PL166951B1 - Sposób wytwarzania tetragonalnych krysztalów ludzkiej interleukiny-4 PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania tetragonalnych krysztalów ludzkiej interleukiny-4, powodu- jacych dyfrakcje promieni rentgenowskich co najmniej do rozdzielczosci 2,7 A, zna- mienny tym, ze inkubuje sie ludzka interleukine-4 w buforowym wodnym roztworze o PH 5-7,' zawierajacym siarczan lub cytrynian, w którym stezenie interleukiny-4 w rów- nowadze wynosi od okolo 5 do 60 mg interleukiny-4 na ml roztworu, w czasie wystar- czajacym do utworzenia sie tetragohalnych krysztalów interleukiny-4. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania tetragonalnych kryształów ludzkiej interleukiny-4.

Interleukinę-4(IL-4) pochodzącą od komórek T opisano po raz pierwszy jako czynnik mysi, który mógłby konstymulować proliferację aktywowanych komórek B /Howard i wsp., J.Exp.Med.l55:914 (1982)/. Następnie wykazano, że mysia IL-4 mogłaby wywierać różne działania biologiczne na komórki B (Paul i wsp., Ann.Rev.Immunol. 5:429 (1987); Noelle i wsp., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6149 (1984); Roehm i wsp., J.Exp.Med. 160:679 (1984); Vitetta i wsp., J.Exp.Med. 162: 1726 (1985); Coffman i wsp., J.Immunol. 136:4538 (1986); Coffman i Wsp. J. Immunol. 136:949 (1986) i inne typy komórek, w tym komórki T (Mosmann i wsp., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83:5654 (1986); Femandez-Botran i wsp., J.Exp.Med. 164:58- (1986); Hu-Li i wsp., J.Exp.Med. 165:157 (1987); Grabstein i wsp., J.Immunol 139:1148 (1987); Zlotnick i wsp., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84:3956 (1987)/, hematopoetyczne komórki przodki /Rennick i wsp., Proc.Natl.Acad.Sci USA 84:6889 (1987); Peschel i wsp., Blood 70:254 (1987)/ i komórki tuczne /Mosman, jw./.

W oparciu o homologię z mysią IL-4 sklonowano cDNA kodujący ludzką interleukinę-4 (huIL-4) [Yokota i wsp., Proc.Natl. Acad.Sci. USA 83:5894 (1986)] i poddano ekspresji zarówno w komórkach ssaków [Le i wsp., J.Biol. Chem. 263:10817 (1988); Sonda i wsp., J.Biotechnology 9:61 (1988): Takebe i wsp., Mol. Cell Biol. 8:466 (1988)], jak i w gospodarzu bakteryjnym [van Kimmenade i wsp., Eur. J.Biochem. 173:109 (1988)].

Jak mysia IL-4, rekombinantowa hulL-4 (rhuIL-4) jest pleotropową limfokiną, która działa na różne typy komórek. Tak więc, na przykład, rhuIL-4 może indukować proliferację aktywowanych limfocytów T i B [Spits i wsp., J.Immunol. 139:1142 (1987); DeFrance i wsp., J.Immunol. 139:1135 (1987)], może wzmagać ekspresję głównych antygenów zdolności tkankowej klasy II i receptora o niskim powinowactwie dla IgE na komórkach B [Rousset i wsp., J. Immunol. 140:2625 (1988); DeFrance i wsp., J.Exp.Med. 165:1459 (1987)] i indukować produkcję IgE i innych immoglobulin [Pene i wsp., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85:6880 (1988)]. Zdolność rhuIL-4 do hamowania zależnej od IL-2 proliferacji komórek przewlekłej białaczki limfocytowej, pochodzących od komórek B, sugeruje kliniczne zastosowanie w neoplazmie komórek B [Karray i wsp., J.Exp. 168:85 (1988)].

