HU206394B

HU206394B - Process for producing monoclonal antidiotypic antibodies and for detecting antiidiotypic antibodies

Info

Publication number: HU206394B
Application number: HU884647A
Authority: HU
Inventors: Ingegerd Us Hellstrom; Karl Erik Us Hellstrom; Maria S. Us Kahn; Donna Francine Us Beaton; Victor Us Lee
Original assignee: Oncogen Ltd. Partnership,Us
Priority date: 1987-09-10
Filing date: 1988-09-09
Publication date: 1992-10-28
Also published as: FI884114A0; EP0306995B1; DE3855850D1; GR3023725T3; EP0306995A3; EP0306995A2; EP0759442A1; IL87692A; AU630592B2; PT88459B; DE3855850T2; ES2102978T3; HUT47973A; ATE151079T1; NO884024D0; FI884114A; AU2207788A; NZ226129A; JPH02494A; DK500888D0

Description

A találmány szerinti eljárás ismertetése szerteágazó, nagy terjedelmű leírást igényel, amelynek áttekintését jelentősen megkönnyíti a tartalom megfelelő rendszerbe osztályozása. Ennek az osztályozásnak az összegzését adja meg az alábbi tartalomjegyzék. 5

1. A találmány tárgya

2. A találmány háttere; a technika állása

2.1 Anti-idiotípusos antitestek

2.2 Tumorral társult antigének

2.3 Tumor immunitás idiotípusos manipuláció 10

2.4 Szuppresszor sejtek és szuppresszor faktorok

3. A találmány összefoglalása

3.1 Meghatározások

4. Az ábrák leírása

5. A találmány részletes leírása 15

5.1 Antigén stimulálással beindított idiotípusos kölcsönhatások

5.2 Idiotop kifejeződés manipulálása anti-idiotípusus antitestekkel

5.2.1 Korábban is létező tumorellenes idioto- 20 pok kiválasztása és sokszorozása

5.2.1.1 Genetikai korlátozás

5.2.1.2 Az immunizálás útja

5.2.1.3 Idiotop fajlagosság

5.2.2 Belső hasonmás antitestek 25

5.3 Olyan idiotípusra fajlagos anti-idiotípusos monoklonális antitestek előállítása, amelyek egy meghatározott tumor antigénre fajlagosak

5.3.1 Anti-idiotípusos monoklonális antitestek 30 előállítása olyan antitesttel (Abl) végzett immunizálással, amely egy meghatározott tumor antigént ismer fel

5.3.2 Anti-idiotípusos monoklonális antitestek előállítása, amelyek T-sejteken levő olyan 35 idiotop ellen irányulnak, amely egy meghatározott tumor antigént ismer fel

5.4 Az immunológiai potenciál értékelésé és bemutatása a tumor-fajlagos CMI indukciójával

5.5 Anti-idiotípusos antitestek további jellemzése 40

5.6 Alkalmazások az immun-megelőzésben, immunterápiában és immun-assayben

5.6.1 Immunizálás tumor ellen

5.6.2 Adoptált immunterápia

5.6.3 Tumorellenes reaktivitás immun-szupp- 45 ressziójának gátlása

5.6.4 Immun-affinitásos alkalmazások

5.6.5 Immun-assayk

6. Rágcsáló szarkómák immunterápiája olyan autoanti-idiotípusos monoklonális antitestekkel, ame- 50 lyek tumor-specifikus T-sejtekhez kötődnek

6.1 Anyagok és módszerek

6.1.1 Egerek

6.1.2 Tumorok

6.1.3 Késleltetett típusú túlérzékenység (DTH) 55 vizsgálata

6.1.4 Auto-anti-idiotípusos monoklonális antitestek kialakítása

6.1.5 T-sejt hibridómák

6.1.6 Szuppresszor faktorok izolálása monok- 60 lonális antitestekkel végzett affinitás kromatográfiával

6.1.7 A K54SF szuppresszor faktor kötése MCA-1490 sejtekhez

6.1.8 T-sejt vonalak izolálása és tenyésztése

6.1.9 Tumor növekedés in vivő manipulációja

6.2 mAb 4.72 vagy mAb 5.96 szubkután beadása

MCA-1490-re és MCA-1511-re tumor-fajlagos DTH-t indukál

6.3 mAb 4.72 intravénás beadása elfojtja a DTH-t

MCA-1490-re

6.4 T-sejteken levő mAb 4.72-vel meghatározott idiotípus kifejezése, DTH-t közvetítve MCA1490-re

6.5 Szuppresszor T-sejtekből származó faktorokon levő mAb 4.72 által felismert idiotípus kifejezése

6.6 MCA-1490 vagy MCA-1511 tumorokkal bíró egerek szeroterápiája

6.7 Tárgyalás

7. Olyan idiotípusra fajlagos anti-idiotípusos antitestek, amelyek felismernek egy humán melanómával társult GD3 gangliozid antigént

7.1 Anyagok és módszerek

7.1.1 Egerek

7.1.2 Célsejtek

7.1.3 Glikolipid

7.1.4 Monoklonális antitestek

7.1.5 Antitestek összekapcsolása fúrókagyló hemocioninnal

7.1.6 MG-21(Abl)-re fajlagos monoklonális anti-idiotípusos antitestek (Ab2) előállítása

7.1.7 mAb(Abl) kötés gátlás mérése

7.1.8 Immunglobin izotípus meghatározása

7.1.9 Anti-idiotípusos antitest (Ab2) kötési vizsgálat

7.1.10 Antitest radio-jódozása és közvetlen ¹²⁵I-Ab2 kötési vizsgálat

7.1.11 Antitest-FITC konjugálás

7.1.12 Fluoreszcenciás aktivált T-sejt-osztályozó elemzés

7.1.13 Komplement-függő citotoxicitási vizsgálat

7.1.14 Antitest-függő celluláris citotoxicitási vizsgálat

7.1.15 Kompetíciós vizsgálat anti-MG-21 antitestek kimutatására betegek szérumában

7.2 Eredmények

7.2.1 Hibridómák kiválasztása

7.2.2 Az mAb 2Cl(Ab2) fajlagos MG-21-re

7.2.3 Az mAb 2Cl(Ab2) gátolja az MG21 (Abl) kötését M-2669 sejtekhez és GD3 antigénhez dózis-függő módon

7.2.4 A 2C1 antitest gátolja az MG-21-nek CDC és ADCC aktivitását M-2669 sejtek ellen

7.2.5 Anti-MG-21 antitestek kimutatása betegek szérumaiban, vizsgáló mintaként 2C1 mAb-t alkalmazva

HU 206 394 Β

8. p97 melanóma antigénre vonatkozó monoklonális, anti-idiotípusos antitestek

8.1 Anyagok és módszerek

8.1.1 Állatok

8.1.2 Humán melanóma sejtek

8.1.3 Egér melanóma sejtek

8.1.4 Antitestek

8.1.5 Hibridómák átvizsgálása _% 8.1.6 Tanulmányok tisztított anti-idiotípusos antitesteken

Λ 8.1.7 Radioaktívan jelzett p97 versengése az mAb 96.5 Fab-fragmentumaihoz való kötődésért

8.1.8 Kutatások Ab3-ra in vivő

8.2 Eredmények

8.2.1 96.5 mAb-η levő idiotípusos determinánsokhoz kötő Ab2 kialakítása

8.2.2 Vizsgálatok Ab2 fajlagosságára a 96.5 mAb antigén-kapcsoló helyhez

8.2.3 Ab2 kötés elemzése mAb-k sorozatához, amely p97^a-tól eltérő p97 epitopokat határoz meg

8.2.4 Ab3 válasz indukciója

8.3 Tárgyalás

9. L6 rákellenes antitestre fajlagos anti-idiotípusos antitestek

9.1 Anyagok és módszerek

9.1.1 Állatok

9.1.2 Sejtvonalak

9.1.3 Tumorellenes antitestek („Abl”)

9.1.4 Anti-idiotípusos antitestek („Ab2”) kialakítása

9.1.5 Az Ab2 tisztítása

9.1.6 Gátlási vizsgálat Ab2 kötés kimutatására az L6 paratop területéhez

9.1.7 Gátlási vizsgálat az Ab2 és az antigén közt az L6 kötőhelyekért való versengés ^K kimutatására

9.1.8 L6 nehéz és könnyű lánc változó terület gén szegmensek klónozása & 9.1.9 Vizsgálatok az L6 anti-idiotípusos változó terület fajlagosságra

9.1.10 Ab3 válasz indukálása

9.1.11 Poliklonális Ab3 tisztítása

9.1.12 Az Ab3 olyan képességének vizsgálata, hogy gátolja az Áb2 kötését L6 Fabhoz

9.1.13 Ab3 sejtekhez való kötődésének vizsgálata

9.2 Eredmények

9.2.1 L6(Abl)-hez való anti idiotípusos mAb(Ab2) kialakulása

9.2.2 Az Ab2 L6-on levő idiotophoz való kötődésének jellemzése

9.2.3 Az L6-tal kialakított Ab2 fajlagossága

9.2.4 Ab2 epitop fajlagosság

9.2.5 Ab3 indukciója ’ 9.2.6 Az Ab3-nak az a képessége, hogy az

L6 által meghatározott antigénhez kötődik

9.3 Tárgyalás

10. Mikroorganizmusok deponálása

11. Szabadalmi igénypontok

1. A találmány tárgya

A jelen találmány olyan módszerre irányul, amely anti-idiotípusos antitesteket hasznosít tumor immunterápiához és immun-megelőzéshez. A találmány az immunrendszer idiotípusos hálózatának manipulálására vonatkozik a terápia előnyös céljára, pl. anti-idiotípu10 sós antitest alkalmazásával tumor elleni immunizáláshoz, szuppresszor T-sejtek vagy egy tumor antigén ellen irányuló idiotopot kifejező szuppresszor faktorok által közvetített immun-elfojtás gátlásához, adaptív immunterápiában alkalmazott limfociták aktiválásához stb. Egy speciális kiviteli módban monoklonális antiidiotípusos antitesteket, amelyek olyan antitest idiotípusa ellen jöttek létre, amely ön-differenciációs antigént, pl. magzati rák (onkofetális) vagy differenciációs antigént határoz meg, alkalmazhatunk in vivő, hogy immunválaszt indukáljunk magzati rák antigént hordozó tumorok ellen.

A jelen találmány szerinti anti-idiotípusos monoklonális antitestek értékesek a tumor immunterápiában és immun-megelőzésben, és általános fontosságúak a hu25 mán gyógyászatban. A jelen találmány szerinti molekulákat lehet alkalmazni reagensként is immunassaykben, pl. ELISA vizsgálatban és radioimmunassaykben, amelyek alkalmasak diagnosztikus eszközként tumorellenes antitestek vagy tumor antigének kimutatásához, és immun-abszorpciós vizsgálatokban, amelyek alkalmasak tumorellenes antitestek izolálásához és azonosításához. Ezen kívül ezek a reagensek értékes eszközök a neoplázia kifejlődésének és növekedésének megértéséhez.

2. A találmány háttere; a technika állása

2.1 Anti-idiotípusos antitestek

Az anti-idiotípusos antitestek vagy anti-idiotípusok olyan antitestek, amelyek más antitest molekulák antigén-kombináló területe vagy változó területe (amelyet idiotípusnak nevezünk) ellen irányulnak. Elméletileg, az idiotípusos kapcsolatok Jeme-féle hálózati modelljére alapozva [Jeme N. K.: Ann. Immunoi. (Paris) 725c: 373 (1974); Jeme N. K. és munkatársai: EMBO 7, 234 (1982)] az immunizálás egy adott antigénhez szolgáló paratopot (antigén-kapcsoló hely) kifejező antitest molekulával anti-antitestek olyan csoportját állíthatja elő, amelyek közül néhány az antigénnel együtt részesedik a paratopra komplementer szerkezetben. Az immunizálás az anti-idiotípusos antitestek szubpopulá50 ciójával viszont antitestek szubpopulációját vagy immunsejtek halmazát termeli, amelyek reaktívak a kiindulási antigénre.

Az idiotopok és anti-idiotopok hálózatát azért hívjuk segítségül, hogy megmagyarázzuk az immun-szabá55 lyozást antitestek, limfociták, és T-limfociták különböző halmazai általános vagy ezekkel összefüggő idiotopjaival és oldható termékeivel, amelyek kölcsönhatásban vannak anti-idiotopokkal [Jeme N. K. fentebb idézett munka (1974); Urbain J. és munkatársai: Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 74, 5126 (1977); Rajewski R. és

HU 206 394 Β

Takemori T.: Ann. Rév. Immunoi. 1,569 (1983)]. Azok a tanulmányok, amelyet a mind hapténekre, mind vírus antigénekre való immunitással kapcsolatban végeztek, jelzik, hogy B-sejt eredetű anti-idiotípusos antitestek indukálhatnak T-sejt válaszokat [Rajewski R. és Takemori T., fentebb idézett munka; Binz H. és Wigzell H.:

J. Exp. Med. 147,63 (1978)]. így pl. Érti és munkatársai egereket immunizáltak Sendai-vírusra fajlagos Tsejt kiónokkal és olyan anti-idiotípusos mAb-t állítottak elő, amely szabályozta a DTH (késleltetett típusú túlérzékenység) választ Sendai-vírusra [Érti H. C. J. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7479 (1982)]. Egy T-sejt idiotopra adott válaszból származó B sejt antitest bizonyítékaként Kennedy és munkatársai tumor-gyengítést észleltek, de tumorellenes antitesteket nem, olyan egerekben, amelyek az SV40 T antigénre vonatkozó anti-idiotopikus antitestekkel kezeltek [Kennedy R. C. és munkatársai: J. Exp. Med. 161, 1432 (1985)]. Exogén anti-idiotípusos antitestek beadása fokozó vagy elfojtó hatást gyakorolhat, több más változó mellett az antitest dózisától függően [Reth M. és munkatársai: Natúré (London) 290,257 (1981)].

2.2 Tumorral társult antigének

Sokféle tumorral társult antigént (TAA) írtak már le. A TAA egyik osztálya a transzplantációs tumorspecifikus sejtfelületi antigén (TSTA), amelyet tumor átültetéses kísérletekben immunválaszok indukciójával ismertek fel.

A TAA egy másik típusa a magzati rák vagy differenciációs antigén. A magzati rák antigének főleg embrió- vagy magzati sejttermékek, amelyek rosszindulatú sejtek révén fejeződnek ki az embrionális gének derepressziója következtében. A humán magzati rák antigénekre egyik példa a vastagbél karcino-embrionális antigénje. Az antigéneknek ezt a sorozatát olyan szöveteken találjuk, amelyek magzati gyomor- és bélrendszerből származnak, és a gyomor- és bélrendszer tumorjain. Az alfa-fetoprotein egy másik magzati rák antigén, amelyet hepatokarcinoma sejtek, valamint rosszindulatú pete-burok és magzati májsejtek és felnőtt májsejtek burjánzó frakciói választanak ki.

A TAA egy harmadik osztálya magában foglalja a vírussal indukált tumor antigéneket. Ezek között találjuk a DNS tumor vírusok által indukált T-antigént és az RNS tumor vírusok burkolati antigénjeit.

Sokféle humán sejt-felületi TAA-t mutattak ki eddig humán neoplazmákban egér monoklonális antitestekkel [Hellstrom K. E. és munkatársai: Humán TumorAssociates Antigens Identified by Monoclonal Antibodies (Monoklonális antitestekkel azonosított humán tumorral társult antigének), az alábbi kiadványban: Springer Seminars in Immunopathology: Mechanism of Hőst Resistance in Cancer, Kiadó: Springer, New York, 127-146. oldal (1982); Herlyn M. és munkatársai: a „Contributions to Oncology” című kiadványban, Kiadó: Karger, Bázel, Svájc, 19. kötet, 161-170 (1984); Reisfeld R. A. és Sell S. (szerkesztők): Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, New Series, 27. kötet, kiadó: Alán R. Liss, Inc., New York). Ezek közül az antigének közül többet határoznak meg magzati rák antigénnek, mivel ezeket tumorok és bizonyos embriósejtek erősen fejezik ki, míg a felnőtt gazdaszervezetből származó normális sejtek sokkal gyengébben. Más tumorral társult antigéneket is kimutattak azon képességük alapján, hogy stimulálják a gazdaszervezet sejt által közvetített immunválaszát (CMI) humán rákban [Hellstrom K. E. és Hellstrom I.: Adv. Cancer Rés. 12, 167-223 (1969); Halliday W. J. és Maluish A. E.: az „Assesment of Immuné Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test” (Az immunológiai állapot becslése a leukocita tapadás gátlás! vizsgálattal) című kiadványban, kiadó: Academic, New York, 1-26. oldal (1982); Herberman R. B.: Adv. Cancer Rés. 19, 207263 (1974); Thomson D. Μ. P.: Cancer Rés. 29, 627629 (1980); Halliday W. J. és munkatársai: Int. J. Cancer 16, 645-654 (1975)], és tumort hordozó állatokban [Taranger L. A. és munkatársai: Science 176, 1337— 1340 (1972); Halliday W. J. és munkatársai: Cell Immunoi. 10, 467-475 (1974); Steele G. és munkatársai:

J. Natl. Cancer Inst. 54, 959-967 (1975)]. Ezek közül az antigének közül néhány magzati rák eredetű (onkofetális), de molekuláris természetük és az egér monoklonális antitestek által meghatározott antigénekkel való kapcsolatuk nem világos.

Egér húgyhólyag karcinomákban levő antigén elleni patkány monoklonális antitesteket kaptak nemrégiben [Hellstrom I. és munkatársai: Int. J. Cancer 29, Y15180 (1982); Hellstrom I. és munkatársai: Cancer Rés. 45, 2210-2218 (1985)]. Az antitestek egyikéről, a

6.10-ről kimutatták, hogy fajlagos egy húgyhólyag tumor onkofetális antigénre [Hellstrom I. és munkatársai: Cancer Rés. 45,2210-2188 (1985)].

Nem módosított tumor antigéneket [Hoover M. C. és munkatársai: Cancer, 55, 1236-1243 (1985); Mclllmurray Μ. B. és munkatársai: Br. Med. J. 1, 579-580 (1978)] és élő rekombináns vírusokat [Earl P. L. és munkatársai: Science 23, 728-731 (1986); Lathe R. és munkatársai: Natúré 236, 878-880 (1987)] alkalmaztak azokban a kísérletekben, amelyekben terápiásán jótékony tumorellenes immunválaszokat indukáltak.

2.3.Tumor immunitás idiotípusos manipulációi

A tumor immunitás számos idiotípusos manipulációjáról számoltak már be. Nepom és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 2864-2867 (1984)] leírták tumor immunitás indukcióját, ahol onkofetális antigént vezettek be egy xenogén gazdaszervezetbe. Poliklonális anti-idiotípusos antitesteket készítettek, amelyek idiotípusos determinánsokat ismertek fel egy egér antitesten p97 humán melanóma antigén p97^c epitópjára. A poliklonális antiszérumok indukálhatnak egerekben mind CMI, mind Ab3 választ p97-re. Forstrom és munkatársai [Natúré, (London) 303, 627-629 (1983)] antiidiotípusos antitestet alkalmaztak, hogy CMI-t indukáljanak egerekben szingén, kémiailag indukált szarkómára. Ebben a tanulmányban az anti-idiotípusos antitest a tumorra való hiperimmunizálás által termelt autó-antitest, és a tumor antigén nem meghatározott molekula. Flood és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 2209-2213 (1980)] és Binz és munkatársai

HU 206 394 Β [Int. J. Cancer 29, 417-423 (1982)] tumor immunitás idiotípusos manipulációit demonstrálták szingén rendszerekben, meghatározott antigén molekulákkal. Flood és munkatársai bizonyítékokat mutattak arra, hogy a rágcsáló anti-idiotípusos T-limfociták részt vehetnek egy autoimmun reakcióban fibroszarkóma-fajlagos Tlimfocitákhoz, és így ellentétesen befolyásolják egy egyén immunválaszát tumorra. Binz és munkatársai anti-idiotípusos antitesteket alkalmaztak, hogy patkány szarkóma sejtekre fajlagosan citotoxikus T-limfociták in vitro burjánzását indukálják.

További tanulmányok figyelték meg anti-idiotípusos antitestek hatását tumor-növekedésre. Tilkin és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1809-1812 (1981)] kimutatták, hogy egy nem azonosított szarkóma antigénre érzékennyé tett nyirokcsomó sejtekkel rendelkező egerek immunizálása tumor-gyengülést és növekedésgátlást eredményez. Kennedy és munkatársai [J. Exp. Med. 161, 1432-1449 (1985)] tumor-képződés szuppresszióját írják le SV40-nel transzformált sejtekkel fertőzött egerekben, SV40 antigénre vonatkozó poliklonális anti-idiotípusos antitestekkel végzett injekció után.

Koprowski és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 216-219 (1984)] kimutatták anti-idiotípusos antitestek jelenlétét olyan betegekben, akik karcinómaremisszióban voltak humán gyomor- és emésztőszervi rák ellen irányuló monoklonális antitest beadása után.

2.4 Szuppresszor sejtek és szuppresszor faktorok

A szuppresszor sejt/faktor lépcsőzetes sorozatot (kaszkádot) tumorban és modell rendszerekben ismerték fel [Nepom G. T. és munkatársai: Experientia 39, 235 (1983); Askerson G. L. és munkatársai: Immunology 53,491 (1984); Dorf Μ. E. és Benacerraf B.: Ann. Rév. Immunoi. 2, 127 (1984)]. A szuppresszor sejtek fontos szerepet játszanak a tumor immunitás szabályozásában [Greene Μ. I. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5118 (1977); Hellstrom K. E. és munkatársai: J. Exp. Med. 148,799 (1978); Nepom G. T. és munkatársai: Experientia 39, 235 (1983); North R. J.: J. Exp. Med. 755 , 1063 (1982); Yamauchi K. és munkatársai: J. Immunoi. 123, (1979)]. Ezek közül a sejtek közül néhány termel szuppresszor faktorokat (SF) [Nelson K. és munkatársai: Int. J. Cancer 16,539 (1975); Greene Μ. I. és munkatársai: J. Immunoi. 779, 759 (1977); Koppi T. A. és Halliday W. I: Cell. Immunoi. 76, 29 (1983)], amelyeket a tumort hordozó állatokból és emberi betegekből nyert szérumokban lehet kimutatni sejt-közvetített immunitás (CMI) in vitro megnyilvánulásának gátlása („blokkolás”) révén [Hellstrom K. E. és munkatársai: J. Exp. Med. 148,799 (1978); Hellstrom I. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62, 362 (1969); Baldwin R. W.: Adv. Cancer Rés. 18, 1(1973); Halliday W. J. és munkatársai: Cell. Immunoi. 10, 467 (1974); Steele G. és munkatársai: J. Natl. Cancer Inst. 54, 959 (1975); Hellstrom K. E. és munkatársai: Biochim. Biophys. Acta 473,121 (1977); Halliday W. J. és munkatársai: J. Natl. Cancer Inst. 65, 327 (1980); Koppi T. A. és Halliday W. J.: J. Natl. Cancer Inst. 66,1089 (1981); Kuchrov V. K. és munkatársai: Cancer Rés. 43, 1325 (1983); Koppi T. A. és munkatársai: J. Natl. Cancer Inst. 66, 1097 (1981)]. Néhány SF-nek tumor-fajlagossága van és a megfelelő tumorral vagy tumorral kapcsolatos antigénnel végzett abszorpcióval el lehet távolítani a szérumból, de olyan tumorokkal nem, amelyek különböző antigéneket fejeznek ki [Kuchrov V. K. és munkatársai: Cancer Rés. 43, 1325 (1983); Baldwin R. W.: Adv. Cancer Rés. 18, 1(1973); Hellstrom K. E. és munkatársai: Biochim.

Biophys. Acta 473, 121 (1977); Koppi-Reynolds T. A. és Halliday W. J.: Immunoi. Lett. 8,219 (1984)]. Ez azt sugallja, hogy az SF molekulákon van egy kötőhely vagy idiotop, amely komplementer a tumor antigén determinánsokra [Nepom G. T. és munkatársai: Experi15 entia 39, 235 (1983); Hellstrom K. E. és munkatársai: Biochim. Biophys. Acta 473, 121 (1977)]. Beszámoltak arról, hogy a cirkuláló SF kötődik a tumor sejtekkel hiperimmunizált egerekből származó antitestekhez, azt sugallva, hogy az antitestek komplementerek az SF-en levő idiotípusos detrminánsokkal [Hellstrom K. E. és munkatársai: Biochim. Biophys. Acta473, 121 (1977); Nepom G. T. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 4605 (1977)]; ezekben a tanulmányokban mind az antitest, mind a szuppresszor sejt válaszokat poliklonálisnak vélték. Bizonyos immun-szérumok, amelyeket tumor eltávolítás vagy visszafejlődés után kaptak, érvénytelenítik („gátlástalanítják”) a tumor hordozó szérumok antigén-specifikus szuppresszív („gátló”) aktivitását, amint ezt in vitro kimérték [Halli30 day W. J. és munkatársai: Cell. Immunoi. 70, 467 (1974); Hellstrom I. és Hellstrom K. E.: Int. J. Cancer 5, 195 (1970)]. Azt az emléletet állították fel, hogy ezt a „gátlástalanító” hatást anti-idiotípusos antitestek közvetítik [Hellstrom K. E. és munkatársai: Biochim. Bi35 ophys. Acta 473, 121 (1977)]. Arról számoltak be, hogy a „gátlástalanító” antitesteknek gyógyászati hatásuk van primer vagy átültetett, polióma vírus által indukált tumorokkal rendelkező patkányokban [Bansal

S. C. és Sjogren Η. O.: Int. J. Cancer 9, 490 (1972);

Sjogren Η. O. és Bansal S. C.: a „Progress in Immunology” című kiadványban, szerkesztő: Amos B., kiadó: Academic Press, New York, 921. oldal (1971); Bansal S. C. és Sjogren Η. O.: Natúré (New Bioi.) 233, 76 (1971)].

3. A találmány összefoglalása

A jelen találmány olyan módszerekre irányul, amelyek anti-idiotípusos antitesteket vagy fragmentumaikat alkalmazzák tumor immunterápiához vagy immunmegelőzéshez. A találmány az immunrendszer idiotí50 pusos hálózatának manipulációjára vonatkozik, terápiás előnyök érdekében. Egy adott kiviteli mód magában foglalja anti-idiotípusos antitestek alkalmazását tumor elleni immunizáláshoz, adaptív immunterápiához alkalmazandó limfociták aktiválásához, szuppresszor T55 sejtek vagy egy tumor antigén ellen irányuló idiotopot kifejező szuppresszor faktorok által közvetített immun szuppresszió gátlásához. Egy speciális kiviteli módban monoklonális anti-idiotípusos antitesteket vagy fragmentumaikat (a) amelyek olyan antitest idiotipus ellen alakulnak ki, amely egy tumor antigént határoz meg,

HU 206 394 Β pl. onkofetális vagy differenciációs antigént; és (b) amelyek tumorfajlagos tulajdonságokat mutatnak, mint pl. tumor-specifikus sejt által közvetített immunitás indukcióját (amint ezt különböző mérésekkel, pl. leukocita tapadás-gátlási mérésekkel vagy késleltetett ti- 5 pusú hiperszenzitivitási mérésekkel mérjük), tumorellenes antitest-kötés gátlását stb. azonosítunk. A monoklonális anti-idiotípusos antitestek vagy fragmentumaik, amelyek immunpotenciált mutatnak, alkalmazhatók betegekben in vivő, hogy olyan tumorsejtek ellen irá- 10 nyúló immunválaszt indukáljunk, amelyek a tumor antigént hordozzák. Az anti-idiotípusos antitesteket vagy fragmentumaikat lehet használni anti-antitest indukció megfigyelésére olyan betegekben, akik tumor antigénre való passzív immunizáláson estek át anti-tumor anti- 15 testek beadása révén.

Egy másik kiviteli módban anti-idiotípusos antitestek in vivő indukciója anti-tumor antitestek vagy immunsejtek vagy tumorellenes idiotopokat kimutató faktorok beadásával terápiás értékű lehet. 20

A találmány olyan monoklonális anti-idiotípusos antitest-molekulákra, antitest-fragmentumokra vagy kémiailag módosított antitestekre vagy fragmentumokra is irányul, amelyek egy meghatározott tumor antigén ellen irányuló idiotípust ismernek fel. A jelen talál- 25 mány szerinti molekulákat bármely, a szakterületen ismert technikával előállíthatjuk, beleértve az eredetileg Kohler és Milstein által leírt hibridóma technikát [Natúré, 256, 495 (1975)], a humán B-sejt hibridóma technikát [Kozbor és munkatársai: Immunology Today 30 4, 72 (1983)], és az EBV-transzformációs technikát [Colé és munkatársai: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, kiadó: Alán R. Liss, Inc., 77-96 oldal (1985)].

A találmányt olyan példa segítségével illusztráljuk, 35 amelyben egerek szeroterápiája rágcsáló fibroszarkómára vonatkozó anti-idiotípusos injekcióval késlelteti az átültetett szarkóma megjelenését és az átültetett szarkóma visszafejlődését okozza, Olyan T-sejt vonalat hozunk létre, amely valamely fibroszarkóma ellen irá- 40 nyúló idiotípust fejez ki, és amely késleltetett típusú hiperszenzitivitást vihet át a fibroszarkómára.

A jelen találmány egy másik példájában egy egér monoklonális anti-idiotípusos antitestet írunk le, amely olyan idiotípusra fajlagos, amely egy humán melanó- 45 mával társult GD3 gangliozid antigént ismer fel. Az anti-idiotípusos antitestről kimutatjuk, hogy megakadályozza az anti-GD3 antitest kötődését saját antigénjéhez, és gátolja az anti-GD3 antitest mind komplement-, mind antitest-függő citotoxicitását. Vizsgáló 50 mintaként anti-idiotípusos antitestet alkalmazva vizsgálati módszert fejlesztünk ki, hogy megfigyeljük az anti-GD3 antitestre való antitesteket olyan betegekben, akik anti-GD3 antitestet kapnak terápiás vagy diagnosztikus célból. 55

A jelen találmány harmadik példájában egér monoklonális anti-idiotípusos antitesteket, amelyek egy humán melanómával társult p97 antigén ellen irányuló idiotípust ismernek fel, írunk le. Monoklonális antiidiotípusos antitesteket kapunk, amelyek kompetitíven 60 gátolják a p97 kötését anti-p97 antitestekhez, és amelyek antitesteket indukálhatnak p97-re in vivő.

Egy további példában olyan rágcsáló monoklonális anti-idiotípusos antitesteket írunk le, amelyek L6 monoklonális antitesten levő idiotípust ismernek fel, ez az antitest határozza meg a humán karcinómák szénhidrát antigénjét. Anti-idiotípusos antitesteket kapunk, amelyek képesek az L6 antitest által meghatározott karcinóma antigénnel reaktív antitestek indukálására in vivő.

A jelen találmány szerinti antitest molekulákat, az antitest molekuláknak a molekulák idiotípusát tartalmazó fragmentumait, vagy ezeknek a molekuláknak kémiai módosításait lehet alkalmazni tumorellenes antitestek jelenlétének kimutatására, tumor-antigének jelenlétének kimutatására kompetíciós vizsgálatokkal, és a sejttel közvetített tumor-immunitás indukálására immun-profilaktikus és immunterápiás alkalmazásokban.

3.1 Meghatározások

Amint itt alkalmazzuk, az alábbi rövidítéseknek az alábbi értelemben elfogadott jelentésük van:

Abl	antitest 1; az anti-idiotípus lépcsőzetes sorozat kiindulási antitestje.
Ab2	antitest 2; Abl idiotípus ellen irányuló anti-idiotípusos antitest
Ab3	antitest 3; Ab2 idiotípus ellen irányuló anti-anti-idiotípusos antitest
ADCC	antitest-függő celluláris citotoxicitás
anti-Id	anti-idiotípusos antitest (vagy antitestek)
BTCC	húgyhólyag átmeneti sejt karcinóma
CDC	komplement-függő toxicitás
CMI	sejt által közvetített immunitás
DTH	késleltetett típusú hiperszenzitivitás
FACS	fluoreszcencia aktivált sejt-osztályozó
FOS	borjúembrió szérum
FITC	fluoreszcein izotiocianát
HRP	torma peroxidáz
Id	idiotop
lg	immunglobulin
i.p.	intaperitoneális
i. V.	intravénás
kDa	kilodalton
KLH	fúrókagyló hemocianín (keyhole limpet hemocyanin)
LAI	leukocita tapadás gátlás
mAb	monoklonális antitest (vagy antitestek)
MCA	3-metil-kolantrén
OPD	O-fenilén-diamin
pár	K-1735-M2 szülő (p97-negatív) C3H/HeN egér melanóma vonal
PBS	foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldat
PC	peritoneális sejtek
SC	lépsejtek
T_H	helper (segítő) T-sejtek
T_s	szuppresszor T-sejtek

4. Az ábrák leírása

1. ábra. Antigén stimulálással beindított idiotípusos és anti-idiotípusos válaszok négy típusának vázlatos ábrázolása. AT_H-t (IB, IH ábrák) vagy T_s-t (IC ábra) mutatjuk be, amelyek az Abl-et helyettesítik az antiidiotípusos antitestek stimulálásában.

HU 206 394 Β

2. ábra. Három út vázlatos ábrázolása, amelyekkel Ab2 tumorellenes immunitást indukálhat. A 2A ábra mutatja be az antigénspecifikus T_h indukcióját Ab2-vel végzett immunizálásra. A normálisan „csendes” Abl fajlagosság előbukkanását mutatjuk be (2B ábra), mint az Id+Ts beindítását (2C ábra).

3. ábra. Belsőképzésű anti-idiotípusos antitesttel végzett immunizálás vázlatos bemutatása, hogy antitest-antigén választ idézzünk elő.

4. ábra. A 90.3 vonal (tele körök) T-sejtjei gátolják az MCA-1490 növekedését (A keret), de nem gátolják az MCA-1510 vagy MCA-1511 növekedését (B és C keretek). Összehasonlításként a kontroll T-sejtekkel kevert tumor növekedését alkalmazzuk.

5. ábra. Tumort hordozó egerek kezelése auto-antiidiotípusos mAb-vel gátolja a tumor növekedését. Az mAb-t intraperitoneálisan adjuk be a 8., 13., 17. és 21. napon. A tumor méretét úgy adjuk meg, mint a tumorok átlagos területét 10 egérnél az egyes kezelési csoportokban. Az egereket mAb 4.72-vel (tele körök), mAb 5.96-tal (üres négyzetek), mAb 8.2-vel (üres körök) vagy PBS-sel (szaggatott vonal) kezeljük. A szignifikancia-szintek: * p kisebb, mint 0,05; ** p kisebb, mint 0,01; *** p kisebb, mint 0,01.

6. ábra. Tumort hordozó egerek kezelése auto-antiidiotipikus monoklonális antitestekkel a karcinómák növekedésének csökkenését indukálja. A 0,2 cm²-nél nagyobb tumorral bíró egerek számát adjuk meg mAb 4.72-vel végzett kezelés (tele körök) vagy mAb 5.96tal végzett kezelés (üres körök) után MCA-1490 tumornál (felső keret) vagy MCA-1511 tumornál (alsó keret)

7. ábra. M-2669 klón 13 sejtekhez kötődő MG-21 mAb gátlása 2C1 anti-idiotípusos antitest-termelő hibridóma tenyészet felülúszójával.

8. ábra. 2C1 monoklonális anti-idiotípusos antitest közvetlen kötődése mAb MG-21-hez. mAb 2C1 (tele körök) vagy Pl. 17 kontroll immunglobulin (tele háromszögek) különböző koncentrációit adjuk mAb MG-21-gyel beborított polivinil-klorid üregekhez.

9. ábra. Anti-idiotípusos mAb 2C1 fajlagossága MG-21-re, összehasonlítva különböző mAb-kkel.

10. ábra. FTTC-vel konjugált MG-21 sejt-osztályozási profiljai M-2669 sejtekkel szemben mAb 2C1 jelenlétében vagy távollétében. Tumorsejteket festünk FITC-vel konjugált MG-21-gyei egyedül (40 pg/ml, „a” keret), vagy festetlen marad, hogy a háttér szintet kapjuk meg („b” keret). A „c” kerettől az ,,f’ keretig tartó keretek a FITC-vel konjugált MG-21 festődés gátlását mutatja be mAb 2C1 jelenlétében különböző koncentrációknál („c” keret: 160 pg/ml; „d” keret: 80 pg/ml; „e” keret: 40 pg/ml; „f ’ keret: 20 pg/ml). A „g” és „h” keretek az FITC-vel konjugált MG-21 festődését mutatják be 26.8 mAb (160 pg/ml) illetve Pl. 17 mAb (160 pg/ml) jelenlétében.

11. ábra. Tisztított anti-idiotípusos antitest (Ab2) kötődése 96.5 anti-p97 mAb Fab fragmentumaihoz. A

96.5 mAb-nek Fab antitest fragmentumait szélesztjük és blokkoljuk, Ab2 különböző hígításait adjuk hozzá, és az Ab2 kötődését kimutatjuk HRP-vel jelzett kecske anti-egér IgG hozzáadásával, amint ezt a 8.1.5 fejezetben leírjuk.

12. ábra. Az Ab2 gátolhatja a 96.5 mAb kötődését az SK MEL-28 sejtekhez. A 96,5 mAb anti-p97-et (0,33 pg/ml) összekeverjük tisztított anti-idiotípusos antitesttel (Ab2) (10 pg/ml) és hozzáadjuk SK MEL28 sejtekhez, amelyek mintegy 400000 p97 molekulát fejeznek ki sejtenként, és amelyeket előzőleg ImmunoIon lemezek üregeibe helyeztünk el. A 96.5 mAb kötő10 dését a sejtekhez ELISA módszerrel mutatjuk ki és ennek a kötésnek az Ab2 által kiváltott gátlását kiszámítjuk.

