HU204576B - Continuous biotechnological process for producing s-(+)-optical isomere of 2-(6-methoxy-2-naphtyl)propionic acid - Google Patents

Continuous biotechnological process for producing s-(+)-optical isomere of 2-(6-methoxy-2-naphtyl)propionic acid Download PDF

Info

Publication number
HU204576B
HU204576B HU89900A HU90089A HU204576B HU 204576 B HU204576 B HU 204576B HU 89900 A HU89900 A HU 89900A HU 90089 A HU90089 A HU 90089A HU 204576 B HU204576 B HU 204576B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
methoxy
naphthyl
ester
racemic
priority
Prior art date
Application number
HU89900A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT52822A (en
Inventor
Daniele Bianchi
Pietro Cesti
Carlo Pina
Ezio Battistel
Original Assignee
Donegani Guido Ist
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from IT19532/88A external-priority patent/IT1217341B/it
Priority claimed from IT8821558A external-priority patent/IT1226553B/it
Application filed by Donegani Guido Ist filed Critical Donegani Guido Ist
Publication of HUT52822A publication Critical patent/HUT52822A/hu
Publication of HU204576B publication Critical patent/HU204576B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/087—Acrylic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
    • C12P41/005—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions by esterification of carboxylic acid groups in the enantiomers or the inverse reaction
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/921—Candida

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány tárgya javított eljárás S(+) 2-(6-metoxi-2naftil)-propionsav (NAPROXÉN®) folyamatos biotechnológiai előállítására a (Π) általános képletű, 50 “C alatti olvadáspontú (R,S) 2-(6-metoxi-2-naftiI)-propionsav-észterből.
Ismeretes, például a Τ. Y. Shen; Angew. Chem., Int.
Ed. Engl., 11,460 (1972) szakirodalmi helyen írják le, hogy a 2-(6-metoxi-2-nafÜl)-propionsavat nem szteroid gyulladásgátló szerként alkalmazzák.
Az említett sav az α-helyzetben aszimmetriacentnimot tartalmaz, így két optikailag aktív enantiomer az S(+) és a R(-) enantiomer formájában létezik.
Az előzőekben hivatkozott szakirodalmi helyen azt is leírják, hogy az S(+) enantiomer gyulladásgátló aktivitása mintegy hússzor nagyobb, mint az R(-) enantiomeré.
Ezért szükséges az S(+) enantiomemek a kevésbé aktív R(-) enantíomertól való elválasztása.
A 195 717 számú európai közrebocsátási iratban a 2-(6-metoxi-2-naftil)-propionsav S(+) és R(-) optikai izomerjeinek biotechnológiai elválasztására olyan eljárást ismertetnek, amelyben az (I) általános képletű megfelelő racém (R,S) észtereket énzimatikusan sztereoszelektíven hidrolizálják. Az (I) általános képletben R jelentése -CH2-OCH, -CH2-CH«CH2, -CH2-CN,
-CHaCOCHj, -CH2COOO-(l-4 szénatomos alkilcsoport), -CH2-CH2-O-(l-4 szénatomos alkilcsoport).
Enzimként előnyösen a Candida cylindracea (ATCC No. 14830) lipáztermelő mikroorganizmust alkalmaz- I zák, amely az S(+) optikai izomernek a racém (I) általános képletű vegyületből való szelektív hidrolizálására képes, miközben az R(-) formájú észter lényegében változatlanul megmarad.
A fenti eljárás azonban aligha alkalmas gazdaságos í ipari termelésre, minthogy az enzim 96 óra elteltével aktivitásának 80%-át elveszíti, ezért további hidrolízislépésekben nem használható fel, illetve nem alkalmazható folyamatos hidrolizálási eljárásban, amelynek során az egységnyi enzimre jutó termékmennyiség nagy 4 lehetne.
Arra a felismerésre jutottunk, hogy ha a 2-(6-metoxi-2-nafül)-propíonsavnak olyan racém észtereit alkalmazzuk, amelyeknek olvadáspontja 50 ’C alatti, és ha az alkalmazott enzim sajátos porózus hordozóanyagon 4 immobilizált Candida cylindracea eredetű enzim, a folyamatos hidrolizálási eljárás úgy hajtható végre, hogy eredményeként a hidrolizált terméket magas hozammal nyerjük, és az enzimaktivitás hosszú időszakon át gyakorlatilag változatlan marad. Az említett eljárásban po- 5 rőzus hordozóanyagként poli(akril-észter) alapú adszorbens gyantákat alkalmazunk, amelyek porozitása 50 és 1000 A közötti, szemcsemérete 1-0,01 mm.
A gyakorlatban megállapítottuk, hogy ha más porózus hordozóanyagot alkalmazunk, amelynek porozitása 5i és szemcseméiete az előzőekben megadott tartományon belül esik, de anyaga a poli(akril-észter)-től eltérő, a racém észter csak kis konverziós fokkal alakítható át hidrolizált termékké, így a folyamatos enzimes hidrolizálási eljárás nem végezhető gazdaságosan. 6(
A fentieknek megfelelőén a találmány tárgya folyamatos eljárás a 2-(6-metoxi-2-naftil)-propionsav S(+) optikai izomerjének biotechnológiai előállítására. Az eljárás során egy (Π) általános képletű, 50 ’C alatti 5 olvadáspontű, racém (R,S) 2-(6-metoxi-2-naftiI)-propionsav-észtert - a képletben
Rr jelentése 2-5 szénatomos alkilcsoport, fenilcsoport, vagy -(CH2CH2O)n-R2-csoport, ahol n értéke 10 és 15 közötti szám, [0 R2 jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport Candida cylindracea eredetű lipázzal reagáltatunk és 60 ’C közötti hőmérsékleten, 5 és 8 közötti pH-értéken, és a kapott S(+) savat eltávolítjuk; az eljárás során az észtert a foszfátpuffer-oldattal együtt fo5 lyamatosan tápláljuk be a bioreaktoroszlopba, amely az előzőekben említett, porózus hordozóanyagon megkötött lipázzal van töltve, a hordozóanyag 50-1000 A porozitású, 1—0,01 mm szemcsméretű akril-észter polimer, és a lipáznak a hordozóanyaghoz viszonyított tö0 mege az 1:2 és 1:10 közötti tartományban van. Az S(+) formájú savat a reakcióelegyből ismert módon különítjükel.
