HU209313B

HU209313B - Process for producing crystalline interleukin-4 and pharmaceutical compositions comprising same

Info

Publication number: HU209313B
Application number: HU9203959A
Authority: HU
Inventors: Gerald S Hammond; Hung V Le; Tattanahalli L Nagabhushan; Paul Reichert; Paul P Trotta
Original assignee: Schering Corp
Priority date: 1990-06-15
Filing date: 1991-06-13
Publication date: 1994-04-28
Also published as: ZA914539B; WO1991019742A1; FI925687A; NZ238530A; EP0597850B1; CA2085377A1; DE69122517D1; JP2509775B2; PT97985A; IE912009A1; JPH05507707A; DE69122517T2; HU9203959D0; CN1119121A; EP0597850A1; MY107577A; IL98484A0; HUT63439A; IE62372B1; ATE143672T1

Description

A T-sejtből származó interleukin-4-et (IL-4) eredetileg olyan rágcsáló (murine) faktorként írták le, amely kostimulálhatja az aktivált B sejtek szaporodását [Howard et al., J. Exp. Med. 755, 914 (1982)]. Ezt követően bemutatták, hogy a rágcsáló IL—4 különböző biológiai hatásokat képes kifejteni B sejteken [Paul et al., Ann. Rév. Immunoi., 5, 429 (1987); Noelle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6149 (1984); Roehm et al., J. Exp. Med., 160, 679 (1984); Vitetta et al., J. Exp. Med., 162, 1726 (1985); Coffman et al., J. Immunoi., 136, 4358 (1986); Coffman et al., J. Immunoi., 136, 949 (1986)] és más típusú sejteken, beleértve a T-sejteket [Mosmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5654 (1986); Femandez-Botran et al., J. Exp. Med., 164, 580 (1986); Hu-Li et al., J. Exp. Med., 165, 157 (1987); Grabstein et al., J. Immunoi., 139, 1148 (1987); Zlotnick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3856 (1987)], hematopoietikus progenitor sejteket [Rennick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6889 (1987); Peschel et al., Blood 70, 254 (1987)] és hízósejteket (ld. Mosmann és munkatársai fentebb idézett közleményét).

A rágcsáló (murine) IL-4-gyel való homológiára alapozva egy humán interleukin-4-et (huIL-4) kódoló cDNS-t klónoztak [Yokota et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 5894 (1986)], és kifejezték mind emlős [Le et al., J. Bioi. Chem., 263, 10 817 (1988); Sonoda et al., J. Biotechnology 9, 61 (1988); Takebe et al., Mól. Cell. Bioi., 8, 466 (1988)], mind bakteriális gazdasejtekben [van Kimmenade et al., Eur. J. Biochem., 173, 109 (1988)]. Ugyanúgy, mint a rágcsáló (murine) IL-4, a rekombináns huIL-4 (rhuIL4) is pleiotrop limfokin, amely sejtek különböző típusaira hat. így például a rhuIL-4 indukálhatja mind az aktivált T, mind a B limfociták szaporodását [Spits et al., J. Immunoi., 139, 1142 (1987), DeFrance et al., J. Immunoi., 139, 1135 (1987)], fokozhatja a nagy hisztokompatibilitású antigének (major histocompatibility antigens) II osztályának és az IgE-re alacsony affínitású receptorok expresszióját B sejteken [Rousset et al., J. Immunoi., 140, 2625 (1988); DeFrance et al., J. Exp. Med., 165, 1459 (1987)], és indukálhatja IgE és más immunglobulinok termelését [Pene et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6880 (1988)]. Az rhuIL-4-nek a B sejt eredetű krónikus limfocitás leukémia sejteknek az IL—2-től függő szaporodását gátló képességére enged következtetni egy B sejt neoplazmákban végzett klinikai alkalmazás [Karray et al., J. Exp. Med., 168, 85 (1988)].

