin 470 emäsparia GTG-aloituskodo-nin yläpuolella.

pLK70-70p katkaistiin Pstl:llä, päät tasattiin DNA-polyme-raasi I:llä (Klenow-fragmentti), jonka jälkeen katkaistiin Xbal:llä.

pLK94GI linearisoitiin BamHIrllä ja katkaistiin eksonukle-aasi Bal31:llä. Näytteitä otettiin eri aikoina, reaktio pysäytettiin dinatriumetyleenidiamiinitetra-asetaatiliä (EDTA), katkaistiin Xbal:llä ja analysoitiin geelielektro-foreesilla leikattujen BamHI-Xbal-fragmenttien keskimääräisen koon määrittämiseksi. Fragmentit, jotka olivat kooltaan 1350 -1450 emäsparia, eluoitiin geelistä. Fragmentti ligoitiin pLK70-70p:hen. E.coli K514 (C.Colson et ai., Genetics £2 (1965) 1043) transformoitiin ligointise-oksella ja ampisilliini-resistentit transformantit valittiin 37 °C:ssa. Plasmidi-DNA, joka eristettiin useista transformanteista, karakterisoitiin restriktioanalyysillä. 24 kloonia, jotka sisälsivät plasmidit, joissa oli ehjä • GI, säilytettiin ja niistä testattiin Eco-Ami(DSM)-GI:n tuotanto. Viljelmiä kasvatettiin yön yli 37 eC:ssa, jonka jälkeen kaikki solu-uutteet fraktioitiin polyakryyliamidi-geelielektroforeesilla (PAGE) 12,5%:isella natrium-dode-kyylisulfaatilla (SDS) (U.Laemmli, Nature 227 (1970) 689). Verrattaessa transformoimattomaan K514-kontrolliviljel- ’· mään, yhden klooneista todettiin johtavan uuden proteii nin, jonka molekyylipaino oli 42 kilodaltonia (kd), voimakkaaseen synteesiin, joka proteiini identifioitiin Eco-Ami(DSM)-GI:ksi Western-analyysillä, käyttämällä polyklonaalista seerumia, joka oli valmistettu puhdistet- « * 22 1 0 2 5 41 tua Actinoplanes missourlensis-GI:tä vastaan. Plasmidi, jolla saatiin korkea EcoAmi(DSM)-GI-tuotanto E.coli K514:ssä, merkittiin pLK70GI.

PR-GI-transkriptionaaliyksikkö voitiin leikata pois EcoRl-Xbal-fragmenttina, jonka sekvenssi on esitetty kuviossa 16. Sen jälkeen, kun tämä fragmentti oli eluoitu agaroosi-geelistä, se ligoitiin sekä pMa5-8:aan että pMc5-8:aan, jotka oli katkaistu EcoRI:llä ja Xbalillä, saatiin pMa5-GI ja vastaavasti pMc5-GI. Näiden vektoreiden todettiin johtavan EcoAmi (DSM)-GI:n yhtäläisiin ja tehokkaisiin syn-teeseihin, vaikka ilmentymistaso ei eroa merkittävästi siitä, mikä saatiin pLK70GI:llä.

GI:n ilmentymistä voitiin edelleen lisätä muuttamalla GTG-aloituskodoni ATG-tripletiksi. Tämä tehtiin paikkaan kohdistetulla mutagenoinnilla, kuten kuvataan esimerkissä 4, käyttäen seuraavaa oligonukleotidialuketta: 5'-GGACAGACATGGTTACC-3'

Villityypiset ja mutantti-GI-entsyymit tuotettiin E.coli-kannassa K514, jota kasvatettiin alustassa, jossa oli 1 % tryptonia, 1 % NaCl:ä, 0,5 % hiivauutetta ja joko ampisil-liinia (100 mg/ml) pMA-tyyppiselle vektorille tai kloram-fenikolia (25 mg/ml) pMC-tyyppiselle vektorille. Soluja kasvatettiin yön yli 37 eC:ssa ja ne sentrifugoitiin. EcoAmi(DSM)-GI-entsyymi voitiin puhdistaa seuraavalla tavalla: Solupelletti suspendoitiin uudestaan mahdollisimman . pieneen määrään seosta, jossa oli 0,05 M Tris:ä (hydroksi-

ί metyyli)aminometaani (Tris/HCl)), 0,1 mM CoCl2:ta, 10 mM

MgCl2:ta, 0,2 M KCl: ää, 5 % glyserolia ja 5 mM EDTA:ta, pH 8,0, ja lysotsyymiä lisättiin lopulliseen konsentraati-oon 1,0 mg/ml. Seisotettiin 20 minuuttia 0 °C:ssa, jonka jälkeen solut liuotettiin käyttämällä ranskalaista puris- • « 23 102541 tinta, sentrifugoitiin (30 min 23 000 g) ja supernatantti laimennettiin yhtä suurella tilavuudella 5%:ista strepto-mysiinisulfaattia. Inkuboitiin 3 tuntia 4 eC:ssa ja sen jälkeen sentrifugoitiin (30 min 23 000 g). Muodostunut supernatantti kuumennettiin 70 *C:seen (paitsi mutanteilla K253Q ja K100R, joita kuumennettiin ainoastaan SO eC:seen) 30 minuutin ajan ja sentrifugoitiin uudestaan. Liukeneva, ylempi faasi kyllästettiin 80%:iseksi ammoniumsulfaatilla. Sakka, joka sisälsi suurimman osan entsymaattisesta aktiivisuudesta, kerättiin sentrifugoimalla, jonka jälkeen se liuotettiin 0,02 M Tris/HCl:ään, 5 mM EDTA:hän, 0,85M am-moniumsulfaattiin. Tätä seuraavissa kromatografisissa vaiheissa käytettiin Phenyl-Superose'a, Sephacryl S-200 HR:ää ja lopuksi Mono-Q HR 10/I0:ntä. On tärkeätä huomata, että 5 mM EDTA-lisäys kaikkiin puskureihin kromatografiaa varten oli tarpeen, metalli-ionien eliminoimiseksi. Ennen käyttöä muodostunut entsyymi dialysoitiin 3 kertaa 10 mM trietanoliamiinin, jonka pH oli 7,2 ja joka sisälsi 10 mM EDTA (lopullinen pH oli noin 5,2) 200 tilavuutta vastaan ja taas uudestaan 5 mM [2-N-morfolino)etaanisulfonihappoa] (MES), jonka pH oli 6,0, 200 tilavuutta vastaan, puskuri vaihdettiin 3 kertaa. Lopullisen entsyymivalmisteen metallipitoisuus määritettiin atomiabsorptiospektrometrisesti laitteena oli Varian SpectrAA 30/40, joka paljasti, että I EcoAmi(DSM)-GI on vapaa metallista, esimerkkinä voidaan tässä osoittaa, että koboltti-ioneja, jotka sitoutuvat entsyymiin erittäin suurella affiniteetilla, laskettiin ainoastaan ± 1 x 10-4 moolia/EcoAmi(DSM)-GI-monomeerimooli (kun EDTA puuttui kromatografiapuskureista, viimeksi mainittu arvo kohosi 0,5 mooliin kobolttia/entsyymimonomeeri-.· mooli). EcoAmi (DSM)-GI:n puhtaus vahvistettiin SDS- PAGE:lla ja hopeavärjäyksellä ja myös käänteisfaasisella, suuren erotuskyvyn nestekromatografiällä (HPLC) Vydac C4-kolonnissa.

24 102541

Glukoosi-isomeraasin entsymaattinen aktiivisuus vahvistettiin kuten jäljempänä esitetään (entsymaattisen aktiivisuuden 1 yksikkö tuottaa 1,0 mikromoolia tuotetta, joka on D-ksyluloosi tai D-fruktoosi, per minuutti, tästä johtuen spesifinen aktiivisuus, spa, ilmoitetaan yksikköinä per GI-entsyymien mg).

Trifenyylitetratsoliumkloridi (TTC)-koe on kuvattu aikaisemmin D-ksyloosi-isomeraasien visualisoinnin yhteydessä levyelektroforeesilla (K.Yamanaka, Bull. Yamaguchi Med. School 18 (1971) 1). Tämä värjäysmenetelmä perustuu soke-reiden tetratsoliumsuolan kanssa tapahtuvaan reaktioon, jossa muodostuu formatsaania huoneen lämpötilassa; reaktio on spesifinen ketoosille huoneen lämpötilassa, koska al-doosi reagoi ainoastaan 100 °C:ssa. Geeleillä aktiivinen ksyloosi-isomeraasi voidaan näin identifioida vaaleanpu-naisena-punaisena juovana. Pienillä muunnoksilla tämä ak-tiivisuustesti sopii käytettäväksi Pharmacia PhastSystem' -issä. Lyhyesti esitettynä, elektroforeesin jälkeen natiivi PAGE-geeli siirrettiin PhastSystem'in värjäyskammioon ja inkuboitiin 15 minuuttia 50 eC:ssa 20 mM Tris/HCl:ssä, pH 7,2, yhdessä 50 mM ksyloosia, 10 mM MgCl2:ta, 0,1 mM CoCl2:ta kanssa, pestiin demineralisoidulla vedellä 0,5 minuuttia 4 eC:ssa, jonka jälkeen geeli upotettiin 3 mi-nuutin ajaksi 20 eC:ssa 0,l%:iseen trifenyylitetratso-liumkloridiin, joka oli juuri valmistettu 1 N NaOH:hon, reaktio lopetettiin inkuboimalla geeliä 2 N HClrssä 15 minuutin ajan 20 eC:ssa, lopuksi pestiin vedellä (0,5 min 4 °C:ssa).