A lipáz, amelyet a Candida cylindracea ATCC 14830 mikroorganizmus termel, olyan enzim, amely 5 különböző tisztaságú minőségben kereskedelmi forgalomból beszerezhető, és a mikroorganizmus tenyészetéből ismert eljárásokkal kinyerhető.
A találmány szerinti eljárásban hordozóanyagként olyan adszorbens gyanták alkalmazhatók, amelyeknek 3 polimer mátrixa 50 és 1000 Á közötti porozitású, és 1 és 0,01 mm közötti szemcseméretű, mind a lipáz, mind a (Π) általános képletű racém észter adszorbeálására alkalmas poliakril-észíer tartalmú. Uyen gyanták például az AMBERLITE® XAD8 és az AMBERLITE* > XAD7 gyanták (az eljárásban alkalmazott AMBERLITE® gyanták a Rohmet Haas Co. termékei).
A lipáznak a hordozón való megkötését a hordozóanyagnak és a pH=6-8 értékre pufferolt vizes lipázoldatnak keverés mellett történő egyszerű elegyítésével 1 végezzük, a lipázt a hordozóanyaghoz viszonyítva 1:2 és 1:10 közötti arányban alkalmazzuk.
A lipáznak a hordozóanyagon való még erősebb megkötése érhető el, ha a hordozóanyagra felvitt lipázt egy többértékű aldehid, különösen telített, alifás, 2-10 szénatomos dialdehid, például glutáraldehid vizes oldatával hozzuk érintkezésbe.
A bioreaktor általában egy hőszabályozással ellátott oszlop, amelynek átmérő:magasság aránya 1:3 és 1:50 közötti, és az immobilizált lipázt tartalmazó hordozóanyaggal van töltve.
A találmány szerinti eljárás kiindulási anyagául szolgáló (H) általános képletű racém (R,S) észterek szokásos észterezési eljárással állíthatók elő racém 2(6-metoxi-2-naftil)-propionsavból, például az 1. reakcióvázlat szerint. A reakcióvázlatban szereplő képletekben Rí jelentése az előzőekben megadott.
A (Π) általános képletű racém (R,S) észterek közül előnyösek azok, amelyekben Rí jelentése 2-4 szénatomos alkilcsoport, különösen előnyös kiindulási anyag a racém 2-(6-metoxi-2-naftil)-propionsav etoxi-etil-ész2
HU 204576 Β tere, n-propoxi-etil-észtere, izopropoxi-etil-észtere és n-butoxi-etil-észtere.
Különböző molaritású, Na2HPO4 és KH2PO4 tartalmú vizes foszfátpuffert alkalmazunk, hogy a hidrolizálás során a reakcióelegy pH-ját az előre meghatározott értéken tartsuk, és hogy a hidrolizálás révén kapott S(+) 2-(6-metoxi-2-naftÜ)-propionsavat só formájában oldjuk.
A hidrolizálást előnyösen 30 és 50 ’C közötti hőmérsékleten, és 6-7 pH-értéken végezzük.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a bioreaktoroszlopot hordozóanyagon immobilizált lipázzal töltjük meg, az oszlop hőmérsékletét úgy szabályozzuk, hogy 20 és 60 ’C között legyen, és a (Π) általános képlető (R,S) észtert folyamatos áramban vezetjük be amíg a hordozóanyag telítetté válik. A bioreaktorban az adszorbeált észter és a töltőanyag mennyiségaránya általában az 1:2 és 1:20 közötti tartományba esik.
Az oszlopra a telítés után folyamatos áramban pH=6,5-ös, 0,15 n foszfátpuffert vezetünk párhuzamosan az előzőekben említett racém észterrel, az észter aránya a pufferoldathoz általában 1:50 és 1:200 közötti.
A racém észter bevezetésekor folyamatosan elfoglalja az oszlopon az R(-) optikai izomerben gazdagodott észter helyét, amely a lipáz hatására nem hidrolizált.
A bioreaktor kimeneténél a (H) általános képlető észter R(-) optikai izomerben dúsult szuszpenzióját nyerjük vizes pufferoldatban, amely oldat tartalmazza a túlnyomórészt S(+) optikai izomer formájában lévő 2-(6-metoxi-2-naftil)-propionsavat, és a megfelelő etilénglikol-étert, amelyek a hidrolízis során keletkeztek.
A sav és az észter a bioreaktort elhagyó elegyből megsavanyítást követően vízzel nem elegyedő szerves oldószerekkel extrahálható, alkalmazhatunk például oldószerként metilén-kloridot, toluolt vagy etil-étert.
