HU208258B - Method for producing virusless natural matters - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás természetes eredetű anyagok előállítására oly módon, hogy az előállítás során a nyersanyagban előforduló vírusoknak mind a csupasz, mind a burokkal (peplonnal) rendelkező formái inaktiválódnak.

Ismeretes, hogy a lipideknek halogénezett szénhidrogénekkel (például kloroformmal vagy fluorokarbonokkal) történő extrakciója során a burokkal rendelkező vírusok inaktiválódnak a burok (peplon) szétesése következtében (EP-B1-0 115 549 számú szabadalmi leírás), míg a csupasz vírusok ellenállóak számos szerves oldószerrel szemben. E tulajdonságuk miatt a biológiai eredetű anyagokban, így a természetes eredetű, parenterálisan adagolható gyógyászati készítményekben (szervkivonatok, hormonkészítmények) intakt állapotban jelen lehetnek és fertőzések forrásává válhatnak.

Lipideknek kloroform-metanol-víz elegyekkel történő extrahálására Bligh és Dyer írtak le egy eljárást [Can. J. Biochem. Physinl., 37, 911-917 (1959)]. A leírás szerint optimális eredményt úgy érnek el, hogy a szövetet kloroform-metanol elegyben elhomogenizálják úgy, hogy az oldószerek a szövet víztartalmával egyfázisú elegyet képezzenek, majd ezt víz és/vagy kloroform hozzáadásával megbontják. A kétfázisú elegyben a lipideket a kloroform, a nem-lipideket a metanol-víz fázis fogja tartalmazni, azonban a vírusok, különösen a csupasz vírusok inaktiválódása a kivonás során nem biztosított.

Kísérleteink során meglepetéssel tapasztaltuk, hogy a halogénezett alifás szénhidrogéneknek, például a kloroformnak, vagy az alkoholoknak, például metanolnak ellenálló csupasz vírusok egy halogénezett 1-4 szénatomos alifás szénhidrogénből és egy legfeljebb 6 szénatomos alkoholból, álló keverékkel inaktiválhatók, illetve elpusztíthatok. Ilyen oldószerelegyek előnyösen állíthatók elő kloroformból és etanolból, és/vagy propanolból, és/vagy butanolból víz hozzáadásával vagy anélkül, különösen kloroformból és metanolból. Különösen jó eredmény érhető el, ha egyfázisú metanolkloroform-víz elegyet használunk.

A találmány szerinti oldószerelegyben a halogénezett alifás szénhidrogén lehet 1,2-diklór-etán, 1,1diklór-bután, 1,1,1-triklór-etán vagy triklór-etilén, főleg azonban kloroform; az alkohol lehet etanol, propánok izopropanol, butanol vagy hexanol, de főkén metanol, Vizet előnyösen akkor adunk az elegyhez, ha ezzel az egyfázisúvá tehető.

A vírusok inaktiválódása, illetve elpusztulása általában akkor következik be, amikor a biológiai eredetű nyersanyagokat elhomogenizáljuk, feloldjuk vagy csak kezeljük egy halogénezett alifás szénhidrogénből és egy alkoholból és adott esetben még vízből vagy fiziológiás konyhasó-oldatból álló (például vízből vagy fiziológiás konyhasó-oldatból, kloroformból és metil-alkoholból álló) oldószerkeverékkel úgy, hogy a keveréket 1-3 órán át alacsony, például -20 ’C és 10 ’C közötti hőmérsékleten tartjuk. Különösen előnyös, ha a kezelést vagy feloldást egyfázisú oldószer-keverékben, például 1 térfogatrész fiziológiás konyhasó-oldatból, 1,1 térfogatrész kloroformból és 2,2 térfogatrész metanolból készült oldószerelegyben 2 órán át végezzük, majd az elegyet további 1 térfogatrész fiziológiás konyhasó-oldattal és 1,1 térfogatrész kloroformmal megbontjuk. Az így létrejött kétfázisú rendszernek sem a vizes, sem a szerves fázisában nem mutatható ki aktív vírusok jelenléte, akár köpennyel rendelkező (peplonos), akár csupasz vírusok voltak jelen a nyersanyagban.

A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi bármilyen biológiai eredetű nyersanyag feldolgozását embernek vagy állatoknak adagolható, vírusmentes, természetes eredetű anyagok előállítása céljából. Az eljárás nem csupán a zsíroldószerekkel kivonható, de a vízoldékony természetes eredetű anyagokra is alkalmazható, mivel a fent leírt módon nyert vizes fázisból sem mutathatók ki aktív vírusok.