GI-aktiivisuus voidaan testata myös suoraan mittaamalla lisäys absorbanssissa aallonpituudella 278 nm ksyluloosil-le, joka tuotetaan 35 °C:ssa isomeroimalla ksyloosi glu-koosi-isomeraaseilla. Tämä testi suoritettiin 50 mM tri-etanoliamiinipuskurissa, jonka pH oli 7,5 ja joka sisälsi 26 102541 10 mM MgS04:ää, 0,1 M ksyloosia läsnäollessa. Glukoosi-isomeraasin lopullinen konsentraatio testissä oli ± 0,01 mg/ml ja määritettiin täsmällisesti ennen laimennusta ent-symaattiseen koeseokseen, absorptiospektroskopisesti, käyttäen ekstinktiokerrointa 1,08 aallonpituudella 278 nm entsyymin 1,0 mg/ml:n liuokselle.

D-sorbitoli-dehydroqenaasi-kytketyssä testissä D-ksyluloo-sin entsymaattinen määritys suoritettiin 35 eC:ssa kuten aikaisemmin on kuvattu (Kersters-Hilderson et ai., Enzyme Microb. Technol. 9 (1987) 145) 50 mM:ssa trietanoliamiini-a, jonka pH oli 7,5 ja jossa oli 10 mM MgS04:ää ja 0,1 M ksyloosia, ±2 x 10-8 M:n D-sorbitoli-dehydrogenaasia (L-iditoli:NAD oksidopelkistin, EC 1.1.14) ja 0,15 nM:n NADH:ta läsnäollessa paitsi, että myös inkubointiseos sisälsi l mM etyleenibis(oksietyleeni-nitrilo)tetraetikka-happoa (EGTA). Tässä kokeessa glukoosi-isomeraasin lopullinen konsentraatio oli ±2,5 x 10-3 mg/ml ja se määritettiin täsmällisesti edellä kuvatulla tavalla.

Käyttäen glukoosia substraattina GI-aktiivisuus voidaan testata mittaamalla isomerointireaktion aikana tuotetun D-fruktoosin määrä, käyttämällä kysteiini-karbatsoli-mene-telmää (CCM), joka perustuu ketosokereiden reaktioon kar-;; ' batsolin kanssa hapoissa, johtaen purppuran väriseen tuot teeseen (Dische ja Borenfreund, 1951).

Esimerkki 2

EcoAmi(DSM)-GI:n lämpöinaktlvoitumisen kinetiikka Lämpöinaktivoitumisen kinetiikkakokeet suoritettiin metalli-vapaalla glukoosi-isomeraasilla lisäyksin, jotka esitetään jokaisessa spesifisessä tapauksessa. Lyhyesti esitettynä puhdistettu entsyymi tasapainotettiin haluttuun puskuriin ja liuos vedettiin Hamiltonin, Teflon-neulalla 26 102541 varustettuun, kaasutiiviiseen ruiskuun, joka oli etukäteen sijoitettu lasivaipan sisään, joka oli yhdistetty kiertävään vesihauteeseen (Lauda RM6), jonka lämpötila oli säädetty esitettyyn lämpötilaan. Aikaisemmat kokeet ovat osoittaneet, että entsyymiliuoksen lämpötilan tasapainottaminen 25 eC:sta 85 °C:seen tapahtuu alle yhdessä minuutissa. Sopivin aikavälein näytteet vedettiin Eppendorf-putkiin ja lämpödenaturoitumisprosessi pysäytettiin jäähdyttämällä näytteet 0 eC:seen.

Vaihtoehtoisesti suuria näytteitä inkuboitiin kuten yksittäisiä näyte-eriä reaktio-putkissa [Reacti-vials (Pierce)].

1. Riippuvuus lämpötilasta ja metallista

EcoAmi(DSM)-GI:n lämpöinaktivoitumisen kinetiikka 50 mM:ssa [ 3-[N-morfolino)-propaanisulfonihappoa] (MOPS), jonka pH oli 7,2 25 eC:ssa (pKa = 7,15 25 °C:ssa, dH/°C = -0,001) lämpötilan funktiona on kuvattu kuviossa l. (Ei lisätty metallia), kuviossa 2 (+ 10 mM MgS04:ää) ja kuviossa 3 (+ 10 mM CoCl2:ta). Kaikki tulospisteet sopivat huomattavan hyvin teoreettisille hajoamiskäyrille, jotka vastaavat ensimmäisen kertaluvun reaktiota riippumatta käytetystä lämpötilasta ja metalli-ionin läsnäolosta tai luonteesta.

Tulokset osoittavat myös magnesium- ja sitäkin vielä enemmän koboltti-ionien stabiloivan vaikutuksen.

• Lämmön vaikutuksesta tapahtuneen entsyymin inaktivoitumi- sen todettiin olevan irreversiibeli, näin ollen lämmittämisen todettiin indusoivan proteiinin kasautumista. Mg2+:n läsnäollessa voitiin todeta, että entsymaattisen aktiivisuuden häviö vastasi erittäin hyvin proteiinisaostumisen määrää.

27 102541

Kuvioon 4 on kerätty kuvioiden 1, 2 ja 3 tulokset ja siitä havaitaan, että käytetyillä lämpötila-alueilla Arrhenius-käyrä on lineaarinen huolimatta siitä onko käytetty metallia vai ei.

Nämä tulokset osoittavat, että EcoAmi(DSM)-GI:n terminen denaturaatio saa alkunsa yhdestä ainoasta tapahtumasta kaikissa testatuissa olosuhteissa, ei tiedetä vallitseeko sama rajoittava vaihe metallin poissaollessa tai metallia käytettäessä, mutta Arrhenius-käyrän lineaarisuus tukee väitettä, että tämä vaihe on yksi ainoa kokeellisten olosuhteiden spesifisessä mallissa.

2. Riippuvuus pH:sta ja ionivahvuudesta GI:n affiniteetti, joka stabiloi metalleja, on voimakkaasti riippuvainen pH:sta, erityisesti se on huomattavasti alentunut pH-arvon ollessa alle 6. Tämän seurauksena pH:n vaikutus EcoAmi(DSM) GI:n termostabiliteettiin tutkittiin käyttämällä metallivapaata entsyymiä, käyttämättä lisättyjä metalleja.

pH-alueella 4,7 - 8,3 EcoAmi(DSM)-GI:n inaktivoituminen 7 2 eC:ssa noudatti aina ensimmäisen kertaluvun kinetiikkaa.

11. Kuviosta 5 nähdään, että inaktivoitumisen nopeusvakio, kD, pysyi käytännöllisesti katsoen muuttumattomana pH-alueella 5,5 - 6,7, mutta lisääntyi tämän pH-alueen molemmin puolin.

Kuviossa 6 on esitetty, kuinka entsyymin lämpöinaktivoitu-’· misen kinetiikka, kun ei käytetty lisättyä metallia, li sääntyi ionivahvuuden funktiona. Tämä, yhdessä pH-riippu-vuustulosten kanssa, osoittaa vahvasti, että polaariset tähteet osallistuvat EcoAmi(DSM)-GI:n termiseen stabiliteettiin.

28 1 0 2 5 41 Tätä ehtoa tukevatedelleen tulokset kuviosta 7, jossa on esitetty, että kohtuullinen lisäys pH:ssa (t.s. pH 6,7 muuttuu pH-arvoksi 7,6 72 *C:ssa) huomattavasti vahvistaa natriumkloridin destabiloivaa vaikutusta.

3. Urean ja syanaatin vaikutukset GI on tetrameeri, joka muodostuu neljästä identtisestä alayksiköstä (F.Rey et ai. ibid.).

Urean ja syanaatin vaikutus tutkittiin yrityksessä identifioida rakennemuutokset, jotka saattavat olla vastuussa entsymaattisen aktiivisuuden häviöstä, seurauksena kuumentamisesta, t.s. alayksiköiden dissosiaatiosta ja/tai las-kostumattomuudesta.

Entsyymin oligomerisaatiotila analysoitiin käyttäen geeli-suodatusta suuren erotuskyvyn omaavalla nestekromatogra-fiällä (SEC-HPLC) Superose 12:11a huoneen lämpötilassa, eluointipuskurin sisältäessä 50 mM Tris/HCl:ää, jonka pH oli 8,0, 25 eC:Ssa, ja 150 mM NaCl:ää, jonka jälkeen seurasi entsyymin pitkäaikainen inkubointi 7 M ureassa huoneen lämpötilassa.

Natiivi GI eluoitui tetrameerina SEC-HPLC:ssä.

Kuvio 8 osoittaa, että pitkäaikainen inkubointi ureassa on tarpeen natiivin EcoAmi(DSM)-GI-tetrameerin dissosiaation indusoimiseksi dimeereiksi.