Ezt követően a kapott szerves extraktumból bepáriás után a lényegében S(+) formájú savat az R(-) izomerben dúsult észtertől kromatográfiás oszlopon, például stacioner fázisú szilikagéloszlopon átengedve elkülöníthetjük.
Más eljárás szerint a lényegében S(+) formában lévő savat extrahálással is elkülöníthetjük a szerves extraktumból lúgos mosással, például 5 tömeg%-os nátriumhidroxid-oldattal vagy 10 tömeg%-os kálium-hidroxidoldattal való mosással.
A találmány egy további megvalósítási módja szerint a savat és az észtert a bioreaktort elhagyó elegyből úgy különítjük el, hogy az elegyet egy második adszorbens gyantával, például AMBERLITE® XAD7 vagy AMBERLITE® XAD4 típusú gyantával (a Rohm et Haas Co. termékei) töltött oszlopra visszük, ahol a sav és az észter a gyantán adszorbeálódik, és az adszorpciós oszlopot elhagyó pufferoldatban a megfelelő etilénglikol-éter található.
Ezt követően a savat és az észtert az adszorpciós oszlopról vízzel elegyedő szerves oldószerrel, például metanollal vagy etanollal való mosással eluáljuk.
A kapott szerves extraktumot ezután bepároljuk, és a lényegében S(+) formában lévő savat az R(-) formában dúsult észtertől az előzőekben leírt módon különítjük el.
Az adszorpciós oszlopról távozó, glikoltartalmú pufferoldatot először a kezdeti 6,5-ős pH-ra állítjuk be kálium-hidroxid vizes oldatával, majd a bioreaktorba visszavezetjük.
A pufferoldat addig vezethető vissza, amíg a glikolkoncentráció nem haladja meg a 10 tömeg% értéket, mivel az ennél magasabb glikolkoncentráció a hidrolizálás inhibitoraként működne.
Az R(-) izomerben gazdag észtert az előzőekben leírt módon végzett elkülönítés után vízmentes közegben bázissal keverve racemizálhatjuk, és a bioreaktorba visszavezethetjük. A következőkben a találmányt nem korlátozó példákban mutatjuk be részletesebben.
l.példa
Az enzim immobilizálása
500 g AMBERLITE® XAD7 gyantát 1 liter metanollal mosunk, majd pH=6,5-ös, 0,15 n foszfátpuffer-oldattal kondicionáljuk.
A gyantát 1 liter pH“6,5-ös, 0,15 n foszfátpufferben oldott 100 g Candida cylindracea (Sigma L 1754 type VH. 500 μΐ/mg) lipázenzimhez adjuk, és az elegyet rázógépen 200 ford/perc fordulatszámmal szobahőmérsékleten 24 órán át keverjük. Ezután a gyantát kiszűrjük és 1 liter pH-6,5-ös foszfátpuffenel mossuk.
Ezt követően a hidrolizálási reakciót és a savnak a reakcióelegyböl való ezt követő elválasztását az 1. ábrán vázlatosan bemutatott berendezésben végezzük el.
Az 1. ábrán szereplő jelölések a következők:
(1) a hordozós lipázt tartalmazó hőszabályozott oszlopból álló bioreaktor, (2) az adszorpciós oszlop, (3) a mosásra szolgáló szerves oldószer bevezetése, (4) az adszorpciós oszlopot elhagyó szerves extraktum, (5) a friss pufferoldat bevezetése, (6) a racém észter betáplálására szolgáló tartály, (7) a friss és a visszavezetett pufferoldat gyűjtésére szolgáló tartály, (8) a hidrolizálás révén kapott reakcióelegy gyűjtésére · szolgáló tartály.
Folyamatos hidrolizálási eljárás
Az 1. ábrára hivatkozva, az előzőekben leírt immobilizált enzimet tartalmazó hordozóanyagot 5 cm átmérőjű és 60 cm magas hőszabályozott oszlopból álló (1) bioreaktorba préseljük.
Az oszlopra ezután beptápláljuk a racém etoxi-etil[2-(6-metoxi-2-naftil)]-propionátot, a betáplálást addig végezzük, amíg a gyanta telítődik.
A hordozóanyag 490 g racém észtert abszorbeál.
Az oszlop hőmérsékletét 35 ’C értékre állítjuk be, és 7,2 ml/óra sebességgel racém etoxi-etil-[2-(6-metoxi2-naftil)]-propionátot és ezzel egyidejűleg 800 ml/óra sebességgel pH-6,5-ös, 0,15 n foszfátpuffert vezetünk rá.
Az oszlopot elhagyó elegy S(+) formájú 2-(6-metoxi-2-naftil)-propionsav és etilénglikol-monoetil-éter tartalmú oldatban szuszpendált, R(-) formában dúsult észter.
I
HU 204576 Β
Az S(+) 2-(6-metoxi-2-naftil)-propiorisav elválasztása a reakcióelegyből
Az (1) bioreaktort elhagyó elegyet folyamatosan 5 cm átmérőjű, 60 cm magas, 20 ’C hőmérsékleten tartott,
500 g préselt AMBERLITE® XAD4 gyantát tartalmazó (2) adszorpciós oszlopra vezetjük.
Ez az oszlop képes arra, hogy mind a 2-(6-metoxi-2naftil)-propionsavat, mind az etoxi-etil-[2-(6-metoxi-2naftil)]-propionátot abszorbeálja.