13. ábra. A ^l25I-vel jelzett p97 antigénnek anti-p97

96.5 mAb Fab fragmentumaihoz való kötődésének gát15 lása anti-idiotípusos antitesttel (Ab2). Az egyes Ab2-k különböző hígításait összekeverjük radio-jódozott p97tel, és a p97 kötődését a 96.5 mAb-nek Fab fragmentumaihoz szilárd fázisú vizsgálattal meghatározzuk.

14. ábra. Az anti-idiotípusos antitest (Ab2) gátolhat20 ja az anti-p97 96.5 mAb Fab fragmentumainak kötődését radioaktívan jelzett p97-hez. A 96.5 mAb-nek Fab fragmentumait Immunoion lemezek üregeibe helyezzük, és Ab2-t (10 pg/ml) adunk hozzá. Az Ab2-t annak a képességének az alapján vizsgáljuk, hogy csökkenti a radioaktívan jelzett p97 kötődését a Fab-bal borított üregekkel olyan módon, hogy blokkolja a p97-kötóhelyeket a Fab fragmentumokon.

15. ábra. mAb azon képességének vizsgálata, amely felismeri a p97 antigén különböző epitópjait, hogy gá30 tolja az Ab2 kötődését az anti-p97 96.5 mAb Fab fragmentumaihoz. Az egyes anti-p97 mAb-ket összekeverjük a vizsgálandó Ab2-vel, és hozzáadjuk a 96.5 mAb-nek Fab fragmentumaival borított lemezekhez, ezt követi kecske anti-egér IgGl-HRP hozzáadása, hogy kimutassák a megfelelő Ab2 kötődését a Fab fragmentumokhoz. Egy adott Ab2 kötődését egyedül vizsgáljuk (tele körök), vagy Pl—17 kontroll immunglobulin jelenlétében (X-X), és összehasonlítjuk azzal a kötődéssel, amelyet különböző, p97-re fajlagos mAb-k hozzáadása után látunk (üres körök).

16. ábra. Lemezre vitt anti-idiotípusos antitest (Ab2) kötődése különböző anti-p97 mAb-khez, és ennek hatása az anti-p97 mAb-nek arra a képességére, hogy ezt követően p97-et kössön. Mindegyik Ab2-t lemezre vi45 szünk, anti-p97 8.2; 4.1 vagy 96.5 mAb különböző koncentrációit adjuk hozzá, és bármelyik radio-jódozott p97-hez kötött anti-p97 mAb kötését mérjük.

17. ábra. Lemezre vitt anti-idiotípusos antitest (Ab2) kötése különböző anti-p97 mAb-khez, és ennek hatása az anti-p97 mAb-nek arra a képességére, hogy ezt követően p97-et kössön. Mindegyik Ab2-t lemezre visszük, anti-p97 96.5 mAb („A” keret, folytonos vonal), 133,1 mAb-t („A” keret, szaggatott vonal), vagy 133,3 mAb-t („B” keret) adunk hozzá, és bármelyik kötött anti-p97 radio-jódozott p97-hez való kötődését mérjük.

18. ábra. „A” keret. Ab3-at tartalmazó egér szérumok kötődését lemezre vitt p97-hez. A szérumok BALB/c egerekből származnak, amelyek előzőleg

KLH-hoz konjugált anti-idiotípusos antitestekkel vol7

HU 206 394 Β tak immunizálva. „B” keret: 96.5 mAb és a p97-re immunizált egerekből gyűjtött szérumok kötődése lemezre vitt p97-hez.

19. ábra. p97-nek Ab3-hoz való kötődésének gátlása p97-pozitív sejtekkel, de nincs gátlás p97-negatív sejtekkel. A p97 pozitív 2A sejtek (p97 gén-fertőzött egér melanoma K-1735-M2 sejtvonal) képesek gátolni az immunizált BALB/c egerekből származó Ab3 kötését a lemezre vitt p97-hez, míg a p97-negatív (szülő K1735-M2) sejtek erre nem képesek. Az „A” keret mutatja az Ab2#3-mal immunizált egerekből származó adatokat, míg a „B”, „C”, és „D” keretek az Ab2#7-tel, illetve #4-gyel, illetve #5-tel immunizált egerekből származó adatokat mutatják be.

20. ábra. Az antitest kötést vizsgáljuk lemezre vitt p97-hez az antitest abszorpciója után p97-pozitív 2A sejtekkel (2a), p97-negatív szülő K-1735-M2 sejtekkel (pár), vagy antitesttel egyedül. „A” keret: 96.5 mAb abszorpciója 2A sejtekkel gátolja a 96.5 mAb kötődését a lemezre vitt p97-hez. „B” keret: p97-tel immunizált egerekből származó szérum antitestek (alfa-p97) abszorpciója 2A sejtekkel gátolja a szérum antitestek kötődését a lemezre vitt p97-hez. „C” keret: pl.l7-tel immunizált egerekből származó szérum antitestek (alfa pl. 17) nem kötődnek p97-hez. „D” keret: A normális egér szérum (NMS) nem kötődik p97-hez.

21. ábra. Ab3 kötődése lemezre vitt p97-hez immunizált egerek szérumában. CH3/HeN egereket immunizálunk KLH-hoz konjugált anti-idiotípusos antitestekkel (Ab2). Az Ab3 kötődését mutatjuk ki p97 antigénhez immunizált egerekből származó szérumban, szilárd fázisú ELISA-val.

22. ábra. 96.5 mAb kötődése lemezre vitt p97-hez. Anti-p97 96.5 mAb kötődését mutatjuk ki lemezre vitt p97 antigénhez szilárd fázisú ELISA-val.

23. ábra. Az L6 mAb kötődésének gátlása H-3347 karcinóma sejtekhez tisztított Ab2-vel. Az Ab2 koncentrációk az alábbiak:

E3 50 gg/ml; S3 5,0 gg/ml; Ξ 0,5 gg/ml; 0,5 gg/ml. Az L6 mAb-t 1,0 gg/ml koncentrációban alkalmazzuk.

24. ábra. FTTC-vel jelzett Ab2 kötődése L6 Fab-bal telített H-3347 sejtekhez. „A” rész: Az eredményeket az alábbi Ab2-knél mutatjuk be :-·— 1;-©- 3;·*· 7; -A- 9; 11; -& 13; -±- 15. „B” rész: Az eredményeket az alábbi Ab2-knél mutatjuk be:

2; -Δ- 4; -·— 6; 8; -s- 10; -Θ- 12;

14. LFE (lineáris fluoreszcencia ekvivalens) hányados azonos a minta fluoreszcencia és a háttér fluoreszcencia hányadosával.

25. ábra. FITC-vel jelzett Ab2 kötődése PE-vel jelzett, L6-tal telített H-3347 sejtekhez. A vizsgált Ab2-t az alábbi vonalak jelzik: — FITC-vel jelzett Ab2;--- Fikoeritrinnel jelzett L6 mAb mintegy 1 mg/ml-es oldat. 1:25 hígításánál. RFL LFE hányados: vörös fluoreszcencia lineáris fluoreszcencia ekvivalens (a minta fikoeritrin fluoreszcencia és a háttér-fluoreszcencia hányadosa); GRFL LFE hányados: zöld fluoreszcencia lineáris fluoreszcencia ekvivalens (FITC minta fluoreszcencia és a háttér fluoreszcencia hányadosa).

26. ábra. F26 mAb kötődésének gátlása H-3347 sejtekhez L6 Ab2-vel. Az Ab2 koncentrációk az alábbiak: ¥Ζλ 200 gg/ml; S 20 gg/ml; SS3 2,0 gg/ml. Az F26 mAb-t 1,0 gg/ml-ben alkalmazzuk.

27. ábra. Ab2 epítóp fajlagosság. A kompetíciós vizsgálatokat L6 anti-idiotípus változó terület fajlagosságra úgy vizsgáljuk, amint ezt a 9.1.9 fejezetben leírjuk. A kompetíciós partnereket 6 gg/ml koncentrációban adjuk be 0,5 órával a biotinilezett kiméra L6 anti10 test beadása előtt, ez utóbbinál 4 gg/ml végső koncentrációt alakítva ki. A kompetíciós (versengő) partnerek az alábbiak: kiméra L6 mAb, 13 kiméra L6 mAb változó nehéz lánca + J558L lambda I könnyű lánc; □ kiméra L6 mAb változó könnyű lánca;

irreleváns humán IgGl (PW P3281B8). Az irreleváns humán IgGl nem mutat gátlást semmiféle Ab2-nél. A közvetlen kötési tanulmányok nem mutatják a V-kappa Ab2 bármelyikének felismerését a kiméra L6 nehéz lánccal, és viszont.

28. ábra. Ab2 kötésének gátlása Abl-hez Ab3-at tartalmazó BALB/c („A” rész) vagy C3H/HeN („B” rész) szérumok jelenlétében. Az Ab3-tartalmú szérumok hígítása az alábbi: E23 1:20; E3 1:200; E3 1:2000; Η 1:20000. Az Ab2-t 1,0 gg/ml koncent25 rációban alkalmazzuk.

29. ábra. Ab2-vel immunizált C3H/HeN egerekből származó, affinitással tisztított szérumok kötődése H3347 karcinóma sejtekhez. 6-20 héttel az első immunizálás előtt veszünk mintákat. Az antiszérumok az aláb30 biak: — anti-Pl—17; -¹·- anti-Ab2#3; -Θ- antiAb2#ll; anti-Ab2#12; -Θ- anti-Ab2#13;

-A- anti-Ab2#14; -A- anti-Ab2#15. Bemutatjuk az L6 mAb kötődését is 0,016 gg/ml koncentrációnál (---), Az LFE (lineáris fluoreszcencia ekvivalens) hányados egyenlő a minta fluoreszcenciának és a háttér fluoreszcenciának a hányadosával.

30. ábra. Ab2-vel immunizált BALB/c egerekből származó, affinitással tisztított szérumok kötődése H3347 karcinóma sejtekhez. A szérumokat 6-24 héttel vesszük az első immunizálás után. Az antiszérumok az alábbiak: — anti-Pl-17; —n*- anti-Ab2#3; -·— antiAb2#ll; —Θ— anti-Ab2#12; A- anti-Ab2#13;

-»· anti-Ab2#14; -b- anti-Ab2#15. Az L6 mAb kötődését is bemutatjuk 0,08 gg/ml koncentrációnál (---). Az LFE (lineáris fluoreszcencia ekvivalens) hányados egyenlő a minta fluoreszcenciának és a háttér-fluoreszcenciának a hányadosával.

5. A találmány részletes leírása

A jelen találmány olyan módszerekre irányul, ame50 lyek anti-idiotípusos antitesteket alkalmaznak tumor immunterápiához és immun-megelőzéshez. A találmány az immunrendszer idiotípusos hálózatának manipulációjára vonatkozik, terápiás előnyök nyerése céljából. Az anti-idiotípusos antitestekkel (Ab2) végzett im55 munizálás indukálhatja anti-anti-idiotípusos immunglobulinok képződését, amelyek közül néhánynak ugyanolyan antigén-fajlagossága van, mint az antiidiotípus leszármaztatásához alkalmazott antitestnek (Abl). Ez erőteljes lehetőséget képez immun-válaszok manipulációjához, megfelelő mechanizmust nyújtja

HU 206 394 Β antigén-fajlagos felismerés kialakításához és felerősítéséhez az immunrendszerben. A tumorokra adott immunválasz, úgy tűnik, magában foglalja a tumor antigén idiotípus-fajlagos felismerését; a jelen találmány ezen felismerés manipulációjának stratégiájára vonatkozik, hogy terápiás előnyöket érhessünk el ilyen módon. A találmány adott kiviteli módjai magukban foglalják anti-idiotípusos antitestek alkalmazását tumorellenes immunizáláshoz, adaptív immunterápiában alkalmazott limfociták aktiválásához, és szuppresszor T-sejtek vagy egy tumor antigén ellen irányuló idiotopot kifejező szuppresszor faktorok által közvetített immun szuppresszió gátlásához. Az anti-idiotípusos antitesteket vagy fragmentumaikat lehet alkalmazni anti-antitest indukció megfigyelésére is olyan betegekben, akik tumor antigénre való passzív immunizáláson mentek keresztül anti-tumor antitest beadásával.

Egy speciális kiviteli módban az anti-idiotípusos antitestek in vivő indukciója anti-tumor antitestek vagy az anti-tumor idiotopot mutató immunsejtek vagy faktorok beadásával terápiás értékű lehet.

A jelen találmány egy másik kiviteli módjában egy antitest olyan idiotípusa ellen kialakult monoklonális anti-idiotípusos antitestet vagy fragmentumát adhatjuk be, amely ön-differenciációs antigént, pl. onkofetális, vagy differenciációs antigént határoz meg, ennek az a célja, hogy fajlagos immunválaszt indukáljunk olyan tumorsejtek ellen, amelyek onkofetális antigént viselnek. Tumorral bíró betegek immunterápiásan kezelhetők a jelen találmány szerinti monoklonális anti-idiotípusos antitestekkel, míg azok a betegek, akikről kimutatták, hogy hajlamuk van erre, immun-profilaktikus kezelésben részesíthetők ezen a módon.

A jelen találmány olyan anti-idiotípusos mAb molekulákra vagy az anti-idiotípusos mAb molekulák fragmentumaira, vagy ezek módosulataira is vonatkozik, amelyek felismerik azt az idiotípust, amely egy tumorra fajlagos, meghatározott antigén ellen irányul. Az ilyen tumor antigének magukban foglalják a fibroszarkóma antigénjeit, ön-differenciációs antigéneket, mint onkofetális vagy differenciációs antigéneket, amelyeket rosszindulatú sejtek fejeznek ki, ezek közé értve (de nemcsak ezekre korlátozva) az olyan onkofetális antigéneket, mint a vastagbél karcino-embrionális antigénjeit, az alfa-fetoproteint, az átmeneti sejt húgyhólyag karcinómák 17S kDa-s egér antigénjének humán antigén megfelelőit vagy funkcionális ekvivalenseit, a p97 vagy GD3 melanómával társult antigéneket, és a humán tüdőkarcinómák differenciációs antigénjeit, pl. az L6-ot és L20-at, amelyeket majd részletesebben is leírunk.

A jelen találmány szerinti mAb molekulák magukban foglalják a teljes monoklonális antitest molekulákat és ezeknek a molekuláknak bármilyen fragmentumát vagy kémiai módosítását, amely tartalmazza az antigén kombináló helyet, amely egy meghatározott tumor antigénre való fajlagossággal rendelkező másik antitest molekulához vagy molekulákhoz kötődik. Az mAb molekula idiotípusát tartalmazó monoklonális antitest fragmentumokat különböző technikákkal lehet kialakítani. Ezek például az alábbiak lehetnek (a korlátozás szándéka nélkül): a F(ab’)₂ fragmentum, amelyet az antitest molekula pepszines kezelésével lehet kialakítani, a Fab’ fragmentumok, amelyeket a F(ab’)₂ frag5 mentumok diszulfid hídjainak redukálásával lehet kialakítani, és a 2Fab és Fab fragmentumok, amelyeket az antitest molekula papainnal végzett kezelésével, illetve redukálószerrel végzett kezelésével lehet kialakítani, hogy a diszulfid hidakat redukáljuk.

A szándékolt felhasználástól függően a találmány szerinti molekulákat lehet kémiailag módosítani sok különféle vegyület bármelyikéhez való kötéssel, a szakterületen ismert kapcsolási technikákat alkalmazva. Ez magában foglalja (de nemcsak ezekre korlátozó15 dik) az enzimes módszereket, az oxidatív helyettesítést, kelátképzést stb., amelyeket alkalmaznak pl. egy radioizotóp kötéséhez immunassay céljából.

Egy vegyület kémiai kötését vagy kapcsolását a molekulához irányítani lehet ahhoz a helyhez, amely nem vesz részt az idiotípus kötésben, mint pl. a molekula Fc területe. Ezt úgy lehet végrehajtani, hogy a molekula kötő helyét védjük a kapcsolási reakció elvégzése előtt, így pl. a molekulát ahhoz az idiotípushoz köthetjük a kapcsolási reakció előtt, amely felismeri ezt. A kapcso25 lás teljessé válása után a komplexet megszüntetjük abból a célból, hogy módosított molekulát alakítsunk ki minimális hatással a molekula kötőhelyére.

A jelen találmány szerinti antitesteket vagy fragmentumaikat alkalmazhatjuk immunogénként, hogy indukáljunk, módosítsunk vagy szabályozzunk fajlagos sejt-közvetített tumor immunitást. Ez magában foglalja (de nemcsak erre korlátozódik) ezeknek a molekuláknak az alkalmazását szingén tumorok elleni immunizálásban.

A jelen találmány szerinti módszert a következő stádiumokra lehet osztani csupán a leírás céljaira: (a) anti-idiotípusos mAb-k előállítása (amelyek lehetnek auto-anti-idiotípusosak), amelyek olyan idiotípus ellen irányulnak, amelyek egy tumor meghatározott antigén40 je ellen irányulnak; (b) az anti-idiotípusos mAb molekulák vagy származék fragmentumaik tumor idiotípus fajlagosságának értékelése és bemutatása pl. az immun-potenciál bemutatásával fajlagos CMI indukciójával, a fajlagos szuppresszor T-sejtekhez vagy szupp45 resszor faktorokhoz való kötődés bemutatásával, fajlagos segítő (helper) T-sejtekhez való kötődés bemutatásával, a tumor antigén ellen irányuló antitest kötése gátlásának bemutatásával, a tumor antigén ellen irányuló antitest citotoxikus tulajdonságai gátlásának be50 mutatásával stb., és (c) immun-megelőző, immunterápiás és immundiagnosztikus menetrendek kidolgozásával.

A jelen találmány egyik speciális példájában leírt modell rendszerben egerek kezelését mutatjuk be fib55 roszarkóma antigénre vonatkozó auto-anti-idiotipikus antitestekkel, hogy fajlagosan csökkentsük a kialakult szarkómák növekedését.

A jelen találmány egy másik példájában egy rágcsáló monoklonális anti-idiotípusos antitestet írunk le, amely humán melanóma GD3 gangliozid antigénje el9

HU 206 394 Β len irányuló idiotípust ismer fel. Ez az antigén képes blokkolni azt az idiotípust tartalmazó antitest kötő- és cititoxikus tulajdonságait, amelyet ez felismer. A találmány egy harmadik példájában humán melanómával társult p97 antigénre vonatkozó rágcsáló monoklonális anti-idiotípusos antitesteket írunk le, amely antitestek kompetitíven képesek gátolni p97 kötését anti-p97 antitesthez, és amelyek p97-hez antitesteket indukálhatnak in vivő. A jelen találmány egy még további példájában leírjuk rágcsáló monoklonális anti-idiotípusos antitestek kialakítását és jellemzését, amely antitestek egy idiotípust ismernek fel L6 monoklonális antitesten, amely humán karcinómák szénhidrát antigénjét határozza meg. Számos antitestről kimutatjuk, hogy képes antitesteket indukálni in vivő az L6 antitesttel meghatározott karcinóma antigénjére. A leírt módszerek azonban nem korlátozódnak melanóma, fibroszarkóma vagy karcinóma antigénekre, hanem felhasználhatók más fajlagos tumor antigénekre vonatkozó anti-idiotípusos mAb-k termelésére és alkalmazására is.

Az anti-idiotípusos antitestek alkalmazását tumorokra való válasz indukálására két külön kérdésnek tekinthetjük. Először az ilyen antitesteket lehet alkalmazni egy már előzőleg is létező tumorellenes repertoár kiválasztására vagy felerősítésére, azaz a tumor antigénre való fajlagossággal bíró T- és/vagy B-sejtek felerősítésére idiotípusos szelekció útján. Másodszor, anti-idiotípusos antitesteket lehet alkalmazni antigének „belső képmás”-aként, hogy olyan primer immunválaszt indukáljunk, amely anti-anti-idiotípusos, és amelynek egy része a névleges tumor antigén ellen irányul. Ez utóbbi esetben az immun-fajlagosság inkább anti-idiotop elleni, mint antigén-elleni.

Anti-idiotípusos antitesteket alkalmazva immunitás indukálására olyan T- és B-sejteket választhatunk ki, amelyek eltérőek azoktól, amelyek egy természetesen előforduló tumorellenes válaszban részt vesznek, akár egy olyan immunválasz túlszabályozásának eredményeként, amely immunválasz normálisan vissza van szorítva, akár egy válasz de novo indukciójával. Nagy gyógyászati jelentőségű az a lehetőség, hogy hatékony tumorellenes reaktivitást indukálunk azokban a gazdaszervezetekben, amelyek egyébként képtelenek kialakítani ilyen reaktivitást.

5.1 Antigén stimulálással beindított idiotípusos kölcsönhatások

Abból a célból, hogy tumor antigének idiotípusos felismerésének gyógyászati manipulációit elvégezhessük, figyelembe kell venni a természetesen előforduló idiotípusos válasz természetét egy növekvő szingén tumorra. így tehát megtárgyaljuk az idiotípusos repertoár természetét bármilyen antigénnel végzett stimulálásra adott válaszban.

Négy lehetséges idiotípusos és anti-idiotípusos választ ábrázolunk az 1. ábrában, amelyek antigének révén indukálódhatnak. Az 1A. ábra indukált komplementer fajták sorrendbeli előrehaladását mutatja be. Az idiotípusos vízesés-szerű reakciók (kaszkádok) ilyen típusában antigénnel végzett immunizálás immunglobulinok olyan populációjához vezet, amely idiotípusként vagy Abl válaszként ismeretes. Az Abl jelenléte azután anti-idiotípusos választ indukál, amelyet antitestek Ab2-ként ismert heterogén populációja jellemez, ez a válasz fajlagos különböző idiotopokra az Abl populációban. Az antigénnel kiváltott válasz irányítottságát a nyilak jelzik az 1. ábrában. Az Ab2 indukciója Ab 1-gyel antigéntől független [Urbain J. és munkatársai: Ann. Immunoi. 133D, 179-189 (1982); Radkey L. S.: J. Exp. Med. 139, 712 (1974); Kelsoe G. és Cemy

J.: Natúré 279,333 (1979)]. Az 1 A. ábra támogatja ezt a modellt tumor immunitásban [Lee V. K. és munkatársai: Biochim. Biophys. Acta 865, 127—139 (1986); lásd még a későbbi, példákat tartalmazó részt].

Egy idiotípusos reakciósorozat (kaszkád) vezethet

Ab2 kialakításához is, amint ezt az IB. ábrában látható reakcióútban bemutatjuk. A tumor antigén felismerés antigén-specifikus T_H sejteket indukál, amelyek adott idiotopokat hordoznak, valószínűleg antigén-receptor molekuláikon. Ezek a T-sejtek azután stimulálják egy anti-idiotípusos immunglobulin válasz kialakulását Ab2 populáció formájában.

Mik egy olyan modell következtetései, amelyben az idiotípusos reakciósor végbemegy váltakozó antitest és T-sejt komponensek révén? Olyan idiotopok elemzésé25 ben, amelyek MCA-indukált egér szarkómákra vagy karcinómákra adott válasszal kapcsolatosak [Lee V. K. és munkatársai: Biochim. Biophys. Acta 865, 127-139 (1986), és lásd még a későbbi 6., 7. és 8. példákat], a monoklonális Ab2-vel végzett immunizálás nem alakít ki Ab3-at Abl-szerű fajlagossággal, míg a tumorellenes T_H könnyen indukálódik. Ez a megfigyelés, összekapcsolva az idiotop-pozitív T_H felfedezésével a természetesen előforduló tumorellenes válaszban, olyan modellt támogat, amelyben közvetlen szabályozó köl35 csönhatás van az Id+T-sejtek és az anti-idiotípusos B sejtek (és Ab2) [Nelson K. és Nepom G. T., a „Paradoxes in Immunology” című kiadványban, szerkesztő: Hoffman G. és munkatársai; kiadó: CRC Press, Boca Raton, Florida, 177-185. oldal (1986); Bismuth G. és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 14,503 (1984); Thomas W. R. és munkatársai: J. Immunoi. 130, 2079 (1983)]. In vivő az Id+T-sejtek szolgáltathatják az ösztönzést egy anti-idiotípus előállításához.

Id+B sejtek felismerésének hiánya bizonyos esetek45 ben hibát tükrözhet a genetikai kapacitásban, hogy tumorellenes idiotopok alakuljanak ki immunglobulin molekulákban; másképpen mondva a szabályozási állapot a tumort viselő gazdaszervezetben hatásosan támogathatja az Id+Abl-et. Amint később tárgyaljuk (lásd az 5.2.1 fejezetet), ezt a látszólagos hibát gyógyászatilag el lehet kerülni egy olyan gazdaszervezetben, amely normálisan nem fejleszt ki Id+antitest válaszokat.

Azokon az idiotípusos kölcsönhatásokon kívül, amelyek tumor gyengítéshez vezető T_H válasz eredményei, a tumor-antigénnek (vagy antigén-antitest komplexeknek) való kitevés antigén-specifikus szuppresszor T-sejtek (T_s) kialakulásához vezethet (IC. ábra). Számos tumor rendszerben a T-sejtekről kimutatták, hogy induktor sejtként működnek, beindítva és felerősítve a

HU 206 394 Β tumor antigén-specifikus szuppresszióját [Nepom G. T. és munkatársai: Experientia 39, 235-242 (1983)]. Ha az Id+T_s közvetlenül indukálódnak antigénstimulálással, mint az IC. ábrában bemutatott modellben, lehetséges, hogy ezek a sejtek, az IB. ábrában levő T_Hsejtekhez hasonlóan, ösztönzésként szolgálhatnak antiidiotípusos Ab2 kialakításában.

Egy olyan modellben, ahol az idiotípusos T_s az antigénnel végzett stimulálást követően alakul ki, egy másik biokémiai út is figyelembe vehető. Amint az ID. ábrában bemutatjuk, az Id+T_s úgy alakulnak ki, mint anti-idiotípusos stimulálás eredményei. Az azobenzolarzonát hapténre adott, IgH-val korlátozott T-sejt válaszok nemrégiben végzett elemzésében az immunglobulin idiotopok természetéről úgy találták, hogy meghatározzák a T_s idiotopok kifejlődését [Hayglass K. és munkatársai: J. Exp. Med. 164, 36-49 (1986); Hayglass K. és munkatársai: Immunoi. Today 7, 179-183 (1986)]. IgH kongenikus egerekben kifejlődő T-sejtek igénylik a gazdaszervezet idiotípusos repertoárját, és újszülött állatok kezelése a μ immunglobulin láncra kialakult antitestekkel lehetetlenné teszi funkcionális T-sejt idiotípusok normál repertoárjának létrehozását, így az immunglobulin szakasz meghatározhatja a komplementer T-sejt felismerő elemek kifejlődését.

Amint később a példákban bemutatjuk, az ID. ábrában ábrázolt idiotípusos út, úgy tűnik, jelen van a tumor antigén felismeréssel összefüggésben is. Egerekben végzett tanulmányainkban, amely egerek vagy szarkómákkal vagy MCA-val indukált húgyhólyag karcinómákkal bírtak, egy egyedi domináns T-sejt idiotopról találtuk azt, hogy túlsúlyban van az akár T_s által, akár oldható faktorok által közvetített szuppresszor válaszban [lásd Kuchroo V. K. és munkatársai: Cellular Immunoi. 104,105-114 (1987), és a példákkal kapcsolatos 6. fejezet]. Az idiotípusok heterogén keveréke helyett tehát bizonyos osztozó „közös” idiotopok dominálnak. Ezt úgy dokumentáljuk, hogy affinitás abszorbenseket alkalmazva szuppresszor faktorokat távolítunk el, ahol az abszorbensek vagy monoklonális, vagy poliklonális anti-idiotípusos antitestekből készültek. Ez a felfedezésünk azt jelzi, hogy a látszólagos idiotípusos fajták többsége részt vesz a szuppresszor válaszban bármilyen adott antigénre.

Modell rendszerekben a „közös” idiotopok jelenléte azoknak a szabályozó idiotopoknak tulajdoníthatók, amelyek fontosak a hálózati kölcsönhatásokhoz [Bona C. és munkatársai: J. Exp. Med. 156, 986 (1982)]. Az ilyen vélt szabályozó idiotopok jelenléte a tumorellenes immunitásban tükrözhet vagy genetikai szelekciót az idiotípusos T_s kialakításában, vagy immunglobulin szelekció befolyását a T_s repertoár kialakításában. Ha az utóbbi esetről van szó, a T_s idiotípus indukciója magában foglalhatja azt az utat, amelyet az ID. ábrában mutatunk be, amelyben az Ab2 válasz befolyásolja a T_s természetét.

5.2 Idiotop kifejeződés manipulálása anti-idiotípusos antitestekkel

Lényegében két megközelítés van anti-idiotípusos antitestek alkalmazásához, hogy manipuláljuk az immunválaszt tumor-antigénekre gyógyászati előnyök elérésére. Az egyik a már létező tumorellenes idiotopok kiválasztásán és sokszorozásán alapul a T és B sejt repertoáron belül, és a másik magában foglal egy de novo válasz beindítást, olyan anti-idiotípust alkalmazva, amely tumor antigén „belső képmás”-aként működik.

5.2.1 Korábban is létező tumorellenes idiotopok kiválasztása és sokszorozása

Anti-idiotípusos antitestek gyógyászati célra termelésében, amely a meglevő tumorellenes idiotop összetétel megváltoztatásán alapul, a terápiás erőfeszítések az 1. ábrában bemutatott reakcióút megfordításán alapulnak, amelyben az Ab2 szakaszt alkalmazzuk az idiotípusos kölcsönhatások beindítójaként.

Három utat mutatunk be a 2. ábrában, amelyben az

Ab2 tumor-fajlagos immunitást indukálhat. A 2A. ábra azt mutatja, hogy az Ab2-vel végzett immunizálás antigén-fajlagos T_H kifejlődéséhez vezethet. Ezt az ered20 ményt fertőző ágensek ellen érték el, és úgy találták, hogy védelmet nyújt betegségek ellen [Sacks D. és munkatársai: J. Exp. Med. 755, 1108 (1982); Sharp A. és munkatársai: J. Exp. Med. 160, 1195-1205 (1984); Fons G. és munkatársai: J. Immunoi. 134, 1225-1229 (1985)]. Analóg felfedezéseket tettek számos kémiai úton vagy vírussal indukált tumornál [Kennedy R. C. és munkatársai: J. Exp. Med. 767, 1432 (1985); Binz H. és munkatársai: Int. J. Cancer 19, 417-423 (1982); Tilken A. F. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 78, 1809 (1981); Flood P. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,2209-2213 (1980)]. Az Ab2, amelyet alkalmazunk, keletkezhet egy antigénnel indukált idiotípusos reakciósor eredményeként, vagy indukálható antigénspecifikus T-sejtekkel végzett immuni35 zálással (lásd az 5.3 fejezetet).

Anti-idiotípusos antitestek stimulálhatnak „csendes” kiónokat is, vagyis olyan kiónokat, amelyek normálisan vissza vannak szorítva még genetikailag kompetens egyénekben is [Bona C. A. és munkatársai: J. Exp. Med.

153, 951 (1981)]. így az anti-idiotípusos antitestek, úgy tűnik, képesek „újra programozni” az immunrendszert, olyan antitesteket alakítva ki, amelyeket egyébként nem alakítana ki (2B. ábra). így pl. E. coli kapszuláris poliszacharidjaira vonatkozó anti-idiotípusos antitestekkel vég45 zett immunizálás védő immunitást alakít ki újszülött egerekben, amelyek normálisan nem fejlesztenek ki antitesteket a kapszuláris poliszacharidok ellen [Stein K. és munkatársai: J. Exp. Med. 160, 1001 (1984)].

Az Ab2-nél, hogy kiválasszuk és stimuláljuk mind az id+B, min a T-sejt kiónokat, valószínű, hogy B és T-sejt receptorok közti megosztott idiotopoknak kell létezniük [Rajewski K. és Takemori T.: Ann. Rév. Immunoi. 7,569-607 (1983); Érti H. C. J. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79,7479 (1982); NadlerP.

I. és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 72, 113 (1982)], és meg kell felelniök olyan antigén-specifikus receptoroknak, amelyek ugyanazt az antigén-fajlagosságot viszik át mind B, mind T-sejtekre, A jelen találmány egyik előnyős kiviteli módjában az immunizálásban való felhasználáshoz ki lehet választani azokat az Ab211

HU 206 394 Β két, amelyek T-sejt immunitást indukálnak; az eljárásban egy olyan T-sejt al-készletet stimulálnak, amely közvetíti a kívánt választ. Az egyik technika a felhasználásra alkalmas Ab2 kiválasztására az Ab2 kísérleti kiváltása antigén-specifikus T-sejtekkel végzett immunizálással [Infante A. J. és munkatársai: J. Exp. Med. 155, 1100 (1982)]. A találmánynak ebben az adott kiviteli módjában a T-sejt receptort alkalmazzuk stimuláló idiotopnak úgy, hogy az Ab2 populáció fajlagosan a kiválasztott T-sejtekre célzódjék. Az ilyen Ab2-vel végzett immunizálás azután olyan T-sejt kiónokat választ ki és stimulál, amelyek megosztják a receptor idiotopokat az immunizáló sejtekkel.

Számos kutató számolt be tumor-biopsziából vagy sebészeti úton kapott szervekből kinyert tumor-beszűrődéses T-limfociták sikeres klónozásáról. Ezek a limfociták, IL-2-vel végzett in vitro tenyésztés után, hatásosak tumorellenes válaszok kiváltásában, amikor visszaadjuk ezeket infúzióban a gazdaszervezetnek [Rosenberg S. A. és munkatársai: Science, 233, 1318 (1986)]. A jelen találmány egyik előnyös kiviteli módjában az ilyen sejtek ideális immunogének lehetnek az ilyen tumorellenes kiónokkal társult adott idiotopok ellen irányuló Ab2 kiváltásához. Ezek az Ab2-k azután anti-idiotípusként szolgálhatnak, amelyek potenciálisan hasonló tumorellenes fajlagossággal bíró T-sejteket választanak ki és sokszoroznak.

Amint fentebb tárgyaltuk, az anti-idiotípusos fajlagosságok tumor-immunizált egerekben, úgy tűnik, komplementerek nem csupán a T_H-val, hanem a T_s-sel és az oldható szuppresszor faktorokkal is [Hellstrom K.

E. és munkatársai: Biophys. Biochem. Acta Reviews on Cancer, 473, 121-148 (1977); lásd a későbbi 8. fejezetet; Binz H. és munkatársai: Int. J. Cancer 79, 417-423 (1982); Tilken A. F. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1809 (1981); Flood P. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 22092213 (1980)]. A bizonyíték, hogy az anti-idiotípusos antitestek felismernek egy domináns közös idiotopot T_s-eredetű faktorokban, azt sugallja, hogy itt szabályozó kapcsolat van az id+celluláris szakasz és az Ab2 szakasz között [lásd a későbbi 6. fejezetet; Kuchrov V.

K. és munkatársai: Cellular Immunoi. 104, 105-114 (1987); Nelson K. és Nepom G. T.: A „Paradoxes in Immunology” című kiadványban, szerkesztők: Hoffman G. és munkatársai, kiadó: CRC Press, Boca Raton, Florida, 177-185. oldal (1986)]. így abból a célból, hogy elkerüljük a Ts szakasz kiemelt aktiválását antiidiotípusos antitestek beadásakor (amint ezt a 2C. ábrában ábrázoljuk), és abból a célból, hogy gyógyászatilag hatásos eredményeket érjünk el, az anti-idiotípusos terápiának rákra alkalmaznia kell az idiotípusos hálózat megfelelő manipulálását. A megfelelő manipulálás magában foglalja három kérdés megfontolását: a genetikai korlátozást az anti-idiotípus és a T-sejt szakasz között; az anti-idiotípus beadás útját; és az idiotop fajlagosság kiválasztását.

5.2.1.1 Genetikai korlátozás

A genetikai korlátozás két típusa jelenthet potenciálisan gátat a celluláris felépülésre az injektált anti-idlotípusok révén: az MHC korlátozás és az IgH korlátozás. A MHC korlátozás (restrikció) T-sejt aktivitás genetikai szabályozásának egyik elemét adja át. Addig a mértékig, amíg egy anti-idiotípus antigént utánoz a felismerési folyamatban, logikus megfontolni a szövettani összeférhetőség (hisztokompatibilitás) lehetséges igényeit. Példákról számoltak be, amelyekben az MHC korlátozta az antigén-beindított T-sejteket nem csupán fajlagos antigén-felismerésükben, hanem abban a képességükben is, hogy sejt-kötött antí-idiotípust ismerjenek fel in vitro [Érti H. és munkatársai: Int. Immunoi. 1,61-66 (1986)].