A találmány szerinti eljárás kivitelezését egy ismert készítmény előállításán mutatjuk be. A Surfactant SFRI 1 felületaktív anyagot állatorvosilag egészségesnek minősített szarvasmarhák tüdejéből, az alveolusok fiziológiás sóoldat és kloroform elegyével történő kimosásával állítják elő. Az SF-RI 1 egy keverék, ami foszfolipidekből (kb. 90 tömeg%), koleszterinből (kb. 3 tömeg%), gliceridekből (kb. 4 tömeg%), zsírsavakból (kb. 0,3 tömeg%) és B-, illetve C-típusú felületi fehérjékből (kb. 1 tömeg%) áll. Bár a marhatüdő általában nem tartalmaz szarvasmarha-vírusokat, ennek lehetősége nem zárható ki teljes biztonsággal. A találmány szerinti eljárás hatékonyságának kipróbálására tehát két tesztvírust adtunk az öblítékből centrifugálással nyert nyers szörfaktánshoz: egy burokkal rendelkező (I. típusú szarvasmarha-herpeszvírus, BHV-1) és egy csupasz (ECBO-vírus LCR-4 törzse, Giesseni Egyetem, Állatorvostudományi Kar Virológiái Intézete) vírust. A BHV-1 a szarvasmarha-állományokban előforduló, burokkal rendelkező vírusok tipikus képviselője, míg az ECBO-vírus egy viszonylag ritkábban előforduló csupasz vírus.

A szarvasmarha-állományokban többek között légúti szincícium-vírus (paramixovírus), a fertőző οσ- és légcsőgyulladás vírusa (herpeszvírus), a parainfluenza vírusa (paramixovírus), a marha-fehérvérűség vírusa (retrovírus), a száj- és körömfájás vírusa (picomavírus) vagy a veszettség vírusa (rhabdovírus) okozhat fertőzéseket. A felületaktív készítményeket tulajdonképpen minden szóba jöhető vírusra vizsgálni kellene, de ez aligha oldható meg. Eljárásunk hatékonysága csak úgy vizsgálható, hogy a felületaktív készítményhez kísérletileg kipróbált vírusokat adunk, majd az inaktiváló kezelés után megkíséreljük az aktív vírusok kimutatását.

Tesztvírusnak a szarvasmarha-állományokban előforduló vírusok közül

a) egy burokkal rendelkező (penlonos) DNS-vírust, és

b) egy csupasz RNS-vírust választottunk.

A kiválasztott DNS-vírus a fent említett BHV-1 (más jelzésrendszer szerint IBR-IPV) vírus, amelynek kloroformra és dietil-éterre érzékeny lipoprotein-burka (peplonja) van. A betegség járvány szerűen léphet fel a borjak között. A virion átmérője 150-180 nm; sterilszűréssel nem távolítható el.

Az RNS-vírus a már szintén említett ECBO-vírus,

HU 208 258 Β amelynek LCR-4 jelzésű törzsét a DVG (Német Állatorvosok Társasága) a fertőtlenítőszerek hatékonysági vizsgálataihoz hivatalosan használja. Az ECBO-vírus a Picomaviridae család Enterovírus nemzetségébe tartozó egyszálú RNS-vírus; burokkal nem rendelkezik, kapszidja gömbszimmetrikus, átmérője 24—30 nm, kloroformnak ellenáll.

A tesztvírusokat a tenyészet tápfolyadékában, tisztítás nélkül használtuk; az aktív virionok koncentrációja 10^{2 * * 5} (BHV-1) és 10^{6 *}·⁸ (LCR-4) KID₅₀/ml volt (a KID₅₀ azt a virion-mennyiséget jelenti, amely a fogékony szövettenyészet sejtjeinek 50%-át képes megfertőzni).

Az előállítási eljárást, a tesztvírusok hozzáadását és a mintavételeket a szarvasmarha-tüdő mosásából nyert nyers felületaktív anyag feldolgozásától kezdve az 1. példa mutatja be. A 2. példa egy ellenőrző vizsgálatot mutat be, amit mindkét vírussal végrehajtottunk.

1. példa

Pozitív kontrollként a vírust tartalmazó tápfolyadékot 9 g/1 nátrium-kloridot tartalmazó (fiziológiás) konyhasóoldattal 1:1 arányban hígítottuk (1. minta), amit 0,22 μτηes szűrőn sterilre szűrve kapjuk az la. mintát. Tulajdonképpen ez helyettesíti a fertőzött nyersanyagot, mivel a natív felületaktív anyag steril szűréssel nem baktériummentesíthető (eltömíti a szűrőt).

A marhatüdők öblítékéből a nyers felületaktív anyagot centrifugálással nyerjük ki. A nedves üledék a felületaktív anyag mellett sejttörmeléket és baktériumokat tartalmaz. A nyers üledék 23 ml-ét 23 ml vírust tartalmazó tápfolyadékkal felszuszpendáljuk. Az így fertőzött szuszpenziót Bligh és Dyer leírása szerint extraháljuk: 50,6 ml kloroform és 101,2 ml metanol elegyével alaposan elkeverjük, és előnyösen -10 —20 °C közötti hőmérsékleten 2 órán át állni hagyjuk. A kicsapódott fehérjéket centrifugálással eltávolítjuk, majd 46 ml fiziológiás sóoldat és 50,6 ml kloroform hozzáadásával a homogén elegyet megbontjuk. A vizes fázist elkülönítjük és baktériummentesre szűrjük (2. minta). A szerves fázist ugyancsak megszűrjük, az oldószert vákuumban, 10 °C hőmérsékleten ledesztilláljuk, és a lipideket szobahőmérsékleten megszárítjuk. 50 mg száraz lipidhez 0,95 ml desztillált vizet adunk és 10 percig rázzuk; az így keletkező liposzómák átlagos átmérője kb. 1000 nm (3. minta). A rázással előállított liposzómák egy részét 4 percig ultrahanggal kezeljük (Branson Sonifier, 20 W átvitt energia, mikrocsúcs): az így kapott liposzómák átlagos átmérője 200 nm (4. minta).

