PT92788B - Processo para a preparacao de substancias naturais isentas de virus - Google Patents

Description

Descrição referente ã patente de invenção de DR. KARL THOMAE GESELLSCHAFT MIT BESCHRÃNKTER HAFTUNG, alemã, industrial e comercial, con sede em D-7950 Biberach an der Riss, República Federal Alemã, (ir ventores: Dr. Dr. Bernd Disse e Eberhard Weller, residentes na Ale manha Ocidental), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS

NATURAIS ISENTAS DE VIRUS.

DESCRIÇÃO

A invenção refere-se a um processo para a preparação de substâncias naturais isentas de vírus, independentemente do facto de os vírus serem revestidos ou não.

As extracções de lípidos com hidrocarbonetos halogenados, como clorofórmio, freon, conduzem, como se sa be, a uma inactivação de vírus revestidos por destruição do invõ lucro (vide EP-B1-0 111 549). Os vírus não revestidos têm sido até hoje resistentes a muitos solventes orgânicos, constituindo assim possivelmente uma fonte de contaminação de materiais de origem biológica, por exemplo de substâncias naturais para util_i zação parenteral em seres humanos, como extractos de órgãos e preparações hormonais.

E.G. Bligh e W.J. Dyer descreveram um méí todo para a extracção de lípidos através de misturas de clorofór mio-metanol-água (vide Can. J. Biochem. Physiol. Vol. 37 (1959),

911-917). Obtém-se assim uma extracção de lípidos óptima, guando

se homogeniza o tecido com uma mistura de clorofórmio e metanol, que origina com a água contida no tecido uma mistura monofásica. Em seguida pode diluir-se a mistura homogénia com água e/ou clorofórmio, formando-se um sistema bifásico, contendo a fase de clorofórmio os lípidos e a fase de metanol-água os não lípidos. Este trabalho não faz referência a qualquer inactivação de vírus, em especial a vírus não revestidos.

Descobriu-se então surpreendentemente, que os víruos não revestidos, que são resistentes isoladamente a hidrocarbonetos alifáticos halogenados, como clorofórmio, e a al coois, como metanol, podem ser mortos ou inactivados com uma mis tura constituída por um hidrocarboneto alifãtico halogenado e por um álcool com até 6 átomos de carbono. Para este fim, revela ram-se preferencialmente adequados misturas de clorofórmio e eta nol e/ou propanol e/ou butanol com ou sem adição de água, em par ticular misturas de clorofórmio e metanol. Obtêm-se resultados particularmente bons com uma mistura de metanol/clorofórmio/água, de preferência na forma de uma fase ternária,

Como hidrocarbonetos alifáticos halogena dos referem-se por exemplo 1,2-dicloroetano, 1,1-diclorobutano,

1,1,1-tricloroetano, tricloroetileno, mas em especial clorofórmio; como álcoois referem-se por exemplo etanol, propanol, isopropanol, n-butanol, n-hexanol, mas em especial metanol. É part_i cularmente útil uma adição de água, quando deste modo se obtém a formação de fases ternárias.

A inactivação ou morte dos vírus consegue-se em geral por homogenização ou dissolução ou simples trata mento do substrato ou material em causa com ou numa mistura cons tituída pelo solvente alifãtico halogenado e por um álcool e, conforme o caso, por água, constituída por exemplo por água ou soro fisiológico, clorofórmio e metanol, deixando-se a mistura em repouso durante cerca de 1 a 3 horas a temperaturas baixas, por exemplo a -20 a 10CC. £ particularmente vantajoso o tratamen to ou a dissolução do material numa fase homogénia constituída por uma parte em volume de soro fisiológico, 1,1 partes em volume de clorofórmio e 2,2 partes em volume de metanol, adicionando -se, após um tempo de acção de por exemplo 2 horas, mais uma par te em volume de soro fisiológico e 1,1 partes em volume de cloro

frmio. Ocorre uma separação em duas fases. Tanto na fase aquosa como na orgânica não se detecte: jã qualquer actividade virai, quer estivessem presentes vírus revestidos ou não revestidos.

