HU211735B - Method for obtaining macrocyclic amino-phosphonic acid complexes - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás leképezőszerekként alkalmazható makrogyűrűs aminofoszfonsav-komplexek előállítására és ezeket tartalmazó készítmények.

Az elmúlt öt évben a paramágneses fémionok komplexeire különös figyelmet fordítottak, különösen annak a képességüknek, hogy javítják a betegekről mágneses rezonancia leképezéssel (MRI) kapott képet. Ezt a felhasználási módot tekintve az érdeklődésre elsősorban számot tartó kelátképzők az amino-karboxilát-analógok, például a dietilén-triamin-pentaecetsav (DTPA), amely jelenleg az Amerikai Egyesült Államokban a kereskedelmi forgalomban kapható egyetlen MRI gyógyászati készítmény (MAGNEVIST^R, a Schering cég terméke). Az MRI céljára való felhasználás szemponjából elsődlegesen érdeklődésre számot tartó fémek a gadolinium (Gd⁺³), vas (Fe⁺³) és mangán (Mn⁺²) vagy Mn(⁺³) paramágneses ionok. Ezek az ionok hatásosan csökkentik a víz relaxációjának értékét annak folytán, hogy a kelátban lévő fémmel erős dipoláris kölcsönhatásba lépnek.

Egy paramágneses kelátnak ahhoz, hogy MRI kontrasztanyagként alkalmazható legyen, a különböző szövetekben meg kell változtatnia a víz relaxációs értékét, kinetikusán inertnek kell lennie, továbbá gyorsan el kell hagynia a szervezetet (a beinjektálást követően órákon belül). Napjainkban az 1,4,7,10-tetraazaciklododekán-l,4,7,10-tetraecetsavat (DOTA) (DOTAREM^r, a Guerbet cég terméke) alkalmazzák Európában MRI felhasználásra hatásos Gd kelátként, azonban ez a vegyület az Amerikai Egyesült Államokban még nem beszerezhető. A Gd-DOTA komplexekre vonatozó ismeretanyag a 4 877 600 és 4 855 363 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban található.

Arra a felismerésre jutottunk, hogy az 1,4,7,10tetraazaciklododekán-1,4,7,10-tetrametilén-foszfonsav (DOTMP) Gd kelátjai a DOTA-hoz hasonlóan viselkednek az MRI kontrasztanyagként való felhasználáshoz szükséges jellemzők szempontjából. A DOTMP kelátok kinetikusán rendkívüli mértékben inertek, biológiai megoszlásuk kedvező, továbbá fokozzák a víz relaxivitását.

A Magn. Reson. Med. 9(1) 94-104 (1989) szakirodalmi helyen [lásd még C.A. 111, 20 192c (1989)] metilén-karbonsav-származék Gd³⁺ komplexet ismertetnek. Ez a többi ismert komplexekhez hasonlóan általános eloszlású. így nem fajlagos egyetlen szövethelyre sem.

Az 1 098 937 A számú szovjet szerzői tanúsítványban az 1,4,7,10-tetrazaciklododekán-l,4,7,10-tetrametilén-foszfonsav Co(II), Cu(II), Cd(II), Pb(II) és La(III) komplexeit, írják le. Más fémekkel alkotott komplexeket nem ölel fel a fenti anterioritás, és a leírt vegyületek előnyeként csak azt említik, hogy a fenti vegyület az ismert komplexképző szereknél stabilabb komplexet képez a fenti kationokkal. A komplexek semmiféle alkalmazásáról nem esik szó.

A 375 376 számú közzétett európai szabadalmi bejelentésben a találmány szerinti ligandumok alkalmazását írják le lantanidasorozat radioaktív nuklidjaival alkotott komplexekként, ezeket a komplexeket csonttumorok kezelésére és csontfájdalmak enyhítésére alkalmazzák. A komplexek elmeszesedett helyekhez való kötődése, például csonthoz, áttételes és elsődleges csonttumorokhoz és meszeseden lágy szövetekhez való kötődése jobb, mint más szövetekéhez. Az elmeszesedett lágy szövetek létrejöhetnek szívroham folytán, ebben az esetben a károsodott szív-szövet meszesedik. Ezek a komplexek képesek arra, hogy a radionuklidot az elmeszesedett felületre szállítsák anélkül, hogy ehhez további ligandum szükséges lenne. így a komplexből kisebb dózis elegendő, és alacsonyabb fémtligandum arány is alkalmazható.

A makrogyűrűs aminofoszfonsavkomplexeket mágneses rezonancia-leképező (MRI) szerekként alkalmazzuk állatokban, az alkalmazott kompozíciók és készítmények hatóanyaga egy makrogyűrűs aminofoszfonsavval komplexszé alakított paramágneses nuklid.