Az adszorpciós oszlop kivezetésénél az enzimes hidrolízis során képződött etilénglikol-monoetil-éter foszfátpufferes oldatát nyerjük. Ezt az oldatot nátriumhidroxid adagolásával ismét pH-6,6*ra állítjuk, míg az etilénglikol-monoetil-éter koncentrációja 5% alatt marad.
Az adszorpciós oszlop 40 órás működtetés utón telítődik, ekkor regeneráljuk.
A regenerálást az oszlopnak 10 liter metanollal való mosásával végezzük, amelyet 850 ml/őra sebességgel vezetünk be, miközben az oszlop hőmérsékletét 35 ’C értéken tartjuk.
A mosást követőén, a (2) oszlopot 5 liter pH=64-ös, 0,15 n foszfátpuffer átáramoltatásával ismétkondicionáljuk, majd ismét összekapcsoljuk az (1) bioreaktorral.
Az eljárás folyamatossá tételére a gyakorlatban egymással felváltva két adszorpciós oszlopot alkalmazunk.
Az adszorpciós oszlopról egy-egy mosáskor lejövő 10 liter metanolos oldatot vákuumban bepároljuk, és az S(+) formájú savat és az R(-) formában dúsult észtert tartalmazó visszamaradó anyagot 2 liter etil-acetótban oldjuk, és 2 liter 5%-os nátrium-hidroxiddal extraháljuk.
A vizes oldatot 10%-os hidrogén-klorid adagolásával pH-l-re állítjuk be, és a kicsapódó S(+) formájú savat kiszűquk, majd 100 ’C hőmérsékletű kemencében szárítjuk.
Az R(-) formában dúsult észtert tartalmazó szerves fázist nátrium-szulfáton szántjuk, lepároljuk róla az etil-acetátot, majd a racemizálási fázisba visszük, amelyet a későbbiekben ismertetünk.
Az adszorpciós oszlop minden mosási ciklusából 60-70 g S(+) 2-(6-meíoxi-2-naftil)-propionsavat nyerünk, amelynek fizikai jellemzői a következők:
op.: 154-155’C, [a]g>-·f-66,4’ (c-1, CHC13)
Ή-NMR (90 MHz, CDClj) (ppm): 1,57 (3H, d, -CHCHj), 3,83 (IH, q, CH), 3,86 (3H, s, OCHj), 6,98,0 (6H, m, aromás), 8,0 (IH, széles s, OH), valamint 260-280 g, az R(-) formában dúsult etoxietil-[2-(6-metoxi-2-naftil)]-propionátot kapunk.
Az előzőekben ismertetett működtetési körülmények mellett az 1. ábrán bemutatott rendszer 1200 órás folyamatos üzemelése alatt 9387 g racém etoxi-etil-[2-(6-metoxi-2-naftil)]-propionátottópláIunkbe, és 1757 gS(+) 2(6-metoxi-2-naftil)-propionsavat nyerünk, ami 25%-os konverziónak felel meg, ennek a terméknek az olvadáspontja 154-155 ’C.
[a]g>-+66,3’(c-1, CHClj), valamint 7050 g, az R(-) formában dúsult észtert kapunk anélkül, hogy a hatékonyságban vagy termelékenységben csökkenés jelentkezne. ·
Az etoxi-etil-[2-(6-metoxi-2-naftil)J-propionát racemizálása
300 ml etilénglikol-monoetil-éter és 36 ml 10%-os kálium-hidroxid elegyéhez 314 g, az R(-) formában 5 dúsult etoxi-etil-[2-(6-metoxi-2-naftil)]-propionátot adunk. Az elegyet 5 órán át visszafolyatő hűtő alatt forraljuk. A reakció befejeződése után ([ctjg’-O’) az etilénglikol-monoetil-étert lepároljuk, 1 liter etil-acetótot adunk hozzá, 3·1 liter vízzel mossuk, majd nátrium0 szulfáton szárítjuk. Az oldószer lepárlása utón 95%-os hozammal 298 g racém etoxi-etil-[2-(6-metoxi-2-naftíl)]-propionátot nyerünk.
2.példa lg Candida cylindracea (Nűeito Sangyo OF-360, 360 000 μ/g) eredetűlipázt 25 g AMBERLITE® XAD7 gyantán immobilizálunk az 1. példában leírt módon.
A gyantát 3 cm átmérőjű, és 30 cm magas hőszabályozott oszlopot tartalmazó bioreaktörba préseljük.
Az oszlopot racém etoxi-etil-[2-(6-metoxi-2-naftil)]propionáttal telítjük, majd ugyanezt az észtert vezetjükrá 0,3 ml/őra sebességgel, egyidejűleg 31 ml/őra sebességgel pH-6,5-ös 0,15 n föszfátpuffert vezetünk a 35 ’C hőmérsékleten tartott oszlopra.
Az oszlopot elhagyó elegyet egy második adszorpciós oszlopra visszük, amelynek átmérője 3 cm, magassága 30 cm és töltete 50 mg préselt AMBERLITE® XAD4 gyanta.
A második oszlopból távozó pufferoldatot nátrium1 hidroxid adagolással pH-6,5-re állítjuk, majd visszavezetjük a bioreaktoroszlop betáplálás! helyére.
Az S(+) formájú savat és az R(-) formában dúsult észtert az adszorpciós oszlopról leoldjuk, és az 1. példában ismertetett eljárással szétválasztjuk.
> Az előzőekben ismertetett működési körülmények mellett 500 órás folyamatos működtetés során 146 g racém észtert táplálunk be, és 34 g S(+) 2-(6-metoxi-2naftil)-propionsavat nyerünk 31 %-os konverzióval, a kapott termék olvadáspontja 154-155 ’C, ' [a]g)=+65,9’(c=l,CHCl3), valamint 101 g R(-) formában dúsult etoxi-etil-[2(6-metoxi-2-naftil)J-propionátot is nyerünk.