A tisztított rhuIL-4 milligrammos mennyiségeinek hozzáférhetősége tette lehetővé a protein szerkezeti vizsgálatainak és a protein szerkezete és funkciói közötti összefüggések vizsgálatainak megindítását. A találmány a kristályos interleukin-4 előállításához szükséges feltételeket közli. Továbbá vonatkozik magának a kristályos rhuIL-4-nek az előállítására is. A kristályok alkalmasak röntgendiffrakciós vizsgálatokra, és alkalmazhatók a rhuIL-4 tisztításánál és formázásánál is.

Tágabb értelemben véve a találmány vonakozik a kristályos interleukin és hatóanyagként ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására.

A találmány tárgyát képezi egy, az interleukin-4 kristályok előállítására szolgáló módszer, amely az interleukin-4-nek egy szulfát vagy citrát sót tartalmazó 5-7 Ph-jú pufferolt vizes oldatból való kristályosításából áll.

A találmány szerinti kristályos interleukin-4 használható röntgenkrisztallográfiás analízishez és olyan kórképek kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek interleukin-4-gyel végzett kezelésre reagálnak.

A találmány szerinti eljárás szemléltetése céljából E.coliban kifejezzük a huIL-4 érett formáját. Más IL-4-ek, valamint rhuIL-4 más formái hasonlóképpen felhasználhatók. A sejt felülúszóból származó rhuIL-4 tisztítását szokásos kromatográfiás módszerekkel végezzük (lásd Le és munkatársai előbb idézett munkáját). A függőcseppes gőzdiffúziós kísérleteket 24 vájatos sejttenyésztő lemezeken (Multiwell, Becton Dickinson & Co., Lincoln Park, NJ) végezzük. 20 mg/ml huIL-4-et, 15-20%-os telítettségnek megfelelő mennyiségű ammónium-szulfátot, 40 mM 6,0-7,0 pH-jú nátrium-foszfátot tartalmazó 6 μΐ-es cseppecskéket lógatunk a 24 vájatos sejttenyésztő lemezekkel szembefordított fedőlemezekről. Ezeket a cseppecskéket vagy 12 vagy 22 °C-on egyensúlyba hozzuk 30-40% telítettségnek megfelelő mennyiségű ammónium-szulfátot és 40 mM 6,07,0 pH-jú nátrium-foszfátot tartalmazó 1 ml oldattal. A szabályzott hőmérsékletű inkubálást 12 vagy 22 °C-ra beállított REVCO klímaszekrényekben végezzük.

A rhuIL-4 koncentrációját a különböző pufferokban spektrofometriásan határozzuk meg 278 nm-en 0,57/cm/mg/ml extinkciós koefficienst használva. A nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézist (SDS-PAGE) Laemmli módszere szerint [Natúré 227, 680 (1970)] végezzük. A fordított fázisú HPLC-t Rainin C4 oszlopon (4,6x250 mm; Dynamax, 300 Ángström) végezzük a kifejlesztést acetonitril lineáris gradienssel 0,1%-os trifluor-ecetsavban végezve. A humán perifériás vér limfociták alkalmazásával végzett T sejt szaporodási aktivitás meghatározást a korábban leírtak szerint hajtjuk végre (lásd Yokota és munkatársai előbb idézett közleményét). A röntgensugár vizsgálatokhoz nagy tetragonális kristályokat helyezünk üvegkapillárisokba, és 22 °C-on fényképezzük egy precessziós kamerával egy Rigaku RU300 forgó anódból kapott CuKa sugárzást használva. Teljes natív adatkészletet ugyanezen sugárfonás alkalmazásával gyűjtünk egy Nicolet X-100A terület detektoron.

Amint már az előbbiekben szemléltetés céljából megállapítottuk, a találmányi leírásban szereplő kristályos humán interleukin-4 E. coliból származó rekonbináns humán interleukin-4. A protein primer szerkezete (egybetűs aminosavrövidítéseket használva) a következő szekvenciával ábrázolható:

HU 209 313 B

1

H

K

C

D I

T

L

Q

E

I

K

T

L

N

S

L

T

E

Q

K

T

L

C

T

E

L

T

V

T

31

D

I

F

AA

S

K

N

T

E

K

E

T

F

c

R

A

T

V

L

R.