«

Koska tiedetään, että urealiuosta seisotettaessa muodostuu syanaattia, arvoitiin, että syanaatin aikaansaama entsyymin kemiallinen modifikaatio saattaisi olla syynä havaittuun alayksiköiden dissosiaatioon.

102541 Tämän hypoteesin testaamiseksi entsyymiä inkuboitiin 16 -24 päivää huoneen lämpötilassa 0,2 M boraatissa, jonka pH oli 8,5, ja jossa oli 150 mM NaCl:ää ja jonka sisältämä syanaattikonsentraatio vaihteli 0 - 200 mMriin, ja tätä seosta inkuboitiin joko sellaisenaan tai käyttäen mukana juuri valmistettua 5,0 M syanaatti-vapaata ureaa (juuri valmistettu varastoliuos, jossa oli 10 M ureaa Milli-Q-puhdistettua vettä, valutettiin läpi AG 501-X8 (D) hartsi-pylväästä (Bio-Rad) valmistajan suositusten mukaisesti; tämä käsittely eliminoi ioniepäpuhtaudet, joiden joukossa syanaatti).

Tehtiin seuraavat havainnot: 1. Käsittely pelkällä syanaatilla ei voi muuttaa EcoAmi (DSM)-GI:n eluoitumisprofiilia SEC-HPLC:llä (kuvio 9A). Natiivi PAGE osoitti entsyymin annoksesta riippuvan kemiallisen modifikaation, josta todisteena negatiivisen varauksen lisääntyminen (kuvio 9B, ylempi paneeli) mutta ilman entsymaattisen aktiivisuuden näkyvää häviötä, kuten osoittaa geelin TTC-värjäys (kuvio 9B, alempi paneeli).

2. EcoAmi(DSM)-GI:n 16 päivää kestäneen, 5,0 M ureassa tapahtuneen inkuboinnin jälkeen ei minkäänlaista dimeerimuo-dostumista havaittu SEC-HPLC:llä (kuvio 10A). Kuitenkin jonkin verran dlmeeri-dimeeri-dissosiaatiota havaittiin natiivin PAGE:n jälkeen (kuvio 10B, ylempi paneeli, 0 mM NaCNO), osoittaen, että käytetyllä ureakonsentraatiolla (5-molaarinen), muodostunut syanaatti indusoi vähäisen kemiallisen modifikaation, joka siitä huolimatta, että se ei johda suoraan tetrameerin dissosiaatioon, heikentää dimee- \ ri-dimeeri-assosiaatiota siinä määrin, että dissosiaatio voitaisiin aikaansaada PAGE:ssa käytetyn sähkökentän vaikutuksen alaisena. Vaihtoehtoisesti voidaan myös olettaa, että urean ja sähkökentän yhdistetty vaikutus aikaansaa tetrameerin dissosiaation dimeeriksi.

30 102541 3. Syanaatin samanaikainen lisäys EcoAmi(DSM)-GI:hin 5,0 M ureassa aikaansaa helposti tetrameerin dissosiaation di-meeriksi konsentraatiosta riippumattomalla tavalla. Tämä todettiin sekä SEC-HPLC-tuloksista (kuvio 10A) että natii-villa PAGE:11a (kuvio 10B, ylempi paneeli). Korkeissa sya-naattikonsentraatioissa tapahtuneen inkuboinnin jälkeen havaittava hidastuminen dimeerin PAGE:ssa johtuu luultavasti entsyymin lisääntyneestä laskostumattomuudesta näissä olosuhteissa. Natiivilla PAGE:11a dimeereillä ei havaittu minkäänlaista GI-aktiivisuutta TTC-värjäyksen jälkeen (kuvio 10B, alempi paneeli). Tämä havainto osoittaa, että entsymaattinen aktiivisuus on hävinnyt sen jälkeen, kun GI-tetrameeri on dissosioitunut dimeereiksi ja/tai se johtuu kemiallisesta modifikaatiosta.

Yhteenvetona voidaan esittää, että molempien sekä syanaatin että urean käyttö on tarpeen EcoAmi(DSM)-GI-tetramee-rin dissosiaation dimeereiksi havaitsemiseksi. Koska syanaatti pelkästään oli tehoton, kemiallisesti modifioitu aminoryhmä (-ryhmät), joka (jotka) on osallisena entsyymien tetrameerirakenteen stabiloinnissa, ei ole liuottimen tavoitettavissa urean puuttuessa. Urea luultavasti tekee epävakaaksi dimeeri/dimeeri-vuorovaikutuksen ja sillä tavalla paljastaa aminohapon (-hapot), joka aikaisemmin piiloutui dimeeri/dimeeri-rajapintaan. Nämä tähteet, jotka sisältävät joko alfa-ja/tai epsilon-aminoryhmän, saadaan tällä tavalla karbamyloitua syanaatilla. Puolestaan syanaatin kovalenttinen kiinnittyminen välialayksikköön yhteydessä olevaan tähteeseen (tähteisiin), stabiloi entsyymin dimeerimuodon. Tästä syystä, voidaan ehdottaa, että \ EcoAmi(DSM)-GI-tetrameerien dissosiaatio dimeereiksi on luultavasti yksi primäärisistä tapahtumista lämpödenatu-raatiossa. Tämän hypoteesin tueksi voitiin havaita, että korkeammat proteiinikonsentraatiot stabiloivat entsyymin lämmön aikaansaamaa denaturaatiota vastaan (tuloksia ei ole esitetty).

3! 102541 4. Glykosylaatio

On todettu, että proteiinille tapahtuu glykosylaatio, t.s. glukoosin ja lukuisten muiden sokereiden aikaansaama alfa-ja epsilon-aminoryhmien ei-entsymaattinen modifikaatio. Odotettiin, että käyttöolosuhteissa (korkeat glukoosikon-sentraatiot, pH 7,5 ja pitkäaikainen hyväksikäyttö) EcoAmi(DSM)-GI:n glykosylaatio luultavasti tapahtuu myös erityisesti jos EcoAmi(DSM)-GI-tetrameerit dissosioituvat dimeereiksi korkeassa lämpötilassa, voisi odottaa, että sama aminohappotähde (-tähteet), joka reagoi syanaatin kanssa käytettäessä ureaa, glykosyloituisi samanaikaisesti tetrameeri-dimeeri-dissosiaation kanssa ja mahdollisesti katalyyttinen aktiivisuus häviäisi.

Metallivapaata EcoAmi(DSM)-GI:tä inkuboitiin ilman magnesiumia 60 eC:ssa joko ilman D-glukoosia tai D-glukoosin kanssa (250 mM) 50 mM MOPS:ssä, jonka pH oli 7,7 60 °C:ssa. Sopivin aikavälein otettiin näytteet, jäähdytettiin 25 eC:seen ja testattiin jäljellä oleva entsymaatti-nen aktiivisuus suoralla ksyluloosiabsorbanssimittauksella aallonpituudella 278 nm.

Kuvio 11, paneeli A osoittaa, että glukoosin käyttö merkittävästi lisää entsyymin lämpöinaktivoitumisnopeutta 60 °C: ssa. Tämä vaikutus ei ollut reversiibeli, koska laaja puskurin vaihto 50 mM MES:iin, jonka pH oli 6,0 4 eC:ssa, ei voi palauttaa EcoAmi(DSM)-GI:n katalyyttistä tehokkuutta (kolmiot kuviossa li, paneelissa A). Lisäksi reaktio-: tuotteiden analyysi SEC-HPLC:llä osoittaa selvästi, että * * kuten ennustettiin, glykosylaatio liittyi tetrameerin dis- sosiaatioon dimeereiksi ajasta riippuvalla tavalla (kuvio 11, paneelit B ja C), havainto, joka tukee ajatusta, että tetrameerin pilkkoutuminen tapahtuu korkeassa lämpötilassa. Luultavasti dimeerien välisillä kosketuspinnoilla ole- 32 1 0 2 5 41 vien reaktiokykyisten aminohappo ryhmien aikaansaama kova-lenttinen modifikaatio sulkee dissosioituneet dimeerit.

Kuvio 11, paneeli C osoittaa, että kuumentaminen aiheuttaa myös proteiinikasautumien syntymistä, jotka ovat kooltaan noin EcoAmi(DSM)-GI:n heksadekameereja (±700 kilodaltonia, t.s. neljä Gl-tetrameerimolekyyliä), tämä kasautuminen lisääntyi suuresti käytettäessä glukoosia. Kuitenkaan ei tiedetä tapahtuuko kasautumisen muodostuminen riippumatta GI-dissosiaatiosta dimeereiksi vai ainoastaan sen seurauksena.

Hyvin samanlaisia tuloksia voitiin jäljitellä erilaisessa puskurisysteemissä, kuten 12,5 mM:ssa kaliumfosfaattia, jonka pH oli 7,7 60 eC:ssa.