3.példa g Candida cylindracea (Meito Sangyo OF-360, 360 000 μ/g) eredetű lipázt 25 g AMBERLITE® XAD8 gyantán immobilizálunk az 1. példában ismertetett eljárással.
Az immobilizált enzimet a bioreaktor 3 cm átmérőjű, 30 cm magas oszlopába töltjük, és a betáplálást a 2. példa szerintvégezzük.
Az adott reakciókörülmények mellett a rendszert 500 órán át folyamatosan működtetjük, ezalatt 146 g racém észtert táplálunk be, 40 g S(+) 2-(6-metoxi-2naftil)-propionsavat nyerünk 37%-os konverzióval, a kapott termék olvadáspontja 154-155 ’C, [a]g>- +67,1’ (c-1, CHCb), valamint kapunk még 91 g, az R(-) formában dúsult etoxí-etil-[2-(6-metoxi-2-náftiI)]-propionátot.
HU 204 576 Β
4. példa
Folyamatos enimes hidrolízist végzünk az előzőekben ismertetett berendezés alkalmazásával, az 1. példában leírt működési körülmények mellett, de a racém etoxi-etil-[2-(6-metoxi-2-naftil)]-propionát helyett racém n-propoxi-etil-[2-(6-metoxi-2-naftil)]-propionátot alkalmazunk. Ebben az esetben az (1) oszlop hordozóanyaga 480 g racém észtert abszorbeál az előbbi 490 g helyett, és az enzimes hidrolízis során etilénglikol-monoetil-éter helyett etilénglikol-monopropil-éter képződik.
Az előzőekben ismertetett körülmények mellett az 1. ábrán bemutatott rendszerre 500 órás folyamatos működtetés alatt 3780 g racém n-propoxi-etil-[2-(6metoxi-2-naftil)]-propionátot táplálunk be, 632 g S(+) 2-(6-metoxi-2-naftil)-propionsavat nyerünk 23%-os konverzióval, a kapott termék olvadáspontja 154-155 ’C,
M^“+65,l0(c=l,CHCl3), és 2910 g, az R(-) formában dúsult észtert kapunk anélkül, hogy a hatékonyság vagy termelékenység észlelhetően csökkenne.
Az n-propoxi-etil-[2-(6-metoxi-2-naftil)]-propionát racemizálása
100 g etilénglikol-monopropilén-éter és 11 ml 10%os kálium-hidroxid elegyéhez 100 g, az R(-) formában dúsult n-propoxi-etil-[2-(6-metoxi-2-naftil)]-propionátot adunk, és az elegyet 5 órán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk.
A reakció befejeződése után ([ot]2P—0°) az etilénglikol-monopropil-étert lepároljuk, a visszamaradó anyaghoz 300 ml etil-acetátot adunk 3·3ΟΟ ml vízzel mossuk és nátrium-szulfáton szárítjuk. Ezután az elegyről az oldószert lepároljuk. így 92%-os hozammal 92 g racém n-propoxi-etil-[2-(6-metoxi-2-naftil)]-propionátot nyerünk.
5. példa g Candida cylindracea (Meito Sangyo Co. Ltd. Japan, type OF-360, 360 000 μ/g) eredetű lipázt 25 g AMBERLITE® XAD7 gyantán immobilizálunk az 1. példában ismertetett módon.
A gyantát egy bioreaktor szabályozható hőmérsékletű, 3 cm átmérőjű, 30 cm magas oszlopába préseljük.
Az oszlopot racém n-butoxi-etil-[2-(6-metoxi-2-naftil)]-propionáttal telítjük, majd a 35 ’C hőmérsékletű oszlopra egyidejűleg 0,4 ml/óra sebességgel a fenti észtert, és 30 ml/óra sebességgel pH-6,5, 0,15 n foszfátpuffert vezetünk be.
Az oszlopot elhagyó elegyet egy második adszorpciós oszlopra visszük, amely oszlop átmérője 3 cm, magassága 30 cm és 50 g préselt AMBERLITE® XAD4 gyantával töltött.
A második oszlop elvezetésénél távozó pufferoldatot nátrium-hidroxid adagolással pH-6,5-re állítjuk, majd a bioreaktoroszlop betáplálásához visszavezetjük.
Az S(+) formájú savat és az R(-) formában dúsult észtert az adszorpciós oszlopról leoldjuk, majd az 1.
példában leírt módon szétválasztjuk.
Az ismertetett működtetési körülmények mellett 600 órás folyamatos működtetés során 252 g racém észtert táplálunk be, és 52 g S(+) 2-(6-metoxi-2-naftil)-propionsavat nyerünk 30%-os konverzióval, a kapott tennék olvadáspontja 154-155 ’C, [a]g>= +66,7° (c=l, CHClj), valamint kapunk még 176 g R(-) formában dúsult n-butoxi-etil-[2-(6-metoxi-2-naftil)]-propionátot.
6. példa g Candida cylindracea (Meito Sangyo Co. Ltd. Japan, type OF-360, 360 000 μ/g) eredetű lipázt 25 g AMBERLITE® XAD7 gyantái immobilizálunk az 1. példában ismertetett módon.