Mi ezeknek a felfedezéseknek a következménye antiidiotípus in vivő beadásánál? Egy olyan tanulmányban, amely anti-idiotípus beindítást alkalmaz vírusellenes immunitás előidézésében, egy genetikailag nem gátolt választ figyelünk meg. Ez lehet a T_H közvetlen kialakulásának következménye, amely ezt követően más T-sejt szakaszokat aktivál. így még ha az anti-Id előidézéshez tartozó MHC gátló elemek különböznek is a névleges antigén előidézés gátló elemeitől, a T-sejt kialakulás mégis végbemehet. A beadás megfelelő módjával (lásd a későbbiekben) anti-idiotípusos antitesteket vezethetünk be az immunrendszerbe antigén-előidéző sejtek révén olyan módon, hogy ezek „látszhatnak” a helyes restrikciós elemekkel kapcsolatban. Valójában egy gazdaszervezet, amely genetikailag nem felel meg a névleges antigénnek, vélhetően megfelelő lehet arra, hogy kihívható legyen anti-idlotípussal, attól a mechanizmustól függően, amely fenntarthatja a fogékonyság hiányát. így az MHC gátlás kisebb jelentőségűnek tűnik, kivéve ott, ahol sejthez kötött anti-idiotípust alkalmazunk. A jelen találmány egyik előnyös módjában az anti-idiotípus beadásnál meg kell kísérelni az Ab2 immunogén előidézésének optimalizálását a gazda immunrendszerhez, még ott is, ahol MHC-inkompatíbilis.

A jelen találmány egyik előnyös kiviteli módjában az IgH gátlás kérdését kell megfontolnunk, vagyis az immunglobulin génekhez kapcsolódó allotípusos markerek genetikai összeillesztésének szükségességét. Mivel ezen antitest változó területének génjei össze vannak kapcsolva a konstans terület génjeivel, a fajlagos idiotípusos determinánsokhoz szolgáló genetikai potenciál lg allotípusos markerekhez van kapcsolva. Az IgH gátlás, úgy tűnik, több lépést kormányoz az idiotípusos reakciósorban [Bach B. A. és munkatársai: J. Exp. Med. 149, 1084 (1979); NodlerP. I. és munkatársai Eur. J. Immunoi. 72, 113 (1982); Yamamoto H. és munkatársai: J. Exp. Med. 158, 635-640 (1983); Forstrom J. W. és munkatársai: Natúré 303,627-629 (1983)]. Ez lényegében úgy működik, mint átengedő gát, amely megfelelő V gének és kapcsolt allotípusos markerek jelenlétét igényli az idiotípusanti-idiotop felismeréshez.

Az Ab-re való immunválasz szigorú IgH gátlása valószínűleg a hálózat V gének közvetlen felismerésének igényeit tükrözi; erről úgy számoltak be, mint „igazi idiotípusos” kölcsönhatásról [Nisonoff A. és Lamoyi E.: Clin. Immunoi. Immunopathol. 27, 397 (1981)]. Ez az igény korlátozza az antitest típusát, amelyet anti-idiotípus immunogénként alkalmazhatunk, olyan típusra, amely

HU 206 394 Β komplementer V géneket válthat ki a gazdaszervezetben, így a jelen találmány egy különösen előnyös kiviteli módjában kísérletileg leszármaztatott anti-idiotípusos antitesteket IgH-illeszteni kell a gazdaszervezettel.

Mikor nem szükséges az IgH-illesztés az anti-idiotípusos antitestekhez? Anti-idiotípusos antitestek, amelyek a névleges antigének belső képmásaként működnek, helyettesíthetik ezt az immunizálást antigénnel. Mivel az ilyen de novo immunizálás nem alapul a hálózat V gének fajlagos szelekcióján, a belső képmás immunogének általában nem IgH-gátoltak, és így nem szükséges, hogy a gazdaszervezet IgH-illesztett legyen.

5.2.1.2 Az immunizálás útja

Az anti-idiotípussal végzett immunizálás útja is befolyásolhatja az immunválasz természetét. A beadás útjától függően az anti-idiotípusos antitestekről úgy találták, hogy vagy növelik, vagy gátolják az immunválaszokat [Rajewski K. és Takemori T.: Ann. Rév. Immunoi. 1,569 (1983); Urbain J. és munkatársai: Ann, Immunoi. 133D, 179 (1982)]. így pl. egy vírus-rendszerben reovírus-fajlagos immunitást lehet alapozni az idiotípusos determinánsok elleni immunizálást követően, és DTH-t, citolitikus T-sejteket és antigén-kötő antitesteket figyelhetünk meg. Ha immunogénként oldható Ab2-t alkalmazunk, csak a DTH választ látjuk, míg az immunizálás sejttel társult anti-idiotípussal hibridómatermelő Ab2 formájában citolitikus T-sejteket is indukál [Érti H. és munkatársai: Int. Rév. Immunoi. 1,61-66 (1986)]. Amikor Ab2-t alkalmazunk belső-képmás immunogénként (mint a reovírusrendszerben), ez lényegében helyettesíti az antigént a kezdeti beindításnál; az immun-manipulációk közül, amelyek antigén-fogékonyságot szolgáltatnak, sok növeli is az immunitást Ab2-re és alkalmazható a jelen találmány különböző kiviteli módjaiban (lásd a későbbi 5.3.2 szakaszt).

Többféle módszert lehet alkalmazni az immunizáló készítmények beadásához; ezek lehetnek (de nemcsak ezekre korlátozódnak) intradermális, intramuszkuláris, intraperitoneális, intravénás, szubkután és intranazális utak. Adott kiviteli módokban az immunitás indukciójához anti-idiotípusos antitestekkel alkalmazhatjuk az antitestek szubkután (s. c.) vagy intramuszkuláris injekcióját különböző adjuvánsok jelenlétében.

Névleges antigén immunizálás esetében egy hapténné tett fehérje adjuvánssal együtt s. c. beadásáról kimutatták, hogy élénk T_H választ alakít ki, míg ugyanez az antigén intravénásán (i. v.) kedvező módon T_s-t indukál [Greene M. és munkatársai: Adv. Immunoi. 32,253 (1982)]. Amikor azonban monoklonális tumorellenes antitesteket alkalmaznak terápiásán, Koprowski és munkatársai az ellenkező helyzetről számolnak be [Koprowski H. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 216-219 (1984); leírnak anti-idiotípusos választ szisztematikusan injektált, emberi gyomor- és bélrendszeri rákra kialakított egér antitestekre, amely nyilvánvalóan gyógyászati hatással társul a betegben.

Arra is van bizonyíték, hogy az Ab2 hatékonyan gátolhatja az Ab 1-nek azt a képességét, hogy antitestfüggő celluláris citotoxicitást közvetítsen vagy tumorsejteket pusztítson komplement jelenlétében (lásd a későbbi 7.2.4 fejezetet).

Mivel az Ab2 beadás útja, valamint az alkalmazott adagolás valószínűleg fontos hatással bír arra, hogy milyen válasz indukálódik, a jelen találmány egyik előnyös szempontja szerint előzetes tanulmányokat végezhetünk a dózisokkal és a beadás hatékonyságával kapcsolatban. Ezeket a tanulmányokat állat-modellen végezhetjük, pl egéren, patkányon, főemlősökön stb. így pl. egy előnyös kiviteli módban a p97 melanóma antigénre vonatkozó anti-idiotípusos antitest beadásának különböző útjait vizsgálhatjuk in vivő és in vitro válaszokra, amelyet ezek p97 antigént kifejező egér melanóma vonallal végzett kihívásra indukálnak [a vonalat a klónozott p97 génnel végzett átfertőzést követően kaphatjuk meg; lásd: Brown és munkatársai: J. Immunoi. 127,539-546 (1981)].

5.2.1.3 Idiotop fajlagosság

A komplex antigének, beleértve a tumor antigéneket, sokrészes epitópokat tartalmaznak. Az immun-felismerés, amelyet ezek előidéznek, ennek megfelelően több idiotopot tartalmaz, amelyeket nem csupán az epitópok heterogén volta határoz meg, hanem a gazdaszervezetben az lg és T-sejt receptor gének közül kiválasztott V gének heterogén volta is. Ezeket az idiotopokat nagy mértékben befolyásolják azok az antí-idiotopok, amelyeket ezek indukálnak. így pl. „titkos” idiotopok olyan Ab2 válaszo25 kát váltanak ki, amelyek egyediek egy adott Abl-re; a „nyilvános” idiotopok olyan Ab2-t idéznek elő, amelynek fajlagossága több Ab 1-gyei osztozik, és belső képmás típusú Ab2 indukálódik az Abl-en levő antigénkötő szerkezetek ellen, amelyek komplementerek az antigé30 nekkel [Urbain J. és munkatársai: Ann. Immunoi. 125C, 373-389; Augustin A. és munkatársai: Surv. Immunoi. Rés. 2, 78 (1983); Mosier D. és Feeney A.: a „The Biology od Idiptypes” című kiadványban;

Greene M. és Nisonoff A. szerkesztők, Plenum

Press, New York kiadó, 403-411 oldal (1984)].

A jelen találmány bizonyos kiviteli módjaiban elcsúszásokat lehet manipulálni az idiotípusos repertoárban egy olyan próbálkozásban, hogy elérjük a kívánt idiotípusos választ. így pl. az idiotop szelekció nagy részben az immunogénként alkalmazott Ab2-től függ. így egy előnyös kiviteli módban az immunogénként alkalmazott Ab2-t úgy határoztuk meg, mint olyant, amely valószínűleg előidézi a gyógyászatilag kívánatos idiotopok kifejeződését. így pl. egy mind T_H, mind T_s sejteken domináns közös idiotoppal rendelkező rendszerben az anti-idiotípusos antitestek beindulhatnak T_H-ra, ha s. c. vezetjük be adjuvánssal, vagy kölcsönhatásba léphetnek oldható T_s faktorokkal. Illusztrációként: egerekben végzett tanulmányokban, amely ege50 rek hapténekre immunisok és amelyekben közös idiotopok ismerhetők fel, egy domináns Abl válasz, megosztott közös idiotoppal, erős anti-Id választ idéz elő IgH-kompatíbilis törzsek egereiben. Ha anti-Id-t adunk be i. v. újszülöttekbe, vagy ha anti-Id T_s-t viszünk át, a közös Abl idiotop gátlódik, és erről kimutatható, hogy változó idiotopok kifejezését idézi elő antigén-fajlagos Abl-en [Kekoe G. és munkatársai: Immunoi. Rév. 52, 75 (1980)]. Amikor anti-Id-vel végzünk immunizálást tumor-terápia irányában, hasonló elcsúszás történhet az idiotípusos repertoárban.

HU 206 394 Β

Egy olyan rendszerben, amelyből hiányzik egy domináns közös idiotop, vagy amikor Abl-et nem azonosítunk, az idiotop szelekciós folyamat alkalmazhatósága biztató alternatívákat szolgáltat. A jelen találmány egyik adott kiviteli módjában, mivel az Ab2 beadása változó idiotípusos válaszokat választhat ki, olyan idiotopokra való antitesteket választhatunk ki, amelyek természetes formában nem fordulnak elő a tumort hordozó gazdaszervezetben; ezt abból a célból végezzük, hogy tumorellenes választ irányítsunk. Más szavakkal: olyan Ab2-vel immunizálhatunk, amely egy T_H készletet választ ki; ezt a készletet nem lehet kiválasztani ^y tumor antigénnek való kitevéssel. így pl. immunizálhatunk egy xenogén tumorellenes antitest ellen kialakult monoklonális, belső képmás Ab2-vel. A meglévő monoklonális tumorellenes antitestek többsége valójában azokra az antigénekre fajlagos, amelyek még nem lehetnek immunogének a tumort viselő gazdaszervezetben [Hellstrom Κ. E. és Hellstrom I.: a „Monoclonal Antibodies fór Tumour Detection and Drug Targeting” című kiadványban, szerkesztők Baldwin R. W. és Byers V. S., kiadó: Academic Press, London, 17-51 oldal (1985)], és alkalmazhatók a jelen találmánynak ebben a kiviteli módjában.

5.2.2 Belső hasonmás antitestek

Az Ab2 immunizálás az Ab3 előidézéséhez vezethet nemcsak fajlagos V gén hálózat kölcsönhatások révén, hanem belső képmás „mimikri” (utánzás) révén is [Urbain J. és munkatársai: Ann. Immunoi. 133D, 179-189 (1982); Augustin A. és munkatársai: Surv. Immunoi. Rés. 2, 78 (1983)]. Ez azt jelenti, hogy amikor az anti-idiotípus az antigén konformációs tükörképét képviseli, ez helyettesítheti a névleges antigént és Ablszerű választ válthat ki [Nisonoff A. és Lamoy E.: Clin. Immunoi. Immunopathol. 27, 397 (1981)]. (3. ábra). Egy előnyös kiviteli módban tehát ilyen anti-idiotípusos antitesteket alkalmazhatunk immunogénként tumorterápiához IgH-hibásan illesztett gazdaszervezetekben.

A jelen találmány egyik, monoklonális anti-idiotípu/ sokat alkalmazható kiviteli módjában a megfelelő Ab2t gondosan ki kell választani. A kísérleti megerősítés, hogy bármilyen adott Ab2 egy anti-idiotípus belső képmás típusa, a körül a képesség körül forog, hogy utánozza-e a konformációs jellemzőket, amelyek meghatározzák az antigén felismerését. A belső képmás antiidiotípusok versengenek in vitro az antigénnel az idiotípus-pozitív Abl-hek való kötésért, és beindítják in vivő az Ab3-at, amely utánozza az Abl-et, és ez a ’ beindítás IgH-gátolatlan módon következik be (Nisonoff és Lamoy, fentebb idézett munka).

Az id+-nak antigénhez való kötődésének gátlásán ¹ kívül az Ab2 belső képmás helyettesítheti az antigént az immun-felismerés szempontjából is. így pl az Ab2 , antigén-specifikus kiónokat stimulálhat in vitro antigén távollétében, vagy Ab2+ sejtek célpontként szolgálhatnak antigén-fajlagos CTL-hez [Érti H. C. J. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7479 (1982)]. Mivel az Ab2 helyettesíti az antigén konformációt, az Ab2 „bejelentkezhet” a T-sejtekhez ezekben a vizsgálatokban MHC molekulákkal összefüggésben, és ezért a válasz MHC-gátoltnak tűnhet, éppen az antigén-specifikus választ illetőleg.

A jelen találmány egyik kiviteli módjában, amely5 ben belső képmás immunogének szükségesek, xenogén anti-idiotípusos antitestek alkalmazhatók. Lehetséges, hogy a belső képmás immunogének nem stimulálnak szuppresszor sejteket, míg ugyanakkor indukálnak T_Ht. Ez a feltevés azon az elgondoláson alapul, amelyet az

ID. és 2C. ábrákban körvonalazunk, hogy a szabályozó idiotopok, amelyek domináns V gének kifejeződése révén alakulnak ki, meghatározzák a kapcsolatot az Ab2 és a T_s között, és hogy bizonyos anti-idiotípusos antitesteket lehet kiválasztani, amelyekből hiányzik az az adott idiotop, amely még megtarthatja a T_H-t beindító belső képmás jellemzőket.

A jelen találmány egyik speciális kiviteli módjában tumor antigén aktivitással rendelkező belső képmás antitesteket lehet alkalmazni tumor „vakcina”-ként faj20 lagos tumor immunitás indukciója céljából. így pl. az ilyen vakcinák gyógyászatilag értékesek lehetnek olyan betegek számára, akikből a primer neoplazmákat eltávolították, de akiknél fennáll az áttételek kifejlődésének kockázata.

A belső képmás Ab2-nek az a képessége, hogy verseng az antigénnel az Abl-hez való kötődésért (és viszont), viselkedésének szerves része. Az Ab2 azonban, amely nem belső képmásként működik, mégis versenghet a sztérikus gátlás következtében (és talán más mechanizmusok következtében is). A jelen találmány egy előnyös szempontja szerint meg kell vizsgálnunk az Ab2-nek azt a képességét, hogy immunválaszt indukál IgH (és MHC) gátakon túl kísérleti állatokban lehetséges belső képmásként való jellemzésének része35 ként.

Mivel alkalmanként a megkülönböztetés a belső képmás anti-Id és az „igazi” anti-Id között bizonytalanná válhat, olyan anti-idiotípusos antitestek, amelyek nem rendelkeznek belső képmás fajlagossággal, még mutathatnak belső képmással társult tulajdonságokat, amelyek terápiás értékűek lehetnek. így pl. egy rágcsáló húgyhólyag karcinóma antigénnel társult monoklonális antitest ellen keletkezett monoklonális anti-idiotípussal kapcsolatos tanulmányunkban az immunizálás az anti-idiotípusokkal élénk Ab3 választ vált ki, amely nélkülöz mindenféle kimutatható antigén-kötést (Lee V. K. és munkatársai: Biochim. Biophys. Acta 865, 127-139). Egy adott anti-Id ellen keletkezett Ab3 nyilvánvalóan azzal az anti-idiotípussal társult „rejtett” faj50 lagosság ellen irányul. Bár az anti-idiotípusos antitestekről kimutattuk, hogy gátolják az Ab 1-gyei való kötődést, erről azt feltételeztük, hogy ez a sztérikus gátlás következménye, és mi csak próbaként közöltük ezeket az adatokat, úgy vélve, hogy az Ab2-k nem belső képmás antitestek. Meglepő módon azonban ezek az ugyanolyan monoklonális Ab2-k képesek beindítani egereket tumorellenes válaszra és kötődni is képesek tumor-fajlagos T-sejt szuppresszor faktorokhoz [Lee V.

K. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,

6286-6290 (1985); Kuchrov V. K. és munkatársai: Cel14

HU 206 394 Β lular Immunoi. 104, 105-114 (1987)]. Mivel az antiidiotípusos monoklonális antitestek ezekben a kísérletekben egerekben alakulnak ki, és patkányokban keletkezett xenogén tumorellenes monoklonális antitestek ellen irányulnak, az egerekben Ab2 immunizálással kiváltott tumorellenes választól nem várható, hogy fajlagos V gén kiválasztáson alapuljon, e helyett ez bizonyos belső képmás Ab2-nek tulajdonítható.

Egy második példa olyan kísérletekből ered, amelyek idiotípusos válaszokat elemeznek TMV-vel társult antigénekre, amely kísérletekben egereket immunizálunk olyan nyúl anti-idiotípusos antitestekkel, amelyek ' fajlagosak a „titkos” nyúl idiotopokra [Francotte M. és

Urbain I: J. Exp. Med. 160, 1485 (9184)]. Meglepő módon ezek az egerek anti-TMV antitesteket készítenek, amelyek idiotípusosan kereszt-reaktívak a nyúl idiotopokkal. így míg a stimulátor anti-idiotípus nem „belső képmás fajlagosságú, ez mégis antigén-fajlagos információt vált ki a látszólagos V gén összeférhetetlenség ellenére.

5.3 Olyan idiotípusra fajlagos anti-idiotípusos monoklonális antitestek előállítása, amelyek egy meghatározott tumor antigénre fajlagosak 5.3.1 Anti-idiotípusos monoklonális antitestek előállítása olyan antitesttel (Abl) végzett immunizálással, amely egy meghatározott tumor antigént ismer fel

A jelen találmány egyik speciális kiviteli módja egy olyan idiotípusra fajlagos anti-idiotípusos monoklonális antitest termelése, amely egy meghatározott tumor idiotípust ismer fel, egy gazdaszervezet immunizálását igényli olyan antitestekkel, amelyek felismerik a meghatározott tumor idiotípust. Amint korábban megmagyaráztuk, az ilyen tumor antigének magukban foglalják (de nemcsak ezekre korlátozódnak) az onkofetális vagy differenciációs antigéneket, mint pl. a CEA-t, alfa-fetoproteint, az átmeneti sejt húgyhólyag karcinó* ma 175 kDa-s rágcsáló humán antigén funkcionális ekvivalensét, a melanómával társult p97 antigént [lásd Brown és munkatársai: J. Immunoi. 127, 539-546 (1981)], humán tüdő karcinóma differenciációs antigénjeit, mint pl. az L6-ot és L20-at [lásd Hellstrom és munkatársai: Cancer Rés. 46, 3917-3923 (1986)], és a humán melanómával társult differenciációs antigént, GD3 gangliozid antigént, a fibroszarkóma antigénjeit és hasonlókat.

A lehetséges gazda-fajok között találjuk (de nemcsak ezekre korlátozódnak) a kísérleti állatokat, mint pl. egereket, nyulakat és csimpánzokat, valamint az embereket. Különböző adjuvánsokat alkalmazhatunk, hogy növeljük az immunológiai választ az antitestekre, a gazda-fajtól függően; ilyenek lehetnek az ásványi ' gélek, pl. az alumínium-hidroxid; felületaktív anyagok, pl. lizolecitin; Pluronic poliolok, polianionok; pepti, dek; olaj-emulziók; és a potenciálisan alkalmazható humán adjuvánsok, pl. BCG (Calmette-Guerin bacillus) és Corynebacterium parvum. Az Ab2 össze lehet kapcsolva egy immunogén hordozóval is, beleértve az LPS-t (de nemcsak erre korlátozva), vagy keresztkötésekkel lehet ellátva glutáraldehiddel [Primi C. D. és munkatársai: J. Immunoi. 129, 1124-1129 (1982)]. Az immunogén be lehet építve liposzómákba is, vagy konjugálva lehet poliszacharidokhoz és/vagy más polimerekhez, vagy másképpen is lehet kémiailag módosítva a felhasználáshoz. Az Ab2 molekulán magán levő allotípusos determinánsok szintén alkalmazhatók az immunogenicitás növelésére. A reovírus rendszerben, amikor az immunizálás Ab2-vel allotípusos gátakat keresztez, azaz amikor a gazdaszervezet hibás IgH illesztésű, élénk Ab3 válasz látható [Érti H. és munkatársai: fentebb idézett munka (1986)]. Ez az eredmény azt sugallja, hogy az lg allotípusos determinánsok az anti-idiotípuson úgy működnek, mint segítő determinánsok az immunválaszok fokozása irányában. így egy adott kiviteli módban a hibás IgH illesztést lehet alkalmazni arra, hogy fokozza az immunogenicitást.

Az immunizáláshoz lehet alkalmazni az anti-idiotípusos antitesteket, az anti-idiotípusos antitestek fragmentumait, vagy antitestek kémiailag módosított frag20 mentumait. Ezen kívül az mAb molekula idiotípusát tartalmazó mAb fragmentumot is lehet alkalmazni, beleértve (de nemcsak ezekre korlátozva) az Fv, Fab, Fab’ vagy F(ab’)₂ fragmentumokat, amelyeket ismert technikákkal lehet kialakítani.

A monoklonális antitesteket el lehet készíteni bármilyen technikát alkalmazva, amely antitest molekulák termelését nyújtja folyamatos sejtvonal-tenyészetben. Ezek között találjuk (de nemcsak ezekre korlátozódnak) a hibridóma technikát, amelyet eredetileg Kohler és Milstein írtak le [Natúré, 256, 495-497 (1975)], és a később leírt humán B-sejt hibridóma technikát [Kozbor és munkatársai: Immunology Today, 4, 72 (1983)], valamint az EBV-transzformációs technikát [Colé és munkatársai: Monoclonal Antibodies and Cancer The35 rapy, kiadó: Alán R. Liss, Inc, 77-96 oldal (1985)]. A hibridóma kiválasztását számos vizsgálati módszer bármelyikével elvégezhetjük, pl. Abl-hez való kötéssel, vagy Ab 1-nek tumorsejtekhez való kötődésének gátlásával [Nepom G. T. és munkatársai: Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 81,2864-2867 (1984); Holbeck S. L. és Nepom G. T.: J. Immunoi. Methods 60, 47-52 (1983); valamint lásd a későbbi 7.1.7 fejezetet].

5.3.2 Anti-idiotípusos monoklonális antitestek előállítása, amelyek T-sejteken levő olyan idiotop ellen irányulnak, amely egy meghatározott tumor antigént ismer fel

A jelen találmány egy másik speciális kiviteli módjában anti-idiotípusos antitestet állítunk elő, amely egy tumor antitestre vonatkozik, és amely egy T-sejtekkel 50 társult idiotop ellen irányul, amely a tumor antigént felismeri. Az idiotop társulva lehet olyan szuppresszor faktorokkal is, amelyek a tumor antigén ellen irányuló idiotopot mutatják be. Az ilyen tumor antigének lehetnek (de nemcsak ezekre korlátozódnak) azok, amelye55 két az előző 5.3.1 fejezetben felsoroltunk. Az egyik kiviteli módban (lásd a későbbi 6. fejezetet) az antiidiotípusos antitestet előállíthatjuk tumor antigénnel végzett immunizálással, hibridómák képzésével, és auto-anti-idiotípusos monoklonális antitestek átvizsgálá60 sával, pl. olyan módszerekkel (de nemcsak ezekre kor15

HU 206 394 Β látozva), mint a tumor-fajlagos DTH, tumor-fajlagos LAI vizsgálatok, a tumor antigén ellen irányuló monoklonális antitest elleni kötés stb. Adott kiviteli módokban az auto-anti-idiotípusos antitest termeléséhez használt tumor antigén fajlagos lehet fibroszarkómára, átmeneti sejt húgyhólyag karcinómára; ez lehet p97 vagy GD3 melanóma antigén, vagy L6 vagy L20 humán tüdő karcinóma antigén. Egy másik módszer szerint T-sejteket (T_H vagy T_s) vagy szuppresszor faktorokat, amelyek tumor antigént kötnek, alkalmazhatunk, hogy egy gazdaszervezetet immunizáljunk az anti-idiotípusos antitest termelése érdekében. Adott kiviteli módokban olyan T-sejteket alkalmazhatunk immunizáláshoz, amelyek fibroszarkómára, átmeneti sejt húgyhólyag karcinómára, p97 melanóma antigénre, GD3 melanóma antigénre, L6 vagy L20 tüdő karcinóma antigénre fajlagos antitest által meghatározott idiotopot fejeznek ki. Mivel T_s sejtek injekciója terápiásán káros lehet, előnyös a T_H sejtekkel végzett immunizálás. Az immunizáláshoz alkalmazott T-sejteket megkaphatjuk pl. a tumort hordozó betegtől magától vagy egy megfelelő (előnyösen hisztokompatíbilis) donortól, akinek immunrendszere a tumor antigénnek volt kitéve. A T-.sejteket azután izolálhatjuk injekcióhoz különböző, a szakterületen ismert technikákkal, pl. fluoreszcenciával jelzett monoklonális, tumorellenes antitest kötéssel, és FACS-sel (lásd a későbbi 6.4 fejezetet). Az immunizáláshoz szuppresszor faktorokat izolálhatunk többféle, a szakterületen ismert technikával, ezek közé beleértve (de nemcsak ezekre korlátozva) az immunaffinitás-kromatográfiát (egy tumor antigénnel borított oszlopra), T-T hibridómák kialakítását tumor hordozó gazdaszervezetekből származó T-sejtek fuzionálásával [Nelson

K. A. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 2866 (1980)], amelyet átvizsgálás követ, pl. DTH szuppressziójára tumor antigénre fajlagos kötésre tumor antigénre stb. (lásd a későbbi 6.5 fejezetet).

5.4 Az immunológiai potenciál értékelése és bemutatása a tumorfajlagos CMI indukciójával

Amikor egy előnyös kiviteli módban a jelen találmány szerinti anti-idiotípusos antitesteket tumorok elleni immunizálásra kívánjuk felhasználni (lásd a későbbi 5.6.1 fejezetet), az immunpotenciált vizsgálnunk kell. Bármely olyan módszer, amely demonstrálni képes az anti-idiotípusos molekula immunpotenciálját, bemutatva tumor-fajlagos CMI indukcióját az antiidiotípusos antitesttel vagy származék fragmentumaival végzett immunizálásra, a jelen találmány oltalmi körén belül van az anti-idiotípusos mAb immunpotenciáljának értékelése szempontjából; az ilyen vizsgálatok között találjuk (de nemcsak ezekre korlátozódnak) a DTH-t [a DTH vizsgálati eljárás leírásával kapcsolatban lásd Forstrom és munkatársai: Natúré (London), 303, 627-629 (1983)] és/vagy a LAI-t [Halliday W. I és Maluish A. E.: az „Assesment of Immuné Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test” című kiadványban, kiadó: Academic, New York, 1-26. oldal (1982); Koppi T. A. és Halliday W. J.: Cell. Immunoi. 66, 394-400 (1982); Koppi T. A. és Halliday W. J.: J. Natl. Cancer Inst. 66, 1089-1096 (1981)]. További fajlagossági vizsgálatok lehetnek (de nemcsak ezekre korlátozódnak) az immunabszorpciós vizsgálatok és peritoneális sejtek kezelése antitestekkel és komplementtel.

5.5 Anti-idiotípusos antitestek további jellemzése

Abból a célból, hogy további meghatározásokat végezzünk az anti-idiotípusos antitest fajlagosságára, Abl kötési vizsgálatokat és/vagy Abl-tumor kötés gátlásának vizsgálatát végezhetjük el. Az ilyen vizsgálato10 kát bármely, a szakterületen ismert módszerrel végrehajthatjuk, pl. azokkal, amelyeket a későbbi 7. fejezetben leírunk. Két további vizsgálat, amelyet elvégezhetünk, az Abl komplement-függő citotoxicitása gátlásának vizsgálata és az Abl antitest-függő celluláris cito15 toxicitási tulajdonságainak vizsgálata (lásd a későbbi 7.1.1.3 és 7.1.1.4 fejezeteket).

5.6 Alkalmazások az immun-megelőzésben, immunterápiában, és immun-assayben

A jelen találmány ezen kiviteli módjának az a célja, hogy leírja a jelen találmány szerinti anti-idiotípusos antitest molekuláknak vagy az antitest molekulák fragmentumainak (amelyek lehetnek kémiailag módosítottak vagy módosítatlanok) alkalmazását a gyógyászat területén.

5.6.1 Immunizálás tumor ellen

Tumorokkal bíró betegeket gyógyászatilag kezelhetünk a jelen találmány anti-idiotípusos monoklonális antitestjeivel, míg azokat a betegeket, akiknek hajlama van tumorra, immun-profilaktikusan kezelhetjük ilyen immunizálással. Az anti-idiotípusos mAb alkalmazásának előnye az antigénnel szemben egy tumor-vakcina kiszerelésben az, hogy azonos anyag nagy mennyiségét kaphatjuk meg immunogénként való felhasználáshoz. Ez különösen értékes akkor, amikor az antigén glikoli35 pid vagy szénhidrát, amelyet magát nehéz megkapni tiszta formában és kielégítő mennyiségben. Ezen kívül ha az antigén fehérje, az anti-idiotípusos antitest hozzáférhetősége szükségtelenné teszi az antigénhez tartozó gén klónozását abból a célból, hogy az antigén megfe40 lelő mennyiségét megkapjuk vakcinákban való felhasználáshoz. Az anti-idiotípusos antitesteket, vagy az anti-idiotípusos antitestek fragmentumait, vagy kémiai úton módosított fragmentumokat vagy antitesteket alkalmazhatjuk, hogy immunizáljunk tumor ellen. Bár45 milyen mAb fragmentumot, amely az mAb molekula idiotípusát tartalmazza, alkalmazhatunk, beleértve (de nemcsak ezekre korlátozva) az Fv, Fab, Fab’ vagy F(ab’)₂ fragmentumokat, amelyeket ismert technikákkal lehet kialakítani. Az anti-idiotípusos antitest mole50 kulát vagy származék-fragmentumait megfelelő adjuvánssal együtt lehet kiszerelni abból a célból, hogy növeljük az immunológiai választ. Ezek az adjuvánsok lehetnek (de nemcsak ezekre korlátozódnak) ásványi gélek, pl. alumínium-hidroxid; felületaktív anyagok, pl. lizolecitin; Pluronic poliolok; poloaniolok; peptidek; olaj-emulziók; és potenciálisan alkalmazhatók humán adjuvánsok is, pl. BCG (Calmette-Guerin bacillus) és Corynebacterium parvum. Az immunogén lehet beépítve liposzómába is, vagy lehet konjugálva poliszacharidhoz és/vagy más polimerekhez, vagy

HU 206 394 Β egyéb formában lehet kémiailag módosítva a felhasználáshoz.

Többféle módszert lehet alkalmazni az immunizáló kiszerelés bevezetésére; ezek között találjuk (de nemcsak ezekre korlátozódnak) az intradermális, intramuszkuláris, intraperitoneális, intravénás, szubkután és intranazális utakat.

A jelen találmány egyik kiviteli módjában fibroszarkómával bíró gazdaszervezetet egy olyan idiotopra fajlagos anti-idiotípusos monoklonális antitesttel injektálhatunk, amely idiotop egy fibroszarkóma antigént ismer fel.

Az immunizálást vizsgálati állatokban úgy figyelhetjük meg, hogy az anti-idiotípusos antitestet vagy rokon származék-molekulát injektáljuk, ezt tumor-képző szerrel pl. szingén tumor sejtekkel vagy kémiai karcinogénekkel végzett kihívás követi; majd a tumor keletkezését és kifejlődését megfigyeljük.

5.6.2 Adoptált immunterápia

A jelen találmány egy másik kiviteli módjában Tsejteket (előnyösen T_H-t) vezethetünk be egy gazdaszervezetbe immunmegelőzéshez vagy immunterápiához, ahol olyan T-sejtekről van szó, amelyek egy tumor antigént felismerő idiotopot fejeznek ki, ez az antigén azok közül való lehet, amelyet korábban, az 5.3.1 fejezetben leírtunk, de nemcsak ezekre korlátozódik. Ilyen sejteket kaphatunk a tumor-nővesztő gazdasejtből magából, in vitro szaporítva, megfelelő idiotípusos fajlagosságra kiválasztva (vagy szaporítás előtt, vagy szaporítás után), és visszavezetve a gazdaszervezetbe (lásd a korábbi 6.4 fejezetet). Egy másik módszer szerint a T-sejteket egy megfelelő (előnyösen hisztokompatíbilis) donorból kaphatjuk meg.

Egy másik megközelítésben lehetséges aktiválni tumor-fajlagos limfocitákat in vitro és kezelni a beteget az aktivált tumor-fajlagos leukocitákkal. Nemrégiben rák visszafejlődését figyelték meg egy adaptív immunterápiás kezelésre adott válaszban, ahol az immunterápiás kezelés magában foglalta limfokin-aktivált ölő sejtek (LAK) beadását tumort hordozó gazdaszervezetbe [Rosenberg és munkatársai: New Engl. J. Medicine 313, 1485-1492 (1985)]. Ez a terápia azonban egy sor nemkívánatos mellékhatást eredményezett, beleértve a súlyos toxicitást, tüdőödémát, és légzési zavarokat. Ezzel ellentétben a jelen találmány ezen kiviteli módja esetében olyan stimulált limfocitákat adunk be a betegbe, amelyek fajlagosak a tumorral társult antigénre (amely lehet valamely, a korábbi 5.3.1 fejezetben leírt antigén, de nemcsak ezekre korlátozódik): ez fajlagosabb terápiát és csökkent mellékhatásokat eredményez, így pl. perifériás limfocitákat lehet kivenni a betegből, vagy olyan hisztokompatíbilis donorból, aki ki volt téve vagy a tumor antigénnek, vagy egy olyan antitest idiotípusára kialakult monoklonális anti-idiotípusos antitestnek, amely meghatározza a tumor antigént, amint ezt fentebb leírtuk. A limfocitákat ezután lehet stimulálni in vitro a jelen találmány tumor-fajlagos, antiidiotípusos antitestjeinek jelenlétében. Az ilyen fajlagos stimulálást a jelen találmány monoklonális, antiidiotípusos antigénjeit alkalmazva hajthatjuk végre pl. olyan módszerrel, amelyet Binz és munkatársai leírtak [Int. J. Cancer 29, 417-423 (1982)]. Az aktivált T-sejteket azután sejttenyészetben lehet szaporítani. Ezt a szaporítást a T-sejtek ismételt stimulálásával lehet végrehajtani a jelen találmány szerinti anti-idiotípusos an5 titestekkel, IL-2-vel vagy anélkül, vagy csak IL—2-t tartalmazó tápközegben való növesztéssel. A T-sejt tenyésztés más módszereit (pl. más limfokinekkel, növekedési faktorokkal, vagy más bioaktív molekulákkal) szintén lehet alkalmazni. Az aktivált limfocitákat az10 után vizsgálhatjuk sejt-közvetített tumorellenes immunreaktivitásra. Ha kívánatos, az aktivált limfociták, mint T-sejtek azonosságának igazolását elvégezhetjük úgy, hogy a sejteken a T- és B-sejt markerek sejtfelületi kifejeződését vizsgáljuk. Ezt pl. immunfluoreszcencia elemzéssel végezhetjük el, T- és B-sejt antigénekre szóló, fluoreszceinnel konjugált monoklonális antitesteket alkalmazva. Ismert T-sejt markerek, mint pl. a CD4 és CD8 antigének, kifejezése igazolja az aktivált limfocitáknak, mint T-sejteknek az azonosságát.

Az aktivált T-sejteket azután tumorellenes aktivitásra vizsgáljuk. Ezt a szakterületen ismert számos technika bármelyikével elvégezhetjük, amelyek fajlagos sejtközvetített immunitást mérnek. így pl. egy citotoxicitási vizsgálatot, amely a stimulált T-sejteknek azt a ké25 pességét méri, hogy elpusztítja a tumorsejteket in vitro, végrehajthatunk olyan módon, hogy a limfocitákat ⁵¹Cr-rel jelzett tumorsejtekkel és nem fertőzött jelzett sejtekkel inkubáljuk, és az ⁵¹Cr kibocsátást mérjük lízis után. Számos ilyen vizsgálatot írtak már le [lásd pl.