On mielenkiintoista palauttaa mieleen, että urean läsnäolo oli tarpeen syanaatille pysyvien GI-dimeerien valmistamiseksi, kun taas glukoosilla todettiin samat ominaisuudet korkeassa lämpötilassa, kun ureaa ei käytetty. Tästä syystä, voimme todeta, että sekä urea että kuumentaminen aiheuttavat EcoAmi(DSM)-GI-tetrameerien dissosiaation dimeereiksi, paljastaen aminohappotähteet, jotka sijaitsevat dimeerien välisessä rajapinnassa ja joiden joukossa aikai-semmin luoksepääsemättömät aminoryhmät muuttuvat siten, että ne voivat reagoida syanaatin tai glukoosin kanssa ja siten sulkevat entsyymin dimeeritilaan.

Esimerkki 3 : Lysiinitähteiden identifioiminen Actinoplasnes missourien- sis-qlukoosi-isomeraasin alayksiköiden rajapinnoissa GI on tetrameeri, joka muodostuu neljästä identtisestä alayksiköstä (A, B, C ja D) (Rey et ai., ibid.), jotka voidaan nähdä kahden dimeerin (AB ja CD) kokoonpanona.

33 102541 Näin voidaan erottaa alayksikön rajapintojen kaksi kategoriaa, rajapinnat monomeerien välillä yhden dimeerin sisällä (dimeerin sisäinen rajapinta) ja rajapinta kahden dimeerin välillä (dimeerien välinen rajapinta).

Tähteen sanotaan olevan osallisena alayksikön rajapinta-kontakteissa, jos sen vastaanottavainen pinta-ala (accessible surface are = ASA) (B.Lee ja F.Richards, J.Mol.Biol. 55 (1971) 379) laskettuna eristetyssä alayksikössä, eroaa siitä, mikä määritettiin oligomeerissa. Taulukkoon 2 on koottu ASA-arvot lysiinitähteiden 20 alayksikölle sekä eristetyssä monomeerissä että Gl-tetrameerissä.

• · • 4 34 102541

Taulukko 2 K ASArp ASAip A^j 10 65,4 65,4 0,0 42 52,6 52,6 0,0 76 77,1 77,1 0,0 100 142,4 142,4 0,0 100 150,0 0,8 149,2 118 17,9 6,8 11,1 132 147,4 147,4 0,0 149 6,9 3,2 3,7 183 8,0 0,1 7,9 239 167,0 167,0 0,0 240 19,2 18,1 1,1 253 111,5 1,5 110,0 294 51,5 28,7 22,8 309 93,2 93,2 0,0 319 30,0 30,0 0,0 323 83,0 83,0 0,0 339 78,0 50,3 27,7 344 178,1 125,8 52,3 • · 375 132,0 119,2 12,8 381 114,2 67,7 46,5 I___1

Yhdentoista näistä tähteistä on todettu olevan osallisena alayksikkörajapinnoissa. Ainoastaan LYS-100 ja LYS 253 * piilottavat laajan alueen (149Ä ja vastaavasti 110Ä) ala- yksikkörajapintoihin ja tulevat melkein täysin piiloutuneiksi tetrameerissä. Toisin sanoen, molemmilla näillä tähteillä on alhainen liuottimen luoksepääsevyys tetrameerissä. Kumpikaan tähde ei myöskään sisälly EcoAmi(DSM)- 35 1 0 2 5 41 GI:n katalyyttiseen aktiivisuuteen. Edelleen LYS-100 ja LYS-253 osallistuvat elektrostaattisiin vuorovaikutuksiin alayksikkörajapinnoissa. LYS-100 S-alayksikössä (A-LYS-100) stabiloi vetysidoksella pienen helixin viimeisen kierteen lähellä asemaa 373 B-alayksikössä. LYS-253 A-alayksikössä (A-LYS-253) toisaalta on osallisena ionises-sa, dimeerien välisessä vuorovaikutuksessa C-alayksikön ASP-190:n kanssa. Käyttäen mallinrakennusmenetelmiä (kuten kuvaavat P.Delhaise et ai., J.Mol.Graph. 2 (1984) 116), todettiin, että LYS-100:n ympäristössä ei todennäköisesti ole tilaa ARG-substituutiolle, kun taas Lys-253:n mutaatio ARG:ksi olisi steerisesti mahdollinen, koska mitään huonoja fysikaalisia kontakteja ei ilmennyt ja ioniset vuorovaikutukset ASP-190:n kanssa säilyivät edullisina.

Toinen lysiinitähde K294 sijaitsee dimeeri-dimeeri-raja-pinnalla mutta se on ainoastaan osittain piiloutuneena tetrameerissä (hyväksikäyttöpinta-ala 22,8 A2). Tämä tähde säilyy lujasti kaikissa aktinomykeettiglukoosi-isomeraa-seissa (katso esimerkki 10 ja kuvio 21), kuitenkin K294 on vuorovaikutuksessa myös N247:n ja D257:n kanssa, jotka molemmat osallistuvat metallin sitomiseen. Näin K294 vaikuttaa glukoosi-isomeraasin stabiliteettiin eri mekanismeilla.

Esimerkki 4

Spesifisten lysiinitähteiden aminohappojen korvautumiset Ac-tinoplanes missouriensis-qlukoosi-isomeraasissa Tämän keksinnön mukaisesti LYS-253 :n korvaaminen arginii-: nilla stabiloisi elektrostaattisen vuorovaikutuksen dimee- ri-dimeeri-rajapinnan yli ja siten lisäisi EcoAmi(DSM) GI:n stabiliteettia lämpöinaktivoitumista vastaan. Lisäksi tämä substituutio estäisi myös kemiallisen modifikaation (glukoosin tai syanaatin aiheuttaman) asemassa 253.

36 102541 A-LYS-253/C-ASP-190-ioniparin elektrosaattisten vuorovaikutusten tärkeyden määrittämiseksi EcoAmi(DSM)-GI:n läm-pöstabiliteetissa, LYS-253 mutatoitiin glutamiiniksi ly-siinisivuketjun ionisen luonteen eliminoimiseksi, tämä mutaatio on muuten jokseenkin säilyttävä.

Paikkaan kohdistettu mutagenointi suoritettiin aukkoja sisältävän kaksois-DNA (gapped duplex DNA = gdDNA) menetelmän mukaisesti, käyttäen pMa5-8:aa ja pMc5-8:aa plasmidi-vektoreina (P.Stanssens et ai. ibid.). Koska mutagenoin-tistrategia vaatii ainutlaatuisten restriktiokohtien käyttöä, jotka sijaitsevat mutagenoitavan alueen ylä- tai alapuolella, GI:tä koodittavaan sekvenssiin lisättiin kaksi muuta katkaisukohtaa koodittavaa aminohapposekvenssiä muuttamatta. Kpnl-kohta luotiin G:n nukleotidisella emäs-vaihdolla A:ksi asemassa 177, käyttämällä seuraavaa oligo-nukleotidialuketta: 5'-CGAAGGGTACCAGG-3'

Xhol-kohta luotiin korvaamalla G C:llä asemassa 825, käyttäen seuraavaa oligonukleotidialuketta: 5'-GCCGTTCTCGAGGAGGTCG-3’ ** GTG:n muuttaminen ATG-kodoniksi (katso esimerkki 1) ja

Kpnl-kohdan luominen suoritettiin yhdellä ainoalla mutage-nointikokeella, jossa kyseessä olevat, entsymaattisesti fosforyloidut oligonukleotidit emäspariutettiin gdDNA:hän, joka johdettiin yksisäikeisestä pMc5-GI:stä ja pMa5-GI:n suuresta BamHI-Aatll-fragmentista.

Xhol-kohta liitettiin erillisessä kokeessa, käytetty gdDNA rakennettiin yksisäikeisestä pMc5-GI:stä ja pMa5-GI:n suuresta SacI-Smal-fragmentista. Nämä kolme mutaatiota tehtiin yhdessä ainoassa geenissä yhdistämällä kaksoismutan- 37 102541 tin ja xhol-mutantin sopivat fragmentit. Muodostunut kol-moismutantti merkittiin pMa-I. Täydennettävä pMc5-I rakennettiin insertoimalla pMa5-I:n pieni EcoRI-Xbal-fragment-ti, joka sisälsi Pp-GI-yhdistelmägeenin, pMc5-8:n Ecori-ja Xbal-kohtien väliin.

pMa5-I ja pMc5-I ovat perusvektoreita, joita käytetään sekä villityyppisen että mutantti-GI:den valmistamiseksi. Kaikissa paikkaan kohdistetuissa mutagenointikokeissa, jotka kuvataan jäljempänä, käytettiin hyväksi gdDNA:ta, joka valmistettiin pMa5-I:n yksisäikeisestä muodosta ja pMc5-I:n sopivasta fragmentista.

1. Lysiini-253 —> qlutamiiniksi gdDNArn rakentamiseksi käytettiin pMc5-I:n suurta Sacl-Xhol-fragmenttia ja seuraavaa oligonukleotidialuketta: 5 ' -CCTGGTCGAACTGCGGGCCG-3 '

Mutanttientsyymi ilmentyi hyvin, spesifinen aktiivisuus, käytettäessä substraattina ksyloosia, oli 96 % villityyppisen EcoAmi(DSM)-GI:n aktiivisuudesta (taulukko 3).