Dotychczas nigdy ludzka interleukina-4 (zwana dalej w skrócie huIL-4) nie została wykrystalizowana. Nie znane też były warunki, w których mogłaby nastąpić krystalizacja inter166 951 leukiny-4. Ponadto, jak dotychczas, nie jest znana żadna usystematyzowana metoda dla przewidywania warunków krystalizowania nieznanego białka, ani nawet do przewidywania czy dane białko w ogóle da się wykrystalizować.

Celem wynalazku było wynalezienie nowych warunków, w których możnaby wykrystalizować ludzką interleukinę-4 do postaci tetragonalnych kryształów.

Dostępność miligramów ilości oczyszczonej rhuIL-4 ułatwia zapoczątkowanie badań na strukturę i zależnościami między strukturą i funkcją białka. Otrzymane tetragonalne kryształy są odpowiednie dla badań metodą dyfrakcji promieni X i mają zastosowanie w oczyszczaniu i wytwarzaniu preparatów rhuIL-4.

Sposobem według wynalazku wytwarza się tetragonalne kryształy ludzkiej interleukiny-4, powodujące dyfrakcję promieni rentgenowskich co najmniej do rozdzielności 2,7 A.

Sposób według wynalazku polega na tym, że inkubuje się ludzką interleukinę-4 w buforowanym wodnym roztworze o pH 5-7, zawierającym siarczan lub cytrynian, w którym stężenie interleukiny-4 w równowadze wynosi około 5-60 mg interleukiny-4 na ml roztworu, w czasie wystarczającym do utworzenia się tetragonalnych kryształów interleukiny-4.

Korzystnie, stosuje się buforowany roztwór zawierający siarczan amonu i o pH=6,0.

Stężenie interleukiny-4 korzystnie wynosi 30-50 mg/ml, a zwłaszcza 40 mg/ml.

Inkubowanie interleukiny-4 najkorzystniej prowadzi się w temperaturze około 12°C.

Według wynalazku korzystnie inkubuje się ludzką interleukinę-4, którą wytworzono metodą rekombinacji DNA. Interleukina ta może być glikozylowana lub nieglikozylowana.

Krystaliczna interleukina-4 wytwarzana sposobem według wynalazku jest użyteczna w rentgenowskiej analizie krystalograficznej i do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do leczenia stanów podatnych na leczenie interleukiną-4.

Aby zilustrować praktyczną stronę wynalazku dojrzałą formę huIL-4 poddano ekspresji w E coli. Inne interleukiny-4, jak również inne formy rhuIL-4 można wykorzystać podobnie. Oczyszczanie rhuIL-4 z supematantu komórek prowadzono konwencjonalnymi metodami chromatograficznymi /Le i wsp.jw.). Doświadczenie z dyfuzją par metodą wiszącej kropli prowadzono na płytkach do hodowli tkankowej z 24 dołkami (Multiwell, Becton Dickenson and Co., Lincoln Park, NJ). Krople (6 pl) zawierające 20 mg/ml huIL-4, zawieszono z silikonowego szkiełka pokrywkowego odwróconego na płytkach do hodowli tkankowej z 24 dołkami. Krople te doprowadzono do stanu równowagi w 12°C albo 22°C wobec 1 ml 30-40% nasyconego siarczanu amonu, 40 mM fosforanu sodu, pH 6,0-7,0. Przeprowadzono inkubację w regulowanej temperaturze w komorze z programowanym środowiskiem w 12°C lub 22°C.

Stężenie rhuIL-4 w różnych buforach oznaczano spektrofotometrycznie stosując współczynnik ekstynkcji 0,57/cm/mg/ml przy 278 nm. Przeprowadzono elektroforezę w żelu poliakryloamidowym z dodecylosulfonianem sodu (SDS-PAGE) zgodnie z metodą Laemmli [Naturę 227:680 (1970)]. Przeprowadzono HPLC z odwróconymi fazami na kolumnie Rainin C4 (4,6 x 250 nm; Dynamax, 300 Angstrom), rozwijano liniowym gradientem acetonitrylu w 0,1% kwasie trifluorooctowym. Oznaczono aktywność proliferacji komórek T używając ludzkich limfocytów krwi obwodowej jak opisano uprzednio (Yokota i wsp., j.w . ). Do badań rentegenowskich duże tetragonalne kryształy zamontowano w szklanych kapilarach i fotografowano precyzyjnym aparatem w 22°C, wykorzystując promieniowanie CuKa z anody obrotowej Rigaku RU-300. Kompletny zestaw danych surowych uzyskano za pomocą powierzchniowego defektora X-100A stosując to samo źródło promieniowania.