Közelebbről, a találmány tárgya eljárás mágneses rezonancia leképezés diagnosztikai alkalmazásában állatok (köztük ember) vizsgálatára alkalmas komplexek előállítására és ezeket tartalmazó készítmények, amelyek a meszeseden helyeket megtalálják, és ott összegyűlnek.

A találmány szerinti (I) általános képletű komplexek összetevői:

(1) a (II) képletű makrociklusos aminofoszfonsav, a DOTMP vagy fiziológiás szempontból elfogadható sói, és egy paramágneses nuklid, M fémion, amely Gd³⁺ ion, és az (1) vegyület mólaránya az (2) fémionhoz legalább 1:1.

Az (I) képletű komplex előállítására egy (Π) képletű vegyületet oldott formában Gd³⁺-iont adó vegyülettel reagáltatunk vizes közegben, a pH 6,9-7,4-re való beállításával, a (II) képletű vegyület és a fém mólarányát legalább 1:1 értéken tartva.

A találmány szerint előállított komplex alacsonyabb dózisban és/vagy alacsonyabb ligandum:fém arány mellett alkalmazható, mint az ismert, a meszes helyeket megtaláló MRI szerek. A találmány szerint előállított komplex alkalmas arra, hogy a paramágneses nuklidot specifikusan a meszes felületre szállítsa a ligandumnak a fémionhoz viszonyított sztöchiometrikus vagy ezt megközelítő aránya mellett. A DOTMP komplexet célfajlagos volta rendkívül vonzóvá teszi MRI kontrasztanyagként, mivel ez a komplex a csont vagy a test bármely, elmeszesedett szöveteket tartalmazó helyének erősen kontrasztos leképezésére képes. Például alkalmas szív leképezésére, ahol a szívrohamot követően ismerten meszesedés következik be.

A találmány tárgyát képezik továbbá olyan készítmények, amelyek a fenti eljárásban alkalmazhatók, ezek a készítmények a (II) képletű makrociklusos aminofoszfonsav és a Gd³⁺ paramágneses nuklid komplexét tartalmazzák, továbbá tartalmaznak fiziológiás szempontból megfelelő hordozóanyagokat, segédanyagokat vagy vivőanyagokat.

Az ilyen készítmények előállítására szolgáló eljárás jól ismert. A készítmények sterilek, beadhatók szuszpenziók, injektálható oldatok vagy más, gyógyászati célra alkalmas készítmények formájában. Gyógyászati szempontból megfelelő szuszpendáló közeg alkalmazható segédanyagok egyidejű alkalmazásával vagy anélkül.

HU 211 735 Β

A találmány tárgyát képezik az olyan fenti készítmények is, amelyek a fenti komplexet egy vagy több olyan szerrel kombináltan tartalmazzák, amelyek ugyancsak MRI szerekként működnek.

Nem várt módon arra a felismerésre jutottunk, hogy az (I) képletű gyűrűs aminofoszfonsav komplex, a GdDOTMP kiválóan alkalmas arra, hogy a meszes helyeken jelenjen meg, mimellett alacsony a lágy szövetekben való megjelenése in vivő, alacsony ligandum:fém mólarány, például 1:1 ligandum:fém mólarány mellett. Ez ellentétes a Gd egyéb aminofoszfonátokkal alkotott komplexeinél tapasztaltakkal, például a Gd-EDTMP esetében I. K. Adzamli és mtsai [J. Med. Chem. 32, 139-144 (1989)] által tapasztaltakkal. A DOTMP komplexeknek a ritka földfémek iránti rendkívüli inertségét Sm-DOTMP kapcsán mutatták ki (lásd a 375 376 számú európai szabadalmi bejelentésben), és tudjuk, hogy a komplex 1:1 ligandum:fém mólarány mellett pH = 1 és pH = 13 között stabil. Ezzel ellentétben azt találtuk, hogy a Sm-EDTMP még 7:1 ligandum:fém mólarány mellett is csak pH 7 körül stabil, és alacsonyabb vagy magasabb pH-η a komplex bomlik. így az analógia alapján azonos viselkedés lenne várható egyéb ritkaföldfémionok, például gadolinium esetén is.

Bár nem kívánunk elméletet felállítani, úgy véljük, hogy a találmány előnyei abból származnak, hogy a Gd-DOTMP komplex kiváló in vivő cél szövet: nemcélszövet aránya a DOTMP és a Gd fémion komplex inertségének és nagy stabilitásának eredménye.