Lämpöinaktivoituminen 72 eC:ssa 50 mM MOPS:ssä, jonka pH oli 7,4 72 *C:ssa, ilman metallia, noudatti ensimmäisen kertaluvun kinetiikkaa ja osoitti, että mutaatio aiheutti 60-kertaisen lisäyksen denaturoitumisnopeusvakioon 1,4 x 10-2 min-1:stä, joka on villityyppisen, 0,9 min-1:teen, . joka on tulos K253Q:lle (kuvio 12, paneeli A). Kun käytet-

; ‘ tiin 10 mM MgS04:ää 85 °C: ssa 50 mM MOPS:ssä, jonka pH

oli 6,5 85 eC:ssa, (kuvio 12, paneeli B), ensimmäisen asteen hajoamisnopeusvakiolla oli arvo 1,2 min-1 K253Q:lla, joka on noin 350 kertaa suurempi kuin villityyppisen entsyymin (kD = 3,4 x 10-3 min-1).

33 102541 K253Q-entsyymin oligomeerisen rakenteen analyysi geelisuo-datuskromatografiässä paljasti koskemattoman tetrameerin. Pitkäaikainen inkubointi 5 molaarisessa, syanaattivapaassa ureassa 0,2 M boraatissa, jonka pH oli 8,5 ja jossa oli 0,15 M NaCl:ää, osoitti kuitenkin, että K253Q-mutantti dissosioituu helposti dimeereiksi, kuten kuvio 13, paneeli A osoittaa; kuvion 13 paneeliin B on kerätty tulokset, jotka osoittavat kehityskäyrän dimeerimuodostukselle vil-lityyppiselle ja mutanttientsyymeille; tulokset osoittavat, että tetrameerit dissosioituvat dimeereiksi mutanttientsyymissä mutta eivät villityyppisessä entsyymissä .

Edellä kuvatut kokeet selvittävät EcoAmi(DSM)-GI-molekyylin stabiliteetin rakenteellista perustaa. Tähteen K253 spesifinen muuttaminen glutamiiniksi tuottaa lämpötila- ja myös urea-sensitiivisen mutaation ja sen seurauksena identifioi olennaisten vuorovaikutusten paikan. Selvä korrelaatio todetaan mutantin lämpöinaktivoitumisherkkyyden ja tetrameerin dimeereiksi dissosioaation laajuuden välillä, mitä urea edistää huoneen lämpötilassa.

2. Lysiini-253 —> arqiniiniksi gdDNA:n rakentamiseksi käytettiin pMc5-I:n suurta Sacl-Xhol-fragmenttia ja seuraavaa oligonukleotidialuketta: 5'-CCTGGTCGAACCGCGGGCCG-3· . EcoAmi(DSM) GI-mutantti, K253R, ilmentyi hyvin ja sillä * oli entsymaattinen aktiivisuus 120 % villityypisestä ak tiivisuudesta, kun substraattina oli ksyloosi (taulukko 3. ) Tämän mutantin termostabiliteetti testattiin 50 mM:ssa (N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N1-2-etaanisulfonihappoa) 39 102541 (EPPS), jonka pH oli 7,5 ja jossa oli 5 mM MgS04:ää, lämpötilojen vaihdellessa 82 eC:sta 92 *C:seen. Taulukossa 4 on esitetty puoliintumisajat tunneissa K253R- ja villi-tyyppiselle entsyymille; tulokset osoittavat, että lämpötila-alueella K253R on johdonmukaisesti pysyvämpi kuin villityyppinen entsyymi.

Mutantin K253R stabiliteetin toteamiseksi koskien glukoosin aiheuttamaa inaktivoitumista korkeissa lämpötiloissa, molempia entsyymejä inkuboitiin 250 mM:n kanssa D-glukoo-sia 60 eC:ssa 12,5 mM kaliumfosfaattipuskurissa, jonka pH oli 7,7. Kuviossa 14 on esitetty inaktivoitumisen aika-käyrä noin 70 tunnin ajalta; tulokset osoittavat selvästi, että K253R-mutantissa on saavutettu suojauksen lisääntyminen inaktivoivaa, irreversiibeliä, kemiallista modifikaatiota vastaan, koska sen puoliintumisaika kohoaa 5-kertai-seksi verrattuna villityyppiseen entsyymiin.

Negatiivisena kontrollina LYS-100 mutatoitiin arginiinik-si, jolloin oli odotettavissa, että kuten jo aikaisemmin mainittiin, uuden tähteen huono steerinen sijoittuminen johtaisi stabiliteetin huononemiseen vaikkakin ilman vaikutusta entsymaattiseen aktiivisuuteen.

3. Lysiini-100 —> arginiiniksi gdDNA:n rakentamiseksi käytettiin pMc5-I:n suurta Kpnl-Aatll-fragmenttia ja seuraavaa oligonukleotidialuketta: 5'-CCGCCGTCCCGGAACACCGG- 3' • · K100R-GI:n spesifinen aktiivisuus oli 22 yksikköä per substraattina käytetty ksyloosi. Näin se on verrattavissa villityyppisen EcoAmi(DSM)-GI:n aktiivisuuteen (24,5 yksikköä per mg). Tämän mutanttientsyymin lämpöinaktivoi- 40 1 0 2 5 41 tuminen tapahtui kuitenkin noin 100 kertaa nopeammin, kD = 0,3 min-1 50 mM EPPScssä, jonka pH oli 7,5 84 1C:ssa ja joka sisälsi 5 mM MgS04:ää.

4. Lysiini-294 —> arqiniinlksi gdDNArn rakentamiseksi käytettiin pMc5-I:n suurta XhoI-Smal-fragmenttia ja seuraavaa oligonukleotidialuketta: 5 1-GGGACGGCCGGTAGTCGAAG-3'

EcoAmi(DSM)-GI-mutantti, K294R, ilmentyi hyvin ja sen ent-symaattinen aktiivisuus oli 85 % villityyppisestä, kun substraattina oli ksyloosi (taulukko 3).

Tämän mutantin termostabiliteetti testattiin 50 mM:ssa (N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N'-2-etaanisulfonihappoa) (EPPS), jonka pH oli 7,5 ja jossa oli 5 mM MgS04:ää, lämpötilojen vaihdellessa 82 °C:sta 92 °C:seen. Taulukossa 4 on esitetty puoliintumisajat tunneissa K294R:lle, tulokset osoittavat, että tällä lämpötila-alueella K294R:llä on suunnilleen sama stabiliteetti kuin villityyppisellä entsyymillä.

„ 102541

Taulukko 3

Villityyppisen (VT) 1a mutantti-EcoAmi(DSM)-GI:n katalyyttiset parametrit substraatteina joko D-ksyloosi (kytketty testi) tai D-qlukoosl

Spa = tuotteen (D-ksyluloosi tai D-fruktoosi) spesifinen aktiivisuus mikromooleissa per minuutti (yksikkö) per entsyymi-mg

Vmaks. on ilmoitettu yksiköissä per entsyymi-mg Km on Michaelis-vakio, joka ilmoitettu mM:ssa ND = ei määritetty (not determined)

Ksyloosi Glukoosi sPa vmaks. Km vmaks. Km VT-GI 24,5 24,2 4,8 34,8. 290 K253R 30,0 24,6 5,3 27,2 177 K253Q 23 15,1 4,4 29,2 210

K100R 22,2 ND ND ND ND

K294R 20,5 13,8 4,5 25,8 187 G70S;A73S;G74T 28 24,9 5,3 39,2 235 1 · 42 1 0 2 5 41

Taulukko 4

Glukoosi-isomeraasin villityyppisen ja muunnettujen mu-tanttlen inaktivoitumien 50 mM:ssa EPPS:ää, jonka pH on 7,5 84 eC:ssa ja joka sisältää 5 mM MgS04:ää

Puoliintumisaika on aika, joka vaaditaan kokonaisentsyymi-aktiivisuuden alenemiseksi 50 %:lla.

Lämpötila 82 84 86 88 90 92 (eC) VT-GI 11,85 3,80 1,07 0,25 0,080 0,032 K253R 17,65 4,17 1,11 0,32 0,094 0,037

K294R 9,39 1,57 0,43 0,14 0,056 ND

G70S;A73S;G74T 22,88 4,83 1,21 0,31 0,093 0,032

Esimerkki 5

Glukoosi-isomeraasin stabilointi mutaatioilla monomeerissa

Vaikka mutaatioiden, jotka voisivat parantaa monomeeriala-yksikön stabiliteettia, huomioonottaen esimerkki 2, ei arvella kovin todennäköisesti vaikuttavan glukoosi-isomeraasin tetrameeriseen stabiliteettiin, eräitä mutaatioita tässä suhteessa on suoritettu. Kolme tähdettä glukoosi-isomeraasimonomeerin 8-säikeisen β-lieriön helixistä B mu-tatoitiin tarkoituksena stabiloida tämä a-helix ja epäsuorasti stabiloida monomeeri. Glysiini 70 mutatoitiin serii-niksi, alaniini 73 mutatoitiin seriiniksi ja glysiini 74 mutatoitiin treoniiniksi.