Zarling J. H. és munkatársai: J. Immunoi. 136, 4669 (1986)]. Az aktivált limfocitákat lehet vizsgálni T-segítő (helper) sejt aktivitásra is, ezeknek azt a képességét mérve, hogy burjánzanak, amint ezt, stimulálás után, ³H-timidin beépüléssel kimutatjuk, és/vagy ezeknek azt a képességét mérve, hogy stimulálásra limfokineket termelnek, pl. IL—2-t vagy interferont, exogén IL-2 távollétében. A fajlagos, sejt-közvetített immunitás más, a szakterületen ismert módszereit is alkalmazhatjuk, pl. a leukocita-tapadás gátlási vizsgálatokat [Thomson D. Μ. P. (szerkesztő): Assesment of Immuné Status by the Leukocyte Adherence Inhibition Test, kiadó: Academic Press, New York (1982)]. A szelektált limfocitákat lehet azután inokulálni a betegbe. Az aktivált T-sejtek inokulálása előnyösen szisztémás beadás45 sál történik, de a beadás más módszerei (pl. közvetlen infúzió az artériába) szintén alkalmazhatók. A T-sejteket intravénásán lehet beadni egy központi vénás katéteren keresztül vagy egy nagy perifériás vénába. Egy előnyös kiviteli módban mintegy lxlO⁸ sejtet adunk be infúzióval kezdetben, és a maradékot a következő néhány óra alatt adjuk be infúzióval. Bizonyos betegekben rekombináns humán IL-2-t alkalmazhatunk és adhatunk be intravénásán minden 8 órában, a T-sejt infúzió idejétől kezdve. Az IL-2 injekciói előnyösen

10000-10000 egy ség/testtömeg kg közti tartományban levő adagokat tartalmaznak, amint ezt rákos betegekben már korábban alkalmazták [Rosenberg S. A. és munkatársai: N, Engl. J. Med. 313, 1485 (1985)]. Az IL-2 infúziót lehet folytatni több napon át az aktivált

T-sejtek infúziója után, ha ezt a beteg tolerálni képes.

HU 206 394 Β

5.6.3 Tumorellenes reaktivitás immun-szuppressziójának gátlása

A jelen találmány egy másik kiviteli módjában antiidiotípusos antitesteket, amelyek speciálisan olyan idiotopot ismernek fel, amely egy tumor antigén ellen irányul és amely idiotop szuppresszor T-sejteken és/vagy szuppresszor faktorokon van jelen, adhatunk be in vivő abból a célból, hogy gátoljuk a tumorellenes aktivitás szuppresszióját. Adott kiviteli módokban az ilyen antigének között találjuk azokat, amelyeket a korábbi 5.3.1. fejezetben felsoroltunk, de nemcsak ezekre korlátozódnak.'

5.6.4 Immun-affinitásos alkalmazások

A jelen találmány szerinti anti-idiotípusos antitesteket vagy rokon molekuláikat alkalmazhatjuk egy meghatározott tumor antigén ellen irányuló antitestek izolálására. Azok között a szakterületen ismert technikák között, amelyekkel ezt végre lehet hajtani, találjuk az immunaffinitás-oszlopokat és az immunabszorpciós reakciókat, de a technikák nemcsak ezekre korlátozódnak. Az anti-idiotípusos antitestek vagy rokon molekulák alkamazása révén izolált tumorellenes antitestek értékes eszközök lehetnek a tumor immunterápiában.

5.6.5 Immunassayk

A jelen találmány egyik alternatív kiviteli módjában a jelen találmány szerinti anti-idiotípusos antitestek vagy rokon molekuláik alkalmazhatók antigénként immunassaykben. Ezek az immunassayk lehetővé teszik tumorellenes antitestek kimutatását állatokban vagy emberi betegekben. A jelen találmány molekulái alkalmazhatók kompetitív immunassaykben is, hogy vizsgáljunk tumor antigének jelenlétére.

A jelen találmány szerinti molekulákat alkalmazhatjuk bármilyen, a szakterületen ismert immunassay rendszerben, beleértve (de nemcsak ezekre korlátozva) a radioimmunassayket, ELISA módszereket, „szendvics” eljárásokat, precipitin reakciókat, gél diffúziós precipitin reakciókat, immundiffúziós vizsgálatokat, agglutinációs vizsgálatokat, komplement-rögzítéses vizsgálatokat, „A” fehérje immunassaykat, fluoreszcens immunassayket, és immun radiometrikus vizsgálatokat.

Egy speciális kiviteli módban a találmány szerinti anti-idiotípusos antitesteket, amelyek egy „1. Antitest” idiotípus ellen irányulnak, amely antitest egy tumor antigént határoz meg, alkalmazhatjuk versengő immunassaykben, hogy kövessük az antitestek jelenlétét olyan betegekben, akiknek 1. Antitestet adtunk be terápiás vagy diagnosztikus célból (lásd a későbbi 7.1.1.5 és 7.2.5 fejezeteket). Egy másik kiviteli módban antiidiotípusos antitesteket alkalmazhatunk, hogy tumorellenes antitesteket azonosítsunk a tisztítási eljárások során.

6. Rágcsáló szarkómák immunterápiája olyan autoanti-idiotípusos monoklonális antitestekkel, amelyek tumor-specifikus T-sejtekhez kötődnek

A hálózat-elmélet szerint [Jeme N. K. Ann. Immunoi. 125C, 373 (1974); Rajewski K. és Takemori T.:

Ann. Rév. Immunoi. 1, 569 (1983); Urbain J. és munkatársai: Ann. Immunoi. I33D, 179 (1982)] szingén szarkómákra immunválaszt képező egereknek antitestekkel kell bímiok a megfelelő limfociták idiotípusaira. Amint a példákban leírjuk, erre a feltételezésre alapozva BALB/c egereket immunizálunk két szingén, átülte5 tett fíbroszarkóma valamelyikével, és hibridómákat képzünk, amelyek olyan monoklonális antitesteket termelnek, amelyek hatására szingén egerekben beindul a tumor-fajlagos DTH. Ezen auto-anti-idiotípusos monoklonális antitestek egyikéről kimutatjuk, hogy egy idiotopot határoz meg, amely jelen van mind a T-sejteken, amelyek tumorellenes aktivitással bírnak, mint a T-szuppresszor sejtek termékein, amelyek ezt az aktivitást gátolják. Azt is kimutatjuk, hogy egerek kezelése a két monoklonális anti-idiotípusos antitest egyikével szignifikánsan csökkenti a meglevő szarkómák növekedését; ez olyan hatás, amely fajlagos a megfelelő mAb tumor kombinációra.

6.1 Anyagok és módszerek

6.1.1 Egerek

BALB/c egereket tenyésztünk a Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC) Animál Resources (Állategészségügyi) részlegénél, és ezeket az egereket az egyes kísérletekben kor és nem szerint összeválogatjuk. Tíz hetesnél idősebb hímeket választunk ki, mivel ezek optimális válaszokat adnak kísérleti vizsgálatokban. CB-20 egereket tenyésztünk az FHCRC-nél a dr. Potter Michaeltől (National Institute os Health) kapott nemző párokból.

6.1.2 Tumorok

MCA-1490, MCA-1510 és MCA-1511 fibroszarkómákat, amelyeket az Oncogen-nél fejlesztettünk ki és onnan szerezhető be, indukálunk BALB/c egerekben trioktanoidban levő 3-metilkolantrén intramuszkuláris injekciójával, és fenntartjuk a második generációban lefagyasztott szövet sorozatos szingén átültetésével. Ezekről kimutatjuk, hogy mentesek LDH-tól, Sendai és ectromelia vírusoktól és mycoplasmá-tól, és más kémiailag indukált egér szarkómához hasonlóan egyéni, egyedi, tumor-fajlagos transzplantációs antigéneket fe40 jeznek ki. A BW5147. G. 1.4. oua^rl egy olyan gyógyszer-jelzett AKR timoma, amely a Salk Institute Cell Distribution Center-tői szerezhető be, vagy az ATCCtől ATCC TIB 48. számon. Az NS1 sejtek dr. Hellstrom Ingegerd laboratóriumából szerezhetők be, vagy az AT45 CC-től ATCC TIB 18 számon. Mind a BW5147, mind az NS1 sejtekről kimutatjuk, hogy mentesek mycoplasmától.

6.1.3 Késleltetett típusú túlérzékenység (DTH) vizsgálata

Olyan vizsgálatot alkalmazunk, amely késleltetett típusú túlérzékenységet (DTH) mér, amint ezt a Thyl⁺, Lytl⁺ limfociták közvetítik, és jellemezzük egy DTH reakció tipikus morfológiai megnyilvánulásával [Forstrom J. W. és munkatársai: Natúré. 303, 627 (1983);

Cory J. és munkatársai: a „Monoclonal Antibodies and Cell Hybridomas” című kiadványban, szerkesztők: Hammerling G. J. és munkatársai, kiadó: Elsevier/North Holland Biomedical Press, 503. oldal (1981)]. Egereket immunizálunk vagy összesen l,10⁶ besugár60 zott (1500 rád) tumorsejt injekciójával két helyre, a

HU 206 394 Β lágyékok egyikébe, vagy 3-10 gg mAb injekciójával (foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldattal, PBS-sel hígítva) négy szubkután helyen. Amikor anyagot vizsgálunk DTH szuppressziójára, ezt mindig induktív fázisának szuppressziójánál vizsgáljuk. Ezekben a kísérletekben a vélt szuppresszív anyagot 100 μΐ-re hígítjuk PBS-ben és egy farokvénába injektáljuk közvetlenül az immunizálás után.

ADTH-ra végzett minden vizsgálatnál a kezelési vagy kontroll csoportok 5 egérből állnak, és ezek mindig megjelöltek. Az immunizálás után 5 nappal a DTH-t kiváltjuk 5X1O⁵ tumorsejt injekciójával a két hátsó mancs egyikébe. 24 óra múlva mind az injektált, mind a nem injektált ellenkező oldali mancsokat mérjük, skálával ellátott mikrométert alkalmazva. Az egyes kezelési csoportoknál az adatokat úgy adjuk meg, mint az átlagos növekedést az injektált mancsok vastagságában (vagyis a duzzadást). A kezelt csoportok és a megfelelő kontrollok közti különbségek szignifikanciáját a kétpróbás Student tesztet alkalmazva határozzuk meg.

6.lAAuto-anti-idiotípusos monoklonális antitestek keletkezése

BALB/c egereket immunizálunk lxlO⁷, tripan kékkel festetlen, tenyésztett MCA-1490 vagy MCA-1511 sejt szubkután injekciójával, ezt követi három héttel később az így létrejött tumor gócok kimetszése. Két héttel később az egereket 2X10⁶ besugárzott (15000 rád), a megfelelő tumorból származó sejttel injektáljuk, és két hét múlva még egyszer injektáljuk ugyanezt ugyanekkora dózisban. Az utolsó injekció után 7 nappal lépsejteket nyerünk ki, és NS-1 melanómasejtekkel fuzionáljuk, már korábban leírt technikákat alkalmazva [Yek Μ. Y. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76,2927 (1979)].

A hibridómákat először IgG antitestek termelésére vizsgáljuk át, radlomimmun versengési vizsgálatot alkalmazva [Brown J. P. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 255,4980 (1980)], és azokat, amelyek 4 gg IgG/ml-nél többet termelnek, szaporítjuk. A tenyészet felülúszóját összegyűjtjük, az egyes gyűjtemények 5 hibridómából származó felülúszót tartalmaznak. Az egyes gyűjteményekből antitesteket tisztítunk affinitáskromatográfiával Sepharose CL-4B-hez kovalensen kapcsolt S. aureus „A” fehérjén (a Sepharose CL-4B a Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, készítménye) [Brown J. P. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 255, 4980 (1980)]. Az antitest oldat pH-ját 8,5-re állítjuk be a kromatográfia előtt, hogy megkönnyítsük az IgG[ izolálását. BALB/c egereket immunizálunk az egyesített antitestek injektálásával, és öt nappal később a megfelelő tumorsejtekkel (MCA-1490 vagy MCA-1511) fertőzünk DTH kiváltására. Az egyesített antitestekre vizsgálva pozitív egyedekből kapott felülúszókat vizsgáljuk DTH beindítására MCA-1940-hez vagy MCA-1511-hez; a két tumor egyike szolgál kontrollként. Az egyes fúziókban az üregek 2-4 százalékáról találjuk úgy, hogy kívánt aktivitású antitesteket tartalmaz. Azokat a hibridómákat, amelyek antitesteket készítenek, amelyek tumorfajlagos DTH-t indítanak be, kétszer klónozzuk korlátozott hígítással, amely után a pozitív kiónokat szaporítjuk és adaptáljuk, hogy aszcitesz tumorként nőjön pristannal beindított BALB/c egerekben [Yeh Μ. Y. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 2927 (1979)]. Monoklonális antitesteket tisztítunk aszcitesz folyadékból affinitáskromatográfiával „A” fehérje Sepharose-on. mAb 4.72-t (amely az MCA-1490-nel kapcsolatos) és mAb 5.96-ot (amely az MCA-1511-gyel kapcsolatos) kapunk a jelen tanulmányban. Ezek mindketten IgGl izotípusúak, akárcsak az mAb 8.2, amelyet kontrollként alkalmazunk bizonyos kísérletekben.

6.1.5 T-sejt hibridómák

Számos hibridóma vonalat kapunk B W5147 sejteknek MCA-1490-t hordozó egerek timocitáival végzett fúziójával, amint ezt korábban már leírták [Nelson K. A. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2866 (1980); Nelson K. és munkatársai: a „T-Cell Hybridomas” című kiadványban, szerkesztő: Taussig M. J., kiadó: CRC Press, 129. oldal (1985)]. Az ebben a tanulmányban alkalmazott négy hibridóma olyan faktorokat termel, amelyek elfojtják az MCA-1490 sejteknek fajlagosan immun T-sejtek által kiváltott lízisét, amit ⁵¹Cr-kibocsátási vizsgálattal vizsgáljuk [Nelson

K. és munkatársai: fentebb idézett munka (1985)]. Ezeknek a hibridómáknak és a B W5147 fúziós partnernek a tenyészeteit Dulbecco által módosított Eagle tápközegen (Grand Island Biological Co., Grand Island, New York) növesztjük, amely ki van egészítve szarvasmarha szérum albuminnal (150 μΐ/ml), penicillinnel (100 egység/ml), streptomicinnel (100 μg/ml) és L-glutaminnal (290 μg/ml), és pufferolva van nátriumbikarbonáttal. A használt tápközeget a sejtekről leszűrjük a lóg fázisú növekedésnél, amikor a sejtek száma mintegy 2.10⁶ sejt/ml. A tápközeget szűrjük (0,4 mikron, Millipore), és -70 °C hőmérsékleten tároljuk a mérésig.

6.1.6 Szuppresszor faktorok izolálása monoklonális antitestekkel végzett affinitáskromatográfiával

A 4.72 vagy 5.96 mAb-t alkalmazzuk egy kontroll

8.2 mAb-vei együtt, amely szintén IgGl izotípusú és a p97 humán melanóma antigénre fajlagos [Brown J. P. és munkatársai: J. Immunoi. 127, 539 (1981)]. Az mAb-t PBS-ben hígítjuk 2 mg/ml-re, majd azonos térfogatú Affi-Gel 10-hez (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia) kötjük egy éjszakán át inkubálva 4 °C hőmérsékleten. A géleket mossuk, 0,1 mól/l-es etanol-aminnal inkubáljuk és oszlop elkészítésére alkalmazzuk. Az oszlopokat élénken mossuk PBS-sel és előeluáljuk 3 mól/1 NaSCN-nel felhasználás előtt. Tsejt hibridómák (mint szuppresszor faktorok forrása) vagy BW5147 sejtek (mint kontroll) kialakult tenyészközegét hígítjuk 1:10 arányban PBS-ben, amely után a hígított tápközeg 0,2 ml-ét átengedjük 0,2 ml gélből alkotott oszlopon. Az oszlopokat PBS-sel mossuk, amíg 2 ml elfolyó anyagot összegyűjtöttünk, ezután az elfolyó anyagot 1:10 arányban hígítjuk PBS-ben, és mérjük a DTH induktív fázisának a szuppressziójára.

Kísérleteket végzünk BALB/c egerekből kapott szérumokból is, amely egerekbe előzőleg MCA-1490 vagy MCA-1511 tumorok voltak ültetve, vagy ame19

HU 206 394 Β lyek kezeletlen alom-társak voltak. A szérumokat 1:10 arányban hígítjuk PBS-ben, amely után a hígított szérum 0,5 ml-ét átengedjük 0,5 ml gélből készült oszlopon. Az oszlopokat PBS-sel mossuk. Az első 1,5 ml-t elfolyóként összegyűjtjük és a további 5 ml-t eldobjuk. 5 A kötött fehérjéket ezután eluáljuk az oszlopról 0,5 ml 3 mól/l-es NaSCN hozzáadásával, és az eluátomot sómentesítjük PBS-sel kiegyensúlyozott Sephadex-25 oszlopon való átengedéssel. Az eluátomokat és elfolyókat PBS-ben hígítjuk, hogy az eredeti szérumokhoz 10 képest 1:100 hígítás jöjjön létre. Ezeket ezután DTH induktív fázisának szuppressziójára vizsgáljuk.

6.1.7 A K54SF szuppresszor faktor kötése MCA-1490 sejtekhez

Felületen tapadva tenyésztett MCA-1490 sejteket 15 inkubálunk etilén-diamin-tetraecetsavban (5 mmól/1), mossuk PBS-sel, és inkubáljuk glutáraldehid 0,1 %-os oldatával 10 percen át 4 °C hőmérsékleten. A sejteket ezután PBS-ben inkubáljuk 0,5% szarvasmarha szérum albuminban, ezt PBS-sel végzett mosás követi. I-K54 20 T-hibridóma sejtek vagy BW5147 kontroll sejtek kialakult tenyészközegeit hígítjuk 1:100 arányban PBS-sel, amely 10 pg 4.72 mAb-t, vagy (kontrollként) 8.2 mAb-t tartalmaz, és inkubáljuk 30 percen át. Ezt követően ezeket 100 pl kiemelt tumorsejthez adjuk, amelyet 25 szuszpendálunk és szobahőmérsékleten 10 percig inkubálunk, majd további 30 percen át jégen inkubálunk.

Az egyik kísérletben a tumorsejteket antitesttel végzett inkubálással előkezeljük és PBS-sel háromszor mossuk az I-K54 vagy BW5147 sejtekből kialakult hígított 30 tápközeg hozzáadása előtt. Jégen való inkubálás után a tumorsejteket ötször mossuk 15 ml PBS-sel és szuszpendáljuk 0,5 ml glicin-HC1 pufferral (pH 3,0). További 10 perces, jégen végzett inkubálás után a tumorsejteket centrifugálással (200 g) üledékbe visszük. A felülú- 35 szó pH-ját azonnal beállítjuk semleges pH-ra PBS-sel kiegyensúlyozott Sephadex G-25-ön való átengedéssel. Az eluátomokat 1:10 arányban hígítjuk PBS-sel és mérjük a DTH induktív fázisának szuppressziójára.

6.1.8 T-sejt vonalak izolálása és tenyésztése 40

4.72 mAb-vel reagáló T-sejteket kapunk olyan nyirokcsomókból, amelyeket egy progresszíven növekvő, transzplantált MCA-1490 szarkóma helyéről emeltünk ki. A sejteket Percoll gradiensen (Pharmacia) végzett centrifugálással izoláljuk és összekeverjük biotinnal 45 összakapcsolt 4.72 mAb-vel vagy 8.2 mAb-vel. Ezt követően ezeket PBS-sel mossuk, avidin-fluoreszcein izotiocianáttal (FTTC) reagáltatjuk, ismét mossuk és fluoreszcenciával aktivált sejt osztályozón (FACS-II/⁷Becton-Dickinson) elemezzük. A fényesen festett sejte- 50 két, amelyek csak a 4.72 mAb-vel kezelt mintában látszanak, és amelyek a mintának kevesebb, mint 1%át képviselik, összegyűjtjük. Ezeket a sejteket, amelyeket 90.3-nak nevezünk, Click tápközegben tenyésztjük, amely 25% olyan tápközeggel van kiegészítve, amelyet 55 24 órán át konkanavalín A-val stimulált patkány lépsejtek tenyészetéből kapunk. Elénk növekedés figyelhető meg 25 nap múlva, és ezt a növekedést fenntartjuk olyan módon, hogy a tenyészeteket friss tápközegben szaporítjuk minden 72 órában. Egy másik sejtvonalat is 60 létrehozunk, a 11,2 vonalat, Lyt-1 pozitív limfocitákból, amelyeket egy MCA-1511 tumor helyéről kiemelt csomókból kaptunk; ezt hasonló módon tartjuk fenn, mint a 90.3 vonalat. A sejteket 6 és 18 hét között vizsgáljuk a 90.3 és 11.2 vonalak kialakítása után. Tumormentes egerek nyirokcsomóiból származó normál T-sejteket tenyésztünk 48 óráig, mielőtt ezeket kontrollként felhasználnánk bizonyos vizsgálatokhoz.

6.1.9 Tumor növekedés in vivő manipulációja

Tumorszöveteket nyerünk egerekből 14-24 nappal sorozatos passzálásból származó MCA-1490 és MCA1511 tumorsejtek injekciója után. Mechanikai szétzúzással és rövid tripszines kezeléssel szuszpenziót készítünk. A tumorsejteket tehát a szakterületen jól ismert technikával nyerjük ki. Az életképességet tripan kék kizárásával becsüljük meg. A 4. ábrában bemutatott kísérletben tumorsejteket összekeverünk tenyésztett T-sejtekkel 1:10 arányban, és a keveréket egy szubkután helyre injektáljuk. A tumor növekedést 2-4 napos intervallumokban megfigyeljük a növekvő tumor göb két merőleges mérésével. A 0,2 cm²-nél nagyobb területű tumorok ritkán fejlődnek vissza a kezeletlen kontrollokban, és ezek megállapodott tumoroknak tekinthetők.

Amikor egy kísérletben valemely mAb-kezelés hatásosságát mérjük, tumorsejteket injektálunk szubkután egerenként egy adott helyre. Az mAb-t PBS-ben hígítjuk és intraperitoneálisan (i. p.) injektálunk, injekcióként 10 pg-ot. A tumor-növekedést úgy figyeljük, ahogyan fentebb leírtuk. Egy kétnyúlványos Student tesztet alkalmazunk, hogy meghatározzuk a különböző kezelt csoportok közti különbség szugnifikanciáját.

6.2 mAb 4.72 vagy mAb 5.96 szubkután beadása MCA-1490-re és MCA-1511-re tumor-fajlagos DTH-T indukál

Korábban már beszámoltunk arról, hogy a 4.72 mAb DTH-t indukálhat MCA-1490-re, amikor szubkután injektáljuk, és hogy ez reagál tumor-fajlagos sejteken levő idiotoppal, azaz hogy ez auto-anti-idiotopikus [Fortstrom J. W. és munkatársai: Natúré, 303,627 (1983)]. Mi kifejlesztettünk itt egy hasonló mAb-t, az 5.96-ot, antigénszempontból különböző szarkómára, az MCA-1511-re érzékennyé tett egerekből származó limfocitákat alkalmazva. Ez lehetővé teszi számunkra, hogy felbecsüljük a DTH hatás immunológiai fajlagosságát, párhuzamosan vizsgálva 4.72 mAb-re és 9.95 mAb-re.

I. táblázat

4.72 és 5.96 mAb-k beindítják a BALB/c egereket DTH-ra, amely tumor-fajlagos és allotípusosan korlátozott*

Egértörzs	Egerek injektálva mivel:	Átlagos mancsduzzadás (. 10^-3±SE-ben) egerekben amelyek fertőzve voltak
MCA-1490-nel	MCA-1511- gyel
BALB/c	4.72 mAb-vel	15,3+1,2⁴	5,0 +1,6
(H-2^d,	MCA-1490 sejtek	18,4+1,6⁴	nem végeztük el

HU 206 394 Β

Egértőrzs	Egerek injektálva mivel:	Átlagos mancsduzzadás (.10^-3±SE-ben) egerekben amelyek fertőzve voltak
MCA-1490-nel	MCA-1511- gyel
Igh—l^a)	5.96 mAb	8,0+1,2	13,7+0,3
	MCA-1511 sejtek	nem végeztük el	18,710,9
	Puffer	8,311,2	5,0+1,8
CB-20	4.72 mAb	7,710,4	6,710,3
(H-2^d	MCA-1490 sejtek	18,310,9²	nem végeztük el
Igh-1”)	5.96 mAb	8,210,6	6,711,2
	MCA-1511 sejtek	nem végeztük el	10,0±l,8*
	Puffer	8,011,2	5,310,6

♦Minden csoportban őt egeret injektálunk szubkután 5 gg mAbvel vagy 10⁶ tumorsejttel 100 μΐ-ben. 5 nappal később az összes egérnek 5X10⁵ tumorsejtet adunk 20 μΐ-ben az egyik hátsó mancsba, Az injektált mancs vastagságának növekedését (duzzadás) az ellenkező oldali mancshoz képest 24 órával később határozzuk meg, és úgy mutatjuk be, mint az egyes csoportok átlagát (±SE).

‘Ezeknek az egereknek a válasza szignifikánsan nagyobb, mint a pufferral injektált egereké, P kisebb, mint 0,01 szinten Student-féle teszttel.

A mancsduzzadás értékei hüvelykben (2,54 cm) értendők, a nem szabványos hosszegység is alkalmas az értékek összehasonlítására.

Amint az I. táblázatból látható, a 4.72 mAb-vel, majd MCA-1490 sejtekkel kezelt BALB/c egerekben kialakult a DTH-válasz, de nem válaszolnak az MCA1511 sejtekkel végzett kezelésre. Az 5.96 mAb analóg módon viselkedik annyiban, hogy ez MCA-15ll-re kialakítja a BALB/c egerekben a DTH-választ, de MCA-1490-re nem. A DTH fajlagossága jelzi, hogy különböző epitopok érdekeltek az MCA-1490-re és az MCA-1511-re adott immunválaszokban.

Korábbi, a 4.72 mAb-re vonatkozó adatokkal összhangban [Forstrom J. W. és munkatársai: Natúré, 303, 627 (1983)], a válasz-kialakítás azonosságot igényel az Igh-1 allotípus lokusszal kapcsolt géneknél (I. táblázat), mivel a két mAb egyike sem indít be CB-20 egerekben immunválaszt. Az immunizálás tumorsejtekkel viszont indukál DTH-t a CB-20 egerekben. Amikor antitest kötési vizsgálatokban vizsgáljuk [Cory J. és munkatársai: a „Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas” című kiadványban, szerkesztők: Hammerling G. J. és munkatársai, kiadó: Elsevier/North-Holland Biomedical Press, 503. oldal (1981)], az 5.96 mAb hasonló a 4.72 mAb-hez [Forstrom J. W. és munkatársai: Natúré, 303, 627 (1983)] annyiban, hogy nem kötődik szarkőma sejtekhez.

Arra a következtetésre jutottunk, hogy a 4.72 és 5.96 mAb funkcionálisan anti-idiotopikusak az MCA1490-re illetve MCA-1511-re adott immunválaszokra.

6.3 mAb 4.72 intravénás beadása elfojtja a DTH-t MCA-1490-re

Megvizsgáljuk 4.72 mAb intravénás (i. v.) beadásának hatását olyan egerek DTH reaktivitására, amelyek előzőleg vagy 4.72 mAb vagy MCA-1490 sejtek vagy MCA-1511 sejtek szubkután injekciójával voltak immunizálva; az utóbbit kontrollként alkalmaztuk.

Közvetlenül a szubkután immunizálás után az egereket farokvénájukon keresztül injektáljuk mintegy 5 pg

4.72 mAb-vel vagy 8.2 mAb-vel (mint kontrollal). A DTH választ 5 nappal később mérjük (II. táblázat).

IL táblázat

A 4.72 mAb elfojtja a DTH-t MCA-1490-re, amikor intravénásán (i. v.) injektáljuk egerekbe közvetlenül MCA-1490 tumor sejtek szubkután injekciójával történő immunizálás után

Egerek immunizálása	Egerek fertőzése	I. v. injektált antitest (vagy Fab fragmentumok)	Átlagos mancsduzzadás (,10-^J±SE)
4.72 mAb-vel	MCA-1490- nel	4.72 mAb	4,810,8²
8.2 mAb	12,210,7
semmi (puffer)	13,6+0,5
MCA-1490- nel	MCA-1490- nel	4.72 mAb	6,8+1,6²
4.72 Fab	7,2+1,3²
8.2 mAb	17,0+1,3
semmi (puffer)	9,810,7
Semmivel	MCA-1490- nel	semmi	4,010,9
MCA-1511 gyel	MCA-1511- gyei	4.72 mAb	15,012,6
4.72 Fab	15,611,2
8.2 mAb	14,812,1
semmi (puffer)	16,5+2,6
Semmivel	MCA-1511- gye!	semmi	4,611,3

*Az egereket szubkután injekcióval immunizáljuk, és a DTH-t mérjük olyan módon, ahogy az I. táblázatban leírtuk. A DTH visszafojtásához vizsgált anyagot hígítjuk, és 100 μΐ-t injektálunk i. v. közvetlenül immunizálás után. Az egyes egerek 5 gg teljes mAb-t vagy 3,5 gg Fab fragmentumot kapnak.

‘Ezeknek az egereknek a válasza jelentősen kisebb, mint azoknak az egereknek a válasza, amelyek puffért kaptak; a szignifikancia-szint kisebb, mint 0,001 a Student-teszt szerint.

Amint a II. táblázatban látható, 4.72 mAb i. v. injekciója elfojtja a szubkután injektált 4.72 mAb-nak vagy MCA-1490 sejteknek azt a képességét, hogy egerekben beindítsa a DTH-t MCA-1490 sejtek hatására. Ezen kívül a 4.72 mAb-ből készített Fab fragmentumok i. v. injekciója is elfojtja az MCA-1490 sejtekkel végzett immunizálást. Ugyanakkor MCA-1511 sejtekkel végzett immunizálásnál nincsen elfojtás; a kontroll,

HU 206 394 Β a 8.2 mAb i. v. injekciójának pedig nincs hatása (negatív kontroll kísérlet).

Arra a következtetésre jutottunk, hogy a beadás módja befolyásolja a 4.72 mAb-t kapott egerek DTH reaktivitását, szubkután injekciójával DTH-t indukálva (lásd a korábbi 6.2 fejezetet), és i. v. injekcióval elfojtva ezt a hatást.

Tanulmányoztuk, vajon a 4.72 mAb definiált idiotop jelen van-e az MCA-1490 hatására DTH-t közvetítő T-sejteken. Növekvő MCA-1490 tumorból kivett nyirokcsomókból származó mononukleáris sejteket elemzünk fluoreszcenciával aktivált sejt osztályozón (FACS), biotinhoz és avidin-FITC-hez kapcsolt 4.72 mAb-t alkalmazva. Bár a fényesen festett sejtek kevesebb, mint 1%-át képviselik a mononukleáris sejtek teljes populációjának, ezek nem láthatók azokban a mintákban, amelyet egy biotinilezett kontroll monoklonális antitesttel, a 8.2 mAb-vel elemezünk, azonos dózist alkalmazva. A festett sejteket izoláljuk és tenyésztjük interleukin-2 (IL—2) jelenlétében, a sejtekből sejtvonalat készítünk, amelyet 90.3-nak nevezünk. A 90.3 sejteket elemezzük felületi fenotípusra a tenyésztés 6 hete után ezek kötnek 4.72 mAb-t, bár a fluoreszcenciás intenzitás kisebb, mint az eredeti sejtek intenzitása. Ezek a sejtek Thy-1 pozitívak és kifejeznek Lyt-1 antigént, de Lyt-2 antigéneket nem.

Ezután megvizsgáljuk a 90.3 sejtek hatását az MCA1490-re kialakított DTH válasz során (III. táblázat).

III. táblázat

Tumor-fajlagos DTH-t viszünk át T-sejtek révén 90.3 és 11.2 vonalakból*

Tumorsejtek és effektor sejtek keverékével injektált egerek	Átlagos láb-mancs duzzadás (.ΚΓ³, +±SE)
Tumor sejtek	Effektor sejtek	1 kísérlet	2 kísérlet
MCA-1490	90.3	12,9±1,6*	15,0 ±2,2*
MCA-1490	normál T	9,6+1,1	4,8 ±0,6
MCA-1490	semmi (puffer)	7,0±0,7	4,0 ±0,4
MCA-1511	90.3	9,4+1,0	4,0 ±0,4
MCA-1511	11.2	17,3+2,6	10,7±l,2*
MCA-1511	normál T	10,2+2,3	3,0±0;3
MCA-1511	semmi (puffer)	8,0+0,7	3,0±0,4
semmi (puffer) 90.3	0,4+1,2	0,2±0,4
semmi (puffer) 11.2	2,6+0,6	l,2±0,6
semmi (puffer) normál T	4,8+1,0	3,6±1,2

*Ezeknek az egereknek a válasza jelentősen nagyobb, mint azoké az egereké, amelyek puffért és MCA-1490 sejteket kaptak; a P kisebb, mint 0,02 Student-teszttel,

Amint a ΙΠ. táblázatban bemutatjuk, DTH alakul ki MCA-1490-re amikor 90.3 sejtek és MCA-1490 sejtek keverékét injektáljuk természetes BALB/c egerek mancsaiba. Nem alakul ki DTH MCA-1511-re és nincs semmiféle mancs-duzzadás azokban az egerekben, amelyek csak 90.3 sejteket kaptak, de MCA-1490 sejteket nem. T-sejteknek egy második vonalát, a 11,2-t, egerek nyirokcsomóiból hozzuk létre, az antigenicitás szempontjából az MCA-1490-től különböző MCA1511 szarkóma kiemelésével. A 11.2 vonal MCA1511-re ad DTH-t, de nem ad MCA-1490-re (a táblázatban nem szerepel). Természetes egerekből származó nyirokcsomókat tenyésztünk IL-2-t tartalmazó tápközegben 48 órával a vizsgálat előtt és ezt használjuk másik kontrollként; ezek nem visznek át DTH-t MCA1490-re.

90.3 sejteket, amelyeket előzőleg 9 hétig tenyésztettünk, vizsgálunk az MCA-1490 tumor in vivő növekedésére való hatásukra. Természetes egerekből származó tenyésztett T-sejteket alkalmazunk kontrollként. A T-sejteket összekeverjük MCA-1490, MCA-1510 vagy MCA-1511 tumorsejtekkel, mindegyik keveréket szubkután 10 természetes BALB/c egérbe injektáljuk. A tumor megjelenésének időpontját figyeljük, valamint figyeljük a tumorok növekedésének sebességét is. Amint a 4. ábrában bemutatjuk, a 10 egér közül csak egy fejleszt tapintható tumorokat abban az esetben, ha MCA-1490 és 90.3 sejtek keveréket kapják, ugyanakkor a tíz egér közül kilenc fejleszt tumorokat, ha kontroll T-sejtek vannak összekeverve a 90.3 sejtek helyett. A 90.3 sejteknek nincs hatása a két, antigenicitás szempontjából eltérő szarkómára, az MCA-1510-re és MCA-1511-re.

Arra a következtetésre jutottunk, hogy a 4.72 mAb reagál MCA-1490-et hordozó egerekből származó Tsejtek egy kis populációjával, és arra, hogy a 90.3 sejtvonal, amely ilyen sejtekből származik, speciálisan reaktív az MCA-1490-nel.

Már korábban leírtuk T-T hibridőmák kialakítását MCA-1490 szarkómát hordozó egerekből származó T-sejtek fuzionálásával [Nelson K. A. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 2866 (1980)]. A monoklonális termékekről (szuppresszor faktorok), amelyeket ezekből a hibridómákból néggyel, az I-K54gyel, II—15-tel, ΙΙ-32-vel és ΙΙ-122-vel - amelyek az Oncogen cégtől szerezhetők be - készítettünk, demonstráltuk, hogy elfojtják a DTH-t MCA-1490-re de nem fojtják el MCA-1511-re, és fajlagosan kötődnek MCA-1490 sejtekhez, míg különböznek a szuppreszszió kinetikáját és genetikai restrikcióját illetően [Nelson K. és munkatársai: a „Τ-Cell Hybridomas” című kiadványban, szerkesztő: Taussig M. J., kiadó: CRC Press, 129. oldal (1985)].

*90.3 vagy 11.2 vonalakból vagy természetes BALB/c egerekből származó effektor T-sejteket (2xl0⁵) összekeverünk MCA-1490 vagy MCA-1511 sejtekkel (5xl0⁵) és injektáljuk egy természetes

BALB/c egér egyik hátsó mancsába. 24 óra múlva a DTH-t mérjük, és kiszámítjuk az 1. táblázatban leírt módon.

HU 206 394 Β

A négy szuppresszor egyikét, a K54SF-et kiválasztjuk, hogy megvizsgáljuk: vajon a 4.72 mAb által meghatározott idiotop össze van-e kapcsolva annak a faktornak a részével, amely kötődni képes MCA-1490hez. K54SF-et (amelyet tenyésztett I-K54 sejtek felülúszójából kapunk) és MCA-1490 sejteket együtt inokulálunk, ezután a tumorsejteket mossuk és minden K54SF-et, amely ezekhez kötődött, eluálunk. A szuppressziót DTH vizsgálattal vizsgáljuk, miután az eluátumot i. v. egerekbe injektáljuk közvetlenül azután, hogy ezek szubkután immunizálva voltak MC A-l 490 vagy MCA-1511 sejtekkel. Az eluátumokban tumorspecifikus elfojtó (szuppresszív) aktivitást nyerünk ki.

