HU209658B - Process for producing cyklodextrin inclusion compexes of fatty acids and their alkalimetal salts, as well as aqueous solutions of the complexes, and microbiological culture medium containing the complexes - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás zsírsavak és alkálifémsóik metilezett ciklodextrinekkel alkotott zárványkomplexeinek és vizes oldatainak az előállítására, valamint zsírsavat vagy ennek alkálifémsóját 10-50 pg/ml koncentrációban tartalmazó mikrobiológiai táptalaj.

A zsírsavak, pl. a palmitinsav és sói, vízben gyakorlatilag oldhatatlanok. A zsírsavak alkálifémsói - melyeket szappanoknak nevezünk, ilyenek pl. a nátriumés a káliumsók - vízben diszpergálhatók, de a kapott rendszer nem molekulár diszperz, tehát nem valódi oldat, hanem csak micelláris szuszpenzió. A micelláris szuszpenzióban több száz, vagy több ezer palmitinsav (vagy hasonló zsírsav) molekula apoláros részletei egymással asszociálódnak és úgy rendeződnek, hogy a poláros rész (az ionizált karboxil-csoport) képezi a fázis egyik oldalát, az apoláros rész pedig a másik oldalát. Ezen alapszik a felületaktivitása az ilyen molekuláknak. A micellák azonban lévén nem molekulár diszperz állapotúak, a biológiai rendszerek - különösképpen a sejtek - számára csak nagyon nehezen hozzáférhetők. Ezért a zsírsavakat, illetve sóikat ez ideig vagy csak szuszpenzióban, vagy legjobb esetben liposzómaként lehet alkalmazni élettani, biokémiai, gyógyszertani és állatkísérletekben, valamint mikrobiológiai táptalajban. Ismert tény, hogy a zsírsavakat szerves oldószerekkel lehet oldani, viszont ezeket nem tűrik el a mikroorganizmusok, ezért a szerves oldószereknek az alkalmazása a zsírsavaknak a mikrobiológiai táptalajokban történő oldására járhatatlan út. Hasonlóképpen a szerves Oldószerekben oldott zsírsavak alkalmatlanok a gyógyszertani, élettani, biokémiai és állatkísérletekre.

Régóta kívánatos annak a problémának a megoldása, hogy a zsírsavakat - különösképpen a palmitinsavat, illetve annak nátriumsóját - molekulár diszperz állapotban, meghatározott koncentráció szintet elérve oldhatóvá lehessen tenni. Ilyen módon ugyanis elérhető, hogy mikrobiológiai táptalajok, szövetkultúrák stb. egyes zsíroldható, biológiailag aktív szubsztrátjai a mikroorganizmusokat zavaró szerves oldószerek alkalmazása nélkül biológiailag hozzáférhetők legyenek.

Ismeretes, hogy ciklodextrinekkel lehet fokozni a zsírsavak vízoldékonyságát. A zsírsavak rendkívül alacsony vízoldékonyságát tekintve az a- és a β-ciklodextrinnel elérhető oldékonyságfokozás jelentős, de abszolút mértékben ez még mindig rendkívül kicsi, az előzőekben vázolt célhoz nem kielégítő. Schlenk és Sand 1955-ben már közölték.: (J. Am. Chem. Soc. 77. 3587-3590. 1955) a zsírsavak oldékonyságfokozását ciklodextrinek alkalmazásával, az oldékonyságfokozódás a ciklodextrin nélküli vízoldékonyság 1,2-30-szorosát érte el.

Kevésbé lipofil anyagoknak a táptalajban történő diszpergálására ciklodextrint sikerrel alkalmazott Bar (Appl. Microbiol. Biotechnology 32 470-472 /1990/), benzaldehid redukciójára Saccharomyces cerevisiaeval, illetve Candida lipolytica tenyésztésére hexadekán mint egyedüli szénforrás tartalmú táptalajon.