Az immobilizált enzimet ezután egy bioreaktor 3 cm átmérőjű, 30 cm magas, hőmérséklet-szabályozással ellátott oszlopába töltjük. Az oszlopot racém izopropoxi-etil[2-(6-metoxi-2-naftil)]-propionáttal telítjük, és a 35 °C hőmérsékletű oszlopra egyidejűleg 0,4 ml/óra sebességgel a fenti észtert, és 35 ml/óra sebességgel pH=6,5, 0,15 n foszfátpuffert vezetünk.
A fenti működési körülmények mellett 500 órás folyamatos működtetés során 210 g racém észtert viszünk fel, 42 g S(+) 2-(6-metoxi-2-naftil)-propionsavat nyerünk 27%-os konverzióval, a kapott termék olvadáspontja: 154-155 °C, [aj2>°- +64,1° (c-1, CHCls), valamint 150 g az R(-) formában dúsult izopropoxietil-[2-(6-metoxi-2-naftil)]-propionátot nyerünk.
7. példa g Candida cylindracea (Meito Sangyo Co. Ltd. type OF-360, 360 000 μ/g) eredetű lipázt 25 g AMBERLITE® XAD7 gyantán immobilizálunk az 1. példában ismertetett módon.
Az immobilizált enzimet egy bioreaktor hőmérséklet-szabályozással ellátott, 3 cm átmérőjű és 30 cm magas oszlopába töltjük.
Az oszlopot mintegy 550 molekulatömegű racém polietilén-oxi-etil-[2-(6-metoxi-2-naftil)]-propionáttal telítjük - a vegyület polietilén-oxi-etil-csoportjának képlete -(CH2CH2O)n-R2, ahol n értéke 11-13 és R2 jelentése metilcsoport -, majd az oszlopra egyidejűleg 0,4 ml/óra sebességgel a fenti észtert, és 35 ml/óra sebességgel pH-6,5, 0,15 n foszfátpuffert vezetünk az oszlopot 35 °C hőmérsékleten tartva.
A fenti működési körülmények mellett a rendszert 600 órán át folyamatosan működtetjük, ezalatt 264 g racém észtert vezetünk rá, 23 g S(+) 2-(6-metoxi-2naftil)-propionsavat nyerünk 30%-os konverzióval, a kapott tennék olvadáspontja: 153-154 'C, [a]g>-+63,9’(c-1, CHC13), valamint 180 g, az R(-) formában dúsult poli(etilénoxi)-etil-[2-(6-metoxi-2-naftil)]-propionátot nyerünk.
8. példa g Candida cylindracea (Meito Sangyo Co. Ltd. Japan, type OF-360, 360 000 μ/g) eredetű lipázt 25 g AMBERLITE® XAD7 gyantán immobilizálunk az 1. példában leírt módon.
HU 204576 Β
Az immobiüzált enzimet egy bioreaktor hőmérséklet-szabályozással ellátott 3 cm átmérőjű és 30 cm magas oszlopába töltjük.
Az oszlopot racém fenoxi-etil-[2-(6-metoxi-2-naftil)]-propionáttal telítjük, majd egyidejűleg 0,3 ml/őra sebességei a fenti észtert, és 30 ml/óra sebességgel pH-6,5, 0,15 n foszfátpuffert vezetünk rá az oszlopot 40 ’C hőmérsékleten tartva.
A fenti működési körülmények mellett a rendszert 300 őrán át folyamatosan üzemeltetjük, ezalatt 98 g racém észtert viszünk rá, 15 g S(+) 2-(6-metoxí-2-naftü)-propionsavat nyerünk 23%-os konverzióval, a kapott tennék olvadáspontja: 154-155’C,
W- +65,7’(c=l, CHClj), valamint 70 g az R(-) fonnában dűsult fenoxi-etil[2-(6-metoxi-2- nafül)]-propionátot nyerünk.
Referenciapélda
Négy folyamatos enzimes hidrolizálási vizsgálatot végzünk, amelyek során a 2. példában ismertetett mű- 20 ködtetési körülményeket alkalmazzuk, azzal az eltéréssel, hogy az AMBERLITE® XAD7 gyanta helyett a következő gyantákat alkalmazzuk:
AMBERLITE® XAD2poIimer sztirol/divinil-benzol mátrixú adszorbens gyanta, 25
DUOLITE® ES762 polimer fenol/formaldehid mátrixú adszorbens gyanta,
DUOLITE® S761 polimer fenol/formaldehid mátrixú adszorbens gyanta,
DUOLITE® ES468 poliakril mátrixú ioncserélő 30 gyanta.
Az AMBERLITE® gyanták a Rohm et Haas Co. termékei, a DUOLITE® gyanták a Diamond Alkáli Co. termékei.
Valamennyi alkalmazott gyanta porozitása 50 és 35 1000 A közötti, szemcseméretük 1-0,01 mm.
A racém etoxi-etil-[2-(6-metoxí-2-naftil)]-propíonát konverziója az S(+) 2-(6-metoxi-2-naftil)-propionsav optikai izomerré 5% alatt marad.