A 4.72 mAb-nek azt a képességét, hogy gátolja a 5 K54SF kötődését MCA-1490-hez, részletesebben is vizsgáljuk. K54SF-et tartalmazó tápközeget összekeverünk vagy 4.72 mAb-vel, vagy 8.2 mAb-vel (kontroll), mielőtt ezt hozzáadnánk MCA-1490 sejtekhez, és a sejtek eluátumait szuppresszióra megvizsgáljuk (IV. táblázat)

IV. táblázat

K54SF (I-K54 T-T hibridóma által készített szuppresszor faktor) inkubálása 4.72 mAb-vel gátolja ennek kötődését MCA-1490 sejtekhez*

Anti-MCA-l 490-nel immunizált egerek, injektálva az alábbi anyagokkal	Átlagos mancs-duzzadás (xl0“³±SE) MCA-1490-nel fertőzött egerekben
A szuppresszor faktor forrása (közeg)	A szuppresszor faktor öszszekeverve az alábbi anyagokkal	Ezt követően inkubálva az alábbi anyagokkal és eluálva az alábbiakból	1. kísérlet	2. kísérlet
I-K54	8.2 mAb	MCA-1490	6,4±0,6*	4,0+0,7*
I-K54	4.72 mAb	MCA-1490	15,6+1,1	15,2±0,9
BW5147 (kontroll)	8.2 mAb	MCA-1490	17,4+0,9	nem végeztük el
BW5147 (kontroll)	4.72 mAb	MCA-1490	17,2+1,6	nem végeztük el
I-K54	puffer	MCA-1490, előinkubálva 8.2 mAb-vel	nem végeztük el	6,6+1,5-¹
I-K54	puffer	MCA-1490, előinkubálva 4.72 mAb-vel	nem végeztük el	17,6±1,2*

*I-K54 vagy BW5147 (kontroll) sejtek tápközegeit először összekeverjük 4.72 mAb-vel vagy 8.2-mAb-vel, amely után ezeket MCA-1490 sejtekkel inkubáljuk. A 2. kísérletben vannak olyan csoportok is (az 5. és 6. sorban a táblázatban), amelyben az MCA-1490 sejteket 8.2 mAb-vel vagy 4.72 mAb-vel inkubáljuk, mielőtt ezeket I-K54 tápkőzeggel inkubálnánk. Inkubálás után a tumorsejteket mossuk és a hozzájuk kötött anyagot eluáljuk és vizsgáljuk DTH gátlására MCA-1490-re. Az átlagos hátsó mancsAmint a IV. táblázatból látható, MCA-1490 sejtek eluátumai, amelyeket előzőleg 8.2 mAb és K54SF keverékével inkubáltunk, visszafojtja a DTH-t MCA- 45 1490-re. Ezzel ellentétben K54SF és 4.72 mAb keverékével inkubált MCA-1490 sejtek eluátuma nem szuppresszív. Ez az eredmény azt jelzi, hogy a K54SF-nek azt a képességét, hogy MCA-1490-hez kötődik, gátolja a kötődése mAb 4.72-höz. MCA-1490 sejtek eluátu- 50 mai, amelyeket előzőleg BW5147 (kontroll) tápközeggel és 8.2 mAb-vel inkubáltunk, nem szuppresszívak; ennek megfelelően az elfojtás (szuppresszió) nem az eluált tumor antigénnek tulajdonítható. Az MCA-1490 sejtek előkezelése 4.72 mAb-vel nem akadályozza meg 55 K54SF kötődését (lásd a XV táblázat 6. vonalát), és így az a gátlás, amely akkor látható, amikor K54SF-et

4.72 mAb-vel inkubálunk, nem tulajdonítható a 4.72 mAb és a K54SF közti kompetíciónak az MCA-1490 sejtek antigén-kötésért. Az eredmények azt sugallják, 60 duzzadás a nem immunizált (kontroll) egerekben 5,0 ±0,3 az 1. kísérletben és 5,2 ±0,6 a 2. kísérletben, és az átlagos hátsó mancsduzzadás az anti-MCA-1490 immun-egerekben, amelyek MCA-1490-nel kihívásnak voltak kitéve, 15,8 ±1,4 az 1. kísérletben és 17,6 ±1,0 a 2. kísérletben.

^:Ezeknek az egereknek a válasza szignifikánsan kisebb, mint azoknak az egereknek a válasza, amelyek puffért kapnak; a szignifikancia szintje: P kisebb, mint 0,001 Student-teszttel.

hogy a 4.72 mAb által felismert idiotop a K54SF azon helyénél fejeződik ki, ahol az MCA-1490-hez köt, vagy legalább szoros közelségben ehhez a helyhez. Hasonló eredményeket kapunk egy T-sejt hibridóma, a

11-32 által termelt szuppresszor faktornál is.

Mivel a K54SF elfojtja a DTH-t MCA-1490-re, megvizsgáltuk a K54SF hatását 90.3 sejtek működésére, mivel ezek a sejtek át tudják vinni az MCA1490-re fajlagos DTH-t (lásd a fentebbi 6.4 fejezetet). Egereket injektálunk az egyik hátsó mancsba

90.3 sejtvonalból származó sejtek és MCA-1490 tumorból származó sejtek keverékével. Egy órával később a K54SF-et (mint az I-K54 hibridóma felülúszóját) injektáljuk ugyanabba a hátsó mancsba; kontrollként BW5147 felülúszót alkalmazunk. Amint az

V. táblázatból látható, K54SF injekciója elfojtja a

90.3 sejteknek azt a képességét, hogy DTH-t közvetítsen MCA-1490-re.

HU 206 394 Β

V. táblázat

A 90.3 vonal T-sejtjeivel átvitt DTH-t MCA-1490 sejtekbe elfojtva egy olyan faktor, amelyet az I-K54 T-T hibridóma termel*

DTH-t átvivő sejtek	A szuppresszor (elfojtó) faktor forrása (tenyésztő tápközeg)	Átlagos mancsduzzadás (xlO’+fcSE
1.kísérlet	2. kísérlet
90.3	Semmi	(puffer)	19,2 ±1,6	15,0±2,2
	I-K54	1,0 μ.1	8.2±0,8*	nem végeztük el
I-K54	0,1 μι	9,410,9*	3,0 ±0,4*
BW5147	1,0 μΐ	20,3±l,4	nem végeztük el
BW5147	0,1 μΐ	19,6±1,6	13,3 ±1,2
Normál T	Semmi	(puffer)	9,6±1,1	4,8 ±0,6
Puffer	Semmi	(puffer)	7,0±0,7	4,0 ±0,6

*A 90.3 vonal T-sejteket összekeverjük MCA-1490 sejtekkel és természetes BALB/c egerek hátsó mancsaiba injektáljuk, hogy megmérjük a DTH-t, amint ezt a III. táblázatnál leírtuk. Az I-K54 vagy BW5147 (kontroll) sejtek tápközegét 5 μΐ-re hígítjuk és ugyanabba a hátsó mancsba injektáljuk, mint a T-sejt-tumorsejt keverékét. 5 egeret alkalmazunk csoportonként.

^:Ezeknek az egereknek a válasza szignifikánsan kisebb, mint azoké az egereké, amelyek 90.3 sejteket, tumorsejteket és puffért kaptak; a szignifikancia szintje: P kisebb, mint 0,01 Student-teszttel.

Mivel úgy tűnik, mind a 90.3 effektor sejtek, mind a K54 szuppresszor sejtek hordoznak egy 4.72 mAb által meghatározott epitópot, értékeljük, vajon ez az idiotop jelen van-e a K54-től eltérő T-sejt hibridómák által készített szuppresszor faktorokon is. A négy különböző T-sejt hibridómából származó szuppresszor faktorokat vizsgáljuk elfojtó (szuppresszív) aktivitásra immobllizált 4.72 mAb-vel végzett inkubálás után. A négy hibridóma és a BW5147 (kontroll) sejtek tenyészközegét

4.72 mAb vagy 8.2 mAb (kontroll) oszlopain engedjük át, amely mAb-ket előzőleg kovalensen kötöttünk agarózhoz. Az átfolyó folyadékokat megvizsgáljuk a DTH elfojtására MCA-1490-re, ezeket i. v. injektálva BALB/c egerekbe közvetlenül azután, hogy ezeket szubkután immunizáltuk MCA-1490-re (VI. táblázat).

VI. táblázat

A 4.72 mAb kötődik azokhoz a faktorokhoz, amelyeket T-sejt hibridómák termelnek és amelyek elfojtják a DTH-t MCA-1490-re*

A szuppresszor faktorok forrása (tenyészközeg az alábbi tenyészetekből)	Átlagos hátsó láb duzzadás (xl0³±SE) az alábbiakkal adszorbeált tenyészközeggel injektált egerekben
8.2 mAb	4.72 mAb
BW5147 (kontroll)	24,2+1,8	23,4±0,8
I-K54 hibridóma	7,8±l,0*	22,9 ±1,2

A szuppresszor faktorok forrása (tenyészközeg az alábbi tenyészetekből)	Átlagos hátsó láb duzzadás (xl0'³±SE) az alábbiakkal adszorbeált tenyészközeggel injektált egerekben
8.2 mAb	4.72 mAb
11-15 hibridóma	9,6±2,8**	18,4 ±2,2
11-32 hibridóma	10,8±2,0**	24,8 ±2,4
H-122 hibridóma	11,0+1,2*	23,6 ±2,0

♦1-K54, II-15, II-32 és 11-122 T-sejt hibridómák vagy BW5147 (kontroll) sejtek kialakult tenyészközegeit átengedjük kovalensen agarózhoz kötött 4.72 vagy 8.2 mAb oszlopon. Az elfolyó folyadé15 kot az MCA-1490-re való DTH induktív fázisának elfojtására vizsgáljuk, amint ezt a II. táblázatnál leírtuk. A hátsó mancs duzzadásban levő különbségek statisztikus szignifikanciáját, összehasonlítva a hígítót kapott kontroll egerekkel, Student teszttel becsüljük meg.

^:P kisebb, mint 0,001 **P kisebb, mint 0,01.

Amint a VI. táblázatból látható a négy T-hibridóma bármelyikéből származó és egy kontroll oszlopon (8.2 mAb) átengedett tenyészközeg elfojtja a DTH indukcióját MCA-1490-re, míg ez az elfojtás megszűnik egy

4.72 mAb oszlopon való átbocsátással. Úgy tűnik ilyen módon, hogy mind a négy szuppresszor faktor kifejezi a 4.72 mAb által meghatározott idiotopot.

Ez az eredmény azt sugallja, hogy a 4.72 mAb által meghatározott idiotop domináns az MCA-1490-re adott szuppresszor válasz szabályozásával. Mivel azonban csak négy hibridómával készített faktorokat tanulmányoztunk, ezután elemezzük a feltehetően po35 liklonális szuppresszor választ növekvő MCA-1490 szarkómák hordozó egerekben. Ez a kísérlet azt mutatja be, hogy MCA-1490 vagy MCA-1511 szarkómákat hordozó egerekből származó szérumok képesek elfojtani DTH indukcióját a megfelelő tumorra (VII. táblá40 zat).

VII. táblázat

Az MCA-1490 vagy MCA-1511 szarkómát hordozó egerekből kapott szérumok elfojtják a DTH-t a megfelelő tumorra*

Szérum donor	Átlagos hátsó mancs duzzadás (xlO^-3 ±SE) egerekben
Immunizálva és kihívást végezve
MC A-l 490-nel	MCA-1511-gyel
MCA-1490 tumort hordozó egerek	6,7 ±1,3*	20,0±0,4
MCA-1511 tumort hordozó egerek	15,9 ±2,6	10,4 ±2,3*

HU 206 394 Β

Szérum donor	Átlagos hátsó mancs duzzadás (xlO^-3 ±SE) egerekben
Immunizálva és kihívást végezve
MCA-1490-nel	MCA-15ll-gyel
Természetes egerek	17,5+4,5	22,2 ±2,6
Semmi (puffer)	15,0+1,4	21,0+1,4

♦Fokozatosan növekvő MCA-1490 vagy MCA-1511 tumorokat hordozó egerekből vagy kontroll egerekből származó szérumokat hígítunk, és 100 μΐ-t injektálunk i. v. egerekbe, közvetlenül az MCA-1490-re vagy MCA-1511-re való immunizálás előtt. A DTH-t úgy váltjuk ki és úgy mérjük, ahogyan ezt az 1. táblázatban leírtuk. Az átlagos hátsó mancs duzzadás a nem immunizált egerekhez 5,3 ±1,2 az MCA-1490-nel végzett kihívás után és 6,3 ±0,3 az MCA-1511-gyel végzett kihívás után.

•Ezeknek az egereknek a válasza szignifikánsan kisebb, mint azoké az egereké, amelyek puffért kaptak; a szignifikancia szintje kevesebb, mint 0,01, Student-teszttel.

A tumort hordozó egerekből kapott szérumokat 4.72 mAb vagy 8.2 mAb (kontroll) oszlopain kromatografáljuk, és az elfolyókat és eluátumokat a DTH elfojtására vizsgáljuk (VIII. táblázat).

Amint a VIII. táblázatból látható, MCA-1490-et hordozó egerekből származó szérumok elfojtják a DTH-t MCA-1490-re, kontroll oszlopon (vagyis 8.2 mAb oszlopán) keresztül történő átengedés után, de nem 4.72 oszlopon történő átengedés után, és az anyagot, amely a DTH-t MCA-1490-re elfojtja, az utóbbi oszlop eluátumából kinyerjük. 4.72-vel végzett immunadszorpció nem vátolítja el egy eltérő tumort, az MCA-1511-et hordozó egerekből származó szérumoknak azt a képességét, hogy elfojtják a DTH-t erre a tumorra.

Vili. táblázat

A 4.72 mAb megköti azokat a szérum faktorokat, amelyek elfojtják a DTH-t MCA-1490-re, de nem köti azokat a szérum faktorokat, amelyek az MCA-1511-re való DTH-t fojtják el

Egerek	Átlagos hátsó mancs duzzadás (xl0³±SE)
Immunizálás	Kihívás	Intravénás injektált	1.kísérlet	2. kísérlet
Szérumok	Immun-adszorbeált az alábbi anyaggal készített oszlopon	Frakció az immunadszorbens oszlopról
MCA-1490-nel	MCA-1490-nel	MCA-1490 tumor-hordozó	8.2 mAb	Elfolyó	6,0±l,3*	6,0±l,4*
8.2 mAb	Eluátum	16,6±0,7	nem végeztük el
4.72 mAb	Elfolyó	15,0±l,0	16,0±2,0
4.72 mAb	Eluátum	7,2±0,8	8,0±l,3*
Semmi(hígító)	-	-
Semmivel (nem immunizált)	MCA-1490-nel	Semmi			5,3+1,2	6,3±0,7
MCA-1511-gyel	MCA-1511-gyel	MCA-1511 tumor-hordozó	8.2 mAb	Elfolyó	10,2+1,2*	10,2±l,2*
8.2 mAb	Eluátum	19,2±2,0	nem végeztük el
4.72 mAb	Elfolyó	9,8+1,6	9,8±1,2
4.72 mAb	Eluátum	16,8±1,5	15,8±1,2
semmi(puffer)	-		21,0±l,4	17,6±0,8
Semmivel (nem immunizált)	MCA-1511-gyel	Semmi			6,3±0,3	5,7±0,7

‘MCA-1490 vagy MCA-1511 tumorokat hordozó egerekből származó szérumokat átengedünk 4.72 mAb vagy 8.2 mAb immunadszorbens oszlopain, ahol az mAb-k kovalensen vannak kötve agarózhoz. Az oszlopokat mossuk, és a kötött anyagot 3 mól/l-es NaSCN-nel eluáljuk, és Sephadex G-25-ön sőmentesítjük, amelyet előzőleg DBS-sel egyensúlyoztunk ki. Az elfolyókat és eluátumokat az egyes oszlopokról a DTH induktív fázisának elfojtására vizsgáljuk, amint ezt a XII. és XVI. táblázatokban bemutatjuk.

^:Ezeknek az egereknek a válasza szignifikánsan kisebb, mint azoknak az immunizált egereknek a válasza, amelyek hígítót kapnak; a szignifikancia szintje: P kisebb, mint 0,01, Student teszttel

HU 206 394 Β

Eredményeink azt jelzik, hogy a DTH elfojtása MCA-1490-re társul egy, a 4.72 mAb által felismert epitóppal, és hogy a DTH elfojtása MCA-1511-re érinti ezt az idiotopot.

6.6 MCA-1490 vagy MCA-1511 tumorokkal bíró egerek szeroterápiája

Megvizsgáljuk, vajon a 4.72 mAb és az 5.96 mAb injekciója védi-e az egereket a megfelelő tumorsejtek kihívása ellen (MCA-1490, illetve MCA-1511), és vajon ennek van-e terápiás hatása kialakult tumorokra. Az mAb-t intraperitoneálisan injektáljuk; az i. v. utat annak a bizonyítéknak az alapján nem választjuk (lásd a korábbi 6.3 fejezetet), hogy az így injektált egerek csökkentett DTH reaktivitást mutattak tumor antigénre.

A kísérletek első sorozatában egereket (csoportonként 20 darabot) injektálunk vagy 4.72 mAb-vel, vagy

8.2 mAb-vel (kontroll). Ezeket öt nappal később kihívásnak vetjük alá MCA-1490 sejtekkel olyan dózissal, amely - kísérleti elővizsgálat szerint - progresszív tumor-növekedést okoz a befogadók mintegy 90%-ában. 4.72-vel injektálva az átültetett MCA-1490 szarkóma megjelenése elhalasztódik 5-9 nappal a kontrolihoz viszonyítva, de nincs szignifikáns különbség a progreszszíven növő tumorban elpusztuló egerek százalékában. Az antigenicitás szempontjából nem rokon MCA-1511 szarkómára nincs hatás. Az injektált 4.72 mAb mennyiségének változtatása nem javítja az eredményeket. Sőt, az egyik kísérletben, amelyben az egerek a 4.72 mAb százszoros mennyiségét kapják a DTH-t beindítani képes mennyiséghez viszonyítva, az MCA-1490 növekedése felgyorsult mind a kontroll egerekhez, mind a kontroll tumorokhoz viszonyítva. Kétszeres hatásról is számolnak be vírusos antigénekre való immunitás manipulációjában, anti-idiotípusos antitesteket alkalmazva [Kennedy R. C. és Dreesman G. R.: J. Exp. Med. 159, 655 (1984); Kennedy R. C. és munkatársai: J. Virol. 50,951 (1984)].

A kísérleteknek egy második sorozatában az egereket először MCA-1490 sejtekkel injektáljuk szubkután, majd ezt követi 7 vagy 8 nappal később 100 pg

4.72 mAb intraperitoneálisan; ebben az időpontban a tumorok éppen csak kitapinthatóvá válnak az egerek mintegy 50%-ában. Az antitest injekciót 4-5 napos időközönként megismételjük összesen négy injekció erejéig. A 10 egér mindegyikében, amely 4.72 mAb-t kapott, az eredeti kis tumor csomócskák visszafejlődnek, amikor a kísérletet 6 hét múlva befejezzük. Ekkor a 10 egér közül, amelyek a kontroll 8.2 mAbt- kapták, 6 progresszíven növekvő tumorral bír, amely tumorok felülete nagyobb vagy egyenlő 0,20 cm²-rel. Ez a különbség a két csoport között szignifikáns, ahol P kisebb vagy egyenlő 0,05-tel.

Abból a célból, hogy megvizsgáljuk a terápia ezen formáinak határait, a tumorsejtek adagját növeljük, annyi tumorsejtet adva be, amely kétszerese a befogadók 100%-ában a tumorsejtek kinövéséhez szükséges mennyiségnek. A két, antigenicitás szempontjából kü-. lönböző szarkómát, az MCA-1490-et és MCA-1511et párhuzamosan kezeljük megfelelő anti-idiotípusos mAb-kkel (4.72, illetve 5.96). Tíz egérből álló csopor26 tót injektálunk 4.72 mAb-vel (ez az MCA-1490-hez tartozik) 5.96 mAb-vel (ez az MCA-1511-hez tartozik), 8.2 mAb-vel (mint kontrollal), vagy hígítóval, kilenc nappal az átültetés után indítva, amikor minden egérnek éppen csak kitapintható tumorja (nagyobb, mint 0,2 cm²) van. Amint az 5. ábrában látható, a kezelés 4.72 mAb-vel korlátozza az MCA-1490 növekedését, de nem korlátozza az MCA-1511 növekedését, és az 5.96 mAb-vel végzett kezelés hasonló módon gátolja az MCA-1511-et, de nem gátolja az MCA1490-et. A különbségek a megfelelő anti-idiotípusos mAb-t és a három kontrollt (a nem megfelelő anti-idiotopikus mAb, a 8.2 mAb, vagy hígító) befogadó egerek között statisztikusan szignifikáns P kisebb, vagy egyenlő 0,001 szinten. A 6. ábra mutatja be ezeket az adatokat részletesebben, bemutatva a tumorral bíró egerek számát az egyes csoportokban, amelyek 4.72 mAb-vel vagy 5.96 mAb-vel vannak kezelve. A két csoport mindegyikében, amelyek megfelelő anti-idiotí20 pusos antitestet kaptak, a 10 kezelt egérből 5 vagy

7-ben fejlődik vissza a tumor, és ezek közül az egerek közül három (a két csoport mindegyikében) tumormentes marad két héttel az antitest utolsó injekciója után. Ebben az időpontban a kontroll csoportban már az összes egérnek tumorja van 1,5 cm²-nél nagyobb felülettel, és néhány egér ezek közül elpusztul tumorban.

Arra a következtetésre jutottunk, hogy a kifejlődött MCA-1490 és MCA-1511 szarkómákkal bíró egerek kezelésének, a megfelelő anti-idiotípusos mAb intraperitoneális injekcióját alkalmazva, szignifikáns tumorellenes aktivitása van.

6.7 .Tárgyalás

Itt bizonyítékot adunk ama, hogy T-sejtek és anti35 idiotípusos B-sejtek keletkeznek olyan egerekben, amelyek vagy növekedő szarkómával bírnak, vagy ilyen tumorral vannak immunizálva. Az azonos idiotopot hordozó T-sejtek magukban foglalják azokat a sejteket, amelyek tumor-fajlagos DTH-t közvetítenek és azokat a sejteket, amelyek oldható, tumor-fajlagos szuppresszor faktort állítanak elő. Anti-idiotopikus mAb-t alkalmazva manipulálhatjuk a tumorellenes választ olyan módon, hogy korlátozza a szóban forgó antigéneket kifejező, kialakult szingén szarkómák nö45 vekedését.

Két mAb-t, a 4.72-t és 5.96-ot, alkalmazunk. Ezeket olyan BALB/c egerekből izoláljuk, amelyek előzőén MCA-1490, illetve MCA-1511 szarkómákkal voltak immunizálva. A két mAb-t úgy tekintjük, hogy anti50 idiotopikusak három szempontból is.

Először mindegyik mAb tumor-fajlagos DTH-t indukál szingén egerekben tumor antigén távollétében. Másodszor, ez az indukció allotípusosra korlátozott. Harmadszor, az mAb egyike sem kötött az immunizáló tumorhoz.

A 4.72 mAb által meghatározott idiotopot olyan T-sejteken azonosítjuk, amelyek DTH-t közvetítenek MCA-1490-re. Ezt olyan kísérletben végezzük, amelyben 4.72 mAb-t alkalmazunk, hogy MCA-1490-nek megfelelő egerek nyirokcsomóiból limfociták egy kis

HU 206 394 Β frakcióját izoláljuk, amelyek egy 4.72 által definiált idiotopot fejeznek ki, és amelyekből egy T-sejtvonal, a

90.3, alakítható ki. 90.3 sejtet befogadó természetes egerek DTH-t mutatnak MCA-1490-re, de nem mutatnak MCA-1511-re, és a 90.3 sejtek megakadályozzák az MCA-1490 szarkóma kinövését, de nem akadályozzák meg az MCA-1510 vagy MCA-1511 kinövését. Cheever és munkatársai [J. Exp. Med. 163, 1100 (1986)] bemutatták Lyt 1+2^- T-sejteknek azt a képességét, hogy korlátozzák a rágcsáló leukémia kifejlődését. Ez a munkamenet azonban magában foglalja a tenyésztett sejtek újra stimulálását antigénnel, valamint IL-2vel. A 90.3 sejtek tumor-fajlagossága az ellen érvel, hogy ezek limfokin-aktivált ölő (killer) sejtek lennének.

Azoknak a T-sejteknek a termékeiről, amelyek elfojtják a DTH választ MCA-1490-re, úgy találjuk, hogy a 4.72 mAb által meghatározott idiotopot fejezik ki. Ezt négy olyan T-sejt hibridómán végzett tanulmányokkal mutattuk ki, amelyeket növekvő MCA-1490 tumorokat hordozó egerekből származó timocitáknak BW5147 sejtekkel végzett fúziójával kaptunk [Nelson

K. és munkatársai: a „T-Cell Hybtidomas” című kiadványban, szerkesztő: Taussig Μ. I, kiadó: CRC Press, 129. oldal (1985)]. Ezeknek a hibridómáknak a termékeiről korábban úgy találták, hogy elfojtják az ⁵¹Cr-rel jelzett MCA-1490 sejtek lízisét, amelyet fajlagosan immun-citolitikus T-sejtek idéznek elő [Nelson K. A. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 2866 (1980)], és elfojtják a DTH indukcióját MCA-1490-re [Cory J. és munkatársai: a „Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas” című kiadványban, szerkesztők: Hammerling G. J. és munkatársai, kiadó: Elsevier/North-Holland Biomedical Press, 503. oldal (1981)], ez az elfojtás fajlagos az MCA-1490-re adott válaszra és allotípusosan behatárolt. Ezen kívül a szuppresszor faktorokról azt találták, hogy kötődnek az MCA-1490 sejtekhez, amelyekből ezeket eluálással ki lehet nyerni [Nelson K. A. és munkatársai: fentebb idézett munka (1980)]. Ezekben az itt leírt példákban azt mutatjuk be, hogy a 4.72 mAb gátolja mind a négy szuppresszor faktor kötődését az MCA-1490 sejtekhez. Ez azt sugallja, hogy a 4.72 mAb _t által meghatározott idiotop társulva van a szuppresszor faktoron levő hellyel, amely kötődik az MCA-1490 sejteken levő tumor antigénhez. A 4.72 mAb által meghatározott idiotopot hordozó T-szuppresszor faktorok elfojtják mind a DTH beindítását 4.72 mAb-re, mind az MCA-1490-re való DTH átvitelét a 90.3 vonalról (amely, amint fentebb tárgyaltuk, kifejezi a 4.72 mAb által meghatározott idiotopot).

Ezekre az adatokra alapozva a következő modellt javasoljuk: a 4.72 mAb egy olyan idiotopot határoz meg, amely tumor-fajlagos szabályozó T-sejteken fordul elő és domináns a BALB/c egerek immunválaszában MCA-1490-re. Ennek a válasznak a során egy azonos vagy egy kereszt-reagáló idiotop anti-idiotípusos antitestet termelő B-sejt kiónt aktivál. Az utóbbi antitestekről feltételezhető, hogy szabályozza mind a szuppresszor T-sejteket, mind a DTH-reaktív T-sejteket. Modellünk feltételezi, amelyet különböző tanulmányok is alátámasztanak [Rajewski K. és Takemori T.: Ann. Rév. Immunoi. 1, 569 (1983); Urbain J. és munkatársai: Ann. Immunoi. 133D, 179; Binz H. és

Wigzell H.: J. Exp. Med. 147, 63 (1978); Érti H. C. J. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 7479 (1982)], hogy a T- és B-sejtek kölcsönhatásban vannak idiotípusos hálózatokban. Modellünk azt is feltételezi, hogy egy B-sejt eredetű anti-idiotípusos antitest (a mi példánkban 4.72 mAb) alakul ki egy T-sejt idiotopra adott válaszban, és nem alakul ki idiotop-pozitív B-sejtek párhuzamos készletében. Ennek támogatására nekünk nincs bizonyítékunk tumorsejt kötő antitestre egereknek MCA-1490-re adott válaszában, és nem va15 gyünk képesek ilyen antitestet indukálni 4.72 mAb-vel végzett immunizálással. Ez ellentétben van a könnyűséggel az idiotop-pozitív, antigénreaktív T-sejtek bemutatásában. Ezek az adatok támogatják azt a hipotézist, hogy egy T-sejt idiotop anti-idiotípusos választ indukálhat B-sejt szakaszban, amely viszont T-sejt válaszokat szabályozhat mind „felfelé”, mind „lefelé” irányban.

Egy másik modell feltételezi, hogy a 4.72 mAb-vel meghatározott idiotop az MCA-1490 tumor antigén belső képmását mutatja. Nehéz azonban összeegyeztetni ezt a modellt a 4.72 mAb által kiváltott DTH indukciójának allotípusos (Igh-1) korlátozásával.

A jelen találmányban a 4.72 anti-idiotípusos mAb-t sikeres kísérletben alkalmazzuk, hogy eltávolítsuk az

MCA-1490-et hordozó egerekből származó szérumok szuppresszív aktivitását. Mindazok a cirkuláló szérumfaktorok, amelyeket ki lehet mutatni az MCA-1490hez szolgáló DTH elfojtásának méréséhez, úgy tűnik, kifejezik a 4.72 által meghatározott idiotopot.

Amint korábban már leírtuk, ezután megvizsgáljuk a tumorra való immunválasz manipulálásának megvalósíthatóságát, anti-idiotípusos mAb-t alkalmazva. A

4.72 és 5.96 mAb-t választjuk ki, mivel ezek mindketten képesek DTH-reaktív sejteket indukálni termé40 szetes egerekben, és mivel az mAb-k egyikével, a 4.72-vel meghatározott idiotopot DTH-reaktív sejtek fejezik ki immun-egerekben, Kísérleteink első sorozata a tumor megelőzés kérdésére válaszol, míg kísérleteinknek egy másik sorozata a már kialakult terápiájával foglalkozik. Amikor az egerek a 4.72 mAb-t az előtt kapják meg, mielőtt MCA-1490 sejtekkel kihívást végeznénk rajtuk, a tumor kinövés általában néhány nappal elhalasztódik. Ezek a tumorellenes hatások nem javulnak az mAb dózis növelésével; sőt egy kísérlet

100-szoros növeléssel az mAb-ben meggyorsult tumor növekedést mutat.

A kísérleteknek egy második sorozatában megvizsgáljuk a már létrejött szarkómákkal bíró egerek injektálásának terápiás értékét, az injektálást intraperitoneá55 Hsán végezve a megfelelő anti-idiotípusos mAb-vel. A

4.72 mAb injekciója korlátozza az MCA-1490 szarkóma növekedését (míg az 5.96 mAb nem), és még pontosabban 10 ilyen szarkómából 3-nál visszafejlődést indukál, és a kezelt egerek túlélésének^ meghosszab60 bodását idézi elő. Az 5.96 mAb injenciója hasonló

HU 206 394 Β hatást mutat (a 4.72 mAb-é viszont nem) az MCA1511 szarkómával bíró egerekben, szintén visszafejlődést indukálva 10 szarkóma közül háromban.

Olyan idiotípusra fajlagos anti-idiotípusos antitestek, amelyek felismernek egy humán melanómával társult GD3 gangliozid antigént Az MG-21 egér monoklonális antitest (mAb) [Hellstrom és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1499-1502 (1985)] egy, a legtöbb humán melanómából származó sejtek és nyomnyi mennyiségben normál sejtek felületén kifejezett GD3 gangliozid antigént ismer fel [Dippold W. G. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 6114-6118 (1980); Nudelman E. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 257, 1275212765 (1982); Yeh Μ. Y. és munkatársai: Int. J. Cancer 29, 269-275 (1982)]. Az MG-21 mAb komplementfüggő citotoxicitást (CDC) mutat GD3-pozitív sejtekre humán szérummal, mint a komplement forrásával, és antitest-függő celluláris citotoxicitást (ADCC) mutat GD3-pozitív sejtekre humán limfocitákkal [Hellstrom és munkatársai; fentebb idézett munka (1985)]. A GD3 antigént, amelyhez az MG-21 kötődik, bizonyos sikerrel alkalmazták már célpontkén egy egér mAb-hez, az R24-hez [Houghton A. N. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1242-1246 (1985)], amelynek fajlagossága és biológiai aktivitása hasonló az MG-21éhez. Amint a példákban leírjuk, az MG-21-et (Abl) immunogénként alkalmazzuk egy egér monoklonális anti-idiotípusos antitest (Ab2) kialakítására, amelyet 2C 1-nek nevezünk. Ezt az mAb-t, amely IgG2a típusú, azon képessége alapján választjuk ki, hogy gátolja az MG-21 kötését egy GD3-pozitív melanóma sejtvonalhoz. A 2C1 mAb-ről úgy találjuk, hogy nagy intenzitással kötődik MG-21-hez, de nem kötődik a többi hat egér mAb egyikéhez sem. Ez teljesen megszünteti az MG-21 kötését a GD3 pozitív melanóma sejtekhez, valamint a tisztított GD3-hoz, és ez gátolja az MG-21 CDC és ADCC tulajdonságait dózis-függő módon. Vizsgáló mintaként 2C1 mAb-t alkalmazva vizsgálatot fejlesztünk ki, hogy megfigyeljük az MG-21 mAb-hez tartozó humán antitesteket olyan betegekben, akik MG-21 mAb-t kapnak gyógyászati vagy diagnosztikai célból. A jelen találmány ezen kiviteli módjának egyes lépéseit részletesen az alábbi al-fejezetekben írjuk le.

7.1 Anyagok és módszerek

7.1.1 Egerek

8-12 hetes BALB/c nőstény egereket vásárolunk a Fred Hutchinson Cancer Research Center Allatszolgáltató Részlegétől (Animál Facilities) (Seattle, Washington, USA).

7.1.2 Célsejtek

M-2669 humán melanóma 13. kiónt, amely az alább megnevezett irodalmi forrás szerint állítható elő, alkalmazunk; az egyszerűség kedvéért ezt ezután itt M2669-nek nevezzük. Ezt korábban áttételes melanómából hozták létre és klónozták [Beaumier P. L. és munkatársai: J. Nucl. Med. 27, 824-828 (1986)]. Az ebből a kiónból származó sejtek erősen fejezik ki az MG-21 mAb által kifejezett GD3 antigént, amint ezt kötési vizsgálatokkal meghatározták. A melanóma sejtek 6%

CO₂-t tartalmazó levegőben, RPMI 1640 tenyésztő tápközegben (Gibco, Grand Island, New York) nőnek, amely tápközeg 15%, hővel inaktivált borjú-embrió szérum albumint tartalmaz (Hyclone Laboratories,

Inc., Logan, Utah), NaHCO₃-mal pufferolva van, és ki van egészítve penicillinnel (100 egység/ml), streptomicinnel (100 mg/ml) és L-glutaminnal (290 mg/liter).

7.1.3 Glikolipid

A GD3 gangliozid antigént M-2669 melanóma sejt

13. klónból tisztítjuk, amint ezt már korábban leírták [Nudelman E. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 257, 12752-12756 (1982)], ezt dr. Sen-itiroh Hakomori bocsátotta rendelkezésre (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, Washington).

7.1.4 Monoklonális antitestek

Az MG-21 [Hellstrom I. és munkatársai: Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 82, 1499-1502 (1985)] olyan IgG3 antitest, amely egy humán melanómák mintegy 8090%-a által erősen kifejezett GD3 gangliozid antigén20 hez kötődik [Nudelman E. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 257, 12752-12756 (1982); Yeh M. Y.: Int. J. Cancer 29, 269-275 (1982)]. Az MG-21 közvetíthet CDC-t humán szérum jelenlétében és ADCC-t humán perifériás vérlimfociták (PBL) jelenlétében, és ez gá25 tolhatja humán melanóma xenograftok kinövését meztelen egerekben [Hellstrom I. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,1499-1502 (1985)].

A 2A-14 mAb egy IgG3, amely szintén kötődik a GD3 gangliozid antigénhez, de egy olyan epitóphoz, amely a kereszt-gátlási kísérletek szerint - úgy tűnik különbözik attól, amelyet az MG-21 ismer fel.

A 96.5 mAb egy Ig2a, amely p97-hez, egy melanómával társult sejt felületi glikoproteinhez kötődik [Brown, J. P. és munkatársai: J. Immunoi. 127, 53935 546(1981)].

Az L6 mAb egy Ig2a, amely a legtöbb humán karcinómából, de nem melanómából származó sejten erősen kifejezett szénhidrát antigénhez kötődik [Hellstrom I. és munkatársai: Cancer Rés. 46, 391740 3923 (1986)].

Az L2 mAb egy IgGl, amely egy, a legtöbb humán karcinómából de nem melanómából származó sejtek felületén kifejezett 110 kDa-s fehérjét azonosít.

A 7T1.1 mAb egy IgG3 immunglobulin, amely egy, 45 több humán karcinómán erősen kifejezett „A” vércsoport antigénre fajlagos.

Az 1G3.10 mAb egy IgG3 antitest, amely szintén több humán karcinómán kifejezett „Α’’-szerű vércsoport antigénre fajlagos.

A 26.8 mAb, amelyet Ab2 kontrollként alkalmazunk, IgGl típusú, amely a p97 melanóma antigénre fajlagos 96.5 mAb-η levő idiotophoz kötődik. Az eddig felsorolt monoklonális antitesteket az Oncogen-nél fejlesztették ki és onnan szerezhetők be.

A Pl. 17 egy IgG2a egér melanóma fehérje, amelyet az American Type Culture Collectiontól szerzünk be (ATCC TIB10 számon).

Az antitesteket vagy kialakult tény észközegekből, vagy aszcitesz folyadékokból tisztítjuk „A”-fehérje60 Sepharose CL-4B affinitáskromatográfiával, amint ezt

HU 206 394 Β

Ey és munkatársai leírták (Immunochemistry 75, 429436 (1978).