Közelebbről, a találmány szerinti készítmény alkalmazásával olyan diagnosztikai eljárás valósítható meg, amelyben állati test mágneses leképezését úgy végezzük, hogy az állatnak egy (I) képletű komplexet magában foglaló, a meszeseden helyeken összegyűlő készítményt adagolunk.

A komplexek adagolhatók megfelelő, gyógyászati szempontból elfogadható hordozóanyagokkal készült készítményeik formájában.

A találmány szempontjából „paramágneses nuklid” megjelölésen olyan fémiont értünk, amely spin szögmomentummal és/vagy orbitális szögmomentummal bír. A két momentum-típus kombinációja a megfigyelt paramágneses momentumot elsősorban a páratlan elektronthordozó atomtól függő módon, kisebb mértékben az atom környezetétől függő módon eredményezi. A találmány szerinti gyakorlatban hasznos paramágneses nuklidnak találtuk a gadolinium (Gd⁺³) iont.

A paramágneses nuklid és a ligandum bármely olyan körülmény mellett kombinálható, amely lehetővé teszi, hogy komplexet képezzenek. Általában mindössze az szükséges, hogy ezeket az összetevőket vízben. szabályozott pH mellett (amely pH a megválasztott ligandumtól és a paramágneses nuklidtól függő) elegyítsük. A komplex képződése kémiai kötés révén jön létre, és viszonylag stabil paramágneses nuklid kompozíciót eredményez, például a paramágneses nuklidnak a ligandumtól való disszociációja tekintetében stabil kompozíció jön létre.

A találmány szerint előállított komplexek alacsonyabb dózisban és/vagy alacsonyabb ligandum:fém arány mellett használhatók, mint az ismert, a meszeseden helyeken összegyűlő MRI szerek. A találmány szerint előállított komplexek a paramágneses nuklidot fajlagosan szállítják a meszeseden helyekre a ligandumnak a fémionhoz való mintegy sztöchiometrikus aránya mellett. A sztöchiometrikus aránynak - amelyet a találmány szerint előállított komplex tesz lehetővé az az előnye, hogy nagyobb mennyiségű fém szállítható a cél-meszes-szövethez.

A makrociklusos aminofoszfonsav-komplexek 1:1, előnyösen 1:1 és 3:1 közötti, még előnyösebben 1:1 és 1,5:1 közötti ligandum:fém mólarányban adagolva olyan biológiai megoszlást eredményeznek, amely a csontvázban felgyűlő kiváló szerekének megfelelő. Ezzel ellentétben bizonyos más, nem-makrociklusos aminofoszfonsav-komplexek felesleges mennyiségű ligandum alkalmazása esetén a lágy szövetekben (például májban) lokalizálódnak. A ligandum nagy feleslege nem kívánatos, mivel a komplexen kívüli ligandum az állatra toxikus lehet, vagy szívmegállást vagy hipokalcemiás görcsöket okozhat. Ezen kívül a makrociklusos aminofoszfonsav ligandumok akkor hasznosak, ha nagy mennyiségű fémbevitele szükséges. Ebben az esetben a makrociklusos aminofoszfonsav ligandumok képesek arra, hogy nagyobb mennyiségű fémet vigyenek be a csontba, mint amennyi azonos mennyiségű, nem gyűrűs aminofoszfonsav ligandummal bevihető.

Az aminofoszfonsavak számos ismert szintetikus eljárással előállíthatók. Különösen fontos a legalább egy reakcióképes amin-hidrogént tartalmazó vegyületnek karbonilvegyülettel (aldehiddel vagy ketonnal) és foszforossavval vagy származékával való reakciója. A makrociklusos aminofoszfonsavak előállítása során alkalmazott amin prekurzor (1,4,7,10-tetraazaciklododekán) a kereskedelmi forgalomban kapható anyag.

A karboxi-alkil-csoportot tartalmazó aminszármazékok előállítására szolgáló karboxi-alkilezési eljárás jól ismert (leírása a 3 726 912 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban található), hasonló módon ismertek azok az eljárások, amelyekkel az amin-nitrogénekre alkil-foszfonsav és hidroxi-alkil helyettesítők vihetők (3 398 198 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás).

A találmány szerint alkalmazott igandumot előnyösen a 375 376 számú közzétett európai szabadalmi bejelentésben leírt eljárással állítjuk elő, de más előállítási eljárások, például az 1 098 937 számú szovjet szerzői tanúsítványban leírt eljárás is használhatók.

A találmány szerinti komplexek és készítmények alkalmasak MRI kontrasztanyagokként való alkalmazásra, különösen amennyiben meszeseden helyek leképezésére szükségesek.

A készítmények előállítási eljárása jól ismert. A készítmények sterilek, lehetnek szuszpenziók, injektálható oldatok vagy más megfelelő, fiziológiás célra alkalmas készítmények. Alkalmazhatunk fiziológiás célra megfelelő szuszpendáló közegeket segédanyagok egyidejű alkalmazásával vagy anélkül. A steril készítmények alkalmasak arra, hogy ezeket állatnak adjuk be.

HU 211 735 Β

Az egyszerűbb megjelölés kedvéért a továbbiakban a (Π) képletű makrociklusos aminofoszfonsav-származékot „ligandum” vagy „kelátképző” néven említjük.

A leírásban „állat” megjelölésen melegvérű emlősöket értünk, ebben a körben az ember is benne foglaltatik, és olyan állatokat értünk a megjelölésen, amelyeknél diagnosztikai célú leképezés szükségessége áll fenn.

A találmány célját tekintve a leírt komplexeket és fiziológiás szempontból elfogadható sóikat egyenértékűnek tekintjük.

Fiziológiás szempontból elfogadható sókon azon bázisokkal alkotott sókat értjük, amelyek a ligandum legalább egy savcsoportjával képződnek, és amely sók nem okoznak jelentős káros fiziológiás hatást az állatnak a jó farmakológiai gyakorlatnak megfelelő dózisban adagolva. A megfelelő bázisok közé tartoznak például az alkálifém- és alkáliföldfém-hidroxidok, -karbonátok és -hidrogénkarbonátok, például a nátrium-hidroxid, a kálium-hidroxid, a kalcium-hidroxid, a kálium-karbonát, a nátrium-hidrogén-karbonát, a magnézium-karbonát; az ammónia és a primer, szekunder és tercier aminok.

A fiziológiás szempontból elfogadható sók előállíthatók az előzőekben ismertetett makrociklusos aminofoszfonsavnak megfelelő bázissal való kezelésével.

A találmány szerinti készítmények lehetnek a paramágneses nuklidot a ligandummal komplexben tartalmazó szilárd vagy folyékony készítmények. Ezek a készítmények lehetnek kit formájúak, így a komponenseket a használat előtt megfelelő időben elegyítjük. Függetlenül attól, hogy előre elegyített vagy kit formájú-e a készítmény, általában gyógyászati célra megfelelő hordozóanyagot alkalmazunk. Gyakran kívánatos az is, hogy a készítmény puffért tartalmazzon. A megfelelő pufferek közé tartoznak például a foszfát-, hidrogénkarbonát- és az N-2-hidroxi-etil-piperazin-N’-2-etánszulfonsav-puffer (HEPES).

A találmány szerinti injektálható készítmények szuszpenzió vagy oldat formájúak. A megfelelő készítmények előállításánál általában figyelembe vesszük, hogy a sók vízoldékonysága nagyobb, mint a szabad savaké. Az oldat formájú készítményeknél a komplexet (vagy kívánt esetben a külön komponenseit) gyógyászati célra alkalmas hordozóanyagban oldjuk. Ilyen hordozóanyagok például a megfelelő oldószerek, tartósítószerek, például benzilalkohol, és kívánt esetben pufferek. Alkalmas oldószerek például a víz, a vizes alkoholok, glikolok és foszfonát- vagy karbonátészterek. A vizes oldatok legfeljebb 50 térfogat% oldószert tartalmaznak.

A találmány szerinti injektálható szuszpenziók készítéséhez hordozóanyagként folyékony szuszpendáló közeget alkalmazunk segédanyaggal vagy anélkül. A szuszpendálószer lehet például vizes polifvinil-pirrolidon), inért olaj, például növényi olaj vagy erősen finomított ásványolaj vagy vizes karboxi-metil-cellulóz. A komplex szuszpenzióban tartásához használható megfelelő, fiziológiásán elfogadható segédanyagok például a sűrítőszerek, például a karboxi-metil-cellulóz, a poli(vinil-pirrolidon), a zselatin és az alginátok. Szuszpendálószerként számos felületaktív szer is hasznos, például a lecitin, az alkil-fenol, a poli(etilén-oxid) adduktumok, a naftalin-szulfonátok, alkil-benzolszulfonátok és a poli(oxi-etilén)-szorbitán-észterek. Az injektálható szuszpenziók készítésénél egyes esetekben hasznos lehet számos olyan anyag, amely a folyékony szuszpenzió hidrofób jellegét, sűrűségét és felületi feszültségét befolyásolja. Alkalmas szuszpendálószerek például a szilikon habzásgátlók, a szorbit és cukrok.

Ha a megfelelő kontraszt kialakításához vagy a diagnosztikai információhoz szükséges, a paramágneses nuklidok például Gd³⁺, Fe³⁺, Mn²⁺ vagy Mn³⁺ különböző kombinációi alkalmazhatók MRI szerekként egymást követően vagy egyidejűleg. Különböző paramágneses nuklidoknak a DOTMP ligandummal alkotott komplexét alkalmazva meggyőző diagnosztikai információkat nyerhetünk. A paramágneses nuklidok kombinációi komplexszé alakíthatók egyidejűleg, vagy két külön komplexszé alakított paramágneses nuklid elegyíthető vagy adagolhatunk külön két komplexszé alakított paramágneses nuklidot egymást követően is. A kompozíciók és készítmények beadhatók egyetlen dózisban, vagy hosszabb időtartam alatt több dózisban.

A találmány szerint előállított komplexek alkalmazhatók a komplex diagnosztikai hatását fokozó és/vagy adagolását könnyebbé tevő más hatóanyagokkal és/vagy összetevőkkel együtt. Különféle, a találmány szerin előállított komplexek minőségi biológiai eloszlását meghatározó vizsgálatokat végeztünk oly módon, hogy a készítményt patkányokba injektáltuk, és a beinjektálást követően 2 óra elteltéig különböző időpontokban mértük az állat teljes testének gamma-sugár képét.

A mennyiségi biológiai eloszlás meghatározására hím, nemanesztetizált Sprague Dawley patkányok farki vénájába 50-100 μΐ komplexet injektáltunk. A patkányokat ezután abszorbens papírral bélelt ketrecekbe helyeztük, hogy az állatok leölése előtt minden kiválasztott vizeletet összegyűjtsünk. Adott idő elteltével az állatokat a nyaki csigolya kimozdításával leöltük, és a különböző szöveteiket szétválasztottuk. A mintákat sóoldattal öblítettük, abszorbens papírral szárazra itattuk, majd mértük. A minták radioaktivitását Nal szcintillációs számlálóval mértük.

A vizsgálatokat a továbbiakban nem korlátozó példákban mutatjuk be közelebbről.

Kiindulási anyagok

A Példa

DOTMP előállítása

100 ml-es, háromnyakú, hőmérővel, visszafolyató hűtővel és fűtőköpennyel ellátott gömblombikba 3,48 g, 20,2 mmól 1,4,7,10-tetraazaciklododekánt és 14 ml vizet mérünk. Az oldathoz 17,2 ml tömény hidrogénkloridot és 7,2 g, 87,8 mmól foszforossavat adunk, és az elegyet 105 °C-ra melegítjük. A visszafolyató hűtő alatt forralt szuszpenziót erősen keverjük, és 1 óra időtartam alatt 13 g, 160,2 mmól, 37 tömeg%-os vizes formaldehidet csepegtetünk hozzá. Ez idő elteltével a reakcióelegyet további 2 órán át visszafolyató hűtő

HU 211 735 Β alatt forraljuk, majd a hőforrást eltávolítjuk, és az oldatot hagyjuk lehűlni, majd szobahőmérsékleten 62,5 órán át állni hagyjuk. A reakcióelegyet ezután vákuumban 40 ’C hőmérsékleten viszkózus, vörösesbarna, félszilárd anyaggá pároljuk be. A kapott anyaghoz 30 ml vizet adunk, ennek hatására az anyag először oldódni, majd ezt követően szilárdulni kezd. Ezután a teljes szuszpenziót 400 ml acetonba öntjük erős keverés mellett. A kapott piszkosfehér csapadékot vákuumban szűrjük, majd éjszakán át szárítjuk. így 97%-os hozammal 10,69 g nyers DOTMP-t nyerünk. Ebből a nyerstermékből 2,0 g, 3,65 mmól mennyiséget 2 ml vízben oldunk 700 μΐ, 10,0 μτηόΐ tömény ammónium-hidroxid 100 μΙ-es részletekben való adagolásával, az ammóniumhidroxiddal az oldat pH-ját 2-3-ra állítjuk be. Az oldatot egyszerre hozzáadjuk 4,5 ml, 13,5 mmól 3 n hidrogén-kloridhoz, alaposan összekeverjük, majd állni hagyjuk. 1 óra múlva apró, négyzetes kristályok kiválása indul meg az üvegen a folyadékfelszín alatt. További 111 órán át zavartalanul hagyjuk a kristályokat növekedni, majd a kristályokat finoman lerázzuk az edény faláról, szűrjük, majd négyszer mossuk egyenként 3-3 ml vízzel, végül a kristályokat levegőn tömegállandóságig szárítjuk. így 60%-os hozammal 1,19 g fehér, kristályos, szilárd DOTMP-t nyerünk.

B Példa

DOTMP előállítása

250 ml-es, háromnyakú gömblombikba 6,96 g, 0,04 mól 1,4,7,10-tetraazaciklododekánt mérünk. A lombikba ezután 14,5 g, 0,177 mól foszforossavat, 30 ml ionmentes vizet és 28 ml, 0,336 mól tömény hidrogénkloridot adunk.

A lombikot visszafolyató hűtőhöz csatoljuk, keverőpálcát helyezünk bele, hőmérővel és hőmérsékletszabályozóval látjuk el. Csepegtetőtölcsérbe 26,0 g, 0,32 mól 37%-os vizes formaldehid-oldatot töltünk, és a tölcsért a lombikhoz csatlakoztatjuk. Ezután a lombik tartalmát erős keverés mellett forrásba hozzuk (mintegy 105 ’C). A formaldehid-oldatot mintegy 30-40 perc alatt a lombikba csepegtetjük. Az oldatot további 3 órán át keverés mellett forraljuk, majd lassan szobahőmérsékletre hűtjük.

A reakcióelegyet 500 ml-es gömblombikba visszük át, és rotációs bepárló berendezéshez csatlakoztatjuk. Az oldatot viszkózus, borostyánszínű, félszilárd anyaggá pároljuk be úgy, hogy a bepárlás során a hőmérséklet soha ne haladja meg a 40 ’C értéket. A kapott félszilárd anyaghoz mintegy 300 ml nagynyomású folyadékkromatográfiás eljáráshoz alkalmas tisztaságú acetont adunk. így halványbama, ragadós, viszkózus olajat nyerünk. Ezt az olajat 22 ml vízben oldjuk, és lassan, erős keverés mellett 1 liter acetonhoz adjuk. Az acetont dekantáljuk, a halvány színű olajat vákuumban szárítjuk. így 76%-os hozammal 16,6 g nyers DOTMPt nyerünk. A kapott DOTMP 13,1 g-jához 39,3 g ionmentes vizet és oltókristályt adunk, és az oldatot éjszakán át állni hagyjuk. A kapott csapadékot vákuumban szűrjük, hideg vízzel mossuk, majd vákuumban szárítjuk. így 36%-os hozammal 4,75 g DOTMP-t nyerünk.

A kapott DOTMP termékből 3,0 g, 5,47 mmól mennyiséget tovább tisztítunk oly módon, hogy 3 ml vízben oldjuk 2,2 ml, 31,5 mmól tömény ammóniumhidroxid hozzáadásával. Ezt az oldatot 2,4 ml, 28,8 mmól tömény hidrogén-klorid hozzáadásával megsavanyítjuk, ekkor fehér, szilárd anyag csapódik ki. A csapadékot vákuumban szűrjük, majd szárítjuk. így 81%-os hozammal 2,42 g tisztított DOTMP-t nyerünk, amely ³¹P kapcsolatlan NMR spektrumában egy szingletet ad 11,5 ppm-nél (85%-os foszforsavra vonatkoztatva).

C Példa

DOTMP előállítása ml-es háromnyakú gömblombikba 2,0 g, 11,6 mmól 1,4,7,10-tetraazadodekánt adunk. Az amint 5,56 g tömény hidrogén-klorid és 3,85 g foszforossav hozzáadásával oldjuk. A lombikot hőmérővel és visszafolyató hűtővel látjuk el, majd melegítő/keverő berendezésre helyezzük. Az oldatot állandó keverés mellett forrásba hozzuk. Egy Sage^R típusú fecskendő szivatytyúba 4,33 g 37 térfogat%-os formaldehid oldatot töltünk. Az oldatot ezután lassan a reakcióedénybe engedjük 0,1 ml/perc áramlási sebességgel. Az elegyet ezen a hőmérsékleten tartjuk 6 órán át. Ezután az oldatot lehűtjük, közepes zsugorított üveg szűrőtölcséren szűrjük, majd rotációs bepárlón szárazra pároljuk. A szilárd anyagot ionmentes vízzel kétszer mossuk, majd rotációs bepárlón viszkózus, borostyánszínű, félszilárd anyaggá pároljuk be. A terméket metanollal eldörzsöljük, majd szűrjük, így 1,6 g cserszínű, szilárd anyagot nyerünk. A metanolos fázist szárazra pároljuk (sötét borostyánszínű viszkózus folyadékká), majd éjszakán át vákuum kemencében szárítjuk. A kapott termék össz-mennyisége 6,17 g.

A fenti két frakciót 100 ml-es gömblombikba helyezzük, és éjszakán át foszfonometilálást végzünk. Az oldatot ezután lehűtjük, és az előzőekben leírtak szerint feldolgozzuk. A termék összmennyisége 4,3 g. A termék ^3IP NMR vizsgálat alapján DOTMP-val azonos.

A következőkben a végtermékek előállítását mutatjuk be.

1. Példa

Gd-DOTMP előállítása

Egy lombikot lemérünk, és beletöltünk 200 mg, 0,36 mól, a C példa szerint előállított DOTMP-t, és 3,0 ml ionmentes vizet. A lombikba μΙ-es mennyiségekben tömény ammónium-hidroxidot adunk a szilárd anyag oldódásáig. Ezután az oldatot keveréssel 80 ’C hőmérsékletre melegítjük. Az oldathoz keverés közben cseppenként hozzáadunk 1,5 ml, 0,300 mmól 0,2 mól/l-es gadolinium-triacetát oldatot. A kapott oldatot 10 percig 80 ’C hőmérsékleten tartjuk, majd lehűtjük, és 0,5 ml 6 n hidrogén-klorid hozzáadásával pH = 7,0-ra állítjuk. A kapott komplex 100 μΙ-éhez hígítás céljából hozzáadunk 1,0 ml D₂O-t és 3,9 ml ionmentes vizet, így nyerjük a végső 680 μιηόΐ/l-es komplexet. Ez az oldat 20 térfogat% D₂O-t tartalmaz.

HU 211 735 Β

2. Példa

A 7j relaxációs idő meghatározása

Az 1. példa szerinti komplexet nitrogéngáz 20 percen át való átbuborékoltatásával oxigénmentesítjük. A mintát 5 mm-es NMR csőbe visszük és 270 MHz-n működő spketrométerbe helyezzük a víz proton relaxációs idejének meghatározására.

A relaxációs idő meghatározására a spin-háló relaxációs idő (Tj) mérésére szokásosan alkalmazott inverziós visszanyeréses NMR eljárást használjuk. Ebben az eljárásban a víz proton NMR rezonanciáját mérjük azon rádiófrekvencia pulzusok közötti késleltetési idő függvényében, amelyek alatt a spin-rendszer az ekvilibrium irányába relaxálódik. A végső adatokat, amelyek a csúcs intenzitásokat jelentik az idő függvényében, ábrázoljuk, és egy exponenciális függvényhez igazítjuk. Azt a jellemző időt, amely alatt a spin-mágnesesség visszaállítja önmagát (T|), az illesztett exponenciális függvény idő-konstansából kapjuk. A komplexre kapott Tj érték az 1. példában 244 ms. Ez az érték jól megfelel azoknak az értékeknek. amelyeket a kísérletet Gd-DTPA komplex alkalmazásával. illetve Gd-DOTA komplex alkalmazásával megismételve kaptunk <422 ms, illetve 540 ms). (A Gd-DTPA és a Gd-DOTA kereskedelmi forgalomban kapható ismert MRI szerek.)

3. Példa

A ¹⁵⁹ Gd-DOTMP biológiai eloszlása

1.45 mg, a B példa szerint előállított DOTMP mintát csőbe helyezünk és 760 μΐ víz és 5 μΐ 50 tömeg%-os nátrium-hidroxid hozzáadásával feloldjuk. Külön csőbe helyezünk 1000 μΐ Gd-oldatot (0,3 mmól/1 Gd 0,1 n hidrogén-kloridban). amely oldat nyomnyi mennyiség Q ¹⁵⁹Gd-t tartalmaz, és ehhez az oldathoz 15 μΐ fenti DOTMP oldatot adunk. Az oldat pH-ját nátrium-hidroxid alkalmazásával 7-8-ra állítjuk. A komplex formájában lévő Gd mennyisége >99% kationcserélő kromatográfiás vizsgálati eredmény alapján. Ennek a készítménynek a ligandum.fém mólaránya 1,5.

A fenti készítményt Sprague Dawley patkánynak beinjektáljuk, majd meghatározzuk biológiai eloszlását. A vizsgálatot úgy végezzük, hogy a patkányokat 5 napon át hagyjuk akklimatizálódni, majd 100 μΐ fenti Gd-oldatot injektálunk be nekik farki vénájukon át. A vizsgálathoz a beinjektálás idején 150-200 g testtömegű patkányokat használunk. Az injekció beadása után 2 órával a patkányokat a nyaki csigolya kimozdításával leöljük. A szöveteket szétválasztjuk, mérjük, és többcsatornás analizátorhoz kapcsolt NaI szcintillációs számlálón meghatározzuk minden egyes szövet radioaktivitását. Az egyes szövetek esetén kapott beütésszámot 100 μΐ standard beütésszámához hasonlítjuk, hogy %-os értékben határozzuk meg az egyes szövetekbe vagy szervekbe az injekció révén bejutott aktivitást. Az így kapott értékeket az 1. táblázatban adjuk meg. A ligandum (DOTMP) aránya a fémhez (Gd) 1,5.

I. Táblázat

A beinjektált dózis (159 Gd) %-a a különböző szövetekben

Szövet	Gd-DOTMP (0,32 mg/ml)
Csont	50
Máj	0,08
Vese	0,25
Izom	N. D.1
Vér	008

*N. D. jelentése: az izomban a beütésszám a háttér-érték alatti volt.

4. Példa

Gd-DOTMP komplex készítése

54,3 mg, 86,3 pmól, a B példa szerint előállított DOTMP mintát 4 ml vízben oldunk 0,049 ml tömény ammónium-hidroxid adagolásával. így 0,021 mól/l-es, pH = 6,33-as DOTMP oldatot nyerünk. Ebből a ligandum oldatból 3 ml-t (64 μπιόΐ) 82 °C hőmérsékletre melegítünk, és 291 μΐ (58 μιηόΐ) 0,2 mól/l-es gadolinium-triacetát-oldatot adunk hozzá. A gadoliniumoldat adagolását 20 perc alatt kis (20-50 μΐ-es) részletekben végezzük. Az adagolás során a pH-t 60 érték fölött tartjuk, ezt tömény ammónium-hidroxid 5 μΐ-es részleteinek adagolásával valósítjuk meg. A gadolinium-triacetát-oldat teljes beadagolása után az oldat pH-ját 6,56ról 7,53-ra állítjuk további 20 μΐ ammóniumhidroxid hozzáadásával. A komplexoldatot ezután szobahőmérsékletre hűtjük, ezt követően a pH-t 8,11 értékűnek találjuk. Az oldadtból végzett anioncserélő nagynyomású folyadékkromatográfiás elemzés 12% ligandum és 88% Gd-DOTMP komplex oldatban való jelenlétét mutatja (W integráció). Ez az eredmény jól illik a 10% ligandum és 90% komplex elméleti értékhez.

5. Példa

A Gd-DOTMP komplex biológiai eloszlása patkányban

Egy 150 g testtömegű Sprague-Dawley patkánynak

6-100 μΐ-es részletekben 4 napon át a 4. példa szerint előállított Gd-DOTMP-t injektáljuk be. A patkányt ezután leöljük, combcsontját eltávolítjuk, és mérjük. A csont tömege 0,690 g. Ezt a csontot 5 ml tömény hidrogén-kloridban feloldjuk, és induktiven csatolt plazma spektroszkópiás eljárással meghatározzuk Gdtartalmát. A csontban talált Gd mennyisége 16,76 pg, ami 419 pg Gd-nak felel meg a patkány teljes csontvázában, feltéve, hogy a combcsont a teljes csontváz 1/25 része. Ez az érték a beinjektált dózis 25,5%-ának a csont által való felvételének felel meg. Ez az eredmény jól megfelel egy hasonló munkánál kapott eredménynek, amelyet ^l53Sm radioaktív jelzővel végeztünk, és amelynél a beinjektált dózisnak 25-30%-a lokalizálódon a csontban. így a Sm-DOTMP és a Gd-DOTMP in vivő viselkedése igen hasonlónak bizonyult.

A leírás és a példák megfontolása alapján szakember számára nyilvánvalóvá válik a találmány számos más megvalósítási módja is.

Claims (6)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Emberi vagy állati szervezet meszes helyein összegyűlő készítmények mágneses rezonancia leképezéshez, azzal jellemezve, hogy egy (I) képletű ható- 5 anyagot - ahol M jelentése Gd³⁺ ion, és a ligandum molekulák mólaránya a Gd³⁺ ionokhoz legalább 1:1 — vagy fiziológiás szempontból elfogadható sóját és gyógyászati szempontból elfogadható hordozó- és/vagy egyéb segédanyagot tartalmaznak.
2. 2. Eljárás az (I) képletű vegyület vagy fiziológiás szempontból elfogadható sói előállítására, azzal jellemezve, hogy egy (II) képletű vegyületet oldott formában Gd³⁺ iont adó vegyülettel reagáltatunk vizes közegben, a pH 6,9-7,4 tartományba való beállításával, a (Π) képletű vegyület és a gadolinium mólarányát legalább 1:1 értéken tartva.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az (I) képletű vegyületben a ligandum és a gadolinium ionok mólaránya 1:1 és 3:1 közötti.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az (I) képletű vegyületben a ligandum és a gadolinium ionok mólaránya 1:1 és 1,5:1 közötti.
5. 5. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (II) képletű vegyület és a gadolinium mólarányát 1:1 és 3:1 közötti értéken tartjuk.
6. 6. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (II) képletű vegyület és a gadolinium mólarányát 1:1 és 1,5:1 közötti értéken tartjuk.