O processo descoberto para a preparação de substâncias naturais isentas de vírus pode utilizar-se para o tratamento de todas as matérias primas naturais que se destinem a aplicação em seres humanos ou animais. 0 processo aplica-se não só a matérias lípido-extractáveis mas também a simples substâncias resistentes aos solventes, um vez que, por exemplo, a fa se aquosa também não apresenta qualquer actividade víral.

modo de funcionamento do processo de acordo com a invenção pode demonstrar-se por meio de um exemplo. Este exemplo refere-se ao agente tensioactivo SF-RI 1, que se prepara a partir da lavagem de pulmões de vaca saudáveis, retira dos por operação veterinária, por meio da lavagem dos alvéolos com soro fisiológico na presença de solventes orgânicos, por exemplo clorofórmio. 0 SF-RI 1 ê uma mistura de fosfolípidos (cerca de 90% em peso), colesterol (cerca de 3% em peso), glicerideno (cerca de 4% em peso), ácidos gordos (cerca de 0,3% em pe so) e proteínas associadas ao tensioactivo, dos tipos B e C (cer ca de 1% em peso). Em geral não existe qualquer contaminação dos pulmões com vírus específicos das vacas, embora não seja de excluir completamente uma contaminação. Para se poder testar o pro cesso de acordo ccm a invenção, em relação à sua eficácia, adicionou-se ao tensioactivo bruto obtido por centrifugação da lava, gem, em estudos separados, um vírus revestido (vírus de herpes bovino, tipo I, abreviado por BEV 1) e um vírus não revestido (vírus ECBO, estirpe LCE.-4 da Universidade de GieBen, Instituto cie Virologia da Faculdade de Medicina Veterinária) . Estes vírus utilizados no teste são representativos dos vírus revestidos que ocorrem na espécie bovina e dos vírus não revestidos relativamen te raros nesta mesma espécie.

As doenças da espécie bovina podem ser causadas por exemplo pelo vírus sincitial respiratório bovino (vírus Paramyxo), pela rinotraqueite bovina infecciosa (vírus herpes), pela parainfluenza (vírus Paramyxo) e ainda pela leucemia bovina (Retrovírus), pela febre aftosa (vírus Picorna) ou pe la raiva (vírus Rhabdo). Para testar um tensioactivo em relação

à contaminação deveria testar-se cada um dos vírus referidos.

Uma vez gue isto é muito difícil, adicionaram-se ao material a testar, antes do tratamento, vírus de teste significativo, e tes tou-se este material novamente em relação à actividade virai, após a inactivação pelo processo de acordo cora a invenção.

Como vírus de teste, utilizaram-se:

a) um vírus de DNA revestido ocorrente em doenças bovinas, e

b) um vírus de RNA não revestido.

Como vírus de DNA utilizou-se, como mencionado acima, o vírus BHV-1 (ou IBR-IPV), que tem um invólucro de lipoproteína, que é sensível ao clorofórmio e ao éter e que é de origem estritamente bovina com larga expressão em doenças bovinas. 0 diâmetro do virião é de 150 a 180 nm e não é possível removê-lo por filtração esterilizada.

Como vírus de RNA utilizou-se o vírus ECBO já mencionado, que se escolheu como estirpe modelo oficial da DVG (Sociedade Alemã de Medicina Veterinária) no âmbito do teste dos meios de desinfecção químicos; género: Enterovírus, Família: Picornaviridae; vírus de RNA de cadeia simples, não revestido, cápsula cúbica, estável em presença de clorofórmio; diã metro 24-30 nm.

Colocaram-se os vírus a testar como sobrenadantes de cultura com 10^ KID₅₀/ml (BHV-1) ou IO⁶'⁸ KID/_C0/ ml. Trataram-se os filtros em autoclave antes da utilização (ΚΙϋ^θ significa dose virai infecciosa para a cultura, à qual 50% das células são infectadas pelos vírus).