7.1.5 Antitestek összekapcsolása fúrókagyló hemocianinnal

MG-21 antitestet összekapcsolunk fúrókagyló hemocianinnal (Keyhole limpet hemocyanin, KLH) kémiai keresztkötéssel glutáraldehid jelenlétében Bona és munkatársai módszere szerint [J. Exp. Med. 149, 815— 823 (1979)]. Röviden ismertetve, 1 ml MG-21 mAb oldatot (3,6 mg/ml) összekeverünk 1 ml KLH oldattal (3 mg/ml) 0,1 mól/literes foszfátpufferben (pH 7,5). Az összekapcsolást 1 ml 0,25%-os glutáraldehid oldat (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri) hozzáadásával indítjuk el. A keveréket szobahőmérsékleten rázzuk 1 órán át. A reakciót 250 ml 1 mól/literes glicin hozzáadásával állítjuk le. Az antitest-KLH konjugátumot fagyasztva tároljuk -20 °C hőmérsékleten felhasználás előtt.

7.1.6 MG-21 (Abl)-re fajlagos monoklonális anti-idiotípusos antitestek (Ab2) előállítása

Két nyolchetes BALB/c nőstény egeret immunizálunk intraperitoneálisan (i. p.) 100 pg MG-21-KLH konjugátummal komplett Freund-féle adjuvánsban. Két héttel később ugyanolyan mennyiségű konjugátumot adunk i. p. nem komplett Freund-féle adjuvánsban. További 8 héttel később az egereknek emlékeztető oltást adunk a konjugátummal fiziológiás sóoldattal. Négy nappal az utolsó immunizálás után a lépeket eltávolítjuk és a kinyert sejteket fuzionáljuk NS-1 egér mielóma sejtekkel polietilénglikol felhasználásával. MG-21-re fajlagos anti-idiotípusos antitesteket kiválasztó hibridómákat választunk ki, HAT tápközegben növesztjük, és klónozzuk, rögzített eljárásokat alkalmazva [Yeh Μ. Y. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,2927-2931 (1979)].

7.1.7 mAb (Abl) kötés gátlás mérése

Az antitest kötés enzimmel kapcsolt immun-szorbens vizsgálatát (ELISA) alkalmazzuk az anti-idiotípusos antitesteket kiválasztó hibridómák kezdeti átvizsgálásához. Ebben a vizsgálatban hibridóma tenyészet felülúszókat vizsgálunk az MG-21 („Abl”) kötésének gátlására M-2669 sejtekhez anti-idiotípusos antitestek („Ab2”) jelenlétének bizonyítékaként. Polivinilklorid lemezekbe elhelyezett (10⁵ sejt/üreg) és 0,5% glutáraldehiddel rögzített M-2669 melanóma sejteket alkalmazunk célpontként. 0,01 pl MG-21 mAb-1 (5 pg/ml) összekeverünk azonos térfogatú hibridóma felülúszóval, Ínkubáljuk 4 °C hőmérsékleten 2-4 órán át, majd hozzáadjuk a célsejtekhez. További 1 órás, 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után a lemezeket háromszor mossuk 0,05% Tween 20-szal (PBS Tween puffer). A sejteket ezután 100 pl kecske anti-egér IgG antitest-peroxidáz konjugátummal (Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana) ínkubáljuk, amely 1/10000 arányban hígítva van PBS-Tween pufferral, az inkubálást 37 °C hőmérsékleten 30 percig végezve, és ismét mossuk. 0,01 pl o-feniléndiamint (OPD), amely 0,015% H₂O₂-t tartalmaz citrát-foszfátban, pH 5, eloszlatunk minden egyes üregben, mint a peroxidáz szubsztrátumát. Mintegy 3-5 perccel később

100 pl 1,3 n H₂SO₄-et adunk hozzá, hogy az enzimszubsztrátum reakciót leállítsuk. Az abszorbanciát két hullámhossznál, 492 nm/630 nm-nél mérjük minden egyes üregnél GSC mikrolemez leolvasóban (Genetic

System Corp., Seattle, Washington).

Abból a célból, hogy megvizsgáljuk az anti-idiotípusos antitest (Ab2) gátló hatásának dózis-függőségét az MG-21 (Abl)-nek a sejtekhez és GD3 antigénhez való kötésére, 100 pl MG-21 rögzített koncentrációt (5 pg/ml) összekeverünk különböző koncentrációjú megfelelő anti-idiotípusos vagy kontroll antitestekkel, inkubálunk 37 °C hőmérsékleten 1 órán át, majd hozzáadjuk M-2669 sejtekkel (10⁵ üreg) vagy tisztított GD3 antigénnel (200 ng/50 pl/üreg) előre befedett üreghez. A további eljárás azonos azzal, amelyet fentebb leírtunk.

7.1.8 Immunglobulin izotípus meghatározása Egér immunglobulin speciális osztálya elleni kecske antiszérumokat alkalmazunk (Southern Biotechnology

Assoc., Birmingham, Alabama). Minden egyes ilyen szérumból 50 pl-t hígítunk PBS-ben, (1 pl/ml), 96 üreges lemezekre helyezzük (Dynatech, Alexandria, Virginia), és ínkubáljuk egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten. A lemezeket egyszer mossuk PBS-Tween pufferral, majd inku25 báljuk egy órán át szobahőmérsékleten 100pl/üreg RPMI tápközeggel, amely 15% borjúembrió szérumot (FCS) tartalmaz. Mosás után 51 pl kialakult hibridóma tenyészközeget adunk hozzá, ezt követi a lemezek inkubálása 1 órán át szobahőmérsékleten, majd egy mosás PBS30 Tween pufferral. Ezt követően 51 pl, 1/10000 arányban PBS-Tween pufferban hígított kecske anti-egér IgG antitest konjugátumot adunk minden egyes üreghez. A lemezeket 30 percig ínkubáljuk 37 °C hőmérsékleten és mossuk ötször PBS-Tween pufferban, amely után 100pl OPD szubsztrátumot adunk minden egyes üreghez. Öt perccel később a reakciót 100 pl 1,3 n H₂SO₄ hozzáadásával leállítjuk, és az abszorbanciát GSC mikrolemez leolvasóban mérjük.

7.1.9 Anti-idiotípusos antitest (Ab2) kötési vizs40 gálát

Egy kötési vizsgálatot alkalmazunk, hogy meghatározzuk: vajon az Ab2-nek az a képessége, hogy gátolja az MG-21 (Abl) kötését, fajlagos-e. 0,5 pg/100 pl tisztított MG-21-et adunk 96 üreges polivinilklorid lemezek (Costar, Cambridge, Massachussets) minden egyes üregének befedéséhez, amely után 200 pl/üreg RPMI 1640 tápközeget, amely 15% FCS-t is tartalmaz, adunk „blokkoló”-ként, hogy megakadályozzuk az antitest kötését a műanyaghoz. Mosás után 100 1 tisztított Ab2-t vagy

Pl. 17 kontroll immunglobulint adunk hozzá különböző koncentrációkban. A lemezeket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 30 percig, majd háromszor mossuk PBS-Tween pufferral. 0,01 pl, peroxidázzal konjugált nyúl anti-egér IgG-t, amely azonos izotípusú, mint az Ab2, adunk ez55 után hozzá PBS-Tween pufferben végzett hígítás után. 30 perces inkubálás után 37 °C hőmérsékleten, amelyet erőteljes mosás követ, 100 pl OPD szubsztrátumot adunk hozzá és 3-5 percig sötétben Ínkubáljuk. Végül 100 pl

1,3 n H₂SO₄-et adunk hozzá. A lemezeket GSC mikrole60 mez leolvasón olvassuk le.

HU 206 394 Β

7.1.10 Antitest radio-jódozása és közvetlen ^12SI-Ab2 kötési vizsgálat

0,01 μ tisztított mAb-t inkubálunk 500 pCi Na¹²⁵Ivel (Amersham Corporation, Arlington Heights, Illinois) és 40 pg klóramin-T-vel 500 pl PBS-ben 4 °C hőmérsékleten három percig. A jelzett mAb-t elkülönítjük a szabad ¹²⁵I-től gélszűréssel Sephadex G-25 oszlopon, a fajlagos aktivitás mintegy 4xl0⁶ cpm/pg. A jelzett mAb-t 15% FCS-et tartalmazó PBS-ben hígítjuk felhasználás előtt.

Közvetlen ¹²⁵I-Ab2 kötési vizsgálathoz különböző tisztított mAb-k 100 pl-eit (50 pg/ml) 15 mmól/literes NaHCO₃-ban (pH 9) 96 üreges lemezre (Dynatech, Alexandria, Virginia), helyezzük és itt tartjuk 4 °C hőmérsékleten egy éjszakán át. Mosás után az üregeket blokkoljuk egy éjszakán át 4 ®C hőmérsékleten inkubálva 200 pl, 15% FCS-et tartalmazó RPMI tápközeggel. A lemezeket háromszor mossuk PBS-Tween pufferben, és 2,5x1ο⁵ cpm jelzett Ab2-t adunk 100 pl 30%-os FCS-ben minden üreghez, és szobahőmérsékleten inkubáljuk 1 órán át. Alapos mosás után a kötött radioaktivitást oldjuk 100 pl 2 mól/l-es NaOH-ban, átvisszük kémcsövekbe és Gamma-számlálón (Beckman, Irvine, Kalifornia) számláljuk.

7.1.11 Antitest-FITC konjugálás

Fluoreszcein izotiocianátot (FITC) konjugálunk

MG-21 mAb-hez, amint ezt Goding és munkatársai leírták [Goding J. W.: J. Immunoi. Methods 13, 215226 (1976)]. Röviden ismertetve, 2 mg tisztított MG-21-et dializálunk egy éjszakán át 0,2 mól/1 karbonát/bikarbonát pufferben, pH 9,5. Dimetil-szulfoxidban feloldott FITC-et (1 mg/ml) (Molecular Probes Inc, Junction City, Oregon) adunk hozzá 40 pg FITC/mg antitest arányban. A keveréket 37 °C hőmérsékleten 45 percen át inkubáljuk, amely után a konjugált mAb-t elkülönítjük a szabad FITC-től G-25 Sephadex oszlopon való átengedéssel, ahol az oszlop 0,1% NaN₃-at tartalmazó PBS-sel van kiegyensúlyozva. A fluoreszcein/antitest arány mintegy

3,5-4,0. A konjugált mAb-t -20 °C hőmérsékleten tároljuk 1% szarvasmarha szérum albumint tartalmazó PBS-ben.

7.1.12 Fluoreszcenciás aktivált sejt-osztályozó elemzés

Fluoreszcenciás aktivált sejt-osztályozó berendezést (FACS) alkalmazó kötés gátlás elemzéshez 100 pl FITC-konjugált MG-21-et inkubálunk 30 percen át 37 °C hőmérsékleten tisztított Ab2 vagy kontroll antitestek különböző koncentrációinak 100 pl-eivel 10%-os normál egér szérumban. Az antitest-keverékeket azután lxlO⁶, paraformaldehiddel rögzített, 100 pl PBS-ben levő M-2669 sejteket tartalmazó kémcsövekhez adjuk. Az inkubálás 30 perce után a sejteket kétszer mossuk PBS-sel, majd elemezzük Coulter Epics C fluoreszcenciás aktivált sejtosztályozóval (Coulter Corporation, Hialeah, Florida). Az adatokat lineáris fluoreszcenciás ekvivalensben (LFE) fejezzük ki, amely relatív fluoreszcenciás intenzitást képvisel.

7.1.13 Komplement-függő citotoxicitási vizsgálat

Abból a célból, hogy megvizsgáljuk, vajon az MG21-re fajlagos Ab2 gátolhatja-e MG-21 mAb komple5 ment-függő citotocicitását (CDC), 4 órás ⁵¹Cr-kibocsátási vizsgálatot [Hellstrom I. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,1499-1502 (1985)] végzünk; célsejtként valamely, MG-21-gyei lizálható sejtet alkalmazunk. Röviden ismertetve, 10⁶ ilyen sejtet jel10 zünk 100 pCi ⁵¹Cr-rel 2 órát át, 37 °C hőmérsékleten. A jelzés után a sejteket háromszor mossuk, újra szuszpendáljuk 15% FCS-et tartalmazó RPMI-1640 tápközegben, és 20000 jelzett sejtet 45 pl RPMI-1640 tápközegben szuszpendálunk és Microtiter V-fenekű le15 mezek (Dynatech Laboratories, Alexandria, Virginia) egyes üregeibe oltjuk. Tisztított MG-21 különböző koncentrációit kombináljuk tisztított Ab2 (vagy kontroll mAb) különböző koncentrációival, hogy megvizsgáljuk a CDC gátlását. Ezeket 90 pl/üreg mennyiség20 ben adjuk be, ezt követi 65 pl hígítatlan, melegítetlen humán szérum üregenként. 4 órás, 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után a lemezeken 400xg-nél centrifugáljuk, a felülúszók 100 pl-ét az egyes üregekből eltávolítjuk, és a radioaktivitás szintjét gamma-számlá25 lóval (Beckman, Irvine, Kalifornia) meghatározzuk. A spontán kibocsátást cpm-ben meghatározzuk, mint azoknak a célsejteknek a kibocsátását a tápközegbe, amelyek előzőleg nem voltak kitéve antitestnek vagy komplementnek, és a teljes kibocsátást cpm-ben úgy becsüljük meg, mint az ozmotikusán lizált célsejtekből történő kibocsátást. A százalékos citotoxicitást az alábbi képlettel számoljuk ki:

Kísérleti _ Spontán kibocsátás kibocsátás

Százalékos citotoxicitás =Teljes _ Spontán kibocsátás kibocsátás

7.1.14 Antitest-függő celluláris citotoxicitási vizsgálat

Abból a célból, hogy megvizsgáljuk, vajon az Ab2 gátolhatja-e az MG-21 mAb antitest-függő celluláris toxicitását (ADCC), egy 4 órás kibocsátási vizsgálatot alkalmazunk.

Egészséges emberi egyénekből PBL-t alkalmazunk effektor sejtekként. Ezeket Ficoll-Hypaque-n különítjük el és elővizsgáljuk alacsony természetes ölő (NK) sejt aktivitásra. Csak kis NK aktivitású limfocitákat (kisebb mint 10% ⁵¹Cr-kibocsátás a négy óra folyamán) alkalmazunk. A célsejtek jelzése után ezeket Microtiter mikrotitráló lemezekre visszük (2xl0⁴ sejt/501), akárcsak a CDC vizsgálatban. Tisztított MG-21 50 plét és tisztított Ab2 (vagy kontroll) mAb 50 pl-ét adjuk hozzá különböző koncentrációkban, ezt követi 2X10⁶limfocita hozzáadása üregenként 50 pl tápközegben; a limfociták aránya a célsejtekhez 100:1. A keverékeket 4 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten 6% CO₂-t tartalmazó levegő atmoszférában. Ezt követően a leme60 zeket centrifugáljuk, és a felülúszók 100 pl-ét az egyes

HU 206 394 Β üregekből átvisszük radioaktivitás méréshez. A százalékos citotoxicitást ugyanúgy számoljuk ki, mint a CDC vizsgálatnál.

Vizsgáló mintaként monoklonális anti-idiotípusós antitestet (Ab2) alkalmazó kompetíciós vizsgálatot fejlesztettünk ki MG-21 antitestek kimutatására MG-21 mAb-vel kezelt betegek szérumában. Röviden ismertetve, 100 μΐ Ab2-t (5 μg/ml) 15 mmól/1 NaHCO₃ pufferban, pH 9, hozzáadunk Falcon elő-kötő vizsgáló lemezek (Becton Dickonson, Oxnard, Kalifornia) minden egyes üregéhez, szobahőmérsékleten inkubáljuk 1 órán át, ezt követően PBS-Tween pufferral mossuk. 75 μΐ MG-21 mAb-t (1 pg/ml) elő-inkubálunk 45 percen át egy betegtől származó szérum vagy összegyűjtött normál humán szérum egyenlő térfogatával; a szérumot 1:2,5; 1:5; és 1:10 arányban hígítjuk PBS-ben. Ezt követően a keverék 100 μΐ-ét hozzáadjuk az Ab2vel előkezelt lemezekhez. További 30 perces, szobahőmérsékleten végzett inkubálás után a lemezeket kétszer mossuk PBS-Tween pufferral. 0,01 μΐ nyúl anti-egér IgG3 antitest-peroxidáz konjugátumot (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, Kalifornia), amelyet 1; 1000 arányban hígítottunk PBS-Tween pufferben, adunk hozzá, és inkubáljuk szobahőmérsékleten. Három mosás után PBS-Tween pufferban az üregeket megtöltjük 100 μΐ OPD szubsztrátummal, amely 0,015% H₂O₂-t tartalmaz citrát-foszfátban (pH 5,0). Öt perccel később 100 μΐ 1,3 n H₂SO₄-et adunk hozzá, és a lemezeket leolvassuk GSC mikrolemez leolvasóval. Az MG-21 kötésének százalékos gátlását a 2C1 mAbhez a következő képlettel számítjuk ki:

otikai sűrűség a beteg szérumának jelenlétében

Százalékos gátlás =1--xlOO optikai sűrűség normál humán szérum jelenlétében

Ebben a vizsgálatban nyolc, kifejlett melanómával rendelkező beteg közül háromból vett szérum mintát vizsgálunk, amely betegek MG-21 mAb I. fázisú kísérletében vesznek részt. Röviden ismertetve, MG-21et 5%-os humán szérum albuminban beviszünk ezekbe a betegekbe 4-6 órás időtartamon át naponta infúzióval, amelyet 7 napon át naponta ismételünk. A szérum mintákat a kezelés előtt vesszük le, valamint különböző időpontonként a kezelés után, és -80 °C hőmérsékleten tároljuk elemzésig.

7.2 Eredmények

7.2.1 Hibridómák kiválasztása

MG-21-gyel immunizált egerekből kinyert lépsejteket fuzionálunk NS-1 sejtekkel, hogy olyan hibridómákat alakítsunk ki, amelyek mAb-t képesek termelni az MG-21-en levő idiotípusos determinánsokra; ez utóbbi mAb-t nevezzük Ab2-nek. A fúzió után két héttel a hibridóma felülúszókat megvizsgáljuk olyan antitestekre, amelyek MG-21 kötését gátolják M-2669 sejtekhez. Az egyik hibridómát, a 2Cl-et, amelynek van ilyen aktivitása, klónozzuk és szaporítjuk. Amint a

7. ábrából látható, a 2C1 hibridóma felülúszója erőteljesen gátolja az MG-21 kötődését M-2669 sejtekhez, de maga nem kötődik az M-2669 sejtekhez. Az NS-1 melanómából származó felülúszót használjuk kontrollként; ez nem gátolja az MG-21 kötődését.

A 2C1 hibridóma aszcitesz tumorként nő, amikor intraperitoneálísan inokuláljuk pristan-nal beindított BALB/c egerekbe. A 2C1 mAb-ről úgy találjuk, hogy ez IgG2a típusú, a vizsgálatot kecske anti-egér lg fajlagos osztályú antiszérumokat alkalmazó szilárd fázisú enzim-immunassay vei végezve.

Amint a 8. ábrából látható, az mAb erős kötődést mutat MG-21-hez, amikor ELISA-val vizsgáljuk

0,08 pg/ml és 1 pg/ml közötti koncentrációknál, de még jelentős kötés figyelhető meg 6,4 ng/ml-nél is. Nem figyelhető meg kötés Pl. 17-tel, amely IgG2a melanóma fehérje (8. ábra).

7.2.2 Az mAb 2C1 (Ab2) fajlagos MG-21-re

Abból a célból, hogy meghatározzuk a 2C1 fajlagosságának mértékét MG-21-re, kötési vizsgálatot hajtunk végre, ¹²⁵I-vel jelzett 2Cl-et alkalmazva. Hat egér mAb-t, amelyeket különböző humán tumorok ellen alakítottunk ki, alkalmazunk kontrollként. Amint a 9.

ábrából látható, a 2C1 mAb erősen kötődik az MG-21hez, de nem kötődik a hat kontroll mAb egyikéhez sem, amelyek közül kettő (a 2A-14 és 96.5) olyan melanómával társult antigénekre fajlagos, amelyek eltérőek az MG-21 által felismert epitóptól. Ebből a két mAb-ből a 2A-14 reagál a GD3 antigén epitópjával, amely eltérő az MG-21 által felismert antigéntől.

7.2.3 Az mAb 2C1 gátolja az MG-21 (Abl) kötését M-2669 sejtekhez és GD3 antigénhez dózis-függő módon

Kötési vizsgálatot alkalmazunk abból a célból, hogy betitráljuk: mennyi 2C1 mAb szükséges Ab2ként, hogy gátolja az MG-21 (Abl) kötését M-2669 sejtekhez. Amint a IX. táblázatból látható, a 2C1 mAb teljesen gátolja az MG-21 kötését M-2669 sej40 tekhez, amikor azonos vagy nagyobb koncentrációban van jelen, mint az MG-21; a két kontroll immunglobulin, a 26.8 mAb és Pl.17 nem ad szignifikáns gátlást.

IX. táblázat

2C1 mAb dózis-függő gátló hatása MG-21 mAb kötésére M-2669 sejtekhez

1. Antitest koncentráció	2. Antitest koncentráció	Abszorbancia 492/630 mm-nél¹
MG-21 (2,5pg/ml)	Semmi	0,324+0,015²
MG-21 (2,5pg/ml)	2C1 mAb (10 pg/ml)	0,071±0,029*
MG-21 (2,5pg/ml)	2C1 mAb (5 pg/ml)	0,043±0,026*
MG-21 (2,5pg/ml)	2C1 mAb (2,5 pg/ml)	0,053±0,002*

HU 206 394 Β

1. Antitest koncentráció	2. Antitest koncentráció	Abszorbancia 492/630 mm-nél¹
MG-21 (2,5pg/ml)	2C1 mAb (1,25 pg/ml)	0,129+0,019**
MG-21 (2,5pg/ml)	2C1 mAb (0,625 pg/ml)	0,156±0,023**
MG-21 (2,5pg/ml)	26.8 mAb (10 pg/ml)	0,305±0,007
MG-21 (2,5pg/ml)	26.8 mAb (5pg/ml)	0,329+0,035
MG-21 (2,5pg/ml)	26.8 mAb (2,5 pg/ml)	0,315±0,024
MG-21 (2,5pg/ml)	26.8 mAb (1,25 pg/ml)	0,337±0,035
MG-21 (2,5pg/ml)	26.8 mAb (0,625 pg/ml)	0,330+0,036
MG-21 (2,5pg/ml)	Pl.17 (10 pg/ml)	0,322±0,049
MG-21 (2,5pg/ml)	Pl. 17 (5 pg/ml)	0,368±0,019
MG-21 (2,5pg/ml)	Pl. 17 (2,5 pg/ml)	0,331+0,019
MG-21 (2,5pg/ml)	Pl.17 (1,25 pg/ml)	0,318±0,035
MG-21 (2,5pg/ml)	Pl.17 (0,625 pg/ml)	0,318±0,031

¹ Az adatok átlagként vannak megadva ±SE (standard hiba) ² Kontroll

A különbségek statisztikusan szignifikánsak az Ab2 nélküli kontrolihoz viszonyítva, *P kisebb, mint 0,01 szinten, **P kisebb, mint 0,025 szinten.

Egy párhuzamos tanulmányban tisztított GD3-at, amely az MG-21 által felismert antigén, alkalmazunk M-2669 helyett. A2C1 mAb gátolja az MG-21 kötését a tisztított GD3 gangliozidhoz dózis-függő módon (X. táblázat).

X. táblázat

2C1 mAb dózis-függő gátló hatása az MG-21 mAb kötésére GD3 gangliozid antigénhez

1. Antitest koncentráció	2. Antitest koncentráció	Abszorbancia 490/630 nm-nél¹
MG-21 (2,5pg/ml)	Semmi	0,486 ±0,092²
MG-21 (2,5pg/ml)	2C1 mAb (25 pg/ml)	0,085 ±0,006*
MG-21 (2,5pg/ml)	2C1 mAb (12,5 pg/ml)	0,073 +0,010*
MG-21 (2,5pg/ml)	2C1 mAb (6,25 pg/ml)	0,075 ±0,008*
MG-21 (2,5pg/ml)	2C1 mAb (3,125 pg/ml)	0,379 ±0,009
MG-21 (2,5pg/ml)	2C1 mAb (1,563 pg/ml)	0,502 ±0,075

1. Antitest koncentráció	2. Antitest koncentráció	Abszorbancia 490/630 nm-nél¹
MG-21 (2,5pg/ml)	2C1 mAb (0,782 pg/ml)	0,482 +0,033
MG-21 (2,5pg/ml)	2C1 mAb (0,391 pg/ml)	0,533 ±0,078

¹ Az adatokat átlagként adjuk meg ±SE (standard hiba) ² Kontroll

A különbségek statisztikusan szignifikánsak az Ab2 nélküli kontrolihoz viszonyítva, ahol *P kevesebb, mint 0,01.

A 2C1 mAb gátló hatását az MG-21 kötésére M2669 sejtekhez FACS elemzéssel igazoljuk, FITC-konjugált MG-21-et alkalmazva. 40 pg/ml FITC-konjugált MG-21-gyel indulva, amely mintegy a telítési koncentrációnak felel meg, fölös mennyiségű 2C1 mAb-t vagy kontroll antitesteket adunk M-2669 sejtekhez. A 10. ábra azt mutatja, hogy a 2C1 teljes mértékben gátolja a FITC-konjugált MG-21 kötését a tumorsejtekhez, míg a kontroll antitesteknek nincs hatása.

7.2.4 A 2C1 antitest gátolja az MG-21 CDC és ADCC aktivitását M-2669 sejtek ellen

Korábbi kísérletek azt mutatják, hogy az MG-21 erős CDC-t és ADCC-t ad GD3-pozitív melanóma sejtekkel [Hellstrom I. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1499-1502 (1985)]. Mi itt azt vizsgáljuk, vajon a 2C 1-nek van-e bármiféle hatása ezekre az aktivitásokra. Amint a XI. áblázatban bemutatjuk, az MG-21 CDC-jét a 2C1 mAb hozzáadása az Művinél nagyobb koncentrációban teljesen megszünteti, de a két kontroll antitest, a 26.8 mAb vagy a Pl. 17 nem szünteti meg.

XI. táblázat

MG-21 mAb CDC-jének gátlása 2C1 mAb-vel M-2669 sejtek ellen

1. antitest Végső koncentráció	2. antitest Végső koncentráció	Citotoxicitás¹ %
MG-21 (5pg/ml)	Semmi	100% (kontroll)
MG-21 (5pg/ml)	2C1 mAb (10 pg/ml)	2*
MG-21 (5pg/ml)	2C1 mAb (1 pg/ml)	84
MG-21 (5pg/ml)	2C1 mAb (0,1 pg/ml)	100
MG-21 (5pg/ml)	26.8 mAb (10 pg/ml)	100
MG-21 (5pg/ml)	26.8 mAb (1 Pg/ml)	100
MG-21 (5pg/ml)	Pl.17 (10 pg/ml)	100
MG-21 (5pg/ml)	Pl.17 (1 pg/ml)	100
MG-21 (1 pg/ml)	Semmi	64 (kontroll)

HU 206 394 Β •y

1. antitest Végsó koncentráció	2. antitest Végsó koncentráció	Citotoxicitás¹ %
MG-21 (lpg/ml)	2C1 mAb (10 pg/ml)	1*
MG-21 (lpg/ml)	2C1 mAb (1 gg/ml)	0*
MG-21 (lpg/ml)	20 mAb (0,1 pg/ml)	56
MG-21 (lpg/ml)	26.8 mAb (10 pg/ml)	69
MG-21 (lpg/ml)	26.8 mAb (1 gg/ml)	60
MG-21 (lpg/ml)	P1.17 (10 pg/ml)	67
MG-21 (lpg/ml)	Pl. 17(1 pg/ml)	69

¹ A citotoxicitást 4 órás ^SICr-kibocsátási vizsgálattal határozzuk meg, komplement-forrásként normál humán szérumot alkalmazva. Humán szérummal egyedül citotoxicitás nem látható. Antitestek egyedül nem adnak semmiféle citotoxicitást. A szignifikancia szintjét Student-teszttel határozzuk meg, és *-gal jelöljük, ahol P kisebb, mint 0,01.

A 2C1 antitest teljes mértékben gátolja az MG-21 ADCC antivitását M-2669 sejtek ellen, amikor koncentrációja nagyobb, mint az MG-21-é, ugyanakkor nem látható szignifikáns gátlás a két kontroll antitesttel (XII. táblázat).

XII. táblázat

MG-21 mAb ADCC-jének gátlása M-2669 sejtek ellen 2C1 mAb-vel

1. antitest Végső koncentráció	2. antitest Végső koncentráció	Citotoxicitás¹ %
MG-21 (5pg/ml)	Semmi	40 (kontroll)
MG-21 (5pg/ml)	20 mAb (10 pg/ml)	4*
MG-21 (5pg/ml)	20 mAb (1 pg/ml)	16*
MG-21 (5pg/ml)	20 mAb (0,1 pg/ml)	33
MG-21 (5pg/ml)	26.8 mAb (10 pg/ml)	44
MG-21 (5pg/ml)	26.2 mAb (1 pg/ml)	40
MG-21 (5pg/ml)	Pl.17 (10 pg/ml)	34
MG-21 (5pg/ml)	Pl.17 (1 pg/ml)	39
MG-21 (lpg/ml)	Semmi	32 (kontroll)
MG-21 (lpg/ml)	20 mAb (10 pg/ml)	7*
MG-21 (lpg/ml)	20 mAb (0,1 pg/ml)	3*
MG-21 (lpg/ml)	20 mAb (0, lpg/ml	16*

1. antitest Végsó koncentráció	2. antitest Végső koncentráció	Citotoxicitás¹ %
MG-21 (lpg/ml)	26.8 mAb (10 pg/ml)	26
MG-21 (lpg/ml)	26.8 mAb (1 pg/ml)	23
MG-21 (lpg/ml)	Pl. 17 (10 pg/ml)	28
MG-21 (lpg/ml)	Pl.17 (1 pg/ml)	23

¹ A citotoxicitást 4 órás ⁵¹Cr-kibocsátási vizsgálattal határozzuk meg, effektorként normál humán perifériás vér limfocitákat alkalmazva. Az effektor sejtek aránya a célsejtekhez 100:1. Az antitesg tek egyedül nem adnak citotoxicitást, és a limfociták egyedül 6,9% citotoxicitást adnak. A szignifikáns különbségeket az Ab2 nélküli kontrolihoz viszonyítva Student-teszttel számoljuk ki, *: P kisebb, mint 0,01.

1.2.5 Anti-MG-21 antitestek kimutatása betegek szérumaiban, vizsgáló mintaként 2C1 mAb-t alkalmazva

Mivel a 2C1 mAb fajlagos MG-21-re, ezt reagens25 ként lehet alkalmazni humán anti-MG-21 antitestek kimutatására MG-21-gyei kezelt betegek szérumában. Kompetíciós vizsgálatot fejlesztünk ki (lásd a korábbi 7.1.15 fejezetet), amellyel megvizsgáljuk, vajon a szérumok az MG-21-gyei injektált 3 beteg bármelyikéből gátolják-e az MG-21 kötődését 2C1 mAb-hez. Amint a XIII. táblázatból kimutatjuk, mindhárom betegből a beadástól számított 17., 18., illetve 21. napon (vagy később) kapott szérumok erősen gátolják az MG-21 kötődését 20 mAb-hez, 2025 83% között. Az előkezelt szérumok kevesebb mint 13% gátlást adnak az összegyűjtött normál humán szérummal összehasonlítva.

XIII. táblázat

MG-21 mAb-nek 20 mAb-hez való kötődésének gátlása MG-21-et kapott betegek szérumával

A beteg sorszáma	Az MG-21 dózisa/nap 7 napon át	Napok az mAb kezelés rajtjától	A kötés %-os gátlása
1:2,5	1:5,	1:10
1	5 mg/M²/nap	0	0	0	0
14	58	53	33
18	60	58	43
43	65	62	47
28	83	87	85
2	5 mg/M²/nap	0	10	12	0
21	55	46	31
28	53	32	25
49	62	46	20
61	59	32	27

HU 206 394 Β

A beteg sorszáma	AzMG-21dózisa/nap 7 napon át	Napok az mAb kezelés rajtjától	A kötés %-os gátlása
1:25”	1:5,	1:10
3	50 mg/M²/nap	0	6	13	2
18	28	21	20
28	30	30	26
45	49	31	15
66	77	60	45
127	73	50	43

* A betegek MG-21 4-6 órás infúzióját kapják naponta 7 napon át a jelzett adagokban. A szérum-mintákat különböző időkben gyűjtjük a kezelés rajtja után.

A szérum-mintákat 1:25, 1:5 és 1:10 arányban hígítjuk PBS-ben.

A 2C1 anti-idiotípusos mAb, amelyet itt leírunk, egy humán melanómával társult GD3 gangliozid antigénre fajlagos idiotípust ismer fel. A 2C1 mAb-ről kimutatjuk, hogy kötődik MG-21 mAb-hez még kis koncentrációban is (0,08 gg/ml), de nem kötődik más, azonos vagy eltérő izotípusú mAb-khez. Ez gátolja dózis-függő módon az MG-21 kötődését a GD3 gangliozid antigénhez, valamint GD3-pozitív M-2669 melanóma sejtekhez. Ezen kívül a 2C1 mAb teljesen megszünteti az MG-21 mAb CDC és ADCC aktivitásait, mindaddig, amíg koncentrációja nagyobb, mint az MG-21 koncentrációja.

Vizsgáló mintaként 2C1 mAb-t alkalmazva vizsgálatot fejlesztünk ki humán anti-MG-21 antitestekre MG-21-gyel kezelt betegek szérumában. Analóg vizsgálatokat lehet kifejleszteni tumorellenes antitestek más típusaira is. Mivel MG-21-hez kötődő humán antitestek rövid ideig vannak jelen (14-21 nap) a betegek MG-21-gyei végzett kezelése után, hacsak az ilyen antitestek nem nagyon hatékonyak a tumor visszaszorításához vezető immunválasz indukálásában, az ilyen antitest kifejlődést minimálisra csökkentő eljárásokat akkor lehet felhasználásra elképzelni, amikor a betegek tumorellenes antitestek beadásával végzett ismételt kezelése kívánatos.

8. p97 melanóma antigénre vonatkozó monoklonális anti-idiotípusos antitestek

Humán melanóma p97 antigénjére vonatkozó monoklonális anti-idiotípusos antitesteket (Ab2) készítünk. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy BALB/c egereket immunizálunk 96.5-tel, amely a p97^a epitópra fajlagos monoklonális antitest, hibridizáljuk az egér lépsejteket NS-1 melanóma sejtekkel, és hibridómákat választunk ki, amelyek a 96.5 mAb-ből készített Fab fragmentumokhoz (Fab 96.5) kötődnek. Az Ab2-t

96.5 mAb-hez való kötődésre és a p97 antigénen levő más epitópokat meghatározó mAb-hez való kötődésre vizsgáljuk, valamint vizsgáljuk arra a képességükre, hogy gátolják a kötést 96.5 mAb és p97 között. Három monoklonális Ab2-t azonosítunk, amelyek teljességgel gátolják a kötést p97 és 96.5 mAb között.

Amikor vagy BALB/c, vagy C3H/HeN egerekbe injektáljuk, kettő közülük olyan Ab3-at indukál, amely azonos idiotípust fejez ki, mint a 96.5 mAb, és amely fajlagos p97-re. Ez a két Ab2 tehát úgy viselkedik, mint a p97 „belső képmás”-a.

8.1 Anyagok és módszerek

8.1.1 Állatok

Mintegy 6-8 hetes nőstény BALB/c és C3H/HeN egereket alkalmazunk ennek a tanulmánynak a során.

8.1.2 Humán melanóma sejtek

SK MEL-28 vonalat (ATCC HTB 72) alkalmazunk p97 antigén-pozitív célsejtek forrásaként. Az egyes SK-MEL 28 sejtek felületükön mintegy 400000 p97 molekulát fejeznek ki.

8.1.3 Egér melanóma sejtek

B16(C57BC) egér melanómából származó sejteket, amelyek előzőleg a p97 génnel át lettek fertőzve [Plowman G. D: „Characterization and expression of the melanotransferrin (p97) gene” (Melanotranszferin p97 gén jellemzése és kifejezése), Doktori disszertáció, University of Washington (1986)], alkalmazunk oldható p97 antigén előállítására. Alkalmazunk a K-1735M2 C3H/HeN egér melanóma sejtből származó sejtvonalat (2A) is [Fidler I. J. és Hart I. R.: Cancer Rés. 41,

3266-3267 (1981)], amely a p97 génjével való átfertőzés után, mintegy 10⁶ p97 mlekulát fejez ki sejtenként. A K-1735-M2 sejteket, amelyekből teljesen hiányzik a p97, tekintjük szülő (pár) sejteknek, mivel a 2A vonal ezekből származik. A fenti melanóma sejtek az említett szakcikkek alapján állíthatók elő, vagy az ATCC-től szerezhetők be ATCC CRL 6322, illetve 6323 számon.