Q

F

Y

S

H

E

61

K

D

T

RC

L

G

A

T

A

Q

F

H

R

H

K

Q

L

I

R

F

L

K

R

L

D

R

N

L

91

W

G

L

AG

L

N

S

C

P

V

K

E

A

N

Q

S

T

L

E

N

F

L

E

R

L

K

T

I

M

121

R

E

K

Y S

K

C

S

Kicsapószerként ammónium-szulfátot használva a rhuIL-4 tűkként és nagy tetragonális kristályokként kristályosodik. A kristályosodás legjobban 34% ammónium-szulfátot tartalmazó 6,0 pH-jú 40 mM nátriumfoszfát pufferben érhető el 12 °C-on 21 napig végzett inkubálással. A tetragonális kristályokat észleljük nátrium-foszfátban 5,0-tól 7,0-ig terjedő pH-értékeknél és 30-tól 40%-ig terjedő ammónium-szulfát telítettségnél.

A kristályosítást 5-től 7-ig, előnyösen 5,5-től 6,5-ig teqedő pH-tartományban és legelőnyösebben körülbelül 6,0 pH-nál végezzük. A hőmérséklet körülbelül 5től 25 °C-ig, előnyösen 12-től 22 °C-ig terjedő tartományba esik, és legelőnyösebb a körülbelül 12 °C. A proteinkoncentrációnak az egyensúlyi állapotban körülbelül 5-től 60 mg/ml-ig, előnyösen 30-tól 50 mg/mlig terjedő tartományba kell esnie, és legelőnyösebben körülbelül 40 mg/ml-nek kell lennie.

Az inkubálási idő 12-22 °C-on 2-től 20 napig változhat. Előre megállapítható, hogy az itt leírt kristályosítási módszerek más gazdasejtekből (például emlős sejttenyészetből, élesztőből, rovarokból és egyéb sejttenyészetekből) származó rhuIL-4 vagy természetes forrásokból (például humán perifériás vér limfocitákból vagy konstitutíven huIL-4-et termelő humán sejtvonalakból) származó huIL-4 kristályosítására is használhatók lesznek. Az is előre megjósolható, hogy a módszer más fajokból származó homológ interleukin4 proteineknél is alkalmazható lesz.

A függő cseppecskékből izoláljuk a rhuIL-4-et, és alaposan mossuk 55% ammónium-szulfátot tartalmazó

6,6 pH-jú 40 mM foszfátpufferral szobahőmérsékleten (22-25 °C). A kristályokat újraoldjuk 0,15 M nátriumkloridot tartalmazó 7,4 pH-jú 20 mM nátrium-foszfátpufferban. Az oldott kristályok T sejt szaporodást kiváltó hatást fejtenek ki (2,0x 10⁷ egység/mg), ami azonos a kontroll rhuIL-4 minta hatásával, amely minta nem lett kristályosítva. SDS-PAGE-nek alávetve az újraoldott kristályos rhulU-4 elektroforetikus migrációja azonos a kontroll mintáéval. Hasonlóképpen, az újraoldott kristályok HPLC elúciós képe megkülönböztethetetlen a kontroll minta elúciós képétől. Nem történik semmiféle protein degradáció 22 °C-on végzett hosszú időtartamú inkubáció eredményeképpen. Még fontosabb, hogy a kristályosítási eljárást követően fiziológiás pufferoldatban való újraoldással nem észlelhető az rhuIL-4 T sejt szaporodást serkentő hatásának semmiféle károsodása.

A röntgensugár-diffrakciós adatokat kezdetben a területi detektor alkalmazásával 2,7 Á felbontásig gyűjtöttük. Az oszcillációs keretek fedése 0,25 volt, és 10 percig mértünk. Az intenzitás adatok indexelését és integrálását a XENGEN processing programok [Howard et al., J. Appl. Ciystallogr., 20, 383 (1987)] alkalmazásával végeztük. Az adatok a tetragonális rendszerbe illettek; a = 92,1 (2), b = 92,1 (7) és c = 46,5 (1)

Á. A tércsoport vagy P₄2vagy P4₃2i2.