Leprával fertőzött emberi és állati szövetekből Kátó {IntJ. Leprosy 56 631-632/1988) rendszeresen tenyésztett Mycobacterium kultúrákat +4-10 °C-on mesterséges táptalajon, melyben palmitinsavat β-ciklodextrinnel diszpergált, de a palmitinsavat nem sikerült tiszta oldatba vinni.

Zsírsavakat, illetve nátriumsóikat folyékony vagy szilárd táptalajban egyedüli szénforrásként molekulár diszperz - tehát tökéletesen oldott - állapotban eddig még senki nem írt le.

Ismeretes, hogy lipidek, trigliceridek enzimes emésztését in vitro és in vivő egyaránt elősegíti a dimetil^-ciklodextrin jelenléte, de egy ilyen rendszerhez a dimetil^-ciklodextrin hozzáadása nem eredményez tiszta oldatot. CA 588271.

Ismeretes az is továbbá, hogy különböző hatóanyagok vízoldékonyságát dimetil^-ciklodextrinnel lehet fokozni (HU 181.703), de ezek ismeretében sem volt várható, hogy zsírsavakból metilezett ciklodextrinekkel olyan stabilis, szilárd terméket lehet előállítani, amely vízzel visszaoldva tiszta, éles, stabilis vizes oldatot eredményez olyan oldott zsírsav-koncentrációval, amely kielégíti a biológiai vizsgálatokkal és a mikrobiológiai táptalajokkal szemben támasztott követelményeket.

Találmányunk lényege az, hogy metilezett ciklodextrinekkel zsírsavakból olyan szilárd, stabilis, jól tárolható és vízben könnyen oldható terméket állítunk elő, amely előnyösen alkalmazható állatkísérletekben, valamint gyógyszertani, élettani, biokémiai és táplálkozástudományi kutatásokban és amely egyáltalán nem zavarja a mikroorganizmusok növekedését, azok energiaforrásként a zsírsavat, szénforrásként pedig a metilezett ciklodextrineket tudják hasznosítani. így lehetővé válik számos nagyon nehezen tenyészthető mikroorganizmus gyors, egyszerű tenyésztése, pl. a tuberkulózis bacilusé és számos lassan növekedő vagy még nem tenyészthető kórokozóé.

A találmányunkban leírt módszer, illetve termék az első példa arra, hogy a zsírsavakat molekulárisán diszperz, oldott állapotban, vizes rendszerben a mikroorganizmusok számára teljes mértékben és gyorsan hozzáférhetővé tudjuk tenni.

A találmányunkban leírt oldható zsírsavkomplexek gyakorlatilag bármilyen folyékony, félszilárd, vagy szilárd táptalajban használhatók.

Ilyen táptalajokon sikeresen tenyésztettünk mikrobaktériumokat humán-, armadilló- és egérszövetekből, melyeket leprabacillussal fertőztünk. Ilyen módon vált lehetővé egy olyan mikrobaktérium felfedezése, amely optimálisan alacsony hőmérsékleten (+4-10 °C-on) növekszik.

Ez az első pszichrofil mikroorganizmus, amelyet patogén mikroorganizmussal fertőzött biopszia mintából tenyésztettünk ki és ily módon új lehetőségeket nyit a fertőző betegségek bakteriológiai vizsgálataihoz.

A vízoldható palmitinsav a táptalajokban igen jelentősen meggyorsítja a mikroorganizmusok növekedését, így pontosabb és gyorsabb mikroorganizmusazonosítást tesz lehetővé, tehát a mikrobiológiai diagnózisra az orvosnak, de a betegnek is rövidebb ideig kell várnia. Az a tény, hogy a folyékony táptalaj kris2

HU 209 658 Β tálytiszta a vízoldható palmitinsav alkalmazásával, lehetővé teszi a fotometriás gyors kvantitatív mérését a mikroorganizmusok szaporodásának. Ezáltal nemcsak a betegségek diagnózisában, de gyógyszerhatóanyagok antimikrobiális hatásának a méréséhez is rendkívül nagy segítséget nyújt.