8.1.4 Antitestek p97 humán melanómával [Brown J. P. és munkatársai: J. Immunoi. 127, 539-546 (1981)] társult antigén35 hez szolgáló két mAb-t alkalmazunk ebben a tanulmányban. A p97 három epltópját határozzuk meg, ezeket az mAb-ket kompetitív kötés-gátlási vizsgálatokban alkalmazva; ezek az epitópok a p97^a (96.5 és 4.1 mAb-vel), a p97^b (118.1; 133.1; és 133.3 mAb-vel), és a p97^c (8,2 és 133.2 mAb-vel). A 96.5 hibridómát, amely p97^a epitóphoz való mAbt- termel, úgy kapjuk meg, hogy immunizált BALB/c egerekbők kapott lépsejteket fuzionálunk NS-1 mielóma sejtekkel. A 96.5 mAb-ből Fab fragmentumokat készítünk papainos emésztéssel a szakterületen közismert eljárás szerint és ezt 96.5 Fab-nak nevezzük. Az F6 mAb egy IgG2a, amely humán melanóma sejteken lévő proteoglikán antigénre fajlagos. Ezt Fab fragmentumok (amelyeket F6 Fab-nak nevezünk) előállítására alkalmazzuk, ame50 lyeket kontrollként alkalmazunk. Az F6-ot az Oncogennél állították elő és onnan szerezhető be.

Abból a célból, hogy anti-Id-t idézzünk elő, BALB/c egereket injektálunk szubkután 100 g tisztított 96.5 mAb-vel, amelyet előzőleg fúrókagyló hemocianinnal (KLH) konjugáltunk, és ezt követően összekevertünk Freund-féle komplett adjuvánssal (Bacto H37Ra, Difco Labs, Detroit, Michigan). Egy hónappal később ezeket intraperitoneálisan injektáltuk azonos mennyiségű KLH-val konjugált 96.5 mAb-vel, Freund-féle in60 komplett adjuvánsban (Difco). Az egereket ezt követő34

HU 206 394 Β en fiziológiás sóoldatban levő 96.5 mAb-vel injektáljuk két hetes időközönként, egyszer vagy kétszer. Az utolsó injekció után három nappal ezeket az egereket leöljük és lépükből sejtszuszpenziót készítünk, és ezt fuzionáljuk NS-1 egér mielóma sejtekkel, standard technikákat alkalmazva [Kohler g. és Milstein C.: Natúré, 256,495-497 (1975)].

8.1.5 Hibridómák átvizsgálása

Az elsődleges átvizsgálást ELISA-val hajtjuk végre [Kohler G. és Milstein C.: Natúré, 256, 495-497 (1975)]. 96.5 Fab-ot 4 pg/ml koncentrációban foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldatban (PBS) Immunoion lemezekre (Dynatech Laboratories, Chantilly, Virginia) viszünk fel. A következő napon a lemezeket mossuk 0,05% Tween 20-at tartalmazó PBS-sel, és „blokkoljuk” 1 órás inkubálással 0,05% Tweent és 1% borjúembrió szérumot (FCS) tartalmazó PBS-sel. Az egyes, növekvő hibridóma sejtekkel bíró üregekből származó felülúszókat (50 μΐ) adjuk hozzá. 1 órával később egy olyan keveréket adunk hozzá, amely az alábbiakat tartalmazza PBS-ben: kecske anti-egérlgGl (Zymed, San Francisco, Kalifornia), amelyet előzőleg torma-peroxidázzal kapcsoltunk össze, 0,05% Tween 20 és 1% FCS. 1 órás inkubálás után a lemezre vitt 96.5 Fab-hoz való antitest-kötődést megfigyeljük o-fenilén-diamin (OPD) hozzáadásával a gyártó (Zymed) útmutatása szerint. A lemezeket automatikus mikrolemez leolvasóban olvassuk le (Genetic Systems Corporation, Seattle, Washington) 492 nm/630 nm abszorbanciánál. F6 mAb-ből származó Fab fragmentumokat alkalmazunk kontrollként, és csak azokat a hibridómákat őrizzük meg további vizsgálatokhoz, amelyek olyan mAb-t állítanak elő, amelyek 96.5 Fab-hoz kötődnek, de F6 Fab-hoz nem kötődnek. Az alkalmazott átvizsgálás! eljárás csak olyan hibridómákat mutat ki, amelyek IgGl antitesteket készítenek.

Abból a célból, hogy tovább vizsgáljuk a felülúszókat aktivitásra, olyan vizsgálatot alkalmazunk, amelyben a felülúszót kétszeresére hígítjuk, kombináljuk egy rész 96.5 mAb-vel, és olyan Immunoion üregekbe adjuk, amelyekbe előzőleg 96.5 Fab-ot helyeztünk. Kecske anti-egér IgG és OPD hozzáadása után megbecsüljük a hozzáadott 96.5 mAb-nek azt a képességét, hogy a felülúszók kötődését megakadályozza a lemezre vitt Fab-hoz. Ezt a vizsgálatot arra is alkalmazzuk, hogy anti-Id-t vizsgáljunk a p97^a-tól eltérő p97 epitopokat meghatározó mAb-hez való kötődésre.

Azokat a hibridómákat, amelyek 96.5 Fab-hoz kötődő, de F6 Fab-hoz nem kötődő antitesteket képeznek, kétszer klónozzuk korlátozott hígítással, amely után ezeket szaporítjuk és pristannal beindított BALB/c egerekbe injektáljuk aszcitesz termelésre.

8.1.6 Tanulmányok tisztított anti-idiotípusos antitesteken

Ab2-t tisztítunk telített ammónium-szulfáttal végzett kicsapással [Mishell B. és Shiigi S.: a „Select Methods in Cellular Immunology” című kiadványban, kiadó: W. H. Freeman and Co., 278-281. oldal (1979)]. Abból a célból, hogy azonosítsuk azt az anti-Id-t, amely közrehathat a 96.5 mAb kötésében p97-hez, SK MEL-28 melanóma sejteket viszünk lemezre 10⁴ sejt/üreg mennyiségben. Tisztított Ab2-t keverünk össze 96.5 mAb-vel (1 pg/ml). A 96.5 mAb kötésének gátlását a melanóma sejtekhez kecske anti-egér HRP konjugátum hozzáadásával mutatjuk ki a korábbiak szerint; néhány ilyen típusú vizsgálatot hajtunk végre hibridóma felülúszókon is.

Abból a célból, hogy tanulmányozzuk, vajon a tisztított Ab2 képes-e blokkolni a 96.5 Fab antigén-kötőhelyét, Ab2 különböző koncentrációit adjuk ImmunoIon lemezek üregeibe, amelyekbe előzőleg 96.5 Fab-ot helyeztünk. Átfertőzött B16 egér melanóma sejtekből izolált p97 antigént radíojódozunk [Rose T. M. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1261-1265 (1986)], 2.1O⁵ cpm jelzett p97-et adunk hozzá, és az üregenkénti beütések számát meghatározzuk.

8.1.7 Radioaktívon jelzett p97 versengése 96.5 mAb Fab fragmentumaihoz való kötődésért

Tisztított Ab2 különböző koncentrációit konstans mennyiségű ¹²⁵I-jelzett p97 antigénnel keverjük össze, és a keveréket olyan lemezekhez adjuk, amelyeket előzőleg 96.5 Fab-vel borítottunk be. 1 óra múlva a lemezeket mossuk, 2 n NaOH-t adunk hozzá, és az üregek tartalmát gamma-számlálóban számláljuk.

8.1.8 Kutatások Ab3-ra in vivő

6-8 hetes és C3H/HeN nőstény egereket injektálunk intraperitoneálisan (i. p.) 51 pg, KLH-hoz konjugált Ab2-vel, és összekeverjük komplett adjuvánssal. Őt nappal később ezeknek Ab2 emlékeztető injekcióját adjuk inkomplett adjuvánsban, és ezt követően fiziológiás sóoldatban levő Ab2-vel injektáljuk 5 napos intervallumokban. Összesen 4, illetve 6 immunizálás után az egerektől vért veszünk. Ezek tovább is kapnak emlékeztető oltásokat 2 hetes intervallumokban több héten keresztül. Bizonyos esetekben az immunizálási munkamenetet 2 hetes intervallumoknál kezdjük 4-5 emlékeztető oltással.

Az immunizált egerekből kapott szérumoknak a titerjét mérjük Ab2-höz kötődő antitestek jelenlétére, és ezeket Ab3-nak nevezzük. Ezt úgy készítjük el, hogy hígított szérumokat összekeverünk Ab2-vel és a keveréket Immunoion lemezekre visszük, amelyeket előzőleg 96.5 Fab-bal (mint Ab 1-gyel) borítottunk, ez után pedig kecske anti-egér IgG-l-HRP-t és OPD-t adunk hozzá. Az adatokat az Ab2-nek Ab 1-hez való kötése százalékos gátlásaként fejezzük ki. Ezeket úgy számítjuk ki, hogy meghatározzuk az OD (optikai sűrűség) értékét (Ab3+Ab2)-re, elosztjuk ezt az Ab2-re magára vonatkozóOD értékkel, és a hányadost kivonjuk 100ból.

A szérumokat megvizsgáljuk az Ab3 kötésére is a p97 antigénhez. Tisztított p97-et felviszünk ImmunoIon lemezekre 5 pg/ml koncentrációban PBS-ben, ésegy éjszakán át állni hagyjuk. Blokkolás után hígított szérumot adunk hozzá, ezt egér immunglobulinhoz tartozó kecske antiszérum hozzáadása követi, amely immunglobulin reagál IgG-vel, IgM-mel és IgA-val, majd HRP-vel összekapcsoljuk.

Szilárd fázisú gátlási vizsgálatot is alkalmazunk, amelyben az egér szérumokat 2.A egér melanóma sej35 ι

HU 206 394 Β tekkel keveijük össze, amely sejtek p97-et fejeznek ki felületükön, vagy pár egér melanóma sejtekkel keverjük össze, amelyek nem fejeznek ki ilyent. A keveréket először 1 órán át inkubáljuk, majd hozzáadjuk a p97 antigénnel burkolt Immunoion lemezekhez. Akárcsak korábban, a kötést OPD hozzáadásával mutatjuk ki anti-egér-HRP konjugátumok jelenlétében.

8.2 Eredmények

8.2.1 96.5 mAb-η levő idiotípusos determinánsokhoz kötő A62 kialakítása

BALB/c egereket immunizálunk 96.5 mAb-vel, lépsejtjeiket fuzionáljuk, és a hibridóma felülúszókat átvizsgáljuk 96.5 mAb-hez tartozó IgGl antitestekre, amint korábban leírtuk. Mintegy 3000 hibridómát kapunk 8 különböző fúzióból. Ezek közül a hibridómák közül 70-ből származó felülúszóról találjuk úgy, hogy kötődik a 96.5 Fab-hoz és nem kötődik a kontroll F6 Fab-hoz; a hibridómák többségéről tehát, amelyekből ezek származnak, feltételezzük, hogy képez Ab2-t. Ezek közül a hibridómák közül hetet klónozunk, és az mAb-t, amelyet ezek készítenek, tisztítjuk és megvizsgáljuk Fab 96.5-höz való kötésre. Amint all. ábrában bemutatjuk, mind a hét hibridóma által készített mAb kötődik 96.5 Fab-hoz, bár van változás az Ab2-k között a nagy antitest koncentrációnál megfigyelt kötési értékekben. Az mAb-k egyike sem kötődik F6 Fab-hez.

8.2.2 Vizsgálatok Ab2 fajlagosságra a 96.5 mAb antigén-kötőhelyhez

Megvizsgáljuk, vajon a hét Ab2 bármelyike, amelyekre adatokat mutatunk be a 11. ábrán, azonosítja-e a

96.5 mAb antigénkötő helyét. Először megmérjük az mAb-nek azt a képessétét, hogy gátolja a 96.5 mAb kötését az SK MEL-28 sejtek által kifejezett p97 antigénhez; ezt úgy hajtjuk végre, ahogyan a 8.1.6 fejezetben leírtuk. A hét Ab2 közül három, a #3, #5 és #7, erősen gátolja ezt a kötést, míg két Ab2 (#4 és #6) gyenge gátlást ad, és két Ab2 (#1 és #2) nem ad gátlást (12. ábra).

Másodszor tanulmányozzuk a hét Ab2-nek azt a képességét, hogy verseng az oldható p97-tel a 96.5 mAb-hez való kötésért. Az egyes Ab2-k különböző hígításait összekeverjük radio-jódozott p97-tel, és a p97 kötését Fab 96.5-ből szilárd fázisú vizsgálattal meghatározzuk (13. ábra). A #3, #5 és #7 anti-id verseng a radio-jódozott p97-tel, míg a négy másik anti-Id (#1, #2, #4, #6) nem verseng. Az eredmények hasonlók azokhoz, amelyeket a 12. ábrában adunk meg.

Harmadszor azt demonstráljuk, hogy ugyanaz a három Ab2, amely rendelkezik a p97-tel való versengés képességével, nevezetesen a #3, #5 és #7, blokkolni képes a 96.5 Fab antigénkötő helyeit úgy, hogy a radiojódozott p97 kötése a 96.5 Fab-hoz 50-60%-kal csökken. Egy Ab2, a #2, ennek a kötésnek 25%-os gátlását adja, és a további három Ab2 (#1, #4, #6) 0-10%-os gátlást ad.

Az adatok így azt sugallják, hogy három Ab2, a #3, #5 és #7, képes utánozni a p97^a epitópját, „belső képmás. Az a lehetőség azonban még fennáll, hogy a térbeli gátlás felelős a megfigyelt hatásokért. Ennek megfelelően megvizsgáljuk az Ab2-nek azt a képességét, hogy Ab3 választ indukál in vivő, amint ezt a 8.2.4 fejezetben leírjuk.

8.2.3 Az Ab2 kötésének elemzése mAb sorozatához, amely a p97^a-tól eltérő p97 epitópokat határoz meg

Hét, p97-hez tartozó mAb-t választunk ki tanulmányozásra. Az mAb p97-pozitív sejtekhez való kötésének kompetitív gátlását mérő vizsgálat szerint a két mAb három különböző, a p97 antigénen levő epitópot határoz meg [Brown J. P. és munkatársai: J. Immunoi. 127, 530-546 (1981)], nevezetesen a p97^a-t (4.1 mAb és 96.5 mAb), a p97^b-t (118,1 mAb, 133.1 mAb, 133.3 mAb és 8.2 mAb), és a p97^c-t (133.2 mAb). A 133.3 mAb IgG2b, a 4.1 és 8.2 mAb IgGl, és a többi mAb IgG2a, kivéve a 4.1-et és 8.2-t, amelyek IgG21-ek.

A 15. ábrában bemutatott kísérletben az 5 IgG2a mAb-t összekeverjük a vizsgálandó Ab2-vel, és 96.5 Fab-bal burkolt lemezekre visszük, ezt követi kecske anti-egér IgGl-HRP hozzáadása, hogy kimutassuk a megfelelő Ab2 kötődését 96.5 Fab-hoz. Amint a 15. ábrán bemutatjuk, a 133.3 mAb gátolja a vizsgált antitestek közül hat (#1, #3, #4, #5, #6 és #7) kötődését 96.5 Fab-hoz (13. ábra); a gátlás mintegy azonos mértékű, mint amely a 96.5 mAb-vel látható. A # 2, amely más Ab2-höz hasonlóan 96.5 mAb-hez való kötésre lett kiválasztva, kötése nem gátlódik. A 118.1; 133.1; és 133.2 mAb nem gátolja a vizsgált Ab2-k egyikét sem.

Egy másik vizsgálatot alkalmazunk az Ab2 és az IgGl izotípusú különböző anti-p97 mAb-k közti kötés mértékének elemzésére, és bármilyen ilyen kötés hatásának elemzésére a radioaktívan jelzett p97 ezt követő kötésére az anti p97 mAb-vel. A két IgGl anti-p97 mAb-t, a 4.1-et és 8.2-t vizsgáljuk, valamint a 96.5 mAb-t. Mindegyik Ab2-t lemezre visszük, 8.2 mAb,

4.1 mAb vagy 96.5 mAb különböző koncentrációit adjuk hozzá, és mérjük az anti-p97 mAb kötődését radio-jódozott p97-hez (16. ábra). Három Ab2, a #3, #5 és #7 gyakorol hatást a 96.5 mAb kötésére p97-hez (egyezésben a korábbi 8.2.2 fejezetben leírt eredményekkel), míg további négy Ab2, az #1, #2, #4 és #6 nem gyakorol hatást. Az Ab2-k egyike sem kötődik a

8.2 vagy 4.1 mAb-hez. A kísérletet megismételjük, a

96.5 mAb-vel párhuzamosan 133,1 és 133.3 mAb-ket vizsgálva, mivel a 15. ábrában bemutatott adatok azt mutatják, hogy a 133.3 mAb kötődhet Ab2-hez (de a

133.1 nem). A 17. ábra azt mutatja, hogy mind a hét vizsgált Ab2 kötődik mind a 96.5, mind a 133.3 mAbhez. Ezzel ellentétben az Ab2-k egyike sem kötődik

133.1 mAb-hez.

Olyan vizsgálatot hajtunk végre, amely azt demonstrálja, hogy az Ab2-k közül hat (a #2 kivételével) megakadályozza, hogy a 133.3 mAb SK MEL-28 melanóma sejtekhez kötődjék. A hét Ab2 egyike sem kötődik a Pl.17-hez, amely IgG2a mielóma fehérje, sem a kontrollként alkalmazott két mAb-hez, az L6-hoz (ez IgG2a karcinóma-ellenes antitest) vagy az MPG24-hez (ez IgGa antitest melanómával társult proteoglikánra) sem egy egér IgG2b elleni kecske antiszérumhoz (XIV. táblázat).

HU 206 394 Β

XIV. táblázat

A 96.5 mAb gátolja néhány Ab2 kötését 96.5 Fab-hoz*

Ab2 száma	Gátlóanyag (Inhibitor)
PBS	96.5	Pl.17	MPG24	L6	Kecske anti- egér IgG2b
1	0,961	0,125	0,941	0,993	0,876	1,026
2	1,074	0,514	0,942	1,064	0,953	1,049
3	0,655	0,084	0,586	0,618	0,567	0,623
4	0,649	0,066	0,629	0,674	0,611	0,743
5	0,555	0,061	0,521	0,557	0,506	0,541
6	0,447	0,091	0,436	0,443	0,418	0,551
7	0,554	0,074	0,515	0,577	0,504	0,627

* Amint ELISA-val kimutatjuk, amelyben különböző gátló anyagokat 80 gg/ml koncentrációban összekeverünk Ab2-vel (0,4 gg/ml) és hozzáadjuk 96.5 Fab-bal burkolt lemezekhez. HRPkonjugált kecske anti-egér IgGl-et adunk a lemezekhez és inkubáljuk 1 órán át, ezt követi OPD hozzáadása. Az OD-t (optikai sűrűség) 429 nm-nél mérjük.

Összefoglalva, észleleteink azt jelzik, hogy a vizsgált hét Ab2 kötődni képes 133.3 mAb-hez, talán antigén-kötő helyénél, a #2 kivételével, amely nem kötődik 133,3 mAb-hez antigén-kötő helyénél. (A #2 azonban kötődik a 133,3 mAb-hez, nyilvánvalóan más helyen, mint az antigén-kötő helye, lásd a 17. ábrát).

8.2.4 Ab3 válasz Indukciója

A hét Ab2-t arra a képességére vizsgáljuk, hogy Ab3 antitest választ indukál egerekben. A kísérletek első sorozatában szingén (BALB/c) egereket immunizálunk Ab2-vel. Ezeknek a kísérleteknek a többségénél az Ab2 KLH-val van konjugálva.

Ab2-vel végzett immunizálás után az egerek szérumait megvizsgáljuk Ab3 jelenlétére, amelyek azon képességük alapján mutathatók ki, hogy kötődnek Ab2höz. Az egér szérumok számos hígítását összekeverjük a megfelelő Ab2-vel, és 96.5 Fab-bal (mint Abl-gyel) burkolt Immunoion lemezekhez adjuk. Ezután kecske anti-egér IgGl-HRP-t alkalmazunk az Ab2 kötésének kimutatásához a 96.5 Fab-hez (XV. táblázat).

XV. táblázat

Az Ab2 kötés gátlása 96.5 Fab-hez (mint Abl-hez) olyan BALB/c egerekből kapott szérummal, amelyet előzőleg a megfelelő Ab2-vel injektáltunk*

Ab2	%-os gátlás
1. vérvétel	2, vérvétel
1	90	96
100	99
2	96	97
95	98

Ab2	%-os gátlás
1. vérvétel	2. vérvétel
3	85	100
83	98
4	82	96
86	87
5	74	92
75	94
6	0	89
25	50
7	73	91
77	92

* A szérumokat 1:10 arányban hígítjuk. A megfelelő Ab2-ket KLH-hoz konjugáljuk az egerekbe való injekció előtt. Az adatokat 2 egér csoport mindegyikéhez és az egerek két egymást kővető vérvételéhez adjuk meg.

Amint a XV. táblázatból látható, csak az első vérmintavételből származó szérum gátolja az Ab2 kötését

96.5 Fab-hez. A gátló aktivitás mennyisége egy második emlékeztető oltás után növekedik.

Ezután megvizsgáljuk, vajon az immunizált egerekből származó szérumok képesek-e kötődni p97-hez (Abl-hez hasonlóan). Oldható p97 antigént lemezre viszünk át hígított egér szérumokat adunk hozzá (blokkolás után), majd ezt követően kecske anti-egér IgGHRP-t adunk hozzá. A két Ab2 valamelyikével, #3-mal vagy #7-tel immunizált egerekből származó szérumok kötődnek p97-hez, míg az öt másik Ab2 bármelyikével, beleértve a #5-öt is immunizált egerekből nyert szérumok, nem kötődnek p97-hez (18. ábra). Pozitív kontrollként titráljuk vagy a 96.5 mAb, vagy az egér antip97 szérum kötődését p97-hez, és összehasonlítjuk a megfigyelt kötést azzal, amelyet akkor figyelünk meg, amikor vagy Ab2 #3-mal, vagy #5-tel immunizált egerekből kapott szérumot alkalmazunk. Az adatok azt mutatják, hogy az utóbbi szérumok p97-fajlagos Ab3at tartalmaznak mintegy 1-5 gg/ml koncentrációban. A #3 vagy #7 Ab2-nek az a képessége, hogy Abl-szerű Ab3 választ indukál, azt jelzi, hogy ezek az Ab2-k belső képmás antitestek.

Abból a célból, hogy tovább vizsgáljuk az Ab3 fajlagosságát p97-re, Ab2-vel immunizált egerekből származó szérumokat abszorbeálunk lxlO⁶ sejttel vagy a p97-pozitív egér melanoma 2A vonalból, vagy ennek p97-negatív szülő-vonalából (mint kontroliból), mielőtt a szérumot p97-hez adnánk, amellyel előzőleg lemezeket burkoltunk. Az Ab3 kötését p97-hez ezután kecske anti-egér IgG-HRP konjugátumot alkalmazva meghatározzuk. Amint a 19. ábrából látható (A és B keretek), a #3 vagy #7 Ab2-vel immunizált egerekből származó szérumok olyan Ab3-at tartalmaznak, amelyek p97-hez kötődnek, és ez az Ab3 aktivitás 2A

HU 206 394 Β sejtekkel való abszorpcióval eltávolítódik, de a pár sejtekkel végzett abszorpcióval nem. Kis mértékű kötés van p97-hez a #4 vagy #5 Ab2-vel immunizált egerekből származó szérumokkal, és ezt a kötést a 2A sejtekkel végzett abszorpció szintén gátolja (19. ábra, C és D keretek). Sem a normál egér szérum, sem a P1.17-tel immunizált egerekből származó szérum (mint kontroll) nem tartalmaz olyan antitesteket, amelyek kötődnek p97-hez. Miközben a tisztított 96.5 mAb kötését p97-hez a 2A sejtekkel történő abszorpció teljesen megsemmisíti (20. ábra), a p97-tel immunizált egerekből származó szérum antitestek kötését csak részben gátolja, akárcsak a #3 vagy #7 Ab2-vel immunizált egerekből származó szérumok Ab3 aktivitását.

Ab3 válasz mutatható ki C3H/HeN egerekben KLHhoz konjugált Ab2-vel végzett immunizálás után is. Az immunizált C3H/HeN egerekből származó szérum kötődik oldható p97-hez szilárd fázisú ELISA-ban (21. és 22. ábrák). Az egér szérumok abszorpciója a 2A sejtekkel vagy pár sejtekkel, mielőtt ezeket a szérumokat az oldható p97-hez való kötésre megvizsgálnánk, igazolja, hogy a kötés p97-hez történik.

Olyan kísérleteket is végzünk, amelyekben BALB/c és C3H/HeN egereket olyan Ab2-vel immunizálunk, amelyeket előzőleg KLH-hoz konjugáltunk. Ezeknek az egereknek a szérumairól úgy találjuk, hogy olyan antitesteket tartalmaznak, amelyek 96.5 Fab-hoz kötődnek. Abból a célból, hogy meghatározzuk, vajon ezek az antitestek Ab2-k-e, amelyek még megmaradnak a vérkeringésben, vagy vajon valamiféle Ab4 indukálódott, ELISA vizsgálatot végzünk HRP konjugátumokkal, amelyek nem csupán IgG 1-et (az Ab2 izotípusát) azonosítanak, hanem IgG2b-t és IgG3-at is. A kapott eredmények azt sugallják, hogy az egér szérumok Ab4-et tartalmaznak, amely Abl-hez képes kötődni és az IgG2b és IgG3 osztályokhoz tartozik.

8.3. Tárgyalás

Egy sorozat egér mAb-t készítünk 96.5 mAb-η levő idiotípusos determinánsokra; ez az mAb a p97 melanóma egyik epitópját, a p97^a-t határozza meg. Az mAb-k sorozatát elemezzük fajlagosságuk szempontjából, és azon képességük szempontjából, hogy Ab3 választ indukálnak egerekben. Hét Ab2-t tanulmányozunk részletesebben. Ezek közül az Ab2-k közül négyről úgy tűnik, hogy nem azonosítja a 96.5 mAb-nek p97 kötésben érdekelt területét, mivel ezek nem gátolják méltányolható módon a kötést a 96.5 mAb és a p97 között, és ezek kötését 96.5 mAb-hez az oldható p97 nem gátolja. Az Ab2-k közül azonban három, amelyet #3, #5 és #7 jelzéssel láttunk el, megakadályozza a kötődést az oldható p97 antigén és a 96.5 mAb között, és az oldható p97 megakadályozza a kötést a 96.5 Fab és ezek között az Ab2-k között.

A 133.3 hasonlóképpen viselkedik, mint a 96.5 mAb, amikor a hét Ab2-vel való kötési vizsgálatokban vizsgáljuk, míg a 4.1 mAb nem így viselkedik. Ez váratlan, mivel a 133.3 mAb-ről leírták, hogy eltérő epitópot (p97^b) azonosít, mint a 96.5 mAb, míg a 4,1 mAb-ről azt írták le, hogy azonos epitópra (p97^a) fajlagos, mint a 96.5 mAb [Brown J. P. és munkatársai: J.

Immunoi. 127,539-546 (1981)]. Az ellentmondás okai az mAb célsejtekhez való kötődésének kompetitív gátlásához való mérést alkalmazva kapott eredmények és a mi eredményeink között, amelyek az Abl és Ab2 közti kötést mérő vizsgálattal kapunk, ismeretlenek.

Az antigén kötés gátlási adatok egybevágnak azzal a nézettel, hogy Ab2-ink közül három, a #3, #5 és #7 „belső képmás” típusúak. Az adatok azonban nem zárják ki az alternatív magyarázatokat, mint pl. a térbeli gátlást. Ezért megvizsgáljuk, vajon ez a három Ab2 képes-e immunválaszt indukálni egerekben. Mivel a humorális antitest válaszokat általában könnyebben és pontosabban lehet tanulmányozni, mint a sejt-közvetített válaszokat, olyan Ab3-ra kutatunk, amely képes p97-hez kötődni.

Két Ab2, a #3 és #7, Ab2-szerű Ab3 választ indukál mind BALB/c, mind C3H/HeN egerekben, így jelezve, hogy ezek belső képmás antitestek. Egy harmadik Ab2, a #5, amelynek viselkedése hasonló a #3-hoz és #7hez, amikor in vitro vizsgáljuk, nem indukál Abl-szerű Ab3 választ. Az Ab3 kötése p97-hez teljességgel gátlódik 2A sejtekkel végzett abszorpcióval, amely sejtek p97-et fejeznek ki, de a p97-negatív pár vonalból származó sejtekkel ez nem történik meg. Az a tény, hogy választ figyelünk meg az allogén C3H/HeN törzsben, azt jelzi, hogy a választ nem a Th gén szabályozza, hanem sokkal valószínűbben a p97 antigén „belső képmása”-ként működő Ab2 indukál [Lee V. K. és munkatársai: Biochim. Biophys. Acta 865, 127-139 (1986)].

Abból a célból, hogy kizárólag Ab-szerű választ kapjunk in vivő, szükséges az Ab2 konjugálása KLH-hoz. Amikor KLH-t nem alkalmazunk, az immunizált egerek széruma tartalmazza mind az Ab2-nek IgGl izotípusú antitesteit, mind más típusú (IgG2b, IgG3) antitesteket, amelyek lehetnek Ab4-ek. Ha Ab4 alakul ki, egy Ab3 válasz is előfordulhat bizonyos tekintetben.

9. L6 rákellenes antitestre fajlagos anti-idiotípusos antitestek

Az L6 (Abl) rágcsáló monoklonális antitest (mAb) IgG2a típusú, és tumornál társult szénhidrát antigénre fajlagos, amely sok különböző humán karcinómából származó sejt felületén található [Hellstrom I. és munkatársai: Cancer Rés. 3917-3923 (1986)]. A6 elleni anti-idiotípusos mAb-t (Ab2) készítünk. Huszonnégy Ab2-t kapunk, amelyek kötődnek az L6-ból készített Fab fragmentumokhoz, de nem kötődnek a kontroll IgG2a-ból készített Fab-hoz. Ebből a 24 mAb-ből 8 képes kötődni nagy koncentrációnál annak a mAb-nek egyikéhez, amelyek függetlenül képződtek, de azonos fajlagosságuk van, mint az L6-nak. A 24 Ab2 közül 14 képes gátolni az L6 kötődését a sejteken levő antigénhez. Ebből a 14 Ab2-ből 6 nem képes kötődni az L6-ból készített Fab fragmentumokhoz és a már kötve levő L6 antigén-pozitív sejtekhez. Klónozott változó terület gén szegmenseket alkalmazva úgy találjuk, hogy ebből a 6 Ab2-ből kettő speciálisan felismeri az L6 nehéz lánc változó területet, amely társulva van egy nem odaillő könnyű lánccal, míg a további négy egy

HU 206 394 Β kombinatorikus determinánst ismer fel, amely azt igényli, hogy L6 nehéz és könnyű lánc változó területek legyenek összekapcsolva. Azt a hat Ab2-t, amely nem kötődik L6 FAb fragmentumokhoz, sejtekhez rögzítve BALB/c és C3H/HeN egerekbe injektáljuk. Közülük kettő (lehet, hogy több) poliklonális antitesteket (Ab3) indukál, amelyek azonos idiotípust fejeznek ki, mint az L6, ezek az antitestek L6 pozitív tumorsejtekhez vannak kötve és versenyeznek az L6-tal antigénkötő helyéért.

9.1 Anyagok és módszerek

9.1.1 Állatok

6-8 hetes BALB/c és C3H/HeN nőstény egereket szerzünk be az Állat-szolgáltató Részlegtől (Fred Hutchinson Cancer Research Center). Ezeket alkalmazzuk végig a kísérlet során, hacsak másképpen nem jelezzük.

9.1.2 Sejtvonalak

A H-3347 humán vastagbél karcinóma vonal [Hellstrom I. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 7059-7063 (1986)], amelyet az Oncogennél fejlesztettek ki az említett szakcikk eljárása szerint, és onnan szerezhető be, magas szinten fejezi ki az L6 által meghatározott antigént. A CEM humán T-sejtvonal (ATCC CCL 119), amely nem kötődik L6-hoz, szerepel negatív kontrollként.

9.1.3 Tumorellenes antitestek („Abl)

L6 (IgG2a) monoklonális antitestet alkalmazunk tumorellenes mAb-ként (Abl) ebben a tanulmányban. Ennek kifejlesztését és jellemzését másutt írták le [Hellstrom I. és munkatársai: Cancer Rés. 46, 3917-3923 (1986); Hellstrom I. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 7059-7063 (1986)]. F26 mAb-t (IgGl) és 012/28-24-et (IgG2a) készítünk olyan hibridómákkal, amelyek karcinóma szövettel immunizált BALB/c egerekből származó lépsejtek fúziójával készültek; a hibridizálás és szelektálás hasonló ahhoz, mint amely az L6-ot eredményező műveletnél volt. Az utóbbi két mAb verseng az L6-tal a karcinóma sejtekkel való kötésért. A 96.5 mAb-t [Brown J. P. és munkatársai: J. Immunoi. 127, 539546 (1981)] és a Pl—17 mielóma fehérjét (American Type Culture Collection, TIB 10 letéti szám), amelyek mindketten IgG2a típusúak, alkalmazzuk kontrollként. L6-ból és 96.5-ből Fab fragmentumokat készítünk papainos emésztéssel, és ezeket L6 Fab-nak, illetve 96.5 Fab-nak nevezzük.

9.1.4 Anti-idio típusos antitestek (Ab2) kialakítása

Olyan munkamenetet alkalmazunk, amelyet korábban már sikeresen alkalmaztunk egy eltérő tumor antigénre, a p97-re vonatkozó Ab2 kialakítására (lásd a korábbi 8. fejezetet). BALB/c egereket immunizálunk 100 pg L6-tal, amelyet előzőleg fúrókagyló hemocianinhoz (KLH) kapcsoltunk, amint ezt Streicher H. L. és munkatársai leírták [J. Immunoi. 136, 1007-1014 (1986)]. Az első immunizálást szubkután adjuk komplett H37Ra adjuvánsban (Difco, Detroit, Michigan), és egy második dózist adunk 4 héttel később intraperitoneálisan (i. p.) inkomplett Freund-adjuvánsban. 2-4 további immunizálást végzünk i. p. fiziológiás sóoldatban két hetes időközönként.

Az utolsó emlékeztető oltás után két héttel a lépeket eltávolítjuk, és a lépsejteket polietilénglikollal végzett centrifugálással NS-1 mielómasejtekkel fuzionáljuk. 10 nappal később a hibridómákat ELISA-val átvizsgáljuk Fab fragmentumok ellen, amelyeket előzőleg Lóból állítottunk elő (ezeket L6 Fab-nak nevezzük) és amelyekkel 96 üreges Immunoion II lemezeket (Dyna10 tech, Chantilly, Virginia) burkoltunk. Az L6 Fab kötését külön az alábbi három különböző reagens mindegyikével megvizsgáljuk: egy egér IgGl elleni nyúlantiszérum, amelyet előzőleg torma peroxidázhoz (HRP) kapcsoltunk (ezt IgGl-HRP-nek nevezzük); egy

HRP-vel konjugált, egér IgG3 elleni antiszérum (ezt antiegér IgG3-HRP-nek nevezzük); és egy HRP-hez kapcsolt „A” fehérje (,,A”-fehérje-HRP); ezeket a reagenseket a Zymedtől szerezzük be (South San Francisco, Kalifornia). Az L6 Fab-hoz kötődő antitesteket

96.5 Fab-hoz való kötődésre vizsgáljuk, hogy kizárjuk a nem fajlagosan kötőket. Azokat a hibridómákat, amelyekről úgy tűnik, hogy L6 idiotípusra mAb-t állítanak elő, kétszer klónozzuk korlátozott hígítással, ezt követi az összes al-klőn átvizsgálása.

9.1.5 Az Ab2 tisztítása

4-6 hetes hím BALB/c egereket pristannal beindítunk. 10 nappal később ezeket 5xl0⁶ Ab2 termelő hibridómával injektáljuk és aszciteszt gyűjtünk 3-8 héten át. Az IgG2a és IgG2b antitesteket tartalmazó aszci30 teszteket „A” fehérje oszlopon tisztítjuk [Brown J. P. és munkatársai: J. Immunoi. 127, 539-546 (1981)], és az IgGl-et tartalmazó aszciteszt ammónium-szulfátos kicsapással tisztítjuk, amelyet DEAE Sephacel (Pharmacia, Uppsala, Svédország) kromatográfia követ. Tisztí35 tott Ab2-t vizsgálunk át L6 Fab-hoz való kötődésre, valamint az L6-nak H-3347 sejtekhez való kötődésének gátlására (lásd alább).

Hasonló vizsgálatot alkalmazunk, mint amelyet korábban a p97 rendszernél alkalmaztunk (lásd a korábbi 8. fejezetet). Ab2-t tartalmazó felülúszókat, vagy tisztított Ab2-t összekeverünk L6 mAb-vel 0,1-0,4 g L6/ml végső koncentrációban. A keveréket inkubáljuk 96 üre45 ges szövettenyésztő lemezen (Falcon, Becton Dickinson, Oxnard, Kalifornia) 30 percen át szobahőmérsékleten, amely után ezt glutáraldehiddel rögzített H-3347 karcinóma sejtekhez adjuk, amelyeket előzőleg egy 96 üreges lemezhez rögzítettünk. Az L6 kötését a H-3347 sejtekhez ELISA-val mutatjuk ki, egér IgG elleni, HRP-hez kapcsolt kecske antiszérumot vagy HRP-hez kapcsolt „A” fehérjét alkalmazva. Az adatokat úgy adjuk meg, mint az L6-nak a sejtekhez való kötésének százalékos gátlását az Ab2 jelenlétében.