Jak uprzednio stwierdzono, dla celów ilustracji krystaliczna ludzka interleukina-4, opisana w tym wynalazku jest rekombinowaną ludzką interleukiną-4 wytworzoną w E. coli. Główna struktura białka jest następująca:

10 15 20 25 30

HKCDITLQE I IKTLNSLTEOKTLCTELΤV T

DIFA ASKNT TE KE T F C R A A T YL R O F Y S HH E

KDTRCLG A T AQ QFHRHKQLIRFLKRLDRN L

W GLA GLNSCP V KEANQ T LE NFLE RKTI M

121 R EKYSKCS S

166 951

Stosując siarczan amonowy jako środek strącający wykrystalizowania rhuIL-4 w postaci igieł i dużych kryształów tetragonalnych. Krystalizację najlepiej przeprowadza się w 40 mM fosforanie sodu - buforze, pH 6,0 zawierającym 34% siarczanu amonu, po 21 dniach inkubacji w 12°C. Tetragonalne kryształy zauważono także w fosforanie sodu przy pH od 5,0 do 7,0 i przy stężeniach siarczanu amonu w zakresie od 30 do 40% nasycenia.

Krystalizację prowadzi się przy pH w zakresie od 5 do 7, korzystnie 5,5 do 6,5 a najkorzystniej przy około 6,0. Temperatura może być w zakresie od około 5 do 25°C, korzystnie od 12 do 22°C, a najkorzystniej będzie wynosiła około 12°C. Stężenie białka w stanie równowagi wynosiłoby od około 5 do 60 mg/ml, korzystnie 30 do 50 mg/ml, a najważniejszej około 40 mg/ml.

Czas inkubacji w 12°C do 22°C może zmieniać się od 2 do 20 dni. Uważa się, że opisane metody krystalizacji będą także użyteczne do krystalizacji rhuIL-4 pochodzącej z komórek innego gospodarza (np. z hodowli komórek ssaków, drożdży, owadów i innych) lub huIL-4 pochodzących ze źródeł naturalnych (np.ludzkich limfocytów z krwi obwodowej lub ludzkich linii komórkowych wytwarzających huIL-4). Uważa się także, że metoda będzie odpowiednia dla homologicznych białek-interleukin-4, pochodzących z innych gatunków.

Krystaliczną rhuIL-4 z wiszących kropli wydziela się i przemywa dokładnie w 55% siarczanu amonu, 40 mM buforu-fosforanu sodu, pH 6,6, w temperaturze otoczenia (22-25°C). Po pewnym rozpuszczeniu w 20 mM fosforanu sodu-buforu, pH 7,4 z 0,15 M chlorku sodu, kryształy wykazywały aktywność proliferacji komórek T (20 x 10⁷jednostek/mg), identyczną jak dla próbki kontrolnej rhuIL-4, która nie była krystalizowana. Gdy poddano elektroforezie SDS-PAGE, migracja elektroforetyczna ponownie rozpuszczonych kryształów rhuIL-4 była taka sama jak migracja próbki kontrolnej. Podobnie, w HPLC z odwróconymi fazami, wzorzec elucji rozpuszczonych ponownie kryształów nie różnił się od wzorca elucji próbki kontrolnej. W wyniku długiego czasu inkubacji w 22°C nie nastąpiła żadna degradacja protein. Co ważniejsze, proces krystalizacji, po którym nastąpiło ponowne rozpuszczenie w buforze fizjologicznym nie zniszczył aktywności rhuIL-4 do proliferacji komórek T.