Realizou-se um estudo de validação (esquema 2) paralelamente ao processo de preparação com ambos os ví rus a testar, separadamente. O esquema do processo de preparação, a adição do vírus a testar e a colheita das amostras estão ilustrados no esquema 1 em relação ao tratamento do tensioactivo bru to obtido a partir da lavagem de pulmões de vaca:

Esquema 1:

Como controle positivo misturou-se a camada sobrenadante da cultura de vírus, na proporção 1:1, com 9

g/1 de soro fisiológico (amostra 1). Após filtração através de um filtro 0,22/m retirou-se a amostra la. Esta amostra substitui o material de partida contaminado a testar, uma vez que o tensio activo nativo não pode ser esterilizado por filtração, pois as suas partículas são maiores do que as bactérias entupindo o filtro.

A partir da lavagem dos pulmões de vaca obtém-se o tensioactivo bruto por meio de centrifugação. 0 peletizado húmido obtido contém, para além do tensioactivo, resíduos celulares e bactérias. Neste ponto retiraram-se 23 ml de peletizado de tensioactivo húmido do processo de produção e suspenderam-se em 23 ml de sobrenadante de cultura contendo os vírus.

Extraiu-se esta mistura de tensioactivo contaminada, de acordo com o método de Bligh e Dyer. Para tal, adicionaram-se 50,6 ml de clorofórmio e 101,2 ml de metanol e guardou-se a fase mista homogénea orgânica-aquosa obtida, durante 2 horas, a baixa temperatura, de preferência a -10 a -20QC. Centrifugou-se o precipitado proteico formado. Por meio da adição de 46 ml de 9 g/1 de soro fisiológico e 50,6 ml de clorofórmio, promoveu-se uma separação de fases, separou-se a fase aquosa e esterilizou-se por filtração através de um filtro de membra na de 0,22/m (amostra 2). Esterilizou-se também por filtração a fase orgânica através de un; filtro de 0,22/m. Destilou-se o solvente em vãcuo a IQGC e secou-se o lípido ã temperatura ambiente For 50 mg de lípido seco adicionaram-se 0,95 ml de água destilada. Apõs cerca de 10 minutos de agitação obtiveram-se liposomas de agitação com um tamanho de vesícula de cerca de 1000 nm (amos tra 3). Uma parte dos liposomas tratou-se durante 4 minutos com ultrassons de 20 watt de potência (I-íicrosseringa Branson Sonifier). Obtiveram-se assim vesículas de 200 nm (amostra 4).

Esquema 2:

Para certificar o princípio virai descoberto estudou-se detalhadamente a influência dos passos processu ais isolados.

Para tal misturaram-se 4 ml de sobrenadante de cultura contendo vírus (vírus ECBO) com 4 ml de soro fi siológico a 9 g/1 e esterilizcu-se por filtração (amostra 1).

Agitaram-se 5 ml de suspensão de vírus (vírus ECBO) com 1 ml de clorofórmio. Separou-se a fase aquosa e esterilizou-se por filtração (amostra 2).

Misturaram-se 5 ml de suspensão de vírus (vírus ECBO) com 0,5 ml de metanol e esterilizou-se por filtração (amostra 3).

Misturaram-se 5 ml de suspensão de vírus (vírus ECBO) com 11 ml de metanol e 5,5 ml de clorofórmio até se obter uma fase homogénea. Por meio da adição de 5 ml de soro fisiológico a 9 g/ml e 5,5 ml de clorofórmio provocou-se a separação das fases. A fase aquosa esterilizou-se por filtração (amostra 4) .

Dissolveu-se 1 g de lípido SF-RI 1 numa mistura de 5 ml de suspensão de vírus (vírus EC30) com 11 ml de metanol e 5,5 ml de clorofórmio. Após adição de 5 ml de soro fisiológico a 9 g/1 e de 5,5 ml de clorofórmio ocorreu a separação de fases. Separou-se a fase aquosa e esterilizou-se por filtração (amostra 5).