• · gdDNA:n rakentamiseksi käytettiin pMc5-I:n suurta Kpnl-Aatll-fragmenttia ja seuraavaa oligonukleotidialuketta: 5 ' - GCCTTCTTGAAGGTCGAGATGATGGAGTCGCGG - 3 ' 43 102541

EcoAmi(DSM)-GI-mutantti G70S;A73S;G74T, ilmentyi hyvin ja sen spesifinen aktiivisuus oli 28 yksikköä per mg (115 % villityyppisestä), kun substraattina oli ksyloosi (taulukko 3 ) .

Tämän mutantin termostabiliteetti testattiin 50 mM:ssa (N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N' -2-etaanisulfonihappoa) (EPPS), jonka pH oli 7,5 ja jossa oli 5 mM MgS04:ää, lämpötilojen vaihdellessa 82 *C:sta 92 eC:seen. Taulukossa 4 on esitetty puoliintumisajat tunneissa G70S;A73S;G74T:lle; tulokset osoittavat, että tällä lämpötila-alueella ja käytetyissä olosuhteissa G70S;A73S,G74T on pysyvämpi kuin villityyppinen entsyymi ja myös pysyvämpi kuin mutantti-K253R.

Esimerkki 6

Villityyppisen ja mutantti-A.missouriensis-qlukoosi-isome-raasin valmistaminen ja puhdistaminen käytön testaamiseksi A.missouriensis-qlukoosi-isomeraasin tuottamiseksi E.co-li'ssa, käytettiin hyväksi yksinomaan ilmentymisyksikköä pMa-tyyppisellä vektorilla.

Glukoosi-isomeraasi vajavaisen E♦coli-kannan K527 (thi, * thr, leu, tonA, IacY, supE, xylA, rK-mK+) transformantte- ja, jotka sisältävät A.missouriensis-glukoosi-isomeraasi-geenin, joka koodittaa villityyppistä proteiinia tai haluttua mutanttiproteiinia, kasvatettiin kasvatusalustassa, jossa oli: hiivauutetta (20 g/1), Bacto-tryptonia (40 g/1), kasaminohappoja (4 g/1), NaCl:ää (10 g/1) ja ampi-silliinia (100 mg/1), 16 tunnin ajan 37 eC:ssa. Sentrifu-goimisen jälkeen solut suspendoitiin uudestaan mahdollisimman pieneen tilavuuteen puskuria, joka sisälsi 20 mM Tris:ä, 10 mM EDTA:ta, 50 mM glukoosia ja jonka pH oli 8,0. Sen jälkeen lisättiin lysotsyymiä lopulliseen kon- 44 1 0 2 5 41 sentraatioon, joka oli 1,5 g/1. Inkuboitiin 37 eC:ssa 30 minuuttia, jonka jälkeen suspensio kuumennettiin 70 °C:seen 30 minuutissa. Seuraavaksi suspensio jäähdytettiin huoneen lämpötilaan ja siihen lisättiin MgCl2:ta ja Dnaselrtä niin, että lopulliset konsentraatiot olivat 20 mM ja vastaavasti 1,5 mg/1 ja inkuboitiin 37 eC:ssa toiset 30 minuuttia. Solujen jäännökset saostettiin sentrifugoi-malla ja supernatantti dialysoitiin 50 mM Trisrä (pH 7,5) vastaan yön yli.

Esimerkki 7

Villityyppisen ja mutanttiqlukoosi-isomeraasin immobilisointi

Entsyymiliuos voidaan immobilisoida ioninvaihtohartsille. Ennen jokaista koetta ioninvaihtohartsit regeneroidaan käsittelemällä hartsi 0,5 N NaOH-liuoksella (>10 pakatun kolonnin tilavuudella), vedellä (kunnes pH on <8), 10%:isel-la NaCl-liuoksella (> 10 pakatun kolonnin tilavuudella) ja vedellä (> 20 pakatun kolonnin tilavuudella). Glukoosi-isomeraasin immobilisoimiseksi hartseiksi valittiin hartsit Lewatit MP500A (Bayer) ja Amberlite IRA 904 (Röhm & Haas). Entsyymin adsorptio näille anioninvaihtohartseille * tapahtuu erittäin tehokkaasti. Entsyymin adsorboituneen määrän ja käytetyn kolonnin aktiivisuuden välillä vallitsee lineaarinen suhde.

10 g anioninvaihtohartsia (Cl“-muoto) laitetaan 50 ml:aan puskuria (50 mM Tris.HCl, pH 7,5). Puhdistettu glukoosi- « isomeraasi lisätään ja annetaan sitoutua yön yli 4 °C:ssa kokonaistilavuuden ollessa 100ml 50 mM Tris.HCl-puskuria (pH 7,5).

45 1 0 2 5 41

Esimerkki 8

Villityyppisen ja mutanttiqlukoosi-isomeraasin käyttötes-taus

Immobilisoidun glukoosi-isomeraasin ja sen mutantin alkuperäinen aktiivisuus ja stabiliteetti määritettiin mittaamalla pumppuamisnopeus 45 %:n muuttumisella ajan funktiona R. van Tilburgin mukaan (väitöskirja: Engineering aspects of Biocatalysts in Industrial Starch Conversion Technology, Delftse Universitaire Pers, 1983). Tästä voidaan laskea KQ ja k^. KQ, näennäisesti ensimmäisen kertaluvun re-aktionopeusvakio, on entsyymiaktiivisuuden mitta k^, ensimmäisen kertaluvun hajoamisvakio, on entsyymin stabiliteetin mitta. Vaikka k^in laskeminen on kuvattu ainoastaan gelatiini-immobilisoidulle glukoosi-isomeraasille (R. van Tilburg, ibid.), samoja laskelmia voidaan käyttää hartsi-immobilisoidulle glukoosi-isomeraasille. Kokeelliset olosuhteet olivat: lämpötila: 70 eC; reaktori: alaspäin vir-taava, pakattu kolonni; substraatti: 3 M glukoosi, 3 mM MgS04, 3 mM Na2S03; muuttuminen: 45%: .resti fruktoosiksi; pH 7,5 (mitattu 35 °C: ssa); Ca: <3 ppm. Tulokset k^:lle on esitetty taulukossa 5.

• « * 46 1 0 2 5 41

Taulukko 5

Hajoamisvakiot villityyppiselle ja mutanttiqlukoosi-isome-raasille, jotka on immobilisoitu erilaisille hartseille kd (x 106 s-1) kd (x 106 s-1)

Lewatit Amberlite VT 2,7 2,4 K253R 1,0 0,7 K294R 2,8 2,9 K253Q ND 3,7 (G7 OS;A7 3S;G74Y) 2,0 2,1

Huomautus: Sekä villityyppinen (VT) että mutanttientsyymi tuotettiin, puhdistettiin ja immobilisoitiin esimerkeissä 6 ja 7 esitetyn kuvauksen mukaisesti.

Taulukosta 5 voidaan päätellä, että sekä mutantti K253R että G70S;A7 3S;G74T omaavat huomattavasti parannetun stabiliteetin 70 eC:ssa suoritetussa käyttökokeessa. Nämä tulokset voidaan kääntää hyvin täsmällisesti tuloksiksi, jotka tullaan saavuttamaan, jos testit suoritetaan teollisuudessa tavallisesti käytetyssä lämpötilassa (R. van Tik-burg, ibid.).

Mutantin K253Q alhainen teho on osoitus emäksisen tähteen . , tärkeydestä asemassa 253, kuten jo todettiin in vitro-ko- keistä, jotka kuvattiin esimerkissä 4. Glutamiinimutantti ei luultavasti muodosta yhtään vetysidosta, jonka vuoksi dimeeri-dimeeri-kontakti destabiloituu.

Samalla tavalla K294R-mutantilla on jonkin verran alhaisempi stabiliteetti kuin villityyppisellä entsyymillä in vitro-kokeissa saatujen tulosten perusteella.

47 102541

Edellä esitetyt tulokset osoittavat, että glukoosi-isome-raasin dimeeri-dimeeri-rajapintakontaktin paraneminen voi johtaa entsyymiin, jonka käyttäytyminen teollisissa sovellutuksissa on ylivoimainen. On selvää, että muut tähteet, jotka osallistuvat rajapintakontakteihin, voi alan ammattimies myös valita. Tähteet, jotka ovat herkkiä kemialliselle modifikaatille tai joilla ei havaita optimaalista vetysitoutumista, voidaan korvata muilla aminohapoilla tässä selityksessä esitetyillä menetelmillä.

Yllättäen mutaatioilla, joiden tarkoituksena on stabiloida monomeerinen alayksikkö, havaitaan myös positiivinen vaikutus tetrameeristabilisaatiossa, kuten osoittavat k^_ -arvot, jotka havaittiin mutantille G70S;A73S;G74T.