2. példa

A találmány szerinti eljárás vírus-inaktiváló hatását az egyes lépések hatásának vizsgálatával ellenőriztük.

ml ECBI-vírust tartalmazó tápfolyadékot 4 ml fiziológiás konyhasó-oldattal hígítunk és sterilre szűrjük (1. minta).

ml ECBO vírust tartalmazó szuszpenziót 1 ml kloroformmal összerázunk, a vizes fázist elválasztjuk és sterilre szűrjük (2. minta).

ml ECBI-vírust tartalmazó szuszpenziót 0,5 ml metanollal összekeverünk és sterilre szűrjük (3. minta).

ml ECBO-vírust tartalmazó szuszpenziót 11 ml metanollal és 5,5 ml kloroformmal homogénre keverünk. Újabb 5 ml fiziológiás konyhasó-oldat és 5,5 ml kloroform hozzáadására a fázisok szétválnak. A vizes fázist sterilre szűrjük (4. minta).

g SF-RI 1 Surfactant és 5 ml ECBO-vírus szuszpenzió keverékét 11 ml metanol és 5,5 ml kloroform elegyében feloldjuk. 5 ml fiziológiás konyhasóoldat és 5,5 ml kloroform hozzáadására a fázisok szétválnak; a vizes fázist elkülönítjük és sterilre szűrjük (5. minta).

Minden mintát NDBK-szövettenyészetre (Nádin és Darby, marhavese, ATCC CCL 22) oltottunk a tápfolyadékba keverve. Az 1. és la. minták kivételével a többit - sejttoxikus voltuk miatt - csak több átoltás után vizsgáltuk a BHV-1 és az ECBO-vírusokra jellemző elváltozások megfigyelésével.

A nyers szörfaktánsnak 10⁵, illetve 1O^6,8 KID₅₀/ml vírustartalmú tápfolyadékkal való 1:1 arányú összekeverése egy súlyos fertőzöttséget szimulál. A tesztvírusok kimutathatóságának határa kb. 10 KID₅₀/ml, ennek ellenére csak az 1. példa 1. és la. mintáiból sikerült mindkét vírust kimutatni. Az 1. példa 3. és 4. mintáiból - amelyek az előállítási eljárás különböző fázisait szimulálják - nem sikerült vírust kimutatnunk. Az 1. példában bemutatott kísérlet azt igazolja, hogy a Bligh és Dyer szerint végrehajtott extrakció inaktiválja vagy elpusztítja a vírusokat, mert sem a vizes fázisból (2. minta), sem a szerves fázis szárazanyagából (3. és 4. minta) nem tudtuk a nyersanyaghoz adott vírusokat többé kimutatni.

Ez az eredmény a burokkal rendelkező és emiatt a kloroformra érzékeny BHV-1 vírus esetében elvárható volt, nem lehetett azonban előre látni a csupasz ECBOvírus esetében. Az ECBO-vírussal elvégzett és a 2. példában bemutatott ellenőrző vizsgálatok során az 1., 2. és 3. minták pozitívnak bizonyultak, de a metanolkloroform-fiziológiás konyhasó-oldat elegy hatására az ECBO-vírus is inaktiválódott (4. és 5. minták).

A bemutatott eredmények azt mutatják, hogy az ECBO-vírust sem a kloroform, sem a metanol egyedül nem képes inaktiválni, de a két oldószer együtt, homogén szerves-vizes fázist alkotva inaktiválja a csupasz tesztvírust is. A fentiek alapján a találmány szerinti eljárás alkalmas általában vírusok, különösen a csupasz vírusok inaktiválására vagy elpusztítására a biológiai eredetű készítményekben.

Claims (6)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás vírusmentes természetes anyagok előállítására különösen csupasz vírusokat tartalmazó biológiai nyersanyagokból, azzal jellemezve, hogy azokat egy halogénezett alifás szénhidrogén és egy legfeljebb 6 szénatomos alkohol elegyével kezeljük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy kloroform és metanol, és/vagy propanol, és/vagy butanol elegyét használjuk.

   HU 208 258 B
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy kloroform-metanol elegyét használunk
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az oldószerelegyhez még vizet is adunk.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy kloroform, metanol és víz egyfázisú elegyét használjuk.
6. 6. A 4. vagy 5. igénypont szerinti eljárás azzal 5 jellemezve hogy víz helyett fiziológiás konyhasó-oldatot használunk.