Testaram-se todas as amostras em relação a culturas celulares MDBK (Nadin e Darby; rim bovino: ATCC CCL 22) em processos de adsorpção e por inoculação no meio de cultura. As amostras, excepto a 1 (la), devido a propriedades citotõxicas, só se testaram após várias subpassagens, em relação as mo dificações específicas do vírus BHV 1 ou do vírus ECBO.

Por meio de mistura da matéria prima ten 5 sioactxva, na proporção 1:1, com o sobrenadante de cultura (10 6 8 e 10 ' KID^g/ml), simulou-se uma elevada contaminação da matéria prima. 0 limite de detecção dos vírus a testar utilizados é de cerca de 10 KID^g/ml. Só nas amostras 1 e la do esquema 1 se conseguiu identificar o vírus BHV-1 revestido ou o vírus ECBO não revestido. Nas amostras 3 e 4 (esquema 1), que simulam as vá rias amostras do processo de produção em diferentes etapas, não se conseguiram detectar os vírus em teste. Os estudos do esquema 1 raostram que logo no processo de extracção segundo Bligh e Dyer, os vírus a testar adicionados foram inactivados ou removidos. Tanto na fase aquosa (amostra 2) como na massa seca da fase orgâ nica (amostras 3 e 4) não se conseguiram detectar os vírus em

teste.

Este resultado era de esperar para o vírus BHV-1 revestido e sensível ao clorofórmio, mas não era de prever para o vírus ECBO não revestido.

Para melhor caracterização e certificação dos passos inactivadores dos vírus, misturaram-se, de acordo com o esquema 2, vírus ECBO com clorofórmio, metanol, metanol-clorofórmio-so fisiológico, bem como com clorofõrmio-metanol-soro fisiológico-SF-RI 1. Nos controles positivos e nas amostras com clorofórmio ou metanol (amostras 1 a 3) puderam detectar-se os efeitos citopatogénicos do vírus ECBO. As amostras 4 e 5 não mostraram, pelo contrario, quaisquer efeitos específicos de vírus sobre culturas celulares MDBK.

Este resultado mostra que os solventes orgânicos clorofórmio ou metanol isoladamente não inactivam os vírus ECBO e que também não afectam os resultados do teste. Sá a acção do clorofórmio e do metanol (em fase mista homogénea orgânica-aquosa) inactivou também o vírus não revestido testado.

Como este tipo de teste mostra, o proceç so de acordo com a invenção é apropriado em geral para a morte ou inactivação de vírus, muito em especial de vírus não revestidos, em preparados ou preparações orgânicas.

- 7 ' Λ·*?

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   - lê Processo para a preparação de substâncias naturais isentas de vírus, em especial as que continham vírus não encapsulados, caracterizado por se tratar essas substâncias com uma mistura de hidrocarbonetos alifáticos halogenados e de álcoois contendo até 6 átomos de carbono.

   - 2ã Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar uma mistura de clorofórmio e me tanol e/ou etanol e/ou propanol e/ou butancl.

   - 3â Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se utilizar uma mistura de metanol-clo rofórmio.

   - 4& Processo de acordo com as reivindicações

   1 a 3, caracterizado por se adicionar ainda água à mistura utili^ zada.

   - 5® - 5δ Processo de acordo cora a reivindicação 4, caracterizado por se utilizar uma fase ternária constituída por clorofórmio, metanol e água.

   Processo de acordo com as reivindicações 4 e 5, caracterizado por se utilizar em vez de água uma solução de soro fisiológico.

   A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 7 de Janeiro de 1989, sob o nQ. P 39 00 350.7.

   Lisboa, 5 de Janeiro de 1990.

   0 AGE5TE OFICIAL Γ) i PROFTFIEDADE IXDCSTEIAL