9.1.7 Gátlási vizsgálat az Ab2 és az antigén közt az L6 kötőhelyekért való versengés kimutatására g/ml L6 Fab-ot adunk 5xl0⁵ H-3347 karcinóma sejthez propilén csőben. 30 perces inkubálás után 4 °C hőmérsékleten a sejteket mossuk, hogy eltávolítsunk

HU 206 394 Β minden nem kötött Fab-ot. A tisztított Ab2-t fluoreszcein izotiocianáttal (FTTC) jelezzük. A jelzett Ab2 különböző koncentrációit adjuk a propilén csőhöz, ezt követi az inkubálás 4 °C hőmérsékleten 30 percig, majd a mosás. Az Ab2 kötést fluoreszcein-aktivált sejt osztályozót (FACS, EPIC-C modell) alkalmazva mutatjuk ki, amint már korábban leírták [Hellstrom I. és munkatársai: Cancer Rés. 46, 3917-3923 (1986)]. Ezt a kísérletet végrehajtjuk fikoeritrinnel (PE) jelzett L6tal is a jelzetlen L6 Fab fragmentumok helyett.

9.1.8 L6 nehéz és könnyű lánc változó terület gén szegmensek

DNS-t izolálunk, úgy, ahogyan Blin és Stafford elvben leírták [Nucl. Acids Rés. 3,2303-2308 (1976)] és Ledbetter és munkatársai részletesen ismertették [Mól. Immunoi. 24,1255-1261 (1987). Az eljárás kiindulási anyagait és az izolálást eljárás részleteit az említett szakirodalmi közlemények mutatják be. Ezt vagy EcoRl-gyel, vagy HindlII-mal emésztjük és méret szerint frakcionáljuk szacharóz gradiensen [Maniatis T. és munkatársai: Molecular Cloning. A Laboratories Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)].

A speciális változó (V) területet tartalmazó gradiens frakciókat a szakterületen jól ismert Southern folt elemzéssel azonosítjuk [Southern Ε. M.: J. Mól. Bioi. 98,503-507 (1975)], A kifejezett alléleket annak alapján azonosítjuk, hogy nem termelő L6 al-vonalak Southern folt elemzésében nem mutathatók ki.

A kifejezett L6 nehéz lánc V terület gén szegmenst tartalmazó, EcoRI-gyel emésztett DNS-t az EMBL3 Lambda fág vektorba klónozzuk (Promega Biotech, Madison, Wisconsin) Gigapack „csomagoló” kivonatokkal (Stratagene, La Jolla, Kalofomia), lemezre visszük, és átvizsgáljuk egy olyan Xbal/EcoRI fragmentumot alkalmazva, amely tartalmazza a rágcsáló könnyű lánc fokozót.

Egy 2,3 kb-s HindlII fragmentumot, amely a rágcsáló nehéz lánc fokozót átéri, pSV2-gpt vektorba klónozzuk [Mulligan R. C. és Berg P.: Science, 209, 14221427 (1980)], amely tartalmazza a humán C exont a HG3A fág kiónból származó 10,5 kb-s BamHI fragmentumként [Ellison J. W. és munkatársai: Nucl. Acids Rés. 10, 4071-4079 (1982)]. A fenti kifejezett változó nehéz lánc gén szegmenst átvisszük ebbe a vektorba, mint 10,5 kb-s EcoRI fragmentumot.

Azokat a gradiens frakciókat, amelyek a HindlIImal emésztett, kifejezett L6 könnyű lánccal bíró DNS-t tartalmazzák, Lambda Zap (Strategene) Xbal helyébe klónozzuk, a HindlII túlnyúló végek betöltésével AG dinukleotiddal és az Xbal túlnyúló vég betöltésével CT dinukleotiddal, ily módon téve hozzáférhetővé a túlnyúló végeket a klónozáshoz. Az így létrejött génkönyvtárat a megfelelő gén-szegmens kiválasztása céljából átvizsgáljuk egy 1 kb-s Pstl/HindlII fragmentummal, amely a 9,5 kb-s, az MCPll-ből származó kifejezett K génnel bíró BamHI fragmentumot tartalmazó pBR322 kiónban a JK-t és CK-t szétválasztó intronból ered [részletesebben lásd: Kelley D. E. etc.: Cell 29, 681-689 (1982)]. A kiméra könnyű lánc kifejező konstrukcióhoz egy 1 kb-s, a rágcsáló K fokozót (MPC11-ből) tartalmazó HindlII/Xmnl fragmentumot klónozunk egy, a humán CK exont kódoló 2,7 kb-s EcoRI fragmentumtól „fölfelé” [részletesebben lásd:

Heiter P. A. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 257,1516— 1522 (1982)] pUC-gpt vektorban. A kifejezett 6 VK gén szegmenst átvisszük ebbe a vektorba, az egyedi PstI helybe kapcsolt EcoRI-NotRl fragmentumként.

A kiméra könnyű lánc és nehéz lánc gén konstrukciókat átfertőzzük az Ag 8,653 egér mielóma sejtvonalba (ATCC CRL 1580), BioRAd elektroporátort alkalmazva a gyártó útmutatásai szerint, majd szelekciót végzünk 0,5 pg/ml mikofenol-savon. Hasonló átfertőzéseket hajtunk végre csak a kiméra könnyű lánc gén konstrukciót és az SP2/0 egér mielóma sejtvonalat alkalmazva, vagy a kiméra nehéz lánc konstrukcióval és a J588L rágcsáló mielómával, amely egy rágcsáló lambda I könnyű láncot fejez ki. A kiméra fehérjéket kifejező sejtvonalakat ELISA-val azonosítjuk.

A kiméria L6 antitesteket „A” fehérje-Sepharose-on tisztítjuk és biotinilezzük, amint ezt korábban már leírták [Pohlit Η. M. és munkatársai: az „Immunological Methods” című kiadványban, szerkesztők: Lefkovics I. és Pemis B., kiadó: Academic Press, New York, 181—

194. oldal (1979)].

9.1.9 Vizsgálatok az L6 anti-idiotípusos változó terület fajlagosságára

Kompetíciós vizsgálatokat hajtunk végre olyan módon, hogy 100 μΐ 187 1 mAb-vel Immunoion II leme30 zeket borítunk (ahol az mAb-t dr. Dale-től, Yeltonból kapjuk), ezt három mosás követi, majd az L6 anti-idiotípusos mAb tenyészeteiből származó felülúszókat adunk hozzá. A lemezeket azután ismét mossuk, és 100 μΐ nem jelzett versengő anyagot adunk hozzá

6 pg/ml koncentrációban. A nem jelzett versengő anyagok vagy a J558L könnyű lánccal társult L6 kiméra változó nehéz láncot kifejező transzfektánsokból, vagy csak az L6 kiméra változó könnyű láncot kifejező transzfektánsokból származó tenyészet felülúszók, vagy olyan tápközegek, amelyekben tisztított kiméra L6 mAb vagy PW P3281B8 mAb található, (kontroll, irreleváns humán IgGl antitest). 30 perc 30 °C hőmérsékleten eltöltött idő után tisztított, biotinilezett kiméra L6 antitest 1 pg/ml-es oldatát adjuk hozzá az üregben már jelen levő 100 μΐ-es térfogathoz. Ezt állni hagyjuk inkubálás céljából további 1 órán át 37 °C hőmérsékleten, majd a lemezt mossuk, inkubáljuk Avidin-HRP-vel CTAGO.Burlingame, Kalifornia) (1:1000 hígítás) 30 percen át szobahőmérsékleten, újra mossuk, és ki50 fejlesztjük TMB kromogénnel pufferolt szubsztrátumban (Genetics Systems, Seattle, Washington). Az adatokat %-os gátlásban fejezzük ki, a versengő anyag nélküli helyzethez (csak tápközeg), mint 100%-hoz viszonyítva, és a háttér-értékeket (Ab2 nélkül) kivon55 va. A vizsgálathoz használt mAb-ket az Oncogen fejlesztette ki és onnan szerezhetők be.

9.1.10 Ab2 válasz indukálása

6-8 hetes BALB/c és C3H/HeN nőstény egereket immunizálunk 51 pg Ab2-vel, amelyet előzőleg KLH60 hoz konjugáltunk [Streicher Η. Z. és munkatársai: J.

HU 206 394 Β

Immunoi. 136, 1007-1014 (1986)]. Hasonló második immunizálást végzünk egy héttel az első után, majd ezeket követi egy harmadik és negyedik immunizálás 1 hetes intervallumokban elvégezve foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldatban (PBS) beadott Ab2-vel, majd további immunizálásokat végzünk 2 hetes időközönként PBS-ben levő Ab2-vel. Az összes immunizálást

i. p. végezzük. 4 hét után az egerektől megfelelő időközönként vért veszünk és szérumaikat megvizsgáljuk (poliklonális) Ab3 jelenlétére.

9.1.11 Poliklonális Ab3 tisztítása

Ab2-vel immunizált egerekből szérumokat veszünk a 6. és 20, hét között az első immunizálástól számítva, és összegyűjtjük. 10 pg megfelelő Ab2-t 1 ml, cianogén-bromiddal aktivált Sepharose 4B-hez (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) konjugáljuk, és kromatográfiát végzünk a gyártó útmutatásai szerint úgy, hogy az az Ab3 dúsuljon fel, amely a megfelelő Ab2-höz kötődni képes.

9.1.12 Az Ab3 olyan képességének vizsgálata, hogy gátolja az Ab3 kötődését L6 Fab-hoz

Egy korábban leírt vizsgálatot alkalmazunk (lásd a 8. fejezetet). Vizsgálandó szérumokat vagy tisztított Ab3-at összekeverünk rögzített koncentrációjú (2,0 pg/ml) tisztított Ab2-vel és Immunolon I lemezre visszük, amelynek üregeit előzőleg L6 Fab-bal burkoltuk; pozitív és negatív kontrollként Ló mAb-t, illetve PBS-t használunk. Az inkubálás 30 percét követően az Ab2 kötődését kimutatjuk L6 Fab-hoz ELISA módszerrel, ismert módon nyúl anti-egér IgGl HRP/„A” fehérje-HRP keveréket („koktélt”) alkalmazva. Az adatokat úgy adjuk meg, mint az Ab2 L6 Fab-hoz való kötésének Ab3 szérum által előidézett százalékos gátlását.

9.1.13 Ab3 sejtekhez való kötődésének vizsgálata

Ab3-ra vizsgálandó egér szérum különböző hígításait vagy tisztított poliklonális Ab3-at (50 μΐ-es menynyiségekben) inkubálunk 4 °C hőmérsékleten 5xl0⁵H-3347 sejtekkel 30 percen át polipropilén csövekben. Tenyészközeget, 96.5 mAb-vel vagy P1.17-tel immunizált egerekből kapott szérumot és normál egér szérumot alkalmazunk negatív kontroliokként. A sejteket kétszer mossuk a tápközegekben. Az Ab3 kötődését a célsejtekhez FITC-vel jelzett kecske anti-egér IgG-vel (Tago, Burlingame, Kalifornia) mutatjuk ki; 50 μΐ-t adunk az egér szérum és tumorsejtek keverékéhez és 30 percen át inkubáljuk. Két mosás után tápközeggel a sejteket FACS-t alkalmazva elemezzük. CEM sejteket, amelyek nem fejezik ki az L6 által meghatározott antigént, alkalmazzuk negatív célsejt kontrollként.

9.2 Eredmények

9.2.1 L6(Abl)-hez való anti-idiotípusos mAb(Ab2) kialakulása

Anti-idiotípusos mAb-t termelő hibridómákat kapunk BALB/c egereket immunizálva L6-tal és lépsejtjeiket fuzionálva NS-1 mielómával, ezt követően a hibridóma sejtek átvizsgálásával L6 Fab-hoz való kötődésre. Az L6 Fab-hoz kötődő felülúszóval bíró üregekből kapott sejteket kétszer klónozzuk és a kiónokat átvizsgáljuk arra a képességükre, hogy L6 Fab-hoz kötődő, de 96.5 Fab-hoz (amelyet negatív kontrollként alkalmazunk) nem kötődő mAb-t alakítanak ki. 8 fúzióból 24 olyan hibridómát, amelyek L6 Fab-ra képeznek mAb-t, izolálunk, stabilizálunk és felhasználunk aszcitesz-termelésre, ezek sok különböző izotípust képviselnek (XVI. táblázat).

XVI. táblázat

Anti-idiotípusos mAb L6 mAb-ra

Anti-idiotípusos hibridóma	Anti-idiotípusos mAb(Ab2)	Kötődés az L6 paratop területéhez*	Izotípus
4/1—6—1	L6 anti—Id 1	Igen	IgG2b
4/2—4—1	L6 anti-Id 2	Igen	IgG2b
4/3—2—1	L6 anti-Id 3	Igen	IgG2b
4/5—1—1	L6 anti-Id 4	Igen	IgG2b
5/4-2-2	L6 anti-Id 5	Nem	IgG3
6/14-2-2	L6 anti-Id 6	Igen	IgGl
6/13-3-1	L6 anti-Id 7	Igen	IgGl
6/20-4-5	L6 anti-Id 8	Igen	IgGl
7/10-2-3	L6 anti-Id 9	Igen	IgGl
5/14-2-6	L6 anti-Id 10	Igen	IgGl
5/15-3-1	L6 anti-Id 11	Igen	IgGl
10/24-1-5	L6 anti-Id 12	Igen	IgGl
10/20-2-3-1	L6 anti-Id 13	Igen	IgGl
11/48-3-14	L6 anti-Id 14	Igen	IgGl
11/75-1-3	L6 anti-Id 15	Igen	IgG2a
11/81-1-2	L6 anti-Id 16	Nem	IgM
11/80-3-8	L6 anti-Id 17	Nem	IgM
10/30-1-6-28	L6 anti-Id 18	Nem	IgG3
10/36-1-1	L6 anti-Id 19	Nem	IgG3
11/5-31-2-4	L6 anti-Id 21	Nem	IgG3
11/26-2-4	L6 anti-Id 22	Nem	IgG3
11/27-5-5-4	L6 anti-Id 23	Nem	IgG3
9/66-11-2	L6 anti-Id 24	Nem	IgG3
10/46-6-4	L6 anti-Id 25	Nem	IgG3

* Úgy határozzuk meg, mint azt a képességet, hogy az L6 mAb-t gátolja a H-3347 karcinóma sejteken levő cél-antigénjéhez való kötődésben

Az aszciteszből tisztított Ab2-t alkalmazzuk további vizsgálathoz (lásd alább)

9.2.2 Az Ab2 L6-on levő idiotophoz való kötődésének jellemzése

Egy induló átvizsgálás a vizsgált 24 hibridómából 14-et azonosít, amely olyan Ab2-t termel, amely 90100%-ban gátolja az L6 kötődését (0,2-04 pg/ml-nél vizsgálva) karcinóma sejtekhez; ezeket tovább vizsgáljuk ara a képességükre, hogy gátolják az L6 kötődését a sejteken levő saját antigénjére. Az ilyen gátlásról

HU 206 394 Β várható, hogy akkor fordul elő, ha az Ab2 az L6 idiotop területével reagál. Erre a célra ELISA-t alkalmazunk, az antigén forrásaként glutáraldehiddel rögzített H3347 sejteket használva. Amint a 23. ábrából látható, az L6 (0,2 pg/ml) kötődése a karcinóma sejtekhez gátlódik, amikor Ab2-t adunk hozzá 0,5 pg/ml és 5 pg/ml koncentrációban. A gátló Ab2-k közül 2 IgG2a típusú, 3 IgG2b típusú, és a további 9 IgGl típusú, míg a 7 IgG3 vagy IgM antitest egyike sem gátló hatású.

A 14 Ab2-t, amely gátolni képes az L6 kötődését a fentebb leírt szilárd fázisú vizsgálatban, FTTC-cel jelöljük elemzés céljára. Minden konjugátumot ELISA-val vizsgálunk arra a képességére, hogy L6 Fab-hoz kötődik, valamint arra a képességére, hogy megakadályozza az L6 kötődését az antigén-pozitív karcinóma sejtekhez. Ezt azért végezzük, hogy megtudjuk, vajon a jelzett antitestek pontosan ugyanúgy viselkednek-e, mint a nem jelzett antitestek. Amikor a FTTC-cel jelzett Ab2-t adjuk az L6 Fab-hoz, amely előzőleg telítési dózisban volt hozzáadva a H-3347 karcinóma sejtekhez, úgy találjuk, hogy a 14 Ab2 közül 8 még képes kötődni az L6 Fab-hoz, míg 6 Ab2 teljesen gátolva van (24. ábra). Amikor PE-vel jelzett L6-ot alkalmazunk L6 Fab helyett ebben a vizsgálatban, úgy találjuk, hogy az L6 kötve marad a sejtekhez és nem helyettesítődik a 6 nem-kötő Ab2 jelenlétében (25. ábra).

A 6 Ab2-t, amely gátolja az L6 kötését cél-antigénjéhez, és amely nem képes kötődni az előzetesen kötött L6 Fab-hoz vagy sejtekhez, kiválasztjuk további vizsgálatokhoz. A következő fejezetekben leírt tanulmányokat ennek a 6 Ab2-nek a mintáin hajtjuk végre; ezek elsősorban azt a célt szolgálják, hogy azonosítsák azokat az Ab2-ket, amelyek az L6 által meghatározott antigén „belső képmás”-aként működnek.

9.2.3 AzL6-tal kialakított Ab2 fajlagossága

Van két mAb, az F2-6 és a 012/28-24, amelyeknek azonos a fajlagossága az L6-éval, amikor FACS-ben vizsgáljuk kompetitív kötés-gátló vizsgálatokban. Ezeket összehasonlító vizsgálatok céljából az Oncogennél fejlesztették ki és onnan szerezhetők be. Ennek a két mAb-nek a mintáit összekeverjük Ab2 különböző koncentrációival, hogy megvizsgáljuk, vajon ez utóbbi képes-e gátolni a két mAb („L6-hoz hasonlónak látszó”) kötődését karcinóma sejtekhez. A 14 megvizsgált Ab2 egyike sem gátolja a 012/28—24 kötődését az L6-tal meghatározott antigénhez, amikor hasonlóképpen vizsgáljuk, mint ahogyan a 26. ábrában az L6-ra megmutatjuk. A14 vizsgált Ab2 közül 8 képes gátolni az F26 kötését nagy koncentrációban: 20-200 g/ml gátol 1 g/ml F26-ot. Ez azt sugallja, hogy a 012/28-24 idiotípusa eltér az L6 idiotípusától, és hogy az F26 és L6 lehet, hogy átfedő idiotopokkal rendelkeznek.

9.2.4 Ab2 Epitóp fajlagosság

Az L6 anti-idiotípusos monoklonális antitestek epitóp fajlagosságát kompetíciós kísérletekben mutatjuk be, amelyekben vagy az L6-ot vagy a J558L rágcsáló lambda 1 könnyű lánccal társult kiméra L6 nehéz láncot, vagy egy irreleváns humán IgGl-et vizsgálunk arra a képességére, hogy verseng az egyes anti-idiotípusos antitestek kötésével biotinilezett kiméra L6-hoz (27. ábra). A 14 Ab2 mindegyikéről kimutatjuk, hogy fajlagosan felismeri a klónozott L6 V területeket azon képessége alapján, hogy kötődik a biotinilezett kiméra L6 molekulához. A kötésről kimutatjuk, hogy gátolható nem jelzett kiméra L6-tal, de nem gátolható irreleváns humán IgGl-gyei. 8 Ab-t lehet gátolni jelentős mértékben a szabad kiméra L6 könnyű lánccal (#1, #2, #4, #6, #7, #9 és #15), de nem lehet gátolni az egér lambda 1-gyel társult kiméra nehéz lánccal, és ezért a 8 Ab egy

L6 változó, nehéz lánccal társult determinánst ismer fel. Ezek azok az Ab2-k, amelyek képesek kötődni a sejtekhez kötött L6 Fab-hoz. Az Ab2-k közül kettő (#12 és #13) gátolható a J558L könnyű lánccal társult kiméra nehéz lánccal, de nem gátolható a szabad kimé15 ra könnyű lánccal, és így ezek egy L6 V-vel asszociált determinánst ismernek fel. A maradék négy Ab2 (#3, #10, #11 és #14) nem gátolható a klónozott V területek egyikével sem külön-külön, és ezért ezeknek fajlagosaknak kell lenniök egy olyan kombinatorikus determi20 nánsra, amely csak a megfelelő V területek összeállításával keletkezik. Ezeket az eredményeket igazolják a közvetlen kötési kísérletek is.

9.2.5 Ab3 indukciója

A 6 Ab2 közül ötöt, amelyek kötőhelyre vonatkozó25 nak tűnnek, KLH-hoz konjugáljuk és felhasználjuk BALB/c és C3H/HeN egerek immunizálására, amint ezt a 9.1.4. fejezetben leírtuk. Az egerekből időközönként vért veszünk és emlékeztető oltást adunk, és szérumukat elemezzük.

Először egy kötés-gátlási vizsgálatot hajtunk végre, hogy meghatározzuk: vajon az immunizált egerek képeznek-e bármiféle Ab3-at, amelyet azon képességük alapján lehet azonosítani, hogy fajlagosan kötődnek Ab2-höz. Az egerekből kapott szérumok különböző hígításait összekeverjük Ab2-vel (1,0 pg/ml), a keverékeket L6 Fab-bal burkolt lemezekre visszük fel, és az Ab2 kötődését az L6 Fab-hoz ELISA-val határozzuk meg. Az eredményeket úgy határozzuk meg, mint az Ab2-nek L6 Fab-hoz való kötődésének százalékos gát40 lását az adott egér-szérum jelenlétében. Amint a 28. ábrán látható, az Ab2 (1,0 pg/ml) kötése az L6 Fab-hoz 90%-ban gátolva van számos immun egér szérum 1:200 hígításánál. Az affinitással tisztított antiszérumokról úgy találjuk, hogy gátolják az Ab2 kötését ugyanebben a vizsgálatban. Ez az összes vizsgált Ab2nél látható, és azt jelzi, hogy az Ab3 az Ab2 paratop területre képződik. Az Ab3 indukciója Ab2-re hasonló a BALB/c és C3H/HeN egerekben.

9.2.6 Az Ab3-nak az a képessége, hogy az L6 által meghatározott antigénhez kötődik

Ha az Ab2 úgy működik, mint az L6 antigén „belső képmás”-a, képes kell hogy legyen olyan Ab3-at kiváltani, amely fajlagosan kötődik az L6(Abl) által meghatározott antigénhez. Abból a célból, hogy meghatároz55 zuk az Ab2-vel immunizált egerekben kialakított Ab3 fajlagosságát, az affinitással tisztított immun egér szérumok különböző hígításait vizsgáljuk az L6-pozitív H-3347 karcinóma vonalakból származó sejtekhez való kötődésre; negatív kontrollként CEM sejteket alkal60 mázunk, amelyekhez nem kötődik az L6. C3H/HeN

HU 206 394 Β

9i egerekből, amelyeket előzőleg #11 és #12 Ab2-vel immunizáltunk, származó szérumok (29. ábra), és BALB/c egerekből, amelyeket előzőleg #14 Ab2-vel immunizáltunk, származó szérumok (30. ábra) kötődnek a karcinóma sejtekhez.

9.3 Tárgyalás

Monoklonális anti-idiotípusos antitesteket (Ab2) alakítunk ki egy egér mAb-re, az L6-ra, amely kötődik egy, több humán karcinómán kifejezett szénhidrát antigénhez. Az Ab2-t először átvizsgáljuk az L6 Fab fragmentumaihoz való kötődésre, majd ezt követi az átvizsgálás arra a képességére, hogy gátolja az L6 kötését a karcinóma sejteken levő cél-antigénhez. Abból az összesen 24 Ab2-ből, amelyet eredetileg kiválasztottunk L6 Fab-hoz való kötődés alapján, 14 Ab2 gátolja az L6 kötését antigén-pozitív karcinóma sejtekhez. Az utóbbi Ab2-k közül 6 nem képes kötődni olyan L6 Fab fragmentumokhoz, amelyek előzőleg sejteken levő antigénhez lettek kötve, azt sugallja, hogy ezek az L6-nak azt a területét azonosítják, amely antigén-kötő helyével társult. Amikor ezt a 6 Ab2-t klónozott L6 könnyű és nehéz lánc változó területeihez való kötődésére vizsgáljuk, csak 4 Ab2 kötődik a megfelelő V területek kombnációjához, míg 2 Ab a változó könnyű lánccal van társulva; egyik sem ismeri fel a könnyű láncokat. Ezzel ellentétben, a nyolc megvizsgált Ab2 közül, amely kötődik a sejtekhez rögzített szabad kiméra L6 Fab-hoz, mind képes kötődni a kiméra L6 könnyű láncokhoz.

In vivő Abl-szerű választ csak akkor kapunk, amikor azokat az Ab2-ket alkalmazzuk, amelyek nem kötődnek a sejtekhez rögzített L6 Fab-hoz, és amelyek vagy egy kombinatorikus, vagy egy változó nehéz lánccal társult determinánshoz kötődnek. Ezzel ellentétben azok közül az Ab2-k közül, amelyek a karcinóma sejtekhez rögzített L6 Fab-hoz és izolált kiméra L6 könnyű láncokhoz kötődnek, egyik sem indukál Ablszerű Ab3 választ egerekben.

A #11, #12 és #14 Ab2-k úgy viselkednek, mint „belső képmás” Ab2-k a vizsgálatok sok különféle típusában.

Két Ab2 (#11, #12) Abl-szerű Ab3 választ képes indukálni egerekben. Ezen Ab2-k bármelyikével immunizált egerekből származó szérumok képesek azonos fajlagossággal kötődni, mint az L6, karcinóma sejtekhez. Mivel Ab3 válasz indukálódik allogén C3H/HeN egerekben, allotípusosan nem korlátozott, sőt várható is, hogy az Ab2 immunregulátorként szolgáljon [Lee V. K. és munkatársai: Biochim. Biophys. Acta 865, 127-139 (1986)]. E helyett az Ab2 az L6 által meghatározott antigén „belső képmás”-aként viselkedik [Urbain J. és munkatársai: Ann. Immunoi. 133D, 179-189 (1982); Lee V. K. és munkatársai: Biochim. Biophys. Acta 865, 127-139 (1986)]. Azt is észleljük, hogy az Ab2-k egyike (#14) képes indukálni egy Abl-szerű Ab3 választ a szingén rendszerben.

10. Mikroorganizmusok deponálása

Az alábbi, a jelzett monoklonális antitestekete termelő hibridóma sejtvonalakat deponáltuk az American Type Culture Collectionnál (Rockville, Maryland); ezek száma is fel van tüntetve a letéti listán.

Hibridóma	Monoklonális antitest	Ide vonatkozó antigén	A deponálás dátuma	Letéti szám
2C1 sejtvonal	2C1	humán melanómával társult GD3 gangliozid antigén	7-17-87	HB 9484
#3 sejtvonal (24.89/1.3cl.5)	#3	humán melanómával társult p97 antigén	8-13-87	HB 9498
#7 sejtvonal (24.6/28.2cl.l)	#7	humán melanómával társult p97 antigén	8-13-87	HB 9497
5/15-3-1	#11	humán karcinómával társult L6 antigén	9-18-87	HB9544
11/24-1-5	#12	humán karcinómával társult L6 antigén	4-1-88	HB9681
11/48-3-14	#14	humán karcinómával társult L6 antigén	4-1-88	HB9680
4/1-6-1	#1	humán karcinómával társult L6 antigén	9-18-87	HB9546
6/14-2-2	#6	humán karcinómával társult L6 antigén	9-18-87	HB 9545

A jelen találmány nem korlátozódik csak a deponált sejtvonalak által behatárolt oltalmi körre, mivel a deponált vonalak csak a találmány egyik szempontjának illusztrációjaként szolgálnak, és bármely sejtvonal, amely funkcionálisan ekvivalens ezekkel, a jelen találmány oltalmi körén belül van. Sőt a jelen találmány különböző módosításai, amelyek az itt leírtakon és 60 bemutatottakon kívül lehetségesek, nyilvánvalóak azok 55 számára, akik a szakterületen jártasak, a bemutatott leírásból és mellékelt rajzokból. Az ilyen módosítások is belül esnek a mellékelt igénypontok oltalmi körén. Az is világos és érthető, hogy minden bázispár-méret, amelyet a nukleotidoknál megadtunk, csak hozzávetőleges, és csak a leírás céljaira alkalmazzuk.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás a humán melanómával társult GD3 antigénre specifikus antitesten jelen levő idiotípust fajlagosan felismerő monoklonális anti-idiotípusos antitestek előállítására, azzaljellemezve, hogy (1) hibridómát állítunk elő (i) a GD3 antigénnel vagy a GD3 antigént felismerő T-sejtekkel vagy antitestekkel immunizált állat lépőből származó antitest-termelő sejteknek (ii) mielóma sejtekkel történő fuzionálása útján;

(2) a tárgyi körben meghatározott fajlagosságú hibridómát klónozással kiválasztjuk és elkülönítjük;

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a (3) lépésben az ATCC HB 9484 hibridómát szaporítjuk.

(Elsőbbsége: 1987.09.10).

(3) az elkülönített hibridómát szaporítjuk; és

(3) az elkülönített hibridómát szaporítjuk; és (4) a hibridóma által termelt monoklonális antitesteket elkülönítjük és kívánt esetben tisztítjuk.

(Elsőbbsége: 1987.11.04).

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a (3) lépésben a hibridómát in vivő szaporítjuk.

(Elsőbbsége: 1987.09.10).

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (3) lépésben a hibridómát úgy szaporítjuk, hogy egerekbe injektáljuk, aszcitesz tumort növesztünk, és a (4) lépésben az antitesteket aszciteszből különítjük el, és affinitáskromatográfiával vagy ammónium-szulfátos kicsapással tisztítjuk.

(Elsőbbsége: 1987.09.10).

5 azzal jellemezve, hogy a (3) lépésben a hibridómát úgy szaporítjuk, hogy egerekbe injektáljuk, aszcitesz tumort növesztünk, és a (4) lépésben az antitesteket az aszciteszből különítjük el, és affinitáskromatográfiával vagy ammónium-szulfátos kicsapással tisztítjuk.

5. Eljárás a humán melanómával társult p97 antigénre specifikus antitesten jelen levő idiotípust fajlagosan felismerő monoklonális anti-idiotípusos antitestek előállítására, azzal jellemezve, hogy (1) hibridómát állítunk elő (i) p97 antigénnel vagy egy p97 antigént felismerő T-sejtekkel vagy antitestekkel immunizált állat lépőből származó antitest termelő sejteknek (ii) mielóma sejtekkel történő fuzionálása útján;

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a (3) lépésben az ATCC HB 9498 hibridómát szaporítjuk.

(Elsőbbsége: 1987.11.04).

7. Az 5. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a (3) lépésben az ATCC HB 9497 hibridómát szaporítjuk.

(Elsőbbsége: 1987.11.04).

8. Az 5. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a (3) lépésben a hibridómát in vivő szaporítjuk.

(Elsőbbsége: 1987.11.04).

9. A 4-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás

10. Eljárás humán karcinómákkal társult L6 antigénre specifikus antitesten jelen levő idiotípust fajlagosan felismerő monoklonális anti-idiotípusos antitestek előállítására, azzal jellemezve, hogy

10 (Elsőbbsége: 1987.11.04).

11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy L6 antigénre specifikus antitestként az ATCC HB

12. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (3) lépésben az ATCC HB 9544 hibridómát szaporítjuk.

35 (Elsőbbsége: 1988.07.28).

13. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (3) lépésben az ATCC HB 9681 hibridómát szaporítjuk.

(Elsőbbsége: 1988.07.28).

40

14. A10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (3) lépésben az ATCC HB 9680 hibridómát szaporítjuk.

(Elsőbbsége: 1988.07.28).

15. A10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,

45 hogy a (3) lépésben a hibridómát iv vivő szaporítjuk.

(Elsőbbsége: 1988.07.28).

15 (1) hibridómát állítunk elő (i) az L6 antigénnel vagy az L6 antigént felismerő T-sejtekkel vagy antitestekkel immunizált állat lépéből származó antitest-termelő sejteknek

16. A10-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (3) lépésben a hibridómát úgy szaporítjuk, hogy egerekbe injektáljuk, aszcitesz tumo50 rókát növesztünk, és a (4) lépésben az antitesteket az aszciteszből különítjük el, és affinitáskromatográfiával vagy ammónium-szulfátos kicsapással tisztítjuk.

(Elsőbbsége: 1988.07.28).

17. Eljárás tumoros betegekben az 1-16. igénypon55 tok bármelyike szerint előállított anti-idiotípusos antitestekkel azonos idiotípust felismerő indukált anti-idiotípusos antitest szintjének követésére, amely betegek olyan tumorellenes antitesteket kaptak vagy éppen kapnak, amely tumorellenes antitest a fentebb meghatáro60 zott tumor antigén ellen irányuló idiotípust fejez ki,

HU 206 394 Β azzal jellemezve, hogy a betegek szérumában az antiídiotípusos antitest szintjét komipetitív immunassayvel méljük valamely 1-16. igénypont szerint előállított, a tumorellenes idiotípusát fajlagosan felismerő monoklonális anti-idiotípusos antitestet alkalmazva.

(Elsőbbsége: 1987.09.10).

18. A17. igénypont szerinti eljárás valamely onkofetális antigén ellen irányuló idiotípust kifejező tumorellenes antitestet felismerő anti-idiotípusos antitest szintjének követésére, azzal jellemezve, hogy a megfelelő monoklonális anti-idiotípusos antitestet alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1987.09.10).

19. A18. igénypont szerinti eljárás valamely melanóma antigén ellen irányuló idiotípust kifejező tumorellenes antitestet felismerő anti-idiotípusos antitest szintjének követésére, azzal jellemezve, hogy a megfelelő monoklonális anti-idiotípusos antitestet alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1987.09.10).

20. A 19. igénypont szerinti eljárás valamely p97 melanóma antigén ellen irányuló idiotípust kifejező tumorellenes antitestet felismerő anti-idiotípusos antitest szintjének követésére, azzal jellemezve, hogy a megfelelő monoklonális anti-idiotípusos antitestet alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1987.11.04).

20 (ii) melanóma sejtekkel történő fuzionálása útján;

21. A 20. igénypont szerinti eljárás p97^a epitóp ellen irányuló idiotípust kifejező tumorellenes antitestet felismerő anti-idiotípusos antitest szintjének követésére, azzal jellemezve, hogy a megfelelő monoklonális antiidiotípusos antitestet alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1987.11.04).

22. A 20. vagy 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy monoklonális antitestként az ATCC HB 9498 deponálási számú vonal által termelt #3 monoklonális anti-idiotípusos antitestet alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1987.11.04).

23. A 20. vagy 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy monoklonális antitestként az ATCC HB 9497 deponálási számú vonal által termelt #7 monoklonális anti-idiotípusos antitestet alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1987.11.04).

24. A 19. igénypont szerinti eljárás GD3 melanóma antigén ellen irányuló idiotípust kifejező tumorellenes antitestet felismerő anti-idiotípusos antitest szintjének követésére, azzal jellemezve, hogy a megfelelő monoklonális anti-idiotípusos antitestet alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1987.09.10).

25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy monoklonális antitestként az ATCC HB 9484 deponálási számú vonal által termelt 2C1 monoklonális anti-idiotípusos antitestet alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1987.09.10).

25 (4) a hibridóma által termelt monoklonális antitesteket elkülönítjük és kívánt esetben tisztítjuk. (Elsőbbsége: 1988.07.28).

26. A 18. igénypont szerinti eljárás valamely humán karcinóma antigén ellen irányuló idiotípust kifejező tumorellenes antitestet felismerő anti-idiotípusos antitest szintjének követésére, azzal jellemezve, hogy a megfelelő monoklonális anti-idiotípusos antitestet alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1987.07.28).

27. A 26. igénypont szerinti eljárás valamely tüdő karcinóma antigén ellen irányuló idiotípust kifejező tumorellenes antitestet felismerő anti-idiotípusos antitest szintjének követésére, azzal jellemezve, hogy a megfelelő monoklonális anti-idiotípusos antitestet alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1988.07.28).

28. A 26. vagy 27. igénypont szerinti eljárás valamely humán karcinómákkal társult L6 antigén ellen irányuló idiotípust kifejező tumorellenes antitestet felismerő anti-idiotípusos antitest szintjének követésére azzal jellemezve, hogy a megfelelő monoklonális anti-idiotípusos antitestet alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1988.07.28).

29. A 28. igénypont szerinti eljárás az ATCC HB 8677 vonal által termelt L6 antigén ellen irányuló idiotípust kifejező tumorellenes antitestet felismerő anti-idiotípusos antitest szintjének követésére azzal jellemezve, hogy a megfelelő monoklonális anti-idiotípusos antitestet alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1988.07.28).

30. A 29. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy monoklonális antitestként az ATCC HB 9544 deponálási számú vonal által termelt #11 monoklonális anti-idiotípusos antitestet alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1988.07.28).

30 8677 vonal által termelt antitestet alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1988.07.28).

31. A 29. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy monoklonális antitestként az ATCC HB 9681 deponálási számú vonal által termelt #12 monoklonális anti-idiotípusos antitestet alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1988.07.28).

32. A 29. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy monoklonális antitestként az ATCC HB 9680 deponálási számú vonal által termelt #14 monoklonális anti-idiotípusos antitestet alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1988.07.28).

33. A 18. igénypont szerinti eljárás valamely fibroszarkóma antigén ellen irányuló idiotípust kifejező tumorellenes antitestet felismerő anti-idiotípusos antitest szintjének követésére azzal jellemezve, hogy a megfelelő monoklonális anti-idiotípusos antitestet alkalmazzuk.

(Elsőbbsége: 1987.09.10).