Úgy tűnik, hogy a lepra gyógyításához a találmányunk szerinti eljárással előállított termék igen jelentős segítséget nyújt. Ugyanis az oldható palmitinsav alkalmazásával sikerült kitenyésztenünk egy olyan mikrobaktérium-klusztert a leprás szövetekből, amelyek azonosnak látszanak a lepra eddig in vitro nem tenyészthető kórokozójával. így most a vízoldható palmitinsavnak a táptalajban történő alkalmazásával elégséges mennyiségű pszichrofil mikrobaktériumot lehet kitenyészteni és rendelkezésére bocsátani a biokémikusoknak, bioenergetikusoknak, hogy tanulmányozzák a lepra kórokozó különböző sajátságait, légzési rendszerét, elektrontranszportját, gyógyszerérzékenységét és antigén sajátságait. Ez nyilván jelentősen meg fogja gyorsítani a lepragyógyítás régi problémájának a megoldását, mert az újonnan felfedezett tenyészet in vitro farmakológiái modell új és hatásos a megfelelő gyógyszerek kidolgozása céljára.

Jelentős mennyiségű bizonyíték gyűlt már össze arra, hogy a leprabacillus energia metabolizmusában a palmitinsav játssza a kulcsszerepet. A Mycobacterium leprae axeniás körülmények között igen előnyösen hasznosítja a palmitinsavat energiagazdag adeozin-trifoszfátképződésre. Manometriás technikával sikerült igazolni azt, hogy a palmitinsav béta-oxidációval a trikarbonsav cikluson keresztül oxidálódik. A Mycobacterium leprae citokrómjait a palmitinsav redukálja, az oxigén pedig visszaoxidálja. A Mycobacterium leprae a palmitinsavat gyorsabban oxidálja, mint bármely más szubsztrátot.

Mivel a 16 szénatomos zsírsav kb. 3-szor több energiát biztosít a sejt számára, mint a glükóz, a palmitinsavat tekinthetjük axéniás közegben a leprabacillus legmegfelelőbb energiaforrásának.

A palmitinsav felvétele azonban heterogén rendszerből csak rendkívül vontatottan történhet meg. Ezért jelentős a találmányunkban leírt vízoldható, molekulár diszperz oldatot képező palmitinsav(metilezett ciklodextrin)-komplex.

Általánosan elfogadott vélemény, hogy ha sikerül megoldani a leprabacillus in vitro tenyésztését, akkor a lepra negyed századon belül a világon jelentéktelen problémává fog válni.

A jelen találmány leírja, hogy telített- és telítetlen, vízben nem vagy csak korlátozottan oldódó zsírsavak és alkálifémsóik metilezett ciklodextrinekkel alkotott zárványkomplexei olyan néhány mg/ml-es oldott zsírsavkoncentrációt biztosítanak, melyek közvetlenül alkalmasak mikrobiológiai táptalajokban szénforrásként olyan mikroorganizmusok tenyésztésére, melyek egyébként nem, vagy csak igen körülményesen tenyészthetők. A vízben rosszul oldódó zsírsavak vagy ezek alkálifémsóinak ciklodextrin komplexeivel biztosított vízben oldott 10-50 pg/ml szubsztrát koncentrációt tartalmazó mikrobiológiai táptalajok a táptalajokban szokásosan alkalmazott adalékanyagok mellett megfigyeléseink szerint alkalmasak az eddig in vitro tenyészthetetlennek tartott leprabacillus (Mycobacterium leprae) tenyésztésére is.

Találmányunk részleteit az alábbiakban leírt példák szemléltetik, anélkül, hogy találmányunkat csupán a példákban leírt megvalósítási módokra korlátoznánk.

A telített és telítetlen, vízben nem vagy csak korlátozottan oldódó zsírsavak és alkálifémsóik metilezett ciklodextrinekkel alkotott zárványkomplexeinek és vizes oldatainak előállítási eljárása során a zsírsavat, illetve alkálifémsóját metilezett ciklodextrinnel zárványkomplexbe visszük, a komplexet ismert módon kinyerjük és kívánt esetben a komplexhez vizet adva valódi oldatot állítunk elő.

A találmány szerinti, vízben nem vagy csak korlátozottan oldódó zsírsavat vagy ennek alkálifémsóját 1050 μg/ml koncentrációban tartalmazó mikrobiológiai táptalaj szerinti eljárással előállított, megfelelő mennyiségű zárványkomplex oldásával keletkezett zsírsavat vagy ennek alkálifémsóját tartalmazza vizes oldatban, a táptalajokban szokásosan alkalmazott adalékanyagok mellett.

Példák

1. példa

Oldható palmitinsav

50,25 g metilezett béta-ciklodextrint (DS = 13-15) oldunk 500 ml vízben 20 °C-on és hozzáadunk 1,059 g palmitinsavat. 2 napon keresztül szobahőmérsékleten kevertetve a palmitinsav teljesen feloldódik és egy tiszta oldatot kapunk. Ezt az oldatot akár porlasztva szárítással, akár fagyasztva szárítással vízmentesítve egy fehér port kapunk, amely vízben oldható. Ha az oldatot 70 °C-ra felmelegítjük, akkor mikrokristályos csapadék formájában a palmitinsav-ciklodextrin-komplex kicsapódik, amely az oldatból szűréssel izolálható, majd 60 °C-on 4 óráig vákuumban szárítva ugyancsak egy vízben oldható port kapunk. A kapott termék stabilis, 20 °C-on vízben oldva az 1 mg/ml oldott palmitinsav koncentráció elérhető. Az oldatot 2-5-szörösre hígítva vízzel, tiszta opaleszcencia mentes marad.

2. példa

Oldható nátrium-palmitát

286,2 g metilezett béta-ciklodextrint (DS = 13-15) vízben oldunk 20 °C-on és hozzáadunk 5,72 g nátriumpalmitátot. Az oldatot 2 napig szobahőmérsékleten kevertetve tiszta oldatot kapunk. Ebből az oldatból a szilárd, por alakú termék éppen úgy állítható elő, mint ahogy azt az I. példában leírtuk. 20 °C hőmérsékletű vízzel elkeverve 30 másodpercen belül elérhető az 1 mg/ml oldott nátriumpalmitát koncentráció. Az 1 mg/ml koncentráció törzsoldatot 2-10-szeresére hígítva az oldat tiszta marad, zavarosodás megjelenése nélkül.

3. példa

Oldható olajsav g metilezett béta-ciklodextrint (DS = 13-15) oldunk 100 ml vízben 20 °C-on, nitrogén atmoszférában

HU 209 658 Β és hozzáadunk 0,100 g olajsavat. Az emulziót 2 napig keverve víztiszta, átlátszó oldatot kapunk. A vizet ezután rotációs vákuumbepárlóval, porlasztva szárítással vagy liofilezéssel távolítjuk el. A kapott könnyen folyó mikrokristályos fehér por vízbe szórva 2 percen belül legalább 1 mg/ml oldott olajsav-koncentrációt eredményez szobahőmérsékleten.

4. példa

Oldható eikozapentaénsav, dokozahexaénsav Az omega-(poli-telítetlen)-zsírsavak szolubilizálhatók, mint pl. az eikozapentaénsav dokozohexaénsav, úgy hogy 15 g metilezett béta-ciklodextrint (DS = 1315) és 0,100 g ómega- {politelítetlen)-zsífsavat, pl. eikozapentaénsavat kevertetünk 150 ml vízben nitrogénatmoszféra alatt szobahőmérsékleten 5 napon át. A kapott kristálytiszta vizes oldatot liofilezéssel, vagy porlasztva szárítással víztelenítjük, így egy olyan mikrokristályos fehér port kapunk, amely szobahőmérsékleten vízben szórva 0,8-1,4 mg/ml oldott telítetlen zsírsav-koncentrációt eredményez. Ezek az oldatok azonban legfeljebb csak 2-szeresre hígíthatok vízzel, nagyobb mértékű hígítás kismértékű opaleszcenciát eredményez.