Yritettäessä rationalisoida näitä tuloksia, tulisi pitää mielessä, että glysiinitähteiden substituutio a-helixissä voi johtaa proteiinin laskostumattoman tilan entropian alenemiseen ja antaa siten proteiinille enemmän vastustuskykyä reversilbelille avautumiselle ja denaturoitumiselle (Proteins, 1 (1986) 43-46). Näin tehtäessä glukoosi-isome-raasin herkkyys (osittain) avautuneen proteiinin kemialliselle modifikaatiolle (ja siitä syystä irreversiibelille denaturaatiolle) voisi olla merkittävästi alentunut johta-en termostabiilimpaan entsyymiin. Vaihtoehtoisesti voidaan tarkastella sitä seikkaa, että mutaatiot, jotka insertoi-tiin mutanttiin G70S;A73S;G74T, ovat kaikki enemmän hydro-fiilisia luonteeltaan ja siitä syystä tuskin ovat edullisia helixin B altistetulle pinnalle. Tämä voi sellaisenaan johtaa monomeerin lisääntyneeseen stabiliteettiin rever-siibeliä avautumista vastaan. Kuten edellä esitettiin, • · tämä voi alentaa tetrameerisen proteiinin herkkyyttä irreversiibeliä denaturaatioa vastaan.

Mutaatiot, jotka esitetään tässä esimerkissä, voidaan aikaansaada samalla tavalla glukoosi-isomeraasin kaikissa 48 102541 α-helixeissä. Helixalueet määritettynä A.missourienis-glukoosi-isomeraasin 3D-rakenteesta (F.Rey et al. ibid.) ovat asemissa: αΐ 35-47, α2 64-80, α3 108-128, α4 150-173, α5 195-206, α6 227-239, α7 264-276, α8 300-328. Glysiini-tähteiden substituutiota, hydrofobisten tähteiden liittämistä ja proliinitähteiden liittämistä a-helixin aminopää-hän voidaan tarkastella.

Molemmat suoritetut mutaatiot K253R ja G70S;A73;G74T johtavat parannettuun lämpöstabiliteettiin verrattuna villi-tyyppiseen glukoosi-isomeraasiin. Kuitenkin käyttötes-teissä mutantti-K253R todetaan pysyvämmäksi kuin mutantti-G70S;A73S; G74T vastoin in vitro kokeiden tuloksia, jotka on kuvattu esimerkissä 4. Tämä voidaan nähdä heijastuksena siitä, että laboratorio-olosuhteissa saadut tulokset ovat ainoastaan tietyssä määrin ennustavia entsyymin teholle käyttöolosuhteissa. Mahdollisesti käyttöolosuhteissa käytetty korkea glukoosikonsentraatio ja glykosulaatioproses-si, joka on riippuvainen glukoosikonsentraatiosta, ovat syynä tähän ilmiöön.

Esimerkki 9

Mutanttiqlukoosi-isomeraasin ominaisuudet eri pH-arvoissa 49 102541 rinnakkaisena. Näin K253R-mutantilla voidaan todeta olevan teollisessa käytössä ei ainoastaan ylivoimainen käyttäytyminen korkeassa lämpötilassa (suurempi muuttumisnopeus) vaan myös alhaisemmassa pH-arvossa (fruktoosituotteen parempi stabiliteetti).

Esimerkki 10

Muista bakteerikannoista saatujen glukoosi-isomeraasiqee-nien kloonaus 1a sekvenointi

Eri bakteereista peräisin olevan glukoosi-isomeraasin aminohapposekvenssi-informaation saamiseksi, glukoosi-isome-raasia koodittavat geenit eristettiin vastaavien bakteerien kromosomista molekyylikloonaamalla E.coli1 in.

Seuraavat bakteerit, joista useiden tiedetään tuottavan teollisesti käytettyjä entsyymejä, valittiin tähän tarkoitukseen : - Arthrobacter-laj it - Streptomyces violaceroruber LMG 7183 - Streptomyces thermovulqaris DSM 40444 - Streptomyces murinus DSM 40091 - Ampullariella-laj it ATCC 31351 * Kaikkien mainittujen lajien kromosomi-DNA eristettiin ja puhdistettiin pääasiallisesti kuten Hopwood (ibid) kuvaa.

Arthrobacter1 in, S.violaceoruber·in ja Ampullariella1 n osittainen katkaisu restriktioendonukleaasilla Sau3AI ja muodostuneiden fragmenttien kloonaus E.coli'iin suoritet-tiin täsmälleen kuten kuvattiin esimerkissä l A.missouri-ensis1 lie. Kromosomi-DNA kannoista S.murinus ja S.thermovulqaris katkaistiin täydellisesti Pstl:llä, jonka jälkeen ligoitiin pECOR251:teen esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.

50 102541

Pesäkkeet, jotka sisälsivät halutun glukoosi-isomeraasi-geenin, todettiin pesäkehybridisaatiolla, jossa käytettiin A.missouriensls-qlukoosi-isomeraasiqeenistä saatavaa 712 emäsparin Mlul-restriktiofragmenttia tai 853 emäsparin SacII-restriktiofragmenttia, joka sijaitsee S.violaceoru-ber-glukoosi-isomeraasigeenissä.

Yhdistelmäplasmidit, jotka sisälsivät eri bakteereiden glukoosi-isomeraasigeenit, karakterisoitiin edelleen restriktiokartoittamalla, kuten on kuvattu A.missourien-sis-glukoosi-isomeraasigeenille. Proteiinia koodittavien alueiden nukleotidisekvenssianalyysi suoritettiin käyttäen kemiallista menetelmää, jonka ovat esittäneet Maxam ja Gilbert (ibid).

Klooni, joka sisälsi S.thermovulqaris-glukoosi-isomeraasi-geenin, osoittautui epätäydelliseksi, tästä syystä ainoastaan koodittava sekvenssi aminohappoon 346 asti (ekvivalentti A.missouriensis-qlukoosi-isomeraasin aseman 351 kanssa) on esitetty.

On syytä huomata, että Ampullariella sp.-glukoosi-isome-raasin aminohapposekvenssi eroaa julkaistusta sekvenssistä siten, että julkaistun sekvenssin proliinin 177 todettiin " olevan arginiini.

Tämän esimerkin tulokset on esitetty kuviossa 21, jossa aminohapposekvenssit, jotka on päätelty tunnetuista nuk-leotidisekvensseistä, on asetettu sopivasti vierekkäin keskinäisen homologian maksimaaliseksi osoittamiseksi.

« · si 102541

Esimerkki 11

Ampullariella sp.-glukoosi-isomeraasin ilmentäminen -ja mutaqenointi

Ampullariella sp.-glukoosi-isomeraasin ilmentämiseksi E.coll1ssa, käytettiin hyväksi tehokasta ilmentymisyksik-köä, joka jo oli saatavilla A.missouriensis-qlukoosi-iso-meraasille. Itse asiassa A.missouriensis-ilmentymisvektori mutatoitiin käyttäen restriktiofragmentteja, jotka olivat peräisin Ampullariella sp.-glukoosi-isomeraasigeenistä, kattaen näiden kahden geenin, koodittavien alueiden kaikki nukleotidierot ja siitä seuraavat aminohappoeroavaisuudet; muodostettiin aukkoja sisältävä kaksoismolekyyli, jossa oli pMa-I:n yksisäikeinen DNA ja pMPc-l:n 4107 emäsparia käsittävä BstEII/NcoI-fragmentti, 124 emäsparia käsittävä BstEII/ ApaLI-fragmentti ja 1059 emäsparia käsittävä ApaLI/BssHII-fragmentti, kaksi viimeksi mainittua fragmenttia johdettiin Ampullariella sp.-glukoosi-isomeraasi-geenistä. Menetelmää jatkettiin pääasiallisesti esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, mukaan lukien geenin uudistetun nukleotidisekvenssin määrittäminen ei-toivottujen muutosten tarkistamiseksi. Näin oikea plasmidi löydettiin ja nimettiin pMc-GIampl:ksi.

Aminohapposekvenssivertailu osoitti, että Ampullariella-glukoosi-isomeraasi, kuten A.missouriensis-qlukoosl-isome-raasi, sisältää lysiinitähteen ekvivalentissa asemassa 253. Tästä johtuen Ampullariella sp.-glukoosi-isomeraasin mutantti, jossa lysiini (K) asemassa 253 korvattiin argi-niinilla (R), muodostettiin käyttäen aukkoja sisältävää kaksoismolekyyliä, joka oli muodostettu emäspariuttamalla yksisäikeinen pMc-GIampl-DNA BamHI/Hindlll:11a katkaistun pMa-GIampl:n kanssa, ja fosforyloitua mutageenista oligo-nukleotidia: 52 102541 5 ' -AGGTCCTGGTCGAACCGCGGGCCGTGCTGG- 3 '

Menetelmä, joka seuraa emäspariuttamisvaihetta, t.s. muodostuneen mutantin valitseminen ja analyysi, suoritettiin täsmälleen esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.

Esimerkki 12

Streptomyces murlnus-qlukoosi-isomeraasin ilmentäminen ja paikkaan kohdistettu mutaqenointi

Streptomyces murinus-glukoosi-isomeraasiqeenin ilmentäminen suoritettiin sijoittamalla geeni plasmidin pMaT5 Tac-promoottorin alapuolelle. pMaT5 on plasmidin pMa5PR johdannainen, jossa lambda PR-promoottori on korvattu säädettävällä Tac-promoottorilla (H. de Boer Proc.Natl.Acad.Sci. USA 6£ (1983) 21). Tämän ilmentymisvektorin rakenne on esitetty kuviossa 15a/c.