Claims (9)

  1. SZABADALMIIGÉNYPONTOK
    1. Eljárás a 2-(6-metoxi-2-nafüI)-propionsav S(+) optikai izomerjének folyamatos biotechnológiai előállítására, amelynek során egy (H) általános képletű racém 45 (R,S) 2-(6-metoxi-2-naftil)-propÍonsav-észtert - a képJetben
    Rí jelentése'2-5 szénatomos alkilcsoport, fenilcsoport, vagy -(CH2CH2O)a-R2- csoport, ahol n értéke 10 és 15 közötti szám, 50
    R2 jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoportCandida cylindracea eredetű lipázzal reagáltatunk
    20-60 ’C hőmérsékleten, 5 és 8 közötti pH-η, és a kapott S(+) savat kinyerjük, azzal jellemezve, hogy
    50 ’C alatti olvadáspontú észtert alkalmazunk, ezt a foszfátpuffer-oldattal egyidejűleg folyamatosan tápláljuk be egy olyan bioreaktoroszlopba, amelyet a tárgyi körben megjelölt lipáz porózus hordozóanyagon immobilizált formájával töltünk meg, hordozóanyagként 501000 Á porozitású, 1-0,01 mm szemcseméretű, akrilészter polimerből álló abszorbens gyantát alkalmazunk, és a lípázt a hordozóanyagon 1:2 és 1:10 közötti tömegarányban kötjük meg. (Elsőbbsége: 1988.07.29.)
  2. 2. Eljárás a 2-(6-metoxi-2-naftil)-propionsav S(+) optikai izomerjének folyamatos biotechnológiai előállítására, amelynek során racém (R,S) etoxi-etil-[2-(6-metoxi-2-naftil)]-propionátot Candida cylindracea eredetű lipázzal reagáltatunk 20-60 ’C hőmérsékleten, 5 és 8 közötti pH-η, és a kapott S(+) savat kinyerjük, azzal jellemezve, hogy 50 ’C alatti olvadáspontú észtert alkalmazunk, ezt a foszfátpuffer-oldattal egyidejűleg folyamatosan tápláljuk be egy olyan bioreaktoroszlopba, amelyet a táigyi körben megjelölt lipáz porózus hordozóanyagon immobilizált formájával töltünkmeg, hordozóanyagként 50-1000 Á porozitású, 1-0,01 mm szemcseméretű, akril-észter polimerből álló abszorbens gyantát alkalmazunk, és a lipázt a hordozóanyagon 1:2 és 1:10 közötti tömegarányban kötjük meg. (Elsőbbsége: 1988.02.25.)
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként racém (R,S) n-propoxi-etü[2-(6-metoxi-2-naftíl)]-propionátot reagáltatunk. (Elsőbbsége: 1988.07.29.)
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként racém (R,S) izopropoxi-etü[2-(6-metoxi-2-naftil)]-propionátot reagáltatunk. (Elsőbbsége: 1988. 07.29.)
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként racém (R,S) n-butoxi-etiI-[2(6-metoxi-2-naftil)]-propionátot reagáltatunk. (Elsőbbsége: 1988.07.29.)
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy porózus hordozóanyagként AMBERLITE® típusú poli(akril-észter) alapú gyantákat alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988.07.29.)
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 30-50 ’C hőmérsékleten és pH=6-7 értéken reagáltatunk. (Elsőbbsége: 1988.07.29.)
  8. 8. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy porózus hordozóanyagként AMBERLITE® típusú poli(akril-észter) alapú gyantákat alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988.02.25.)
  9. 9. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 30-50 ’C hőmérsékleten és pH-6-7 értéken reagáltatunk. (Elsőbbsége: 1988.02.25.)
HU89900A 1988-02-25 1989-02-24 Continuous biotechnological process for producing s-(+)-optical isomere of 2-(6-methoxy-2-naphtyl)propionic acid HU204576B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT19532/88A IT1217341B (it) 1988-02-25 1988-02-25 Processo per la preparazione biotecnologica in continuo dell'isomero ottico s (+) dell'acido 2-(6-metossi-2-naftil) propionico
IT8821558A IT1226553B (it) 1988-07-29 1988-07-29 Processo per la preparazione biotecnologica in continuo dell'isomero ottico s (+) dell'acido 2 -(6-metossi-2-naftil) propionico.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT52822A HUT52822A (en) 1990-08-28
HU204576B true HU204576B (en) 1992-01-28

Family

ID=26327198

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU89900A HU204576B (en) 1988-02-25 1989-02-24 Continuous biotechnological process for producing s-(+)-optical isomere of 2-(6-methoxy-2-naphtyl)propionic acid

Country Status (8)

Country Link
US (1) US5229280A (hu)
EP (1) EP0330217B1 (hu)
JP (1) JPH01304897A (hu)
AU (1) AU619249B2 (hu)
DE (1) DE68914703T2 (hu)
ES (1) ES2051903T3 (hu)
HU (1) HU204576B (hu)
IL (1) IL89379A (hu)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2626288B1 (hu) * 1988-01-27 1990-05-18 Rhone Poulenc Sante
IT1247533B (it) * 1991-04-26 1994-12-17 Mini Ricerca Scient Tecnolog Processo per la separazione degli isomeri ottici di acidi carbossilici alfa-sostitutivi
EP0644940A1 (en) * 1992-05-15 1995-03-29 Syntex Pharmaceuticals International Limited PROCESS FOR ENZYMATIC PREPARATION OF -i(S)-6-METHOXY-A-METHYL-2-MAPHTHALENEACETIC ACID
US5457051A (en) * 1993-03-09 1995-10-10 Sepracor, Inc. Enantioselective hydrolysis of ketoprofen esters by beauveria bassiana and enzymes derived therefrom