5. példa

Táptalaj előállítás liter vízben oldunk 2,5 kg kálium-hidrofoszfátot, g dinátrium-hidrofoszfátot, 0,05 g magnézium-szulfátot, 0,05 g ferri-ammoncitrátot, és 20 ml ammónium-tioglikolátot (Fluka, 60% v/w vízben). Ezen törzsoldat 100 ml-éhez hozzáadunk 0,25 g a 2. példa szerint előállított (nátriumpalmitát)-(dimetil-béta-ciklodextrin)-komplexet (palmitinsav-tartalma 20 mg/g termék). Az oldatot keverve, vagy egy dörzscsészében a szilárd (nátrium-palmitát)-(dimetil-béta-ciklodextrin)-komplex az oldattal eldörzsölve tiszta, átlátszó oldatot kapunk. Ezen oldathoz g granulált agart adunk, majd 100 °C-on autoklávozással azt feloldjuk benne. A forró táptalajt szétosztjuk 50 ml-es csavaros záró kupakkal ellátott steril kémcsövekbe, mindegyikbe 12 ml-t töltve, majd azokat 25 percig autoklávozzuk, utána döntött állásban hűlni hagyjuk és így állítjuk elő a ferde agar lemezeket.

6. példa

Folyékony táptalaj előállítása

A folyékony táptalajt ugyanúgy állítjuk elő, mint azt az előző példában leírtuk, az eltérés csak az, hogy nem adunk a rendszerhez agart. Az ilyen tiszta, átlátszó táptalaj különösen alkalmas a baktériumok szaporodásának megfigyelésére, illetve turbidimetriás módszerrel a baktérium szaporodás kvantitatív mérésére.

Claims (5)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás telített és telítetlen, vízben nem vagy csak korlátozottan oldódó zsírsavak és alkálifémsóik metilezett ciklodextrinekkel alkotott zárványkomplexeinek és vizes oldatainak előállítására, azzal jellemezve, hogy a zsírsavat, illetve alkálifémsóját metilezett cildodextrinnel zárványkomplexbe visszük, a komplexet ismert módon kinyerjük, és kívánt esetben a komplexhez vizet adva valódi oldatot állítunk elő.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy metilezett ciklodextrinként 1-18 metilcsoportot tartalmazó alfa-ciklodextrint, vagy 1-21 metilcsoportot tartalmazó béta-ciklodextrint, vagy 1-24 metilcsoportot tartalmazó gamma-ciklodextrint, előnyösen 13-15 metilcsoportot tartalmazó béta-ciklodextrint alkalmazunk.

3. Az 1. vagy 2. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 10-22 szénatomot, előnyösen 1618 szénatomot tartalmazó zsírsavakat alkalmazunk, illetve ezek alkálifémsóit alkalmazzuk.

4. Vízben nem vagy csak korlátozottan oldódó zsírsavat vagy ennek alkálifémsóját 10-50 μg/ml koncentrációban tartalmazó mikrobiológiai táptalaj, azzal jellemezve, hogy a táptalaj az 1. igénypont szerinti eljárással előállított, megfelelő mennyiségű zárványkomplex oldódásával keletkezett zsírsavat vagy ennek alkálifémsóját tartalmazza vizes oldatban, a táptalajokban szokásosan alkalmazott adalékanyagok mellett.

5. A 4. igénypont szerinti mikrobiológiai táptalaj, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott zárványkomplex 0,01-6 tömeg%, előnyösen 2 tömeg% zsírsavat vagy zsírsavalkálifémsót tartalmaz.