Az interleukin ezt követő röntgensugár precessziós fényképei megerősítették a tércsoport és egységcella paramétereket. A tetragonális kristályok stabilak röntgensugarakkal szemben, és szobahőmérsékleten leg15 alább öt napig adnak diffrakciót, és legalább 2,7 A felbontásig szórnak.

Nagy méretű kristályosítási műveletek a gőzdiffüzióval egyenértékű módszerekkel, például dialízissel és ultraszűréssel hajthatók végre. A függőcseppes kísér20 létből kapott oltókristályok használhatók a nagy mértékben végzett kristályosítás gyorsítására, ha már megállapítottuk az optimális körülmények beállását. Bár kicsapószerként az ammónium-szulfát használata előnyös, helyettesíthető más szokásos szulfát- és citrát25 sókkal, például nátrium-, kálium-, kalcium- vagy magnézium-szulfáttal, nátrium-citráttal és másokkal (McPherson, Preparation and Analysis of Protein Ciystals, 1982, John Wiley & Sons, New York, New York). A rhuIL-4 nagy mértékben végzett kris30 tályosítása klinikai gyártásban végső tisztítási lépésként és/vagy koncentrálási lépésként vezethető be. Az rhuIL-4 hatóanyag kristályos formában való hosszú ideig tartó tárolhatósága igen kívánatos a kristályoknak a tartósítószerekkel készített oldatban tárolt rhuIL-435 hez viszonyított jelentősen megnőtt stabilitása miatt.

A leírt módszerrel előállított kristályok különösen előnyös formák gyógyszer dózisformák készítéséhez. A kristályok használhatók például alapként egy in vivő lassú hatóanyagkibocsátású rhuIL-4 formához. Úgy véljük, hogy fémek (például cink vagy vas) és huIL-4 komplexei képezhetők, és ezt követően kristályosíthatok. Ezen komplexek kristályai szintén használhatók megfelelő gyógyszerészeti segédanyagokat tartalmazó lassú hatóanyagkibocsátású protein-készítményekben. Hasonló lassú hatóanyagkibocsátású protein-készítményekre példaként a cink-inzulin kristályos komplex (Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985., Gennaro, A. R., Ed., Mack Publishing Co., Fasten, Pennsylvania, 974-976. old.) és a cink-inzulin-protamin kristályos komplex (Pharmaceutical Manufacturing Encyclopedia, 1989, Sitting, M., Ed., 820-821. old.) említhető.

A találmány szerinti kristályos interleukin-4-et tartalmazó lassú hatóanyagkibocsátású gyógyszerkészítmények az ilyen interleukin-4 valamilyen fém és/vagy protein komplexképző szerrel való összekeverésével állíthatók elő a fentebb leírtak szerint.

A találmányt részletesebben a következő példákkal szemléltetjük. Kiindulási anyagként bakteriálisán kifejezett, tisztított interleukin-4-et (a továbbiakban IL-4) használunk.

HU 209 313 B

1. példa

Kristályos IL-4 előállítása fiiggőcseppes gőzdiffiiziós módszerrel.

mg/ml koncentrációjú, 7 pH-jú IL-4 oldatot készítünk 40 mM nátrium-foszfátot és 20 tömeg% ammónium-szulfátot tartalmazó vizes oldatban oldva. (A koncentrációt spektrofotometriásán határozzuk meg 278 nm-nél 0,57/cm/mg/ml extinkciós koefficienst használva.) Egy szilikonozott fedőlapra 6 μΐ-es cseppet cseppettünk, majd a fedőlapot megfordítjuk, és egy 24 vájatos szövettenyésztő lemezre tesszük úgy, hogy az IL-4-et tartalmazó cseppecske a fedőlapról a szövettenyésztő lemez vájatában levő ammónium-szulfát-oldat felé lógjon. A váj atban levő ammónium-szulfát-oldat koncentrációja 40 tömeg%, és az oldat pH-ját 37 mM nátrium-foszfát puffer tartja 6,9 értéken. Az egész kristályosító készüléket egy 22 °C-ra temperált REVCO® klímakamrában tartjuk. A kristályok a 4. napon jelennek meg.

2. példa

IL-4 kristályokat állítunk elő az 1. példában leírt módon, de azzal az eltéréssel, hogy 10 mg/ml koncentrációjú IL-4 oldatot cseppentünk a fedőlemezre, és a szövettenyésztő lemez vájatába 35 tömeg%-os ammónium-szulfát-oldatot töltünk, amelynek pH-ját 35 mM nátrium-foszfát puffer tartja 6,5 értéken. A kristályok a 7. napon jelennek meg.

3. példa

IL-4 kristályokat állítunk elő az 1. példában leírt módon, de azzal az eltéréssel, hogy 40 mg/ml koncentrációjú IL-4 oldatot cseppentünk a fedőlemezre, és a szövettenyésztő lemez vájatába 35 tömeg%-os ammónium-szulfát-oldatot töltünk, amelynek pH-ját 37 mM nátrium-foszfát puffer tartja 6,8 értéken. A kristályok a

4. napon jelennek meg.

4. példa

IL-4 kristályokat állítunk elő a 3. példa szerint, de azzal az eltéréssel, hogy a klímakamra hőmérsékletét 12 ’C-on tartjuk. A kristályok a 7. napon jelennek meg.

5. példa

IL-4 kristályokat állítunk elő a 4. példában leírt módon, de azzal az eltéréssel, hogy a szövettenyésztő lemez vájatába 34 tömeg%-os ammónium-szulfát-oldatot töltünk, amelynek pH-ját 6,7 értéken tartja a nátrium-foszfát puffer. A kristályok a 7. napon jelennek meg.

6. példa

IL-4 kristályokat állítunk elő a 4. példában leírt módon, de azzal az eltéréssel, hogy a szövettenyésztő lemez vájatába 39 tömeg%-os ammónium-szulfát-oldatot töltünk, amelynek pH-ját 6,6 értéken tartja a nátrium-foszfát puffer. A kristályok a 7. napon jelennek meg.

7. példa

IL-4 kristályokat állítunk elő a 4. példában leírt módon, de azzal az eltéréssel, hogy a szövettenyésztő lemez vájatába 36 tömeg%-os ammónium-szulfát-oldatot töltünk, amelynek pH-ját 6,5 értéken tartja a nátrium-foszfát puffer. A kristályok a 7. napon jelennek meg.

8. példa

IL-4 kristályokat állítunk elő a 4. példában leírt módon, de azzal az eltéréssel, hogy a szövettenyésztő lemez vájatába 36 tömeg%-os ammónium-szulfát-oldatot töltünk, amelynek pH-ját 6,4 értéken tartjuk nátrium-foszfát pufferral. A kristályok 7. napon jelennek meg.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás kristályos interleukin-4 előállítására, azzal jellemezve, hogy interleukin-4 valamilyen szulfátvagy citrát-só oldatával készített 5-60 mg/ml koncentrációjú, 5-7 pH-jú pufferolt vizes oldatát 30-40 tömeg% koncentrációjú vizes ammónium-szulfát oldattal szemben 5 °C és 25 °C közötti hőmérsékleten 2-20 napig inkubáljuk, és a képződött kristályokat elkülönítjük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy interleukin-4 30-50 mg/ml koncentrációjú oldatát inkubáljuk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy interleukin-4 oldatát 40 mg/ml koncentrációjú oldatát inkubáljuk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az interleukin-4 40 tömeg%-os vizes ammónium-szulfát-oldattal szemben inkubáljuk.
5. Eljárás hatóanyagként kristályos interleukin-4-et tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított hatóanyagot egy fém komplexképzővel és/vagy a gyógyszertechnológiában általánosan használt segédanyagokkal keverjük, és a keveréket gyógyszerkészítménnyé feldolgozzuk.