Wyniki z dyfrakcji rentgenograficznej początkowo zebrano do rozdzielczości 2,7 A stosując detektor powierzchniowy. Ramy oscylacji obejmowały 0,25 i były mierzone przez 10 minut. Indeksowanie i całkowanie danych natężenia przeprowadzono stosując programy IENGEN [Howard i wsp., J. Appl. Crystallogr. 20:383 (1987)]. Dane indeksowano w układzie tetragonalnym; za = 92,1 (2), h = 92,1 (7) i c = 46,5 (1) A. Grupa przestrzenna jest P₄2,2 lub P4₃2,2.

Następnie wykonane dokładne fotografie przy naświetlaniu promieniami rentgenowskimi interleukiny-4 potwierdziły grupę przestrzenną i parametry komórki jednostkowej. Kryształy tetragonalne są odporne na promieniowanie rentgenowskie i powodują dyfrakcję w temperaturze pokojowej co najmniej przez 5 dni o co najmniej do rozdzielczości 2,7 A.

Krystalizację w dużej skali można przeprowadzić metodami równoważnymi z dyfuzją par, mianowicie, metodą dializy i ultrafiltracji. Kryształy zaszczepiające otrzymane z doświadczenia z wiszącą kroplą można użyć do przyspieszenia krystalizacji na dużą skalę, gdy ustalą się optymalne warunki. Chociaż korzystne jest zastosowanie siarczanu amonu jako środka strącającego, można go zastąpić innym popularnym siarczanem i cytrynianem, takim jak siarczan sodu, potasu, wapnia lub magnezu, cytrynian sodu i inne (McPherson, Preparation and Analysis of Protein Crystals, 1982 John Wiley and Sons, Nowy Jork). Krystalizację rhuIL-4 w dużej skali można wprowadzić jako końcowy etap oczyszczania i/lub etap zatężania w wytwarzaniu klinicznym. Możliwość długiego przechowywania leku rhuIL-4 w postaci krystalicznej z uwagi na właściwą kryształom trwałość, jest cechą wysoce pożądaną w porównaniu z rhuIL-4 przechowywaną w roztworze ze środkami konserwującymi.

Kryształy wytworzone opisaną metodą stanowią także szczególnie korzystną formę dla wytwarzania postaci użytkowych preparatów farmaceutycznych. Kryształy można stosować np. jako podstawę dla formulacji o spowolnionym uwalnianiu rhuIL-4 in vivo.

Uważa się, że można byłoby wytwarzać kompleksy metali (np. cynku lub żelaza) i hiIL-4 i wtedy następnie krystalizować. Kryształy tych kompleksów można byłoby także stosować

166 951 w formulacjach o spowolnionym uwalnianiu zawierających odpowiednie dodatki farmaceutyczne. Przykładem podobnych formulacji białkowych o spowolnionym uwalnianiu jest kompleks krystaliczny cynku i insuliny (Gennaro A.R. Remington Pharmaceuticals, wyd. Mack Publishing Co , Fasten, Pennsylvania, str. 974-976) i kompleks krystaliczny cynku, insuliny i protaminy (Pharmaceutical Manufactring Encyclopedia, 1989, wyd. Sittig, M., str. 820-821).

Kompozycje farmaceutyczne o spowolnionym uwalnianiu zawierające krystaliczną interleukinę-4 wytwarzaną sposobem według wynalazku można otrzymywać przez zmieszanie takiej interleukiny-4 z metalem i/lub czynnikiem kompleksującym białko, jak opisano powyżej.

Poniższe przykłady bliżej ilustrują wynalazek, nie ograniczając jego zakresu.

Przykład I. Wytworzono krystaliczną IL-4 stosując dyfuzję par metodą wiszącej kropli. We wszystkich poniższych przykładach stosowano oczyszczoną IL-4 wytworzoną przez ekspresje w bakteriach. W niniejszym przykładzie sporządzono wodny roztwór IL-4, zawierający 20 mg/ml IL-4 (co oznaczono spektrofotometrycznie stosując współczynnik absorpcji 0,57/cm/mg/ml w 278 nm), o pH=7 i o stężenie fosforanu sodu 40 mM i stężeniu siarczanu amonu 20%. Kroplę 6 objętości plitra umieszczono na silikonowym szkiełku nakrywkowym i przewrócono nad hodowlą tkankową w 24 zagłębieniach, umieszczoną tak, że kropla zawierająca IL-4 zwisła ze szkiełka nakrywkowego nad roztworem siarczanu amonu w zagłębieniu. Roztwór w zagłębieniu miał stężenie siarczanu amonu 40%, pH=6,9 utrzymywane przez buforujący roztwór fosforanu sodu o stężeniu 37 mM. Całe urządzenie do krystalizacji inkubowano w 22°C w komorze środowiskowej REVCO®. Zarodki kryształów IL-4 pojawiły się czwartego dnia.

Przykład II. Wytworzono kryształy IL-4 w sposób opisany w przykładzie I, przy zastosowaniu następujących zmienionych parametrów. Stężenie IL-4 wynosiło 10 m/ml wodnego roztworu. Stężenie siarczanu amonu w roztworze równoważącym w zagłębieniu wynosiło 35% przy pH=6,5, utrzymywanym za pomocą roztworu buforującego fosforanu sodu o stężeniu 35 mM. Zarodki kryształów IL-4 pojawiły się siódmego dnia.

Przykład III. Wytworzono kryształy IL-4 według przykładu I, przy zastosowaniu następujących zmienionych parametrów. Stężenie IL-4 wynosiło 40 mg/ml. Stężenie siarczanu amonu w roztworze równoważącym w zagłębieniu wynosiło 35% przy pH=6,8, utrzymywanym za pomocą roztworu buforującego fosforanu sodu o stężeniu 37 mM. Zarodki kryształów IL-4 pojawiły się czwartego dnia.

Przykład IV. Wytworzono kryształy IL-4 według przykładu III, przy zastosowaniu temperatury inkubacji 12°C. Zarodki kryształów IL-4 pojawiły się siódmego dnia.

Przykład V. Wytworzono kryształy IL-4 według przykładu IV, z tą różnicą, że stężenie roztworu siarczanu amonu w zagłębieniu wynosiło 34%, a pH roztworu w zagłębieniu wynosiło 6,7. Zarodki kryształów IL-4 pojawiły się siódmego dnia.

Przykład VI. Wytworzono kryształy El-4 według przykładu IV, z tą różnicą, że stężenie roztworu siarczanu amonu w zagłębieniu wynosiło 39%, a pH roztworu w zagłębieniu wynosiło 6,6. Zarodki kryształów IL-4 pojawiły się siódmego dnia.

Przykład VII. Wytworzono kryształy IL-4 według przykładu IV, z tą różnicą, że stężenie roztworu siarczanu amonu w zagłębieniu wynosiło 36, a pH roztworu w zagłębieniu wynosiło 6,5. Zarodki kryształów IL-4 pojawiły się siódmego dnia.

Przykład VIII. Wytworzono kryształy IL-4 według przykładu IV, z tą różnicą, że stężenie roztworu siarczanu amonu w zagłębieniu wynosiło 36%, a pH roztworu w zagłębieniu wynosiło 6,4. Zarodki kryształów IL-4 pojawiły się siódmego dnia.

166 951

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 1,00 zł.

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania tetragonalnych kryształów ludzkiej interleukiny-4, powodujących dyfrakcję promieni rentgenowskich co najmniej do rozdzielczości 2,7 A, znamienny tym, że inkubuje się ludzką interleukinę-4 w buforowym wodnym roztworze o pH 5-7, zawierającym siarczan lub cytrynian, w którym stężenie interleukiny-4 w równowadze wynosi od około 5 do 60 mg interleukiny-4 na ml roztworu, w czasie wystarczającym do utworzenia się tetragonalnych kryształów interleukiny-4.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że buforowy roztwór zawiera siarczan amonu i ma pH=6,0.
3. 3. Sposób według zastrz. l, znamienny tym, że stężenie interleukiny-4 wynosi od 30 do 50 mg/ml.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stężenie interleukiny-4 wynosi 40 mg/ml.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że inkubowanie IL-4 prowadzi się w temperaturze około 12°C.

   * * *