1280 emäsparia käsittävä BstXI/MluI-restriktiofragmentti, joka sisälsi täydellisen Streptomyces murinus-glukoosi-isomeraasigeenin, käsiteltiin DNA-polymeraasi I:llä (Klenow-fragmentilla) fragmentin reunojen päiden tasaamiseksi ja sen jälkeen ligoitiin plasmidiin pUC19. Seuraa-vaksi geeni taas leikattiin käyttäen BamHIitä ja HindIII:a ” ja insertoitiin BamHI/Hindu:llä katkaistuun pMc5T:hen.

Muodostunut plasmidi nimettiin pMc-GIsmul:ksi. Streptomy-ces murinus-qlukoosi-isomeraasin nukleotidi- ja siitä päätelty aminohapposekvenssi ja ilmentymisyksikön rakenne on esitetty kuvioissa 19 ja vastaavasti 20.

V Myös S.murinus-glukoosi-isomeraasilla on lysiinitähde pro- • · teiinisekvenssin asemassa 253, joka on ekvivalenttinen A.missourlensis-K253:lle. Mutaatio, joka johtaa lysiinin 253 (K) korvautumiseen arginiinilla (R) Streptomyces muri-nus-glukoosi-isomeraasissa, suoritettiin käyttäen aukkoja 53 102541 sisältävää kaksoismolekyyliä, joka muodostui yksisäikei-sestä pMc-GIsmul-DNA:sta ja BamHI/HindIII:lla katkaistusta pMa5T:stä, ja fosforyloitua, mutageenista oligonukleoti-dia: 5' -GGTCCTGGTCGTACCGGATGCCGGACTGG- 3 '

Menetelmä, joka seurasi emäspariuttamisvaihetta, t.s. muodostuneen mutantin valinta ja analyysi suoritettiin pääasiallisesti esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.

On selvää, että keksintö ei rajoitu edellä ehdotettuihin ja kuvattuihin mutaatioihin. Vaikka edellä mainittua keksintöä on kuvattu joissain yksityiskohdissa kuvaavin esimerkein, tarkoituksena selventää ymmärrettävyyttä, on selvää, että tiettyjä muutoksia ja modifikaatioita voidaan soveltaa liitteenä olevien vaatimusten piirissä.

* » i «

Claims (16)

54 102541

1. Modifioitu glukoosi-isomeraasi, joka on peräisin Ac-tinoplanes-lajista ja jolla on korkeampi konversioteho 5 ja/tai parantunut stabiilisuus vakiokäyttöolosuhteissa verrattuna villityyppiseen Actinoplanes-lajin glukoosi-isomeraasiin, tunnettu siitä, että mainittu modifioitu glukoosi-isomeraasi sisältää aminohapposekvenssin, joka eroaa mainitusta villityyppisen Actinoplemes-lajin glukoo-10 si-isomeraasin sekvenssistä siten, että ainakin yksi lysii-ni on korvattu arginiinilla, jolloin mainittu korvaaminen ei muuta glukoosi-isomeraasiaktiivisuutta.

2. Modifioitu glukoosi-isomeraasi, joka on peräisin Ac-15 tinoplanes-lajista ja jolla on korkeampi konversioteho ja/tai parantunut stabiilisuus vakiokäyttöolosuhteissa verrattuna villityyppiseen Actinoplanes-lajin glukoosi-isomeraasi in, tunnettu siitä, että mainittu modifioitu glukoosi-isomeraasi sisältää aminohapposekvenssin, joka 20 eroaa mainitusta villityyppisen Actinoplanes-lajin glukoo-si-isomeraasin sekvenssistä siten, että ainakin yksi aminohappo on korvattu eri aminohapolla, jolloin mainittu korvaaminen käsittää Gly70:n korvaamisen Ser70:llä, Ala73:n korvaamisen Ser73:lla tai Gly74:n korvaamisen Thr74:llä ja 25 jolloin mainittu korvaaminen ei muuta glukoosi-isomeraasi-aktiivisuutta.

3. Modifioitu glukoosi-isomeraasi, joka on peräisin Ac-tinoplanes-lajista ja jolla on multimeerirakenne, jonka 30 mainitun rakenteen kunkin monomeeriyksikön aminohapposek-: venssi eroaa vastaavan villityyppisen Actinoplanes-lajin -* glukoosi-isomeraasista siten, että ainakin yksi aminohappo on korvattu eri aminohapolla, tunnettu siitä, että korvataan Actinoplanes-lajista peräisin olevan glukoosi-isome-35 raasin sekvenssin ainakin yksi varauksen omaava aminohappo vastakkaisen varauksen omaavalla aminohapolla suolasillan : muodostamiseksi multimeerirakenteessa, jolloin mainittu 102541 korvaaminen ei muuta glukoosi-isomeraasiaktiivisuutta, ja mainitulla glukoosi-isomeraasilla on korkeampi konversiote-ho ja/tai parantunut stabiilisuus vakiokäyttöolosuhteissa verrattuna mainittuun vastaavaan villityyppiseen Actinopla-5 nes-lajin glukoosi-isomeraasiin.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen modifioitu glukoosi-isomeraasi, tunnettu siitä, että parantunut vuorovaikutus saa aikaan entsyymin parantuneen lämpötilastabii- 10 lisuuden.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen modifioitu glu-koosi-isomeraasi, tunnettu siitä, että parantuneen vuorovaikutuksen ansiosta entsyymi tulee resistentimmäksi subst- 15 raattimolekyylien kovalenttiselle sitoutumiselle.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen modifioitu glukoosi-isomeraasi, joka (1) on monomeerinen entsyymi, joka sisältää ainakin 20 kaksi aluetta tai oligomeerinen entsyymi, joka muodostuu ainakin kahdesta alayksiköstä, joista osa tai kaikki mahdollisesti myös sisältävät alueita, ja jossa (2) mainitut alueet, tai sen ollessa tarkoituksenmu- 25 kaista, alayksiköt, sisältävät kohdat, joissa liuottimen luoksepäästävyys on alhainen, (3) eräät mainituista kohdista sisältävät aminohappotähteitä, jotka ovat osallisina elektrostaattisessa vuorovaikutuksessa muiden kohtien toisten aminohap- 30 potähteiden kanssa, tunnettu siitä, että mainittu kohta, joka sisältää mainitun korvaavan aminohappotähteen, on samanaikaisesti yksi mainituista kohdista, joissa liuottimen luoksepäästävyys on alhainen. 35

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen modifioitu glukoosi-isomeraasi, tunnettu siitä, että se on peräisin 56 102541 Actinoplanes missouriensiksesta.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen modifioitu glukoosi-isomeraasi, tunnettu siitä, että mainitun glukoo-5 si-isomeraasin aminohapposekvenssi on ainakin 65%:isesti homologinen villityyppisen Actinoplanes missouriensis -kannasta peräisin olevan glukoosi-isomeraasin aminohapposekvenssin kanssa.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen modifioitu glukoosi-iso meraasi, tunnettu siitä, että ainakin Lys253 on korvattu Arg253:11a.

10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukainen modifioitu 15 glukoosi-isomeraasi, tunnettu siitä, että sillä on parantunut termostabiilisuus vakiokäyttöolosuhteissa verrattuna vastaavaan villityyppiseen entsyymiin.

11. Jonkin patenttivaatimuksista 1-10 mukainen modifioitu 20 glukoosi-isomeraasi, tunnettu siitä, että sillä on parantunut stabiilisuus eri pH-arvoissa verrattuna vastaavaan villityyppiseen entsyymiin.

12. Immobilisoitu glukoosi-isomeraasi, tunnettu siitä, että 25 se sisältää jonkin patenttivaatimuksista 1-11 mukaisen modifioidun glukoosi-isomeraasin.

13. Jonkin patenttivaatimuksista 1-12 mukaisen modifioidun glukoosi-isomeraasin käyttö fruktoosisiirappien tuottami- 30 seksi.

14. Menetelmä patenttivaatimuksen 3 mukaisen modifioidun glukoosi-isomeraasin tuottamiseksi, jolla on multimeerira-kenne, jonka kussakin monomeerissa on aminohappo, joka 35 eroaa vastaavan lähtöaineena käytetyn glukoosi-isomeraasi-entsyymin vastaavasta aminohaposta, ja jolla on parantunut vuorovaikutus, tunnettu siitä, että 102541 a) otetaan lähtöaineena käytettävä glukoosi-isomeraasi, jolla on aminohappotähde sellaisessa kohdassa, jossa voidaan steerisesti korvata yksi aminohappotähde eri aminohappotähteellä ilman että muutetaan lähtöaineena 5 käytetyn glukoosi-isomeraasin biologista aktiivisuutta, b) korvataan ainakin yksi aminohappo eri aminohapolla, jolloin mainittu korvaaminen ei muuta glukoosi-isome-raasiaktiivisuutta, jolloin mainitulla modifioidulla glukoosi-isomeraasilla on parantunut vuorovaikutus, 10 mikä johtaa parantuneeseen konversioon ja stabiilisuu- teen.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että parantunut vuorovaikutus saa aikaan entsyymin 15 parantuneen lämpötilastabiilisuuden.

16. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että parantuneen vuorovaikutuksen ansiosta entsyymi tulee resistentimmäksi substraattimolekyylien kovalentti- 20 selle sitoutumiselle. « · 58 102541