AU7324696A (en) * 1995-11-17 1997-06-11 Aeci Limited Synthesis of propionic acid derivatives
CA2319265A1 (en) 1998-01-26 1999-07-29 Pharm-Eco Laboratories Inc. Enzyme activated supports for enantiomeric separations
US6844574B1 (en) 1999-03-12 2005-01-18 Sumitomo Chemical Company, Limited III-V compound semiconductor
JP4192331B2 (ja) * 1999-04-16 2008-12-10 住友化学株式会社 光学活性２−オキソビシクロ［３．１．０］ヘキサン−６−カルボン酸誘導体の製造方法
EP2216403A3 (en) 2006-02-02 2010-11-24 Verenium Corporation Esterases and related nucleic acids and methods

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3663467A (en) * 1968-08-30 1972-05-16 Rohm & Haas Porous polymers based on trimethylolpropane trimethacrylate and related materials
US3891412A (en) * 1974-05-06 1975-06-24 Johns Manville Trimethylolpropane use of macroreticular polymers of trimethacrylate for making chromatographic separations
GB1536822A (en) * 1976-05-31 1978-12-20 Sumitomo Chemical Co Immobilized non-specific proteases
DK402583D0 (da) * 1983-09-05 1983-09-05 Novo Industri As Fremgangsmade til fremstilling af et immobiliseret lipasepraeparat og anvendelse deraf
JPS6058086A (ja) * 1983-09-09 1985-04-04 Nitto Electric Ind Co Ltd エステル類の製造方法
DE3345660A1 (de) * 1983-12-16 1985-06-27 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur gewinnung von d(+)naproxen
IT1201408B (it) * 1985-03-22 1989-02-02 Montedison Spa Processo per la preparazione biotecnologica di acidi alfa-arilalcanoici otticamente attivi
EP0197474B1 (en) * 1985-04-01 1991-07-10 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Process for preparing optically active indoline-2-carboxylic acid
DE3532026A1 (de) * 1985-09-09 1987-03-19 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung optisch aktiver (alpha)-phenoxypropionsaeure und deren derivate
DK620486A (da) * 1985-12-20 1987-06-21 Wisconsin Alumni Res Found Fremgangsmaade til fremstilling af eddikesyrederivater
GB8600245D0 (en) * 1986-01-07 1986-02-12 Shell Int Research Preparation of 2-arylpropionic acids
WO1989002916A1 (en) * 1987-09-28 1989-04-06 Novo-Nordisk A/S Method for immobilizing lipase
US4897352A (en) * 1988-01-15 1990-01-30 The Dow Chemical Company Acrylate based adsorbent resin for the immobilization of enzymes

Also Published As

Publication number Publication date
DE68914703D1 (de) 1994-05-26
IL89379A (en) 1992-12-01
IL89379A0 (en) 1989-09-10
DE68914703T2 (de) 1994-09-08
EP0330217B1 (en) 1994-04-20
JPH01304897A (ja) 1989-12-08
ES2051903T3 (es) 1994-07-01
EP0330217A3 (en) 1991-01-16
HUT52822A (en) 1990-08-28
AU3014789A (en) 1989-08-31
US5229280A (en) 1993-07-20
AU619249B2 (en) 1992-01-23
EP0330217A2 (en) 1989-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Inagaki et al. One-pot synthesis of optically active cyanohydrin acetates from aldehydes via lipase-catalyzed kinetic resolution coupled with in situ formation and racemization of cyanohydrins
JPH072118B2 (ja) エステル交換による酵素的ラセミ分割法
US4898822A (en) Process for preparing optically active indoline-2-carboxylic acid
AU617747B2 (en) Enzymatic process for the preparation of optically active cyanohydrins
JP3610600B2 (ja) 光学活性エンド−２−ノルボルネオール類の製造方法
HU204576B (en) Continuous biotechnological process for producing s-(+)-optical isomere of 2-(6-methoxy-2-naphtyl)propionic acid
JP3060187B2 (ja) （２ｒ，３ｓ）−３−（４−メトキシ−フェニル）−グリシド酸エステルの製造方法
Hamaguchi et al. Stereospecific hydrolysis of 2-oxazolidinone esters and separation of products with an immobilized lipase column
US4923810A (en) Resolution of glycidyl esters to high enantiomeric excess
EP0494203B1 (en) Synthesis of aryl alkanediols having high optical purity
JP3140549B2 (ja) α−置換カルボン酸の光学異性体の分離法
US5811294A (en) Production of optically active 1,2-dihydroxyindance derivatives by asymetric assimilation
CA2315837A1 (en) Microbial production of levodione
EP0517798B1 (en) Stereospecific resolution by hydrolysis of esters of 2-arylpropionic acids by liver enzymes
HUT62940A (en) Process for the enzymatic hydrolysis of carboxylic acid derivatives
EP0474250A2 (en) Enzymatic process for separating the optical isomers of racemic 1,2-diols
EP1074630B1 (en) Microbial production of levodione
Kato et al. Optical resolution of 2, 2, 2-trifluoro-1-(9-phenanthryl) ethanol via enzymatic alcoholysis of its activated ester
US5726344A (en) Enantiomeric enrichment of bicyclic alcohols
JPH0616718B2 (ja) 固定化酵素もしくは固定化微生物による光学活性インドリン−２−カルボン酸の製造方法
JP3105653B2 (ja) 多機能固定化リパーゼ
US5175100A (en) Stereospecific resolution by hydrolysis of esters of 2-arylpropionic acids by liver enzymes
CA2351913A1 (en) Process for preparation of optically active 1,2-diols by cultivating microorganisms
US5306638A (en) Amine additive assisted enzymatic esterification of 1,2-diol monosulfonates
JPH08113550A (ja) 光学活性３−ヒドロキシヘキサン酸類の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee