HU208474B - Method for removing cyclodextrine remains from fats and oils - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás ciklodextrinmaradékok eltávolítására zsírokból és olajokból, amelyekből komplexbe vihető' nem kívánatos anyagokat - mind például szterineket, különösen koleszterint, szabad zsírsavakat, vitaminokat, festékanyagokat és egyéb szennyezó'ket távolítottak el ciklodextrin segítségével, és amelyek ezért egy bizonyos mennyiségű maradék ciklodextrint tartalmaznak.

Ismeretes, hogy az emberi vérszérum megnövekedett koleszterinértéke megnöveli az arterioszklerózis, illetve a koronáriás szívbetegségek rizikófaktorát. Ezért az élelmiszeriparban jelentó's erőfeszítéseket tesznek annak érdekében, hogy az állati eredetű, zsírokban gazdag élelmiszerek koleszterin-, illetve koleszterin-észter-tartalmát lényegesen csökkentsék. Ezzel kapcsolatban azonban jelentó's nehézséget okoz az, hogy az élelmiszerek érzékszervi és táplálkozásfiziológiai sajátosságait messzemenó'en megó'rizzék.

A koleszterinszármazékok eltávolítására egy viszonylag kíméletes eljárás komplexbe vitelük β-ciklodextrinnel és a képzó'dött komplex elválasztása.

A 0 256 911 számú európai közrebocsátási irat szerint egy folyékony zsiradékmasszát szilárd ciklodextrinnel kezelnek, minek hatására a koleszterinértékek a leírás szerint körülbelül 80%-ig terjedő' mértékben csökkennek; ehhez azonban többszöri ciklodextrines kezelés szükséges.

A 164 933 számú európai közrebocsátási iratban Bacillus megaterium eredetű α-amiláz alkalmazását ismertetik α-ciklodextrin lebontására. Bár viszonylag magas enzimkoncentrációt használnak és a reakcióidő' is igen hosszú (például 10 nap), az α-ciklodextrin csak 45—78%-át tudják hidrolizálni a felhasznált a-amilázokkal.

A Carbohydr. Rex. 777, 1-11 (1983) közlemény szerint Bacillus coagulans eredetű CTG-ázt alkalmaznak viszonylag hosszú (15-40 órás) reakcióidőkkel. A ciklodextrinek lebontását azonban így is csak részlegesen tudják megvalósítani.

A Carbohydr. Rés. 137, 217-25 (1985) cikkben ciklodextrinek enzimes lebontását írják le Bacillus macerans-ból vagy Klebsiella pneumoniae-ból származó CTG-ázzal. A reakcióidó'ró'l és a lebontás fokáról nem tesznek említést; valószínű azonban, hogy a Bacillus coagulans-ból származó CTG-ázokhoz hasonlóan ezeknek az enzimeknek az aktivitása is viszonylag csekély, azaz hosszabb reakcióidő alatt is csak viszonylag kis lebontási arányokat biztosítanak.

Schlenk, W. és Sand. V. M. közleményéből [J. Am. Chem. Soc., 84, 2312, (1961)] ismeretes, hogy szabad zsírsavak ciklodextrinnel komplexekbe vihetők.

Zsírokban és olajokban a ciklodextrin és a zsírsavak között képződő komplexek kizárólag az olajos fázisban helyezkednek el. Mivel a ciklodextrint lebontó enzimek kizárólag a vizes fázisban vannak jelen, feltételezhető, hogy a ciklodextrin enzimes lebontása tökéletlenül vagy igen lassan megy végbe, ha egyáltalán lezajlik.

Ennél az eljárásnál jelentős nehézséget okoz továbbá az a tény, hogy a feloldódott ciklodextrin egy része a zsírokban és olajokban visszamarad, ha elválasztásra az eddig ismert módszereket alkalmazzák. A ciklodextrinek (α-, β-, γ-), amelyek 6-8 glükózegységből álló gyűrű alakú oligoszacharidok, toxikológiailag ártalmatlanok. Az egereken és patkányokon orális adagolással végzett akut toxicitási vizsgálatok sem utaltak semmiféle toxikus hatásra. Ennek dacára a ciklodextrineket számos országban mind ez idáig nem engedélyezték mint élelmiszeradalékokat (food additive).

Találmányunk célkitűzése ezért az volt, hogy olyan eljárást dolgozzunk ki ciklodextrinmaradékok zsírokból és olajokból való eltávolítására, ami lehetővé teszi a ciklodextrin gyors, messzemenő és szelektív eltávolítását a kezelt kiindulási anyagból komoly műszaki felszerelés nélkül is; ezt mind ez ideig senkinek sem sikerült megvalósítania.

Ezt a feladatot találmányunk értelmében úgy oldjuk meg, hogy olaj-a-vízben emulziót készítünk, adott esetben a víz vagy az emulzió pH-értékét az enzim(ek) hozzáadása előtt az alkalmazott enzim(ek) számára kedvező pH-tartományba állítjuk be, és a ciklodextrint annak 1 g-jára számítva legalább egy α-amiláz 10500 FAU mennyisége - amely az Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bacillus polymyxa, Bacillus coagulans vagy egy Flavobacterium által termelt a-amiláz vagy sertéspankreászból származó amiláz - és/vagy egy CTG-áz - amely a Bacillus, Klebsiella, Micrococcus vagy lúgos közeget kedvelő baktériumok által termelt CTG-áz - a ciklodextrin 1 g-jára számított 0,520 U mennyisége segítségével enzimesen lebontjuk, adott esetben kétértékű kationok vagy akceptorok jelenlétében, a zsír, illetve olaj olvadáspontja és 70 °C közötti hőmérsékleten.

Meglepő módon azt találtuk, hogy ezzel az eljárással az olajokban és zsírokban levő ciklodextrin gyakorlatilag teljesen lebontható gazdaságos módon. Ez azért meglepő, mert a ciklodextrineket mint az ot- és β-amilázok hatásos inhibitorait írták le [Weselake, R. J., Hill, R. D.: Cereal Chem., 60, 98, (1983)] és a legtöbb a- és β-amilázzal szemben messzemenó'en ellenállónk. Találtak azonban néhány α-amiláz típust - úgymint a Bacillus polymyxa vagy az Aspergillus oryzae amiláza, vagy a sertéspankreászból származó amiláz - amelyek hidrolizálni tudják a ciklodextrineket, de csak kis sebességgel. Ezért különösen meglepő és előre nem látható volt, hogy ez az aktivitás zsír- és olajemulziókban elegendő ahhoz, hogy a ciklodextrint viszonylag gyorsan és teljesen lebontsa.

A találmány szerinti eljárásnál az állati vagy növényi eredetű zsírokból vagy olajokból álló kiindulási anyagot, így például vajzsírt, sertés- vagy marhazsírt, libazsírt, halolajokat, napraforgóolajat, amelyek ciklodextrines kezelés következtében még valamennyi, például 0,001-1,0 tömeg% ciklodextrin maradékot tartalmaznak, enzimes kezelésnek vetjük alá.

Ehhez előnyösen Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bacillus polymyxa, Bacillus coagulans vagy Flavobacterium mikroorganizmusok által termelt vagy sertéspankreászból származó α-amilázt használunk. A CTG-ázok (ciklodextrin-íranszglikozilázok = EC

HU 208 474 Β

2.4.1.19) csoportjából különösen alkalmasak a Bacillus nemzetségbe tartozó baktériumok (például Bacillus macerans, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus circulans vagy Bacillus ohbensis), Klebsiellák (például pneumoniae), Micrococcusok (például variáns) vagy lúgkedveló' baktériumok (például a 38-2 vagy a 17-1 számúak) által termelt CTGázok. Az említett enzimeket más eredetű gazdasejtek genetikai átalakításával is nyerhetjük. Ezek az a-amilázok, illetve CTG-ázok a ciklodextrin gyakorlatilag teljes lebontását teszik lehetó'vé. A szükséges enzimmennyiség lényegében a zsír vagy az olaj kiindulási ciklodextrin-tartalmához igazodik és α-amilázok esetében 10-500 FAU/g eltávolítandó ciklodextrin/1 FAU (fungal α-amylase unit) standard körülmények között (szubsztrátum oldható keményítő, inkubációs idő 720 perc, hőmérséklet 37 °C, pH = 4,7) 5,2 g keményítőt bont le 1 óra alatt). Ha CTG-ázokat alkalmazunk, úgy azokat az eltávolítandó ciklodextrin 1 g-jára számítva 0,5-20 U (1 U az a mennyiség, ami percenként 1 pmól szubsztrátot alakít át) mennyiségben alkalmazzuk. Használhatunk több enzimet is, ez azonban általában rontja a módszer gazdaságosságát, mert nem javítja a hatást. Egy előnyös megvalósítási mód szerint α-amiláz és CTG-áz keverékeit alkalmazzuk.

A találmány szempontjából lényeges, hogy a zsírt vagy az olajat olaj-víz emulzió formájában alkalmazzuk. Ebből a célból a kiindulási anyagot, adott esetben folyékonyan vízben emulgeáljuk, amelynek során 1 kg zsírhoz vagy olajhoz előnyösen 0,1-5 kg vizet adunk. A víz már tartalmazhatja az a-amilázt és/vagy a CTG-ázt, az enzimet azonban hozzáadhatjuk akkor is, amikor az emulziót már elkészítettük. Az enzim hozzáadása előtt a víz vagy az emulzió pH-értékét előnyösen az alkalmazott enzim számára kedvező, különösen az enzim számára optimális tartományba állítjuk be. A pH beállítását előnyösen pufferekkel végezzük, alkalmazhatunk azonban egyszerűen savakat vagy bázisokat is, különösképpen elfogyasztható anyagokat, mint például citromsavat, tejsavat vagy ezek sóit. Adott esetben az emulzióhoz még kofaktorokat, így kétértékű ionokat (például kalcium-, magnéziumionokat) adunk nyomnyi mennyiségben. Ezen kívül a CTG-ázokhoz még akceptorokat, mint például glükózt is keverhetünk.

A kezelési körülményeket, így a hőmérsékletet és az időtartamot bizonyos határok között változtathatjuk, de a zsíroknak és olajoknak folyékony fázisban kell lenniük, azaz az enzimes bontást a zsír vagy olaj olvadáspontja és 70 °C közötti hőmérsékleten kell végezni. Az enzimes lebontás előnyös hőmérséklete 25-55 °C, és a szokásos kezelési idő 1-5 óra.

A találmány szerinti eljárás segítségével műszakilag különösen egyszerű módon lehetséges a ciklodextrin messzemenő és szelektív eltávolítása a kezelt zsírokból vagy olajokból úgy, hogy a maradék ciklodextrintartalom a 10 ppm-nél kisebb kimutathatósági határ alatt legyen.

A találmány szerinti megoldást a következő nem korlátozó példákkal világítjuk meg közelebbről.

1. példa kg, β-ciklodextrinnel előkezelt halolajhoz, amelynek maradék β-ciklodextrin tartalma 150 ppm, 1 kg vizet keverünk és 40 °C hőmérsékleten emulgeáljuk. Az emulzió pH-értékét citromsavval 5,5-re állítjuk be. Ezután hozzáadjuk egy Aspergillus oryzae-ból származó α-amiláz keverék 50 FAU-nyi mennyiségét, a Fungamyl 800 néven forgalmazott termék formájában (gyártja a Novo Industri A/S, Bagsvoerd, Dánia).

órás, 40 °C-on való inkubálás után a β-ciklodextrint már nem lehet kimutatni (kimutatási határ 10 ppm).

2. példa kg, β-ciklodextrinnel előkezelt vajolajat, amelynek maradék β-ciklodextrin tartalma 2500 ppm, 50 °C-on emulgeálunk 1 kg vízben. Az emulzió pHértékét citromsavval 6,2-re állítjuk be, és 50 °C-on 2 óra hosszat inkubáljuk Bacillus coagulans-ból származó a-amiláz 250 FAU-nyi mennyiségével (nem tisztított készítmény). Ez után a kezelés után a β-ciklodextrint már nem lehetett kimutatni (kimutatási határ 10 ppm).

3. példa kg marhafaggyút, amelynek maradék a-ciklodextrin tartalma 200 ppm, 5 mmól-l-es kalcium-szulfát oldatban emulgeálunk 40 °C-on és pH-értékét citromsavval 6,5-re álh'tjuk be. Ezután az emulzióhoz 5 g glükózt és Bacillus macerans-ból származó CTG-áz 20 U-nyi mennyiségét adjuk. 2,5 órás, 40 °C-on való inkubálás után az a-ciklodextrint már nem lehetett kimutatni (kimutatási határ 10 ppm).

4. példa kg vajolajat, amelyet β-ciklodextrinnel előkezeltünk és amelynek maradék β-ciklodextrin tartalma 2300 ppm, 1 kg vízben emulgeálunk 40 °C-on. Az emulzió pH-értékét citromsavval 6,0-ra állítjuk be.

Ezután az emulzióhoz 5 g glükózt adunk. A β-ciklodextrin lebontására az elegyhez 10 U Bacillus macerans-ból nyert CTG-ázt és 100 FAU Aspergillus oryzae-ból nyert α-amilázt adunk. 2 órás inkubálás után 40 °C-on a β-ciklodextrint már nem lehetett kimutatni (kimutatási határ 10 ppm).

Claims (6)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás ciklodextrinmaradékok eltávolítására zsírokból és olajokból, azzal jellemezve, hogy olaj-avízben emulziót készítünk, adott esetben a víz vagy az emulzió pH-értékét az enzim(ek) hozzáadása előtt az alkalmazott enzim(ek) számára kedvező pH-tartományba állítjuk be, és a ciklodextrint annak 1 g-jára számítva legalább egy a-amiláz 10-500 FAU menynyisége - amely az Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bacillus polymyxa, Bacillus coagulans vagy egy Flavobacterium által termelt α-amiláz vagy sertéspankreászból származó amiláz - és/vagy egy

   HU 208 474 Β

   CTG-áz - amely a Bacillus, Klebsiella, Micrococcus vagy lúgos közeget kedvelő baktériumok által termelt CTG-áz - a ciklodextrin 1 g-jára számított 0,5-20 U mennyisége segítségével enzimesen lebontjuk, adott esetben kétértékű kationok vagy akceptorok jelenlétében, a zsír, illetve olaj olvadáspontja és 70 °C közötti hőmérsékleten.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az enzimes bontást egy CTG-áz alkalmazásával végezzük.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az enzimes bontást 25-55 °C hőmérsékleten végezzük.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 1 tömegrész zsírra vagy olajra
5. 5 számítva 0,1-5 tömegrész vízzel emulgeálunk.

   5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kétértékű ionokként kalciumés/vagy magnéziumionokat alkalmazunk.
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, 10 azzal jellemezve, hogy akceptorként glükózt alkalmazunk.